WO2022005113A1 - 항－ＦｃＲｎ 항체에 대한 제형 - Google Patents

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WO2022005113A1
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hl161bkn
histidine
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안혜경
김영주
정미진
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Definitions

  • the present invention relates to formulations optimized for the anti-FcRn antibody HL161BKN.
  • autoimmune diseases have been studied for a long time from genetic, environmental and immunological viewpoints, but the cause of the disease is still unknown. Many recent studies have revealed that many autoimmune diseases are caused by IgG-type autoantibodies. In fact, in autoimmune disease diagnosis and treatment research, the relationship between the presence or absence of disease-specific autoantibodies and the therapeutic effect of the decrease has been widely investigated.
  • the first choice is systemic high-dose steroid injection, and if the symptoms are severe or difficult to control with steroids, high-dose intravenous immunoglobulin (IVIG) administration or plasmapheresis is applied.
  • IVIG intravenous immunoglobulin
  • Plasmapheresis is applied.
  • High-dose steroids are ineffective or have serious side effects when used repeatedly.
  • the treatment cost is high and there are various side effects and risks of infection.
  • an autoimmune disease treatment using an FcRn antibody is being studied (Korean Patent Publication No. 10-2014-0147606).
  • the antibody blocks FcRn (Neonatal Fc Receptor), which is involved in the recycling of IgG, and increases the loss rate (Catabolism) of IgG in the body, thereby lowering autoantibodies to treat diseases. It is a drug with a new mechanism.
  • Such anti-FcRn antibody is expected as a product that can solve the problems of existing therapeutic agents.
  • the present inventors developed a buffer and formulation optimized for the anti-FcRn antibody HL161BKN.
  • an anti-FcRn antibody or fragment thereof (b) at least one additive selected from mannitol, sorbitol, arginine, histidine, glycine and salts thereof, ( c) a buffer system selected from citrate or histidine, and (d) a surfactant.
  • a pharmaceutical formulation having a pH of 4.0 to 8.0 containing a surfactant is a pharmaceutical composition optimized for HL161BKN, and it was confirmed that the stability of HL161BKN was improved in the formulation.
  • Figure 2 confirms the 4-week accelerated stability of HL161BKN in sodium citrate-phosphate buffer pH 5.0, 6.0, 7.0, and 8.0 conditions.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the process for studying the formulation of HL161BKN.
  • Figure 10 confirms the amount of change in aggregates and fragments of HL161BKN (210 mg/mL) in the additional excipient test.
  • 11 is an analysis of charge variants of HL161BKN according to excipient conditions in an additional excipient test using CEX-HPLC.
  • Figure 12 confirms the effect of HL161BKN (210 mg / mL) with or without PSB20 on the stirring stress.
  • Figure 14 confirms the amount of change in aggregates and fragments of HL161BKN (210 mg/mL) in the viscosity reducing excipient test.
  • 16 is an analysis of charge variants of HL161BKN according to the primary excipient screening conditions using CEX-HPLC.
  • 17 shows the changes in aggregates and fragments of HL161BKN (210 mg/mL) in secondary excipient screening.
  • Figure 19 confirms the change in the number of insoluble particles (sub-visible particles) of HL161BKN.
  • an anti-FcRn antibody or fragment thereof (b) one or more additives selected from mannitol, sorbitol, arginine, histidine, glycine and salts thereof, (c) citrate or histidine
  • a pharmaceutical formulation of pH 4.0 to 8.0 comprising a selected buffer system, and (d) a surfactant.
  • the pharmaceutical preparation may additionally include methionine.
  • the pharmaceutical preparation may additionally include saccharides such as sucrose and trehalose.
  • the buffer system is meant a buffer that is resistant to changes in pH due to its acid-base counterpart.
  • the term "histidine buffer” means a buffer containing histidine ions.
  • the specific example of the histidine buffer may be any one selected from the group consisting of histidine chloride buffer, histidine acetate buffer, histidine phosphate buffer, and histidine sulfate buffer, but is not limited thereto.
  • citrate buffer means a buffer containing citrate ions.
  • the specific example of the citrate buffer may be any one selected from the group consisting of a citrate-sodium buffer, a citrate-potassium buffer, a citrate-calcium buffer, and a citrate-magnesium buffer, but is not limited thereto.
  • surfactant refers to a pharmaceutically acceptable excipient used to protect a protein formulation against mechanical stress such as agitation and shearing.
  • Specific examples of surfactants include polysorbate 20, polysorbate 40, polysorbate 60, polysorbate 80, poloxamer, triton, sodium dodecyl sulfate, sodium lauryl sulfonate, sodium octyl glycoside, lauryl- Sulfobetaine, myristyl-sulfobetaine, linoleyl-sulfobetaine, stearyl-sulfobetaine, lauryl-sarcosine, myristyl-sarcosine, linoleyl-sarcosine, stearyl-sarcosine, linol Rail-betaine, myristyl-betaine, cetyl-betaine, lauryl amidopropyl-betaine, cocaramidopropyl-betaine, cocaramid
  • the pharmaceutical formulation may be an aqueous formulation, preferably an injectable liquid formulation.
  • the anti-FcRn antibody may be HL161BKN.
  • the HL161BKN comprises a heavy chain variable region comprising H-CDR1 having the amino acid of SEQ ID NO: 5, H-CDR2 having the amino acid of SEQ ID NO: 6, and H-CDR3 having the amino acid of SEQ ID NO: 7, It includes a light chain variable region comprising L-CDR1 having an amino acid, L-CDR2 having an amino acid of SEQ ID NO: 9, and L-CDR3 having an amino acid of SEQ ID NO: 10.
  • the HL161BKN may include the heavy chain and light chain regions shown in Table 1 below.
  • the heavy and light chains may be encoded by the nucleic acids shown in Table 2.
  • glycosylation sites of the antibody are as follows: Asn301, N-glycan (G0F, G1F, G0-GlcNac, Man5).
  • the pharmaceutical formulation may be characterized in that it has a viscosity of 20 cP or less. Specifically, the pharmaceutical formulation may have a viscosity of 1 cP to 20 cP. In addition, the pharmaceutical formulation may have a viscosity of 10 cP to 20 cP, about 10 cP, about 11 cP, about 12 cP, about 13 cP, about 14 cP, about 15 cP, about 16 cP, about 17 cP , about 18 cP, about 19 cP, about 20 cP.
  • the pharmaceutical formulation may be characterized as having an osmotic pressure of 250 mOs/kg to 500 mOs/kg. Specifically, the pharmaceutical formulation may have an osmotic pressure of 300 mOs/kg to 450 mOs/kg or 350 mOs/kg to 400 mOs/kg.
  • the pharmaceutical formulation is about 250 mOs/kg, about 260 mOs/kg, about 270 mOs/kg, about 280 mOs/kg, about 290 mOs/kg, about 300 mOs/kg, about 310 mOs/kg, about About 320 mOs/kg, about 330 mOs/kg, about 340 mOs/kg, about 350 mOs/kg, about 360 mOs/kg, about 370 mOs/kg, about 380 mOs/kg, about 390 mOs/kg, about 400 mOs /kg, about 410 mOs/kg, about 420 mOs/kg, about 430 mOs/kg, about 440 mOs/kg, about 450 mOs/kg, about 460 mOs/kg, about 470 mOs/kg, about 480 mOs/kg , about 490 mOs/kg,
  • the pharmaceutical formulation may include HL161BKN at a concentration of 50 mg/mL to 250 mg/mL.
  • the pharmaceutical formulation is 60 mg/mL to 250 mg/mL, 70 mg/mL to 250 mg/mL, 80 mg/mL to 250 mg/mL, 90 mg/mL to 250 mg/mL or 100 mg /mL to 250 mg/mL may be included.
  • the pharmaceutical formulation may contain HL161BKN in an amount of 120 mg/mL to 230 mg/mL, 150 mg/mL to 220 mg/mL, or 180 mg/mL to 210 mg/mL.
  • the pharmaceutical formulation contains about 50 mg/mL, about 60 mg/mL, about 70 mg/mL, about 80 mg/mL, about 90 mg/mL, about 100 mg/mL, about 110 mg/mL of HL161BKN. , about 120 mg/mL, about 130 mg/mL, about 140 mg/mL, about 150 mg/mL, about 160 mg/mL, about 170 mg/mL, about 180 mg/mL, about 190 mg/mL, about 200 mg/mL, about 210 mg/mL, about 220 mg/mL, about 230 mg/mL, about 240 mg/mL, or about 250 mg/mL.
  • the pharmaceutical formulation may have a pH of 4.0 to 8.0. Specifically, the pharmaceutical formulation may have a pH of 4.0 to 7.0. Preferably, the pharmaceutical formulation may have a pH of 5.0 to 6.0. In addition, the pharmaceutical formulation is about pH 5.0, about pH 5.1, about pH 5.2, about pH 5.3, about pH 5.4, about pH 5.5, about pH 5.6, about pH 5.7, about pH 5.8, about pH 5.9, about pH 6.0 , about pH 6.1, about pH 6.2, about pH 6.3, about pH 6.4, about pH 6.5, about pH 6.6, about pH 6.7, about pH 6.8, about pH 6.9 or about pH 7.0.
  • the additive may be included in an amount of 10 mM to 400 mM.
  • the additive may be used alone, mannitol, sorbitol, arginine, histidine or glycine, or two or more may be used in combination.
  • the additive may be included in an amount of 10 mM to 400 mM, 20 mM to 300 mM, 50 mM to 250 mM, or 100 mM to 150 mM, respectively.
  • the additive is about 10 mM, about 20 mM, about 30 mM, about 40 mM, about 50 mM, about 60 mM, about 70 mM, about 80 mM, about 90 mM, about 100 mM, about 110 mM, respectively , about 120 mM, about 130 mM, about 140 mM, about 150 mM, about 160 mM, about 170 mM, about 180 mM, about 190 mM, about 200 mM, about 210 mM, about 220 mM, about 230 mM, about 240 mM, about 250 mM, about 260 mM, about 270 mM, about 280 mM, about 290 mM, about 300 mM.
  • the additive may include mannitol and sorbitol. In one embodiment, the additive may include mannitol and arginine. In one embodiment, the additive may include mannitol and histidine. In one embodiment, the additive may include mannitol and glycine. In one embodiment, the additive may include sorbitol and arginine. In one embodiment, the additive may include sorbitol and histidine. In one embodiment, the additive may include sorbitol and glycine. In one embodiment, the additive may include arginine and histidine. In one embodiment, the additive may include arginine and glycine. In one embodiment, the additive may include histidine and glycine. In this case, each additive may be included in the pharmaceutical formulation at the above-mentioned concentration.
  • the pharmaceutical formulation (a) 100 mg/mL to 250 mg/mL of an anti-FcRn antibody, (b) 50 to 250 mM L-arginine or hydrochloride thereof, (c) 50 to 250 mM It may be a pharmaceutical formulation of pH 5.0 to 6.0, comprising L-histidine and (d) 0.01 to 0.05% of polysorbate 20.
  • the anti-FcRn antibody is as described above.
  • the pharmaceutical formulation may be an aqueous formulation or may be an injectable liquid formulation.
  • the above-described pharmaceutical formulation may be characterized in that it is administered subcutaneously.
  • the pharmaceutical formulation is very stable under accelerated conditions.
  • the content of aggregates and fragments may be about 10% or less as a result of a 6-month test under accelerated conditions (25° C., 60% relative humidity).
  • the content of aggregates and fragments may be about 9% or less, about 8% or less, about 7% or less, about 6% or less, about 5.5% or less, or about 5.0% or less.
  • the pharmaceutical formulation is very stable even under long-term storage conditions.
  • the content of aggregates and fragments may be about 10% or less under the conditions of 5°C and 36 months.
  • the content of aggregates and fragments under the above conditions is about 9% or less, about 8% or less, about 7% or less, about 6% or less, about 5% or less, about 4% or less, about 3% or less, about 2% or less , about 1.8% or less, about 1.5% or less, or about 1.2% or less.
  • autoimmune diseases include Myasthenia Gravis (MG), Thyroid Eye Disease (TED), Warm Autoimmune Hemolytic Anemia (WAIHA), Neuromyelitis Optica (NMO), idiopathic Immune Thrombocytopenic Purpura (ITP), Pemphigus Vulgaris (PV), Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy (CIDP), Lupus Nephritis (LN), and Membrane Nephritis (Membranous Nephropathy, MN) may be any one selected from the group consisting of.
  • HL161BKN is prepared at a concentration of about 210 mg/mL for each condition and stored for 4 weeks under accelerated conditions at 40°C, concentration (A280), turbidity (A340), purity (SEC-HPLC, CEX-HPLC), viscosity, osmotic pressure, insolubility Particle (MFI) analysis was performed to evaluate the stability and suitability of the subcutaneous administration of the sample.
  • L-histidine and D-mannitol were selected as excipients.
  • L-methionine which showed an effect of reducing aggregation production, was additionally selected.
  • histidine can be used as a basic buffer.
  • high-purity 0.02% polysorbate 20 which exhibits the effect of inhibiting the formation of aggregates due to agitation stress that may occur during storage and transport of the product, was selected.
  • the primary concentration screening test of the selected histidine base buffer, L-arginine hydrochloride, D-mannitol, and L-methionine excipients was performed.
  • the PBS20 concentration was fixed at 0.02% and performed.
  • high stability was confirmed in the 50 mM histidine base buffer condition without excipients.
  • L-arginine hydrochloride, 0.02% PSB20 was selected in L-histidine basic buffer as HL161BKN formulation.
  • a polynucleotide having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 encoding a heavy chain comprising an amino acid of SEQ ID NO: 1 was loaded into a pCHO 1.0 vector (Life Technologies).
  • a polynucleotide having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 encoding a light chain comprising the amino acid of SEQ ID NO: 2 was loaded into the pCHO 1.0 vector.
  • CHO-S cells were transformed using the expression vector prepared in Preparation Example 1, and after the selection process of methotrexate and puromycin, a final production cell line was prepared.
  • the prepared cell line was prepared as a cell bank and used for HL161BKN production as a storage box.
  • Antibody production was performed in a bioreactor containing a culture medium (Dynamis medium + 8 mM L-glutamine) by adding an additional medium (EFB+) every 2 days, and the supernatant was recovered after culturing for about 15 days. Then, a Protein A column was performed, and after viral inactivation at low pH, anion exchange chromatography (AEX) and cation exchange chromatography (CEX) were performed.
  • AEX anion exchange chromatography
  • CEX cation exchange chromatography
  • Thermal stability of HL161BKN was conducted.
  • Tm values were analyzed by differential scanning calorimetry (DSC), and the degree of aggregate and fragment formation was monitored while storage at 37° C. for 1 month in accelerated conditions for each pH.
  • HL161BKN was prepared at 100 mg/mL using buffers of low or high concentration of 5.0 and 6.0, which are low pH, and then stored at 40°C accelerated condition for 4 weeks, and stability test was performed. As a result, HL161BKN showed a stable tendency at low pH conditions, pH 5.0 to 6.0, and maintained a high level of monomer overall in all conditions.
  • the purpose of this experiment is to select the dosage form of the drug substance and drug product for the development of high-concentration subcutaneous administration products of HL161BKN.
  • three production batches of HL161BKN-B005, HL161BKN-B018, and HL161BKN-B021 were used, and the reagents and instruments used are as follows (Table 3).
  • the formulation selection test for HL161BKN was largely divided into an excipient screening test and an excipient concentration screening test. Specifically, an experiment was performed in the same manner as in FIG. 3 .
  • Sucrose, D-Trehalose, D-Mannitol, D-Sorbitol, L-Arginine are 11 excipients that are frequently used in antibody products currently on the market.
  • Hydrochloride (L-Arginine HCl), L-Histidine Hydrochloride (L-Histidine HCl), L-Histidine (L-Histidine), L-Glycine (L-Glycine), Polysorbate 20 (Polysorbate 20), Polysorbate 80 (Polysorbate 80) and sodium chloride (NaCl) were selected. Specifically, the excipients test was performed in 12 buffer conditions using 5 mM sodium citrate (pH 6.0) as a basic buffer (Table 5).
  • HL161BKN was concentrated to 1 mL or less using Amicon ® (Cut off MW. 30,000), and then buffer exchanged with the corresponding buffer conditions to obtain a final concentration of 210 mg/mL.
  • Samples for each condition were prepared by 0.3 to 0.5 mL, and stored in a 1.5 mL microcentrifuge tube at 40°C for 4 weeks. Samples were sampled at weeks 0, 2, and 4 to evaluate changes in concentration (A280), turbidity (A340), and purity (SEC-HPLC, CEX-HPLC).
  • Example 1.1 When combining the five excipients (L-histidine, L-arginine hydrochloride, L-glycine, D-sorbitol, D-mannitol) selected in Example 1.1, it was confirmed whether there was a synergistic effect. Specifically, 17 conditions tests were planned in a 2-level factorial (2 n-1 ) design using DOE (design of experiments) software (Stat-ease Design-Expert ® , version 7.0) (Table 6). Specifically, a total of 12 condition tests were performed: a 5 mM sodium citrate (pH 6.0) basic buffer condition and 11 excipient combination conditions. In addition, the test results of Example 1.1 were used for the five excipient-only condition tests.
  • test method was performed in the same manner as in Example 1.1, and the osmotic pressure of the buffer and sample for each condition was further measured, and ANOVA analysis and effect values were calculated using the DOE Software.
  • Samples were prepared by 1 mL for each condition in the same manner as in Example 1.1, and the viscosity was measured at 25°C. In addition, changes in concentration (A280) and purity (SEC-HPLC) for each condition were evaluated while performing a 4-week accelerated stability test.
  • the experiment was performed in the same manner as in Example 1.1, and the concentration (A280), turbidity (A340), purity (SEC-HPLC, CEX-HPLC), viscosity, and osmotic pressure change were analyzed.
  • HL161BKN concentration increased for 4 weeks (Table 12), which was assumed to be due to buffer evaporation under accelerated conditions at 40°C.
  • SEC-HPLC was used to compare and evaluate the amount of aggregate and fragment increase for each excipient condition (Table 14).
  • L-arginine hydrochloride, L-histidine, L-histidine hydrochloride, D-mannitol, L-glycine, and D-sorbitol effectively inhibited the formation of aggregates.
  • 0.2% PSB20, 0.2% PSB80, and NaCl rather increased the formation of aggregates.
  • the excipients inhibiting fragment formation were L-histidine, L-histidine hydrochloride, L-arginine hydrochloride, and L-glycine, and NaCl increased fragment formation (Table 14 and FIG. 4).
  • the stability effect of the HL161BKN sample by the combination of five excipients selected in the excipient test of Example 1.1 was evaluated. Specifically, an accelerated test was performed at 40° C. for 4 weeks, and L-arginine hydrochloride, L-histidine, and D-mannitol, which effectively inhibit the formation of aggregates and fragments, were selected.
  • the HL161BKN concentration increased for 4 weeks, which was estimated to be due to buffer evaporation at 40°C accelerated condition (Table 16). On the other hand, turbidity did not increase or showed a slight increase to less than 0.054 (Table 17).
  • SEC-HPLC was used to compare and evaluate the amount of aggregate and fragment increase for each excipient combination condition (Table 18 and FIG. 7).
  • SEC-HPLC data for a total of 17 conditions including the excipient-only condition test of Example 1.1 were analyzed by ANOVA. As a result, it was confirmed that L-arginine hydrochloride reduced the aggregate formation to a statistically significant level (p ⁇ 0.01) ( FIG. 6 ), and there was no excipient that reduced the fragment formation to a statistically significant level.
  • A 50 mM L-arginine hydrochloride
  • H 50 mM L-histidine
  • G 100 mM L-glycine
  • M 200 mM D-mannitol
  • S 250 mM D-sorbitol
  • CEX-HPLC was used to confirm the change in charge variants of HL161BKN according to excipient combination conditions. As a result, no distinct charge variants (basic and acidic variants) change could be observed (FIG. 9).
  • the osmotic pressure of subcutaneous injections is similar to the osmotic pressure in the body (about 290 mOsmol/kg) and is controlled in the range of about 250 to 500 mOsmol/kg (PCT/EP2009/066675). Therefore, it was determined that the osmotic pressure of the formulation buffer should be adjusted in the range of about 220 to 450 mOsmol/kg in consideration of the HL161BKN concentration. Therefore, it was decided to proceed with the excipient concentration screening test later in consideration of the osmotic pressure range.
  • A 50 mM L-arginine hydrochloride
  • H 50 mM L-histidine
  • G 100 mM L-glycine
  • M 200 mM D-mannitol
  • S 250 mM D-sorbitol
  • L-methionine showed an excellent effect in inhibiting the formation of aggregates. Also, there was no increase in aggregate production by 0.02% PSB20.
  • the results of the condition in which L-histidine was added as an excipient and the condition in which the basic buffer was used were similar, and aggregate formation was reduced in the 50 mM histidine condition than in 10 mM histidine (Table 22 and FIG. 10).
  • PSB20 has an effect of protecting the stress caused by agitation of high concentration HL161BKN.
  • the HL161BKN concentration increased for 4 weeks (Table 25), which was estimated to be due to buffer evaporation at 40°C accelerated condition.
  • L-histidine hydrochloride, L-arginine hydrochloride, and L-glycine were added, the viscosity was reduced compared to Condition 1, but the effect was insignificant.
  • L-lysine hydrochloride, NaCl, Na 2 SO 4 , and NH 4 Cl the viscosity increased significantly (Table 26).
  • Example 1.3 In order to screen the concentration of histidine base buffer (pH 6.0) selected in Example 1.3 and three excipients (L-methionine, L-arginine hydrochloride, D-mannitol) in 0.02% PSB20, a test was performed under a total of 9 conditions. (Table 28). As a result, L-arginine hydrochloride and PSB20 were selected as excipients in histidine basic buffer.
  • the HL161BKN concentration increased to around 15% for 4 weeks, which was estimated to be due to buffer evaporation under the accelerated condition at 40°C (Table 29).
  • the turbidity in each condition showed only a slight increase of about 0.048 on average (Table 30).
  • HL161BKN 2 batch samples (HL161BKN B018, HL161BKN B021) were used under 4 conditions to select the optimal concentration of L-arginine hydrochloride
  • concentration 100 mM L-histidine, 100 mM L-arginine hydrochloride, 0.02% PSB20, pH 6.0 was determined as the final formulation of HL161BKN (Table 33).
  • the concentration of HL161BKN did not change for 4 weeks, and this was expected to be an effect of preventing the evaporation of the buffer by sealing the 1.5 mL microcentrifuge with parafilm and storing it in a constant temperature and humidifier (Table 34). And, the turbidity showed a slight increase to 0.102 or less under all conditions (Table 35).
  • condition 3 100 mM L-Histidine, 100 mM L-Arginine HCl, 0.02% PSB20, pH 6.0
  • condition 4 50 mM L-Histidine
  • the viscosity was 11 to 16 cP, which was controlled to be below 20 cp, the viscosity limit of the subcutaneously administered product, and the osmotic pressure was 350 to 465 mOsmol/kg, 250 to 500 mOsmol/kg. kg (Table 37).
  • MFI micro flow imaging
  • HL161BKN For HL161BKN, a 36-month long-term storage and accelerated stability test under the final selected formulation conditions were performed by Catalent (USA).
  • drug product (DP) was stored using a borosilicate glass vial and a rubber stopper coated with Teflon.
  • Teflon As a result of confirming the stability under the selected formulation conditions, the stability of DP was confirmed for 36 months, thereby securing the possibility of development as an injection (Table 39 and Table 40).
  • HL161BKN shows a tendency to be very stable at high concentrations in the formulation, it was intended to confirm the possibility of development in the form of an injection for subcutaneous administration.
  • a viscosity of 20 cP or less is suitable for subcutaneous administration in order to reduce pain and side effects at the administration site.
  • HL161BKN was concentrated under 9 concentration conditions and the viscosity was measured at 5°C and 25°C conditions.
  • As a result of checking the viscosity of the 170 mg/mL high concentration HL161BKN sample it was confirmed to be 10 cP at 25° C., confirming that subcutaneous administration was possible ( FIG. 20 ).
  • HL161BKN was confirmed to have very stable properties even at a high concentration of 200 mg/mL or more in the formulation study. As a result, it is expected that it will be possible to develop a self-administered SC injection product in the future. Considering that all competing products of other companies are infusion type products, differentiation is possible by increasing patient convenience.
  • the formulation can be applied to various concentrations of HL161BKN.

Abstract

본 발명의 일 측면은, (a) HL161 BKN 항체 또는 이의 단편, (b) 만니톨, 솔비톨, 아르기닌, 히스티딘, 글리신 및 이들의 염으로부터 선택되는 1종 이상의 첨가제, (c) 시트레이트 또는 히스티딘으로부터 선택된 완충 시스템, 및 (d) 폴리소르베이트를 포함하는 pH 4.0 내지 8.0의 수성 약제학적 제제를 제공한다. 상기 제형 내에 존재하는 HL161BKN 항체는 안정성이 향상되며, 독성이 없어 산업적으로 활용 가능성이 높다.

Description

항－ＦｃＲｎ 항체에 대한 제형
본 발명은 항-FcRn 항체인 HL161BKN에 최적화된 제형에 관한 것이다.
자가면역 질환의 원인은 유전적, 환경적 및 면역학적인 관점에서 오랜 기간 연구가 진행되어 왔으나, 여전히 명확한 질병의 발생 원인은 밝혀지지 않고 있다. 최근 많은 연구를 통해 다수의 자가 면역 질환들이 IgG 형태의 자가항체(autoantibody)에 의해 발생하는 것으로 밝혀지고 있다. 실제로 자가면역 질환 진단 및 치료연구에서 질환 특이적인 자가항체들의 존재 유무와 감소에 따른 치료효과와의 연관성이 널리 규명되고 있다.
이와 같은 자가면역 질환 치료제로서 1차 선택제는 전신 고용량 스테로이드 주사이며, 증상이 심각하거나 스테로이드로 조절이 어려운 경우 고용량의 IVIG(Intravenous immunoglobulin) 투여 또는 혈장 분리 반출술을 적용하였다. 고용량 스테로이드는 효과가 미약하거나 반복 사용시 심각한 부작용이 나타날 수 있으며, IVIG와 혈장 분리 반출술의 경우는 치료비용이 비싸고 다양한 부작용과 감염의 위험이 있어 이 치료 분야에서의 치료제 개발이 절실한 상태이다.
한편, 최근 FcRn 항체를 이용한 자가면역질환 치료제가 연구되고 있다(대한민국 특허공개번호 제10-2014-0147606호). 상기 항체는 IgG의 리사이클링(Recycling) 작용에 관여하는 FcRn(Neonatal Fc Receptor)을 블록킹하여 체내 IgG의 소실속도(Catabolism)를 증가시킴으로써 자가항체를 낮추어 질환을 치료하고자 하는 새로운 기전의 약물이다. 이러한 항-FcRn 항체는 기존 치료제들의 문제점을 해결할 수 있는 제품으로 기대된다.
그러나, 이러한 항체를 체내 자가항원(Autoantigen)에 대한 자가항체(Autoantibody)가 발생하여 질환이 나타나는 천포창(Pemphigus bulgaris)이나 신경성 척수염(Neuromyelitis optica), 중증 근무력증(Myasthenia gravis)과 같은 중증 자가면역 질환에 적용하기 위해서는 이러한 항체에 최적화된 제형 및 투여 방법에 따라 최적화된 제형이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 중증 자가면역 질환을 치료하기 위한 항-FcRn 항체에 최적화된 제형을 개발하기 위해서 연구한 결과, 항-FcRn 항체인 HL161BKN에 최적화된 버퍼 및 제형을 개발하였다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, (a) 항-FcRn 항체 또는 이의 단편, (b) 만니톨, 솔비톨, 아르기닌, 히스티딘, 글리신 및 이들의 염으로부터 선택되는 1종 이상의 첨가제, (c) 시트레이트 또는 히스티딘으로부터 선택된 완충 시스템, 및 (d) 계면활성제를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다.
본 발명에 따른 (a) 항-FcRn 항체 또는 이의 단편, (b) 만니톨, 솔비톨, 아르기닌, 히스티딘, 글리신 및 이들의 염으로부터 선택되는 1종 이상의 첨가제, (c) 시트레이트 또는 히스티딘으로부터 선택된 완충 시스템, 및 (d) 계면활성제를 포함하는 pH 4.0 내지 8.0의 약제학적 제제는 HL161BKN에 최적화된 약학 조성물으로서, 상기 제형에서 HL161BKN의 안정성이 향상됨을 확인하였다.
도 1은 DSC(Differential Scanning Calorimetry)를 이용하여 HL161BKN의 열안정성을 분석한 것이다.
도 2는 시트르산 나트륨-포스페이트 버퍼 pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 조건에서 HL161BKN의 4주 가속 안정성을 확인한 것이다.
도 3은 HL161BKN의 제형을 연구하기 위한 과정을 도식화한 것이다.
도 4는 부형제 테스트 결과, 부형제에 따라 생성된 HL161BKN(210 mg/mL)의 응집체(aggregates) 및 단편(fragments)의 변화량를 확인한 것이다.
도 5는 각 부형제 조건에 따른 HL161BKN(210 mg/mL)의 전하 변이체(charge variants) 양상을 CEX-HPLC를 이용하여 분석한 것이다.
도 6은 부형제 조합에 따른 HL161BKN의 응집체 변화량의 분산분석(Analysis of variance, ANOVA) 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 부형제 조합에 따라 생성된 HL161BKN(210 mg/mL)의 응집체 및 단편의 변화량을 확인한 것이다.
도 8은 부형제 조합에 따른 HL161BKN의 응집체 및 단편의 변화량의 실험계획법(Design of Experiment, DOE) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 부형제 조합에 따른 HL161BKN의 전하 변이체(charge variants) 양상을 CEX-HPLC를 이용하여 분석한 것이다.
도 10은 추가 부형제 테스트에서 HL161BKN(210 mg/mL)의 응집체 및 단편의 변화량을 확인한 것이다.
도 11은 추가 부형제 테스트에서 부형제 조건에 따른 HL161BKN의 전하 변이체(charge variants) 양상을 CEX-HPLC를 이용하여 분석한 것이다.
도 12는 HL161BKN(210 mg/mL)의 교반 스트레스에 대한 PSB20 유무에 따른 영향을 확인한 것이다.
도 13은 교반 테스트에서 PSB20 유무에 따른 HL161BKN의 단량체(monomer) 변화를 확인한 것이다.
도 14는 점성 감소 부형제 테스트에서 HL161BKN(210 mg/mL)의 응집체 및 단편의 변화량을 확인한 것이다.
도 15는 1차 부형제 스크리닝에서 HL161BKN(210 mg/mL)의 응집체 및 단편의 변화를 확인한 것이다.
도 16은 1차 부형제 스크리닝 조건에 따른 HL161BKN의 전하 변이체(charge variants) 양상을 CEX-HPLC를 이용하여 분석한 것이다.
도 17은 2차 부형제 스크리닝에서 HL161BKN(210 mg/mL)의 응집체 및 단편의 변화를 확인한 것이다.
도 18은 2차 부형제 조건에 따른 HL161BKN의 전하 변이체(charge variants) 양상을 CEX-HPLC를 이용하여 분석한 것이다.
도 19는 HL161BKN의 불용성 미립자(sub-visible particle) 수의 변화를 확인한 것이다.
도 20은 HL161BKN 제형에서 HL161BKN의 농도에 따른 점성을 확인한 결과이다. 이때, HL161BKN이 170 mg/mL 일때, 10 cP로 확인되었다.
본 발명의 일 측면은, (a) 항-FcRn 항체 또는 이의 단편, (b) 만니톨, 솔비톨, 아르기닌, 히스티딘, 글리신 및 이들의 염으로부터 선택되는 1종 이상의 첨가제, (c) 시트레이트 또는 히스티딘으로부터 선택된 완충 시스템, 및 (d) 계면활성제를 포함하는 pH 4.0 내지 8.0의 약제학적 제제를 제공한다.
또한, 상기 약제학적 제제는 추가적으로 메티오닌를 포함할 수 있다. 또한, 상기 약제학적 제제는 추가적으로 수크로스, 트레할로스와 같은 당류를 포함할 수 있다.
상기 완충 시스템은 그 짝 산-염기 성분으로 인해 pH에서의 변화에 저항성인　버퍼를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "히스티딘　버퍼"는 히스티딘 이온을 포함하는　버퍼를 의미한다. 이때, 히스티딘　버퍼의 구체예는 히스티딘 클로라이드　버퍼, 히스티딘 아세테이트　버퍼, 히스티딘 포스페이트　버퍼, 및 히스티딘 설페이트　버퍼로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "시트레이트　버퍼"는 시트레이트 이온을 포함하는　버퍼를 의미한다. 이때, 시트레이트　버퍼의 구체예는 시트르산-나트륨 버퍼, 시트르산-칼륨 버퍼, 시트르산-칼슘 버퍼, 및 시트르산-마그네슘 버퍼로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "계면활성제"는 교반(agitation) 및 전단(shearing)과 같은 기계적 스트레스에 대해 단백질 제형을 보호하기 위해 사용되는 약학적으로 허용가능한 부형제를 나타낸다. 계면활성제의 구체예는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 폴록사머, 트리톤, 나트륨 도데실 설페이트, 나트륨 라우릴 설포네이트, 나트륨 옥틸 글리코시드, 라우릴-설포베타인, 미리스틸-설포베타인, 리놀레일-설포베타인, 스테아릴-설포베타인, 라우릴-사르코신, 미리스틸-사르코신, 리놀레일-사르코신, 스테아릴-사르코신, 리놀레일-베타인, 미리스틸-베타인, 세틸-베타인, 라우릴 아미도프로필-베타인, 코카르아미도프로필-베타인, 리놀레아미도프로필-베타인, 미리스트아미도프로필-베타인, 팔미토일아미도프로필-베타인, 이소스테아르아미도프로필-베타인, 미리스트아미도프로필-디메틸아민, 팔미토일아미도프로필-디메틸아민, 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민, 나트륨 메틸 코카아실, 나트륨 메틸 올레일-타우레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 코폴리머으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 계면활성제일 수 있다. 이때, 상기 계면활성제는 바람직하게 폴리소르베이트 20 일 수 있다.
또한, 상기 약제학적 제제는 수성 제제일 수 있으며, 바람직하게는 주사형 액상 제제일 수 있다.
이때, 상기 항-FcRn 항체는 HL161BKN 일 수 있다.
상기 HL161BKN은 서열번호 5의 아미노산을 가지는 H-CDR1, 서열번호 6의 아미노산을 가지는 H-CDR2, 및 서열번호 7의 아미노산을 가지는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하며, 서열번호 8의 아미노산을 가지는 L-CDR1, 서열번호 9의 아미노산을 가지는 L-CDR2, 및 서열번호 10의 아미노산을 가지는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함한다.
또한, 상기 HL161BKN은 하기 표 1에 기재된 중쇄 및 경쇄 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 중쇄 및 경쇄는 표 2에 기재된 핵산에 의해 코딩될 수 있다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000001
상기 항체의 당화 위치는 다음과 같다: Asn301, N-glycan(G0F, G1F, G0-GlcNac, Man5).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000002
이때, 상기 약제학적 제제는 20 cP 이하의 점도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로 상기 약제학적 제제는 1 cP 내지 20 cP의 점도를 가질 수 있다. 또한, 상기 약제학적 제제는 10 cP 내지 20 cP의 점도를 가질 수 있으며, 약 10 cP, 약 11 cP, 약 12 cP, 약 13 cP, 약 14 cP, 약 15 cP, 약 16 cP, 약 17 cP, 약 18 cP, 약 19 cP, 약 20 cP의 점도를 가질 수 있다.
또한, 상기 약제학적 제제는 250 mOs/kg 내지 500 mOs/kg의 삼투압을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로, 상기 약제학적 제제는 300 mOs/kg ~ 450 mOs/kg 또는 350 mOs/kg ~ 400 mOs/kg의 삼투압을 가질 수 있다. 또한, 상기 약제학적 제제는 약 250 mOs/kg, 약 260 mOs/kg, 약 270 mOs/kg, 약 280 mOs/kg, 약 290 mOs/kg, 약 300 mOs/kg, 약 310 mOs/kg, 약 320 mOs/kg, 약 330 mOs/kg, 약 340 mOs/kg, 약 350 mOs/kg, 약 360 mOs/kg, 약 370 mOs/kg, 약 380 mOs/kg, 약 390 mOs/kg, 약 400 mOs/kg, 약 410 mOs/kg, 약 420 mOs/kg, 약 430 mOs/kg, 약 440 mOs/kg, 약 450 mOs/kg, 약 460 mOs/kg, 약 470 mOs/kg, 약 480 mOs/kg, 약 490 mOs/kg, 또는 약 500 mOs/kg의 삼투압을 가질 수 있다.
또한, 상기 약제학적 제제는 HL161BKN을 50 mg/mL 내지 250 mg/mL의 농도로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약제학적 제제는 60 mg/mL 내지 250 mg/mL, 70 mg/mL 내지 250 mg/mL, 80 mg/mL 내지 250 mg/mL, 90 mg/mL 내지 250 mg/mL 또는 100 mg/mL 내지 250 mg/mL로 포함할 수 있다. 또한, 상기 약제학적 제제는 HL161BKN을 120 mg/mL 내지 230 mg/mL, 150 mg/mL 내지 220 mg/mL 또는 180 mg/mL 내지 210 mg/mL로 포함할 수 있다. 또한, 상기 약제학적 제제는 HL161BKN을 약 50 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 90 mg/mL, 약 100 mg/mL, 약 110 mg/mL, 약 120 mg/mL, 약 130 mg/mL, 약 140 mg/mL, 약 150 mg/mL, 약 160 mg/mL, 약 170 mg/mL, 약 180 mg/mL, 약 190 mg/mL, 약 200 mg/mL, 약 210 mg/mL, 약 220 mg/mL, 약 230 mg/mL, 약 240 mg/mL, 또는 약 250 mg/mL로 포함할 수 있다.
또한, 상기 약제학적 제제는 pH 4.0 내지 8.0 일 수 있다. 구체적으로, 상기 약제학적 제제는 pH 4.0 내지 7.0 일 수 있다. 바람직하게는 상기 약제학적 제제는 pH 5.0 내지 6.0일 수 있다. 또한, 상기 약제학적 제제는 약 pH 5.0, 약 pH 5.1, 약 pH 5.2, 약 pH 5.3, 약 pH 5.4, 약 pH 5.5, 약 pH 5.6, 약 pH 5.7, 약 pH 5.8, 약 pH 5.9, 약 pH 6.0, 약 pH 6.1, 약 pH 6.2, 약 pH 6.3, 약 pH 6.4, 약 pH 6.5, 약 pH 6.6, 약 pH 6.7, 약 pH 6.8, 약 pH 6.9 또는 약 pH 7.0 일 수 있다.
또한, 상기 첨가제는 10 mM 내지 400 mM로 포함될 수 있다. 이때, 상기 첨가제는 만니톨, 솔비톨, 아르기닌, 히스티딘 또는 글리신 단독으로 사용될 수 있으며, 2개 이상이 혼합하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 첨가제는 각각 10 mM 내지 400 mM, 20 mM 내지 300 mM, 50 mM 내지 250 mM 또는 100 mM 내지 150 mM로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 첨가제는 각각 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 mM, 약 180 mM, 약 190 mM, 약 200 mM, 약 210 mM, 약 220 mM, 약 230 mM, 약 240 mM, 약 250 mM, 약 260 mM, 약 270 mM, 약 280 mM, 약 290 mM, 약 300 mM로 포함될 수 있다.
또한, 상기 첨가제는 2개가 혼합되어 사용될 수 있다. 일 구체예로 상기 첨가제는 만니톨 및 솔비톨을 포함할 수 있다. 일 구체예로 상기 첨가제는 만니톨 및 아르기닌을 포함할 수 있다. 일 구체예로 상기 첨가제는 만니톨 및 히스티딘을 포함할 수 있다. 일 구체예로 상기 첨가제는 만니톨 및 글리신을 포함할 수 있다. 일 구체예로 상기 첨가제는 솔비톨 및 아르기닌을 포함할 수 있다. 일 구체예로 상기 첨가제는 솔비톨 및 히스티딘을 포함할 수 있다. 일 구체예로 상기 첨가제는 솔비톨 및 글리신을 포함할 수 있다. 일 구체예로 상기 첨가제는 아르기닌 및 히스티딘을 포함할 수 있다. 일 구체예로 상기 첨가제는 아르기닌 및 글리신을 포함할 수 있다. 일 구체예로 상기 첨가제는 히스티딘 및 글리신을 포함할 수 있다. 이때, 각각의 첨가제는 상술한 농도로 약제학적 제제에 포함될 수 있다.
상기 약제학적 제제의 일 구체예는 (a) 100 mg/mL 내지 250 mg/mL의 항-FcRn 항체, (b) 50 내지 250 mM의 L-아르기닌 또는 이의 염산염, (c) 50 내지 250 mM의 L-히스티딘 및 (d) 0.01 내지 0.05%의 폴리소르베이트 20을 포함하는, pH 5.0 내지 6.0의 약제학적 제제 일 수 있다.
이때, 상기 항-FcRn 항체는 상술한 바와 같다. 또한, 상기 약제학적 제제는 수성 제제일 수 있으며, 주사형 액상 제제일 수 있다. 또한, 상술한 약제학적 제제는 피하로 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 약제학적 제제는 가속 조건에서 매우 안정함을 확인하였다. 구체적으로 가속 조건(25℃, 상대습도 60%)에서 6개월 테스트 결과 응집체 및 단편의 함유량이 약 10% 이하일 수 있다. 또한, 상기 조건에서 응집체 및 단편의 함유량은 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5.5% 이하 또는 약 5.0% 이하 일 수 있다.
뿐만 아니라, 상기 약제학적 제제는 장기 보존 조건에서도 매우 안정적임을 확인하였다. 구체적으로, 5℃, 36개월 조건에서 응집체 및 단편의 함유량이 약 10% 이하일 수 있다. 또한, 상기 조건에서 응집체 및 단편의 함유량은 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1.8% 이하, 약 1.5% 이하 또는 약 1.2% 이하 일 수 있다.
또한, 상기 약제학적 제제는 자가면역 질환의 치료에 사용될 수 있다. 이때, 자가면역 질환은 중증 근무력증(Myasthenia Gravis, MG), 갑상선눈병증(Thyroid Eye Disease, TED), 온 자가면역 용혈성 빈혈(Warm Autoimmune Hemolytic Anemia, WAIHA), 시신경척수염(Neuromyelitis Optica, NMO), 특발성 혈소판 감소성 자반증(Immune Thrombocytopenic Purpura, ITP), 보통 천포창(Pemphigus Vulgaris, PV), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy, CIDP), 루프스 신염(Lupus Nephritis, LN), 및 막성신증(Membranous Nephropathy, MN)으로 이루어진 군으부터 선택된 어느 하나 일 수 있다.
HL161BKN에 최적화된 제형 스크리닝
HL161BKN을 각 조건별로 약 210 mg/mL 농도로 제조하여 40℃ 가속조건에서 4주간 보관하며, 농도(A280), 탁도(A340), 순도(SEC-HPLC, CEX-HPLC), 점도, 삼투압, 불용성미립자(MFI) 분석 등을 수행하여 시료의 안정성 및 피하투여 적합성을 평가하였다.
우선, 기존 항체 제품에서 사용 빈도가 높은 부형제 11종을 대상으로 스크리닝 시험을 수행하였다. 그 결과, L-히스티딘, L-아르기닌 염산염, L-글리신, D-소르비톨, D-만니톨이 응집체 생성 감소 효과가 있음을 확인하였다.
이에 선정된 부형제 5종의 조합을 통한 시너지 효과를 시험하였다. 그 결과, L-아르기닌 염산염이 통계적으로 유의한 수준(p<0.01)으로 응집체 생성을 감소시키는 것을 확인하였다.
응집체 및 단편화에 대한 효과값(effect value) 비교 결과를 종합하여, L-히스티딘, D-만니톨을 부형제로 선택하였다. 또한, 추가 부형제 스크리닝 결과, 응집 생성 감소 효과를 나타낸 L-메티오닌을 추가로 선정하였다. 또한, 히스티딘을 기본 버퍼로 사용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 제품의 보관 및 이송 중 발생할 수 있는 교반 스트레스에 의한 응집체 생성 억제 효과를 나타낸 고순도의 0.02% 폴리소르베이트 20을 선택하였다.
다음으로 선정된 히스티딘 기본 버퍼와 L-아르기닌 염산염, D-만니톨, L-메티오닌 부형제의 1차 농도 스크리닝 시험을 수행하였다. 이때, PBS20 농도를 0.02%로 고정하고 수행하였다. 그 결과, 부형제 없이 50 mM 히스티딘 기본 버퍼 조건에서의 높은 안정성을 확인할 수 있었다. 또한, 부형제 조건에 따른 응집체 및 단편 증가량은 유의적 차이를 보이지 않았으나, L-아르기닌 염산염 첨가 농도가 높을수록 응집체 생성이 감소되었다.
반면 D-만니톨 유무 및 L-메티오닌 농도에 따른 차이는 거의 없는 것으로 확인되었다. 따라서, HL161BKN 제형으로 L-히스티딘 기본 버퍼에 L-아르기닌 염산염, 0.02% PSB20을 선정하였다.
마지막으로, L-히스티딘 및 L-아르기닌 염산염의 최적 농도를 선정하기 위해 HL161BKN 2배치를 가지고, 2차 농도 스크리닝을 수행하였다. 그 결과, 부형제 농도 조건에 따른 응집체 및 단편 증가량은 유의적 차이를 보이지 않았으며, 모든 조건에서의 점도 및 삼투압 측정값이 피하투여에 적합한 20 cP 이하, 250 ~ 500 mOsmol/kg로 확인되었다.
또한 각 조건 시료에 대하여 미세 유체 이미징(Micro flow imaging, MFI)을 이용한 불용성 미립자 분석을 수행한 결과, 불용성 미립자(sub-visible particles) 수 증가가 가장 적었던 조건을 확인하였으며, 순도(aggregates 및 fragments), 점도, 삼투압 시험을 통한 안정성 및 피하주사(SC) 투여 적합도를 평가하여 최종 제형을 선정하였다.
결론적으로, HL161BKN의 비임상 및 임상 1상 시험을 위한 제형을 약 100 mM L-히스티딘, 약 100 mM L-아르기닌 염산염, 약 0.02% 폴리소르베이트 20(pH 6.0)으로 선정하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
I. HL161BKN의 제조
제조예 1. HL161 항체를 제조하기 위한 유전자 컨스트럭트 및 벡터 준비
HL161BKN을 제조하기 위하여 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 중쇄를 코딩하는 서열번호 3의 핵산 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 pCHO 1.0 벡터(Life Technologies)에 적재하였다. 또한, 서열번호 2의 아미노산을 포함하는 경쇄를 코딩하는 서열번호 4의 핵산 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 pCHO 1.0 벡터에 적재하였다.
제조예 2. HL161BKN 세포주 제작 및 생산
제조예 1에서 제작한 발현 벡터를 이용하여 CHO-S 세포에 형질전환하고 methotrexate와 puromycin의 선별 과정을 거친 후, 최종 생산 세포주를 제작하였다. 제작한 세포주는 cell bank로 제작하여 보관함으로서 HL161BKN 생산에 이용하였다. 항체 생산은 배양 배지(Dynamis medium + 8 mM L-glutamine)가 들어 있는 바이오리액터에서 2일 간격으로 첨가 배지(EFB+)를 첨가함으로써 약 15일동안 배양한 후 상등액을 회수하였다. 그 후, Protein A 컬럼을 수행하고, low pH에서 viral inactivation 시킨 후, Anion exchange chromatography(AEX) 및 Cation exchange chromatography(CEX)를 수행하였다. 그 후, 농축 및 buffer 교환(Ultrafiltration/Diafiltration) 후, 제균 여과하는 단계로 정제하였다. SEC-HPLC, CE-SDS, cIEF, ELISA, Potency, Concentration 등의 분석을 통해 생산한 항체 시료의 품질을 확인하였다.
제조예 3. HL161BKN의 기본 특성 분석
HL161BKN의 열 안정성과 pH에 따른 가속 조건에서의 안정성 시험, 용해도 시험을 진행하였다. 열 안정성은 DSC(differential scanning calorimetry)로 Tm 값을 분석하였으며, pH 별 가속조건 실험은 37℃에서 1개월간 보관하면서 응집체 및 단편 생성 정도를 모니터링 하였다.
Tm 값 분석을 위한 DSC는 오송 첨단의료산업진흥재단 장비를 이용하였다. 25℃ ~ 100℃ 범위에서 실험하였으며 그 결과는 도 1과 같이 확인되었다. IgG1 type의 전형적인 DSC histogram을 나타냈으며, CH 도메인과 Fv 도메인에 따른 커브를 확인할 수 있었다. HL161BKN은 79.9℃의 높은 Tm을 나타내 열역학적으로 매우 안정한 것으로 분석되었다.
또한, pH 5.0, 6.0, 7.0, 및 8.0의 시트르산 나트륨-포스페이트 버퍼를 이용하여, HL161BKN 농도를 10 mg/mL로 제조하였다. 그 후, 37℃에 4주 보관하면서 SEC-HPLC를 이용한 응집체(aggregates) 또는 단편(fragments) 생성 정도를 확인하였다. 그 결과, pH가 높을수록 응집체 또는 단편 발생이 증가하였다(도 2).
이 결과를 토대로 낮은 pH인 5.0과 6.0의 저농도 또는 고농도의 버퍼들을 이용하여 HL161BKN을 100 mg/mL로 제조 후, 40℃ 가속 조건에서 4주간 보관하며 안정성 시험을 수행하였다. 그 결과, HL161BKN은 낮은 pH 조건인 pH 5.0 ~ 6.0에서 안정한 경향을 나타냈으며, 모든 조건에서 전체적으로 단량체(monomer)가 높은 수준을 유지하였다.
또한, HL161BKN의 용해도를 확인하고자 10 ~ 300 mg/mL 농도까지 6단계로 농축하면서, 단계별로 시료를 채취하여 육안 관찰, A280 nm(농도), A340 nm(탁도, turbidity), SEC-HPLC 순도 분석을 실시하였다. 그 결과 HL161BKN은 농도가 증가함에 따라 탁도가 점차 증가되나, 268 mg/mL 농도까지 단량체 순도 변화는 거의 없음을 확인하였다.
II. HL161BKN에 최적화된 제형 선별
준비예 1. HL161BKN에 최적화된 제형 스크리닝
본 실험목적은 HL161BKN의 고농도 피하투여 제품 개발을 위한 원액(drug substance) 및 제품(drug product)의 제형을 선정하기 위함이다. 본 실험에는 HL161BKN-B005, HL161BKN-B018, HL161BKN-B021 3개의 생산 배치를 이용하였으며 사용한 시약 및 기구는 하기와 같다(표 3).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000003
본 제형 테스트를 위해 사용한 기기는 다음과 같다(표 4).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000004
준비예 2. 시험 방법
HL161BKN의 제형 선정 시험은 크게 부형제 스크리닝과 부형제 농도 스크리닝 시험으로 나누어 수행하였다. 구체적으로, 도 3과 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
실시예 1. 부형제 스크리닝
실시예 1.1. 부형제 테스트
현재 시판중인 항체 제품에서 사용 빈도가 높은 11종의 부형제로 수크로오스(Sucrose), D-트레할로스(D-Trehalose), D-만니톨(D-Mannitol), D-소르비톨(D-Sorbitol), L-아르기닌 염산염(L-Arginine HCl), L-히스티딘 염산염(L-Histidine HCl), L-히스티딘(L-Histidine), L-글리신(L-Glycine), 폴리소르베이트 20(Polysorbate 20), 폴리소르베이트80(Polysorbate 80), 염화나트륨(NaCl)을 선정하였다. 구체적으로, 5 mM 시트르산 나트륨(sodium citrate)(pH 6.0)을 기본 버퍼로 하여 12가지 buffer 조건에서 excipients test를 수행하였다(표 5).
HL161BKN을 Amicon®(Cut off MW. 30,000)을 이용하여 1 mL 이하로 농축 후, 해당 buffer 조건으로 버퍼교환 하여 최종 농도가 210 mg/mL이 되도록 제조하였다. 각 조건별 시료는 0.3 ~ 0.5 mL씩 제조하였으며, 1.5 mL 마이크로원심분리기 튜브에 담아 40℃, 4주간 보관하였다. 0, 2, 4주차에 시료를 샘플링하여 농도(A280), 탁도(A340), 순도(SEC-HPLC, CEX-HPLC)의 변화를 평가하였다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000005
실시예 1.2. 부형제 조합 테스트
실시예 1.1에서 선정된 5종의 부형제(L-히스티딘, L-아르기닌 염산염, L-글리신, D-소르비톨, D-만니톨)를 조합할 경우 시너지 효과가 있는지 확인하였다. 구체적으로 DOE(design of experiments) software(Stat-ease Design-Expert®, version 7.0)를 사용하여 2 level factorial(2n-1) design으로 17가지 조건 시험을 계획하였다(표 6). 구체적으로, 5 mM 시트르산 나트륨(pH 6.0) 기본 버퍼 조건과 11가지 부형제 조합 조건의 총 12가지 조건 시험을 수행하였다. 또한, 5가지 excipient 단독 조건 시험은 실시예 1.1의 시험 결과를 사용하였다.
시험 방법은 실시예 1.1과 동일하게 수행하였으며 추가로 각 조건별 버퍼 및 시료에 대한 삼투압을 측정하였고, 상기 DOE Software를 사용하여 ANOVA 분석 및 효과값(effects value)를 계산하였다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000006
실시예 1.3. 추가 부형제 테스트
HL161BKN 제형 시험에 대한 부형제 추가 분석을 진행하였다.
공유 결합 응집(Covalent aggregates) 감소 효과가 알려진 L-메티오닌의 추가 시험과 주사(injection)시 통증을 유발할 수 있는 시트르산 나트륨(pH 6.0) 기본 버퍼를 히스티딘(pH 6.0)으로 변경 시험을 수행하였다. 또한, peroxide가 많이 함유된 저품질의 PSB20(Polysorbate 20) 사용 시 산화에 의해 항체 안정성이 감소하므로, 제형용 고품질의 PSB20으로 변경하였다. 그 후, 상기 제형을 일반적으로 많이 사용되는 0.02% 농도에서 교반 스트레스(agitation stress)에 대한 영향을 확인하였다. 그리고, 고농도 항체 제품의 점도를 감소시킬 수 있는 부형제를 스크리닝하였다.
실시예 1.3.1. L-메티오닌 및 히스티딘 기본 버퍼(Histidine basal buffer) 테스트
L-메티오닌 효과와 기본 버퍼인 5 mM 시트르산 나트륨(pH 6.0)을 히스티딘(pH 6.0)으로 변경 가능한지 확인하고자 표 7의 6가지 조건으로 시험을 수행하였다. 히스티딘 기본 버퍼의 경우, L-히스티딘과 L-히스티딘 염산염을 혼합하여 pH 6.0이 되도록 제조하여 사용하였다. 시험 방법은 실시예 1.1과 동일하게 수행하였다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000007
실시예 1.3.2. 폴리소르베이트 20(PSB20) 테스트
교반 스트레스(Agitation stress)에 대한 PSB20의 보호 효과를 확인하고자 표 8의 4가지 조건으로 시험을 수행하였다. 실시예 1.1과 동일하게 제조된 시료를 1.5 mL 마이크로원심분리기 튜브에 0.5 mL씩 담고 MyLab intelli mixer에 장착하여 실온에서 1주일 동안 10 rpm으로 회전시킨 후, 농도, 탁도, 순도(SEC-HPLC) 분석을 수행하였다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000008
실시예 1.3.3. 점도 감소를 위한 부형제 스크리닝
HL161BKN 고농도 제품을 피하투여 경로로 개발하기 위해 일반적으로 점도를 감소시킨다고 알려져 있는 8종의 부형제를 테스트하였다. 50 mM 히스티딘(pH 6.0)을 기본 버퍼로 하여 총 9가지 부형제 스크리닝 시험을 수행하였다(표 9).
시료를 실시예 1.1과 동일한 방법으로 각 조건별 1 mL씩 제조하여 25℃에서 점도를 측정하였다. 또한, 4주 가속 안정성시험을 수행하면서 각 조건 별 농도(A280), 순도(SEC-HPLC) 변화를 평가하였다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000009
실시예 1.4. 부형제 농도 스크리닝
실시예 1.4.1. 1차 부형제 농도 스크리닝
실시예 1.1, 1.2 및 1.3을 통해서 선정된 50 mM 히스티딘(pH 6.0) 기본 버퍼와 부형제 4종(L-메티오닌, L-아르기닌 염산염, D-만니톨, PSB20) 중 3종(L-메티오닌, L-아르기닌 염산염, D-만니톨)에 대하여 2 level factorial(2n) design의 DOE 시험을 계획하여 총 9가지 조건으로 부형제 농도 스크리닝을 수행하였다(표 10).
실험은 실시예 1.1과 동일하게 수행하였으며, 농도(A280), 탁도(A340), 순도(SEC-HPLC, CEX-HPLC), 점도, 삼투압 변화를 분석하였다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000010
실시예 1.4.2. 2차 부형제 농도 스크리닝
최종 선정된 히스티딘 기본 버퍼와 부형제 2종(L-아르기닌 염산염, PSB20) 중, L-아르기닌 염산염의 최적 농도 탐색을 위하여 4가지 조건에서 4주 40℃ 가속 안정성 시험을 HL161BKN B018 및 B021의 2배치를 사용하여 수행하였다(표 11). 시험은 실시예 1.1과 동일하게 수행하였으며, 농도(A280), 탁도(A340), 순도(SEC-HPLC, CEX-HPLC), 점도, 삼투압, 불용성 미립자(Micro flow imaging; MFI)를 분석하였다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000011
실시예 2. 부형제 스크리닝 시험결과
실시예 2.1. 부형제 테스트 수행 결과
부형제 스크리닝을 위해 선정된 11종 부형제의 HL161BKN 시료 안정성에 대한 영향을 평가하기 위해 40℃ 가속조건의 0, 2, 4주차에 농도, 탁도, 순도, 응집체(aggregates), 단편(fragments) 및 전하 변이체(charge variants) 분석을 수행하였다. 이러한 분석을 통해, 응집체 및 단편의 생성을 억제하는 효과가 좋은 5 종(L-아르기닌 염산염, L-히스티딘, D-만니톨, L-글리신, D-소르비톨)의 부형제를 선정하였다.
실시예 2.1.1. 농도(A280) 및 탁도(A340) 분석 결과
HL161BKN 농도가 4주 동안 증가하였으며(표 12), 이는 40℃ 가속조건에서 버퍼 증발에 의한 것으로 추정되었다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000012
반면, 대부분의 조건에서 탁도는 증가하지 않거나, 0.020 이하의 변화량을 보였다. 단, PSB20 조건에서 육안으로 뿌옇게 변한 것이 관찰되었으며 탁도(A340) 역시 크게 증가한 것으로 확인되었다(표 13).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000013
실시예 2.1.2. 응집체 및 단편 분석 결과
SEC-HPLC를 이용하여 각 부형제 조건 별 응집체 및 단편 증가량을 비교 평가하였다(표 14). 기본 버퍼 조건과 비교하여 L-아르기닌 염산염, L-히스티딘, L-히스티딘 염산염, D-만니톨, L-글리신, D-소르비톨은 응집체 생성을 효과적으로 억제하였다. 또한, 0.2% PSB20, 0.2% PSB80, NaCl은 오히려 응집체 생성을 증가시켰다. 그리고, 단편 생성을 억제하는 부형제는 L-히스티딘, L-히스티딘 염산염, L-아르기닌 염산염, L-글리신이었으며, NaCl은 단편 생성을 증가시켰다(표 14 및 도 4).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000014
실시예 2.1.3. 전하 변이체 분석 결과
CEX-HPLC를 이용하여 각 부형제 조건에 따른 HL161BKN의 전하 변이체(charge variants) 변화 양상을 확인하였다. 그 결과, 뚜렷한 전하 변이체 변화를 관찰할 수 없었다. 다만, PSB20과 NaCl 조건에서 주요 피크(main peak)가 많이 감소하였다(도 5). 이는 응집체 증가로 인한 결과로 예상되었다.
실시예 2.2. 부형제 조합 테스트 결과
실시예 1.1의 부형제 테스트에서 선정된 5종의 부형제 조합에 의한 HL161BKN 시료 안정성 효과를 평가하였다. 구체적으로 40℃, 4주 가속 시험을 실시하였으며, 응집체 및 단편의 생성을 효과적으로 억제하는 L-아르기닌 염산염, L-히스티딘, 및 D-만니톨을 선정하였다.
부형제 스크리닝 시험을 통해 선정된 부형제에 대하여 조합(combination)을 통한 시너지 효과가 있는지 확인하고자 design of experiments(DOE) software를 사용하여 조건시험을 계획하였다. 기본 buffer 조건과 11가지 excipients combination조건의 총 12가지 조건 시험을 수행하였다. 5가지 excipients 단독 조건 시험은 실시예 1.1의 시험 결과를 사용하였다(표 15).
응집체 변화량 비교 결과를 ANOVA로 분석하였을 때 통계적으로 유의한 수준(p<0.01)으로 aggregates 생성을 감소시키는 부형제를 찾았다. 그러나 단편 생성을 통계적 유의 수준으로 감소시키는 부형제는 없었다.
반면, HL161BKN의 경우 부형제 조합에 따라 응집체 생성 양상이 달랐으나, 부형제 조합에 의한 시너지 효과는 없었다. ANOVA 분석 및 effect value 비교 순위를 참고하여 부형제 종류를 선정하였다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000015
실시예 2.2.1. 농도(A280) 및 탁도(A340) 분석 결과
HL161BKN 농도가 4주 동안 증가하였으며, 이는 40℃ 가속조건에서 버퍼 증발에 의한 것으로 추정되었다(표 16). 반면 탁도는 증가하지 않거나 0.054 이하로 미미한 증가를 보였다(표 17).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000016
Figure PCTKR2021008000-appb-T000017
실시예 2.2.2. 응집체 및 단편 분석 결과
SEC-HPLC를 이용하여 각 부형제 조합 조건 별 응집체 및 단편 증가량을 비교 평가하였다(표 18 및 도 7). 또한, 실시예 1.1의 부형제 단독 조건시험을 포함하여 총 17가지 조건에 대한 SEC-HPLC 데이터를 ANOVA 분석하였다. 그 결과, L-아르기닌 염산염이 통계적으로 유의한 수준(p<0.01)으로 응집체 생성을 감소시키는 것으로 확인되었으며(도 6), 단편 생성을 통계적으로 유의한 수준까지 감소시키는 부형제는 없었다.
또한, 응집 및 단편화에 대한 effect value를 비교한 결과, L-히스티딘, D-만니톨, D-소르비톨을 부형제로 사용하였을 경우, HL161BKN의 응집체 및 단편 생성이 감소함을 확인할 수 있었다. 그러나, 부형제간의 시너지 효과는 없었다. D-만니톨과 D-소르비톨은 이성질체로써 둘 중 사용 빈도가 높은 D-만니톨을 선택하였다(도 8).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000018
* A: 50 mM L-아르기닌 염산염, H: 50 mM L-히스티딘, G: 100 mM L-글리신, M: 200 mM D-만니톨, S: 250 mM D-소르비톨
실시예 2.2.3. 전하 변이체 분석 결과
CEX-HPLC를 이용하여 부형제 조합 조건에 따른 HL161BKN의 전하 변이체 변화 양상을 확인하였다. 그 결과, 뚜렷한 전하 변이체(basic 및 acidic variants) 변화를 관찰할 수 없었다(도 9).
실시예 2.2.4. 점도 및 삼투압 분석 결과
각 부형제 조합 조건별 점도를 측정한 결과, L-아르기닌 염산염 첨가 시 점도가 감소되는 경향이 확인되었다. 삼투압은 첨가된 부형제의 개수와 농도가 증가할수록 높아졌다. 구체적으로, 50 mM L-아르기닌 염산염, 50 mM L-히스티딘, 100 mM L-글리신 첨가 시에 각각 약 100 mOsmol/kg, 200 mM D-만니톨 첨가 시에 약 200 mOsmol/kg, 250 mM D-소르비톨 첨가 시에 약 250 mOsmol/kg의 삼투압이 증가되는 것으로 확인되었다(표 19).
일반적으로 피하 주사제들의 삼투압은 체내 삼투압(약 290 mOsmol/kg)과 유사하며 약 250 ~ 500 mOsmol/kg 범위로 조절된다(PCT/EP2009/066675). 따라서 HL161BKN 농도를 감안하여 제형 버퍼의 삼투압은 약 220 ~ 450 mOsmol/kg 범위로 조절되어야 한다고 판단되었다. 이에 삼투압 범위를 고려하여 추후 부형제 농도 스크리닝 시험을 진행하기로 하였다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000019
* A: 50 mM L-아르기닌 염산염, H: 50 mM L-히스티딘, G: 100 mM L-글리신, M: 200 mM D-만니톨, S: 250 mM D-소르비톨
실시예 2.3. 추가 부형제 테스트 수행 결과
추가 부형제 시험을 수행하였다. 그 결과, 50 mM 히스티딘(pH 6.0)을 기본 버퍼로 사용하며, 응집 생성을 억제하는 효과가 있는 L-메티오닌과 교반 스트레스 조건하에서 응집체 생성을 억제하는 0.02% PSB20을 추가 부형제로 선택하였다.
실시예 2.3.1. L-메티오닌 및 히스티딘 기본 버퍼 테스트 수행 결과
1) 농도(A280) 및 탁도(A340) 분석 결과
HL161BKN 농도가 4주 동안 증가하였으며, 이는 40℃ 가속조건에서 버퍼 증발에 의한 것으로 추정되었다(표 20). 탁도는 증가되지 않거나 0.1 이하로 미미한 증가를 보였다(표 21).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000020
Figure PCTKR2021008000-appb-T000021
2) 응집체 및 단편 분석 결과
기본 버퍼 조건과 비교하여 L-메티오닌이 응집체 생성을 억제하는데 우수한 효과를 나타내었다. 또한, 0.02% PSB20에 의한 응집체 생성 증가는 없었다. 또한 L-히스티딘을 부형제로 첨가한 조건과 기본 버퍼로 사용한 조건의 결과는 유사하였으며, 10 mM 히스티딘보다 50 mM 히스티딘 조건에서 응집체 생성이 감소하였다(표 22 및 도 10).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000022
3) 전하 변이체 분석 결과
CEX-HPLC 분석 결과, 뚜렷한 전하 변이체(basic 및 acidic variants)의 변화는 관찰할 수 없었다(도 11).
실시예 2.3.2. 폴리소르베이트 20 테스트 수행 결과
1) 농도(A280) 및 탁도(A340) 분석 결과
실온에서의 교반 시험 결과, 농도 변화는 거의 없었다. PSB20 없이 교반한 시료는 육안상 하얗게 변하여 탁도를 측정할 수 없었다(도 12). 반면, PSB20이 있는 시료는 교반조건시에 육안상 약간 뿌옇게 변하였으며, 탁도가 0.227 정도 증가하였다(표 23).
이를 통해 고농도 HL161BKN의 교반에 의한 스트레스를 PSB20이 보호하는 효과가 있음을 확인하였다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000023
2) 응집체 및 단편 분석 결과
교반 스트레스에 의해 응집체 생성이 증가되었으며, PSB20에 의한 응집체 생성 억제 효과를 확인할 수 있었다. 반면 교반 스트레스에 의한 단편 증가는 나타나지 않았다(표 24 및 도 13).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000024
실시예 2.3.3. 점도 감소를 위한 부형제 스크리닝 수행 결과
1) 농도(A280) 및 점도 분석 결과
HL161BKN 농도가 4주 동안 증가하였으며(표 25), 이는 40℃ 가속조건에서 buffer 증발에 의한 것으로 추정되었다. L-히스티딘 염산염, L-아르기닌 염산염, L-글리신 첨가 시, 조건 1 대비 점도가 감소되었으나 그 효과는 미미한 수준이었다. 반면, L-라이신 염산염, NaCl, Na2SO4, NH4Cl의 경우는 오히려 점도가 크게 증가하는 결과를 보였다(표 26).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000025
Figure PCTKR2021008000-appb-T000026
2) 응집체 및 단편 분석 결과
SEC-HPLC 분석을 통해 응집체 및 단편을 분석하였다. 그 결과, 조건 1 대비 L-히스티딘 염산염, L-아르기닌 염산염을 첨가했을 때 응집체가 상대적으로 적게 발생하였으며, 단편 생성을 감소시키는 부형제는 없었다(표 27 및 도 14).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000027
실시예 2.4. 부형제 농도 스크리닝 수행 결과
실시예 2.4.1. 1차 부형제 농도 스크리닝 수행 결과
상기 실시예 1.3에서 선정된 히스티딘 기본 버퍼(pH 6.0)와 0.02% PSB20에서의 부형제 3종(L-메티오닌, L-아르기닌 염산염, D-만니톨)의 농도를 스크리닝하고자 총 9가지 조건에서 시험을 수행하였다(표 28). 그 결과, 히스티딘 기본 버퍼에 L-아르기닌 염산염과 PSB20을 부형제로 선정하였다.
Figure PCTKR2021008000-appb-T000028
1) 농도(A280) 및 탁도(A340) 분석 결과
HL161BKN 농도가 4주간 약 15% 내외로 증가하였으며, 이는 40℃ 가속조건에서 버퍼 증발에 의한 것으로 추정되었다(표 29). 각 조건에서의 탁도는 평균 0.048 정도의 미미한 증가만을 나타내었다(표 30).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000029
Figure PCTKR2021008000-appb-T000030
2) 응집체 및 단편 분석 결과
SEC-HPLC 분석 결과, 각 부형제 농도 조건에 따른 응집체 및 단편 증가량은 유의적 차이를 보이지 않았다. 다만, 50 mM 히스티딘의 기본 버퍼 조건(조건 1)에서의 안정성이 높게 나타났으며, 50 mM 보다 100 mM L-아르기닌 염산염 첨가시 응집체 생성이 감소되었다. 그리고, L-메티오닌의 농도 및 D-만니톨 첨가 유무에 따른 응집체 및 단편 증가량은 기본 버퍼 조건과 거의 차이가 없거나 약간 증가된 것으로 확인되었다(표 31 및 도 15).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000031
3) 전하 변이체 분석 결과
CEX-HPLC 분석 결과, 각 부형제 조건에 따른 뚜렷한 전하 변이체(charge variants) 변화는 관찰되지 않았다(도 16).
4) 점도 및 삼투압 분석 결과
각 부형제 농도 조건에 따른 점도와 삼투압 측정 결과, 50 mM 보다 100 mM 농도의 L-아르기닌 염산염 첨가 조건에서 점도 감소효과가 큰 것을 확인하였으며, 112 ~ 588 mOsmol/kg로 대부분 삼투압 기준을 만족하였다(표 32).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000032
실시예 2.4.2. 2차 부형제 농도 스크리닝
실시예 1.4.1의 1차 부형제 농도 스크리닝에서 선정된 히스티딘 기본 버퍼와 2 종의 부형제 중, L-아르기닌 염산염의 최적 농도 선정을 위해 4가지 조건에서 HL161BKN 2 배치 시료(HL161BKN B018, HL161BKN B021)로 농도, 탁도, 순도(aggregates 및 fragments), 점도, 삼투압 시험을 통한 안정성 및 피하주사(SC) 투여 적합도를 평가한 결과, 100 mM L-히스티딘, 100 mM L-아르기닌 염산염, 0.02% PSB20, pH 6.0을 HL161BKN의 최종 제형으로 결정하였다(표 33).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000033
1) 농도(A280) 및 탁도(A340) 분석
HL161BKN 농도가 4주간 변화가 거의 없었으며, 이는 1.5 mL 마이크로원심분리기를 파라필름(parafilm)으로 밀봉한 후, 항온항습기에 보관함으로써 버퍼의 증발을 방지한 효과로 예상되었다(표 34). 그리고, 탁도는 모든 조건에서 0.102 이하로 미미한 증가를 보였다(표 35).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000034
Figure PCTKR2021008000-appb-T000035
2) 응집체 및 단편 분석
SEC-HPLC 분석을 통하여, 각 부형제 조건에 따른 응집체 및 단편 증가량은 유의적 차이를 보이지 않았으나, 조건 3(100 mM L-Histidine, 100 mM L-Arginine HCl, 0.02% PSB20, pH 6.0)과 조건 4(50 mM L-Histidine, 100 mM L-Arginine HCl, 0.02% PSB20, pH 6.0)에서의 응집체 생성이 가장 적은 것으로 확인되었다(표 36 및 도 17).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000036
3) 전하 변이체 분석
CEX-HPLC 분석 결과, 각 부형제 조건에 따른 뚜렷한 전하 변이체(basic 및 acidic variants) 변화는 관찰되지 않았다(도 18).
4) 점도 및 삼투압 분석
각 부형제 농도 조건에 따른 점도 및 삼투압 측정 결과, 점도는 11 ~ 16 cP로 피하투여 제품의 점도 한계인 20 cp 이하로 조절이 되었으며, 삼투압은 350 ~ 465 mOsmol/kg으로 기준인 250 ~ 500 mOsmol/kg에 적합하였다(표 37).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000037
5) 불용성 미립자 분석
HL161BKN의 각 부형제 조건 시료에 대하여 미세 유체 이미징(Micro flow imaging, MFI)을 이용한 불용성 미립자 분석을 오송 첨단의료산업진흥재단 신약개발 지원센터에서 진행하였다.
각 조건의 시료를 10 mg/mL로 희석하여 5 ㎛ ~ 100 ㎛ 범위의 미립자(sub-visible particles) 수 증가량을 비교하였다. 그 결과, 조건 3에서 미립자 수 증가가 가장 적었다(표 38 및 도 19).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000038
실시예 3. 안정성 시험
HL161BKN에 대해 최종 선정된 제제 조건에서 36개월 장기보존 및 가속 안정성 시험을 Catalent(USA)사에서 수행하였다. 안정성 평가를 위하여 완제의약품(Drug product, DP)는 Borosilicate glass vial과 테플론(teflon)이 코팅된 고무 마개(rubber stopper)를 사용하여 보관하였다. 선정된 제제 조건으로 안정성을 확인한 결과, 36개월 동안 DP의 안정성이 확인되어 주사제로서의 개발 가능성을 확보하였다(표 39 및 표 40).
Figure PCTKR2021008000-appb-T000039
Figure PCTKR2021008000-appb-T000040
실시예 4. 최종 개발 후보 항체 제형 선정
HL161BKN은 상기 제형에서 고농도에서 매우 안정한 경향을 나타내기 때문에 피하 투여 주사제 형태로의 개발 가능성을 확인하고자 하였다. 주사제를 개발하는 경우 투여 부위의 통증 및 부작용을 줄이기 위해 피하 투여가 가능한 점도는 20 cP 이하가 적합한 것으로 알려져 있다. 이에 따라 HL161BKN을 9단계 농도 조건으로 농축하여 5℃, 25℃ 조건에서 viscosity를 측정하였다. 170 mg/mL의 고농도 HL161BKN 시료의 점도를 확인한 결과, 25℃에서 10 cP로 확인되어 피하 투여가 가능함을 확인하였다(도 20).
HL161BKN은 상기 제형 연구에서 200 mg/mL 이상의 고농도에서도 매우 안정한 성질을 가짐이 확인되었다. 이로서 향후 자가 투여가 가능한 SC 주사제 제품 형태로 개발이 가능할 것으로 예상되며 타사 경쟁 제품들이 모두 infusion 형태의 제품인 것을 감안할 때 환자 편의성 증대라는 차별화가 가능하다.
뿐만 아니라, 상기 제형에서 고농도의 HL161BKN가 안정함을 확인하였으므로, 저농도의 HL161BKN도 상기 제형에서 안정할 것으로 예상된다. 따라서, 다양한 농도의 HL161BKN에 상기 제형은 적용될 수 있다.

Claims (17)

  1. (a) 항-FcRn 항체 또는 이의 단편,
    (b) 만니톨, 솔비톨, 아르기닌, 히스티딘, 글리신 및 이들의 염으로부터 선택되는 1종 이상의 첨가제,
    (c) 시트레이트 또는 히스티딘으로부터 선택된 완충 시스템, 및
    (d) 계면활성제
    를 포함하는 pH 4.0 내지 8.0의 약제학적 제제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 첨가제가 아르기닌 또는 이의 염이고,
    상기 완충 시스템이 히스티딘인, 약제학적 제제.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 계면활성제는 폴리소르베이트인 것인, 약제학적 제제.
  4. 제1항에 있어서,
    추가적으로 메티오닌을 포함하는, 약제학적 제제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 제제는 주사제형인 것을 특징으로 하는 것인, 약제학적 제제.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 제제는 20 cP 이하의 점도를 갖는 것을 특징으로 하는 것인, 약제학적 제제.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 제제는 250 mOs/kg 내지 500 mOs/kg의 삼투압을 갖는 것을 특징으로 하는 것인, 약제학적 제제.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항-FcRn 항체 또는 이의 단편의 농도가 50 mg/mL 내지 250 mg/mL인 것인, 약제학적 제제.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항-FcRn 항체 또는 이의 단편의 농도가 80 mg/mL 내지 250 mg/mL인 것인, 약제학적 제제.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 제제의 pH는 4.0 내지 7.0인 것인, 약제학적 제제.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 항-FcRn 항체는
    서열번호 5의 아미노산을 가지는 H-CDR1, 서열번호 6의 아미노산을 가지는 H-CDR2, 및 서열번호 7의 아미노산을 가지는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하며;
    서열번호 8의 아미노산을 가지는 L-CDR1, 서열번호 9의 아미노산을 가지는 L-CDR2, 및 서열번호 10의 아미노산을 가지는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인,
    약제학적 제제.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 제제는 피하로 투여되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 제제.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 제제는
    (a) 50 mg/mL 내지 250 mg/mL의 항-FcRn 항체,
    (b) 50 내지 250 mM의 L-아르기닌 또는 이의 염산염,
    (c) 50 내지 250 mM의 L-히스티딘 버퍼 및
    (d) 0.01 내지 0.05%의 폴리소르베이트 20을 포함하며,
    pH 4.0 내지 7.0인 것을 특징으로 하는, 약제학적 제제.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 제제는 가속 조건 하(25℃ 상대습도 60%) 6개월 보관 시 HL161BKN의 응집체 및 단편의 양이 10% 이하인, 안정성이 증가된, 약제학적 제제.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 제제는 장기보존 조건(5℃) 하 36개월 보관 시 HL161BKN의 응집체 및 단편의 양이 10% 이하인, 안정성이 증가된, 약제학적 제제.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 제제는 장기보존 조건(5℃) 하 36개월 보관 시 HL161BKN의 응집체 및 단편의 양이 5.0% 이하인, 안정성이 증가된, 약제학적 제제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적 제제는 중증 근무력증, 갑상선눈병증, 온 자가면역 용혈성 빈혈, 시신경척수염, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 보통 천포창, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 루프스 신염, 및 막성신증으로 이루어진 군으부터 선택된 자가면역 질환의 치료를 위한 것인, 약제학적 제제.
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