WO2023021878A1 - ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法およびその利用 - Google Patents
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Classifications
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Definitions
- the present invention relates to a method for producing polyhydroxyalkanoic acid and its use.
- PHA Polyhydroxyalkanoic acid
- PHA produced by microorganisms accumulates within the cells of the microorganisms, so in order to use PHA as a plastic, it is necessary to separate and purify the PHA from the cells of the microorganisms.
- PHA is removed from the obtained aqueous suspension.
- separation operations such as centrifugation, filtration, and drying are performed.
- nucleic acids are released from the cells, increasing the viscosity of the culture solution. There is a problem that it becomes difficult to carry out the purification process. Viscosity-lowering treatments such as heat treatment, addition of hypochlorite, addition of commercially available nuclease, and the like are known to address this problem.
- Patent Document 1 discloses a method of adding a peroxide such as hydrogen peroxide to decompose nucleic acids.
- Patent Document 2 discloses a technique for improving purification efficiency without lowering the molecular weight of 3-hydroxyalkanoic acid by adjusting the pH by adding hydrogen peroxide.
- one aspect of the present invention aims to provide a technique for reducing the viscosity of a culture solution that is easy to industrialize when recovering PHA from PHA-producing bacteria.
- the present inventors added an oxidizing agent to the culture solution containing PHA-producing bacteria after inactivation, adjusted it to a specific pH, and adjusted it to a specific temperature. By maintaining the, it was found for the first time that the increase in the viscosity of the culture solution can be suppressed, and the present invention has been completed.
- the method for producing a polyhydroxyalkanoic acid according to one aspect of the present invention comprises (a) adding 40 and (b) adding an oxidizing agent to the culture solution obtained in step (a) and adjusting the pH to 10.5-13.0, and process to maintain,
- a method for producing a polyhydroxyalkanoic acid comprising:
- an aqueous suspension of polyhydroxyalkanoic acid according to one embodiment of the present invention contains hydrogen peroxide and polyhydroxyalkanoic acid and is It is an aqueous suspension of polyhydroxyalkanoic acid having a shear viscosity at 1/s of 1 to 10 mPa ⁇ s.
- the present inventors have made extensive studies to provide a technique for reducing the viscosity of the culture solution that is easy to industrialize. A new finding was obtained that adding an oxidizing agent to the liquid, adjusting the pH to a specific value, and maintaining the temperature at a specific value can suppress the increase in the viscosity of the culture solution. In addition, the present inventors have found that it is possible to control (promote) the reduction in the molecular weight of PHA by the above method, and that PHA having a desired weight-average molecular weight can be obtained.
- the viscosity of the culture solution is lowered, making it easier to handle and enabling use on an industrial scale.
- the amount of enzymes and surfactants for example, sodium dodecyl sulfate
- the amount of enzymes and surfactants for example, sodium dodecyl sulfate
- the amount of plastic waste generated can be reduced. conservee and sustainably use sea and marine resources.”
- the composition of the present production method and the present aqueous suspension will be described in detail below.
- This production method is a method comprising the following steps (a) to (b): - Step (a): A step of maintaining a culture solution containing bacterial cells containing polyhydroxyalkanoic acid at 40 to 80 ° C. - Step (b): Add an oxidizing agent to the culture solution obtained in the step (a) and adjusting the pH to 10.5-13.0 and maintaining at 30-75°C.
- Step (a) The step (a) in this production method is a step of maintaining a culture solution containing cells containing polyhydroxyalkanoic acid at 40 to 80°C. PHA-producing bacteria can be inactivated by step (a). Further, in the step (a), the cells in the culture medium are inactivated in advance by subjecting them to an inactivation temperature, thereby facilitating the later-described purification step and the like.
- the term "inactivation temperature” means a temperature that can kill microorganisms in a culture solution.
- the “inactivation temperature” means a temperature at which catalase, an enzyme possessed by microorganisms, can be deactivated.
- the inactivation temperature is 40° C. to 80° C., preferably 50° C. to 80° C., which is the temperature at which microorganisms are killed and catalase is inactivated, more preferably 60°C to 80°C.
- PHA is a general term for polymers having hydroxyalkanoic acid as a monomer unit.
- the hydroxyalkanoic acid constituting PHA is not particularly limited, but examples include 3-hydroxybutanoic acid, 4-hydroxybutanoic acid, 3-hydroxypropionic acid, 3-hydroxypentanoic acid, 3-hydroxyhexanoic acid, 3-hydroxy heptanoic acid, 3-hydroxyoctanoic acid, and the like.
- These polymers may be homopolymers or copolymers containing two or more monomer units.
- PHA includes, for example, poly(3-hydroxybutyrate) (P3HB), poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) (P3HB3HH), poly(3-hydroxybutyrate) -co-3-hydroxyvalerate) (P3HB3HV), poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) (P3HB4HB), poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctanoate) (P3HB3HO), Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctadecanoate) (P3HB3HOD), Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxydecanoate) (P3HB3HD), Poly(3 -hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-3-hydroxyhexanoate) (P3HB3HV3HH) and the like.
- P3HB, P3HB3HH, P3HB3HV, and P3HB4HB are preferable
- the melting point and crystallinity can be changed.
- a copolymer of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid is used from the viewpoint that it is possible to impart it and that it is a plastic that is easy to produce industrially and has physical properties as described above.
- Some P3HB3HH are more preferred.
- the composition ratio of the repeating units of P3HB3HH is 3-hydroxybutyrate unit/3-hydroxyhexanoate unit composition ratio of 80/20 to 80/20 from the viewpoint of balance between flexibility and strength. It is preferably 99.9/0.1 (mol/mol), more preferably 85/15 to 97/3 (mol/mol).
- the composition ratio of 3-hydroxybutyrate units/3-hydroxyhexanoate units is 99.9/0.01 (mol/mol) or less, sufficient flexibility can be obtained, and 80/20 (mol/ mol) or more, sufficient hardness can be obtained.
- the PHA obtained in the step (a) preferably has a weight average molecular weight (hereinafter sometimes referred to as "Mw") of 1,500,000 to 2,500,000, more preferably. is 1.6 million to 2.4 million, more preferably 1.7 million to 2.3 million. If the weight average molecular weight of PHA is within the above range, the culture productivity is excellent.
- the weight average molecular weight of PHA was determined by gel permeation chromatography (GPC) ("Shodex GPC-101" manufactured by Showa Denko) using polystyrene gel (“Shodex K-804" manufactured by Showa Denko) as a column and chloroform as the mobile phase. , can be obtained as a molecular weight in terms of polystyrene.
- the solid content concentration of the culture solution obtained in step (a) is preferably 20 to 40% by weight, more preferably 25 to 40% by weight, and even more preferably is 30 to 40% by weight. If the solid content concentration of the culture solution obtained in the step (a) is within the above range, a sufficient amount of PHA can be obtained.
- the microbial cells used in step (a) are not particularly limited as long as they are microorganisms capable of intracellularly producing PHA.
- microorganisms that have been deposited in depositories of microorganisms and strains isolated from nature (eg, IFO, ATCC, etc.), or mutants and transformants that can be prepared therefrom can be used.
- Bacillus megaterium which was discovered in 1925, was the first bacterial cell that produces P3HB, which is an example of PHA.
- natural microorganisms such as Ralstonia eutropha and Alcaligenes latus. These microorganisms are known to accumulate PHA in their cells.
- Alcaligenes eutrophus Alcaligenes eutrophus AC32 strain (Alcaligenes eutrophus AC32, FERM BP-6038) (T.Fukui, Y.Doi, J.Bateriol) into which PHA synthase group genes were introduced in order to increase the productivity of P3HB3HH ., 179, p4821-4830 (1997)) and the like are more preferred.
- the microbial cells may be genetically modified microorganisms into which various PHA-synthesis-related genes have been introduced according to the PHA to be produced.
- PHA can also be produced, for example, by the method described in International Publication No. 2010/013483.
- Commercial products of PHA include, for example, Kaneka Corporation "Kaneka Biodegradable Polymer PHBH (registered trademark)" (eg, X131A and 151C used in Examples).
- PHA-producing bacteria the above-mentioned microorganisms capable of producing PHA in cells are sometimes referred to as "PHA-producing bacteria".
- Step (b) The step (b) in this production method includes adding an oxidizing agent to the culture solution obtained in the step (a), adjusting the pH to 10.5 to 13.0, and maintaining it at 30 to 75°C. It is a process.
- viscosity intends "shear viscosity in 50 degreeC 100 1/s” measured by the method as described in an Example.
- PHA aqueous suspension the aqueous suspension containing PHA obtained in step (b) and subsequent steps.
- the step (b) can reduce the viscosity of the obtained culture solution.
- the amount of enzyme used in step (c) described later can be reduced, and the production cost of PHA is reduced.
- the weight average molecular weight of PHA it is possible to produce PHA having a desired weight average molecular weight.
- the oxidizing agent examples include, but are not limited to, hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), ozone; sodium peroxide (Na 2 O 2 ), sodium perborate (Na 2 H 4 B 2 O 8 ), Other inorganic peroxides such as sodium percarbonate ( Na2H3CO6 ), sodium persulfate ( Na2S2O8 ) ; chlorite, chlorate , metachloroperbenzoic acid ( C7H5 CIO3 ) similar halogen compounds such as perchlorate , perchloric acid ( CIO4 ), chlorine dioxide ( CIO2 ) ; permanganate compounds such as potassium permanganate; sodium perborate; potassium nitrate ( KNO3 ); sodium bismuthate; cerium (IV) compounds such as ammonium cerium nitrate and cerium sulfate.
- the oxidizing agent is preferably hydrogen peroxide or ozone from the viewpoint of easy availability.
- the concentration of hydrogen peroxide in the culture medium is, for example, 0.2 to 30% by weight, preferably 0.2 to 15% by weight, more preferably 0.2 to 10% by weight. If it is 0.2% by weight or more, the viscosity of the PHA aqueous suspension can be reduced. Also, if the content is 30% by weight or less, the PHA production cost can be suppressed. Hydrogen peroxide may be added in step (b) to achieve the above concentrations.
- the amount of ozone added is, for example, 0.01 to 0.1 g, preferably 0.02 to 0.08 g, more preferably 0.02 to 0.08 g per 1 g of biomass containing PHA. , 0.02 to 0.07 g. If it is 0.01 g or more, the viscosity of the PHA aqueous suspension can be reduced. Moreover, if it is 0.1 g or less, the amount of residual ozone will be small.
- NaHCO 3 may be added along with the hydrogen peroxide addition. NaHCO 3 is expected to assist the action of hydrogen peroxide.
- a chelating agent may be added together with the addition of hydrogen peroxide. Addition of a chelating agent can stabilize the hydrogen peroxide solution.
- Chelating agents include, but are not limited to, sodium silicate, EDTA, trans-1,2-cyclohexanediaminetetraacetic acid monohydrate, and the like.
- a suitable pH is 10.5 to 13.0, more preferably pH 10.6. ⁇ 12.9, more preferably pH 10.7-12.8. If the pH is 10.5 or more, the viscosity of the PHA aqueous suspension is lowered, and the handleability is improved. Moreover, if the pH is 13.0 or less, sufficient time can be obtained for adjusting the weight average molecular weight of the PHA. Adjustment of pH may be performed, for example, by adding an alkaline aqueous solution.
- the alkaline aqueous solution is an aqueous solution containing a basic compound.
- the basic compound contained in the alkaline aqueous solution is not particularly limited, but for example, hydroxides of alkali metals or alkaline earth metals such as sodium hydroxide and potassium hydroxide; metal carbonates such as sodium carbonate and potassium carbonate; Metal phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, sodium hydrogen phosphate and potassium hydrogen phosphate, and metal hydrogen phosphates are included.
- the basic compound contained in the alkaline aqueous solution is preferably an alkali metal hydroxide or an alkaline earth metal hydroxide, more preferably sodium hydroxide.
- a basic compound may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
- step (b) the order of adding the oxidizing agent and adjusting the pH is not particularly limited, but from the viewpoint of efficiently lowering the pH, it is preferable to adjust the pH after adding the oxidizing agent.
- the temperature of the culture medium is 30° C. to 75° C., preferably 35° C. to 70° C., in order to control the viscosity of the PHA aqueous suspension and the weight average molecular weight of the PHA, More preferably, it is 40°C to 65°C. If the temperature of the culture solution is 30°C or higher, the time for adjusting the PHA weight average molecular weight does not become longer than necessary, and if the temperature is 80°C or lower, a sufficient adjustment time can be obtained.
- the PHA aqueous suspension obtained in step (b) is preferably a Newtonian fluid. If the PHA aqueous suspension is a Newtonian fluid, the shear rate dependence of the viscosity is low, so that the PHA aqueous suspension tends to become uniform in the stirring device, improving handling properties.
- step (b) the adjusted pH is preferably maintained for 0.1 to 30 hours, more preferably 0.25 to 24 hours, more preferably 0.5 to 15 hours. including the step of maintaining.
- step (b) the pH of the culture solution is gradually lowered as the PHA in the culture solution is decomposed. Therefore, by maintaining the pH of the culture medium in step (b), the viscosity of the resulting PHA aqueous suspension can be further reduced.
- the method for maintaining the adjusted pH is not particularly limited, and for example, it is performed by adding an alkaline aqueous solution.
- the alkaline aqueous solution is not particularly limited, for example, the alkaline aqueous solution described above is used.
- the temperature in the pH maintenance step is not particularly limited, but is, for example, 30 to 80°C, preferably 30 to 75°C.
- the step (b) may include a step of maintaining the pH at a predetermined temperature for a predetermined time and then maintaining the temperature at 30-75°C for 0.5-30 hours.
- the pH of the culture solution gradually decreases due to the decomposition of PHA, so by including the step of maintaining at 30 to 75 ° C. for 0.5 to 30 hours, the neutralization step at a later stage is simplified. be able to.
- the weight average molecular weight of PHA in the PHA aqueous suspension obtained in step (b) is preferably 100,000 to 800,000, more preferably 200,000 to 80,000. 10,000, more preferably 400,000 to 800,000.
- the weight average molecular weight is 100,000 or more, sufficient mechanical properties can be obtained, and when it is 800,000 or less, a sufficient crystallization rate can be obtained and good moldability can be achieved.
- the solid content concentration of the aqueous suspension obtained in step (b) is preferably 20 to 40% by weight, more preferably 25 to 40% by weight, and even more preferably is 30-40% by weight. If the solid content concentration of the aqueous suspension obtained in the step (b) is within the above range, a sufficient amount of PHA can be obtained.
- the production method may further comprise the following steps (c)-(d): - Step (c): A step of adding an enzyme to the aqueous suspension obtained in the step (b) and enzymatically treating the bacterial cells - Step (d): The aqueous solution obtained in the step (c) A step of adding a surfactant and an alkaline aqueous solution to the suspension to adjust the pH to 10.0 to 12.0.
- Step (c) The step (c) in this production method is a step of adding an enzyme to the aqueous suspension obtained in the step (b) to subject the bacterial cells to enzyme treatment.
- an enzyme By destroying and removing impurities (cell walls, proteins, etc.) derived from the microbial cells in step (c), PHA can be efficiently recovered from the microbial cells.
- the enzymatic treatment in step (c) can be lytic enzyme treatment and/or alkaline proteolytic enzyme treatment.
- the bacteriolytic enzyme treatment and the alkaline protease treatment are preferably performed at least once each, and if necessary, the bacteriolytic enzyme treatment and/or the alkaline protease treatment may be performed twice or more.
- the order of lytic enzyme treatment and/or alkaline protease treatment is not particularly limited.
- step (c) when enzymatic treatment (e.g., lytic enzyme treatment and alkaline proteolytic enzyme treatment) is performed, the pH and temperature of the culture solution are adjusted according to the optimum pH and optimum temperature of the enzyme to be used. preferably. Methods for adjusting the pH and temperature of the culture solution are not particularly limited, and known methods can be used.
- the step (c) may include a step of adding a surfactant.
- the addition of the surfactant in step (c) can be performed before, at the same time as, or after the addition of the alkaline protease. Preferably after the addition of alkaline protease.
- the bacteriolytic enzyme treatment is a step of adding a bacteriolytic enzyme to the culture solution and enzymatically treating the bacterial cells.
- lytic enzyme refers to an enzyme that has the activity of degrading (bacteriolysing) the cell wall (eg, peptidoglycan) of bacterial cells.
- the lytic enzyme is not particularly limited, and examples thereof include lysozyme, labyrinthine, ⁇ -N-acetylglucosaminidase, endolysin, autolysin and the like. Lysozyme is preferred from the viewpoint of being economically advantageous. One of these may be used alone, or two or more of them may be used in combination.
- lytic enzymes Commercially available products can also be used as lytic enzymes, and examples include “lysozyme” and “acromopeptidase” manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- the optimum pH of the lytic enzyme is not particularly limited as long as the lytic enzyme has cell wall degrading activity, but is, for example, 5.0 to 11.0, preferably 6.0 to 9. .0, more preferably 6.0 to 8.0.
- the optimum temperature of the lytic enzyme is not particularly limited, but from the viewpoint that it does not require excessive heating and can prevent thermal change (thermal decomposition) of PHA, it is 60 ° C. or less. is preferred, and 50°C or lower is more preferred.
- the lower limit of the optimum temperature is not particularly limited, it is preferably room temperature (for example, 25° C.) or higher from the viewpoint of economy without excessive cooling operation.
- alkaline protease means a protease having the activity of degrading proteins in an alkaline environment (for example, in a pH 8.5 solution).
- alkaline protease treatment intends a step of adding the alkaline protease to the culture solution to enzymatically treat the bacterial cells.
- the alkaline protease is not particularly limited as long as it has the activity of degrading protein in an alkaline environment.
- specific protease eg papain, bromelain, cathepsin
- aspartic acid-specific protease eg pepsin, cathepsin D, HIV protease
- serine-specific proteolytic enzymes especially subtilisins (eg, Alcalase) are preferred.
- subtilisins eg, Alcalase
- alkaline protease commercially available products can be used, for example, Novozyme "Alcalase 2.5L”; Amano Enzyme Co., Ltd. “Protin SD-AY10” and “Protease P “Amano” 3SD”; Japan Co., Ltd. “Multifect PR6L” and “Optimase PR89L”; Shinnihon Chemical Industry Co., Ltd. “Sumiteam MP”; DM Japan Co., Ltd. "Delbolase”; Nagase ChemteX Co., Ltd. "Bioprase OP” , “Bioplase SP-20FG” and “Bioplase SP-4FG”; HBI Co., Ltd. "Orientase 22BF”; Yakult Pharmaceutical Co., Ltd. "Alloase XA-10";
- the optimal pH of the alkaline protease is not particularly limited as long as the alkaline protease has activity in an alkaline environment, for example 8.0 to 14.0, preferably 8.0 to 12.0, more preferably 8.0 to 10.0, still more preferably 8.0 to 9.0, most preferably 8.5.
- the optimum temperature for the alkaline protease is not particularly limited, but from the viewpoint that it does not require excessive heating and can prevent thermal change (thermal decomposition) of P3HA, 60° C. or lower is preferable, and 50° C. or lower is more preferable.
- the lower limit of the optimum temperature is not particularly limited, but it is preferably room temperature (for example, 25° C.) or higher from the viewpoint of economy without excessive cooling operation.
- the enzymatic treatment of step (c) can be performed with a combination of lysozyme and alcalase.
- Step (d) The step (d) in this production method is a step of adding a surfactant and an alkaline aqueous solution to the aqueous suspension obtained in the step (c) to adjust the pH to 10.0 to 12.0. be.
- Step (d) preferably includes the following steps (d1) and (d2).
- Step (d1) A step of adding an alkaline aqueous solution to the culture solution obtained in the step (c) to adjust the pH to 10.0 to 12.0
- Step (d2) A step of adding a surfactant ⁇ Step (d1)> Step (d1) is, as described above, a step of adding an alkaline aqueous solution to the aqueous PHA suspension obtained in step (c) to adjust the pH to 10.0 to 12.0.
- impurities nucleic acids, proteins, etc.
- step (d1) the description of the section (step (b)) is used for the alkaline aqueous solution.
- step (d1) the pH is preferably adjusted to 10.0 to 12.0, more preferably 10.2 to 11.8, and 10.4 by adding an alkaline aqueous solution. Adjusting to ⁇ 11.6 is even more preferred. Adjusting the pH to 10.0 or higher has the advantage of being able to decompose and dissolve bacterial components. In addition, by adjusting the pH to 12.0 or less, unintended damage to the cells can be prevented.
- the temperature in step (d1) is preferably less than 100°C, more preferably less than 80°C. Although the lower limit is not particularly limited, it is preferably 40° C. or higher, for example.
- Step (d2) is a step of adding a surfactant to the culture solution.
- impurities contained in the microbial cells, particularly cell membranes can be efficiently treated, and more impurities derived from the microbial cells can be removed, so that PHA of higher purity can be separated from the microbial cells. can be done.
- the surfactant is not particularly limited, but examples include anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants, nonionic surfactants, and the like. Of these, anionic surfactants are preferred from the viewpoint of their high ability to remove cell membranes. One of these may be used alone, or two or more of them may be used in combination.
- anionic surfactants include alkyl sulfates, alkylbenzenesulfonates, alkyl sulfates, alkenyl sulfates, alkyl ether sulfates, alkenyl ether sulfates, ⁇ -olefinsulfonates, ⁇ - Examples include sulfo fatty acid salts, esters of ⁇ -sulfo fatty acid salts, alkyl ether carboxylates, alkenyl ether carboxylates, amino acid type surfactants, N-acylamino acid type surfactants, and the like.
- alkyl sulfate ester salts are preferred, and sodium dodecyl sulfate (SDS) is particularly preferred from the viewpoint of its high ability to remove cell membranes and its low cost.
- SDS sodium dodecyl sulfate
- the amount of surfactant to be added is not particularly limited, and is, for example, 0.1 to 5.0% by weight, and 0.3 to 2.5% by weight with respect to the culture medium. preferable.
- Step (d2) may be performed before, at the same time as, or after step (d1). That is, in the step (d), the addition of the surfactant and the aqueous alkali solution may be carried out by adding the aqueous alkali solution to adjust the pH, and then adding the surfactant, or adding the surfactant and the aqueous alkali solution at the same time. After addition of the surfactant, the pH may be adjusted by adding an alkaline aqueous solution.
- the manufacturing method may further include step (e).
- Step (e) is a step of centrifuging the PHA aqueous suspension obtained in step (d) and removing the supernatant to obtain a PHA aqueous suspension in which PHA is concentrated. That is, it is a step of removing impurities from the PHA separated from the cells, and concentrating and purifying the PHA.
- step (e) the method for centrifuging the culture solution is not particularly limited, and a known method can be used.
- step (e) it is preferable to repeat the steps of centrifuging the culture solution, removing the supernatant, adding a solution to the sediment, centrifuging again, and removing the supernatant.
- the solution added after removing the supernatant is preferably an alkaline aqueous solution adjusted to the same pH as the culture medium.
- said solution is preferably the same as the alkaline aqueous solution used in said step (d).
- step (e) it is preferable to reduce these impurities as much as possible, for which the amount of impurities remaining in the final product is generally determined by step (e).
- impurities may be mixed as long as the physical properties of the final product are not impaired.
- impurities should be reduced as much as possible. preferable.
- An indicator of the degree of purification at that time is, for example, the amount of protein remaining in the PHA aqueous suspension (residual protein amount).
- the amount of protein in the PHA aqueous suspension is not particularly limited as long as it is an amount capable of achieving the residual protein amount of the PHA powder.
- the amount of protein is preferably 3000 ppm or less, more preferably 2500 ppm or less, and still more preferably 2000 ppm or less per PHA weight in the PHA aqueous suspension.
- the solvent constituting the PHA aqueous suspension (“solvent” is also referred to as “aqueous medium”) is not particularly limited, and may be water or a mixed solvent of water and an organic solvent. good too.
- the concentration of the organic solvent is not particularly limited as long as it is equal to or lower than the solubility of the organic solvent used in water.
- the organic solvent is not particularly limited, but for example, alcohols such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol, pentanol, hexanol, heptanol; acetone, methyl ethyl ketone ethers such as tetrahydrofuran and dioxane; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; amides such as dimethylformamide and acetamide; dimethylsulfoxide, pyridine, piperidine and the like.
- alcohols such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol, pentanol, hexanol, heptanol
- acetone methyl ethyl ketone ethers
- nitriles such as ace
- methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol, acetone, methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, propionitrile and the like are preferable because they are easy to remove.
- Methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, acetone and the like are more preferable because they are readily available.
- methanol, ethanol and acetone are particularly preferred.
- the water content in the aqueous medium constituting the PHA aqueous suspension is preferably 5% by weight or more, more preferably 10% by weight or more, still more preferably 30% by weight or more, and particularly preferably , 50% by weight or more.
- the PHA aqueous suspension in step (e) may contain other solvents, components derived from bacterial cells, compounds generated during purification, etc., as long as they do not impair the essence of the present invention.
- Aqueous suspension of polyhydroxyalkanoic acid contains hydrogen peroxide and polyhydroxyalkanoic acid, and has a shear viscosity of 1 to 10 mPa ⁇ s at 50° C. and 100 1/s. Since the present PHA aqueous suspension has a low viscosity, it is excellent in handleability and allows efficient production of PHA.
- the shear viscosity of the present PHA aqueous suspension at 50°C and 100 1/s is 1 to 10 mPa ⁇ s, preferably 1 to 9 mPa ⁇ s, more preferably 1 to 8 mPa ⁇ s.
- the shear viscosity of the present PHA aqueous suspension at 50° C. 10 1/s is, for example, 1 to 20 mPa ⁇ s, preferably 1 to 18 mPa ⁇ s, more preferably 1 to 15 mPa ⁇ s.
- the shear viscosity of the present PHA aqueous suspension is measured by the method described in Examples.
- the PHA aqueous suspension has a solid content concentration of, for example, 20 to 40% by weight, preferably 25 to 40% by weight.
- the solid content concentration of the aqueous suspension is 20 to 40% by weight, the viscosity of the aqueous suspension is usually high, making the subsequent purification treatment difficult.
- the inclusion of hydrogen peroxide makes it possible to provide an aqueous suspension in which an increase in viscosity is suppressed.
- the solid content concentration of the present PHA aqueous suspension is measured by the method described in Examples.
- the weight average molecular weight of the PHA contained in the present PHA aqueous suspension is, for example, 100,000 to 800,000, preferably 100,000 to 800,000, more preferably 200,000 to 800,000, and even more preferably. is between 400,000 and 800,000.
- weight average molecular weight is 100,000 or more, sufficient mechanical properties can be obtained, and when it is 800,000 or less, a sufficient crystallization rate can be obtained and good moldability can be achieved.
- the concentration of hydrogen peroxide in the present PHA aqueous suspension is, for example, 0.2 to 30% by weight, preferably 0.2 to 15% by weight, more preferably 0.2 to 10% by weight. is. If it is 0.2% by weight or more, the viscosity of the PHA aqueous suspension can be lowered. Also, if the content is 30% by weight or less, the PHA production cost can be suppressed.
- the present PHA aqueous suspension may contain various components generated or not removed during the course of the present production method, as long as the effects of the present invention are exhibited.
- one aspect of the present invention includes the following. ⁇ 1> (a) a step of maintaining a culture medium containing bacterial cells containing polyhydroxyalkanoic acid at 40 to 80° C., and (b) adding an oxidizing agent to the culture medium obtained in step (a) and adjusting the pH to 10.5-13.0 and maintaining at 30-75°C;
- a method for producing a polyhydroxyalkanoic acid comprising: ⁇ 2> The method for producing a polyhydroxyalkanoic acid according to ⁇ 1>, wherein the oxidizing agent is aqueous hydrogen peroxide or ozone.
- ⁇ 3> Furthermore, (c) adding an enzyme to the aqueous suspension obtained in the step (b) to treat the bacterial cells with an enzyme; and (d) adding an enzyme to the aqueous suspension obtained in the step (c).
- the weight-average molecular weight of the polyhydroxyalkanoic acid in the culture medium obtained in the step (a) is 1,500,000 to 2,500,000
- the weight average molecular weight of the polyhydroxyalkanoic acid in the aqueous suspension obtained in the step (b) is 100,000 to 800,000
- ⁇ 7> When hydrogen peroxide is added to the culture medium in the step (b), it is added so that the concentration of hydrogen peroxide in the culture medium is 0.2 to 30% by weight.
- ⁇ 8> The method for producing a polyhydroxyalkanoic acid according to any one of ⁇ 3> to ⁇ 7>, wherein the enzyme in step (c) is a lytic enzyme and/or an alkaline protease.
- ⁇ 10> An aqueous suspension of polyhydroxyalkanoic acid, containing hydrogen peroxide and polyhydroxyalkanoic acid, and having a shear viscosity of 1 to 10 mPa ⁇ s at 50° C. and 100 1/s.
- ⁇ 11> The aqueous suspension of polyhydroxyalkanoic acid according to ⁇ 10>, which has a solid content concentration of 20 to 40% by weight.
- ⁇ 12> The aqueous suspension of polyhydroxyalkanoic acid according to ⁇ 10> or ⁇ 11>, wherein the polyhydroxyalkanoic acid has a weight average molecular weight of 100,000 to 800,000.
- ⁇ 13> The aqueous suspension of polyhydroxyalkanoic acid according to any one of ⁇ 10> to ⁇ 12>, wherein the concentration of hydrogen peroxide is 0.2 to 30% by weight.
- the viscosity of the PHA aqueous suspension was measured by the following method. Specifically, the viscosity was measured with a coaxial double cylinder using MCR302 manufactured by Anton Paar. The PHA aqueous suspension was put into a 20 mL cylinder, and the liquid temperature was adjusted to 50°C. After reaching the target shear rate, the viscosity was measured when the change in torque with time became less than 1%.
- the residual protein content of the PHA powder was measured using a BCA Protein Assay Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific). Specifically, 10 mg of PHBH powder was put into a 15 mL falcon tube, 2 mL of the reagent of the above kit was added, and then shaken at 60° C. for 30 minutes. After 30 minutes from the end of shaking, the mixture was cooled to 25° C. and absorbance at a wavelength of 562 nm was measured.
- the inactivated PHA-containing culture medium was diluted with distilled water, centrifuged, and then the supernatant was removed. Ethanol was added to the obtained precipitate (PHA), and after dispersing in ethanol, centrifugation was performed. The supernatant was removed and dried in a vacuum dryer for 1 hour or more to completely dry the precipitate to obtain a dry body (PHA powder). After dissolving 10 mg of the obtained PHA powder in 10 mL of chloroform, insoluble matter was removed by filtration.
- Solid content concentration The solid content concentration of the PHA-containing culture solution after inactivation was measured using a heat drying moisture meter ML-50 (manufactured by A&D Co., Ltd.). The culture solution was heated at 130° C. until the weight change rate was less than 0.05%/min, and the solid content concentration was determined from the weight change before and after heating.
- Example 1 (Preparation of cell culture solution)
- Ralstonia eutropha described in International Publication No. WO2019/142717 was cultured by the method described in paragraphs [0041] to [0048] of the same document to obtain a cell culture solution containing cells containing PHA.
- Ralstonia eutropha is now classified as Capriavidus necator.
- the composition ratio of repeating units of PHA was 85/15 to 92/8 (mol/mol).
- Step (a) (Inactivation)
- the cell culture solution obtained above was sterilized by heating and stirring at an internal temperature of 60 to 70° C. for 7 hours to obtain an inactivated culture solution.
- the weight average molecular weight of PHA in the inactivated culture medium was 1.8 million.
- the solid content concentration of the inactivated culture solution was 30% by weight.
- Step (b) (viscosity reduction treatment) Hydrogen peroxide (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the inactivated culture solution obtained above to obtain the concentrations shown in Table 1. A 30% aqueous sodium hydroxide solution was then added to adjust the pH to 11.0. While maintaining the solution at 60° C., the pH was maintained at 11.0 for the time shown in Table 1 by continuing to add a 30% aqueous sodium hydroxide solution to obtain an aqueous PHA suspension. Table 1 shows the results. The solid content concentration after the viscosity reduction treatment was 28 to 30% by weight.
- the PHA aqueous suspension of Comparative Example 1-1 has a higher viscosity than the PHA aqueous suspensions of Examples 1-1 to 1-6, and the addition of hydrogen peroxide reduces the viscosity. was found to be an important factor in Further, when the pH was 10.0, the PHA aqueous suspensions of Comparative Examples 1-2 to 1-6 had higher viscosities than the PHA aqueous suspensions of Examples 1-1 to 1-6. It has been found that pH is an important factor for viscosity reduction.
- the weight-average molecular weight of the PHA of (Comparative Example 1-1) was 1.8 million, and the weight-average molecular weight of the PHA when reacted for 1 hour at a hydrogen peroxide concentration of 0.99% (Comparative Example 1-4) was 160. was 10,000.
- Example 2 A PHA aqueous suspension was obtained in the same manner as in Example 1, except that the pH, hydrogen peroxide concentration and reaction time were changed as shown in Table 2. Table 2 shows the results.
- Example 3 A PHA aqueous suspension was obtained in the same manner as in Example 1, except that the pH, hydrogen peroxide concentration and reaction time were changed as shown in Table 3. Table 3 shows the results.
- Example 4 A PHA aqueous suspension was obtained in the same manner as in Example 1, except that the hydrogen peroxide concentration, reaction temperature and reaction time were changed as shown in Table 4. Table 4 shows the results.
- Example 5 (Step (c)) (enzyme treatment) 10% sulfuric acid was added to the PHA aqueous suspension of Example 1-3 to adjust the pH to 7.0 ⁇ 0.2. When the solid content concentration of the PHA aqueous suspension to which sulfuric acid was added was measured, it was 30% by weight. After the addition of sulfuric acid, lysozyme (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), an enzyme that decomposes sugar chains (peptidoglycan) in cell walls, was added to a liquid concentration of 10 ppm, and the mixture was kept at 50°C for 2 hours.
- lysozyme manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- Alcalase 2.5 L manufactured by Novozyme
- 30% sodium hydroxide was added at 50°C to adjust the pH to 8.5. maintained for 2 hours.
- Step (d) (alkali treatment) Sodium dodecyl sulfate (SDS, manufactured by Kao Corporation) was added to the enzyme-treated solution so as to be 0.6 to 1.0 wt %. After that, an aqueous sodium hydroxide solution was used to adjust the pH to 11.0 ⁇ 0.2. Next, the enzyme-treated solution was centrifuged (4500 rpm, 10 minutes), and the supernatant was removed to obtain a two-fold concentrated PHA aqueous suspension. To the concentrated PHA aqueous suspension, the same amount of sodium hydroxide as the removed supernatant was added, centrifugation was performed again (4500 rpm, 10 minutes), and the supernatant was removed, which was repeated three times. The residual protein concentration in the obtained PHA aqueous suspension was 1217 ppm. Table 5 shows the results.
- Example 6 The treatment was carried out in the same manner as in Example 5 except that the lysozyme concentration was 5 ppm and the alcalase 2.5L concentration was 150 ppm. The residual protein concentration in the obtained PHA aqueous suspension was 1645 ppm. Table 5 shows the results.
- Example 3 The treatment was performed in the same manner as in Example 1 until the inactivation treatment, and the pH was kept at 11.0 for 1.5 hours.
- the viscosity at 50° C. and a shear rate of 10 1/s was 60.17 mPa ⁇ s, indicating poor handleability.
- IW industrial water
- the residual protein concentration in the resulting PHA aqueous suspension was 1675 ppm. Table 5 shows the results.
- Examples 5 and 6 the reaction speed of the enzyme reaction was faster than in Comparative Example 3. This is presumed to be due to the low viscosity of the PHA aqueous suspension.
- Example 7 (Step (c)) (enzyme treatment) Esperase (manufactured by Novozymes), which is an alkaline proteolytic enzyme, was added to the aqueous PHA suspension of Example 1-3 so that the concentration in the liquid was 100 ppm. Then, 30% sodium hydroxide was added at 50° C. and maintained for 2 hours while adjusting the pH to 11.0. Then, after centrifugation (4500 rpm, 10 minutes), the supernatant was removed to obtain a two-fold concentrated PHA aqueous suspension. To the concentrated PHA aqueous suspension, the same amount of sodium hydroxide as the removed supernatant was added to obtain a PHA aqueous suspension.
- Esperase manufactured by Novozymes
- Step (d) (alkali treatment) SDS was added so as to be 0.3 to 1.0 wt % with respect to the enzyme-treated solution. After that, an aqueous sodium hydroxide solution was used to adjust the pH to 11.0 ⁇ 0.2, and the mixture was reacted at 40° C. for 1 hour. Next, the enzyme-treated solution was centrifuged (4500 rpm, 10 minutes), and the supernatant was removed to obtain a two-fold concentrated PHA aqueous suspension. To the concentrated PHA aqueous suspension, the same amount of sodium hydroxide as the removed supernatant was added, centrifugation was performed again (4500 rpm, 10 minutes), and the supernatant was removed, which was repeated three times. The residual protein concentration in the resulting PHA aqueous suspension was 926 ppm.
- Example 8 The treatment was carried out in the same manner as in Example 7, except that esperase was not added, up to the alkali treatment.
- the residual protein concentration in the obtained PHA aqueous suspension was 1244 ppm.
- Example 7 From Table 6, both Examples 7 and 8 were able to obtain a sufficient amount of protein.
- the protein concentration of Example 8 is higher than that of Example 7, presumably due to the inclusion of impurities. Therefore, it was shown that PHA with higher purity can be obtained by performing treatment with esperase.
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Abstract
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸生産菌からポリヒドロキシアルカン酸を回収するにあたり、工業化が容易な培養液の低粘度化技術を提供することを目的とする。以下の工程(a)および(b)を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。(a)前記ポリヒドロキシアルカン酸を含有する菌体を含む培養液を40~80℃で維持する工程、および(b)前記工程(a)で得られた培養液に酸化剤を添加し、かつ、pHを10.5~13.0に調整し、30~75℃で維持する工程。
Description
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法およびその利用に関する。
ポリヒドロキシアルカン酸(以下、「PHA」と称する場合がある。)は、生分解性を有することが知られている。
微生物が生成するPHAは、微生物の菌体内に蓄積されるため、PHAをプラスチックとして利用するためには、微生物の菌体内からPHAを分離・精製する工程が必要となる。PHAを分離・精製する工程では、PHA以外の生物由来成分を可溶化した後、得られた水性懸濁液からPHAを取り出す。このとき、例えば、遠心分離、ろ過、乾燥等の分離操作が行われる。しかし、培養後にPHA生産菌を不活化すると核酸が菌体より放出され、培養液粘度が上昇し、遠心分離や膜分離によるPHAの回収を困難とするだけでなく、酵素反応やアルカリ処理等の精製処理の実施も難しくなるとの課題がある。かかる問題に対して、熱処理、次亜塩素酸塩の添加、市販ヌクレアーゼの添加等の粘性低下処理等が知られている。
また、特許文献1には、過酸化水素等の過酸化物を添加して、核酸を分解する方法が開示されている。特許文献2には、過酸化水素を添加してpHを調整することにより、3-ヒドロキシアルカン酸の分子量を低下させずに精製効率を向上させる技術が開示されている。
しかしながら、上述のような従来技術は、コスト増等により工業規模には向かない等の問題があり、改善の余地があった。
したがって、本発明の一態様は、PHA生産菌からPHAを回収するにあたり、工業化容易な培養液の低粘度化技術を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、不活化後のPHA生産菌を含む培養液に酸化剤を添加し、かつ、特定のpHに調整し、特定の温度を維持することにより、培養液の粘度上昇を抑制できることを初めて見出し、本発明を完成させるに至った。
したがって、本発明の一態様に係るポリヒドロキシアルカン酸を製造する方法(以下、「本製造方法」と称する。)は、(a)前記ポリヒドロキシアルカン酸を含有する菌体を含む培養液を40~80℃で維持する工程、および(b)前記工程(a)で得られた培養液に酸化剤を添加し、かつ、pHを10.5~13.0に調整し、30~75℃で維持する工程、
を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法である。
を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法である。
また、本発明の一実施形態に係るポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液(以下、「本水性懸濁液」と称する。)は、過酸化水素とポリヒドロキシアルカン酸とを含み、50℃ 100 1/sでのせん断粘度が、1~10mPa・sである、ポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液である。
本発明の一態様によれば、PHA生産菌からPHAを回収するにあたり、工業化が容易な培養液の低粘度化技術を提供することができる。
本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「A~B」は、「A以上、B以下」を意味する。
〔1.本発明の概要〕
上述のように、不活化後のPHA生産菌を含む培養液の粘度上昇を抑える従来の技術は、コスト増等により工業規模には向かない等の問題があった。
上述のように、不活化後のPHA生産菌を含む培養液の粘度上昇を抑える従来の技術は、コスト増等により工業規模には向かない等の問題があった。
そこで、本発明者らは、PHA生産菌からPHAを回収するにあたり、工業化が容易な培養液の低粘度化技術を提供すべく鋭意検討を重ねた結果、不活化後のPHA生産菌を含む培養液に酸化剤を添加し、かつ、特定のpHに調整し、特定の温度を維持することにより、培養液の粘度上昇を抑制できるとの新規知見を得た。また、本発明者らは、上記の方法により、PHAの分子量低下を制御(促進)することが可能であり、所望の重量平均分子量を有するPHAが得られることを見出した。
本製造方法によれば、培養液の粘性が下がることでハンドリングが良くなり、工業規模での使用が可能となる。また、培養液の粘性低下に伴い、精製に必要な酵素量や界面活性剤(例えば、ドデシル硫酸ナトリウム)量を低減することができ、コスト面でも極めて有利である。
また、上述したような構成によれば、プラスチックゴミの発生量を低減でき、これにより、例えば、目標12「持続可能な消費生産形態を確保する」や目標14「持続可能な開発のために、海・海洋資源を保全し、持続可能な形で利用する」等の持続可能な開発目標(SDGs)の達成に貢献できる。以下、本製造方法および本水性懸濁液の構成について詳説する。
〔2.ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法〕
本製造方法は、以下の工程(a)~(b)を含む方法である:
・工程(a):ポリヒドロキシアルカン酸を含有する菌体を含む培養液を40~80℃で維持する工程
・工程(b):前記工程(a)で得られた培養液に酸化剤を添加し、かつ、pHを10.5~13.0に調整し、30~75℃で維持する工程。
本製造方法は、以下の工程(a)~(b)を含む方法である:
・工程(a):ポリヒドロキシアルカン酸を含有する菌体を含む培養液を40~80℃で維持する工程
・工程(b):前記工程(a)で得られた培養液に酸化剤を添加し、かつ、pHを10.5~13.0に調整し、30~75℃で維持する工程。
(工程(a))
本製造方法における工程(a)は、ポリヒドロキシアルカン酸を含有する菌体を含む培養液を40~80℃で維持する工程である。工程(a)により、PHA生産菌を不活化することができる。また、工程(a)により、あらかじめ培養液中の菌体を不活化温度に供して不活化しておくことにより、後述する精製工程等を容易に行うことができる。
本製造方法における工程(a)は、ポリヒドロキシアルカン酸を含有する菌体を含む培養液を40~80℃で維持する工程である。工程(a)により、PHA生産菌を不活化することができる。また、工程(a)により、あらかじめ培養液中の菌体を不活化温度に供して不活化しておくことにより、後述する精製工程等を容易に行うことができる。
<不活化温度>
本明細書において、「不活化温度」とは、培養液中の微生物を死滅させ得る温度を意味する。換言すれば、「不活化温度」とは、微生物が有する酵素であるカタラーゼを失活させ得る温度を意味する。本発明の一実施形態において、不活化温度は、微生物が死滅し、カタラーゼが不活化される温度である40℃~80℃であり、好ましくは、50℃~80℃であり、より好ましくは、60℃~80℃である。
本明細書において、「不活化温度」とは、培養液中の微生物を死滅させ得る温度を意味する。換言すれば、「不活化温度」とは、微生物が有する酵素であるカタラーゼを失活させ得る温度を意味する。本発明の一実施形態において、不活化温度は、微生物が死滅し、カタラーゼが不活化される温度である40℃~80℃であり、好ましくは、50℃~80℃であり、より好ましくは、60℃~80℃である。
<PHA>
本明細書において、「PHA」とは、ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする重合体の総称である。PHAを構成するヒドロキシアルカン酸としては、特に限定されないが、例えば、3-ヒドロキシブタン酸、4-ヒドロキシブタン酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、3-ヒドロキシペンタン酸、3-ヒドロキシヘキサン酸、3-ヒドロキシヘプタン酸、3-ヒドロキシオクタン酸等が挙げられる。これらの重合体は、単独重合体でも、2種以上のモノマーユニットを含む共重合体でもよい。
本明細書において、「PHA」とは、ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする重合体の総称である。PHAを構成するヒドロキシアルカン酸としては、特に限定されないが、例えば、3-ヒドロキシブタン酸、4-ヒドロキシブタン酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、3-ヒドロキシペンタン酸、3-ヒドロキシヘキサン酸、3-ヒドロキシヘプタン酸、3-ヒドロキシオクタン酸等が挙げられる。これらの重合体は、単独重合体でも、2種以上のモノマーユニットを含む共重合体でもよい。
より詳しくは、PHAとしては、例えば、ポリ(3-ヒドロキシブチレート)(P3HB)、ポリ(3-ヒドロキシブチレート-コ-3-ヒドロキシヘキサノエート)(P3HB3HH)、ポリ(3-ヒドロキシブチレート-コ-3-ヒドロキシバリレート)(P3HB3HV)、ポリ(3-ヒドロキシブチレート-コ-4-ヒドロキシブチレート)(P3HB4HB)、ポリ(3-ヒドロキシブチレート-コ-3-ヒドロキシオクタノエート)(P3HB3HO)、ポリ(3-ヒドロキシブチレート-コ-3-ヒドロキシオクタデカノエート)(P3HB3HOD)、ポリ(3-ヒドロキシブチレート-コ-3-ヒドロキシデカノエート)(P3HB3HD)、ポリ(3-ヒドロキシブチレート-コ-3-ヒドロキシバリレート-コ-3-ヒドロキシヘキサノエート)(P3HB3HV3HH)等が挙げられる。中でも、工業的に生産が容易であることから、P3HB、P3HB3HH、P3HB3HV、P3HB4HBが好ましい。
また、繰り返し単位の組成比を変えることで、融点、結晶化度を変化させ、結果として、ヤング率、耐熱性等の物性を変化させることができ、かつ、ポリプロピレンとポリエチレンとの間の物性を付与することが可能であること、および上記したように工業的に生産が容易であり、物性的に有用なプラスチックであるという観点から、3-ヒドロキシ酪酸と3-ヒドロキシヘキサン酸の共重合体であるP3HB3HHがより好ましい。
本発明の一実施形態において、P3HB3HHの繰り返し単位の組成比は、柔軟性および強度のバランスの観点から、3-ヒドロキシブチレート単位/3-ヒドロキシヘキサノエート単位の組成比が、80/20~99.9/0.1(mol/mol)であることが好ましく、85/15~97/3(mol/mol)であることがより好ましい。3-ヒドロキシブチレート単位/3-ヒドロキシヘキサノエート単位の組成比が、99.9/0.01(mol/mol)以下であると、十分な柔軟性が得られ、80/20(mol/mol)以上であると、十分な硬度が得られる。
本発明の一実施形態において、前記工程(a)で得られたPHAの重量平均分子量(以下、「Mw」と称する場合がある。)は、好ましくは、150万~250万であり、より好ましくは、160万~240万であり、さらに好ましくは、170万~230万である。PHAの重量平均分子量が前記範囲であれば、培養生産性に優れる。PHAの重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)(昭和電工製「Shodex GPC-101」)によって、カラムにポリスチレンゲル(昭和電工製「Shodex K-804」)を用い、クロロホルムを移動相とし、ポリスチレン換算した場合の分子量として求めることができる。
本発明の一実施形態において、前記工程(a)で得られた培養液の固形分濃度は、好ましくは、20~40重量%であり、より好ましくは、25~40重量%であり、さらに好ましくは、30~40重量%である。前記工程(a)で得られた培養液の固形分濃度が前記範囲であれば、十分な量のPHAを得ることができる。
<菌体>
工程(a)で用いられる菌体は、細胞内にPHAを生成し得る微生物である限り、特に限定されない。例えば、天然から単離された微生物および菌株の寄託機関(例えば、IFO、ATCC等)に寄託されている微生物、またはそれらから調製し得る変異体および形質転換体等を使用できる。例えば、PHAの一例であるP3HBを生成する菌体としては、1925年に発見されたBacillus megateriumが最初で、他にもカプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)(旧分類:アルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligenes eutrophus)、ラルストニア・ユートロフア(Ralstonia eutropha))、アルカリゲネス・ラタス(Alcaligenes latus)等の天然微生物が挙げられる。これらの微生物ではPHAが菌体内に蓄積されることが知られている。
工程(a)で用いられる菌体は、細胞内にPHAを生成し得る微生物である限り、特に限定されない。例えば、天然から単離された微生物および菌株の寄託機関(例えば、IFO、ATCC等)に寄託されている微生物、またはそれらから調製し得る変異体および形質転換体等を使用できる。例えば、PHAの一例であるP3HBを生成する菌体としては、1925年に発見されたBacillus megateriumが最初で、他にもカプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)(旧分類:アルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligenes eutrophus)、ラルストニア・ユートロフア(Ralstonia eutropha))、アルカリゲネス・ラタス(Alcaligenes latus)等の天然微生物が挙げられる。これらの微生物ではPHAが菌体内に蓄積されることが知られている。
また、PHAの一例である、ヒドロキシブチレートとその他のヒドロキシアルカノエートとの共重合体を生成する菌体としては、P3HB3HVおよびP3HB3HH生産菌であるアエロモナス・キヤビエ(Aeromonas caviae)、P3HB4HB生産菌であるアルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligenes eutrophus)等が挙げられる。特に、P3HB3HHに関し、P3HB3HHの生産性を上げるために、PHA合成酵素群の遺伝子を導入したアルカリゲネス・ユートロファス AC32株(Alcaligenes eutrophus AC32, FERM BP-6038)(T.Fukui,Y.Doi,J.Bateriol.,179,p4821-4830(1997))等がより好ましい。また、菌体は、上記以外にも、生産したいPHAに合わせて、各種PHA合成関連遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物であっても良い。
また、PHAは、例えば、国際公開第2010/013483号公報に記載された方法によっても製造され得る。PHAの市販品としては、例えば、株式会社カネカ「カネカ生分解性ポリマーPHBH(登録商標)」(例えば、実施例で使用されるX131A、151C)等が挙げられる。
なお、本明細書において、上述した細胞内にPHAを生成し得る微生物を、「PHA生産菌」と称する場合もある。
(工程(b))
本製造方法における工程(b)は、前記工程(a)で得られた培養液に酸化剤を添加し、かつ、pHを10.5~13.0に調整し、30~75℃で維持する工程である。なお、本明細書において、「粘度」とは、実施例に記載の方法により測定された「50℃ 100 1/sでのせん断粘度」を意図する。また、工程(b)およびそれ以降の工程で得られる、PHAを含む水性懸濁液を、「PHA水性懸濁液」と略して表記する場合がある。
本製造方法における工程(b)は、前記工程(a)で得られた培養液に酸化剤を添加し、かつ、pHを10.5~13.0に調整し、30~75℃で維持する工程である。なお、本明細書において、「粘度」とは、実施例に記載の方法により測定された「50℃ 100 1/sでのせん断粘度」を意図する。また、工程(b)およびそれ以降の工程で得られる、PHAを含む水性懸濁液を、「PHA水性懸濁液」と略して表記する場合がある。
工程(b)により、得られる培養液の粘度を低下させることができる。培養液の粘度を低下させることにより、工業用水等による希釈を必要としないため、後述する工程(c)において使用する酵素の量を低減が可能になり、PHAの製造コストが低下する。また、PHAの重量平均分子量を調整することにより、所望の重量平均分子量のPHAを製造することが可能となる。
前記酸化剤としては、特に限定されないが、例えば、過酸化水素(H2O2)、オゾン;過酸化ナトリウム(Na2O2)、過ホウ酸ナトリウム(Na2H4B2O8)、過炭酸ナトリウム(Na2H3CO6)、過硫酸ナトリウム(Na2S2O8)等の他の無機過酸化物;亜塩素酸塩、塩素酸塩、メタクロロ過安息香酸(C7H5CIO3)過塩素酸塩、過塩素酸(CIO4)、二酸化塩素(CIO2)等の類似のハロゲン化合物;過ギ酸(CH2O3)、過酢酸(CH3CO3H)等の過酸;過マンガン酸カリウム等の過マンガン酸化合物;過ホウ酸ナトリウム;硝酸カリウム(KNO3);ビスマス酸ナトリウム;硝酸セリウムアンモニウム、硫酸セリウム等のセリウム(IV)化合物等が挙げられる。
上述した中でも、入手が容易である観点から、酸化剤は、過酸化水素またはオゾンであることが好ましい。
工程(b)において、培養液中の過酸化水素の濃度は、例えば、0.2~30重量%であり、好ましくは、0.2~15重量%であり、より好ましくは、0.2~10重量%である。0.2重量%以上であれば、PHA水性懸濁液の粘度を低下させることができる。また、30重量%以下であれば、PHA製造コストを抑えることができる。工程(b)において、上記の濃度となるように、過酸化水素を添加し得る。
また、工程(b)において、オゾンの添加量は、例えば、PHAを含有するバイオマス1gにつき、0.01~0.1gであり、好ましくは、0.02~0.08gであり、より好ましくは、0.02~0.07gである。0.01g以上であれば、PHA水性懸濁液の粘度を低下させることができる。また、0.1g以下であれば、残存オゾン量が少量となる。
本発明の一実施形態において、過酸化水素を添加する場合、過酸化水素の添加とともに、NaHCO3を添加してもよい。NaHCO3により、過酸化水素の働きが補助されることが期待される。
また、本発明の一実施形態において過酸化水素を添加する場合、過酸化水素の添加とともに、キレート剤を添加してもよい。キレート剤の添加により、過酸化水素溶液を安定化させることができる。キレート剤としては、特に限定されないが、ケイ酸ナトリウム、EDTA、trans-1,2-シクロヘキサンジアミン四酢酸一水和物等が挙げられる。
工程(b)において、得られるPHA水性懸濁液の粘度、およびPHAの重量平均分子量を制御するために、好適なpHは、10.5~13.0であり、より好ましくは、pH10.6~12.9であり、さらに好ましくはpH10.7~12.8である。pHが10.5以上であれば、PHA水性懸濁液の粘度が低下し、ハンドリング性が向上する。また、pHが13.0以下であれば、PHAの重量平均分子量を調整するための時間が十分に得られる。pHの調整は、例えば、アルカリ水溶液を添加することによって行ってもよい。
本発明の一実施形態において、アルカリ水溶液は、塩基性化合物を含む水溶液である。アルカリ水溶液に含まれる塩基性化合物としては、特に限定されないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物;炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の金属炭酸塩;リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム等の金属リン酸塩または金属リン酸水素塩等が挙げられる。
本発明の一実施形態において、アルカリ水溶液に含まれる塩基性化合物は、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物が好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。塩基性化合物は、1種を単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
工程(b)において、酸化剤の添加と、pHの調整とを行う順番は特に限定されないが、効率的にpHを低下させる観点から酸化剤を添加した後に、pHの調整を行うことが好ましい。
工程(b)において、PHA水性懸濁液の粘度およびPHAの重量平均分子量を制御するために、培養液の温度は、30℃~75℃であり、好ましくは、35℃~70℃であり、より好ましくは40℃~65℃である。培養液の温度が30℃以上であれば、PHA重量平均分子量を調整するための時間が必要以上にならず、80℃以下であれば十分な調整時間を得られる。
工程(b)において得られるPHA水性懸濁液は、ニュートン流体となっていることが好ましい。PHA水性懸濁液がニュートン流体であれば、粘度のせん断速度依存性が低いため、撹拌装置内においてPHA水性懸濁液が均一になりやすく、ハンドリング性が向上する。
本発明の一実施形態において、工程(b)において、調整したpHを、好ましくは、0.1~30時間、より好ましくは、0.25~24時間、さらに好ましくは、0.5~15時間維持する工程を含む。工程(b)では、培養液中のPHAの分解に伴い、培養液のpHが徐々に下がっていく。したがって、工程(b)において、培養液のpHを維持することにより、得られるPHA水性懸濁液の粘度をより低下させることができる。
上記pHの維持工程において、調整したpHを維持する方法は特に限定されず、例えば、アルカリ水溶液の添加により行われる。アルカリ水溶液は、特に限定されないが、例えば、上述したアルカリ水溶液が使用される。
また、本発明の一実施形態において、上記pHの維持工程における温度は、特に限定されないが、例えば、30~80℃であり、好ましくは、30~75℃である。
また、本発明の一実施形態において、前記工程(b)において、pHを所定時間、所定温度で維持したのち、30~75℃で0.5~30時間維持する工程を含んでもよい。上述した通り、PHAの分解により培養液のpHは徐々に下がっていくため、30~75℃で0.5~30時間維持する工程を含むことにより、後の段階で中和工程を簡略化することができる。
本発明の一実施形態において、前記工程(b)で得られたPHA水性懸濁液中のPHAの重量平均分子量は、好ましくは、10万~80万であり、より好ましくは、20万~80万であり、さらに好ましくは、40万~80万である。重量平均分子量が10万以上であると、十分な機械物性等が得られ、80万以下であると、十分な結晶化速度が得られ、良好な成形加工性が達成される。
本発明の一実施形態において、前記工程(b)で得られた水性懸濁液の固形分濃度は、好ましくは20~40重量%であり、より好ましくは25~40重量%であり、さらに好ましくは30~40重量%である。前記工程(b)で得られた水性懸濁液の固形分濃度が前記範囲であれば、十分な量のPHAを得ることができる。
本発明の一実施形態において、本製造方法は、さらに、以下の工程(c)~(d)を含んでいてもよい:
・工程(c):前記工程(b)で得られた水性懸濁液に酵素を添加して、前記菌体を酵素処理する工程
・工程(d):前記工程(c)で得られた水性懸濁液に、界面活性剤およびアルカリ水溶液を添加して、pHを10.0~12.0に調整する工程。
・工程(c):前記工程(b)で得られた水性懸濁液に酵素を添加して、前記菌体を酵素処理する工程
・工程(d):前記工程(c)で得られた水性懸濁液に、界面活性剤およびアルカリ水溶液を添加して、pHを10.0~12.0に調整する工程。
(工程(c))
本製造方法における工程(c)は、前記工程(b)で得られた水性懸濁液に酵素を添加して、前記菌体を酵素処理する工程である。工程(c)により、前記菌体由来の不純物(細胞壁、タンパク質等)を破壊および除去することで、前記菌体からPHAを効率的に回収できる。
本製造方法における工程(c)は、前記工程(b)で得られた水性懸濁液に酵素を添加して、前記菌体を酵素処理する工程である。工程(c)により、前記菌体由来の不純物(細胞壁、タンパク質等)を破壊および除去することで、前記菌体からPHAを効率的に回収できる。
本発明の一実施形態において、工程(c)の酵素処理は、溶菌酵素処理および/またはアルカリ性タンパク質分解酵素処理であり得る。溶菌酵素処理およびアルカリ性タンパク質分解酵素処理は、少なくとも1回ずつ行うことが好ましく、必要に応じて、溶菌酵素処理および/またはアルカリ性タンパク質分解酵素処理は、2回以上行ってもよい。
本発明の一実施形態において、溶菌酵素処理および/またはアルカリ性タンパク質分解酵素処理を行う順序は特に限定されない。
工程(c)において、酵素処理(例えば、溶菌酵素処理およびアルカリ性タンパク質分解酵素処理)を行う際には、使用する酵素の至適pHおよび至適温度に合わせて前記培養液のpHおよび温度を調整することが好ましい。前記培養液のpHおよび温度の調整方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
工程(c)において、界面活性剤を添加する工程を含んでもよい。工程(c)において界面活性剤の添加は、アルカリ性タンパク質分解酵素の添加前、添加と同時、添加後のいずれにおいても行うことができる。好ましくは、アルカリ性タンパク質分解酵素の添加後である。工程(c)において界面活性剤を添加することにより、菌体由来の不純物(核酸、タンパク質等)を分散および溶解させ、高純度のPHAを菌体から分離することができる。
<溶菌酵素処理>
本発明の一実施形態において、溶菌酵素処理とは、溶菌酵素を前記培養液に添加し、前記菌体を酵素処理する工程である。
本発明の一実施形態において、溶菌酵素処理とは、溶菌酵素を前記培養液に添加し、前記菌体を酵素処理する工程である。
本明細書において、「溶菌酵素」とは、菌体の細胞壁(例えば、ペプチドグリカン)を分解する(溶菌する)活性を有する酵素を意図する。
本発明の一実施形態において、溶菌酵素は特に限定されず、例えば、リゾチーム、ラビアー、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、エンドリシン、オートリシン等が挙げられる。経済的に有利であるとの観点から、リゾチームが好ましい。これらの1種類を単独で使用してもよく、2種類以上を組み合わせて使用してもよい。
溶菌酵素としては、市販品を用いることもでき、例えば、富士フイルム和光純薬株式会社製「リゾチーム」、「アクロモペプチダーゼ」等が挙げられる。
本発明の一実施形態において、溶菌酵素の至適pHは、当該溶菌酵素が細胞壁分解活性を有する限り特に限定されないが、例えば、5.0~11.0であり、好ましくは6.0~9.0であり、より好ましくは6.0~8.0である。
本発明の一実施形態において、溶菌酵素の至適温度は特に限定されないが、過度の加温を必要とせず、PHAの熱変化(熱分解)を防ぐことができるとの観点から、60℃以下が好ましく、50℃以下がさらに好ましい。至適温度の下限は特に限定されないが、過度の冷却操作が必要なく、経済的であるとの観点から、室温(例えば25℃)以上であることが好ましい。
<アルカリ性タンパク質分解酵素処理>
本明細書において、「アルカリ性タンパク質分解酵素」とは、アルカリ環境下(例えばpH8.5の溶液中)でタンパク質を分解する活性を有するタンパク質分解酵素を意図する。
本明細書において、「アルカリ性タンパク質分解酵素」とは、アルカリ環境下(例えばpH8.5の溶液中)でタンパク質を分解する活性を有するタンパク質分解酵素を意図する。
また、本明細書において、「アルカリ性タンパク質分解酵素処理」とは、前記アルカリ性タンパク質分解酵素を前記培養液に添加し、菌体を酵素処理する工程を意図する。
本発明の一実施形態において、アルカリ性タンパク質分解酵素は、アルカリ環境下でタンパク質を分解する活性を有する限り特に限定されず、例えば、セリン特異的タンパク質分解酵素(例えば、サブチリシン、キモトリプシン、トリプシン)、システイン特異的タンパク質分解酵素(例えばパパイン、プロメライン、カテプシン)、アスパラギン酸特異的タンパク質分解酵素(例えば、ペプシン、カテプシンD、HIVプロテアーゼ)等が挙げられる。経済的に有利であるとの観点から、セリン特異的タンパク質分解酵素、とりわけ、サブチリシン(例えば、アルカラーゼ)が好ましい。これらの1種類を単独で使用してもよく、2種類以上を組み合わせて使用してもよい。
アルカリ性タンパク質分解酵素としては、市販品を用いることもでき、例えば、Novozyme社製「アルカラーゼ2.5L」;天野エンザイム株式会社社製「プロチンSD-AY10」および「プロテアーゼP「アマノ」3SD」;ダニスコジャパン株式会社製「マルチフェクトPR6L」および「オプチマーゼPR89L」;新日本化学工業株式会社製「スミチームMP」;ディー・エス・エムジャパン株式会社製「デルボラーゼ」;ナガセケムテックス株式会社製「ビオプラーゼOP」、「ビオプラーゼSP-20FG」および「ビオプラーゼSP-4FG」;HBI株式会社製「オリエンターゼ22BF」;ヤクルト薬品工業株式会社製「アロアーゼXA-10」;Novozyme社製「エスペラーゼ」等が挙げられる。
本発明の一実施形態において、アルカリ性タンパク質分解酵素の至適pHは、当該アルカリ性タンパク質分解酵素がアルカリ環境下で活性を有する限り特に限定されないが、例えば8.0~14.0であり、好ましくは8.0~12.0であり、より好ましくは8.0~10.0であり、さらに好ましくは8.0~9.0であり、最も好ましくは8.5である。
本発明の一実施形態において、アルカリ性タンパク質分解酵素の至適温度は、特に限定されないが、過度の加温を必要とせず、P3HAの熱変化(熱分解)を防ぐことができるとの観点から、60℃以下が好ましく、50℃以下がさらに好ましい。至適温度の下限は、特に限定されないが、過度の冷却操作が必要なく、経済的であるとの観点から、室温(例えば、25℃)以上であることが好ましい。
本発明の一実施形態において、工程(c)の酵素処理は、リゾチームおよびアルカラーゼの組み合わせにより行われ得る。
(工程(d))
本製造方法における工程(d)は、前記工程(c)で得られた水性懸濁液に、界面活性剤およびアルカリ水溶液を添加して、pHを10.0~12.0に調整する工程である。工程(d)は、下記の工程(d1)および工程(d2)を含むことが好ましい。
・工程(d1):前記工程(c)で得られた培養液にアルカリ水溶液を添加してpHを10.0~12.0に調整する工程
・工程(d2):界面活性剤を添加する工程
<工程(d1)>
工程(d1)は、上述の通り、前記工程(c)で得られたPHA水性懸濁液にアルカリ水溶液を添加してpHを10.0~12.0に調整する工程である。工程(d1)により、菌体由来の不純物(核酸、タンパク質等)を分散および溶解することで、高純度のPHAを菌体から分離することができる。
本製造方法における工程(d)は、前記工程(c)で得られた水性懸濁液に、界面活性剤およびアルカリ水溶液を添加して、pHを10.0~12.0に調整する工程である。工程(d)は、下記の工程(d1)および工程(d2)を含むことが好ましい。
・工程(d1):前記工程(c)で得られた培養液にアルカリ水溶液を添加してpHを10.0~12.0に調整する工程
・工程(d2):界面活性剤を添加する工程
<工程(d1)>
工程(d1)は、上述の通り、前記工程(c)で得られたPHA水性懸濁液にアルカリ水溶液を添加してpHを10.0~12.0に調整する工程である。工程(d1)により、菌体由来の不純物(核酸、タンパク質等)を分散および溶解することで、高純度のPHAを菌体から分離することができる。
工程(d1)において、アルカリ水溶液は、(工程(b))の項の記載が援用される。
工程(d1)において、アルカリ水溶液を添加することにより、pHを10.0~12.0に調整することが好ましく、pHを10.2~11.8に調整することがより好ましく、10.4~11.6に調整することがさらに好ましい。pHを10.0以上に調整することで、菌体成分の分解および溶解ができるという利点を有する。また、pHを12.0以下に調整することで、意図しない菌体の損傷を防ぐことができる。
工程(d1)における温度は、100℃未満であることが好ましく、80℃未満であることがより好ましい。下限は特に限定されないが、例えば、40℃以上であることが好ましい。
<工程(d2)>
工程(d2)は、培養液に界面活性剤を添加する工程である。工程(d2)により、前記菌体に含まれる不純物、特に細胞膜を効率的に処理することができ、菌体由来の不純物をより多く除去できるため、より高純度のPHAを菌体から分離することができる。
工程(d2)は、培養液に界面活性剤を添加する工程である。工程(d2)により、前記菌体に含まれる不純物、特に細胞膜を効率的に処理することができ、菌体由来の不純物をより多く除去できるため、より高純度のPHAを菌体から分離することができる。
本発明の一実施形態において、界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤等が挙げられる。このうち、細胞膜の除去能力が高いとの観点から、陰イオン界面活性が好ましい。これらの1種類を単独で使用してもよく、2種類以上を組み合わせて使用してもよい。
陰イオン界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルケニル硫酸エステル塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルケニルエーテル硫酸エステル塩、α-オレフィンスルホン酸塩、α-スルホ脂肪酸塩、α-スルホ脂肪酸塩のエステル、アルキルエーテルカルボン酸塩、アルケニルエーテルカルボン酸塩、アミノ酸型界面活性剤、N-アシルアミノ酸型界面活性剤等が挙げられる。この中でも、アルキル硫酸エステル塩が好ましく、細胞膜の除去能力が高く、安価であるとの観点から、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)が特に好ましい。これらの1種類を単独で使用してもよく、2種類以上を組み合わせて使用してもよい。
工程(d2)において、添加する界面活性剤の量は特に限定されず、前記培養液に対して、例えば、0.1~5.0重量%であり、0.3~2.5重量%が好ましい。
工程(d2)は、工程(d1)の前に行ってもよいし、同時に行ってもよいし、後に行ってもよい。すなわち、工程(d)において、界面活性剤およびアルカリ水溶液の添加は、アルカリ水溶液を添加しpH調整を行った後、界面活性剤を添加してもよいし、界面活性剤およびアルカリ水溶液を同時に添加しpH調整を行ってもよいし、界面活性剤の添加の後、アルカリ水溶液を添加しpH調整を行ってもよい。
<工程(e)>
本発明の一実施形態において、本製造方法は、工程(e)をさらに含み得る。
本発明の一実施形態において、本製造方法は、工程(e)をさらに含み得る。
工程(e)は、前記工程(d)で得られたPHA水性懸濁液を遠心分離し、上清を除去して、PHAが濃縮されたPHA水性懸濁液を得る工程である。すなわち、菌体から分離したPHAから不純物を除去し、濃縮および精製する工程である。
工程(e)において、前記培養液を遠心分離する方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
工程(e)において、前記培養液を遠心分離し、上清を除去した後、沈降物に溶液を添加し、再度遠心分離および上清を除去する工程を繰り返し行うことが好ましい。この操作により、より濃縮および精製されたPHA水性懸濁液を得ることができる。ここで、上清を除去した後に添加する溶液は、前記培養液と同じpHに調整されたアルカリ水溶液であることが好ましい。本発明の一実施形態において、前記溶液は、前記工程(d)において使用したアルカリ水溶液と同じであることが好ましい。
工程(e)により、最終製品に残留する不純物量が概ね決定されるこれらの不純物は、できる限り低減させた方が好ましい。当然に、用途によっては、最終製品の物性を損なわない限り不純物が混入しても構わないが、医療用用途等、高純度のPHAが必要とされる場合は、できる限り不純物を低減させることが好ましい。その際の精製度の指標としては、例えば、PHA水性懸濁液中に残留しているタンパク質量(残タンパク質量)が挙げられる。PHA水性懸濁液中のタンパク質量は、PHA粉体の残タンパク質量を達成できる量であれば、特に限定されない。当該タンパク質量は、好ましくは、PHA水性懸濁液中のPHA重量当たり3000ppm以下、より好ましくは、2500ppm以下、さらに好ましくは、2000ppm以下である。
工程(e)において、PHA水性懸濁液を構成する溶媒(「溶媒」は、「水性媒体」とも称する。)は、特に限定されず、水、または水と有機溶媒との混合溶媒であってもよい。また、当該混合溶媒において、有機溶媒の濃度は、使用する有機溶媒の水への溶解度以下であれば特に限定されない。また、有機溶媒は特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、2-ブタノール、iso-ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール等のアルコール類;アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類;テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類;アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類;ジメチルホルムアミド、アセトアミド等のアミド類;ジメチルスルホキシド、ピリジン、ピペリジン等が挙げられる。中でも、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、2-ブタノール、iso-ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、プロピオニトリル等が、除去しやすい点から好ましい。また、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、ブタノール、アセトン等が、入手容易であることからより好ましい。さらに、メタノール、エタノール、アセトンが、特に好ましい。
PHA水性懸濁液を構成する水性媒体中の水の含有量は、5重量%以上が好ましく、より好ましくは、10重量%以上であり、さらに好ましくは、30重量%以上であり、特に好ましくは、50重量%以上である。
なお、工程(e)におけるPHA水性懸濁液体は、本発明の本質を損なわない限り、他の溶媒、菌体由来の成分、精製時に発生する化合物等を含んでいても構わない。
〔3.ポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液〕
本PHA水性懸濁液は、過酸化水素とポリヒドロキシアルカン酸とを含み、50℃ 100 1/sでのせん断粘度が、1~10mPa・sである、PHAの水性懸濁液である。本PHA水性懸濁液は、低粘度であるため、ハンドリング性に優れ、効率的にPHAを製造することができる。
本PHA水性懸濁液は、過酸化水素とポリヒドロキシアルカン酸とを含み、50℃ 100 1/sでのせん断粘度が、1~10mPa・sである、PHAの水性懸濁液である。本PHA水性懸濁液は、低粘度であるため、ハンドリング性に優れ、効率的にPHAを製造することができる。
本PHA水性懸濁液の50℃ 100 1/sでのせん断粘度は、1~10mPa・sであり、1~9mPa・sが好ましく、1~8mPa・sがより好ましい。また、本PHA水性懸濁液の50℃ 10 1/sでのせん断粘度は、例えば、1~20mPa・sであり、1~18mPa・sが好ましく、1~15mPa・sがより好ましい。本PHA水性懸濁液のせん断粘度が上記の範囲であると、ハンドリング性に優れるという利点を有する。本PHA水性懸濁液のせん断粘度は、実施例に記載の方法により測定される。
本発明の一実施形態において、本PHA水性懸濁液の固形分濃度は、例えば、20~40重量%であり、好ましくは、25~40重量%である。水性懸濁液の固形分濃度が20~40重量%であると、通常は、水性懸濁液の粘度が高いために、その後の精製処理が困難になる。しかしながら、本PHA水性懸濁液では、このような高い固形分濃度であったとしても、過酸化水素を含むことにより、粘度の上昇を抑えた水性懸濁液を提供できる。本PHA水性懸濁液の固形分濃度は、実施例に記載の方法により測定される。
本PHA水性懸濁液に含まれるPHAの重量平均分子量は例えば、10万~80万であり、好ましくは、10万~80万であり、より好ましくは、20万~80万であり、さらに好ましくは、40万~80万である。重量平均分子量が10万以上であると、十分な機械物性等が得られ、80万以下であると、十分な結晶化速度が得られ、良好な成形加工性が達成される。
本PHA水性懸濁液の過酸化水素の濃度は、例えば、0.2~30重量%であり、好ましくは、0.2~15重量%であり、より好ましくは、0.2~10重量%である。0.2重量%以上であれば、PHA水性懸濁液の粘度を低下させることができる。また、30重量%以下であれば、PHA製造コストを抑えることができる。
本PHA水性懸濁液は、本発明の効果を奏する限り、本製造方法の過程で生じた、または除去されなかった種々の成分を含んでいてもよい。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
すなわち、本発明の一態様は、以下を含む。
<1>(a)ポリヒドロキシアルカン酸を含有する菌体を含む培養液を40~80℃で維持する工程、および
(b)前記工程(a)で得られた培養液に酸化剤を添加し、かつ、pHを10.5~13.0に調整し、30~75℃で維持する工程、
を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<2>前記酸化剤は、過酸化水素水またはオゾンである、<1>に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<3>さらに、
(c)前記工程(b)で得られた水性懸濁液に酵素を添加して、前記菌体を酵素処理する工程、および
(d)前記工程(c)で得られた水性懸濁液に、界面活性剤およびアルカリ水溶液を添加して、pHを10.0~12.0に調整する工程
を含む、<1>または<2>に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<4>前記工程(a)で得られた培養液中のポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が150万~250万であり、
前記工程(a)で得られた培養液の固形分濃度が20~40重量%である、<1>~<3>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<5>
前記工程(b)において、調整したpHを0.1~30時間維持する工程を含む、<1>~<4>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<6>
前記工程(b)で得られた水性懸濁液中のポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が10万~80万であり、
前記工程(b)で得られた水性懸濁液の固形分濃度が20~40重量%である、請求項<1>~<5>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<7>前記工程(b)において、前記培養液に過酸化水素を添加する場合、前記培養液中の過酸化水素の濃度が、0.2~30重量%となるように添加する、<1>~<6>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<8>前記工程(c)における酵素が、溶菌酵素、および/またはアルカリ性タンパク質分解酵素である、<3>~<7>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<9>前記工程(c)において、界面活性剤を添加する工程を含む、<3>~<8>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<10>過酸化水素とポリヒドロキシアルカン酸とを含み、50℃ 100 1/sでのせん断粘度が、1~10mPa・sである、ポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液。
<11>固形分濃度が20~40重量%である、<10>に記載のポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液。
<12>前記ポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が10万~80万である、<10>または<11>に記載のポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液。
<13>前記過酸化水素の濃度が0.2~30重量%である、<10>~<12>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液。
<1>(a)ポリヒドロキシアルカン酸を含有する菌体を含む培養液を40~80℃で維持する工程、および
(b)前記工程(a)で得られた培養液に酸化剤を添加し、かつ、pHを10.5~13.0に調整し、30~75℃で維持する工程、
を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<2>前記酸化剤は、過酸化水素水またはオゾンである、<1>に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<3>さらに、
(c)前記工程(b)で得られた水性懸濁液に酵素を添加して、前記菌体を酵素処理する工程、および
(d)前記工程(c)で得られた水性懸濁液に、界面活性剤およびアルカリ水溶液を添加して、pHを10.0~12.0に調整する工程
を含む、<1>または<2>に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<4>前記工程(a)で得られた培養液中のポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が150万~250万であり、
前記工程(a)で得られた培養液の固形分濃度が20~40重量%である、<1>~<3>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<5>
前記工程(b)において、調整したpHを0.1~30時間維持する工程を含む、<1>~<4>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<6>
前記工程(b)で得られた水性懸濁液中のポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が10万~80万であり、
前記工程(b)で得られた水性懸濁液の固形分濃度が20~40重量%である、請求項<1>~<5>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<7>前記工程(b)において、前記培養液に過酸化水素を添加する場合、前記培養液中の過酸化水素の濃度が、0.2~30重量%となるように添加する、<1>~<6>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<8>前記工程(c)における酵素が、溶菌酵素、および/またはアルカリ性タンパク質分解酵素である、<3>~<7>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<9>前記工程(c)において、界面活性剤を添加する工程を含む、<3>~<8>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
<10>過酸化水素とポリヒドロキシアルカン酸とを含み、50℃ 100 1/sでのせん断粘度が、1~10mPa・sである、ポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液。
<11>固形分濃度が20~40重量%である、<10>に記載のポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液。
<12>前記ポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が10万~80万である、<10>または<11>に記載のポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液。
<13>前記過酸化水素の濃度が0.2~30重量%である、<10>~<12>のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液。
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、実施例において、「PHA」としては「PHBH」を用いており、「PHA」を「PHBH」と読み替えることができる。
〔測定方法〕
実施例および比較例における測定を、以下の方法で行った。
実施例および比較例における測定を、以下の方法で行った。
(PHA水性懸濁液のせん断粘度)
PHA水性懸濁液の粘度は、以下の方法により測定した。具体的には、Anton Paar社製のMCR302を用いて、同軸2重円筒にて粘度を測定した。PHA水性懸濁液を20mL円筒に投入し、液温度は50℃に調整した。目的せん断速度到達後、トルクの時間変化が1%未満になった際の粘度を測定した。
PHA水性懸濁液の粘度は、以下の方法により測定した。具体的には、Anton Paar社製のMCR302を用いて、同軸2重円筒にて粘度を測定した。PHA水性懸濁液を20mL円筒に投入し、液温度は50℃に調整した。目的せん断速度到達後、トルクの時間変化が1%未満になった際の粘度を測定した。
(残タンパク質量)
PHA粉体の残タンパク質量は、BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて測定した。具体的には、10mgのPHBH粉体を15mLのファルコンチューブに投入し、上記キットの試薬2mLを添加した後、60℃で30分間振とうした。振とう終了から30分後に25℃に冷却し、562nmの波長の吸光度を測定した。
PHA粉体の残タンパク質量は、BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて測定した。具体的には、10mgのPHBH粉体を15mLのファルコンチューブに投入し、上記キットの試薬2mLを添加した後、60℃で30分間振とうした。振とう終了から30分後に25℃に冷却し、562nmの波長の吸光度を測定した。
(重量平均分子量)
不活化後のPHAを含む培養液を蒸留水で希釈し、遠心分離を行った後、上清を除去した。得られた沈殿物(PHA)にエタノールを加え、エタノールに分散させた後、遠心分離を行った。上清を除去し、真空乾燥器により1時間以上乾燥させ、沈殿物を完全に乾燥させ、乾燥体(PHA粉体)を得た。得られたPHA粉体10mgを、クロロホルム10mLに溶解させた後、不溶物を濾過により除いた。この溶液(濾液)を、「Shodex K805L(300×8mm、2本連結)」(昭和電工社製)を装着した島津製作所製のGPCシステムを用い、クロロホルムを移動相として初期分子量を測定した。分子量標準サンプルには、昭和電工(株)製Shodex K-804(ポリスチレンゲル)を用いた。
不活化後のPHAを含む培養液を蒸留水で希釈し、遠心分離を行った後、上清を除去した。得られた沈殿物(PHA)にエタノールを加え、エタノールに分散させた後、遠心分離を行った。上清を除去し、真空乾燥器により1時間以上乾燥させ、沈殿物を完全に乾燥させ、乾燥体(PHA粉体)を得た。得られたPHA粉体10mgを、クロロホルム10mLに溶解させた後、不溶物を濾過により除いた。この溶液(濾液)を、「Shodex K805L(300×8mm、2本連結)」(昭和電工社製)を装着した島津製作所製のGPCシステムを用い、クロロホルムを移動相として初期分子量を測定した。分子量標準サンプルには、昭和電工(株)製Shodex K-804(ポリスチレンゲル)を用いた。
(固形分濃度)
不活化後のPHAを含む培養液の固形分濃度を、加熱乾燥式水分計ML-50(株式会社A&D製)を用いて測定した。前記培養液を130℃で加熱し、重量変化速度が0.05%/分を下回るまで加熱し、加熱前後の重量変化から固形分濃度を割り出した。
不活化後のPHAを含む培養液の固形分濃度を、加熱乾燥式水分計ML-50(株式会社A&D製)を用いて測定した。前記培養液を130℃で加熱し、重量変化速度が0.05%/分を下回るまで加熱し、加熱前後の重量変化から固形分濃度を割り出した。
(過酸化水素濃度)
分子量調整後のPHAを含む培養液を遠心分離した後、上清を1ml分取し、「パックテスト 過酸化水素(高濃度)」(共立理化学研究所製)の測定チューブを用いて、過酸化水素濃度を測定した。
分子量調整後のPHAを含む培養液を遠心分離した後、上清を1ml分取し、「パックテスト 過酸化水素(高濃度)」(共立理化学研究所製)の測定チューブを用いて、過酸化水素濃度を測定した。
〔実施例1〕
(菌体培養液の調製)
国際公開第WO2019/142717号に記載のラルストニア・ユートロファを、同文献の段落〔0041〕~〔0048〕に記載の方法で培養し、PHAを含有する菌体を含む菌体培養液を得た。なお、ラルストニア・ユートロファは、現在では、カプリアビダス・ネカトールに分類されている。PHAの繰り返し単位の組成比(3HB単位/3HH単位の組成比)は85/15~92/8(mol/mol)であった。
(菌体培養液の調製)
国際公開第WO2019/142717号に記載のラルストニア・ユートロファを、同文献の段落〔0041〕~〔0048〕に記載の方法で培養し、PHAを含有する菌体を含む菌体培養液を得た。なお、ラルストニア・ユートロファは、現在では、カプリアビダス・ネカトールに分類されている。PHAの繰り返し単位の組成比(3HB単位/3HH単位の組成比)は85/15~92/8(mol/mol)であった。
(工程(a))(不活化)
上記で得られた菌体培養液を、内温60~70℃で7時間加熱および攪拌処理することにより滅菌処理を行い、不活化培養液を得た。不活化培養液中のPHAの重量平均分子量は、180万であった。また、不活化培養液の固形分濃度は、30重量%であった。
上記で得られた菌体培養液を、内温60~70℃で7時間加熱および攪拌処理することにより滅菌処理を行い、不活化培養液を得た。不活化培養液中のPHAの重量平均分子量は、180万であった。また、不活化培養液の固形分濃度は、30重量%であった。
(工程(b))(粘度低下処理)
上記で得られた不活化培養液に過酸化水素(富士フィルム和光純薬製)を添加して、表1に記載の濃度とした。次いで、30%水酸化ナトリウム水溶液を添加して、pHを11.0に調整した。溶液を60℃で維持しつつ、30%水酸化ナトリウム水溶液を添加し続けることにより、pHを11.0で表1に記載の時間維持し、PHA水性懸濁液を得た。結果を表1に示す。なお、粘度低下処理後の固形分濃度は、28~30重量%であった。
上記で得られた不活化培養液に過酸化水素(富士フィルム和光純薬製)を添加して、表1に記載の濃度とした。次いで、30%水酸化ナトリウム水溶液を添加して、pHを11.0に調整した。溶液を60℃で維持しつつ、30%水酸化ナトリウム水溶液を添加し続けることにより、pHを11.0で表1に記載の時間維持し、PHA水性懸濁液を得た。結果を表1に示す。なお、粘度低下処理後の固形分濃度は、28~30重量%であった。
〔比較例1〕
pH、過酸化水素濃度および反応時間を、表2に記載の通り変更した以外は実施例1と同様の方法で、PHA水性懸濁液を得た。結果を表2に示す。
pH、過酸化水素濃度および反応時間を、表2に記載の通り変更した以外は実施例1と同様の方法で、PHA水性懸濁液を得た。結果を表2に示す。
一方で、比較例1-1のPHA水性懸濁液は、実施例1-1~1-6のPHA水性懸濁液と比して粘度が高く、過酸化水素の添加が、粘度低下のために重要な要素であることがわかった。また、pHが10.0の場合、比較例1-2~1-6のPHA水性懸濁液は、実施例1-1~1-6のPHA水性懸濁液と比して粘度が高く、pHが粘度低下のために重要な要素であることがわかった。(比較例1-1)のPHAの重量平均分子量は180万であり、過酸化水素濃度0.99%で1時間反応させた場合(比較例1-4)のPHAの重量平均分子量は、160万であった。
〔実施例2〕
pH、過酸化水素濃度および反応時間を、表2に記載の通り変更した以外は実施例1と同様の方法で、PHA水性懸濁液を得た。結果を表2に示す。
pH、過酸化水素濃度および反応時間を、表2に記載の通り変更した以外は実施例1と同様の方法で、PHA水性懸濁液を得た。結果を表2に示す。
〔比較例2〕
過酸化水素濃度および反応時間を、表2に記載の通り変更した以外は実施例1と同様の方法で、PHA水性懸濁液を得た。結果を表2に示す。
過酸化水素濃度および反応時間を、表2に記載の通り変更した以外は実施例1と同様の方法で、PHA水性懸濁液を得た。結果を表2に示す。
〔実施例3〕
pH、過酸化水素濃度および反応時間を、表3に記載の通り変更した以外は実施例1と同様の方法で、PHA水性懸濁液を得た。結果を表3に示す。
pH、過酸化水素濃度および反応時間を、表3に記載の通り変更した以外は実施例1と同様の方法で、PHA水性懸濁液を得た。結果を表3に示す。
〔実施例4〕
過酸化水素濃度、反応温度および反応時間を、表4に記載の通り変更した以外は実施例1と同様の方法で、PHA水性懸濁液を得た。結果を表4に示す。
過酸化水素濃度、反応温度および反応時間を、表4に記載の通り変更した以外は実施例1と同様の方法で、PHA水性懸濁液を得た。結果を表4に示す。
〔実施例5〕
(工程(c))(酵素処理)
実施例1-3のPHA水性懸濁液に対し10%硫酸を添加してpHを7.0±0.2に調整した。硫酸を添加したPHA水性懸濁液の固形分濃度を測定したところ、30重量%であった。硫酸添加後、細胞壁中の糖鎖(ペプチドグリカン)を分解する酵素であるリゾチーム(富士フイルム和光純薬製)を、液中濃度が10ppmとなるように添加して、50℃で2時間保持した。その後、タンパク質分解酵素であるアルカラーゼ2.5L(Novozyme社製)を、液中濃度が300ppmとなるように添加し、次いで、50℃で30%水酸化ナトリウムを添加して、pH8.5に調整しながら2時間維持した。
(工程(c))(酵素処理)
実施例1-3のPHA水性懸濁液に対し10%硫酸を添加してpHを7.0±0.2に調整した。硫酸を添加したPHA水性懸濁液の固形分濃度を測定したところ、30重量%であった。硫酸添加後、細胞壁中の糖鎖(ペプチドグリカン)を分解する酵素であるリゾチーム(富士フイルム和光純薬製)を、液中濃度が10ppmとなるように添加して、50℃で2時間保持した。その後、タンパク質分解酵素であるアルカラーゼ2.5L(Novozyme社製)を、液中濃度が300ppmとなるように添加し、次いで、50℃で30%水酸化ナトリウムを添加して、pH8.5に調整しながら2時間維持した。
(工程(d))(アルカリ処理)
前記酵素処理液に対して、0.6~1.0wt%になるようにドデシル硫酸ナトリウム(SDS、花王製)を添加した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて、pHが11.0±0.2となるように調整した。次いで、前記酵素処理液を遠心分離(4500rpm、10分間)した後、上清を除去して2倍濃縮したPHA水性懸濁液を得た。前記濃縮PHA水性懸濁液に、除去した上清と同量の水酸化ナトリウムを添加して再度遠心分離(4500rpm、10分間)して、上清を除去することを3回繰り返した。得られたPHA水性懸濁液中の残タンパク質濃度は、1217ppmであった。結果を表5に示す。
前記酵素処理液に対して、0.6~1.0wt%になるようにドデシル硫酸ナトリウム(SDS、花王製)を添加した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて、pHが11.0±0.2となるように調整した。次いで、前記酵素処理液を遠心分離(4500rpm、10分間)した後、上清を除去して2倍濃縮したPHA水性懸濁液を得た。前記濃縮PHA水性懸濁液に、除去した上清と同量の水酸化ナトリウムを添加して再度遠心分離(4500rpm、10分間)して、上清を除去することを3回繰り返した。得られたPHA水性懸濁液中の残タンパク質濃度は、1217ppmであった。結果を表5に示す。
〔実施例6〕
リゾチーム濃度を5ppm、アルカラーゼ2.5L濃度を150ppmとした以外は実施例5と同様の方法で、処理を行った。得られたPHA水性懸濁液中の残タンパク質濃度は、1645ppmであった。結果を表5に示す。
リゾチーム濃度を5ppm、アルカラーゼ2.5L濃度を150ppmとした以外は実施例5と同様の方法で、処理を行った。得られたPHA水性懸濁液中の残タンパク質濃度は、1645ppmであった。結果を表5に示す。
〔比較例3〕
不活化処理までは実施例1と同様の方法で処理を行い、pH11.0で1.5時間保持した。50℃、せん断速度10 1/sにおける粘度は、60.17mPa・sであり、ハンドリング性が悪かった。ハンドリング性を向上させるために、IW(工業用水)を添加して、固形分濃度が18%になるよう希釈した。その後の操作は、実施例5と同様の方法で処理を行った。得られたPHA水性懸濁液中の残タンパク質濃度は、1675ppmであった。結果を表5に示す。
不活化処理までは実施例1と同様の方法で処理を行い、pH11.0で1.5時間保持した。50℃、せん断速度10 1/sにおける粘度は、60.17mPa・sであり、ハンドリング性が悪かった。ハンドリング性を向上させるために、IW(工業用水)を添加して、固形分濃度が18%になるよう希釈した。その後の操作は、実施例5と同様の方法で処理を行った。得られたPHA水性懸濁液中の残タンパク質濃度は、1675ppmであった。結果を表5に示す。
また、実施例5、6は比較例3と比べて酵素による反応の反応速度が速かった。これは、PHA水性懸濁液の粘度が低いことによるものと推測される。これらの結果から、実施例5、6は、比較例3と比して、より少ない酵素量およびSDS量で、同程度あるいはより多い量のタンパク質(PHA)を生産可能であることがわかる。
〔実施例7〕
(工程(c))(酵素処理)
実施例1-3のPHA水性懸濁液に対し、アルカリ性タンパク質分解酵素であるエスペラーゼ(Novozymes社製)を液中濃度が100ppmとなるように添加した。次いで、50℃で30%水酸化ナトリウムを添加して、pH11.0に調整しながら2時間維持した。次いで、遠心分離(4500rpm、10分間)した後、上清を除去して2倍濃縮したPHA水性懸濁液を得た。前記濃縮PHA水性懸濁液に、除去した上清と同量の水酸化ナトリウムを添加しPHA水性懸濁液を得た。このPHA水性懸濁液に対し、10%硫酸を添加してpHを7.0±0.2に調整した。硫酸を添加したPHA水性懸濁液の固形分濃度を測定したところ、30重量%であった。硫酸添加後、細胞壁中の糖鎖を分解する酵素であるリゾチームを、液中濃度が10ppmとなるように添加して、50℃で2時間保持した。その後、タンパク質分解酵素であるアルカラーゼ2.5Lを、液中濃度が300ppmとなるように添加し、次いで、50℃で30%水酸化ナトリウムを添加して、pH8.5に調整しながら2時間維持した。
(工程(c))(酵素処理)
実施例1-3のPHA水性懸濁液に対し、アルカリ性タンパク質分解酵素であるエスペラーゼ(Novozymes社製)を液中濃度が100ppmとなるように添加した。次いで、50℃で30%水酸化ナトリウムを添加して、pH11.0に調整しながら2時間維持した。次いで、遠心分離(4500rpm、10分間)した後、上清を除去して2倍濃縮したPHA水性懸濁液を得た。前記濃縮PHA水性懸濁液に、除去した上清と同量の水酸化ナトリウムを添加しPHA水性懸濁液を得た。このPHA水性懸濁液に対し、10%硫酸を添加してpHを7.0±0.2に調整した。硫酸を添加したPHA水性懸濁液の固形分濃度を測定したところ、30重量%であった。硫酸添加後、細胞壁中の糖鎖を分解する酵素であるリゾチームを、液中濃度が10ppmとなるように添加して、50℃で2時間保持した。その後、タンパク質分解酵素であるアルカラーゼ2.5Lを、液中濃度が300ppmとなるように添加し、次いで、50℃で30%水酸化ナトリウムを添加して、pH8.5に調整しながら2時間維持した。
(工程(d))(アルカリ処理)
前記酵素処理液に対して、0.3~1.0wt%になるようにSDSを添加した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて、pHが11.0±0.2となるように調整し40℃で1時間反応させた。次いで、前記酵素処理液を遠心分離(4500rpm、10分間)した後、上清を除去して2倍濃縮したPHA水性懸濁液を得た。前記濃縮PHA水性懸濁液に、除去した上清と同量の水酸化ナトリウムを添加して再度遠心分離(4500rpm、10分間)して、上清を除去することを3回繰り返した。得られたPHA水性懸濁液中の残タンパク質濃度は、926ppmであった。
前記酵素処理液に対して、0.3~1.0wt%になるようにSDSを添加した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて、pHが11.0±0.2となるように調整し40℃で1時間反応させた。次いで、前記酵素処理液を遠心分離(4500rpm、10分間)した後、上清を除去して2倍濃縮したPHA水性懸濁液を得た。前記濃縮PHA水性懸濁液に、除去した上清と同量の水酸化ナトリウムを添加して再度遠心分離(4500rpm、10分間)して、上清を除去することを3回繰り返した。得られたPHA水性懸濁液中の残タンパク質濃度は、926ppmであった。
〔実施例8〕
実施例7においてエスペラーゼを添加しなかったことを除き、アルカリ処理まで同様の方法で処理を行った。得られたPHA水性懸濁液中の残タンパク質濃度は、1244ppmであった。
実施例7においてエスペラーゼを添加しなかったことを除き、アルカリ処理まで同様の方法で処理を行った。得られたPHA水性懸濁液中の残タンパク質濃度は、1244ppmであった。
〔まとめ〕
以上より、本製造方法によると、粘性が低く、ハンドリング性に優れたPHA水性懸濁液が得られること、および所望の重量平均分子量のPHAが得られることがわかった。また、当該PHA水性懸濁液は、精製処理に必要な資材量を低減することができ、コスト面でも有利であることがわかった。
以上より、本製造方法によると、粘性が低く、ハンドリング性に優れたPHA水性懸濁液が得られること、および所望の重量平均分子量のPHAが得られることがわかった。また、当該PHA水性懸濁液は、精製処理に必要な資材量を低減することができ、コスト面でも有利であることがわかった。
本製造方法は、簡便な操作でPHAを製造することができることから、PHAの製造において有利に使用できる。
Claims (13)
- (a)ポリヒドロキシアルカン酸を含有する菌体を含む培養液を40~80℃で維持する工程、および
(b)前記工程(a)で得られた培養液に酸化剤を添加し、かつ、pHを10.5~13.0に調整し、30~75℃で維持する工程、
を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。 - 前記酸化剤は、過酸化水素水またはオゾンである、請求項1に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- さらに、
(c)前記工程(b)で得られた水性懸濁液に酵素を添加して、前記菌体を酵素処理する工程、および
(d)前記工程(c)で得られた水性懸濁液に、界面活性剤およびアルカリ水溶液を添加して、pHを10.0~12.0に調整する工程
を含む、請求項1に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。 - 前記工程(a)で得られた培養液中のポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が150万~250万であり、
前記工程(a)で得られた培養液の固形分濃度が20~40重量%である、請求項1または3に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。 - 前記工程(b)において、調整したpHを0.1~30時間維持する工程を含む、請求項1または3に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 前記工程(b)で得られた水性懸濁液中のポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が10万~80万であり、
前記工程(b)で得られた水性懸濁液の固形分濃度が20~40重量%である、請求項1または3に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。 - 前記工程(b)において、前記培養液に過酸化水素を添加する場合、前記培養液中の過酸化水素の濃度が、0.2~30重量%となるように添加する、請求項1または3に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 前記工程(c)における酵素が、溶菌酵素、および/またはアルカリ性タンパク質分解酵素である、請求項3に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 前記工程(c)において、界面活性剤を添加する工程を含む、請求項3に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 過酸化水素とポリヒドロキシアルカン酸とを含み、50℃ 100 1/sでのせん断粘度が、1~10mPa・sである、ポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液。
- 固形分濃度が20~40重量%である、請求項10に記載のポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸の重量平均分子量が10万~80万である、請求項10に記載のポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液。
- 前記過酸化水素の濃度が0.2~30重量%である、請求項10に記載のポリヒドロキシアルカン酸の水性懸濁液。
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