WO2021200940A1 - 血中アミロイドβの免疫測定方法及びそのためのキット - Google Patents

血中アミロイドβの免疫測定方法及びそのためのキット Download PDF

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    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay method for blood amyloid ⁇ and a kit for that purpose.
  • Amyloid ⁇ is known as a biomarker for Alzheimer's disease, and it is known to measure amyloid ⁇ in a sample by immunoassay (Patent Document 1), and a kit for that purpose is also commercially available. Many commercially available immunoassay kits for amyloid ⁇ use cerebrospinal fluid (CSF) as a sample. On the other hand, it is known that amyloid ⁇ is also present in blood in patients with Alzheimer's disease. Since CSF collection is invasive, it would be advantageous if amyloid ⁇ in blood samples could be measured immunologically.
  • CSF cerebrospinal fluid
  • an object of the present invention is to provide an immunoassay method capable of measuring amyloid ⁇ in a blood sample with high sensitivity and a kit for that purpose.
  • amyloid ⁇ in a blood sample can be measured with high sensitivity by performing the above, and have reached the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • a method for immunoassaying amyloid ⁇ in a blood sample wherein the immunoassay is performed in the presence of an anionic polymer.
  • the anionic polymer is an anionic polymer having a sulfate group or a sulfo group in the side chain.
  • the anionic polymer is at least one selected from the group consisting of dextran sulfuric acid and its salt, polystyrene sulfonic acid and its salt, and heparin sulfuric acid and its salt.
  • the anionic polymer is sodium dextran sulfate.
  • the immunoassay is a sandwich method, and in the presence of the anionic polymer, the amyloid ⁇ in the blood sample and an anti-amyloid ⁇ antibody immobilized on a solid phase or an antigen-binding fragment thereof.
  • a kit for immunoassaying amyloid ⁇ in a blood sample which comprises an anti-amyloid ⁇ antibody or an antigen-binding fragment thereof, and an anionic polymer.
  • the immunoassay is a sandwich method, which comprises a solid phase in which an anti-amyloid ⁇ antibody or an antigen-binding fragment thereof is immobilized, and an anionic polymer.
  • the solid phase is a particle, and the particle liquid containing the particle and the anionic polymer is provided.
  • amyloid ⁇ in a blood sample can be measured with high sensitivity.
  • the sample used for the immunoassay method of the present invention is a blood sample.
  • Blood samples include whole blood, serum, and plasma. Preferably, it is serum or plasma.
  • purified amyloid ⁇ is added to plasma and buffer, and gel filtration is performed by an experiment comparing the recovery level (count value) of the added amyloid ⁇ using immunoassay. It was found that there is a substance (coating substance) that suppresses the reaction between amyloid ⁇ and anti-amyloid ⁇ antibody, which is eluted in a fraction corresponding to a molecular weight of 300 to 400 kDa by chromatography. Furthermore, as a result of research, it was found that the inhibition of binding by the coating substance can be reduced by performing an immunoassay antigen-antibody reaction in the presence of an anionic polymer. The present invention is based on this new finding and is characterized in that immunoassays are performed in the presence of anionic polymers.
  • Anionic polymers include dextran sulphate, heparin sulphate, chondroitin A sulphate, chondroitin B sulphate and chondroitin C sulphate and salts thereof, those having a sulfate group in the side chain, polystyrene sulfonic acid and salts thereof. , Those having a sulfo group in the side chain, and those having a carboxyl group such as poly (meth) acrylic acid and a salt thereof are preferable.
  • dextran sulfate polystyrene sulfonic acid and heparin sulfuric acid and salts thereof are more preferable, and dextran sulfate and polystyrene sulfonic acid and salts thereof are particularly preferable.
  • Dextransulfate and salts thereof are preferred.
  • the salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt.
  • the average molecular weight of the anionic polymer is usually about 1,000 to 5,000,000, about 2,000 to 4,000,000, about 3,000 to 2,000,000, and 4 as a mass average molecular weight. It is about 5,000 to 1,000,000, preferably about 5,000 to 700,000, and more preferably about 5,000 to 50,000.
  • Anionic polymers are amyloid ⁇ from a coating material and an anti-amyloid ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof (hereinafter, unless it is clear from the context, the term “antibody” refers to “antibody or its antigen”. It is clear that it is effective for any immunoassay method because it reduces the suppression of the antigen-antibody reaction with (meaning an antigen-binding fragment). That is, the immunoassay includes a sandwich method, a competitive method, an agglutination method, an immunochromatography method, and the like, and the present invention includes any of these immunoassays. These immunoassay methods themselves are well known and do not need to be described in detail here, but each will be briefly described.
  • sandwich method examples include chemiluminescent immunoassay (CLEIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay, and chemiluminescence immunoassay (ECLIA). ), Fluorescence Immunoassay (FIA), and other methods, and the present invention includes any of these methods.
  • CLIA chemiluminescent immunoassay
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • ELIA chemiluminescence immunoassay
  • FIA Fluorescence Immunoassay
  • the immunoassay of the present invention is not particularly limited, but may be a sandwich method.
  • the sandwich method includes, for example, a one-step sandwich method and a two-step sandwich method.
  • an anti-amyloid ⁇ antibody immobilized on a solid phase or an anti-amyloid ⁇ antibody immobilized on a solid phase (solid phase antibody) is contacted with amyloid ⁇ in a blood sample. Then, an antigen-antibody reaction between the solid-phase antibody and amyloid ⁇ is carried out (primary reaction).
  • the solid phase antibody is an anti-amyloid ⁇ antibody immobilized on the solid phase
  • the solid phase antibody is immobilized on the solid phase after the primary reaction. After that, B / F separation is performed.
  • amyloid ⁇ bound to the solid phase antibody and the anti-amyloid ⁇ antibody (labeled antibody) to which the labeling substance for detection is bound are brought into contact with each other to carry out an antigen-antibody reaction between the amyloid ⁇ and the labeled antibody (secondary). reaction).
  • B / F separation is performed, and the amyloid ⁇ in the blood sample can be measured by detecting the signal derived from the label of the labeled antibody bound to the amyloid ⁇ bound to the solid phase. Washing may be performed after B / F separation.
  • the solid phase antibody, the amyloid ⁇ in the sample, and the labeled antibody are brought into contact with each other to carry out an antigen-antibody reaction between the solid phase antibody and the amyloid ⁇ and an antigen-antibody reaction between the amyloid ⁇ and the labeled antibody.
  • the solid phase antibody is an anti-amyloid ⁇ antibody immobilized on the solid phase
  • the solid phase antibody is immobilized on the solid phase after the antigen-antibody reaction or at the same time as the antigen-antibody reaction.
  • B / F separation is performed, and the amyloid ⁇ in the blood sample can be measured by detecting the signal derived from the label of the labeled antibody bound to the amyloid ⁇ bound to the solid phase.
  • an antibody against the target antigen (amyloid ⁇ in the present invention) to be measured is immobilized on a solid phase (immobilization), and a blocking treatment for preventing nonspecific adsorption (solid phase with a protein solution such as serum albumin). After that, this antibody is reacted with a test sample containing the target antigen and a certain amount of labeled antigen, and after washing, the label bound to the solid phase is quantified. Since the antigen in the test sample and the labeled antigen competitively bind to the antibody, the larger the amount of antigen in the test sample, the smaller the amount of labeled antigen that binds to the solid phase.
  • Antigen standard solutions having various known concentrations were prepared, and the amount of labeling immobilized on the solid phase (the same applies hereinafter, such as absorbance, emission intensity, fluorescence intensity, etc., depending on the nature of the label) was measured for each of them to obtain the antigen concentration.
  • the direct competition method itself is well known in the art and is described, for example, in US 201501666678A.
  • the target antigen (amyloid ⁇ in the present invention) is immobilized.
  • the test sample containing the target antigen and a certain amount of antitarget antigen antibody are mixed and reacted with the solid phase antigen.
  • the anti-target antigen antibody bound to the solid phase is quantified. This can be done by reacting the labeled secondary antibody with respect to the anti-target antigen antibody, washing, and then measuring the labeled amount.
  • Antigen standard solutions having various known concentrations are prepared, and each of them is immobilized on a solid phase and the labeled amount is measured to prepare a calibration curve.
  • the amount of antigen in the unknown test sample can be measured. It is also possible to use a labeled primary antibody without using a labeled secondary antibody.
  • the indirect competition method itself is well known in the art and is described, for example, in US 201501666678A described above.
  • chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA), chemiluminescent immunoassay (CLIA), enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), and fluorescence immunoassay (FIA) are the direct competitors described above. It is an immunoassay classified based on the type of label used when performing the indirect competition method, the sandwich method, or the like.
  • Chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) is an immunoassay using an enzyme (eg, alkaline phosphatase) as a label and a substrate (eg, AMPPD) that produces a chemiluminescent compound as a substrate.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay is an immunoassay using an enzyme (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase, etc.) as a label.
  • an enzyme eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase, etc.
  • a compound that can be quantified by measuring absorbance or the like is used.
  • peroxidase 1,2-phenylenediamine (OPD), 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), etc.
  • OPD 1,2-phenylenediamine
  • TMB 5,5'-tetramethylbenzidine
  • alkaline phosphatase p-nitrophenyl phosphate.
  • Radioimmunoassay is a method using a radioactive substance as a label, as the radioactive substance, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 radioactive elements such as I like.
  • Fluorescent immunoassay is a method using a fluorescent substance or fluorescent protein as a label, and examples of the fluorescent substance or fluorescent protein include fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, green fluorescent protein, and red fluorescent protein. Immunoassays themselves using these labels are well known in the art and are described, for example, in US8039223B and US201530109016A1.
  • Turbidimetry is an immunoassay using a phenomenon in which turbidity is increased by an antigen-antibody complex produced by binding a target antigen (amyloid ⁇ in the present invention) to be measured and an antibody against the antigen.
  • Antigens of various known concentrations are added to the antitarget antigen antibody solution, the turbidity of each is measured, and a calibration curve is prepared. By measuring the turbidity of the unknown test sample in the same manner and applying the measured turbidity to the calibration curve, the amount of antigen in the unknown test sample can be measured.
  • the immunoturbidimetry method itself is well known and is described, for example, in US 20140186238 A1.
  • the latex agglutination method is similar to the turbidimetry method, but is a method in which a suspension of latex particles having an anti-target antigen antibody immobilized on the surface is used instead of the antibody solution in the turbidimetry method.
  • Turbidimetry and latex agglutination itself are well known in the art and are described, for example, in US 7,820,398B.
  • the immunochromatography method is a method of performing the above-mentioned sandwich method or competitive method on a substrate (also called a matrix or strip) formed of a porous material such as filter paper, cellulose membrane, glass fiber, or non-woven fabric.
  • a substrate also called a matrix or strip
  • a detection zone in which an anti-target antigen antibody is immobilized is provided on the substrate, a test sample containing the target antigen is added to the substrate, and a developing solution is flowed from the upstream side to target.
  • the antigen is moved to the detection zone and immobilized in the detection zone.
  • the target antigen in the test sample is detected by sandwiching the immobilized target antigen with a labeled secondary antibody and detecting the label immobilized in the detection zone.
  • a labeled secondary antibody By forming the labeled zone containing the labeled secondary antibody on the upstream side of the detection zone, the conjugate of the target antigen and the labeled secondary antibody is immobilized in the detection zone.
  • the label is an enzyme
  • a substrate zone containing the substrate of the enzyme is also provided upstream of the detection zone.
  • the target antigen can be immobilized in the detection zone, and the target antigen in the test sample can compete with the target antigen immobilized in the detection zone.
  • a labeled antibody zone is provided on the upstream side of the detection zone, the target antigen in the test sample is reacted with the labeled antibody, and the unreacted labeled antibody is immobilized in the detection zone to detect or quantify the label.
  • the target antigen in the test sample can be detected or quantified.
  • the immunochromatography method itself is well known in the art and is described, for example, in US 6210898 B.
  • the sandwich method in particular, using magnetic particles as the solid phase, using an enzyme (for example, alkaline phosphatase) as the label, and chemiluminescent compound as the substrate.
  • an enzyme for example, alkaline phosphatase
  • chemiluminescent compound as the substrate.
  • AMPPD chemiluminescent enzyme immunoassay method
  • CLIA chemiluminescent enzyme immunoassay method
  • the anionic polymer is present in the reaction system in which the amyloid ⁇ in the blood sample and the anti-amyloid ⁇ antibody are brought into contact with each other to carry out an antigen-antibody reaction between the amyloid ⁇ and the anti-amyloid ⁇ antibody in the blood sample.
  • the anionic polymer is present in a reaction system in which a solid phase antibody and amyloid ⁇ in a sample are brought into contact with each other to carry out an antigen-antibody reaction between the solid phase antibody and amyloid ⁇ .
  • the anionic polymer is preferably present in a reaction system in which a solid phase antibody, amyloid ⁇ in a sample, and a labeled antibody are brought into contact with each other to carry out an antigen-antibody reaction.
  • the solid phase is not particularly limited, and a solid phase used in a known immunoassay can be used.
  • the material of the solid phase include, but are not limited to, polystyrene, polyethylene, cepharose, latex, dextran, agarose, gelatin, polyacrylamide and the like. It is preferable that the solid phase used is such that the antibody can be easily immobilized on the surface thereof and the immune complex formed during the measurement and the unreacted component can be easily separated.
  • plastic plates, latex particles and magnetic particles used in conventional immunoassays are preferred. From the viewpoint of ease of handling, storage, separation, etc., it is most preferable to use magnetic particles made of the above-mentioned materials.
  • Immobilization of the antibody on these solid phases can be carried out by a conventional method well known to those skilled in the art. Immobilization of the antibody on the solid phase may be carried out by physical adsorption or by using a covalent bond. Immobilization of an antibody to a solid phase also solidifies one of the affinity substances, such as biotin streptavidin, to the solid phase, binds the other to the antibody, and mixes them to obtain the affinity substance.
  • the antibody may be immobilized on a solid phase via the above.
  • the labeling substance is not particularly limited, and the same labeling substance as that used in known immunoassays can be used. Specific examples include enzymes, fluorescent substances, chemical luminescent substances, dyeing substances, radioactive substances and the like. As the enzyme, known ones such as alkaline phosphatase (ALP), peroxidase, and ⁇ -galactosidase can be used, but the enzyme is not limited thereto.
  • ALP alkaline phosphatase
  • peroxidase peroxidase
  • ⁇ -galactosidase the enzyme is not limited thereto.
  • Amyloid ⁇ is produced by being cleaved by an enzyme from its precursor, but due to the difference in cleaving enzyme, it consists of amino acids 1 to 42 (amyloid ⁇ 1-42 (A ⁇ 1-42)), 1 to 42. Those consisting of amino acid No. 40 (amyloid ⁇ 1-40 (A ⁇ 1-40)), those consisting of amino acids Nos. 5 to 42 (amyloid ⁇ 5-42 (A ⁇ 5-42 )), amino acids Nos.
  • amyloid ⁇ 35-42 (A ⁇ 35-42 )), those consisting of amino acids Nos. 35-40 (“Amyloid ⁇ 35-40 (A ⁇ 35-40)), etc.
  • a ⁇ 1-42 A ⁇ 5-42 , A ⁇ 11-42 , A ⁇ 16-42 , A ⁇ 17-42 , A ⁇ 20-42 , A ⁇ 21-42 , and A ⁇ 35-42. It is called amyloid ⁇ X-42.
  • a ⁇ 1-40 , A ⁇ 5-40 , A ⁇ 11-40 , A ⁇ 16-40 , A ⁇ 17-40 , A ⁇ 20-40 , A ⁇ 21-40 , A ⁇ 35-40 are summarized.
  • the present invention is useful for measuring any of amyloid ⁇ , and any of these is included in the scope of the present invention, and in particular, amyloid ⁇ 1-4. 2 and preferably used for the measurement of amyloid ⁇ 1-40.
  • the anti-amyloid ⁇ antibody or its antigen-binding fragment may be an antibody that specifically binds to amyloid ⁇ or its antigen-binding fragment.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Generally, a monoclonal antibody is preferably used. Since methods for producing polyclonal antibodies and monoclonal antibodies are well known, anti-amyloid ⁇ antibodies may be prepared using amyloid ⁇ antigen as an immunogen.
  • the "antigen-binding fragment” may be any antibody fragment as long as the binding property (antigen-antibody reactivity) of the original antibody to the corresponding antigen is maintained. Specific examples include, but are not limited to, Fab, F (ab') 2, scFv, and the like.
  • Fab and F (ab') 2 can be obtained by treating the antibody with a proteolytic enzyme such as papain or pepsin, as is well known.
  • a method for producing scFv single chain fragment of variable region, single chain antibody is also well known, and can be produced according to a well-known method.
  • the anti-amyloid ⁇ antibody or its antigen-binding fragment can be appropriately selected according to the type of amyloid ⁇ to be measured.
  • Such antibodies and combinations of antibodies are known, and commercially available ones can be used.
  • an antibody that specifically binds to the C-terminal region of amyloid ⁇ x-42 (anti-A ⁇ 42 antibody) and an N-terminal region containing the first amino acid of amyloid ⁇ are used.
  • An antibody that specifically binds (anti-A ⁇ N-terminal antibody) and the like can be used.
  • an antibody may be a commercially available antibody or may be produced by a well-known method.
  • An anti-A ⁇ 42 antibody may be used as the solid phase antibody, an anti-A ⁇ N terminal antibody may be used as the labeling antibody, and conversely, an anti-A ⁇ N terminal antibody may be used as the solid phase antibody, and an anti-A ⁇ 42 antibody may be used as the labeling antibody.
  • an antibody that specifically binds to the C-terminal region of amyloid ⁇ x-40 and an N-terminal region containing the first amino acid of amyloid ⁇ are used.
  • An antibody that specifically binds (anti-A ⁇ N-terminal antibody) and the like can be used. As described above, these antibodies may be commercially available antibodies or may be produced by a well-known method.
  • An anti-A ⁇ 40 antibody may be used as the solid phase antibody, an anti-A ⁇ N terminal antibody may be used as the labeling antibody, and conversely, an anti-A ⁇ N terminal antibody may be used as the solid phase antibody, and an anti-A ⁇ 40 antibody may be used as the labeling antibody.
  • the anionic polymer can be added separately to the antigen-antibody reaction system, a solution containing an antibody-immobilized solid phase such as antibody-immobilized particles, or a reagent such as a sample diluent for diluting a blood sample. It can also be added to the class in advance. It can also be added to blood samples.
  • the final concentration of the anionic polymer in the antigen-antibody reaction system is usually about 0.01 g / L to 50 g / L, about 0.02 g / L to 25 g / L, about 0.03 g / L to 10 g / L, and so on. It is about 0.04 g / L to 5 g / L, preferably about 0.05 g / L to 2.5 g / L.
  • the immunoassay method itself is well known, and as described above, the present invention can be applied to any immunoassay method. That is, in the immunoassay method of the present invention, a well-known immunoassay method can be used as it is, except that the antigen-antibody reaction is carried out in the presence of an anionic polymer. Furthermore, as described above, since immunoassay using CSF as a sample has already been carried out, the kit used for this immunoassay can be used as it is.
  • the kit of the present invention may be a kit for performing the above-mentioned immunoassay method of the present invention, and contains at least an anti-amyloid ⁇ antibody and an anionic polymer.
  • the immunoassay is a sandwich method
  • a solid phase in which an anti-amyloid ⁇ antibody is immobilized is also included.
  • the solid phase is a particle such as a magnetic particle
  • the particle usually in the form of a particle liquid
  • the kit of the present invention can be obtained by including an anionic polymer in a well-known kit for measuring amyloid ⁇ immunoassay.
  • the anionic polymer may be contained in reagents such as an anti-amyloid ⁇ antibody-immobilized particle solution and a sample diluent, or may be separately included in the kit alone.
  • the obtained anti-A ⁇ 42 antibody-immobilized particles were suspended in a particle diluent (50 mM Tris buffer, 1 mM EDTA2Na, 0.1% NaN 3 , 2.0% BSA, pH 7.2) to solidify the anti-A ⁇ 42 antibody.
  • a particle solution was obtained.
  • anti-A ⁇ 40 antibody-immobilized particles and anti-A ⁇ 40 antibody-immobilized particle solutions were prepared in the same manner.
  • ⁇ Preparation of alkaline phosphatase-labeled antibody Desalted alkaline phosphatase (ALP) and N- (4-maleimide butyryloxy) -succinimide (GMBS) (final concentration 0.3 mg / mL) are mixed and allowed to stand at 30 ° C. for 1 hour for maleimide formation. rice field. Then, in a coupling reaction solution (100 mM phosphate buffer, 1 mM EDTA2Na, pH 6.3), a mouse antibody that specifically binds to the N-terminal region containing the first amino acid of amyloid ⁇ , which has been Fab'ized.
  • ALP alkaline phosphatase
  • GMBS N- (4-maleimide butyryloxy) -succinimide
  • a ⁇ N-terminal antibody and maleimided ALP were mixed at a molar ratio of 1: 1 and reacted at 25 ° C. for 1 hour. Purification was performed using column chromatography of Superdex200 10/300 (manufactured by GE) to obtain an alkaline phosphatase-labeled antibody (ALP-labeled antibody).
  • ALP-labeled antibody was suspended in labeled diluent (50 mM MES buffer, 150 mM NaCl, 0.3 mM ZnCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 0.1% NaN 3 , 2.0% BSA, pH 6.8) and labeled with ALP. An antibody solution was obtained.
  • ⁇ Measuring method of amyloid ⁇ 1-42 (A ⁇ 1-42)> 50 ⁇ L of the sample and 50 ⁇ L of the anti-A ⁇ 42 antibody-immobilized particle solution were dispensed into the reaction vessel and stirred. Then, it was incubated at 37 ° C. for 8 minutes, and B / F separation and washing were performed using a magnetic field. Further, 50 ⁇ L of the ALP-labeled antibody solution was dispensed into this reaction vessel, and after stirring, the mixture was incubated at 37 ° C. for 8 minutes, and B / F separation and washing were performed using a magnetic field.
  • Lumipulse (registered) containing the chemiluminescent substrate 3- (2'-spirodamantan) -4-methoxy-4- (3 ′′ -phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane / 2-sodium salt (AMPPD).
  • 200 ⁇ L of a substrate solution (manufactured by Fujirebio) was dispensed into a reaction vessel, stirred, incubated at 37 ° C. for 4 minutes, and then the amount of luminescence was measured with a luminometer. The actual measurement was performed by a fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay system (Lumipulse L2400 (manufactured by Fujirebio)).
  • ⁇ Measuring method of amyloid ⁇ 1-40 (A ⁇ 1-40)> 30 ⁇ L of the sample and 50 ⁇ L of the anti-A ⁇ 40 antibody-immobilized particle solution were dispensed into the reaction vessel and stirred. Then, it was incubated at 37 ° C. for 8 minutes, and B / F separation and washing were performed using a magnetic field. Further, 50 ⁇ L of the enzyme-labeled antibody solution was dispensed into this reaction vessel, and after stirring, the mixture was incubated at 37 ° C. for 8 minutes, and B / F separation and washing were performed using a magnetic field.
  • a Lumipulse substrate solution manufactured by Fujirebio
  • AMPPD alumipulse substrate solution
  • 200 ⁇ L of a Lumipulse substrate solution (manufactured by Fujirebio) containing AMPPD was dispensed into a reaction vessel, stirred, incubated at 37 ° C. for 4 minutes, and then the amount of luminescence was measured with a luminometer.
  • the actual measurement was performed by a fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay system (Lumipulse L2400 (manufactured by Fujirebio)).
  • Example 1 The effect of adding sodium dextran sulfate in the measurement of A ⁇ 1-42 and A ⁇ 1-40 using blood samples was examined.
  • a ⁇ 1-42 and A ⁇ 1-40 were measured, respectively, according to the methods described in "Measuring method of A ⁇ 1-42 " and “Measuring method of A ⁇ 1-40” above.
  • sodium dextran sulfate sodium dextran sulfate (mass average molecular weight 5000 (hereinafter referred to as “molecular weight 5000”, the same applies hereinafter)) is added to the antibody-immobilized particle solution so as to be 0.5 g / L. , The effect of its addition was examined.
  • the final concentration of sodium dextran sulfate in the antigen-antibody reaction system is 0.25 g / L for A ⁇ 1-42 and 0.31 g / L for A ⁇ 1-40.
  • each sample (serum, EDTA / 2K plasma and TBS buffer) to which no antigen was added was measured in the same manner, and the obtained count was used as a blank value.
  • the count value was obtained by subtracting the blank value from the count of each antigen-containing sample.
  • the A [beta] 1-40 is also in the conditions of adding non-dextran sodium sulfate, the count value of the A [beta] 1-40 in plasma samples, at a lower value than the count value of the buffer sample there were. Assuming that the count value of the buffer sample was 100%, the plasma sample EDTA2K was significantly reduced to 36.4%. On the other hand, when sodium dextran sulfate was added to the antibody-immobilized particle solution and A ⁇ 1-40 was measured, the count value of the plasma sample increased, and the count value reached 90% or more of the count value of the buffer solution sample. The value has recovered.
  • Example 2 The concentration of sodium dextran sulfate added in the measurement of A ⁇ 1-42 in blood was examined.
  • sodium dextran sulfate sodium dextran sulfate (molecular weight 5000) is added to the antibody-immobilized particle solution so as to have the concentration shown in Table 3 (0.1 g / L to 5.0 g / L), and the effect of the addition thereof. It was investigated.
  • the final concentration of sodium dextran sulfate in the antigen-antibody reaction system is 0.05 g / L to 2.5 g / L. Further, a blank value was acquired and a count value was calculated in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 3.
  • the count value was higher than the count value in the non-added condition under all the conditions of the examined sodium dextran sulfate concentration.
  • Examples 3 to 5 Comparative Examples 1 to 3
  • the effect of adding various anionic polymers on A ⁇ measurement in blood samples was investigated.
  • the serum antigen-containing serum, Serum2
  • the antigen-containing TBS buffer Buffer
  • a ⁇ 1-42 was measured by the method.
  • anionic polymers sodium dextran sulfate (molecular weight 5,000) (Example 3), poly (sodium 4-styrene sulfonate) (molecular weight 700,000) (Example 4), sodium dodecyl sulfate (SDS) ( Comparative Example 1), sodium dodecylbenzene sulfonate (SDBS) (Comparative Example 2), sodium polyacrylate (molecular weight 5,100) (Example 5), sodium N-lauroyl sarcosin (NLS) (Comparative Example 3). Using. These anionic polymers were added to the antibody-immobilized particle solution at 0.5 g / L, and the effect of the addition was examined. Further, a blank value was acquired and a count value was calculated in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 4.
  • the count value of the serum sample was 56.9% as compared with the count value of the buffer sample, whereas it was an anion.
  • the ionic polymers sodium dextran sulfate (Example 3), poly (sodium 4-styrene sulfonate) (Example 4), and sodium polyacrylate (Example 5) were added, 82.6%, respectively, The count increased to 77.4% and 66.9%.
  • sodium dextran sulfate and poly (sodium 4-styrene sulfonate), which are anionic polymers having a sulfate group or a sulfo group in the side chain showed a large recovery of the count value and were particularly effective.
  • SDS which is a surfactant having a sulfate group in the side chain
  • SDBS Synthetic Example 2
  • NLS NLS having a carboxyl group in the side chain.
  • the addition of the anionic polymer to the reaction solution has the effect of improving the decrease in the count value at the time of measuring amyloid ⁇ in the blood sample. Further, it was shown that among the anionic polymers, the anionic polymer having a sulfate group or a sulfo group in the side chain has a particularly large improving effect.
  • Example 6 The effect of the added concentration of the anionic polymer on the A ⁇ measurement in the blood sample was examined. 50 ⁇ L of synthetic A ⁇ 1-42 antigen at a concentration of 50,000 pg / mL was added to 5 mL of blood samples (serum and EDTA / 2K plasma) in which A ⁇ 1-42 was below the measurement limit, and antigen-containing serum (Serum1, Serum2) and antigen were added. Contained plasma (EDTA2K) was prepared. In addition, a synthetic A ⁇ 1-42 antigen having the same concentration as that of the blood sample was added to Tris buffered saline (TBS buffer, pH 7.4) to prepare an antigen-containing TBS buffer.
  • TBS buffer Tris buffered saline
  • a ⁇ 1-42 was measured by the method described in Example 1.
  • sodium heparin sulfate which is an anionic polymer having a sulfate group in the side chain
  • the final concentrations of sodium heparin sulfate in the antigen-antibody reaction system are 0.25 g / L and 2.5 g / L. Further, a blank value was acquired and a count value was calculated in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 5.
  • Example 7 The effect of adding sodium dextran sulfate having a different molecular weight on A ⁇ measurement in a blood sample was examined.
  • 50 ⁇ L of synthetic A ⁇ 1-42 antigen having a concentration of 50,000 pg / mL was added to 5 mL of serum (Serum2) whose count value was particularly markedly decreased under the condition that sodium dextran sulfate was not added, and the antigen-containing serum was added. It was prepared and A ⁇ 1-42 was measured by the method described in Example 1. Further, synthetic A ⁇ 1-42 antigen having the same concentration as that of the blood sample was added to the TBS buffer solution to prepare an antigen-containing TBS buffer solution (Buffer), and A ⁇ 1-42 was measured in the same manner.
  • an anionic polymer such as sodium dextran sulfate having an average molecular weight of 5000 or more to the reaction solution has an effect of improving the decrease in the count value at the time of measuring amyloid ⁇ in a blood sample. rice field.
  • Example 8 In blood samples, EDTA / 2K plasma and cerebrospinal fluid (CSF) were fractionated using a gel filtration column for the purpose of investigating the cause of lower count values than buffer samples.
  • the conditions are as follows.
  • the device is AKTA FPLC (manufactured by GE Healthcare)
  • the column is Superose6 10 ⁇ 300 (manufactured by GE Healthcare)
  • the flow rate is 0.3 mL / min
  • the buffer is D-PBS (-)
  • the amount of application is 1 mL
  • the amount is 1 mL.
  • Samples were prepared by adding A ⁇ 1-42 antigen to each of the obtained fractions at 1000 pg / mL.
  • a ⁇ 1-42 was measured by the method described in Example 1.
  • Sodium dextran sulfate (molecular weight 5000) was added to the antibody-immobilized particle solution so as to have a molecular weight of 2.5 g / L, and the effect of the addition was examined.
  • the final concentration of sodium dextran sulfate in the antigen-antibody reaction system is 1.3 g / L.
  • a control sample a TBS buffer solution in which A ⁇ 1-42 antigen was added at 1000 pg / mL was used, and the measurement was performed in the same manner.
  • the ratio (%) of the count value of each sample to the count value of the control sample is shown in Table 7.
  • a molecular weight marker manufactured by Bio-Rad Laboratories, Inc.
  • the component that lowers the count value exists only in the blood sample, and it is considered that the influence of this component can be avoided by adding the anionic polymer.
  • Example 9 The effects of anionic polymers on A ⁇ 1-42 and A ⁇ 1-40 measurements in serum samples from healthy individuals and EDTA2Na plasma samples were investigated. Blood samples were collected using plain (10 mL blood collection tube, manufactured by Terumo) and EDTA2Na (7 mL blood collection tube, manufactured by Terumo), allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and centrifuged at 1200 xg for 10 minutes. , Prepared by collecting the supernatant.
  • synthetic A ⁇ 1-42 peptide and synthetic A ⁇ 1-40 peptide were prepared to be 0 pg / mL, 10 pg / mL, 100 pg / mL, and 1000 pg / mL, respectively, and measured as a calibrator.
  • An approximate expression was created based on the count values obtained by measuring this calibrator, and the count values obtained from each sample were applied to the approximate curve to calculate the measured values.
  • anionic polymers such as sodium dextran sulfate increases the count values for A ⁇ 1-42 and A ⁇ 1-40 , and is unaffected by shelf life, A ⁇ 1-42 /. It was confirmed that an A ⁇ 1-40 ratio was obtained.
  • Example 10 A ⁇ 1-42 and A ⁇ 1-40 were measured in serum samples of Alzheimer's disease (AD) and non-AD patients using a reagent supplemented with sodium dextran sulfate.
  • a ⁇ 1-42 and A ⁇ 1-40 in serum samples of AD patients (26 cases) and non-AD patients (22 cases) were measured by the following methods.
  • 50 ⁇ L of the sample and 250 ⁇ L of the antibody-immobilized particle solution to which sodium dextran sulfate (molecular weight 5000) was added so as to be 0.5 g / L were dispensed into the reaction vessel and stirred.
  • the final concentration of sodium dextran sulfate in the antigen-antibody reaction system is 0.42 g / L.
  • FIG. 1 is a box-and-whisker plot of A ⁇ 1-42 / A ⁇ 1-40 ratio obtained from each of the obtained measured values.
  • the A ⁇ 1-42 / A ⁇ 1-40 ratio of AD patients was significantly higher than the A ⁇ 1-42 / A ⁇ 1-40 ratio among non-AD patient groups.
  • the value was low (p value 0.0022 (Wilcoxon-Mann-Whitney test)), confirming that the addition of anionic polymer to the reaction solution is also useful in the measurement of A ⁇ using patient samples.
  • reagents supplemented with anionic polymers such as sodium dextran sulfate are useful for the diagnosis of Alzheimer's disease.

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Abstract

要約　血液検体中のアミロイドβを高感度に測定することができる免疫測定方法及びそのためのキットが開示されている。アミロイドβの免疫測定方法は、血液検体中のアミロイドβを免疫測定する方法であって、免疫測定を、デキストラン硫酸塩やポリスチレンスルホン酸塩等の陰イオン性ポリマーの存在下で行う。血液検体中のアミロイドβを免疫測定するためのキットは、抗アミロイドβ抗体又はその抗原結合性断片と、陰イオン性ポリマーを含む。

Description

血中アミロイドβの免疫測定方法及びそのためのキット
　本発明は、血中アミロイドβの免疫測定方法及びそのためのキットに関する。
　アミロイドβは、アルツハイマー病のバイオマーカーとして公知であり、免疫測定により検体中のアミロイドβを測定することが知られており（特許文献１）、そのためのキットも市販されている。市販されている多くのアミロイドβの免疫測定キットは、検体として脳脊髄液(CSF)を使用するものである。一方、アルツハイマー病患者では、血液中にもアミロイドβが存在することが知られている。CSFの採取は侵襲的であるので、血液検体中のアミロイドβを免疫学的に測定できれば有利である。
WO 2017/179611
　CSF中であれ、血液中であれ、測定対象は同じアミロイドβであるから、CSFと同様にして血液中のアミロイドβを免疫測定することができると考えられた。しかしながら、血液検体中のアミロイドβを免疫測定しようとすると、CSFを検体とする場合と比較して感度が低くなるという問題があることがわかった。
　したがって、本発明の目的は、血液検体中のアミロイドβを高感度に測定することができる免疫測定方法及びそのためのキットを提供することである。
　本願発明者らは、血液中のアミロイドβの測定に関する鋭意研究の結果、陰イオン性ポリマーの存在下で、血液検体中のアミロイドβと抗アミロイドβ抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を行うことにより、高感度に血液検体中のアミロイドβを測定できることを見出し、本発明に到達した。
　すなわち、本発明は以下のものを提供する。
(1)　血液検体中のアミロイドβを免疫測定する方法であって、前記免疫測定を、陰イオン性ポリマーの存在下で行う、アミロイドβの免疫測定方法。
(2)　前記陰イオン性ポリマーが、側鎖に硫酸基又はスルホ基を有する陰イオン性ポリマーである、(1)記載の方法。
(3)　前記陰イオン性ポリマーが、デキストラン硫酸及びその塩、ポリスチレンスルホン酸及びその塩、並びにヘパリン硫酸及びその塩から成る群より選ばれる少なくとも一種である、(2)記載の方法。
(4)　前記陰イオン性ポリマーが、デキストラン硫酸ナトリウムである、(3)記載の方法。
(5)　前記免疫測定がサンドイッチ法であり、前記陰イオン性ポリマーの存在下で、前記血液検体中の前記アミロイドβと、固相に固相化した抗アミロイドβ抗体又はその抗原結合性断片とを接触させて、該アミロイドβを測定することを含む、(1)～(4)のいずれかに記載の方法。
(6)　前記アミロイドβが、アミロイドβ１－４０又はアミロイドβ１－４２である、(1)～(5)のいずれかに記載の方法。
(7)　血液検体中のアミロイドβを免疫測定するためのキットであって、抗アミロイドβ抗体又はその抗原結合性断片と、陰イオン性ポリマーを含むキット。
(8)　前記免疫測定がサンドイッチ法であり、抗アミロイドβ抗体又はその抗原結合性断片を固相化した固相と、陰イオン性ポリマーを含む、(7)記載のキット。
(9)　前記固相が粒子であり、該粒子と前記陰イオン性ポリマーを含む粒子液を具備する、(8)記載のキット。
　本発明の方法によれば、血液検体中のアミロイドβを高感度に測定することができる。
下記実施例において測定した、アルツハイマー病患者と健常人における、Aβ1-42／Aβ1-40比を示す図である。
　本発明の免疫測定方法に供する検体は、血液検体である。血液検体には、全血、血清、血漿のいずれも包含される。好ましくは、血清又は血漿である。
　下記実施例に具体的に記載するように、血漿及び緩衝液中に精製アミロイドβを添加し、免疫測定を用いて、添加したアミロイドβの回収レベル（カウント値）を比較する実験により、ゲルろ過クロマトグラフィーで300～400kDaの分子量に相当するフラクションに溶出される、アミロイドβと抗アミロイドβ抗体との反応を抑制する物質（被覆物質）が存在することが見出された。さらに研究の結果、陰イオン性ポリマーの存在下で免疫測定の抗原抗体反応を行うことにより、被覆物質による結合抑制を軽減できることが見出された。本発明は、この新知見に基づいており、免疫測定を、陰イオン性ポリマーの存在下で行うことを最大の特徴とする。
　陰イオン性ポリマーとしては、デキストラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチンＡ硫酸、コンドロイチンＢ硫酸及びコンドロイチンＣ硫酸並びにこれらの塩のような、側鎖に硫酸基を有するもの、ポリスチレンスルホン酸及びその塩のような、側鎖にスルホ基を有するもの、並びにポリ（メタ）アクリル酸及びその塩のような、カルボキシル基を有するものが好ましい。これらのうち、側鎖に硫酸基又はスルホ基を有するものが好ましく、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸及びヘパリン硫酸並びにこれらの塩がより好ましく、特にデキストラン硫酸及びポリスチレンスルホン酸並びにこれらの塩が好ましく、とりわけ、デキストラン硫酸及びその塩が好ましい。塩としては、ナトリウム塩やカリウム塩等のアルカリ金属塩を挙げることができる。これらの陰イオン性ポリマーは、単独で用いることもできるし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
　陰イオン性ポリマーの平均分子量は、質量平均分子量として、通常、１，０００～５，０００，０００程度、２，０００～４，０００，０００程度、３，０００～２，０００，０００程度、４，０００～１，０００，０００程度、好ましくは、５，０００～７００，０００程度、より好ましくは、５，０００～５０，０００程度である。
　陰イオン性ポリマーは、被覆物質によるアミロイドβと、抗アミロイドβ抗体又はその抗原結合性断片（以下、文脈上そうではないことが明らかな場合を除き、「抗体」という語は、「抗体又はその抗原結合性断片」を意味する）との抗原抗体反応の抑制を軽減するものであるから、いずれの免疫測定方法にも有効であることが明らかである。すなわち、免疫測定には、サンドイッチ法、競合法、凝集法、イムノクロマト法等が包含されるが、本発明は、これらの免疫測定のいずれをも包含する。これらの免疫測定方法自体は周知であり、ここで詳しく述べる必要はないが、それぞれ簡単に説明する。
　サンドイッチ法には例えば、化学発光酵素免疫測定法（chemiluminescent enzyme immunoassay; CLEIA）、酵素結合免疫吸着法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA）、ラジオイムノアッセイ、電気化学発光免疫測定法（Electro Chemiluminescence Immunoassay； ECLIA）、蛍光免疫測定法（Fluorescence Immunoassay; FIA）等の各種の手法があり、本発明はいずれの手法をも包含する。本発明の免疫測定は、特に限定されないが、サンドイッチ法であってもよい。サンドイッチ法には例えば、１ステップサンドイッチ法と２ステップサンドイッチ法がある。
　２ステップサンドイッチ法では、例えば、まず固相に固相化された抗アミロイドβ抗体または固相に固相化される抗アミロイドβ抗体（固相抗体）と、血液検体中のアミロイドβとを接触させて、固相抗体とアミロイドβとの抗原抗体反応を行う（一次反応）。固相抗体が、固相に固相化される抗アミロイドβ抗体である場合は、一次反応後に、固相抗体を固相に固定化する。その後、Ｂ／Ｆ分離を行う。次いで、固相抗体に結合したアミロイドβと、検出のための標識物質が結合した抗アミロイドβ抗体（標識抗体）とを接触させて、アミロイドβと標識抗体との抗原抗体反応を行う（二次反応）。次いで、Ｂ／Ｆ分離を行い、固相に結合したアミロイドβに結合した標識抗体の標識由来のシグナルを検出することによって、血液検体中のアミロイドβを測定することができる。Ｂ／Ｆ分離後に洗浄を行ってもよい。
　１ステップサンドイッチ法では、固相抗体と、検体中のアミロイドβと、標識抗体とを接触させて、固相抗体とアミロイドβとの抗原抗体反応と、アミロイドβと標識抗体との抗原抗体反応とを一つの工程で行う。固相抗体が、固相に固相化される抗アミロイドβ抗体である場合は、抗原抗体反応後または抗原抗体反応と同時に、固相抗体を固相に固定化する。その後、Ｂ／Ｆ分離を行い、固相に結合したアミロイドβに結合した標識抗体の標識由来のシグナルを検出することによって、血液検体中のアミロイドβを測定することができる。
　直接競合法は、測定すべき標的抗原（本発明ではアミロイドβ）に対する抗体を固相に固定化し（固相化）、非特異吸着を防ぐためのブロッキング処理（血清アルブミン等のタンパク質溶液で固相を処理）後、この抗体と、前記標的抗原を含む被検試料と、一定量の標識した抗原とを反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を定量する方法である。被検試料中の抗原と標識抗原とが、抗体に対して競合的に結合するので、被検試料中の抗原量が多いほど、固相に結合する標識の量が少なくなる。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化された標識量（標識の性質に応じて、吸光度、発光強度、蛍光強度等、以下同じ）を測定して、抗原濃度を横軸、標識量を縦軸にとった検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。直接競合法自体はこの分野において周知であり、例えば、ＵＳ２０１５０１６６６７８Ａに記載されている。
　間接競合法では、標的抗原（本発明ではアミロイドβ）を固相化する。次いで、固相のブロッキング処理後、標的抗原を含む被検試料と、一定量の抗標的抗原抗体とを混合し、前記固相化抗原と反応させる。洗浄後、固相に結合された前記抗標的抗原抗体を定量する。これは、前記抗標的抗原抗体に対する標識した二次抗体を反応させ、洗浄後、標識量を測定することにより行うことができる。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化されて標識量を測定して、検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。なお、標識二次抗体を用いずに、標識した一次抗体を用いることも可能である。間接競合法自体はこの分野において周知であり、例えば、上記したＵＳ２０１５０１６６６７８Ａに記載されている。
　上記した各種免疫測定のうち、化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は、上記した直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等を行う際に用いる標識の種類に基づいて分類した免疫測定である。化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）は、標識として酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ）を用い、基質として化学発光性化合物を生じる基質（例えば、ＡＭＰＰＤ）を用いた、免疫測定である。酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）は、標識として酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ等）を用いる免疫測定である。各酵素の基質としては、吸光度測定等により定量可能な化合物が用いられる。例えば、ペルオキシダーゼの場合には、１，２－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）や３，３'，５，５'－テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）等、アルカリフォスファターゼの場合には、ｐ－ニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ）等、β－ガラクトシダーゼの場合には、ＭＧ：４－メチルウンベリフェリルガラクトシド、ＮＧ：ニトロフェニルガラクトシド等、ルシフェラーゼの場合には、ルシフェリン等が用いられる。放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）は、標識として放射性物質を用いる方法であり、放射性物質としては、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ等の放射性元素が挙げられる。蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は、標識として蛍光物質または蛍光タンパク質を用いる方法であり、蛍光物質または蛍光タンパク質としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質等が挙げられる。これらの標識を用いる免疫測定自体はこの分野において周知であり、例えば、ＵＳ８０３９２２３ＢやＵＳ２０１５０３０９０１６Ａ１に記載されている。
　免疫比濁法（ＴＩＡ）は、測定すべき標的抗原（本発明ではアミロイドβ）と、該抗原に対する抗体との結合により生成された抗原抗体複合物により濁度が増大する現象を利用した免疫測定である。抗標的抗原抗体溶液に、種々の既知濃度の抗原を添加し、それぞれ濁度を測定し、検量線を作成する。未知の被検試料について、同様に濁度を測定し、測定された濁度を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。免疫比濁法自体は周知であり、例えば、ＵＳ　２０１４０１８６２３８　Ａ１に記載されている。ラテックス凝集法は、免疫比濁法と類似しているが、免疫比濁法における抗体溶液に代えて、表面に抗標的抗原抗体を固定化したラテックス粒子の浮遊液を用いる方法である。免疫比濁法及びラテックス凝集法自体はこの分野において周知であり、例えば、ＵＳ　７，８２０，３９８　Ｂに記載されている。
　イムノクロマトグラフィー法は、ろ紙、セルロースメンブレン、ガラス繊維、不織布等の多孔性材料で形成された基体（マトリックスやストリップとも呼ばれる）上で上記したサンドイッチ法や競合法を行う方法である。例えば、サンドイッチ法によるイムノクロマトグラフィー法の場合、抗標的抗原抗体を固定化した検出ゾーンを上記基体上に設け、標的抗原を含む被検試料を基体に添加し、上流側から展開液を流して標的抗原を検出ゾーンまで移動させ、検出ゾーンに固定化させる。固定化された標的抗原を、標識した二次抗体でサンドイッチして、検出ゾーンに固定化された標識を検出することにより、被検試料中の標的抗原を検出する。標識二次抗体を含む標識ゾーンを検出ゾーンよりも上流側に形成しておくことにより、標的抗原と標識二次抗体との結合体が検出ゾーンに固定化される。標識が酵素の場合には、酵素の基質を含めた基質ゾーンも検出ゾーンよりも上流側に設けられる。競合法の場合には、例えば、検出ゾーンに標的抗原を固定化しておき、被検試料中の標的抗原と、検出ゾーンに固定化された標的抗原とを競合させることができる。検出ゾーンよりも上流側に標識抗体ゾーンを設けておき、被検試料中の標的抗原と標識抗体を反応させ、未反応の標識抗体を検出ゾーンに固定化して標識を検出又は定量することにより、被検試料中の標的抗原を検出又は定量することができる。イムノクロマトグラフィー法自体は、この分野において周知であり、例えばＵＳ　６２１０８９８　Ｂに記載されている。
　上記した各種免疫測定のうち、検出感度及び自動化の容易性の観点から、サンドイッチ法、特に、固相として磁性粒子を用い、標識として酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ）を用い、基質として化学発光性化合物を生じる基質（例えば、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ））を用いる免疫測定である化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）が好ましい。
　陰イオン性ポリマーは、血液検体中のアミロイドβと抗アミロイドβ抗体とを接触させて、血液検体中のアミロイドβと抗アミロイドβ抗体との抗原抗体反応を行う反応の系中に存在させる。
　例えば、２ステップサンドイッチ法では、陰イオン性ポリマーは、固相抗体と、検体中のアミロイドβとを接触させて、固相抗体とアミロイドβとの抗原抗体反応を行う反応系中に存在することが好ましい。１ステップサンドイッチ法では、陰イオン性ポリマーは、固相抗体と、検体中のアミロイドβと、標識抗体とを接触させて、抗原抗体反応を行う反応系に存在することが好ましい。
　固相は特に限定されず、公知の免疫測定で使用される固相を用いることができる。固相の材質の具体例としては、ポリスチレン、ポリエチレン、セファロース、ラテックス、デキストラン、アガロース、ゼラチン、ポリアクリルアミド等が挙げられるが、これらに限定されない。使用する固相は、その表面への抗体の固定化が容易で、測定中に形成される免疫複合体と未反応の成分を容易に分離できるものであることが好ましい。特に、通常の免疫測定法に使用されるプラスチックプレート、ラテックス粒子や磁性粒子が好ましい。取り扱い、保存、および分離の容易性等の観点から、前述のような材質の磁性粒子を使用することが最も好ましい。これらの固相への抗体の固相化は当業者に周知の常法によって行なうことができる。固相への抗体の固相化は、物理的吸着により行ってもよいし、共有結合を用いてもよい。固相への抗体の固相化はまた、ビオチンーストレプトアビジンのような親和性物質の一方を固相に固相化し、他方を抗体に結合し、これらを混合することで、親和性物質を介して、抗体を固相に固相化してもよい。
　標識物質も特に限定されず、公知の免疫測定で使用されている標識物質と同様のものを用いることができる。具体例としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、染色物質、放射性物質などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、パーオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等、公知のものを用いることができるが、これに限定されるものではない。
　アミロイドβは、その前駆体から酵素による切断を受けて生成するが、切断酵素の相違により、１番～４２番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ１－４２（Ａβ１－４２））、１番～４０番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ１－４０（Ａβ１－４０））、５番～４２番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ５－４２（Ａβ５－４２））、５番～４０番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ５－４０（Ａβ５－４０））、１１番～４２番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ１１－４２（Ａβ１１－４２））、１１番～４０番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ１１－４０（Ａβ１１－４０））、１６番～４２番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ１６－４２（Ａβ１６－４２））、１６番～４０番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ１６－４０（Ａβ１６－４０））、１７番～４２番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ１７－４２（Ａβ１７－４２））、１７番～４０番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ１７－４０（Ａβ１７－４０））、２０番～４２番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ２０－４２（Ａβ２０－４２））、２０番～４０番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ２０－４０（Ａβ２０－４０））、２１番～４２番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ２１－４２（Ａβ２１－４２））、２１番～４０番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ２１－４０（Ａβ２１－４０））、３５番～４２番のアミノ酸から成るもの（アミロイドβ３５－４２（Ａβ３５－４２）と呼ばれている）と、３５番～４０番のアミノ酸から成るもの（「アミロイドβ３５－４０（Ａβ３５－４０））、等の複数の種類が存在する。Ａβ１－４２、Ａβ５－４２、Ａβ１１－４２、Ａβ１６－４２、Ａβ１７－４２、Ａβ２０－４２、Ａβ２１－４２、Ａβ３５－４２をまとめてアミロイドβＸ－４２と呼ぶ。また、Ａβ１－４０、Ａβ５－４０、Ａβ１１－４０、Ａβ１６－４０、Ａβ１７－４０、Ａβ２０－４０、Ａβ２１－４０、Ａβ３５－４０をまとめてアミロイドβＸ－４０と呼ぶ。本発明は、いずれのアミロイドβの測定にも有用であり、これらのいずれを測定する場合も本発明の範囲に含まれるが、特に、アミロイドβ１－４２およびアミロイドβ１－４０の測定に用いることが好ましい。
　抗アミロイドβ抗体又はその抗原結合性断片は、アミロイドβに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片であればよい。抗体は、モノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体でもよい。一般的にはモノクローナル抗体が好ましく用いられる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製方法は、周知であるので、アミロイドβ抗原を免疫原として用いて抗アミロイドβ抗体を調製してもよい。「抗原結合性断片」は、もとの抗体の対応抗原に対する結合性（抗原抗体反応性）を維持している限り、いかなる抗体断片であってもよい。具体例としては、Fab、F(ab')2、scFv等を挙げることができるが、これらに限定されない。FabやF(ab')2は、周知の通り、抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。scFv（single chain fragment of variable region、単鎖抗体）の作製方法も周知であり、周知の方法に従って作製することができる。
　抗アミロイドβ抗体又はその抗原結合性断片は、測定の対象となるアミロイドβの種類に応じて、適宜選択することができる。このような抗体及び抗体の組み合わせは公知であり、市販されているものを用いることができる。
　例えば、サンドイッチ法によりアミロイドβ１－４２を測定するには、アミロイドβｘ－４２のＣ末端領域に特異的に結合する抗体（抗Ａβ４２抗体）と、アミロイドβの１番目のアミノ酸を含むＮ末端領域に特異的に結合する抗体（抗ＡβＮ末端抗体）と、を用いることができる。上記の通り、このような抗体は市販されている抗体を用いてもよいし、周知の方法により製造してもよい。固相抗体として抗Ａβ４２抗体を、標識抗体として抗ＡβＮ末端抗体を用いてもよいし、その逆に固相抗体として抗ＡβＮ末端抗体を、標識抗体として抗Ａβ４２抗体を用いてもよい。
　また、サンドイッチ法によりアミロイドβ１－４０を測定するには、アミロイドβｘ－４０のＣ末端領域に特異的に結合する抗体（抗Ａβ４０抗体）と、アミロイドβの１番目のアミノ酸を含むＮ末端領域に特異的に結合する抗体（抗ＡβＮ末端抗体）と、を用いることができる。上記の通り、これら抗体は市販されている抗体を用いてもよいし、周知の方法により製造してもよい。固相抗体として抗Ａβ４０抗体を、標識抗体として抗ＡβＮ末端抗体を用いてもよいし、その逆に固相抗体として抗ＡβＮ末端抗体を、標識抗体として抗Ａβ４０抗体を用いてもよい。
　陰イオン性ポリマーは、抗原抗体反応系に別途添加することもできるし、抗体固相化粒子等の抗体固相化固相を含む溶液や、血液検体を希釈するための検体希釈液等の試薬類に予め添加しておくこともできる。また、血液検体に添加しておくことも可能である。
　抗原抗体反応系中の陰イオン性ポリマーの終濃度は、通常、０．０１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌ程度、０．０２ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌ程度、０．０３ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌ程度、０．０４ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌ程度、好ましくは０．０５ｇ／Ｌ～２．５ｇ／Ｌ程度である。
　免疫測定方法自体は周知であり、上記の通り、本発明はいずれの免疫測定方法にも適用可能である。すなわち、本発明の免疫測定方法は、抗原抗体反応を、陰イオン性ポリマーの存在下で行うこと以外は、周知の免疫測定方法をそのまま用いることができる。さらに、上記したとおり、CSFを検体とする免疫測定は既に実施されているので、この免疫測定に用いられるキットをそのまま利用することもできる。
　なお、CSF中と同様、血液中にもＡβ１－４２とＡβ１－４０の両方が含まれていることが知られており、CSF中及び血液中の何れも、これらの比、すなわち、Ａβ１－４２／Ａβ１－４０をとることで診断特異度が上昇することが知られているため、Ａβ１－４２とＡβ１－４０の両方を定量して、その比を算出することが行われている。この比が健常人よりも小さい場合、アルツハイマー病である可能性が高いと判定されている。一般に、血液検体の採取時から免疫測定までの経過時間が長くなると、免疫測定の感度が低下するが、下記実施例に具体的に記載するように、陰イオン性ポリマーの存在下で抗原抗体反応を行うことにより、検体採取時からの経過時間が長くても、感度はほとんど低下しない（すなわち、Ａβ１－４２／Ａβ１－４０が経時的にほとんど変化しない）という、予想外の効果も見出された。
　本発明のキットは、上記した本発明の免疫測定方法を行うためのキットであればよく、抗アミロイドβ抗体と、陰イオン性ポリマーを少なくとも含むものである。免疫測定がサンドイッチ法の場合、抗アミロイドβ抗体を固相化した固相も含まれる。該固相が磁性粒子のような粒子の場合、該粒子（通常、粒子液の形態にある）も含まれる。周知のアミロイドβ免疫測定用キットに陰イオン性ポリマーを含めることにより、本発明のキットとすることができる。上記のとおり、陰イオン性ポリマーは、抗アミロイドβ抗体固相化粒子液や、検体希釈液等の試薬類に含有させてもよいし、別途、単独でキットに含めてもよい。
　以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
＜固相化粒子の調製＞
　１０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中で磁性粒子０．０１ｇ／ｍＬに、アミロイドβｘ－４２のＣ末端領域に特異的に結合する、マウス抗Ａβ４２抗体０．２ｍｇ／ｍＬを添加し、２５℃で１時間ゆるやかに攪拌しながらインキュベートした。反応後、磁性粒子を磁石で集磁し、粒子を洗浄液（５０ｍＭ　トリス緩衝液、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２．０％　ＢＳＡ、ｐＨ７．２）にて洗浄し、抗Ａβ４２抗体固相化粒子を得た。得られた抗Ａβ４２抗体固相化粒子を粒子希釈液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液、１ｍＭ　ＥＤＴＡ２Ｎａ、０．１％　ＮａＮ３、２．０％　ＢＳＡ、ｐＨ７．２）に懸濁し、抗Ａβ４２抗体固相化粒子溶液を得た。
　アミロイドβｘ－４０のＣ末端領域に特異的に結合する、マウス抗Ａβ４０抗体を用いて、同様にして、抗Ａβ４０抗体固相化粒子及び抗Ａβ４０抗体固相化粒子溶液を調製した。
＜アルカリホスファターゼ標識抗体の調製＞
　脱塩したアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とＮ－（４－マレイミドブチリロキシ）－スクシンイミド（ＧＭＢＳ）（終濃度０．３　ｍｇ/ｍＬ）を混合し、３０℃で１時間静置してマレイミド化を行った。次いで、カップリング用反応液（１００ｍＭリン酸緩衝液、１ｍＭ　ＥＤＴＡ２Ｎａ、ｐＨ６．３）中で、Ｆａｂ’化した、アミロイドβの１番目のアミノ酸を含むＮ末端領域に特異的に結合する、マウス抗ＡβＮ末端抗体と、マレイミド化ＡＬＰを１：１のモル比で混合し、２５℃で１時間反応させた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００　１０／３００（ＧＥ社製）のカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、アルカリホスファターゼ標識抗体（ＡＬＰ標識抗体）を得た。ＡＬＰ標識抗体を標識体希釈液（５０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．３ｍＭ　ＺｎＣｌ２、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１％　ＮａＮ３、２．０％　ＢＳＡ、ｐＨ６．８）に懸濁し、ＡＬＰ標識抗体溶液を得た。
＜アミロイドβ１－４２（Ａβ１－４２）の測定方法＞
　サンプル５０μＬと抗Ａβ４２抗体固相化粒子溶液５０μＬを反応槽に分注し、攪拌した。その後、３７℃で８分間インキュベートし、磁場を用いたＢ／Ｆ分離および洗浄を行った。この反応槽に、さらにＡＬＰ標識抗体溶液５０μＬを分注し、攪拌後、３７℃で８分間インキュベートし、磁場を用いたＢ／Ｆ分離および洗浄を行った。その後、化学発光基質である３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３''－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を含むルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社製）２００μＬを反応槽に分注し、攪拌後３７℃で４分間インキュベートした後、発光量をルミノメーターで測定した。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルスＬ２４００（富士レビオ社製））にて行った。
＜アミロイドβ１－４０（Ａβ１－４０）の測定方法＞
　サンプル３０μＬと抗Ａβ４０抗体固相化粒子溶液５０μＬを反応槽に分注し、攪拌した。その後、３７℃で８分間インキュベートし、磁場を用いたＢ／Ｆ分離および洗浄を行った。この反応槽に、さらに酵素標識抗体溶液５０μＬを分注し、攪拌後、３７℃で８分間インキュベートし、磁場を用いたＢ／Ｆ分離および洗浄を行った。その後、ＡＭＰＰＤを含むルミパルス基質液（富士レビオ社製）２００μＬを反応槽に分注し、攪拌後３７℃で４分間インキュベートした後、発光量をルミノメーターで測定した。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルスＬ２４００（富士レビオ社製））にて行った。
実施例１
　血液サンプルを用いたＡβ１－４２およびＡβ１－４０の測定におけるデキストラン硫酸ナトリウムの添加効果を検討した。
　サンプルとして、Ａβ１－４２およびＡβ１－４０が測定限界以下である血液サンプル（血清およびＥＤＴＡ・２Ｋ血漿）４．５ｍＬに、Ａβ１－４２抗原およびＡβ１－４０抗原をそれぞれ約７９４ｐｇ／ｍＬの濃度および約７７４４ｐｇ／ｍＬの濃度で含む脳脊髄液（ＣＳＦ）５００μＬを添加し、抗原含有血清（Ｓｅｒｕｍ１、Ｓｅｒｕｍ２）および抗原含有血漿（ＥＤＴＡ２Ｋ）を調製した。また、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４）に、血液サンプルと同濃度のＡβ１－４２抗原およびＡβ１－４０抗原を添加して、抗原含有ＴＢＳ緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ）を調製した。調製したサンプルを用いて、上記の「Ａβ１－４２の測定方法」および「Ａβ１－４０の測定方法」に記載の方法に従って、Ａβ１－４２およびＡβ１－４０をそれぞれ測定した。デキストラン硫酸ナトリウムとしては、デキストラン硫酸ナトリウム（質量平均分子量５０００（以下、「分子量５０００」と記載、他も同様））を抗体固相化粒子溶液に、０．５ｇ／Ｌになるように添加して、その添加効果を検討した。抗原抗体反応系中のデキストラン硫酸ナトリウムの終濃度は、Ａβ１－４２では０．２５ｇ／Ｌ、Ａβ１－４０では０．３１ｇ／Ｌである。また、ブランクとして、抗原を添加していない各サンプル（血清、ＥＤＴＡ・２Ｋ血漿及びＴＢＳ緩衝液）を同様に測定し、得られたカウントをブランク値とした。各抗原含有サンプルのカウントからブランク値を引いたものをカウント値とした。Ａβ１－４２の結果を表１に、Ａβ１－４０の結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示されるように、デキストラン硫酸ナトリウム未添加の条件では、血清サンプルおよび血漿サンプルのＡβ１－４２のカウント値は、緩衝液サンプルのカウント値に比べて低い値であった。緩衝液サンプルのカウント値を１００％とすると、血清サンプルであるＳｅｒｕｍ２のカウント値は５６．９％と大幅に低下していた。
　一方、抗体固相化粒子溶液にデキストラン硫酸ナトリウムを添加して、Ａβ１－４２を測定すると、血清サンプルおよび血漿サンプル共にカウント値が上昇し、緩衝液サンプルのカウント値に対して８０％以上にまでカウント値が回復した。
　また、表２に示されるように、Ａβ１－４０についても、デキストラン硫酸ナトリウム未添加の条件では、血漿サンプルのＡβ１－４０のカウント値は、緩衝液サンプルのカウント値に比べて低い値であった。緩衝液サンプルのカウント値を１００％とすると、血漿サンプルＥＤＴＡ２Ｋは３６．４％と大幅に低下していた。一方、抗体固相化粒子溶液に、デキストラン硫酸ナトリウムを添加して、Ａβ１－４０を測定すると、血漿サンプルのカウント値が上昇し、緩衝液サンプルのカウント値に対して９０％以上にまでカウント値が回復した。
実施例２
　血液中のＡβ１－４２の測定におけるデキストラン硫酸ナトリウムの添加濃度を検討した。実施例１に記載の方法にて、抗原含有血清（Ｓｅｒｕｍ１、Ｓｅｒｕｍ２）、抗原含有血漿（ＥＤＴＡ２Ｋ）および抗原含有ＴＢＳ緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ）のＡβ１－４２を測定した。デキストラン硫酸ナトリウムとしては、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０００）を抗体固相化粒子溶液に、表３の濃度（０．１ｇ／Ｌ～５．０ｇ／Ｌ）になるように添加して、その添加効果を検討した。抗原抗体反応系中のデキストラン硫酸ナトリウムの終濃度は、０．０５ｇ／Ｌ～２．５ｇ／Ｌである。また、実施例１と同様にブランク値を取得し、カウント値を算出した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示されるように、検討したデキストラン硫酸ナトリウムの濃度のすべての条件で、カウント値が、未添加の条件におけるカウント値に比べて上昇した。
実施例３～５、比較例１～３
　様々な陰イオン性ポリマーの添加による血液サンプル中のＡβ測定への効果を検討した。実施例１および２において、デキストラン硫酸ナトリウム未添加条件にて特にカウント値の低下が著しい血清（抗原含有血清、Ｓｅｒｕｍ２）と、抗原含有ＴＢＳ緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ）を用いて、実施例１に記載の方法にて、Ａβ１－４２を測定した。陰イオン性ポリマーとしては、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５，０００）（実施例３）、ポリ（４－スチレンスルホン酸ナトリウム）（分子量７００，０００）（実施例４）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（比較例１）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）（比較例２）、ポリアクリル酸ナトリウム塩（分子量５，１００）（実施例５）、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）（比較例３）を用いた。これら陰イオン性ポリマーを、抗体固相化粒子溶液に、０．５ｇ／Ｌになるように添加して、その添加効果を検討した。また、実施例１と同様にブランク値を取得し、カウント値を算出した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示されるように、陰イオン性ポリマーの未添加の条件では、血清サンプル（Ｓｅｒｕｍ２）のカウント値は、緩衝液サンプルのカウント値に比べて、５６．９％であるのに対し、陰イオン性ポリマーであるデキストラン硫酸ナトリウム（実施例３）、ポリ（４－スチレンスルホン酸ナトリウム）（実施例４）、およびポリアクリル酸ナトリウム塩（実施例５）を添加すると、それぞれ８２．６％、７７．４％および６６．９％までカウント値が上昇した。特に側鎖に硫酸基又はスルホ基を有する陰イオン性ポリマーであるデキストラン硫酸ナトリウムおよびポリ（４－スチレンスルホン酸ナトリウム）では、カウント値の回復が大きく、特に効果があることが示された。一方で、側鎖に硫酸基を有する界面活性剤であるＳＤＳ（比較例１）、側鎖にスルホ基を有する界面活性剤であるＳＤＢＳ（比較例２）、または側鎖にカルボキシル基を有するＮＬＳ（比較例３）を添加しても、カウント値は回復しなかった。
　よって、反応液への陰イオン性ポリマーの添加は、血液サンプルにおけるアミロイドβ測定時のカウント値の低下を改善する効果があることが示された。また、陰イオン性ポリマーのうち、特に側鎖に硫酸基又はスルホ基を有する陰イオン性ポリマーの改善効果が大きいことが示された。
実施例６
　陰イオン性ポリマーの添加濃度による血液サンプル中のＡβ測定への効果を検討した。Ａβ１－４２が測定限界以下である血液サンプル（血清およびＥＤＴＡ・２Ｋ血漿）５ｍＬに、５００００ｐｇ／ｍＬの濃度の合成Ａβ１－４２抗原を５０μＬ添加し、抗原含有血清（Ｓｅｒｕｍ１、Ｓｅｒｕｍ２）および抗原含有血漿（ＥＤＴＡ２Ｋ）を調製した。また、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４）に、血液サンプルと同濃度の合成Ａβ１－４２抗原を添加して、抗原含有ＴＢＳ緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ）を調製した。調製した各サンプルを用いて、実施例１に記載の方法にて、Ａβ１－４２を測定した。陰イオン性ポリマーとしては、デキストラン硫酸ナトリウムの代わりに、側鎖に硫酸基を有する陰イオン性ポリマーであるヘパリン硫酸ナトリウムを、抗体固相化粒子溶液に、表５の濃度（０．５ｇ／Ｌ、５．０ｇ／Ｌ）になるように添加して、その添加効果を検討した。抗原抗体反応系中のヘパリン硫酸ナトリウムの終濃度は、０．２５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌである。また、実施例１と同様にブランク値を取得し、カウント値を算出した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示されるように、検討したヘパリン硫酸ナトリウムを添加した濃度のすべての条件で、未添加の条件におけるカウント値に比べて、カウント値が上昇した。
実施例７
　分子量が異なるデキストラン硫酸ナトリウムの添加による血液サンプル中のＡβ測定への効果を検討した。実施例１および２において、デキストラン硫酸ナトリウム未添加条件にて特にカウント値の低下が著しい血清（Ｓｅｒｕｍ２）５ｍＬに、５００００ｐｇ／ｍＬの濃度の合成Ａβ１－４２抗原を５０μＬ添加し、抗原含有血清を調製し、実施例１に記載の方法にて、Ａβ１－４２を測定した。また、ＴＢＳ緩衝液に、血液サンプルと同濃度の合成Ａβ１－４２抗原を添加して、抗原含有ＴＢＳ緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ）を調製し、同様にＡβ１－４２を測定した。平均分子量が５０００と５００００である二種類のデキストラン硫酸を使用し、抗体固相化粒子溶液への添加濃度は７ｇ／Ｌとした。抗原抗体反応系中のデキストラン硫酸ナトリウムの終濃度は、３．５ｇ／Ｌである。さらに、実施例１と同様にブランク値を取得し、カウント値を算出した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示されるように、デキストラン硫酸ナトリウムの未添加の条件では、血清サンプル（Ｓｅｒｕｍ２）のカウント値は、緩衝液サンプルのカウント値に比べて、６６．７％であるのに対し、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０００）、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５００００）を添加すると、それぞれ８０．９％、９３．８％までカウント値が上昇した。
　よって、平均分子量５０００以上のデキストラン硫酸ナトリウムをはじめとした陰イオン性ポリマーを反応液への添加することは、血液サンプルにおけるアミロイドβ測定時のカウント値の低下を改善する効果があることが示された。
実施例８
　血液サンプルにおいて、緩衝液サンプルよりもカウント値が下がる原因を検討する目的で、ＥＤＴＡ・２Ｋ血漿、および脳脊髄液（ＣＳＦ）を、ゲルろ過カラムを用いて分画した。条件は次のとおりである。装置はＡＫＴＡ　ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア製）、カラムはＳｕｐｅｒｏｓｅ６　１０×３００（ＧＥヘルスケア製）、流速は０．３ｍＬ／分、バッファーはＤ－ＰＢＳ（－）、アプライ量は１ｍＬ、各フラクションの液量は１ｍＬである。取得した各フラクションに対してＡβ１－４２抗原を１０００ｐｇ／ｍＬになるように添加して、サンプルを調製した。調製したサンプルを用いて、実施例１に記載の方法でＡβ１－４２を測定した。抗体固相化粒子溶液に、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０００）を２．５ｇ／Ｌになるように添加して、その添加効果を検討した。抗原抗体反応系中のデキストラン硫酸ナトリウムの終濃度は、１．３ｇ／Ｌである。コントロールサンプルとして、Ａβ１－４２抗原を１０００ｐｇ／ｍＬになるように添加したＴＢＳ緩衝液を用いて、同様に測定した。結果として、コントロールサンプルのカウント値に対する各サンプルのカウント値の比率（％）を表７に示す。分子量は、分子量マーカー（バイオラッド社製）を上記条件で操作し、近似式を作成して各フラクションでの分子量を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示されるように、ＥＤＴＡ２Ｋ血漿では、３００－４００ｋＤａ付近のフラクションにおいてデキストラン硫酸ナトリウムの未添加の条件でカウント値の比率が６１％にまで低下したが、デキストラン硫酸ナトリウムを添加することでカウント値がコントロールサンプルと同程度（１０６％）まで回復することが確認された。一方、ＣＳＦでは、いずれのフラクションにおいてもデキストラン硫酸ナトリウムの未添加の条件でカウント値がコントロールサンプルと比較して低下せず、デキストラン硫酸ナトリウムの添加の有無によってカウント値の比率が大きく異なるフラクションもみられなかった。
　よって、カウント値を低下させる成分は血液サンプルのみに存在し、この成分による影響が、陰イオン性ポリマーを添加することによって回避できると考えられる。
実施例９
　健常人由来の血清サンプル、およびＥＤＴＡ２Ｎａ血漿サンプル中のＡβ１－４２およびＡβ１－４０測定における陰イオン性ポリマーの影響を検討した。血液サンプルは、それぞれプレーン（１０ｍＬ採血管、テルモ製）、およびＥＤＴＡ２Ｎａ（７ｍＬ採血管、テルモ製）を使用して採血し、３０分間室温で静置し、１２００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上清を回収することにより調製した。
　サンプルの保存による影響を評価するため、サンプル調製後４℃で、０日、１日、２日、および３日間保存したサンプルを用いて、上記の「Ａβ１－４２の測定方法」および「Ａβ１－４０の測定方法」に従って、Ａβ１－４２およびＡβ１－４０を測定した。陰イオン性ポリマーとしては、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０００）を、抗体固相化粒子溶液に０．５ｇ／Ｌになるように添加して、その添加効果を検討した。測定値と、各条件における保存期間０日に対する測定値の比率を表８に示す。測定値の算出方法は、合成Ａβ１－４２ペプチドと合成Ａβ１－４０ペプチドをそれぞれ０ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、１０００ｐｇ／ｍＬとなるように調製したものをキャリブレーターとして測定した。このキャリブレーターを測定して得られたカウント値をもとに近似式を作成し、各サンプルから得られたカウント値を近似曲線に当てはめて測定値を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表８に示されるように、デキストラン硫酸ナトリウムを添加した試薬では、血清検体、血漿検体ともにカウント値および測定値が上昇した。経時的に測定すると、測定値は低下する傾向がみられた。
　アミロイドβの測定では、Ａβ１－４２とＡβ１－４０の比をとって比較することが行われている。そこで、本実施例で測定した各条件におけるＡβ１－４０に対するＡβ１－４２の比を算出した。結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表９に示されるように、デキストラン硫酸ナトリウムを添加していない試薬で血清を測定すると経時的にＡβ１－４２／Ａβ１－４０比の値が変化することが確認された。しかし、デキストラン硫酸ナトリウムを添加した試薬で血清を測定すると、経時的にＡβ１－４２／Ａβ１－４０比の値が変化せず、保存期間に影響を受けずにＡβ１－４２／Ａβ１－４０比が得られることが確認された。
　よって、デキストラン硫酸ナトリウムのような陰イオン性ポリマーを添加すると、Ａβ１－４２およびＡβ１－４０のカウント値が上昇することに加えて、保存期間に影響を受けずに、Ａβ１－４２／Ａβ１－４０比が得られることが確認された。
実施例１０
　デキストラン硫酸ナトリウム添加の試薬を用いて、アルツハイマー病（ＡＤ）患者と非ＡＤ患者の血清検体中のＡβ１－４２およびＡβ１－４０を測定した。
　ＡＤ患者（２６例）と非ＡＤ患者（２２例）の血清検体中のＡβ１－４２およびＡβ１－４０を以下の方法で測定した。まず、サンプル５０μＬと、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０００）を０．５ｇ／Ｌになるように添加した抗体固相化粒子溶液２５０μＬを反応槽に分注し、攪拌した。抗原抗体反応系中のデキストラン硫酸ナトリウムの終濃度は、０．４２ｇ／Ｌである。その後、３７℃で８分間インキュベートし、磁場を用いたＢ／Ｆ分離および洗浄を行った。この反応槽に、さらに酵素標識抗体溶液２５０μＬを分注し、攪拌後、３７℃で８分間インキュベートし、磁場を用いたＢ／Ｆ分離および洗浄を行った。その後、化学発光基質であるＡＭＰＰＤを含むルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社製）２００μＬを反応槽に分注し、攪拌後３７℃で４分間インキュベートした後、発光量をルミノメーターで測定した。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルスＧ１２００（富士レビオ社製））にて行った。結果を図１に示す。実施例６と同様のキャリブレーターを用いて近似式を作成し、検体のカウントからＡβ１－４２およびＡβ１－４０の測定値を算出した。
　図１は、得られた各測定値から求めた、Ａβ１－４２／Ａβ１－４０比の箱ひげ図である。デキストラン硫酸ナトリウムが入った試薬を用いて測定した結果、ＡＤ患者のＡβ１－４２／Ａβ１－４０比が、非ＡＤ患者群間のＡβ１－４２／Ａβ１－４０比に対して有意に低い値となり（ｐ値０．００２２(Wilcoxon-Mann-Whitney test)）、患者検体を用いたＡβの測定においても、陰イオン性ポリマーの反応液への添加が有用であることが確認された。
　よって、デキストラン硫酸ナトリウムなどの陰イオン性ポリマーを添加した試薬はアルツハイマー病の診断に有用であることが示された。

Claims (9)

  1. 　血液検体中のアミロイドβを免疫測定する方法であって、前記免疫測定を、陰イオン性ポリマーの存在下で行う、アミロイドβの免疫測定方法。
  2. 　前記陰イオン性ポリマーが、側鎖に硫酸基又はスルホ基を有する陰イオン性ポリマーである、請求項１記載の方法。
  3. 　前記陰イオン性ポリマーが、デキストラン硫酸及びその塩、ポリスチレンスルホン酸及びその塩、並びにヘパリン硫酸及びその塩から成る群より選ばれる少なくとも一種である、請求項２記載の方法。
  4. 　前記陰イオン性ポリマーが、デキストラン硫酸ナトリウムである、請求項３記載の方法。
  5. 　前記免疫測定がサンドイッチ法であり、前記陰イオン性ポリマーの存在下で、前記血液検体中の前記アミロイドβと、固相に固相化した抗アミロイドβ抗体又はその抗原結合性断片とを接触させて、該アミロイドβを測定することを含む、請求項１～請求項４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記アミロイドβが、アミロイドβ１－４０又はアミロイドβ１－４２である、請求項１～請求項５のいずれかに記載の方法。
  7. 　血液検体中のアミロイドβを免疫測定するためのキットであって、抗アミロイドβ抗体又はその抗原結合性断片と、陰イオン性ポリマーを含むキット。
  8. 　前記免疫測定がサンドイッチ法であり、抗アミロイドβ抗体又はその抗原結合性断片を固相化した固相と、陰イオン性ポリマーを含む、請求項７記載のキット。
  9. 　前記固相が粒子であり、該粒子と前記陰イオン性ポリマーを含む粒子液を具備する、請求項８記載のキット。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114814240A (zh) * 2022-05-30 2022-07-29 苏州宇测生物科技有限公司 β淀粉样蛋白检测试剂盒
EP4202442A1 (en) * 2021-12-23 2023-06-28 Sysmex Corporation Specimen analysis method and specimen analyzer

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5164295A (en) * 1991-03-06 1992-11-17 The Upjohn Company Method for identifying amyloid protein-extracellular matrix protein affinity altering compounds
JPH0658935A (ja) * 1992-08-08 1994-03-04 Denka Seiken Co Ltd 免疫学的測定方法及びその試薬
US6210898B1 (en) 1992-03-31 2001-04-03 Abbott Laboratories Method of performing immunochromatography
JP2005519088A (ja) * 2002-02-28 2005-06-30 マイクロセンズ バイオファージ リミテッド 異常型プリオンタンパク質の結合
JP2006507488A (ja) * 2002-11-01 2006-03-02 プロテオテック・インコーポレーテッド 硫酸化グリコサミノグリカンによる、アルツハイマー病アミロイド斑形成の迅速な誘導
US7820398B2 (en) 2003-11-06 2010-10-26 Grace Laboratories Inc. Immunosorbent blood tests for assessing paroxysmal cerebral discharges
JP2011081011A (ja) * 2003-04-14 2011-04-21 Wako Pure Chemical Industries Ltd 移動度シフトアッセイ干渉の低減
US8039223B2 (en) 2003-10-15 2011-10-18 Sekisui Medical Co., Ltd. Method of selectively assaying adiponectin multimers
US20140186238A1 (en) 2011-09-25 2014-07-03 Theranos, Inc. Systems and Methods for Fluid Handling
WO2015052654A1 (en) * 2013-10-08 2015-04-16 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Method for the diagnosis and/or the prognosis of myotonic dystrophy type 1 (dm1)
US20150166678A1 (en) 2007-08-28 2015-06-18 Abbvie Biotechnology Ltd Compositions and methods comprising binding proteins for adalimumab
US20150309016A1 (en) 2006-10-06 2015-10-29 Sirigen Inc. Fluorescent Methods and Materials for Directed Biomarker Signal Amplification
WO2017179611A1 (ja) 2016-04-13 2017-10-19 株式会社Ｌｓｉメディエンス 硫酸化多糖類を用いた免疫学的測定法
JP2018151162A (ja) * 2017-03-09 2018-09-27 学校法人日本大学 被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬、及び被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6651794B2 (ja) * 2015-11-05 2020-02-19 富士レビオ株式会社 心筋トロポニンｉ測定試薬及び方法

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5164295A (en) * 1991-03-06 1992-11-17 The Upjohn Company Method for identifying amyloid protein-extracellular matrix protein affinity altering compounds
US6210898B1 (en) 1992-03-31 2001-04-03 Abbott Laboratories Method of performing immunochromatography
JPH0658935A (ja) * 1992-08-08 1994-03-04 Denka Seiken Co Ltd 免疫学的測定方法及びその試薬
JP2005519088A (ja) * 2002-02-28 2005-06-30 マイクロセンズ バイオファージ リミテッド 異常型プリオンタンパク質の結合
JP2006507488A (ja) * 2002-11-01 2006-03-02 プロテオテック・インコーポレーテッド 硫酸化グリコサミノグリカンによる、アルツハイマー病アミロイド斑形成の迅速な誘導
JP2011081011A (ja) * 2003-04-14 2011-04-21 Wako Pure Chemical Industries Ltd 移動度シフトアッセイ干渉の低減
US8039223B2 (en) 2003-10-15 2011-10-18 Sekisui Medical Co., Ltd. Method of selectively assaying adiponectin multimers
US7820398B2 (en) 2003-11-06 2010-10-26 Grace Laboratories Inc. Immunosorbent blood tests for assessing paroxysmal cerebral discharges
US20150309016A1 (en) 2006-10-06 2015-10-29 Sirigen Inc. Fluorescent Methods and Materials for Directed Biomarker Signal Amplification
US20150166678A1 (en) 2007-08-28 2015-06-18 Abbvie Biotechnology Ltd Compositions and methods comprising binding proteins for adalimumab
US20140186238A1 (en) 2011-09-25 2014-07-03 Theranos, Inc. Systems and Methods for Fluid Handling
WO2015052654A1 (en) * 2013-10-08 2015-04-16 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Method for the diagnosis and/or the prognosis of myotonic dystrophy type 1 (dm1)
WO2017179611A1 (ja) 2016-04-13 2017-10-19 株式会社Ｌｓｉメディエンス 硫酸化多糖類を用いた免疫学的測定法
JP2018151162A (ja) * 2017-03-09 2018-09-27 学校法人日本大学 被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬、及び被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP4130741A4
TIMMER, N. M ET AL.: "Aggregation and cytotoxic properties towards cultured cerebrovascular cells of Dutch -mutated Abeta40 (DAbeta1-40) are modulated by sulfate moieties of heparin", NEUROSCIENCE RESEARCH, vol. 66, 30 December 2009 (2009-12-30), pages 380 - 389, XP026923632, DOI: 10.1016/j.neures.2009.12.012 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4202442A1 (en) * 2021-12-23 2023-06-28 Sysmex Corporation Specimen analysis method and specimen analyzer
CN114814240A (zh) * 2022-05-30 2022-07-29 苏州宇测生物科技有限公司 β淀粉样蛋白检测试剂盒

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