WO2021162090A1 - 多能性幹細胞の分化抑制方法 - Google Patents
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- C12N2513/00—3D culture
Definitions
- the present invention relates to a production method for producing pluripotent stem cells by suspension culture, and also relates to a production method for producing a pluripotent stem cell population by suspension culture.
- Pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells have the ability to proliferate indefinitely and differentiate into various somatic cells.
- the practical application of a treatment method for transplanting somatic cells induced to differentiate from pluripotent stem cells may fundamentally change the treatment method for intractable diseases and lifestyle-related diseases.
- a technique for inducing differentiation of pluripotent stem cells into a wide variety of somatic cells such as nerve cells, myocardial cells, blood cells, and retinal cells has already been developed.
- pluripotent stem cells still has problems for practical use, and one of the problems is the productivity of pluripotent stem cells.
- the method for culturing pluripotent stem cells is roughly classified into adhesion culture in which cells are adhered and cultured on a flat substrate, and suspension culture in which cells are suspended and cultured in a liquid medium.
- adhesion culture in which cells are adhered and cultured on a flat substrate
- suspension culture in which cells are suspended and cultured in a liquid medium.
- To culturing the cells of the number by adhesion culture is required 10 6 cm 2 or more substrates, which corresponds to approximately 20,000 sheets in general 10cm dish.
- Non-Patent Document 1 discloses a method in which a spinner flask is used as a cell culture container for suspension culture, and pluripotent stem cells are suspension-cultured while stirring a liquid medium.
- Non-Patent Document 2 discloses a method for suppressing the spontaneous differentiation of pluripotent stem cells by adding a protein kinase C (PKC) inhibitor to the medium in the adherent culture of pluripotent stem cells.
- PLC protein kinase C
- Non-Patent Document 3 discloses a method for suppressing spontaneous differentiation of pluripotent stem cells by adding a tankylase (TNKS) inhibitor to the medium in the adhesive culture of pluripotent stem cells.
- TNKS tankylase
- Non-Patent Documents 2 and 3 only describe the adhesive culture, not the spontaneous differentiation inhibitory effect in the suspension culture, and describe the effect of combining the PKC inhibitor and the TNKS inhibitor. There is no suggestion.
- the present invention has been set as a problem to be solved to provide a technique for suppressing spontaneous differentiation of endoderm, mesoderm and ectoderm in all three directions and maintaining an undifferentiated state of pluripotent stem cells. ..
- the present inventors have allowed the PKC ⁇ inhibitor and the TNKS inhibitor to coexist in the suspension culture of pluripotent stem cells to spontaneously move in all three germ layers. We succeeded in suppressing the differentiation and maintaining the undifferentiated state of pluripotent stem cells.
- the present invention has been completed based on these research results, and includes the following.
- a method for producing a pluripotent stem cell population which comprises a step of suspending and culturing pluripotent stem cells in a liquid medium containing a PKC ⁇ inhibitor and a TNKS inhibitor.
- the PKC ⁇ inhibitor-containing concentration in the liquid medium is 25 nM or more and 15 ⁇ M or less.
- the concentration of the TNKS inhibitor in the liquid medium is 90 nM or more and 40 ⁇ M or less.
- the ratio of the content concentration of the PKC ⁇ inhibitor and the TNKS inhibitor in the liquid medium is in the range of 167: 1 or more and 1: 1600 or less.
- the liquid medium contains at least one selected from the group consisting of L-ascorbic acid, insulin, transferrin, selenium and sodium hydrogen carbonate.
- the liquid medium contains FGF2 and / or TGF- ⁇ 1.
- the liquid medium contains a ROCK inhibitor.
- the ROCK inhibitor is Y-27632.
- the suspension culture step includes a step of forming a cell aggregate.
- the suspension culture step includes a step of collecting cell aggregates.
- the ratio of cells positive for OCT4 is 90% or more, the ratio of cells positive for SOX2 is 90% or more, and the ratio of cells positive for Nanog is 90% or more.
- the method according to (1) which is 90% or more.
- the pluripotent stem cells are ES cells and / or induced pluripotent stem cells.
- the suspension culture is performed until the lactic acid concentration in the liquid medium reaches 5 to 15 mM.
- the suspension culture is a stirring culture in which the blade tip velocity is 0.05 m / s or more and 1.37 m / s or less.
- a pluripotent stem cell differentiation inhibitor which comprises a PKC ⁇ inhibitor and a TNKS inhibitor.
- the pluripotent stem cell differentiation inhibitor according to (16), wherein the ratio of the content concentration of the PKC ⁇ inhibitor and the TNKS inhibitor in the differentiation inhibitor is in the range of 167: 1 or more and 1: 1600 or less.
- a pluripotent stem cell differentiation inhibitory kit comprising the pluripotent stem cell differentiation inhibitor according to any one of (16) to (19) above.
- the PKC ⁇ inhibitors include Go6983, GF109203X, LY-333531, Enzastaurin, Sotrastaurin, Ro-31-8220-mesylate, Ro-32-0432-hydrochloride, Go6976, Luteolin, Midostaurin, Midostaurin, Midostaurin.
- the method according to (1) The method according to (1).
- the TNKS inhibitor is at least one selected from the group consisting of IWR-1-endo, XAV939, G007-LK, G244-LM and WIKI4. Potential stem cell differentiation inhibitor.
- (23) The method according to (1) and the pluripotent stem cell differentiation inhibitor according to (16), wherein the pluripotent stem cell is a prime-type pluripotent stem cell.
- the PKC ⁇ inhibitor is a compound having the following structural formula [Formula I]. The method according to (1) and the pluripotent stem cell differentiation inhibitor according to (16).
- R 1 is a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms (preferably a methoxy group).
- R 2 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms (preferably a methyl group), or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms substituted with ⁇ N (RA ) 2 (preferably ⁇ (CH 2). ) 3- N (CH 3 ) 2 ), RA is independently an ethyl group or a methyl group (preferably a methyl group).
- the configuration of the asymmetric carbon contained in the divalent group is not particularly limited, but is preferable.
- RC is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms substituted with ⁇ N ( RD ) 2 (preferably ⁇ (CH 2 ) ⁇ N (CH 3 ) 2 ).
- RD is independently an ethyl group or a methyl group (preferably a methyl group).
- Examples of the salt of the compound represented by the formula I include hydrochloride or sulfate. This specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2020-021843, which is the basis of the priority of the present application.
- the method for producing a pluripotent stem cell population it is possible to produce a pluripotent stem cell population that maintains an undifferentiated state by suspension culture.
- the pluripotent stem cell differentiation inhibitor of the present invention the undifferentiated state of pluripotent stem cells in suspension culture can be maintained.
- 3 is a characteristic diagram showing the relative gene expression level of T in the pluripotent stem cells cultured in Reference Example 4, Comparative Examples 8 and 9, and Example 7.
- 3 is a characteristic diagram showing the relative gene expression level of SOX17 in pluripotent stem cells cultured in Reference Example 4, Comparative Examples 8 and 9, and Example 7. It is a phase difference image of the cell aggregate imaged in Comparative Example 10 and Example 9.
- 3 is a characteristic diagram showing the relative gene expression level of T in the pluripotent stem cells cultured in Reference Example 5, Comparative Example 10 and Example 9.
- FIG. 5 is a characteristic diagram showing the relative gene expression level of SOX17 in pluripotent stem cells cultured in Reference Example 5, Comparative Example 10 and Example 9.
- FIG. 3 is a characteristic diagram showing the relative gene expression level of PAX6 in pluripotent stem cells cultured in Reference Example 5, Comparative Example 10 and Example 9. It is a phase difference image which imaged the pluripotent stem cell (the condition with which the TNKS inhibitor and the PKC ⁇ inhibitor were added and the condition without addition) which were adherently cultured in Comparative Example 11. It is a phase difference image which imaged the pluripotent stem cell (the condition which added the TNKS inhibitor and the PKC ⁇ inhibitor and the condition which did not add) which was suspension-cultured in Example 11. It is a characteristic diagram which shows the amplification rate in the pluripotent stem cell cultured in Comparative Example 11 and Example 11.
- phase difference image which imaged the pluripotent stem cell which was suspension-cultured in the comparative example 12. It is a phase difference image of a cell aggregate imaged. It is a phase difference image which imaged the pluripotent stem cell which was suspension-cultured in Example 12. It is a phase difference image of a cell aggregate imaged. It is a characteristic diagram showing the relative gene expression level of OCT4 and SOX2 in the pluripotent stem cells cultured in Comparative Example 12 and Example 12. It is a characteristic diagram showing the positive rate of OCT4 in the pluripotent stem cells cultured in Comparative Example 12 and Example 12. It is a characteristic diagram which shows the reached viable cell density in the pluripotent stem cell cultured in Comparative Example 12 and Example 12. FIG.
- FIG. 5 is a characteristic diagram showing the concentration of lactic acid contained in the medium of pluripotent stem cells cultured in Example 12.
- FIG. 5 is a characteristic diagram showing relative gene expression levels of OCT4, SOX2, NANOG, T, SOX17 and PAX6 in pluripotent stem cells cultured in Example 13 and Reference Example 6. It is a characteristic diagram which shows the result of G-Band analysis about the pluripotent stem cell cultured in Example 13. The results of measuring the relative gene expression levels of CDX2, PDGFRa, SOX17 and PAX6 in pluripotent stem cells cultured in Example 13 and Reference Example 6 (maintenance of undifferentiation) and Example 14 and Reference Example 7 (induction of differentiation) are shown. It is a characteristic diagram.
- the pluripotent stem cell differentiation inhibitor according to the present invention is characterized by containing a protein kinase C ⁇ (PKC ⁇ ) inhibitor and a tankylase (TNKS) inhibitor.
- PKC ⁇ protein kinase C ⁇
- TNKS tankylase
- the pluripotent stem cell differentiation inhibitor according to the present invention can be a composition composed of a PKC ⁇ inhibitor and a TNKS inhibitor.
- the pluripotent stem cell differentiation inhibitor according to the present invention can maintain an undifferentiated state in cells in suspension culture, and can easily produce a pluripotent stem cell population by suspension culture.
- pluripotency capable of differentiating into all types of cells constituting the living body, and under appropriate conditions.
- Such cells include, for example, embryonic stem cells (ES cells: embryonic stem cells), embryonic stem cells (EG cells: embryonic germ cells), germline stem cells (GS cells: Germline stem cells), and induced pluripotent stem cells. (IPS cells: induced pluripotent stem cells) and the like.
- ES cells are pluripotent stem cells prepared from early embryos.
- EG cells are pluripotent stem cells prepared from fetal primordial germ cells (Shamblott MJ et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95: 13726-13731. ).
- a "GS cell” is a pluripotent stem cell prepared from the cell testis (Conrad S., 2008, Nature, 456: 344-349).
- the "iPS cell” refers to a pluripotent stem cell that can be reprogrammed to bring the somatic cell into an undifferentiated state by introducing a gene encoding a small number of reprogramming factors into the differentiated somatic cell. ..
- the pluripotent stem cell in the present specification may be a cell derived from a multicellular organism. It is preferably an animal-derived cell, more preferably a mammalian-derived cell. Examples include rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, livestock or pets such as dogs, cats, rabbits, cows, horses, sheep and goats, and primates such as humans, red-tailed monkeys, gorillas and chimpanzees. .. Particularly preferred are human-derived cells.
- the pluripotent stem cells used herein include naive pluripotent stem cells and prime pluripotent stem cells.
- Naive pluripotent stem cells are in a state close to pluripotency found in the inner cell mass before implantation, and prime pluripotent stem cells are in a state close to pluripotency found in epiblast after implantation.
- Prime-type pluripotent stem cells contribute less frequently to ontogeny, have only one X-chromosome transcriptional activity, and have higher levels of transcriptional repressive histone modifications compared to naive-type pluripotent stem cells. There is a feature such as.
- the marker gene in prime-type pluripotent stem cells is OTX2, and the marker gene in prime-type pluripotent stem cells is REX1 and KLF family.
- the colonization of prime-type pluripotent stem cells is flat, and the colonization of naive-type pluripotent stem cells is dome-shaped.
- pluripotent stem cell used in the present specification, a commercially available cell or a cell for sale may be used, or a newly prepared cell may be used. Although not limited, iPS cells or ES cells are preferable as the pluripotent stem cells when used in each invention of the present specification.
- iPS cells used in the present specification are commercially available products, for example, 253G1 strain, 253G4 strain, 201B6 strain, 201B7 strain, 409B2 strain, 454E2 strain, 606A1 strain, 610B1 strain, 648A1 strain, HiPS-RIKEN.
- the combination of the genes of the reprogramming factors to be introduced is not limited, but for example, OCT3 / 4 gene, KLF4 gene, SOX2 gene and c. -Myc gene combination (YuJ, et al. 2007, Science, 318: 1917-20.), OCT3 / 4 gene, SOX2 gene, LIN28 gene and Nanog gene combination (Takahashi K, et al. 2007, Cell, 131: 861-72.) Can be used.
- the form of introduction of these genes into cells is not particularly limited, and for example, gene transfer using a plasmid, introduction of synthetic RNA, or introduction as a protein may be performed.
- iPS cells prepared by a method using microRNA, RNA, a small molecule compound or the like may be used.
- newly prepared clinical grade iPS cells may be used.
- KhES-1 strain, KhEs-2 strain, KhEs-3 strain, KhEs-4 strain, KhEs-5 strain, SEES1 strain, SEES2 strain are not limited.
- SEES3 strain, SES-4 strain, SEEs-5 strain, SEEs-6 strain, SEEs-7 strain, HUES8 strain, CyT49 strain, H1 strain, H9 strain, HS-181 strain and the like can be used.
- cell agglutinin is a mass of cells formed by cell agglutination in suspension culture, and is also called a spheroid.
- Cell aggregates are usually substantially spherical.
- the cells constituting the cell aggregate are not particularly limited as long as they are one or more types of the cells.
- a cell aggregate composed of pluripotent stem cells such as human pluripotent stem cells or human embryonic stem cells expresses pluripotent stem cell markers and / or cells that are positive for pluripotent stem cell markers. including.
- Pluripotent stem cell markers are genetic markers that are specifically or overexpressed in pluripotent stem cells, such as Alkaline Phosphatase, Nanog, OCT4, SOX2, TRA-1-60, c-Myc, KLF4, LIN28. , SSEA-4, SSEA-1 and the like can be exemplified.
- the pluripotent stem cell marker can be detected by any detection method in the art.
- the method for detecting a cell marker includes, but is not limited to, flow cytometry, for example.
- flow cytometry for example.
- a fluorescently labeled antibody is used as a detection reagent in flow cytometry
- a cell that emits stronger fluorescence than a negative control (isotype control) is detected, the cell is determined to be "positive" for the marker.
- the percentage of cells that are positive for fluorescently labeled antibodies analyzed by flow cytometry is sometimes referred to as the "positive rate.”
- the fluorescently labeled antibody any antibody known in the art can be used, for example, an antibody labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), allophycocyanin (APC), or the like. However, it is not limited to these.
- the positive rate of the pluripotent stem cell marker is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 91% or more, more preferably 92. % Or more, more preferably 93% or more, more preferably 94% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99%. As mentioned above, it can be more preferably 100% or less.
- a cell aggregate in which the proportion of cells expressing the pluripotent stem cell marker and / or positive for the pluripotent stem cell marker is within the above range is a highly undifferentiated and more homogeneous cell population.
- Floating culture is one of the cell culture methods, and refers to growing cells in a floating state in a medium.
- the term "floating state” refers to a state in which cells are not adhered to an external matrix such as a culture vessel.
- the "suspension culture method” is a method of suspending and culturing cells, and the cells in this method exist as a cell mass aggregated in a culture medium.
- the "adhesive culture method” is a method of adhering and culturing cells.
- Adhesive culture means that cells are adhered to an external matrix such as a culture vessel and, in principle, are grown in a single layer.
- the above-mentioned adhesive cells can usually be cultured not only in adhesive culture but also in suspension culture.
- the term "medium” refers to a liquid or solid substance prepared for culturing cells. As a general rule, it contains the minimum necessary components that are essential for cell proliferation and / or maintenance. Unless otherwise specified, the medium of the present specification corresponds to a liquid medium for animal cells used for culturing animal-derived cells.
- basal medium refers to a medium that is the basis of various animal cell media. It can be cultured alone, or it can be prepared into a medium specific to various cells according to the purpose by adding various culture additives.
- Basal medium used in the present specification, BME medium, BGJb medium, CMRL1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium (Iscover's Modified Dulvecco'S Medium), Medium Medium 99 , ⁇ MEM medium, DMEM medium (Dulvecco'S Modified Eagle'S Medium), ham F10 medium, ham F12 medium, RPMI 1640 medium, Fisher'S medium, and a mixed medium thereof (for example, DMEM / F12 medium (Dulvecco'S)).
- the medium is not particularly limited.
- the weight ratio of the DMEM medium and the ham F12 medium is preferably in the range of 60/40 or more and 40/60 or less, for example, 58/42, 55/45, 52/48, 50/50, 48 /. A medium mixed with 52, 45/55, 42/58, etc. is used.
- the medium used for culturing human iPS cells and human ES cells can also be preferably used.
- the medium used in the present invention is preferably a serum-free medium, that is, a serum-free medium.
- the "culture additive” is a substance other than serum added to the medium for the purpose of culturing.
- culture additives include, but are not limited to, L-ascorbic acid, insulin, transferase, selenium, sodium hydrogen carbonate, growth factors, fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, cytokines, antioxidants. Agents, 2-mercaptoethanol, pyruvate, buffers, inorganic salts, antibiotics and the like.
- Insulin, transferrin, and cytokines may be of natural origin isolated from animal (preferably human, mouse, rat, bovine, horse, goat, etc.) tissues or sera, or genetically engineered.
- the growth factors are not limited, but are, for example, FGF2 (Basic fibroblast growth factor-2), TGF- ⁇ 1 (Transforming growth factor- ⁇ 1), Activin A, IGF-1, MCP-1, IL-6. , PAI, PEDF, IGFBP-2, LIF and IGFBP-7 can be used.
- Antibacterial agents include, but are not limited to, penicillin, streptomycin, amphotericin B and the like.
- Particularly preferred growth factors as culture additives for the medium used in the present invention are FGF2 and / or TGF- ⁇ 1.
- the medium contains a ROCK inhibitor.
- the ROCK inhibitor include Y-27632.
- the medium when prime-type pluripotent stem cells are to be cultured, the medium preferably has a composition that does not contain LIF. Furthermore, when prime-type pluripotent stem cells are to be cultured, it is preferable that the medium composition does not contain either one of the GSK3 inhibitor and the MEK / ERK inhibitor, preferably both. If the medium does not contain these LIF, GSK3 inhibitor, and MEK / ERK inhibitor, prime-type pluripotent stem cells can be cultured without being naive and in an undifferentiated state.
- the medium used in the present invention can contain one or more of the culture additives.
- the medium to which the culture additive is added is generally, but not limited to, the basal medium.
- Culture additives can be added to the medium in the form of solutions, derivatives, salts, mixed reagents and the like.
- L-ascorbic acid may be added to the medium in the form of a derivative such as magnesium 2-ascorbic acid
- selenium may be added to the medium in the form of a selenium salt (sodium selenite, etc.). May be good.
- Insulin, transferrin, and selenium can also be added to the medium in the form of an ITS reagent (insulin-transferrin-selenium). It is also possible to use a commercially available medium supplemented with at least one selected from L-ascorbic acid, insulin, transferrin, selenium and sodium hydrogen carbonate.
- CHO-S-SFM II Life Technologies Japan Co., Ltd.
- Hybridoma-SFM Life Technologies Japan Co., Ltd.
- eRDF Dry Powered Media Life Technologies Japan Co., Ltd.
- UltraCULTURE TM (BioWhittaker, Inc.), UltraDOMA TM (BioWhittaker, Inc.), UltraCHO TM (BioWhittaker, Inc.), UltraMDCK TM (BioWhittaker, Inc.), STEMPRO (registered trademark) hESC SFM (Life Technologies Japan, Ltd.), Essential8 TM (Life Technologies Japan, Ltd. ), StemFit (registered trademark) AK02N (Ajinomoto Co., Ltd.), mTeSR1 (Veritas Co., Ltd.), TeSR2 (Veritas Co., Ltd.) and the like.
- the most preferable medium used in the present invention is a serum-free medium containing L-ascorbic acid, insulin, transferrin, selenium and sodium hydrogen carbonate, and at least one growth factor.
- a serum-free medium containing L-ascorbic acid, insulin, transferrin, selenium and sodium hydrogen carbonate, and at least one growth factor.
- DMEM / F12 medium containing L-ascorbic acid, insulin, transferrin, selenium and sodium hydrogen carbonate, and at least one growth factor (preferably FGF2 and TGF- ⁇ 1) and serum-free.
- protein kinase C ⁇ (PKC ⁇ ) inhibitor means a substance that inhibits or suppresses the activity of PKC ⁇ .
- PKC ⁇ protein kinase C ⁇
- Protein kinases have a catalytic region on the C-terminal side and a regulatory region on the N-terminal side.
- the catalytic region is composed of a sequence that recognizes a phosphorylated residue on the substrate protein and a sequence that binds to ATP / Mg 2+.
- the regulatory region is composed of C1 and C2 domains.
- PKC includes PKC ⁇ , PKC ⁇ I, PKC ⁇ II and PKC ⁇ as conventional isozymes.
- the PKC includes PKC ⁇ , PKC ⁇ , PKC ⁇ and PKC ⁇ as new isozymes, and PKC ⁇ , PKC ⁇ and PKC ⁇ as atypical isozymes.
- PKC ⁇ means including both PKC ⁇ I and PKC ⁇ II or one of PKC ⁇ I and PKC ⁇ II.
- PKC ⁇ inhibitor as used herein means a substance that inhibits at least PKC ⁇ I and / or PKC ⁇ II among these conventional, new and atypical isozymes. That is, the PKC ⁇ inhibitor means a substance that inhibits or suppresses only the activity of PKC ⁇ I, a substance that inhibits or suppresses only the activity of PKC ⁇ II, and a substance that inhibits or suppresses the activity of PKC ⁇ I and PKC ⁇ II.
- the PKC ⁇ inhibitor may be a substance that specifically inhibits or suppresses only the activity of PKC ⁇ , but may be a substance that inhibits or suppresses the activity of other isozymes other than PKC ⁇ I or PKC ⁇ II.
- the PKC ⁇ inhibitor may be a substance that inhibits or suppresses the activity of all the conventional, neoplastic and atypical isozymes described above, including PKC ⁇ I and PKC ⁇ II.
- the PKC ⁇ inhibitor may be a substance that inhibits or suppresses the activities of the conventional isozymes PKC ⁇ and PKC ⁇ .
- the PKC ⁇ inhibitor may be a substance that inhibits or suppresses the activities of the new isozymes PKC ⁇ , PKC ⁇ , PKC ⁇ and PKC ⁇ in addition to PKC ⁇ I and PKC ⁇ II.
- PKC ⁇ inhibitors include compounds that act directly or indirectly on PKC ⁇ , antisense nucleic acids against genes encoding PKC ⁇ , RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA), dominant negative variants, and their expression vectors. Can be mentioned.
- the PKC ⁇ inhibitor can be a compound having the following structural formula [Formula I].
- R 1 is a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms (preferably a methoxy group)
- R 2 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms (preferably a methyl group), or -N (preferably a methyl group).
- RA An alkyl group having 1 to 3 carbon atoms substituted with 2 (preferably ⁇ (CH 2 ) 3- N (CH 3 ) 2 ).
- RA is independently an ethyl group or a methyl group (preferably a methyl group).
- RC is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms substituted with ⁇ N ( RD ) 2 (preferably ⁇ (CH 2 ) ⁇ N (CH 3 ) 2 ).
- RD is independently an ethyl group or a methyl group (preferably a methyl group).
- Examples of the salt of the compound represented by the formula I include hydrochloride or sulfate.
- Specific examples of the PKC ⁇ inhibitor having the above structural formula [Formula I] include Go6983, GF109203X, LY-333531, Enzastaurin, Sotrastaurin, Ro-31-8220-messylate, Ro-32-0432-hydrochloride, Go6976, Rotter.
- LY-333531 ((9S)-[(dimethylamino) methyl] -6,7,10,11-tetrahydro-9H, 18H-5,21: 12,17-dimethenodibenzo [e, k] pyrrolo [3,4- h] [1,4,13] Oxaziazacyclohexadecin-18,20 (19H) -dione, monohydroxychloride) structural formulas are shown below.
- Enzastaurin (3- (1-methylindole-3-yl) -4- [1- [1- (pyridin-2-ylmethyl) piperidine-4-yl] indole-3-yl] pyrrole-2,5-dione)
- the structural formula of is shown below.
- Ro-31-8220-mesylate (3- [3- [2,5-dihydro-4- (1-methyl-1H-indole-3-yl) -2,5-dioxo-1H-pyrrole-3-yl]]
- the structural formula of -1H-indole-1-yl] propylcarbamimide thioic acid ester mesylate) is shown below.
- Ro-32-0432-hydrochloride (3-[(8S) -8-[(dimethylamino) methyl] -6,7,8,9-tetrahydropyrrole [1,2-a] indole-10-yl]-
- the structural formula of 4- (1-methyl-1H-indole-3-yl) -1H-pyrrole-2,5-dione hydrochloride) is shown below.
- tankyrace (TNKS) inhibitor means a substance that inhibits or suppresses the activity of tankyrace.
- Tankyrace (sometimes referred to as tankylase) belongs to the poly (ADP-ribosyl) -forming enzyme (PARP) family that poly (ADP-ribosyl) the target protein, and tankyrace-1 (tankyrace-1 / PARP-5a).
- PARP poly (ADP-ribosyl) -forming enzyme
- tankyrace-2 / PARP-5b are known.
- the telomere protein TRF1 is poly (ADP-ribosyl) and released from telomeres to promote telomere elongation by telomerase.
- TNKS means including both tanker race 1 and tanker race 2 or one of tanker race 1 and tanker race 2.
- TNKS inhibitor as used herein means a substance that inhibits tankyrace 1 and / or tankyrace 2. That is, the TNKS inhibitor includes a substance that inhibits or suppresses only the activity of tankylase 1, a substance that inhibits or suppresses only the activity of tankylase 2, and a substance that inhibits or suppresses the activity of tankylase 1 and tankylase 2. Meaning.
- TNKS inhibitors include compounds that act directly or indirectly on TNKS, antisense nucleic acids against genes encoding TNKS, RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA), dominant negative variants, and their expression vectors. Can be mentioned.
- examples of the TNKS inhibitor include compounds selected from the group consisting of IWR-1-endo, XAV939, G007-LK, G244-LM, MSC2504877 and WIKI4.
- G007-LK (4- [5-[(1E) -2- [4- (2-chlorophenyl) -5- [5- (methylsulfonyl) -2-pyridinyl] -4H-1,2,4-thiazol-
- the structural formula of 3-yl] ethenyl] -1,3,4-oxadiazol-2-yl] -benzonitrile) is shown below.
- G244-LM (3,5,7,8-tetrahydro-2- [4- [2- (methylsulfonyl) phenyl] -1-piperazinyl] -4H-thiopyrano [4,3-d] pyrimidin-4-one)
- the structural formula of is shown below.
- WIKI4 (2- [3-[[4- (4-Methoxyphenyl) -5- (4-pyridinyl) -4H-1,2,4-thiasol-3-yl] thio] propyl] -1H-benzo [de ]
- the structural formula of isoquinoline-1,3 (2H) -dione) is shown below.
- composition The pluripotent stem cell differentiation inhibitor according to the present invention is described in 1-2.
- the PKC ⁇ inhibitor and the TNKS inhibitor defined in the above are included as active ingredients.
- the PKC ⁇ inhibitor may be one kind or a combination of two or more different kinds.
- the lower limit of the concentration of the PKC ⁇ inhibitor is not particularly limited, and can be determined according to the range having a differentiation inhibitory effect on pluripotent stem cells.
- the PKC ⁇ inhibitor can have a final concentration of 25 nM or more, 30 nM or more, 50 nM or more, 80 nM or more, 100 nM or more as the final concentration in the liquid medium. It can be 150 nM or more, 200 nM or more, 500 nM or more, 700 nM or more, 1 ⁇ M or more, 3 ⁇ M or more. It can be 5 ⁇ M or more, and can be 10 ⁇ M or more.
- the upper limit of the concentration of the PKC ⁇ inhibitor is not particularly limited, and can be determined according to the range having a differentiation inhibitory effect on pluripotent stem cells, the solubility of the PKC ⁇ inhibitor, and the like.
- the PKC ⁇ inhibitor can have a final concentration of 15 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or less, 5 ⁇ M or less, 3 ⁇ M or less, and 1 ⁇ M or less in the liquid medium. It can be 700 nM or less, 500 nM or less, 200 nM or less, 150 nM or less, 100 nM or less, 80 nM or less. It can be 50 nM or less, and can be 30 nM or less.
- the concentration of the PKC ⁇ inhibitor in the composition can be determined so as to be within the above range when added to the medium.
- the lower limit of the PKC ⁇ inhibitor in the composition can be 50 nM or more, 60 nM or more, 100 nM or more. , 160 nM or more, 200 nM or more, 300 nM or more, 400 nM or more, 1 ⁇ M or more, 1.4 ⁇ M or more. It can be 2, 2 ⁇ M or more, 6 ⁇ M or more, 10 ⁇ M or more, and 20 ⁇ M or more.
- the upper limit of the PKC ⁇ inhibitor in the composition is not particularly limited, and the solubility of the PKC ⁇ inhibitor can be used. Specifically, the upper limit of the PKC ⁇ inhibitor in the composition can be 200 mM.
- the TNKS inhibitor may be one kind or a combination of two or more different kinds.
- the lower limit of the concentration of the TNKS inhibitor is not particularly limited, and can be determined according to the range having a differentiation inhibitory effect on pluripotent stem cells.
- the TNKS inhibitor can have a final concentration of 90 nM or more, 100 nM or more, 150 nM or more, 200 nM or more, 300 nM or more as the final concentration in the liquid medium. It can be 400 nM or more, 500 nM or more, 600 nM or more, 700 nM or more, 800 nM or more, 900 nM or more. It can be 1 ⁇ M or more, 1.5 ⁇ M or more, 3 ⁇ M or more, 5 ⁇ M or more, 10 ⁇ M or more, 15 ⁇ M or more. It can be 30 ⁇ M or more, and can be 35 ⁇ M or more.
- the upper limit of the concentration of the TNKS inhibitor is not particularly limited, and can be determined according to the range having a differentiation inhibitory effect on pluripotent stem cells, the solubility of the TNKS inhibitor, and the like.
- the TNKS inhibitor can have a final concentration of 40 ⁇ M or less, 35 ⁇ M or less, 30 ⁇ M or less, 15 ⁇ M or less, and 10 ⁇ M or less in the liquid medium. It can be 5 ⁇ M or less, 3 ⁇ M or less, 1.5 ⁇ M or less, 1 ⁇ M or less, 900 nM or less, 800 nM or less. It can be 700 nM or less, 600 nM or less, 500 nM or less, 400 nM or less, 300 nM or less, 200 nM or less. It can be 150 nM or less, and can be 100 nM or less.
- the concentration of the TNKS inhibitor in the composition can be determined so as to be within the above range when added to the medium.
- the lower limit of the TNKS inhibitor in the composition can be 180 nM or more, 200 nM or more, 300 nM or more. , 400 nM or more, 600 nM or more, 800 nM or more, 1 ⁇ M or more, 1.2 ⁇ M or more, 1.4 ⁇ M or more.
- the upper limit of the TNKS inhibitor in the composition is not particularly limited, and the solubility of the TNKS inhibitor can be used. Specifically, the upper limit of the TNKS inhibitor in the composition can be 113 mM.
- the lower limit of the content concentration ratio of the PKC ⁇ inhibitor and the TNKS inhibitor in the liquid medium is not particularly limited, but is, for example, 167: 1 or more, 111: 1 or more, 56: 1 or more, 33: 1 or more, 11: It can be 1 or more, 7.8: 1 or more, 5.6: 1 or more, 2.2: 1 or more, 1.7: 1 or more, or 1.1: 1 or more.
- the upper limit of the content concentration ratio of the PKC ⁇ inhibitor and the TNKS inhibitor in the liquid medium is not particularly limited, but for example, 1: 1600 or less, 1: 1400 or less, 1: 1200 or less, 1: 600 or less, 1: 400.
- the ratio of the content concentration of the PKC ⁇ inhibitor to the TNKS inhibitor in the liquid medium is not particularly limited, but can be, for example, in the range of 167: 1 or more and 1: 1600 or less.
- the ratio of the content concentration of the PKC ⁇ inhibitor and the TNKS inhibitor in the liquid medium can be in the range of 111: 1 or more and 1: 1600 or less, and can be in the range of 56: 1 or more and 1: 1600 or less. It can be in the range of 33: 1 or more and 1: 1600 or less, in the range of 11: 1 or more and 1: 1600 or less, and in the range of 7.8: 1 or more and 1: 1600 or less. It can be in the range of 5.6: 1 or more and 1: 1600 or less, can be in the range of 2.2: 1 or more and 1: 1600 or less, and can be in the range of 1.7: 1 or more and 1: 1600 or less.
- the ratio of the content concentration of the PKC ⁇ inhibitor and the TNKS inhibitor in the liquid medium can be in the range of 167: 1 or more and 1: 1400 or less, and can be in the range of 167: 1 or more and 1: 1200 or less. , 167: 1 or more and 1: 600 or less, 167: 1 or more and 1: 400 or less, 167: 1 or more and 1: 200 or less, 167.
- It can be in the range of 1 or more and 1: 120 or less, can be in the range of 167: 1 or more and 1:60 or less, can be in the range of 167: 1 or more and 1:40 or less, and can be in the range of 167: 1 or more and 1:40 or less.
- It can be a range of 1:36 or less, a range of 167: 1 or more and 1:32 or less, a range of 167: 1 or more and 1:28 or less, and a range of 167: 1 or more and 1 : 24 or less, 167: 1 or more and 1:20 or less, 167: 1 or more and 1:16 or less, 167: 1 or more and 1:12 It can be in the following range, it can be in the range of 167: 1 or more and 1: 8 or less, it can be in the range of 167: 1 or more and 1: 6 or less, and it can be in the range of 167: 1 or more and 1: 4 or less. Can be a range.
- the pluripotent stem cell differentiation inhibitor is a composition
- a carrier can be mentioned as another component to be combined with the PKC ⁇ inhibitor and the TNKS inhibitor which are active ingredients.
- Carriers include solvents and / or excipients.
- solvent examples include water, buffer (including PBS), raw food, organic solvent (DMSO, DMF, xylene, lower alcohol) and the like.
- excipients examples include antibiotics, buffers, thickeners, colorants, stabilizers, surfactants, emulsifiers, preservatives, preservatives, antioxidants and the like.
- the antibiotic is not particularly limited, but for example, penicillin, streptomycin, amphotericin B and the like can be used.
- the buffer include a phosphate buffer solution, a Tris-hydrochloric acid buffer solution, and a glycine buffer solution.
- the thickener include gelatin and polysaccharides.
- the colorant include phenol red and the like.
- stabilizer examples include albumin, dextran, methyl cellulose, gelatin and the like.
- Surfactants include cholesterol, alkyl glycosides, alkyl polyglucosides, alkyl monoglyceryl ethers, glucosides, maltosides, neopentyl glycols, polyoxyethylene glycols, thioglucosides, thiomaltosides, peptides, saponins, phospholipids, fatty acid sorbitan esters. , Fatty acid diethanolamide and the like.
- the emulsifier include glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, and sucrose fatty acid ester.
- Preservatives include aminoethylsulfonic acid, benzoic acid, sodium benzoate, ethanol, sodium edetate, canten, dl-camfur, citric acid, sodium citrate, salicylic acid, sodium salicylate, phenyl salicylate, dibutylhydroxytoluene, sorbic acid.
- Potassium sorbate nitrogen, dehydroacetic acid, sodium dehydroacetate, 2-naphthol, sucrose, honey, isobutyl paraoxybenzoate, isopropyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, butyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, paraoxybenzoic acid Methyl, l-menthol, eucalyptus oil and the like can be mentioned.
- Preservatives include benzoic acid, sodium benzoate, ethanol, sodium edetate, dry sodium sulfite, citric acid, glycerin, salicylic acid, sodium salicylate, dibutylhydroxytoluene, D-sorbitol, sorbic acid, potassium sorbate, sodium dehydroacetate. , Isobutyl paraoxybenzoate, isopropyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, butyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, methyl paraoxybenzoate, propylene glycol, phosphoric acid and the like.
- Antioxidants include citric acid, citric acid derivatives, vitamin C and its derivatives, licopen, vitamin A, carotenoids, vitamin B and its derivatives, flavonoids, polyphenols, glutathione, selenium, sodium thiosulfate, vitamin E and Examples thereof include ⁇ -lipoic acid and its derivatives, pycnogenol, flavongenol, superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase, glutathione-S-transferase, glutathione reductase, catalase, ascorbic acid peroxidase, and mixtures thereof. ..
- the pluripotent stem cell differentiation inhibitor may contain one or more growth factors.
- Growth factors include, for example, FGF2 and TGF- ⁇ 1.
- the form of the pluripotent stem cell differentiation inhibitor may be either a liquid agent or a solid agent (including granules, powders, and powders).
- the application form of the pluripotent stem cell differentiation inhibitor is not particularly limited. For example, it may be in the form of a medium used for suspension culture, or may be in the form of an additive to be added when preparing a medium for suspension culture.
- pluripotent stem cell differentiation inhibitor of the present invention it is possible to maintain the undifferentiated state of pluripotent stem cells in a suspension culture system and form cell aggregates. This makes it possible to efficiently produce a large amount of pluripotent stem cells. 2. Method for producing pluripotent stem cell population
- the method for producing a pluripotent stem cell population according to the present invention includes a step of suspending and culturing pluripotent stem cells in the presence of a protein kinase C ⁇ (PKC ⁇ ) inhibitor and a tankylase (TNKS) inhibitor.
- PKC ⁇ protein kinase C ⁇
- TNKS tankylase
- the presence of a PKC ⁇ inhibitor and a TNKS inhibitor maintains an undifferentiated state in pluripotent stem cells, and a pluripotent stem cell population is produced by suspension culture. It can be easily manufactured.
- the method of this embodiment includes a suspension culture step as an essential step, and a maintenance culture step and a recovery step as selection steps. Hereinafter, each step will be described.
- the "maintenance culture step” is to proliferate cells in a state in which the cell population before the suspension culture step, or the cell agglutination obtained after the suspension culture step or after the recovery step is maintained in an undifferentiated state. It is a step of culturing in.
- animal cell culture methods known in the art can be utilized. For example, it may be an adhesive culture in which cells are cultured while being adhered to a culture substrate such as a container or a carrier, or a suspension culture.
- the cells used in this step are cells capable of cell aggregation in suspension culture. As described in the section "Culture and medium” in “1-2. Definition of terms” described above, animal cells are preferable, and human cells are more preferable.
- the cell type is pluripotent stem cells, and pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells are particularly preferable.
- the culture container used for culturing is preferably a container having low cell adhesion to the inner surface of the container.
- the container having low cell adhesion to the inner surface of the container include a plate having a hydrophilic surface treatment with a biocompatible substance.
- Nunclon TM Sphera (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) can be used as a culture vessel.
- the shape of the culture vessel is not particularly limited, and examples thereof include a culture vessel having a dish shape, a flask shape, a well shape, a bag shape, a spinner flask shape, and the like.
- the capacity of the culture vessel to be used can be appropriately selected and is not particularly limited, but the lower limit of the area when the bottom surface of the portion containing the medium is viewed in a plan view is 0.32 cm 2 or more, 0.65 cm 2 or more, 1. 9cm 2 or more, 3.0 cm 2 or more, 3.5 cm 2 or more, 9.0 cm 2 or more, or 9.6 cm 2 or more, and the upper limit is, 1000 cm 2 or less, 500 cm 2 or less, 300 cm 2 or less, 150 cm 2 or less, 75 cm It is preferably 2 or less, 55 cm 2 or less, 25 cm 2 or less, 21 cm 2 or less, 9.6 cm 2 or less, or 3.5 cm 2 or less.
- the amount of the medium and the culture solution may be appropriately adjusted depending on the culture vessel used.
- the amount per well is 0.5 mL or more, 1.5 mL or less, preferably about 1.3 mL. Can be.
- the lower limit of the amount per well is 1.5 mL or more, 2 mL or more, or 3 mL or more.
- the upper limit can be 6.0 mL or less, 5 mL or less, and 4 mL or less.
- the lower limit can be 10 mL or more, 15 mL or more, 20 mL or more, 25 mL or more, or 30 mL or more, and the upper limit can be 10 mL or more. It can be 50 mL or less, 45 mL or less, or 40 mL or less.
- the lower limit can be 100 mL or more, 105 mL or more, 110 mL or more, 115 mL or more, or 120 mL or more, and the upper limit can be 150 mL or less and 145 mL or less. , 140 mL or less, 135 mL or less, 130 mL or less, or 125 mL or less.
- the lower limit can be 250 mL or more, 260 mL or more, 270 mL or more, 280 mL or more, or 290 mL or more
- the upper limit can be 350 mL or less and 340 mL or less. , 330 mL or less, 320 mL or less, or 310 mL or less.
- the lower limit of the amount per bag is 100 mL or more, 200 mL or more, 300 mL or more, 400 mL or more, 500 mL or more, 600 mL or more, 700 mL or more, 800 mL or more, 900 mL or more.
- Or 1000 mL or more, and the upper limit can be 2000 mL or less, 1900 mL or less, 1800 mL or less, 1700 mL or less, 1600 mL or less, 1500 mL or less, 1400 mL or less, 1300 mL or less, 1200 mL or less, or 1100 mL or less.
- the lower limit of the amount per bag can be 500 mL or more, 1 L or more, 2 L or more, 3 L or more, 4 L or more, or 5 L or more, and the upper limit is 10 L.
- it can be 9 L or less, 8 L or less, 7 L or less, or 6 L or less.
- the density of cells seeded in a new medium can be appropriately adjusted in consideration of the culture time, the cell state after culture, and the number of cells required after culture.
- the lower limit is usually 0.01 ⁇ 10 5 cells / mL or more, 0.1 ⁇ 10 5 cells / mL or more, 1 ⁇ 10 5 cells / mL or more, or 2 ⁇ 10 5 cells / mL or more
- the upper limit may be in the range of 20 ⁇ 10 5 cells / mL or less, or 10 ⁇ 10 5 cells / mL or less.
- Culture conditions such as culture temperature, time, and CO 2 concentration are not particularly limited. It may be done within the range of the conventional method in the field.
- the lower limit of the culture temperature may be 20 ° C. or higher or 35 ° C. or higher
- the upper limit may be 45 ° C. or lower or 40 ° C. or lower, but is preferably 37 ° C.
- the lower limit of the culture time may be 0.5 hours or more or 6 hours or more
- the upper limit may be in the range of 7 days or less, 120 hours or less, 96 hours or less, 72 hours or less, or 48 hours or less.
- the CO 2 concentration during culturing may have a lower limit of 4% or more, or 4.5% or more, and an upper limit of 10% or less, or 5.5% or less, but is preferably 5%.
- the medium can be exchanged at an appropriate frequency.
- the frequency of medium exchange varies depending on the cell type to be cultured, but for example, once every 5 days or more, once every 4 days or more, once every 3 days or more, once every 2 days or more, once a day or more, Alternatively, it may be performed twice or more a day, but is not limited thereto.
- the medium may be exchanged by collecting the cells by the same method as in the recovery step, adding fresh medium, gently dispersing the cell aggregates, and then culturing again.
- the frequency and method of medium exchange are not limited to the above frequency and method, and the optimum method may be appropriately adopted.
- the timing of the end of the culture and the timing of the medium exchange can be determined based on, for example, the lactic acid concentration in the medium.
- Lactic acid is produced by cells during culture and accumulates in the medium. Lactic acid produced by cells or lactic acid originally contained in the medium damages cells, and as a result, inhibits the maintenance of undifferentiated pluripotent stem cells, and proliferation, especially cell proliferation ability after passage. It is known to have adverse effects such as reducing lactic acid. Therefore, by determining the timing of the end of culture and / or the timing of medium replacement based on the concentration of lactic acid in the medium, it is possible to avoid the inhibitory effect of lactic acid on the maintenance of undifferentiated state and the effect of lactic acid on the cell proliferation ability. can.
- pluripotent stem cells when pluripotent stem cells are suspended-cultured in the presence of a protein kinase C ⁇ (PKC ⁇ ) inhibitor and a tankylase (TNKS) inhibitor, the above-mentioned effect of lactic acid can be reduced.
- PLC ⁇ protein kinase C ⁇
- TNKS tankylase
- the lactic acid concentration in the medium is preferably up to 15 mM.
- the lactic acid concentration in the medium is preferably 14 mM or less, 13 mM or less, 12 mM or less, and 10 mM or less.
- the lactic acid concentration in the medium is within this range, a significant decrease in the pH of the medium can be suppressed, and the above-mentioned action on cells can be avoided.
- the timing of the end of culture and the timing of medium replacement are determined by lactic acid in the medium.
- the concentration can be, for example, up to 15 mM, up to 14 mM or less, up to 13 mM or less, up to 12 mM or less, up to 10 mM or less.
- the timing of the end of the culture and the timing of the medium exchange may be set to the time when the lactic acid concentration in the medium is lower than this range.
- the flow state of the medium during culturing does not matter. It may be a static culture or a fluid culture, but it is preferably a fluid culture.
- Standing culture means culturing the medium in a culture container in a stationary state. In adhesive culture, this static culture is usually adopted.
- Fluid culture refers to culturing under conditions in which the medium is allowed to flow.
- a method of fluidizing the medium so as to promote cell aggregation is preferable. Examples of such a culturing method include a swirling culturing method, a oscillating culturing method, agitated culturing, or a combination thereof.
- “Swirl culture method” refers to a method of culturing under conditions in which the medium flows so that cells gather at one point due to stress (centrifugal force, centripetal force) due to swirling flow. Specifically, the culture vessel containing the medium containing cells is swirled so as to draw a closed orbit such as a circle, an ellipse, a flat circle, or a flat ellipse along a horizontal plane.
- the turning speed is not particularly limited, but the lower limit can be 1 rpm or more, 10 rpm or more, 50 rpm or more, 60 rpm or more, 70 rpm or more, 80 rpm or more, 83 rpm or more, 85 rpm or more, or 90 rpm or more.
- the upper limit can be 200 rpm or less, 150 rpm or less, 120 rpm or less, 115 rpm or less, 110 rpm or less, 105 rpm or less, 100 rpm or less, 95 rpm or less, or 90 rpm or less.
- the amplitude of the shaker used for swirling culture is not particularly limited, but the lower limit can be, for example, 1 mm or more, 10 mm or more, 20 mm or more, or 25 mm or more.
- the upper limit can be, for example, 200 mm or less, 100 mm or less, 50 mm or less, 30 mm or less, or 25 mm or less.
- the radius of gyration during swirling culture is also not particularly limited, but is preferably set so that the amplitude is within the above range.
- the lower limit of the turning radius can be, for example, 5 mm or more or 10 mm or more, and the upper limit can be, for example, 100 mm or less or 50 mm or less.
- it is preferable to set the swirling condition within the above range because it becomes easy to produce cell aggregates of an appropriate size.
- the "rocking culture method” refers to a method of culturing under conditions in which a rocking flow is applied to the medium by a linear reciprocating motion such as rocking stirring. Specifically, the culture vessel containing the medium containing cells is shaken in a plane substantially perpendicular to the horizontal plane.
- the rocking speed is not particularly limited, but for example, when one round trip is once, the lower limit is 2 times or more, 4 times or more, 6 times or more, 8 times or more, or 10 times or more, while the upper limit is 1. It may swing at 15 times or less, 20 times or less, 25 times or less, or 50 times or less per minute.
- the swing angle is not particularly limited, but for example, the lower limit is 0.1 ° or more, 2 ° or more, 4 ° or more, 6 ° or more, or 8 ° or more, while the upper limit is 20 ° or less, 18 ° or less, 15 °. Hereinafter, it can be 12 ° or less or 10 ° or less.
- the rocking condition within the above range because it becomes easy to produce cell aggregates of an appropriate size.
- the “stirring culture method” refers to a method in which the culture medium is cultivated under the condition of stirring the medium in the container using a stirring means such as a stirrer bar or a stirring blade while the culture container is left to stand.
- stirring culture can be achieved by using a spinner flask-shaped culture vessel with stirring blades.
- Such culture vessels are commercially available and they can also be utilized. If it is a commercially available spinner flask-shaped culture container, the amount recommended by the manufacturer can be preferably used as the amount of the cell culture composition.
- the stirring speed by the stirring means is not particularly limited, but the lower limit may be 1 rpm or more, 10 rpm or more, 30 rpm or more, 50 rpm or more, or 70 rpm or more, 90 rpm or more, 110 rpm or more, 130 rpm or more.
- the upper limit can be 200 rpm or less, or 150 rpm or less.
- the shear stress applied to the cells being cultured it is preferable to control the shear stress applied to the cells being cultured.
- Animal cells, including pluripotent stem cells are generally more vulnerable to physical stress than other cells. Therefore, if the shear stress applied to the cells during agitation culture is too large, the cells may be physically damaged and their proliferative capacity may be reduced, or pluripotent stem cells may not be able to maintain their undifferentiated state. There is.
- the shear stress applied to the cells in agitated culture is not limited, but depends on, for example, the blade tip velocity.
- the maximum distance can be used.
- pluripotent stem cells when pluripotent stem cells are suspended-cultured in the presence of a protein kinase C ⁇ (PKC ⁇ ) inhibitor and a tankylase (TNKS) inhibitor, the above-mentioned action can be reduced to the applied shear stress.
- PLC ⁇ protein kinase C ⁇
- TNKS tankylase
- the pluripotent stem cells when pluripotent stem cells are suspended-cultured in the presence of protein kinase C ⁇ (PKC ⁇ ) inhibitors and tankirase (TNKS) inhibitors, the conditions under which higher shear stress is applied than in normal cell culture. Can maintain undifferentiated or cell proliferation ability. Specifically, even if the wing tip velocity is a very large value such as 0.23 m / s or more, the pluripotent stem cells can be cultivated by stirring while maintaining the undifferentiated state.
- the blade tip speed is preferably 0.05 m / s or more, preferably 0.08 m / s or more, preferably 0.10 m / s or more, and 0.13 m / s or more. It is preferably 0.17 m / s or more, 0.20 m / s or more, 0.23 m / s or more, and 0.25 m / s or more. Is preferable, and it is preferably 0.30 m / s or more.
- the blade tip speed is preferably 1.37 m / s or less, preferably 1.00 m / s or less, preferably 0.84 m / s or less, and 0.50 m / s or less. It is preferably 0.42 m / s or less, preferably 0.34 m / s or less, and preferably 0.30 m / s or less.
- How much the number of cells should be increased in this step and where the state of the cells should be adjusted may be appropriately determined according to the type of cells to be cultured, the purpose of cell aggregation, the type of medium and the culture conditions.
- the size of the individual cell aggregates produced by the suspension culture method of this embodiment is not particularly limited, but when observed under a microscope, the lower limit of the maximum width size in the observed image is 30 ⁇ m or more, 40 ⁇ m or more, 50 ⁇ m or more, It may be 60 ⁇ m or more, 70 ⁇ m or more, 80 ⁇ m or more, 90 ⁇ m or more, or 100 ⁇ m or more.
- the upper limit may be 1000 ⁇ m or less, 900 ⁇ m or less, 800 ⁇ m or less, 700 ⁇ m or less, 600 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, 400 ⁇ m or less, or 300 ⁇ m or less.
- a cell aggregate in this range is preferable as a cell growth environment because oxygen and nutrient components are easily supplied to the cells inside.
- the lower limit is 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more on a weight basis. , 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 100% is preferably a cell aggregate within the above size range.
- the proportion (survival rate) of living cells among the cells constituting the population is, for example, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80%. As mentioned above, it is preferably 90% or more.
- a cell aggregate having a viability in the above range is easy to maintain an aggregated state and is a preferable state for cell proliferation.
- the culture solution and the cells are separated by a conventional method, and the cells are collected. At this time, it is preferable that the cells are collected as a single cell by exfoliation or dispersion treatment. The specific method will be described in detail in the recovery step described later.
- the collected cells may be washed as they are or, if necessary, with a buffer (including PBS buffer), saline, or a medium (preferably the medium used in the next step or the basal medium), and then subjected to the next step. ..
- the "suspension culture step” is a step of suspend culturing cells in a medium containing the above-mentioned pluripotent stem cell differentiation inhibitor or its active ingredients PKC ⁇ inhibitor and TNKS inhibitor.
- the cell culture method in this step basically conforms to the culture method described in "2-2-1. Maintenance culture step" described above. Therefore, here, the description common to the above-mentioned method in the maintenance culture step will be omitted, and only the points characteristic of this step will be described in detail.
- the cells used in this step are not limited, but cells prepared after the maintenance culture step are preferable.
- the cell type is also pluripotent stem cells as described in the maintenance culture step, and pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells are particularly preferable.
- the state of cells when seeded in a medium is preferably a single cell state.
- the pluripotent stem cell used in this step may be a single cell or a cell population composed of a plurality of cells (pluripotent stem cell population).
- the pluripotent stem cell is a pluripotent stem cell population, the proportion of cells expressing the pluripotent stem cell marker (eg, OCT4, SOX2, Nanog) and / or the pluripotent stem cell marker positive in the population. ) Is, for example, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 100% or less.
- This step is characterized in that it is cultured in a medium containing a PKC ⁇ inhibitor and a TNKS inhibitor, and in this respect, it differs from the medium used in the maintenance culture step.
- the type of medium is not limited as long as it contains a PKC ⁇ inhibitor and a TNKS inhibitor and can proliferate and / or maintain cells.
- the concentrations of PKC ⁇ inhibitor and TNKS inhibitor contained in the medium in this step are as described in 1-3. It shall be as described in the configuration column. As long as the concentrations of the PKC ⁇ inhibitor and the TNKS inhibitor in the medium at the start of this step are within the above range, the method of adding the PKC ⁇ inhibitor and the TNKS inhibitor is not particularly limited. For example, one or more PKC ⁇ inhibitors and TNKS inhibitors may be directly administered to the medium so that the total amount is within the above concentration range.
- the culture method is preferably fluid culture in which the medium flows.
- pluripotent stem cell marker expressed in pluripotent stem cells taken out during culture, it is possible to confirm whether or not the undifferentiated state is maintained.
- the pluripotent stem cell marker as described above, for example, Alkaline Phosphatase, Nanog, OCT4, SOX2, TRA-1-60, c-Myc, KLF4, LIN28, SSEA-4, SSEA-1 and the like can be exemplified.
- flow cytometry can be mentioned as a method for detecting these pluripotent stem cell markers.
- the positive rate of the pluripotent stem cell marker is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 91% or more, more preferably 92% or more, and more. It is preferably 93% or more, more preferably 94% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, more preferably. When is 100% or less, it can be judged that the undifferentiated state is maintained.
- the undifferentiated state is determined by measuring the expression of trigerm marker (endoderm cell marker, mesoderm cell marker and ectoderm cell marker) in pluripotent stem cells taken out during culture. You can check if it is maintained. That is, the positive rates of these endoderm cell markers, mesoderm cell markers, and ectoderm cell markers are all preferably 20% or less, more preferably 10% or less, more preferably 9% or less, and more preferably.
- the endoderm cell marker is a gene specific to endoderm cells, and examples thereof include SOX17, FOXA2, CXCR4, AFP, GATA4, and EOMES.
- Endograft cells include tissues of organs such as the gastrointestinal tract, lung, thyroid, pancreas, and liver, cells of secretory glands that open to the gastrointestinal tract, peritoneum, thoracic membrane, laryngeal tract, ear canal, trachea, bronchus, and urethra (bladder). , Most of the urethra, part of the ureter).
- the mesoderm cell marker is a gene specific to mesoderm cells, and is, for example, T (BRACHYURY), MESS1, MESS2, FOXF1, HAND1, EVX1, IRX3, CDX2, TBX6, MIXL1, ISL1, SNAI2, FOXC1. And PDGFR ⁇ and the like.
- the mesoderm cells include the body cavity and the mesothelium, muscles, skeleton, skin dermis, connective tissue, heart, blood vessels (including vascular endothelium), blood (including blood cells), lymph vessels, spleen, and kidneys that support the body cavity. , Urinary tract, gonads (testis, uterus, dermis epithelium), etc.
- the ectoderm cell marker is a gene specific to the ectoderm cell, and examples thereof include FGF5, NESTIN, SOX1, and PAX6.
- Ectoderm cells include the epithelium of the epithelium of the skin and the epithelium of the terminal urinary tract of men, hair, nails, skin glands (including mammary glands and sweat glands), and sensory organs (oral cavity, pharynx, nose, and epithelium of the terminal end of the rectum). , Salivary glands) Form the crystalline lens, peripheral nervous system, etc.
- a part of the ectoderm invades in a groove shape during development to form a neural tube, which is also a source of neurons and melanocytes of the central nervous system such as the brain and spinal cord.
- the expression of these three germ layer markers can be measured by any detection method in the art.
- the method for measuring the expression of the three germ layer markers is not limited, but for example, quantitative real-time PCR analysis, RNA-Seq method, Northern High Examples thereof include hybridization or a hybridization method using a DNA array.
- the expression level of the marker gene to be measured can be converted into the relative expression level with respect to the expression level of the internal standard gene, and the expression level of the marker gene can be evaluated based on the relative expression level.
- the internal standard gene include a glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene and a ⁇ -actin (ACTB) gene.
- Recovery step is a step of recovering cultured cells from the culture solution after the maintenance culture step or the suspension culture step, and is a selection step in the method of the present invention.
- recovery (of cells) means to obtain cells by separating the culture medium and cells.
- the method for collecting cells may follow the conventional method used in the cell culture method in the art, and is not particularly limited.
- the cells exist in a suspended state in the culture medium. Therefore, cell recovery can be achieved by removing the liquid component of the supernatant by standing or centrifuging. It can also be collected using a filtration filter, a hollow fiber separation membrane, or the like.
- the container containing the culture solution may be left in the stationary state for about 5 minutes, and the supernatant may be removed leaving the precipitated cells and cell aggregates. Centrifugation may be performed at a centrifugal acceleration and a treatment time so that the cells are not damaged by the centrifugal force.
- the lower limit of the centrifugal acceleration is not particularly limited as long as the cells can be precipitated, but may be, for example, 100 ⁇ g or more, 300 ⁇ g or more, 800 ⁇ g or more, or 1000 ⁇ g or more.
- the upper limit may be a speed at which the cells are not damaged by centrifugal force or are not easily damaged, and may be, for example, 1400 ⁇ g or less, 1500 ⁇ g or less, or 1600 ⁇ g or less.
- the lower limit of the treatment time is not particularly limited as long as the cells can be precipitated by the centrifugal acceleration, but may be, for example, 30 seconds or more, 1 minute or more, 3 minutes or more, or 5 minutes or more.
- the upper limit may be a time during which the cells are not or are not easily damaged by the centrifugal acceleration, and may be, for example, 10 minutes or less, 8 minutes or less, 6 minutes or less, or 30 seconds or less.
- the filtrate may be removed by passing the culture solution through a non-woven fabric or a mesh filter, and the remaining cell aggregates may be collected.
- the culture solution and the cells may be separated and recovered using a device equipped with the hollow fiber separation membrane such as a cell concentration washing system (Kaneka Co., Ltd.). ..
- the collected cells can be washed as needed.
- the cleaning method is not limited. For example, it may be carried out in the same manner as the washing method described in "Post-process treatment" in the above-mentioned maintenance culture step.
- a buffer including a PBS buffer
- saline a line
- a medium basic medium is preferable
- single cellization refers to a single free cell state in which a cell aggregate in which a plurality of cells adhere or aggregate to each other, such as a monolayer cell fragment or a cell aggregate, is dispersed. To do.
- a stripping agent and / or a chelating agent is used for single cell formation.
- the release agent is not limited, but for example, trypsin, collagenase, pronase, hyaluronidase, elastase, commercially available Accutase (registered trademark), Accumax (registered trademark), TrypLE TM Express Enzyme (Life Technologies Japan Co., Ltd.), TrypLE TM Select. Enzyme (Life Technologies Japan Co., Ltd.), Dispase (registered trademark), etc. can be used.
- the lower limit of the concentration in the solution is not particularly limited as long as it can disperse the cell aggregate, but for example, 0.15% by volume or more and 0.18% by volume. As mentioned above, it may be 0.20% by volume or more, or 0.24% by volume or more.
- the upper limit of the concentration in the solution is not particularly limited as long as it is not affected by the lysis of the cells themselves, but is 0.30% by volume or less, 0.28% by volume or less, or 0.25. It may be less than or equal to the volume%.
- the treatment time depends on the concentration of trypsin, but the lower limit thereof is not particularly limited as long as the cell aggregate is sufficiently dispersed by the action of trypsin, for example, 5 minutes or more, 8 minutes or more. It may be 10 minutes or more, 12 minutes or more, or 15 minutes or more.
- the upper limit of the treatment time is not particularly limited as long as it is not affected by the action of trypsin, such as lysis of the cells themselves. For example, 30 minutes or less, 28 minutes or less, 25 minutes or less, 22 minutes or less. , 20 minutes or less, or 18 minutes or less.
- a commercially available release agent it may be used at a concentration that allows the cells to be dispersed into a single state as described in the attached protocol.
- Single cell formation can be promoted by physically lightly treating after the treatment with the release agent and / or the chelating agent.
- This physical treatment is not limited, and examples thereof include a method of pipetting cells together with a solution multiple times.
- cells may be passed through a strainer or mesh, if desired.
- the cells that have become single cells can be recovered by removing the supernatant containing the release agent by standing or centrifuging.
- the collected cells may be washed if necessary.
- the conditions for centrifugation and the cleaning method may be the same as described above.
- Cell agglutination By the cell agglutination production method of this embodiment, a cell agglutination that maintains an undifferentiated state can be produced.
- the size of the individual cell aggregates produced by the cell aggregate production method of this embodiment is not particularly limited, but when observed with a microscope, the lower limit of the maximum width size in the observation image is 30 ⁇ m or more, 40 ⁇ m or more, and 50 ⁇ m. As mentioned above, it may be 60 ⁇ m or more, 70 ⁇ m or more, 80 ⁇ m or more, 90 ⁇ m or more, or 100 ⁇ m or more.
- the upper limit may be 1000 ⁇ m or less, 900 ⁇ m or less, 800 ⁇ m or less, 700 ⁇ m or less, 600 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, 400 ⁇ m or less, 300 ⁇ m or less, or 200 ⁇ m or less.
- one human iPS cell has a size of about 10 ⁇ m.
- a cell aggregate in this range is preferable as a cell growth environment because oxygen and nutrient components are easily supplied to the cells inside.
- the lower limit is 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70 on a weight basis.
- % Or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 100% is preferably a cell aggregate within the above size range.
- oxygen and nutrient components are easily supplied to the cells inside each individual cell aggregates, which is preferable as a cell growth environment.
- the proportion (survival rate) of living cells among the cells constituting the population is, for example, 50% or more, 60% or more, 70% or more. It is preferably 80% or more and 90% or more.
- a cell aggregate having a viability in the above range is easy to maintain an aggregated state and is a preferable state for cell proliferation.
- the proportion of cells expressing the pluripotent stem cell marker and / or positive for the pluripotent stem cell marker is pluripotent.
- the undifferentiated nature of stem cells may be determined.
- the positive rate of pluripotent stem cell markers is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 91% or more, more preferably 92% or more, more preferably 93% or more, more preferably 94. % Or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, still more preferably 100% or less.
- the cell agglutination in which the pluripotent stem cell marker is within the positive rate range is composed of a pluripotent stem cell population that maintains an undifferentiated state, and can be said to be a more homogeneous cell population.
- the pluripotent stem cell marker can be detected by any detection method in the art.
- the method for detecting a cell marker includes, but is not limited to, flow cytometry, for example.
- flow cytometry for example.
- a fluorescently labeled antibody is used as a detection reagent in flow cytometry
- a cell that emits stronger fluorescence than a negative control (isotype control) is detected, the cell is determined to be "positive" for the marker.
- the percentage of cells that are positive for fluorescently labeled antibodies analyzed by flow cytometry is sometimes referred to as the "positive rate.”
- the fluorescently labeled antibody any antibody known in the art can be used, for example, an antibody labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), allophycocyanin (APC), or the like. However, it is not limited to these.
- the cells constituting the cell aggregate may be composed of a single type or two or more types of cells.
- it may be a cell aggregate composed of only iPS cells, or it may be a cell aggregate composed of iPS cells and ES cells.
- the pluripotent stem cell aggregate can be produced by using the above-mentioned "2. Method for producing pluripotent stem cell population". According to this production method, it is possible to produce a cell aggregate that maintains an undifferentiated state of pluripotent stem cells.
- Method for Producing Pluripotent Stem Cell Clumps The basic steps in the method for producing pluripotent stem cell clumps of this embodiment are based on the above-mentioned "2. Method for producing pluripotent stem cell population". That is, as an essential step, a step of suspension culture in a medium containing a PKC ⁇ inhibitor and a TNKS inhibitor (first step) is included, and as a selection step, a maintenance culture step and a recovery step are included. As a general rule, the description of each step is as described in "2. Method for producing pluripotent stem cell population" described above.
- the culture time of the first step described above is preferably 0.5 hours or more, more preferably 12 hours or more, preferably 7 days or less, 6 days or less, 5 days or less, 4 days or less, more preferably 72 hours or less. It is more preferably 48 hours or less, and most preferably 24 hours or less.
- the culture time of the above-mentioned maintenance culture step is preferably 0.5 hours or more, more preferably 12 hours or more, 24 hours or more, 48 hours or more, preferably 7 days or less, 6 days or less, 5 days or less, and more. It is preferably 4 days or less, most preferably 72 hours or less.
- the medium can be exchanged at an appropriate frequency.
- the medium is exchanged between the first step and the maintenance culture step.
- the frequency of medium exchange varies depending on the cell type to be cultured, but for example, once every 5 days or more, once every 4 days or more, once every 3 days or more, once every 2 days or more, once a day or more, It may be done more than once a day, but it is not limited to them.
- the frequency and method of medium exchange are not limited to the above frequency and method, and the optimum method may be appropriately adopted.
- pluripotent stem cell aggregates According to the method for producing pluripotent stem cell clusters of this embodiment, pluripotent stem cell aggregates of an appropriate size can be produced while maintaining the undifferentiated state of pluripotent stem cells. ..
- pluripotent stem cell markers eg, OCT4, SOX2, NANOG
- pluripotent stem cell markers are expressed and / or pluripotent stem cell markers are positive.
- the proportions (ratio) of cells to be presented are, for example, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, It is 100% or less.
- Suspension culture medium 5-1 Outline This aspect is a medium for suspension culture of cells. By using the suspension culture medium of this embodiment, the undifferentiated state of pluripotent stem cells can be maintained in the medium.
- the cell suspension culture medium of this embodiment contains at least the differentiation inhibitor described in "1. Pluripotent stem cell differentiation inhibitor” described above, or its active ingredients PKC ⁇ inhibitor and TNKS inhibitor, and is suspended. It is composed of a cell proliferation medium for maintaining the undifferentiated state of pluripotent stem cells in culture.
- composition of the suspension culture medium of this embodiment is described in detail in the section "Culture and medium” in “1-2. Definition of terms” of "1. Pluripotent stem cell differentiation inhibitor” described above.
- composition of the differentiation inhibitor the PKC ⁇ inhibitor and the TNKS inhibitor which are the active ingredients thereof, and the concentration contained in the differentiation inhibitor, refer to "1-3. Composition of the pluripotent stem cell differentiation inhibitor” described above. It is described in detail in.
- the medium for suspension culture is used as a liquid medium at least during cell culture, but for storage, it may be in a solid state, for example, powdered and prepared. In this case, it may be dissolved in sterilized water or the like before use as a medium, diluted to an appropriate concentration, and then used.
- suspension culture medium can be frozen and stored until before use, and thawed before use.
- the kit containing the pluripotent stem cell differentiation inhibitor according to the present invention is a kit used for culturing pluripotent stem cells, which comprises a pluripotent stem cell differentiation inhibitor consisting of a PKC ⁇ inhibitor and a TNKS inhibitor.
- a pluripotent stem cell differentiation inhibitor consisting of a PKC ⁇ inhibitor and a TNKS inhibitor.
- the pluripotent stem cell differentiation inhibitor kit includes a pluripotent stem cell differentiation inhibitor consisting of a PKC ⁇ inhibitor and a TNKS inhibitor as essential components, and a medium and / or protocol as selective components.
- the protocol describes how to use this pluripotent stem cell differentiation suppression kit. Specifically, the amount of PKC ⁇ inhibitor and TNKS inhibitor included in the pluripotent stem cell differentiation suppression kit added to the medium, the amount of other components added, a suitable suspension culture method for maintaining undifferentiation, and the like are described. Has been done.
- ⁇ Reference example 1 Adhesive culture of human iPS cell WTC-11 strain> Human iPS cell WTC-11 strain (Coriel Institute) was seeded on a cell culture dish coated with iMatrix-511 Silk (Nippi) at 0.25 ⁇ g / cm 2 , and the temperature was 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere. Adhesive culture was performed below. As the medium, StemFit (registered trademark) AK02N (Ajinomoto Co., Inc.) was used, and the medium was changed every day. Only at the time of cell seeding, a ROCK inhibitor (Y-27632 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) was added to the medium so that the final concentration was 10 ⁇ M.
- a ROCK inhibitor Y-27632 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
- ⁇ Comparative Example 1 Suspension culture of human iPS cell WTC-11 strain>
- the human iPS cell WTC-11 strain adherently cultured in the procedure of Reference Example 1 was washed with Dulbecco's PBS (Nacalai Tesque) and then treated with 0.5 mM EDTA solution in Dulbecco's PBS (Nacalai Tesque) for 5 minutes. bottom.
- StemFit® AK02N medium was added to the dish, the cells were detached with a cell scraper, and then dispersed into a single cell by pipetting.
- the cells were suspended in StemFit® AK02N medium containing Y-27632 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) having a final concentration of 10 ⁇ M, and a part thereof was stained with trypan blue to measure the number of viable cells.
- Cell suspensions were prepared using StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632 to contain 1 ⁇ 10 5 cells per mL.
- a 6-well plate for suspension culture (Sumitomo Bakelite) was seeded with 4 mL of cell suspension per well.
- the cell-seeded plate is swirled on a rotary shaker (Optima) at a speed of 90 rpm along a horizontal plane in a circle with a swirling width (diameter) of 25 mm, and suspended-cultured in a 5% CO 2 environment at 37 ° C. was done.
- the day when the cells were seeded was defined as the 0th day of the culture, subculture was performed on the 5th day of the culture, and suspension culture was performed until the 10th day of the culture.
- Medium exchange was performed on days 2, 4, 7, and 9 of the culture.
- 3 mL of the culture supernatant was removed by suction from the well, and then 3 mL of StemFit® AK02N medium containing no Y-27632 was added to the well.
- the cell aggregates and the culture supernatant were collected from the wells in a centrifuge tube and allowed to stand for about 5 minutes to allow the cell aggregates to settle and the culture supernatant was removed.
- 1 mL of Accutase was added to the cell aggregate and treated at 37 ° C. for 10 minutes, and then dispersed into single cells by pipetting.
- the cells were suspended in StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632, and a part thereof was stained with trypan blue to measure the number of viable cells.
- the cell suspension was prepared using StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632 so as to contain 1 ⁇ 10 5 cells per mL, and the cells were seeded in the same manner as on the 0th day of culture. Then, suspension culture was continued. On the 10th day of culturing, a phase-contrast image of the cell agglomerate was acquired using a phase-contrast microscope. A phase-difference image of the cell aggregate is shown in FIG. From FIG. 1, it was confirmed that cell aggregates were formed.
- ⁇ Comparative Example 2 Addition of TNKS inhibitor to suspension culture of human iPS cell WTC-11 strain> The procedure is the same as in Comparative Example 1 except that the seed medium and the medium exchange medium for the suspension culture were prepared so as to contain the TNKS inhibitor IWR-1-endo (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a final concentration of 10 ⁇ M. Suspension culture was performed.
- ⁇ Comparative Example 3 Addition of PKC ⁇ inhibitor to suspension culture of human iPS cell WTC-11 strain> Suspension culture was carried out in the same procedure as in Comparative Example 1, except that the seeding medium and medium exchange medium for suspension culture were prepared so as to contain Go6983 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is a PKC ⁇ inhibitor, at a final concentration of 10 ⁇ M. bottom.
- Go6983 Fluji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- Example 1 Addition of TNKS inhibitor and PKC ⁇ inhibitor to suspension culture of human iPS cell WTC-11 strain> Suspension culture was carried out in the same procedure as in Comparative Example 1, except that the seeding medium and the medium exchange medium for the suspension culture were prepared so as to contain IWR-1-endo and Go6983 at a final concentration of 10 ⁇ M, respectively.
- Example 2 Quantitative real-time PCR analysis
- Quantitative real-time PCR analysis was performed according to the procedure shown below.
- the cells of Reference Example 1 on day 5 of culture and the cells of Comparative Examples 1, 2 and Example 1 on day 10 of culture were washed with Dulvecco's PBS, and Monarch Total RNA Miniprep Kit (New England Biolab Japan). ) was used to purify total RNA.
- the purification method was according to the instruction manual attached to the kit. 1000 ng of total RNA was fractionated with a microspectrophotometer.
- RNA For the separated RNA, RiverTra Ace (registered trademark) (Toyobo) 1 ⁇ L, 5x RT buffer (Toyobo) 4 ⁇ L, 10 mM dNTPs Mixture (Toyobo) 2 ⁇ L, RNase primer (10 units / ⁇ L) (Toyobo) 1 ⁇ L. 1 ⁇ L of Random primer (25 pmol / ⁇ L) (Toyobo Co., Ltd.) and RNase Free dH 2 O were added to prepare 20 ⁇ L, and cDNA synthesis was performed using SimpliAmp Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.). The reaction conditions for cDNA synthesis were as follows: reaction at 30 ° C.
- the synthesized cDNA solution was diluted 5-fold with sterile water. Diluted cDNA solution 0.5 ⁇ L / well, sterile water 3.98 ⁇ L / well, THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (Toyobo) 5 ⁇ L / well, Taqman® probe 0.5 ⁇ L / well, 50X ROX refinement day (Toyobo Co., Ltd.) was added to the reaction plate at 0.02 ⁇ L / well and mixed. GAPDH, Oct4, T, SOX17, and PAX6 were used as Taqman probes. Quantitative real-time PCR analysis was performed using a TaqMan® QuantStudio3 real-time PCR system (Thermo Fisher Scientific). The reaction conditions are shown in Table 1.
- the Assay ID of the Taqman® probe used for quantitative real-time PCR analysis is shown below.
- GAPDH Hs027866624_g1
- OCT4 Hs01088114_m1
- T Hs00610080_m1
- SOX17 Hs00751752_s1
- PAX6 Hs04260367_gH
- Table 2 The results of measuring gene expression are shown in Table 2 and FIG.
- T meoderm marker gene
- SOX17 endoderm marker gene
- PAX6 ectoderm marker gene
- Comparative Example 1 in which suspension culture was performed, the expression levels of T, SOX17, and PAX6 increased as compared with Reference Example 1. From this, it was shown that in the suspension culture, spontaneous differentiation into mesoderm, endoderm and ectoderm occurred, and the undifferentiated state of pluripotent stem cells could not be maintained. Further, in Comparative Example 2 in which a TNKS inhibitor was added and suspension culture was performed, the expression levels of T and SOX17 could be suppressed to the same level as in Reference Example 1, but the expression level of PAX6 was higher than that in Reference Example 1. rice field.
- the TNKS inhibitor can effectively suppress the spontaneous differentiation into mesoderm and endoderm, but the suppressive effect on ectoderm differentiation is weak. It was also shown that the PKC ⁇ inhibitor promotes mesoderm and endoderm differentiation, although it can suppress spontaneous differentiation into ectoderm. On the other hand, it was clarified that the spontaneous differentiation of all mesoderm, endoderm and ectoderm can be suppressed by performing suspension culture by adding both a TNKS inhibitor and a PKC ⁇ inhibitor.
- TNKS inhibitors and PKC ⁇ inhibitors are used. It is not enough to add either one, and only by adding both TNKS inhibitor and PKC ⁇ inhibitor, it suppresses spontaneous differentiation into all mesoderm, endoderm and ectoderm, and is pluripotent. It was revealed that the undifferentiated state of stem cells can be maintained.
- ⁇ Reference example 2 Adhesive culture of human iPS cell 201B7 strain> Human iPS cell 201B7 strain (Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University) was seeded on a cell culture dish coated with Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated (Thermo Fisher Scientific) at 0.5 ⁇ g / cm 2. Then, adhesive culture was carried out at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. As the medium, StemFit (registered trademark) AK02N (Ajinomoto Co., Inc.) was used, and the medium was changed every day. Only at the time of cell seeding, Y-27632 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the medium so that the final concentration was 10 ⁇ M.
- ⁇ Comparative Example 4 Suspension culture of human iPS cell 201B7 strain>
- the human iPS cell 201B7 strain adherently cultured in the same procedure as in Reference Example 2 was treated with Accutase (Innovative Cell Technology Co., Ltd.) for 5 minutes, exfoliated from the culture surface, and dispersed into a single cell by pipetting.
- the cells were suspended in StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632, and a part thereof was stained with trypan blue to measure the number of viable cells.
- Cell suspensions were prepared using StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632 to contain 2 ⁇ 10 5 cells per mL.
- a 6-well plate for suspension culture was seeded with 4 mL of cell suspension per well.
- the plate in which the cells were seeded was swirled on a rotary shaker at a speed of 83 rpm along a horizontal plane in a circle having a swirling width (diameter) of 25 mm, and suspension culture was performed in a 37 ° C., 5% CO 2 environment.
- the day when the cells were seeded was defined as the 0th day of the culture, subculture was performed on the 4th day of the culture, and suspension culture was performed until the 8th day of the culture. Medium exchange was performed daily.
- the entire amount of the medium containing the cell aggregate was collected in a centrifuge tube and allowed to stand for about 5 minutes to allow the cell aggregate to settle.
- the culture supernatant was then removed and gently resuspended in StemFit® AK02N medium and returned to the original wells.
- Y-27632 was added to the medium to a final concentration of 5 ⁇ M on the 1st and 5th days of the culture, and Y-27632 was added to the medium to a final concentration of 2 ⁇ M on the 2nd and 6th days of the culture. Was added to.
- the cell aggregates and the culture supernatant were collected from the wells in a centrifuge tube and allowed to stand for about 5 minutes to allow the cell aggregates to settle and the culture supernatant was removed.
- the cells were dispersed into a single cell by pipetting.
- the cells were suspended in StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632, and a part thereof was stained with trypan blue to measure the number of viable cells.
- the cell suspension was prepared using StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632 so as to contain 2 ⁇ 10 5 cells per mL, and the cells were seeded in the same manner as on the 0th day of culture. Then, suspension culture was continued. On the 8th day of culturing, a phase-contrast image of the cell agglomerate was acquired using a phase-contrast microscope. A phase-difference image of the cell aggregate is shown in FIG. From FIG. 3, it was confirmed that a cell aggregate was formed.
- ⁇ Comparative Example 5 Addition of TNKS inhibitor and PKC inhibitor to suspension culture of human iPS cell 201B7 strain>
- suspension culture was carried out by the following method. Same as Comparative Example 4 except that a TNKS inhibitor and a PKC inhibitor (inhibiting the activity of PKC isozymes other than PKC ⁇ ) were added to the seed medium and the medium exchange medium of the suspension culture in the combination shown in Table 3. Suspension culture was performed according to the procedure.
- Example 3 Addition of TNKS inhibitor and PKC ⁇ inhibitor to suspension culture of human iPS cell 201B7 strain>
- suspension culture was carried out by the following method. Suspension culture was carried out in the same procedure as in Comparative Example 4, except that a TNKS inhibitor and a PKC ⁇ inhibitor were added to the seed medium and the medium exchange medium of the suspension culture in the combination shown in Table 4.
- the synthesized cDNA solution was diluted 100-fold with 10 mM Tris-HCl pH 8.0 (Nacalai Tesque) and added to a 384-well PCR plate (Thermo Fisher Scientific) at 5 ⁇ L / well.
- KOD SYBR registered trademark
- qPCR Mix Toyobo Co., Ltd.
- Forward primer prepared to 50 ⁇ M Riverse primer prepared to 50 ⁇ M
- DEPC-treated water Nacalai Tesque
- the mixture was added to the 384-well PCR plate at 15 ⁇ L / well and mixed.
- As primers, GAPDH, OCT4, T, SOX17, and PAX6 were used.
- the 384-well PCR plate was centrifuged to remove air bubbles in the wells, and quantitative real-time PCR analysis was performed using the Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). The reaction conditions are shown in Table 5.
- ACTB (Forward): 5'-CCTCATGAAGATCCTCACCGA-3'(SEQ ID NO: 1)
- ACTB (Reverse): 5'-TTGCCAATGGGTGATCTGG-3'(SEQ ID NO: 2)
- OCT4 (Forward): 5'-AGTGGGTGGAGGGAAGCTGACAAC-3'(SEQ ID NO: 3)
- OCT4 (Reverse): 5'-TCGTTGTGCATAGTCCGCTGCTTGA-3'(SEQ ID NO: 4)
- SOX2 (Forward): 5'-CACCAATCCCATCCACACTCAC-3'(SEQ ID NO: 5)
- SOX2 (Reverse): 5'-GCAAAGCTCCTACCCGTACCAC-3'(SEQ ID NO: 6)
- NANOG (Forward): 5'-AGCCTCCAGATAGCAAGACTAC-3'(SEQ ID NO: 7)
- NANOG (Reverse): 5'-AGCCTCCAGATAGC
- Comparative Example 4 in which suspension culture was performed, the expression level of PAX6 was increased as compared with adhesive culture (Reference Example 2), and spontaneous differentiation into ectoderm was observed. It was shown to be awake. Comparative Examples 5-1 to 5-4 to which a TNKS inhibitor and a PKC inhibitor (inhibiting the activity of PKC isozymes other than PKC ⁇ ) were added had PAX6 expression levels similar to those of Comparative Example 4. In Examples 3-1 to 3-3 to which the TNKS inhibitor and the PKC ⁇ inhibitor were added, the expression level of PAX6 was lower than that of Comparative Example 4 and was similar to that of Reference Example 2.
- LY-333531 added in Example 3 is a selective inhibitor of PKC ⁇
- Go6983 and GF109203X are broad-spectrum inhibitors that inhibit the activity of a plurality of PKC isozymes including PKC ⁇ . From these facts, it was clarified that inhibition of PKC ⁇ is effective for suppressing spontaneous differentiation into ectoderm, and that PKC ⁇ inhibitors are useful as agents for suppressing differentiation of pluripotent stem cells into ectoderm. rice field.
- ⁇ Comparative Example 7 Preparation of cells for flow cytometry analysis>
- a TNKS inhibitor and a PKC inhibitor which inhibits the activity of PKC isozymes other than PKC ⁇
- the cells were cultured for 8 days in the same procedure as in Comparative Example 5.
- Table 7 shows the combinations of the TNKS inhibitor and PKC inhibitor used (which inhibit the activity of PKC isozymes other than PKC ⁇ ).
- Example 5 Preparation of cells for flow cytometry analysis>
- the cells were prepared by culturing for 8 days in the same procedure as in Examples 3-2 and 3-3. bottom.
- the combinations of the TNKS inhibitor and PKC ⁇ inhibitor used are shown in Table 8.
- Example 6 Flow cytometry analysis was performed according to the procedure shown below.
- the cells obtained in Reference Example 3, Comparative Example 6, Comparative Example 7, and Example 5 were treated with Accutase and dispersed into a single cell by pipetting.
- the cells were washed with PBS (phosphate buffered saline). Then, it was fixed with 4% PFA (paraformaldehyde) at room temperature for 20 minutes, washed with PBS three times, and permeated with cold methanol at ⁇ 20 ° C. overnight. After washing 3 times with PBS, the cells were blocked with 3% FBS (fetal bovine serum) / PBS for 1 hour at room temperature.
- PBS phosphate buffered saline
- FBS fetal bovine serum
- the cell sample was then divided into two and resuspended in 50 ⁇ L each.
- Fluorescently labeled anti-OCT4, anti-SOX2, and anti-NANOG antibodies were added to one side and mixed, and a fluorescently labeled isotype control antibody was added to the other side, mixed, and stained at 4 ° C. for 1 hour in a light-shielded state.
- Table 9 shows the antibodies used and their addition amounts.
- Example 5 in which suspension culture was carried out by adding a TNKS inhibitor and a PKC ⁇ inhibitor, the proportion of cells showing positive for OCT4, SOX2, and NANOG was 90% or more, and spontaneous differentiation was suppressed and not yet. It was considered that a cell population that maintained the differentiated state was obtained. From these results, it was clarified that it is possible to obtain a pluripotent stem cell population that suppresses spontaneous differentiation and maintains an undifferentiated state by suspension culture using a TNKS inhibitor and a PKC ⁇ inhibitor.
- ⁇ Comparative Example 8 Suspension culture of human iPS cell 201B7 strain>
- the human iPS cell 201B7 strain adherently cultured in the same procedure as in Reference Example 2 was treated with Accutase for 5 minutes, exfoliated from the cultured surface, and dispersed into a single cell by pipetting.
- the cells were suspended in StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632, and a part thereof was stained with trypan blue to measure the number of viable cells.
- Cell suspensions were prepared using StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632 to contain 2 ⁇ 10 5 cells per mL.
- a 12-well plate for suspension culture (Sumitomo Bakelite) was seeded with 1 mL of cell suspension per well.
- the plate in which the cells were seeded was swirled on a rotary shaker at a speed of 98 rpm along a horizontal plane in a circle having a swirling width (diameter) of 25 mm, and suspension culture was performed in a 37 ° C., 5% CO 2 environment.
- the day when the cells were seeded was defined as the 0th day of the culture, subculture was performed on the 5th day of the culture, and suspension culture was performed until the 10th day of the culture.
- Medium exchange was performed daily.
- the entire amount of the medium containing the cell aggregate was collected in a centrifuge tube and allowed to stand for about 5 minutes to allow the cell aggregate to settle.
- the culture supernatant was then removed and gently resuspended in StemFit® AK02N medium and returned to the original wells.
- Y-27632 was added to the medium to a final concentration of 5 ⁇ M on the 1st and 6th days of the culture, and Y-27632 was added to the medium to a final concentration of 2 ⁇ M on the 2nd and 7th days of the culture. was added to.
- the cell aggregates and the culture supernatant were collected from the wells in a centrifuge tube and allowed to stand for about 5 minutes to allow the cell aggregates to settle and the culture supernatant was removed.
- the cells were dispersed into a single cell by pipetting.
- the cells were suspended in StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632, and a part thereof was stained with trypan blue to measure the number of viable cells.
- the cell suspension was prepared using StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632 so as to contain 2 ⁇ 10 5 cells per mL, and the cells were seeded in the same manner as on the 0th day of culture. Then, suspension culture was continued.
- Example 9 Addition of PORCN inhibitor and PKC ⁇ inhibitor to suspension culture of human iPS cell 201B7 strain>
- the TNKS inhibitor used in Example 1 is known to have an inhibitory effect on WNT signaling. Therefore, in order to confirm whether or not there is a differentiation inhibitory effect even when a Porcupine (PORCN) inhibitor having an inhibitory effect on WNT signal is used in addition to the TNKS inhibitor, suspension culture was carried out by the following method.
- Example 7 Addition of TNKS inhibitor and PKC ⁇ inhibitor to suspension culture of human iPS cell 201B7 strain>
- suspension culture was carried out by the following method. Except for the addition of IWR-1-endo or XAV939 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a TNKS inhibitor and GF109203X or LY-333531 as a PKC ⁇ inhibitor to the seed medium and medium exchange medium of the suspension culture. Then, suspension culture was carried out in the same procedure as in Comparative Example 8.
- Example 8 Quantitative real-time PCR analysis> Quantitative real-time PCR analysis was performed on the cells of Reference Example 4 on the 4th day of culture and the cells of Comparative Example 8, Comparative Example 9, and Example 7 on the 10th day of culture in the same procedure as in Example 4. The results of measuring gene expression are shown in Tables 11 and 12 and FIGS. 6 and 7.
- Comparative Example 9 In Comparative Example 9 in which a PORCN inhibitor and a PKC ⁇ inhibitor were added and suspension culture was performed, the expression levels of T and SOX17 were lower than in Comparative Example 8, so that the PORCN inhibitor spontaneously appeared in the mesoderm and endoderm. It was shown to suppress target differentiation. Further, in Example 7 in which suspension culture was carried out by adding a TNKS inhibitor and a PKC ⁇ inhibitor, the expression levels of T and SOX17 were further lower than those in Comparative Example 9, and thus TNKS inhibition was higher than that of the PORCN inhibitor. It was shown that the drug can more strongly suppress the spontaneous differentiation into mesoderm and endoderm. Both the PORCN inhibitor and the TNKS inhibitor have an inhibitory effect on WNT signaling, but the TNKS inhibitor is more effective in suppressing spontaneous differentiation into mesoderm and endoderm in combination with a PKC ⁇ inhibitor. Became clear.
- Adhesive culture of human iPS cell 201B7 strain Adhesive culture was carried out in the same procedure as in Reference Example 2.
- ⁇ Comparative Example 10 Suspension culture of human iPS cell 201B7 strain> Suspension culture was carried out in the same procedure as in Comparative Example 8. On the 8th day of culturing, a phase-contrast image of the cell agglomerate was acquired using a phase-contrast microscope. A phase-difference image of the cell aggregate is shown in FIG. From FIG. 8, it was confirmed that a cell aggregate was formed.
- Example 9 Examination of concentrations of TNKS inhibitor and PKC ⁇ inhibitor in suspension culture of human iPS cell 201B7 strain> IWR-1-endo as a TNKS inhibitor was added to the seed medium and medium exchange medium of the suspension culture at a final concentration of 30 ⁇ M, 10 ⁇ M, 3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 300 nM, or 100 nM, and Go6983 was added as a PKC ⁇ inhibitor.
- suspension culture was carried out in the same procedure as in Comparative Example 8 except that LY-333531 was added at a final concentration of 10 ⁇ M, 100 nM, or 30 nM.
- Example 10 Quantitative real-time PCR analysis> Quantitative real-time PCR analysis was performed on the cells of Reference Example 5 on the 4th day of culture and the cells of Comparative Examples 10 and 9 on the 10th day of culture in the same procedure as in Example 4. The results of measuring gene expression are shown in Tables 13 and 14 and FIGS. 9 to 11.
- Example 9 in which a TNKS inhibitor and a PKC ⁇ inhibitor were added and suspension culture was performed, when the TNKS inhibitor was added in a concentration range of 30 ⁇ M or less and 100 nM or more, the expression levels of T and SOX17 were higher than those of Comparative Example 10. It was relatively low and suppressed spontaneous differentiation into mesoderm and endoderm. Further, in Example 9, when the PKC ⁇ inhibitor was added in a final concentration range of 10 ⁇ M or less and 30 nM or more, the expression level of PAX6 was lower than that of Comparative Example 10, and spontaneous differentiation into ectoderm was suppressed.
- ⁇ Comparative Example 11 Addition of TNKS inhibitor and PKC ⁇ inhibitor in adhesive culture of human iPS cell 201B7 strain>
- adhesive culture was carried out under two conditions, one in which XAV939 was added at a final concentration of 10 ⁇ M and the final concentration of GF109203X was 5 ⁇ M, and the other was not added to the seed culture and medium exchange medium for adhesive culture.
- the phase difference image of the cells on the 4th day of culture is shown in FIG. From FIG. 12, it was confirmed that most of the cells died under the condition that XAV939 and GF109203X were added.
- the cells were treated with Accutase for 5 minutes, detached from the culture surface, and dispersed into single cells by pipetting.
- the cells were suspended in StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632, and a part thereof was stained with trypan blue to measure the number of viable cells.
- the amplification factor of the conditions added XAV939 and GF109203X was 2.11 ⁇ 10 -2. From this, it was shown that the addition of the TNKS inhibitor and the PKC ⁇ inhibitor in the adhesive culture adversely affects the survival and proliferation of pluripotent stem cells.
- Example 11 Addition of TNKS inhibitor and PKC ⁇ inhibitor in suspension culture of human iPS cell 201B7 strain>
- suspension culture was carried out under two conditions, one in which XAV939 was added at a final concentration of 10 ⁇ M and GF109203X at a final concentration of 5 ⁇ M, and the other was not added to the seed medium and medium exchange medium for suspension culture.
- the phase difference image of the cells on the 4th day of culture is shown in FIG. From FIG. 13, the conditions in which XAV939 and GF109203X were added formed cell aggregates in the same manner as in the conditions without addition, and showed the same morphology.
- the cells were treated with Accutase for 10 minutes, exfoliated, and dispersed into single cells by pipetting.
- the cells were suspended in StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632, and a part thereof was stained with trypan blue to measure the number of viable cells.
- the amplification factor was calculated in the same manner as in Comparative Example 9, the amplification factor under the condition that XAV939 and GF109203X were added was 2.68.
- a comparison of amplification factors between Comparative Example 11 and Example 11 is shown in FIG. From these facts, it is clear that when the TNKS inhibitor and PKC ⁇ inhibitor of Example 11 are added in suspension culture, the adverse effects on survival and proliferation confirmed in the adhesive culture of Comparative Example 11 are remarkably improved. Became.
- ⁇ Comparative Example 12 Long-term suspension culture of human iPS cell 1231A3 strain>
- the human iPS cell 1231A3 strain adherently cultured in the same procedure as in Reference Example 2 was treated with Accutase (Innovative Cell Technology Co., Ltd.) for 5 minutes, exfoliated from the culture surface, and dispersed into a single cell by pipetting.
- the cells were suspended in StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632, and a part thereof was stained with trypan blue to measure the number of viable cells.
- Cell suspensions were prepared using StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632 to contain 2 ⁇ 10 5 cells per mL.
- a 6-well plate for suspension culture was seeded with 4 mL of cell suspension per well.
- the plate in which the cells were seeded was swirled on a rotary shaker at a speed of 90 rpm along a horizontal plane in a circle having a swirling width (diameter) of 25 mm, and suspension culture was performed in a 37 ° C., 5% CO 2 environment.
- the day on which the cells were seeded was defined as the 0th day of the culture, subculture was carried out on the 4th, 8th, 16th and 20th days of the culture, and suspension culture was carried out until the 24th day of the culture.
- Medium exchange was performed daily.
- the entire amount of the medium containing the cell aggregate was collected in a centrifuge tube and allowed to stand for about 5 minutes to allow the cell aggregate to settle.
- the culture supernatant was then removed, gently resuspended in StemFit® AK02N medium and returned to the original wells for medium replacement.
- Y-27632 was added to the medium to a final concentration of 5 ⁇ M, and on days 2, 6, 10, 14, 18, and 22 of culture. was added to the medium to a final concentration of 2 ⁇ M.
- the cell aggregates and the culture supernatant were collected from the wells in a centrifuge tube and allowed to stand for about 5 minutes to allow the cell aggregates to settle and the culture supernatant was removed.
- the cells were dispersed into a single cell by pipetting. The cells were suspended in StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632, and a part thereof was stained with trypan blue to measure the number of viable cells.
- the cell suspension was prepared using StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632 so as to contain 2 ⁇ 10 5 cells per mL, and the cells were seeded in the same manner as on the 0th day of culture. Then, suspension culture was continued. Phase-contrast images of cell aggregates were acquired using a phase-contrast microscope on days 8, 16 and 24 of the culture. A phase-difference image of the cell aggregate is shown in FIG. From FIG. 15, it was confirmed that a cell aggregate was formed, but the shape was distorted.
- Example 12 Addition of TNKS inhibitor and PKC ⁇ inhibitor in long-term suspension culture of human iPS cell 1231A3 strain> 20 ⁇ M of IWR-1-endo as a TNKS inhibitor and 1 ⁇ M of LY-333531 as a PKC ⁇ inhibitor were added to the medium of the suspension culture, and the culture supernatant was sampled immediately before the medium exchange and passage. Culturing was carried out in the same manner as in Comparative Example 12, except that the lactic acid concentration was measured using the multi-functional biosensor BF-7D manufactured by the manufacturer. A phase-difference image of the cell aggregate is shown in FIG. From FIG. 16, it was confirmed that a beautiful spherical cell aggregate was formed. In addition, FIG.
- FIG. 17 shows the transition of the results of the quantitative real-time PCR analysis performed in Comparative Example 12 and Example 12 (see Example 4 for the primers and analysis conditions used). As shown in FIG. 17, it was found that in Example 12, the relative gene expression level of OCT4, which is an undifferentiated marker, was maintained high even in long-term culture. Further, in Example 12, it can be seen that the relative gene expression level of SOX17, which is an endoderm marker, is maintained low even in long-term culture.
- FIG. 18 shows the transition of the positive rate of OCT4, which is an undifferentiated marker, in Comparative Example 12 and Example 12. From FIG. 18, it can be seen that in Example 12, the positive rate of OCT4, which is an undifferentiated marker, is maintained high even in long-term culture.
- FIG. 19 shows the transition of the reached viable cell density in Comparative Example 12 and Example 12. From FIG. 19, it was found that in Example 12, pluripotent stem cells could maintain their proliferative potential even after suspension culture for a long period of time. Furthermore, FIG. 20 shows the results of measuring the lactic acid concentration in the medium immediately before the medium exchange and passage of Example 12. From FIG.
- Example 12 it was found that in Example 12, the lactic acid concentration in the medium immediately before the passage exceeded 10 mM and increased to about 12 mM. From the results shown in FIGS. 17 to 20 above, by using a medium containing a TNKS inhibitor and a PKC ⁇ inhibitor, even if the lactic acid concentration in the medium is relatively high, the pluripotent stem cells are undifferentiated. It was found that the proliferative ability could be maintained.
- Example 13 Long-term suspension culture using a stirring reactor> A culture vessel for suspension culture was seeded with a 30 mL cell suspension using a single-use bioreactor (30 mL) for iPS cell culture manufactured by ABLE, and stirred at 135 rpm, that is, a blade tip speed of 0.23 m / s. , Subculture was carried out on the 3rd, 6th, 9th and 12th days of the culture, and suspension culture was carried out until the 15th day of the culture. In this example, at the time of medium exchange, on days 1, 4, 7, 10 and 13 of culture, Y-27632 was added to the medium to a final concentration of 6.9 ⁇ M, and on days 2, 5, 8, 11 and 14 of culture. The eyes were cultured in the same manner as in Example 12 except that Y-27632 was added to the medium to a final concentration of 3.71 ⁇ M.
- ⁇ Reference example 6 Long-term adhesive culture of human iPS cell 1231A3 strain>
- the human iPS cell 1231A3 strain adherently cultured in the same procedure as in Reference Example 2 was treated with Accutase (Innovative Cell Technology Co., Ltd.) for 5 minutes, exfoliated from the culture surface, and dispersed into a single cell by pipetting. After that, the culture and passage were repeated in the same procedure as in Reference Example 2 except that the number of culture days and the number of passages were the same as in Example 13.
- FIG. 21 shows the transition of the results of the quantitative real-time PCR analysis performed in Example 13 and Reference Example 6 (see Example 4 for the primers and analysis conditions used). In addition, the point where the data is missing in FIG.
- FIG. 21 means that it was below the detection limit value. As shown in FIG. 21, it can be seen that the relative gene expression level of the undifferentiated marker is maintained as high as that in the adhesive culture of Reference Example 6 even in the long-term culture, although the culture is suspension in Example 13. Further, in Example 13, it can be seen that the relative gene expression level of the typical three germ layer markers is maintained low even in the long-term culture as in the adhesive culture of Reference Example 6.
- FIG. 22 shows the results of G-Band analysis of the cells obtained in Example 13 (consigned to Japan Genetic Research Institute Co., Ltd.). As shown in FIG. 22, it was found that the suspension culture in Example 13 did not cause new karyotype abnormalities in both the 3rd and 5th generations of the passage. From the results shown in FIGS.
- nuclei are used even under stirring culture conditions in which a high shear stress is applied to pluripotent stem cells. It was found that the undifferentiated state of pluripotent stem cells can be maintained without causing typographical abnormalities.
- Example 14 Evaluation of iPS cell differentiation potential after long-term suspension culture>
- the cryopreserved cells of Example 13 were thawed, suspended in StemFit® AK02N medium containing a final concentration of 10 ⁇ M Y-27632, and a part thereof was stained with trypan blue to measure the number of viable cells.
- the cell suspension should contain 2 ⁇ 10 5 cells per mL using StemFit® AK02N medium containing Y-27632 at a final concentration of 10 ⁇ M, IWR-1-endo at 20 ⁇ M, and LY-333531 at 1 ⁇ M.
- a 6-well plate for suspension culture was seeded with 4 mL of cell suspension per well.
- the cell-seeded plate is swirled on a rotary shaker at a speed of 90 rpm along a horizontal plane in a circle with a swirling width (diameter) of 25 mm, and is subjected to suspension culture for 4 days in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. went.
- Medium exchange was performed daily.
- the entire amount of the medium containing the cell aggregate was collected in a centrifuge tube and allowed to stand for about 5 minutes to allow the cell aggregate to settle. Then, the culture supernatant was removed, gently resuspended in the medium, and returned to the original well to exchange the medium.
- the final concentration of Y-27632 in the medium was reduced to 6.9 ⁇ M one day after the start of the culture, and the final concentration of Y-27632 in the medium was reduced to 3.71 ⁇ M two days after the culture. After a day, the final concentration of Y-27632 in the medium was reduced to 2.53 ⁇ M.
- differentiation was induced into each of the three germ layers while changing the medium and the additives in the medium as shown in Table 15.
- ⁇ Reference Example 7 Evaluation of differentiation potential of adhesively cultured iPS cells>
- the cells of Reference Example 6 cryopreserved were thawed and adherently cultured in the same manner as in Reference Example 2. However, a culture dish having an inner diameter of 6 cm, a medium volume of 4.2 mL, and a seeding density of 1.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 were used for culturing for 4 days.
- the human iPS cell 1231A3 strain was treated with Accutase (Innovative Cell Technology Co., Ltd.) for 5 minutes to exfoliate the cells from the culture surface and disperse them into single cells by pipetting. Then, differentiation induction into three germ layers was carried out in the same manner as in Example 14.
- Example 23 shows the results of measuring the relative gene expression levels of the three germ layer markers by quantitative real-time PCR analysis. As shown in FIG. 23, it was revealed that the iPS cells cultured for a long period of time in Example 14 have the ability to induce differentiation into each of the three germ layers.
- ⁇ About Examples 12-14> As shown above, by using a medium containing a TNKS inhibitor and a PKC ⁇ inhibitor, suspension culture, which is expected as a method for mass preparation of pluripotent stem cells, can be subjected to proliferative, undifferentiated, and differentiation-inducing ability. It was shown that it can be cultured for a long period of time while maintaining it.
- the pluripotent stem cells used in Examples 12 to 14 include those provided by a production method equivalent to that of clinical pluripotent stem cells, such as being established in a feeder-free manner. Therefore, it can be expected that clinical pluripotent stem cells can also be adjusted in large quantities while maintaining proliferative, undifferentiated, and differentiation-inducing ability as shown in Examples 12 to 14.
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Abstract
未分化状態を維持しながら多能性幹細胞を浮遊培養する。多能性幹細胞を浮遊培養する際に、PKC阻害剤のなかでもPKCβ阻害剤と、タンキレース阻害剤(TNKS阻害剤)とを存在させることで未分化状態を維持する。
Description
本発明は、多能性幹細胞を浮遊培養によって製造する製造方法に関し、また、浮遊培養によって多能性幹細胞集団を製造する製造方法に関する。
ES細胞やiPS細胞等の多能性幹細胞は、無限に増殖できる能力と様々な体細胞に分化する能力を有している。多能性幹細胞から分化誘導させた体細胞を移植する治療法の実用化は、難治性疾患や生活習慣病に対する治療法を根本的に変革できる可能性がある。例えば、多能性幹細胞から、神経細胞をはじめとして、心筋細胞、血液細胞、及び網膜細胞等の多種多様な体細胞に試験管内で分化誘導する技術が既に開発されている。
一方で、多能性幹細胞を用いた再生医療は、実用化に向けて課題が残されており、その課題の一つは、多能性幹細胞の生産性である。例えば、肝臓の再生には約2×1011個の細胞が必要と言われている。多能性幹細胞の培養方法は、平坦な基板上に細胞接着させて培養する接着培養と、液体培地中に細胞を浮遊させて培養する浮遊培養に大別される。接着培養により前記個数の細胞を培養するには106cm2以上の基板が必要であり、これは一般的な10cmディッシュで約20,000枚分に相当する。このように、基板表面上での接着培養では得られる細胞数が培養面積に依存するため、スケールアップに膨大な面積が必要となり、再生医療に必要な量の細胞を供給することは困難である。浮遊培養では液体培地中で細胞を浮遊させながら培養するため、得られる細胞数は培地体積に依存する。そのため、浮遊培養はスケールアップが容易であり、細胞の大量生産に適している。例えば、非特許文献1には、浮遊培養の細胞培養容器としてスピナーフラスコを用い、液体培地を撹拌しながら多能性幹細胞を浮遊培養する方法が開示されている。
また、前記再生医療の実用化に向けた別の課題としては、目的体細胞の生産性が挙げられる。目的体細胞を効率的に生産するための取り組みとして、分化誘導効率を向上させる取り組みが挙げられ、その方法は種々報告されている。例えば、非特許文献2には、多能性幹細胞の接着培養において、プロテインキナーゼC(PKC)阻害剤を培地中に添加することで、多能性幹細胞の自発的分化を抑制する方法が開示されている。また、非特許文献3には、多能性幹細胞の接着培養において、タンキレース(TNKS)阻害剤を培地中に添加することで、多能性幹細胞の自発的分化を抑制する方法が開示されている。
上述したように、多能性幹細胞から目的体細胞を効率的に生産するための方法は各種開発されている。しかしながら、非特許文献2及び3の方法は、接着培養に関する記載のみであり、浮遊培養での自発的分化抑制効果は記載されておらず、PKC阻害剤とTNKS阻害剤を組み合わせることによる効果は記載も示唆もない。
Olmer R.et al.,Tissue Engineering:Part C,Volume 18(10):772-784(2012)
M.Kinehara et al.,PLoS One.2013;8(1):e54122
T.Sumi et al.,PLoS One.2013;8(5):e63378
本発明は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の三胚葉全ての方向への自発的分化を抑制し、多能性幹細胞の未分化状態を維持する技術を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、多能性幹細胞の浮遊培養において、PKCβ阻害剤と、TNKS阻害剤とを共存させることで、三胚葉全ての方向への自発的分化を抑制して、多能性幹細胞の未分化状態を維持できることに成功した。本発明は、これらの研究結果に基づいて完成に至ったものであり、以下を包含する。
(1)PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む液体培地中で、多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞集団の製造方法。
(2)前記液体培地中のPKCβ阻害剤含有濃度が、25nM以上15μM以下である(1)記載の方法。
(3)前記液体培地中のTNKS阻害剤含有濃度が、90nM以上40μM以下である(1)記載の方法。
(4)前記液体培地中のPKCβ阻害剤とTNKS阻害剤の含有濃度の比率が167:1以上1:1600以下の範囲である(1)記載の方法。
(5)前記液体培地が、L-アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも1つを含有する(1)記載の方法。
(6)前記液体培地が、FGF2及び/又はTGF-β1を含む(1)記載の方法。
(7)前記液体培地が、ROCK阻害剤を含有する(1)記載の方法。
(8)前記ROCK阻害剤が、Y-27632である(7)記載の方法。
(9)前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を形成する工程を含む(1)記載の方法。
(10)前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を回収する工程を含む(1)記載の方法。
(11)前記多能性幹細胞集団は、OCT4が陽性を呈する細胞の比率が90%以上であり、SOX2が陽性を呈する細胞の比率が90%以上であり、Nanogが陽性を呈する細胞の比率が90%以上である(1)記載の方法。
(12)前記多能性幹細胞が、ES細胞及び/又は人工多能性幹細胞である(1)記載の方法。
(13)上記液体培地中の乳酸濃度が5~15mMになるまで上記浮遊培養する(1)記載の方法。
(14)上記浮遊培養は、翼先端速度を0.05m/s以上1.37m/s以下とした攪拌培養である(1)記載の方法。
(15)前記(1)~(14)の何れかに記載の方法により製造される多能性幹細胞集団。
(16)PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む、多能性幹細胞分化抑制剤。
(17)前記PKCβ阻害剤含有濃度が、50nM以上200mM以下である(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
(18)前記TNKS阻害剤含有濃度が、180nM以上113mM以下である(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
(19)前記分化抑制剤中のPKCβ阻害剤とTNKS阻害剤の含有濃度の比率が、167:1以上1:1600以下の範囲である(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
(20)前記(16)~(19)の何れかに記載の多能性幹細胞分化抑制剤を含む多能性幹細胞分化抑制キット。
(2)前記液体培地中のPKCβ阻害剤含有濃度が、25nM以上15μM以下である(1)記載の方法。
(3)前記液体培地中のTNKS阻害剤含有濃度が、90nM以上40μM以下である(1)記載の方法。
(4)前記液体培地中のPKCβ阻害剤とTNKS阻害剤の含有濃度の比率が167:1以上1:1600以下の範囲である(1)記載の方法。
(5)前記液体培地が、L-アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも1つを含有する(1)記載の方法。
(6)前記液体培地が、FGF2及び/又はTGF-β1を含む(1)記載の方法。
(7)前記液体培地が、ROCK阻害剤を含有する(1)記載の方法。
(8)前記ROCK阻害剤が、Y-27632である(7)記載の方法。
(9)前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を形成する工程を含む(1)記載の方法。
(10)前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を回収する工程を含む(1)記載の方法。
(11)前記多能性幹細胞集団は、OCT4が陽性を呈する細胞の比率が90%以上であり、SOX2が陽性を呈する細胞の比率が90%以上であり、Nanogが陽性を呈する細胞の比率が90%以上である(1)記載の方法。
(12)前記多能性幹細胞が、ES細胞及び/又は人工多能性幹細胞である(1)記載の方法。
(13)上記液体培地中の乳酸濃度が5~15mMになるまで上記浮遊培養する(1)記載の方法。
(14)上記浮遊培養は、翼先端速度を0.05m/s以上1.37m/s以下とした攪拌培養である(1)記載の方法。
(15)前記(1)~(14)の何れかに記載の方法により製造される多能性幹細胞集団。
(16)PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む、多能性幹細胞分化抑制剤。
(17)前記PKCβ阻害剤含有濃度が、50nM以上200mM以下である(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
(18)前記TNKS阻害剤含有濃度が、180nM以上113mM以下である(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
(19)前記分化抑制剤中のPKCβ阻害剤とTNKS阻害剤の含有濃度の比率が、167:1以上1:1600以下の範囲である(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
(20)前記(16)~(19)の何れかに記載の多能性幹細胞分化抑制剤を含む多能性幹細胞分化抑制キット。
(21)前記PKCβ阻害剤は、Go6983、GF109203X、LY-333531、Enzastaurin、Sotrastaurin、Ro-31-8220-mesylate、Ro-32-0432-hydrochloride、Go6976、Rottlerin、Midostaurin、Daphnetin、Dequalinium Chloride、Baicalein、Quercetin、Luteolin、Bisindolylmaleimide II、Calphostin C、Chelerythrine chloride、L-threo Dihydrosphingosine及びMelittinからなる群から選ばれる少なくとも1つである(1)記載の方法及び(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
(22)前記TNKS阻害剤は、IWR-1-endo、XAV939、G007-LK、G244-LM及びWIKI4からなる群から選ばれる少なくとも1つである(1)記載の方法及び(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
(23)前記多能性幹細胞がプライム型多能性幹細胞である(1)記載の方法及び(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
(24)前記液体培地がLIFを含まない(1)記載の方法。
(25)LIFを含まない液体培地組成物を含む(20)記載の多能性幹細胞分化抑制キット。
(26)前記液体培地がGSK3阻害剤を含まない(1)記載の方法。
(27)GSK3阻害剤を含まない液体培地組成物を含む(20)記載の多能性幹細胞分化抑制キット。
(28)前記液体培地がGSK3阻害剤とMEK/ERK阻害剤を含まない(1)記載の方法。
(29)GSK3阻害剤とMEK/ERK阻害剤を含まない液体培地組成物を含む(20)記載の多能性幹細胞分化抑制キット。
(30)PKCβ阻害剤は下記構造式[式I]を有する化合物である(1)記載の方法及び(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
(22)前記TNKS阻害剤は、IWR-1-endo、XAV939、G007-LK、G244-LM及びWIKI4からなる群から選ばれる少なくとも1つである(1)記載の方法及び(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
(23)前記多能性幹細胞がプライム型多能性幹細胞である(1)記載の方法及び(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
(24)前記液体培地がLIFを含まない(1)記載の方法。
(25)LIFを含まない液体培地組成物を含む(20)記載の多能性幹細胞分化抑制キット。
(26)前記液体培地がGSK3阻害剤を含まない(1)記載の方法。
(27)GSK3阻害剤を含まない液体培地組成物を含む(20)記載の多能性幹細胞分化抑制キット。
(28)前記液体培地がGSK3阻害剤とMEK/ERK阻害剤を含まない(1)記載の方法。
(29)GSK3阻害剤とMEK/ERK阻害剤を含まない液体培地組成物を含む(20)記載の多能性幹細胞分化抑制キット。
(30)PKCβ阻害剤は下記構造式[式I]を有する化合物である(1)記載の方法及び(16)記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
式Iにおいて、
R1は水素原子または炭素数1~3のアルコキシ基(好ましくはメトキシ基)であり、
R2は、水素原子、炭素数1~3のアルキル基(好ましくはメチル基)、又は、-N(RA)2により置換された炭素数1~3のアルキル基(好ましくは-(CH2)3-N(CH3)2)であり、
RAは独立にエチル基又はメチル基(好ましくはメチル基)であり、
R3は、
又は
RBは、水素原子、-S-C(=NH)(-NH2)により置換された炭素数2~4のアルキル基(好ましくは-(CH2)3-S-C(=NH)(-NH2))、又は
本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法によれば、浮遊培養により未分化状態を維持した多能性幹細胞集団を製造することができる。
本発明の多能性幹細胞分化抑制剤によれば、浮遊培養中の多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。
本発明の多能性幹細胞分化抑制剤によれば、浮遊培養中の多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。
1.多能性幹細胞分化抑制剤
1-1.概要
本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤は、プロテインキナーゼCβ(PKCβ)阻害剤及びタンキレース(TNKS)阻害剤を含有することに特徴がある。また、本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤は、PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤からなる組成物とすることができる。本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤により、浮遊培養中の細胞における未分化状態を維持し、浮遊培養によって多能性幹細胞集団を容易に製造することができる。
1-1.概要
本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤は、プロテインキナーゼCβ(PKCβ)阻害剤及びタンキレース(TNKS)阻害剤を含有することに特徴がある。また、本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤は、PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤からなる組成物とすることができる。本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤により、浮遊培養中の細胞における未分化状態を維持し、浮遊培養によって多能性幹細胞集団を容易に製造することができる。
1-2.用語の定義
本明細書で使用する以下の用語について定義する。
≪細胞≫
本明細書において発明の対象となる「多能性幹細胞」とは、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能(多能性)を有し、適切な条件下のインビトロ(in vitro)での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。より具体的に、多能性とは、個体を構成する胚葉(脊椎動物では外胚葉、中胚葉及び内胚葉の三胚葉)に分化できる能力を意味する。このような細胞は例えば、胚性幹細胞(ES細胞:embryonic stem cell)、胚性生殖幹細胞(EG細胞:embryonic germ cell)、生殖系幹細胞(GS細胞:Germline stem cell)、そして人工多能性幹細胞(iPS細胞:induced pluripotent stem cells)等が挙げられる。「ES細胞」とは、初期胚より調製された多能性幹細胞である。「EG細胞」とは、胎児の始原生殖細胞より調製された多能性幹細胞である(Shamblott M.J.et al.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,95:13726-13731)。「GS細胞」とは、細胞精巣より調製された多能性幹細胞である(Conrad S.,2008,Nature,456:344-349)。また、「iPS細胞」とは、分化済みの体細胞に少数の初期化因子をコードする遺伝子を導入することによって体細胞を未分化状態にするリプログラミングが可能となった多能性幹細胞をいう。
本明細書で使用する以下の用語について定義する。
≪細胞≫
本明細書において発明の対象となる「多能性幹細胞」とは、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能(多能性)を有し、適切な条件下のインビトロ(in vitro)での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。より具体的に、多能性とは、個体を構成する胚葉(脊椎動物では外胚葉、中胚葉及び内胚葉の三胚葉)に分化できる能力を意味する。このような細胞は例えば、胚性幹細胞(ES細胞:embryonic stem cell)、胚性生殖幹細胞(EG細胞:embryonic germ cell)、生殖系幹細胞(GS細胞:Germline stem cell)、そして人工多能性幹細胞(iPS細胞:induced pluripotent stem cells)等が挙げられる。「ES細胞」とは、初期胚より調製された多能性幹細胞である。「EG細胞」とは、胎児の始原生殖細胞より調製された多能性幹細胞である(Shamblott M.J.et al.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,95:13726-13731)。「GS細胞」とは、細胞精巣より調製された多能性幹細胞である(Conrad S.,2008,Nature,456:344-349)。また、「iPS細胞」とは、分化済みの体細胞に少数の初期化因子をコードする遺伝子を導入することによって体細胞を未分化状態にするリプログラミングが可能となった多能性幹細胞をいう。
本明細書における多能性幹細胞は、多細胞生物に由来する細胞であればよい。好ましくは動物由来細胞、より好ましくは哺乳動物由来細胞である。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜又は愛玩動物、そしてヒト、アカゲザル、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。特に好ましくは、ヒト由来細胞である。
本明細書で使用する多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞及びプライム型多能性幹細胞を含む。ナイーブ型多能性幹細胞は着床前の内部細胞塊でみられる多能性に近い状態であり、プライム型多能性幹細胞は着床後のエピブラスト内でみられる多能性に近い状態と定義される。プライム型多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞と比較して、個体発生への寄与が低頻度であり、X染色体の転写活性が一本のみであり、転写抑制ヒストン修飾が高レベルであるといった特徴がある。また、プライム型多能性幹細胞におけるマーカー遺伝子はOTX2であり、プライム型多能性幹細胞のマーカー遺伝子はREX1、KLFファミリーである。さらに、プライム型多能性幹細胞のコロニー形成は扁平であり、ナイーブ型多能性幹細胞のコロニー形成はドーム状である。本明細書で使用する多能性幹細胞は、特にプライム型多能性幹細胞を用いることが好ましい。
本明細書で使用する多能性幹細胞は、市販の細胞又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製した細胞を用いてもよい。なお、限定はしないが、本明細書の各発明に用いる場合、多能性幹細胞は、iPS細胞又はES細胞が好ましい。
本明細書で使用するiPS細胞が市販品の場合、限定はしないが、例えば253G1株、253G4株、201B6株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、TkDN4-M株、TkDA3-1株、TkDA3-2株、TkDA3-4株、TkDA3-5株、TkDA3-9株、TkDA3-20株、hiPSC38-2株、MSC-iPSC1株、BJ-iPSC1株、RPChiPS771-2、WTC-11株、1231A3株、1383D2株、1383D6株、1210B2株、1201C1株、1205B2株等を使用することができる。
また、本明細書で使用するiPS細胞が新たに作製された細胞の場合、導入される初期化因子の遺伝子の組み合わせは、限定はしないが、例えばOCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、SOX2遺伝子及びc-Myc遺伝子の組み合わせ(Yu J,et al.2007,Science,318:1917-20.)、OCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子、LIN28遺伝子及びNanog遺伝子の組み合わせ(Takahashi K,et al.2007,Cell,131:861‐72.)を使用することができる。これらの遺伝子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成RNAの導入であってもよいしタンパク質として導入してもよい。また、microRNAやRNA、低分子化合物等を用いた方法で作製されたiPS細胞を用いてもよい。さらに、新たに作製された臨床グレードのiPS細胞を用いてもよい。
本明細書で使用するES細胞が市販品の場合、限定はしないが、例えばKhES-1株、KhEs-2株、KhEs-3株、KhEs-4株、KhEs-5株、SEES1株、SEES2株、SEES3株、SEES-4株、SEEs-5株、SEEs-6株、SEEs-7株、HUES8株、CyT49株、H1株、H9株、HS-181株等を使用することができる。
≪細胞凝集塊≫
本明細書において「細胞凝集塊」とは、浮遊培養において細胞凝集によって形成される塊状の細胞集団であって、スフェロイドとも呼ばれる。細胞凝集塊は、通常、略球状を呈する。細胞凝集塊を構成する細胞は、1種類以上の前記細胞であれば特に限定されない。例えば、ヒト多能性幹細胞又はヒト胚性幹細胞等の多能性幹細胞で構成された細胞凝集塊は、多能性幹細胞マーカーを発現している及び/又は多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞を含む。
本明細書において「細胞凝集塊」とは、浮遊培養において細胞凝集によって形成される塊状の細胞集団であって、スフェロイドとも呼ばれる。細胞凝集塊は、通常、略球状を呈する。細胞凝集塊を構成する細胞は、1種類以上の前記細胞であれば特に限定されない。例えば、ヒト多能性幹細胞又はヒト胚性幹細胞等の多能性幹細胞で構成された細胞凝集塊は、多能性幹細胞マーカーを発現している及び/又は多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞を含む。
多能性幹細胞マーカーは、多能性幹細胞で特異的に又は過剰に発現している遺伝子マーカーで、例えば、Alkaline Phosphatase、Nanog、OCT4、SOX2、TRA-1-60、c-Myc、KLF4、LIN28、SSEA-4、SSEA-1等が例示できる。
多能性幹細胞マーカーは、当該技術分野において任意の検出方法により検出することができる。細胞マーカーを検出する方法としては、限定はしないが、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーにおいて、検出試薬として蛍光標識抗体を用いる場合、ネガティブコントロール(アイソタイプコントロール)と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出されたときに、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。フローサイトメトリーによって解析した蛍光標識抗体について陽性を呈する細胞の比率は、「陽性率」と記載されることがある。また、蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)、フィコエリスリン(PE)、アロフィコシアニン(APC)等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞凝集塊を構成する細胞が多能性幹細胞である場合、多能性幹細胞マーカーの陽性率は、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは91%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは94%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、より好ましくは100%以下とすることができる。多能性幹細胞マーカーを発現する及び/又は多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合が前記範囲内である細胞凝集塊は、未分化性が高く、より均質な細胞集団である。
≪培養及び培地≫
「浮遊培養」とは、細胞培養方法の一つで、培地中で細胞を浮遊状態で増殖させることをいう。本明細書において「浮遊状態」とは、培養容器等の外部マトリクスに対して細胞が非接着の状態をいう。「浮遊培養法」は、細胞を浮遊培養する方法であって、この方法での細胞は、培養液中で凝集した細胞塊で存在する。浮遊培養法に対する他の培養方法として、接着培養法がある。「接着培養法」は、細胞を接着培養する方法である。「接着培養」とは、細胞を培養容器等の外部マトリクス等に接着させて、原則単層で増殖させることをいう。なお、前述の接着性細胞は、通常、接着培養のみならず、浮遊培養での培養も可能である。
「浮遊培養」とは、細胞培養方法の一つで、培地中で細胞を浮遊状態で増殖させることをいう。本明細書において「浮遊状態」とは、培養容器等の外部マトリクスに対して細胞が非接着の状態をいう。「浮遊培養法」は、細胞を浮遊培養する方法であって、この方法での細胞は、培養液中で凝集した細胞塊で存在する。浮遊培養法に対する他の培養方法として、接着培養法がある。「接着培養法」は、細胞を接着培養する方法である。「接着培養」とは、細胞を培養容器等の外部マトリクス等に接着させて、原則単層で増殖させることをいう。なお、前述の接着性細胞は、通常、接着培養のみならず、浮遊培養での培養も可能である。
本明細書において「培地」とは、細胞を培養するために調製された液状又は固形状の物質をいう。原則として、細胞の増殖及び/又は維持に不可欠の成分を必要最小限以上含有する。本明細書の培地は、特に断りがない限り、動物由来細胞の培養に使用する動物細胞用の液体培地が該当する。
本明細書において「基礎培地」とは、様々な動物細胞用培地の基礎となる培地をいう。単体でも培養は可能であり、また様々な培養添加物を加えて、目的に応じた各種細胞に特異的な培地に調製することもできる。本明細書で使用する基礎培地としては、BME培地、BGJb培地、CMRL1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地(Iscove’S Modified Dulbecco’S Medium)、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地(Dulbecco’S Modified Eagle’S Medium)、ハムF10培地、ハムF12培地、RPMI 1640培地、Fischer’S培地、及びこれらの混合培地(例えば、DMEM/F12培地(Dulbecco’S Modified Eagle’S Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham))等の培地を使用することができるが、特に限定されない。DMEM/F12培地としては特に、DMEM培地とハムF12培地の重量比を好ましくは60/40以上40/60以下の範囲、例えば58/42、55/45、52/48、50/50、48/52、45/55、又は42/58等で混合した培地を用いる。その他、ヒトiPS細胞やヒトES細胞の培養に使用されている培地も好適に使用することができる。
本発明で用いる培地は、好ましくは血清を含まない培地、すなわち無血清培地である。
本発明で用いる培地は、好ましくは血清を含まない培地、すなわち無血清培地である。
本明細書において「培養添加物」とは、培養目的で培地に添加される血清以外の物質である。培養添加物の具体例として、限定はしないが、L-アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、炭酸水素ナトリウム、増殖因子、脂肪酸又は脂質、アミノ酸(例えば、非必須アミノ酸)、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生剤等が挙げられる。インスリン、トランスフェリン、及びサイトカインは、動物(好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ等)の組織又は血清等から分離した天然由来のものであってもよいし、遺伝子工学的に作製した組換えタンパク質であってもよい。また、増殖因子は、限定するものではないが、例えば、FGF2(Basic fibroblast growth factor-2)、TGF-β1(Transforming growth factor-β1)、Activin A、IGF-1、MCP-1、IL-6、PAI、PEDF、IGFBP-2、LIF及びIGFBP-7を使用することができる。抗生剤は、限定するものではないが、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンB等を使用することができる。本発明で用いる培地の培養添加物として、特に好ましい増殖因子は、FGF2及び/又はTGF-β1である。
また、培地には、ROCK阻害剤を含有することが好ましい。ROCK阻害剤としては、Y-27632が挙げられる。ROCK阻害剤を培地に含有することで、多能性幹細胞の浮遊培養における細胞死を大幅に抑制することができる。
さらに、培地としては、プライム型多能性幹細胞を培養対象とする場合、LIFを含まない組成とすることが好ましい。さらに、プライム型多能性幹細胞を培養対象とする場合、GSK3阻害剤及びMEK/ERK阻害剤のいずれか一方、好ましくは両方を含まない培地組成とすることが好ましい。これらLIF、GSK3阻害剤、及びMEK/ERK阻害剤を含まない培地であれば、プライム型多能性幹細胞をナイーブ化することなく、且つ未分化状態を維持して培養することができる。
本発明で用いる培地は、前記培養添加物を1種以上含むことができる。前記培養添加物を添加する培地としては、限定はしないが、前記基礎培地が一般的である。
培養添加物は、溶液、誘導体、塩又は混合試薬等の形態で培地に添加することができる。例えば、L-アスコルビン酸は、2-リン酸アスコルビン酸マグネシウム等の誘導体の形態で培地に添加してもよく、セレンは亜セレン酸塩(亜セレン酸ナトリウム等)の形態で培地に添加してもよい。また、インスリン、トランスフェリン、及びセレンに関しては、ITS試薬(インスリン-トランスフェリン-セレン)の形態で培地に添加することもできる。また、L-アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも1つが添加された市販の培地を使用することもできる。インスリン及びトランスフェリンを添加した市販の培地としては、CHO-S-SFM II(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)、Hybridoma-SFM(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)、eRDF Dry Powdered Media(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)、UltraCULTURETM(BioWhittaker社)、UltraDOMATM(BioWhittaker社)、UltraCHOTM(BioWhittaker社)、UltraMDCKTM(BioWhittaker社)、STEMPRO(登録商標)hESC SFM(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)、Essential8TM(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)、StemFit(登録商標)AK02N(味の素社)、mTeSR1(Veritas社)、及びTeSR2(Veritas社)等が挙げられる。
なお、本発明で用いる培地として最も好ましいものは、L-アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも1つの増殖因子を含む無血清培地である。特に好ましくは、L-アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも1つの増殖因子(好ましくはFGF2及びTGF-β1)を含み、血清を含まないDMEM/F12培地である。
≪PKCβ阻害剤≫
本明細書において「プロテインキナーゼCβ(PKCβ)阻害剤」とは、PKCβの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。プロテインキナーゼは、C末端側の触媒領域及びN末端側の調節領域を有している。触媒領域は、基質タンパク質上のリン酸化残基を認識する配列と、ATP/Mg2+結合する配列とから構成される。調節領域はC1とC2ドメインから構成される。
本明細書において「プロテインキナーゼCβ(PKCβ)阻害剤」とは、PKCβの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。プロテインキナーゼは、C末端側の触媒領域及びN末端側の調節領域を有している。触媒領域は、基質タンパク質上のリン酸化残基を認識する配列と、ATP/Mg2+結合する配列とから構成される。調節領域はC1とC2ドメインから構成される。
PKCには、在来型(Conventional)アイソザイムとしてPKCα、PKCβI、PKCβII及びPKCγがある。なお、PKCには、新型(Novel)アイソザイムとしてPKCδ、PKCε、PKCθ及びPKCηがあり、非典型(Atypical)アイソザイムとしてPKCζ、PKCλ及びPKCμがある。
本明細書において、PKCβという場合、これらPKCβI及びPKCβIIの両者を含む意味若しくはPKCβI及びPKCβIIのうち一方を意味する。また、本明細書においてPKCβ阻害剤という場合、これら従来型、新型及び非典型アイソザイムのうち、少なくともPKCβI及び/又はPKCβIIを阻害する物質を意味する。すなわち、PKCβ阻害剤は、PKCβIの活性のみを阻害又は抑制する物質、PKCβIIの活性のみを阻害又は抑制する物質、及びPKCβI及びPKCβIIの活性を阻害又は抑制する物質を含む意味である。
なお、PKCβ阻害剤は、PKCβの活性のみを特異的に阻害又は抑制する物質でもよいが、PKCβI又はPKCβII以外に他のアイソザイムの活性を阻害又は抑制する物質であってもよい。例えば、PKCβ阻害剤は、PKCβI及びPKCβIIを含む、前述した全ての従来型、新型及び非典型アイソザイムの活性を阻害又は抑制する物質でもよい。また、PKCβ阻害剤は、PKCβI及びPKCβIIの他に従来型アイソザイムであるPKCα及びPKCγの活性を阻害又は抑制する物質であっても良い。さらに、PKCβ阻害剤は、PKCβI及びPKCβIIの他に新型アイソザイムであるPKCδ、PKCε、PKCθ及びPKCηの活性を阻害又は抑制する物質であっても良い。
PKCβ阻害剤は、PKCβに対して直接又は間接的に作用する化合物、PKCβをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸(例えば、siRNA)、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。
一例として、PKCβ阻害剤は、下記構造式[式I]を有する化合物を挙げることができる。
式Iにおいて、
R1は水素原子または炭素数1~3のアルコキシ基(好ましくはメトキシ基)であり、 R2は、水素原子、炭素数1~3のアルキル基(好ましくはメチル基)、又は、-N(RA)2により置換された炭素数1~3のアルキル基(好ましくは-(CH2)3-N(CH3)2)であり、
RAは独立にエチル基又はメチル基(好ましくはメチル基)であり、
R3は、
又は
RBは、水素原子、-S-C(=NH)(-NH2)により置換された炭素数2~4のアルキル基(好ましくは-(CH2)3-S-C(=NH)(-NH2))、又は
或いは、R2とRBとが一体となって下記の二価基
前記二価基に含まれる不斉炭素の立体配置は特に限定されないが、好ましくは、
RCは、-N(RD)2により置換された炭素数1~3のアルキル基(好ましくは-(CH2)-N(CH3)2)であり、
RDは独立にエチル基又はメチル基(好ましくはメチル基)である。
式Iで表される化合物の塩としては塩酸塩又は硫酸塩が例示できる。
上記構造式[式I]を有するPKCβ阻害剤としては、具体的に、Go6983、GF109203X、LY-333531、Enzastaurin、Sotrastaurin、Ro-31-8220-mesylate、Ro-32-0432-hydrochloride、Go6976、Rottlerin、Midostaurin、Daphnetin、Dequalinium Chloride、Baicalein、Quercetin、Luteolin、Bisindolylmaleimide II、Calphostin C、Chelerythrine chloride、L-threo Dihydrosphingosine及びMelittinからなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。特に、上記構造式を有するPKCβ阻害剤の中でも、Go6983、GF109203X及びLY-333531からなる群から選ばれる化合物を使用することが好ましい。
上記構造式[式I]を有するPKCβ阻害剤としては、具体的に、Go6983、GF109203X、LY-333531、Enzastaurin、Sotrastaurin、Ro-31-8220-mesylate、Ro-32-0432-hydrochloride、Go6976、Rottlerin、Midostaurin、Daphnetin、Dequalinium Chloride、Baicalein、Quercetin、Luteolin、Bisindolylmaleimide II、Calphostin C、Chelerythrine chloride、L-threo Dihydrosphingosine及びMelittinからなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。特に、上記構造式を有するPKCβ阻害剤の中でも、Go6983、GF109203X及びLY-333531からなる群から選ばれる化合物を使用することが好ましい。
Go6983(3-[1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-5-メトキシ-1H-インドール-3-イル]-4-(1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン)の構造式を下記に示す。
GF109203X(2-[1-(3-ジメチルアミノプロピル)インドール-3-イル]-3-(インドール-3-イル)マレイミド)の構造式を下記に示す。
LY-333531((9S)-[(ジメチルアミノ)メチル]-6,7,10,11-テトラヒドロ-9H,18H-5,21:12,17-ジメテノジベンゾ [e,k]ピロロ[3,4-h][1,4,13]オキサジアザシクロヘキサデシン-18,20(19H)-ジオン、モノヒドロキシクロライド)の構造式を下記に示す。
Enzastaurin(3-(1-メチルインドール-3-イル)-4-[1-[1-(ピリジン-2-イルメチル)ピペリジン-4-イル]インドール-3-イル]ピロール-2,5-ジオン)の構造式を下記に示す。
Sotrastaurin(3-(1H-インドール-3-イル)-4-(2-(4-メチルピペラジン-1-イル)キナゾリン-4-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン)の構造式を下記に示す。
Ro-31-8220-mesylate(3-[3-[2,5-ジヒドロ-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-2,5-ジオキソ-1H-ピロール-3-yl]-1H-インドール-1-イル]プロピルカルバムイミドチオ酸エステルメシラート)の構造式を下記に示す。
Ro-32-0432-hydrochloride(3-[(8S)-8-[(ジメチルアミノ)メチル]-6,7,8,9-テトラヒドロピリド [1,2-a]インドール-10-イル]-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン 塩酸塩)の構造式を下記に示す。
≪TNKS阻害剤≫
本明細書において「タンキレース(TNKS)阻害剤」とは、タンキレースの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。タンキレース(タンキラーゼと称する場合もある)は、標的タンパク質をポリ(ADP-リボシル)化するポリ(ADP-リボシル)化酵素(PARP)ファミリーに属し、タンキレース1(tankyrase-1/PARP-5a)及びタンキレース2(tankyrase-2/PARP-5b)が知られている。タンキレースについては、テロメア蛋白質TRF1をポリ(ADP-リボシル)化し、これをテロメアから遊離させることにより、テロメラーゼによるテロメア伸長を促進する機能が知られている。
本明細書において「タンキレース(TNKS)阻害剤」とは、タンキレースの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。タンキレース(タンキラーゼと称する場合もある)は、標的タンパク質をポリ(ADP-リボシル)化するポリ(ADP-リボシル)化酵素(PARP)ファミリーに属し、タンキレース1(tankyrase-1/PARP-5a)及びタンキレース2(tankyrase-2/PARP-5b)が知られている。タンキレースについては、テロメア蛋白質TRF1をポリ(ADP-リボシル)化し、これをテロメアから遊離させることにより、テロメラーゼによるテロメア伸長を促進する機能が知られている。
本明細書において、TNKSという場合、これらタンキレース1及びタンキレース2の両者を含む意味若しくはタンキレース1及びタンキレース2のうち一方を意味する。また、本明細書においてTNKS阻害剤という場合、タンキレース1及び/又はタンキレース2を阻害する物質を意味する。すなわち、TNKS阻害剤は、タンキレース1の活性のみを阻害又は抑制する物質、タンキレース2の活性のみを阻害又は抑制する物質及びタンキレース1並びにタンキレース2の活性を阻害又は抑制する物質を含む意味である。
TNKS阻害剤は、TNKSに対して直接又は間接的に作用する化合物、TNKSをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸(例えば、siRNA)、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。
一例として、TNKS阻害剤としては、IWR-1-endo、XAV939、G007-LK、G244-LM、MSC2504877及びWIKI4からなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。特に、TNKS阻害剤の中でも、IWR-1-endo及び/又はXAV939を使用することが好ましい。
IWR-1-endo(4-(1,3,3a,4,7,7a-ヘキサヒドロ-1,3-ジオキソ-4,7-メタノ-2H-イソインドール-2-イル)-N-8-キノリニル-ベンズアミド)の構造式を下記に示す。
XAV939(3,5,7,8-テトラヒドロ-2-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-4H-チオピラノ[4,3-d]ピリミジン-4-オン)の構造式を下記に示す。
G007-LK(4-[5-[(1E)-2-[4-(2-クロロフェニル)-5-[5-(メチルスルフォニル)-2-ピリジニル]-4H-1,2,4-チアゾル-3-イル]エテニル]-1,3,4-オキサジアゾ-ル-2-イル]-ベンゾニトリル)の構造式を下記に示す。
G244-LM(3,5,7,8-テトラヒドロ-2-[4-[2-(メチルスルフォニル)フェニル]-1-ピペラジニル]-4H-チオピラノ[4,3-d]ピリミジン-4-オン)の構造式を下記に示す。
WIKI4(2-[3-[[4-(4-メトキシフェニル)-5-(4-ピリジニル)-4H-1,2,4-チアゾル-3-イル]チオ]プロピル]-1H-ベンゾ[デ]イソキノリン-1,3(2H)-ジオン)の構造式を下記に示す。
1-3.構成
本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤は、上記1-2.で定義したPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を有効成分として含む。
本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤は、上記1-2.で定義したPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を有効成分として含む。
ここで、多能性幹細胞分化抑制剤においてPKCβ阻害剤は、1種、又は異なる2種以上の組み合わせであってもよい。
PKCβ阻害剤の濃度の下限は、特に限定されず、多能性幹細胞に対する分化抑制作用を有する範囲に応じて決定することができる。
例えば、PKCβ阻害剤は、液体培地中の終濃度として25nM以上とすることができ、30nM以上とすることができ、50nM以上とすることができ、80nM以上とすることができ、100nM以上とすることができ、150nM以上とすることができ、200nM以上とすることができ、500nM以上とすることができ、700nM以上とすることができ、1μM以上とすることができ、3μM以上とすることができ、5μM以上とすることができ、10μM以上とすることができる。
PKCβ阻害剤の濃度の上限は、特に限定されず、多能性幹細胞に対する分化抑制作用を有する範囲やPKCβ阻害剤の溶解度等に応じて決定することができる。
例えば、PKCβ阻害剤は、液体培地中の終濃度として15μM以下とすることができ、10μM以下とすることができ、5μM以下とすることができ、3μM以下とすることができ、1μM以下とすることができ、700nM以下とすることができ、500nM以下とすることができ、200nM以下とすることができ、150nM以下とすることができ、100nM以下とすることができ、80nM以下とすることができ、50nM以下とすることができ、30nM以下とすることができる。
なお、多能性幹細胞分化抑制剤が組成物の場合、当該組成物中のPKCβ阻害剤の濃度は、培地に添加されたときに上記範囲となるように決めることができる。例えば、当該組成物を2倍希釈して使用する場合、当該組成物中のPKCβ阻害剤の下限は、50nM以上とすることができ、60nM以上とすることができ、100nM以上とすることができ、160nM以上とすることができ、200nM以上とすることができ、300nM以上とすることができ、400nM以上とすることができ、1μM以上とすることができ、1.4μM以上とすることができ、2μM以上とすることができ、6μM以上とすることができ、10μM以上とすることができ、20μM以上とすることができる。
なお、当該組成物中のPKCβ阻害剤の上限は、特に限定されず、PKCβ阻害剤の溶解度とすることができる。具体的には、当該組成物中のPKCβ阻害剤の上限を200mMとすることができる。
一方、多能性幹細胞分化抑制剤においてTNKS阻害剤は、1種、又は異なる2種以上の組み合わせであってもよい。
TNKS阻害剤の濃度の下限は、特に限定されず、多能性幹細胞に対する分化抑制作用を有する範囲に応じて決定することができる。
例えば、TNKS阻害剤は、液体培地中の終濃度として90nM以上とすることができ、100nM以上とすることができ、150nM以上とすることができ、200nM以上とすることができ、300nM以上とすることができ、400nM以上とすることができ、500nM以上とすることができ、600nM以上とすることができ、700nM以上とすることができ、800nM以上とすることができ、900nM以上とすることができ、1μM以上とすることができ、1.5μM以上とすることができ、3μM以上とすることができ、5μM以上とすることができ、10μM以上とすることができ、15μM以上とすることができ、30μM以上とすることができ、35μM以上とすることができる。
TNKS阻害剤の濃度の上限は、特に限定されず、多能性幹細胞に対する分化抑制作用を有する範囲やTNKS阻害剤の溶解度等に応じて決定することができる。
例えば、TNKS阻害剤は、液体培地中の終濃度として40μM以下とすることができ、35μM以下とすることができ、30μM以下とすることができ、15μM以下とすることができ、10μM以下とすることができ、5μM以下とすることができ、3μM以下とすることができ、1.5μM以下とすることができ、1μM以下とすることができ、900nM以下とすることができ、800nM以下とすることができ、700nM以下とすることができ、600nM以下とすることができ、500nM以下とすることができ、400nM以下とすることができ、300nM以下とすることができ、200nM以下とすることができ、150nM以下とすることができ、100nM以下とすることができる。
なお、多能性幹細胞分化抑制剤が組成物の場合、当該組成物中のTNKS阻害剤の濃度は、培地に添加されたときに上記範囲となるように決めることができる。例えば、当該組成物を2倍希釈して使用する場合、当該組成物中のTNKS阻害剤の下限は、180nM以上とすることができ、200nM以上とすることができ、300nM以上とすることができ、400nM以上とすることができ、600nM以上とすることができ、800nM以上とすることができ、1μM以上とすることができ、1.2μM以上とすることができ、1.4μM以上とすることができ、1.6μM以上とすることができ、1.8μM以上とすることができ、2μM以上とすることができ、3μM以上とすることができ、6μM以上とすることができ、10μM以上とすることができ、20μM以上とすることができ、30μM以上とすることができ、60μM以上とすることができ、70μM以上とすることができる。
なお、当該組成物中のTNKS阻害剤の上限は、特に限定されず、TNKS阻害剤の溶解度とすることができる。具体的には、当該組成物中のTNKS阻害剤の上限を113mMとすることができる。
また、液体培地中のPKCβ阻害剤とTNKS阻害剤の含有濃度の比率の下限は、特に限定されないが、例えば167:1以上、111:1以上、56:1以上、33:1以上、11:1以上、7.8:1以上、5.6:1以上、2.2:1以上、1.7:1以上、又は1.1:1以上とすることができる。液体培地中のPKCβ阻害剤とTNKS阻害剤の含有濃度の比率の上限は、特に限定されないが、例えば、1:1600以下、1:1400以下、1:1200以下、1:600以下、1:400以下、1:200以下、1:120以下、1:60以下、1:40以下、1:36以下、1:32以下、1:28以下、1:24以下、1:20以下、1:16以下、1:12以下、1:8以下、1:6以下、又は1:4以下とすることができる。液体培地中のPKCβ阻害剤とTNKS阻害剤の含有濃度の比率は、特に限定されないが、例えば167:1以上1:1600以下の範囲とすることができる。また、液体培地中のPKCβ阻害剤とTNKS阻害剤の含有濃度の比率は、111:1以上1:1600以下の範囲とすることができ、56:1以上1:1600以下の範囲とすることができ、33:1以上1:1600以下の範囲とすることができ、11:1以上1:1600以下の範囲とすることができ、7.8:1以上1:1600以下の範囲とすることができ、5.6:1以上1:1600以下の範囲とすることができ、2.2:1以上1:1600以下の範囲とすることができ、1.7:1以上1:1600以下の範囲とすることができ、1.1:1以上1:1600以下の範囲とすることができる。さらに液体培地中のPKCβ阻害剤とTNKS阻害剤の含有濃度の比率は、167:1以上1:1400以下の範囲とすることができ、167:1以上1:1200以下の範囲とすることができ、167:1以上1:600以下の範囲とすることができ、167:1以上1:400以下の範囲とすることができ、167:1以上1:200以下の範囲とすることができ、167:1以上1:120以下の範囲とすることができ、167:1以上1:60以下の範囲とすることができ、167:1以上1:40以下の範囲とすることができ、167:1以上1:36以下の範囲とすることができ、167:1以上1:32以下の範囲とすることができ、167:1以上1:28以下の範囲とすることができ、167:1以上1:24以下の範囲とすることができ、167:1以上1:20以下の範囲とすることができ、167:1以上1:16以下の範囲とすることができ、167:1以上1:12以下の範囲とすることができ、167:1以上1:8以下の範囲とすることができ、167:1以上1:6以下の範囲とすることができ、167:1以上1:4以下の範囲とすることができる。
一方、多能性幹細胞分化抑制剤が組成物の場合、有効成分であるPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤と組み合わされる他の成分として、担体が挙げられる。担体には、溶媒及び/又は賦形剤が含まれる。
溶媒としては、例えば、水、バッファ(PBSを含む)、生食、有機溶媒(DMSO、DMF、キシレン、低級アルコール)等が挙げられる。
賦形剤としては、抗生剤、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤等を挙げることができる。抗生剤は、特に限定されないが、例えばペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンB等を使用することができる。緩衝剤としては、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。増粘剤としては、ゼラチン、多糖類などが挙げられる。着色剤としては、フェノールレッドなどが挙げられる。安定化剤としては、アルブミン、デキストラン、メチルセルロース、ゼラチンなどが挙げられる。界面活性剤としては、コレステロール、アルキルグリコシド、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、グルコシド、マルトシド、ネオペンチルグリコール系、ポリオキシエチレングリコール系、チオグルコシド、チオマルトシド、ペプチド、サポニン、リン脂質、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ジエタノールアミドなどが挙げられる。乳化剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどが挙げられる。防腐剤としては、アミノエチルスルホン酸、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、カンテン、dl-カンフル、クエン酸、クエン酸ナトリウム、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸フェニル、ジブチルヒドロキシトルエン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、窒素、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、2-ナフトール、白糖、ハチミツ、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、l-メントール、ユーカリ油などが挙げられる。保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グリセリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、D-ソルビトール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、プロピレングリコール、リン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、クエン酸、クエン酸誘導体、ビタミンC及びその誘導体、リコペン、ビタミンA、カロテノイド類、ビタミンB及びその誘導体、フラボノイド類、ポリフェノール類、グルタチオン、セレン、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンE及びその誘導体、αリポ酸及びその誘導体、ピクノジェノール、フラバンジェノール、スーパーオキサイドディスムターゼ(SOD)、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、グルタチオン還元酵素、カタラーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、及びこれらの混合物などが挙げられる。
また、多能性幹細胞分化抑制剤は、1種以上の増殖因子を含有してもよい。増殖因子には、例えば、FGF2及びTGF-β1が挙げられる。
多能性幹細胞分化抑制剤の形態は、液剤、又は固形剤(顆粒剤、散剤、粉剤を含む)のいずれであってもよい。多能性幹細胞分化抑制剤の適用形態は特に限定されない。例えば、浮遊培養に用いる培地の形態であってもよいし、浮遊培養用の培地の調製時に配合される添加物の形態であってもよい。
1-4.効果
本発明の多能性幹細胞分化抑制剤によれば、浮遊培養系において多能性幹細胞の未分化状態を維持し、細胞凝集塊を形成させることができる。それによって、大量の多能性幹細胞を効率的に生産することが可能となる。
2.多能性幹細胞集団の製造方法
本発明の多能性幹細胞分化抑制剤によれば、浮遊培養系において多能性幹細胞の未分化状態を維持し、細胞凝集塊を形成させることができる。それによって、大量の多能性幹細胞を効率的に生産することが可能となる。
2.多能性幹細胞集団の製造方法
2-1.概要
本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法は、プロテインキナーゼCβ(PKCβ)阻害剤及びタンキレース(TNKS)阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む。本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法によれば、PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤が存在することで、多能性幹細胞における未分化状態を維持し、浮遊培養によって多能性幹細胞集団を容易に製造することができる。
本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法は、プロテインキナーゼCβ(PKCβ)阻害剤及びタンキレース(TNKS)阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む。本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法によれば、PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤が存在することで、多能性幹細胞における未分化状態を維持し、浮遊培養によって多能性幹細胞集団を容易に製造することができる。
2-2.方法
本態様の方法は、浮遊培養工程を必須の工程として、また、維持培養工程並びに回収工程を選択工程として含む。以下、それぞれの工程について、説明をする。
本態様の方法は、浮遊培養工程を必須の工程として、また、維持培養工程並びに回収工程を選択工程として含む。以下、それぞれの工程について、説明をする。
2-2-1.維持培養工程
「維持培養工程」は、浮遊培養工程前の細胞集団、又は浮遊培養工程後、若しくはその後の回収工程後に得られる細胞凝集塊を、未分化状態を維持した状態で細胞を増殖させるために培養する工程である。維持培養は、当該分野で既知の動物細胞培養法を利用することができる。例えば、細胞を容器、担体等培養基材に接着させながら培養する接着培養であってもよいし、浮遊培養であってもよい。
「維持培養工程」は、浮遊培養工程前の細胞集団、又は浮遊培養工程後、若しくはその後の回収工程後に得られる細胞凝集塊を、未分化状態を維持した状態で細胞を増殖させるために培養する工程である。維持培養は、当該分野で既知の動物細胞培養法を利用することができる。例えば、細胞を容器、担体等培養基材に接着させながら培養する接着培養であってもよいし、浮遊培養であってもよい。
以下、限定はしないが、本工程をはじめ、後述する浮遊培養工程で用いる動物細胞培養法について例示し、説明をする。
(細胞)
本工程で使用する細胞は、浮遊培養において細胞凝集が可能な細胞である。前述の「1-2.用語の定義」における「培養及び培地」の項で記載したように、動物細胞が好ましく、ヒト細胞はより好ましい。また、細胞の種類は、多能性幹細胞であり、iPS細胞やES細胞のような多能性幹細胞は特に好ましい。
本工程で使用する細胞は、浮遊培養において細胞凝集が可能な細胞である。前述の「1-2.用語の定義」における「培養及び培地」の項で記載したように、動物細胞が好ましく、ヒト細胞はより好ましい。また、細胞の種類は、多能性幹細胞であり、iPS細胞やES細胞のような多能性幹細胞は特に好ましい。
(培養容器)
培養に用いる培養容器は、容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、NunclonTM Sphera(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)を培養容器として使用できる。
培養に用いる培養容器は、容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、NunclonTM Sphera(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)を培養容器として使用できる。
培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。
使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積の下限が、0.32cm2以上、0.65cm2以上、1.9cm2以上、3.0cm2以上、3.5cm2以上、9.0cm2以上、又は9.6cm2以上で、上限が、1000cm2以下、500cm2以下、300cm2以下、150cm2以下、75cm2以下、55cm2以下、25cm2以下、21cm2以下、9.6cm2以下、又は3.5cm2以下であることが好ましい。
(培地)
培地や培養液の量は、使用する培養容器によって適宜調整すればよい。例えば12ウェルプレート(平面視でのウェル底面の面積が1ウェルあたり3.5cm2)を使用する場合は、1ウェルあたりの量を0.5mL以上、1.5mL以下、好ましくは約1.3mLとすることができる。また、6ウェルプレート(平面視でのウェル底面の面積が1ウェルあたり9.6cm2)を使用する場合には、1ウェルあたりの量を下限は1.5mL以上、2mL以上、又は3mL以上とすることができ、また上限は6.0mL以下、5mL以下、4mL以下とすることができる。さらに、125mL三角フラスコ(容量が125mLの三角フラスコ)を使用する場合は、容器当たりの量を下限は10mL以上、15mL以上、20mL以上、25mL以上、又は30mL以上とすることができ、また上限は50mL以下、45mL以下、又は40mL以下とすることができる。また、容量が500mLの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は100mL以上、105mL以上、110mL以上、115mL以上、又は120mL以上とすることができ、また上限は150mL以下、145mL以下、140mL以下、135mL以下、130mL以下、又は125mL以下とすることができる。さらに、容量が1000mLの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は250mL以上、260mL以上、270mL以上、280mL以上、又は290mL以上とすることができ、また上限は350mL以下、340mL以下、330mL以下、320mL以下、又は310mL以下とすることができる。さらに、例えば容量が2Lのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、1バッグ当たりの量を下限は100mL以上、200mL以上、300mL以上、400mL以上、500mL以上、600mL以上、700mL以上、800mL以上、900mL以上、又は1000mL以上とすることができ、上限は2000mL以下、1900mL以下、1800mL以下、1700mL以下、1600mL以下、1500mL以下、1400mL以下、1300mL以下、1200mL以下、又は1100mL以下とすることができる。また、容量が10Lのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、1バッグ当たりの量を下限は500mL以上、1L以上、2L以上、3L以上、4L以上、又は5L以上とすることができ、上限は10L以下、9L以下、8L以下、7L以下、又は6L以下とすることができる。
培地や培養液の量は、使用する培養容器によって適宜調整すればよい。例えば12ウェルプレート(平面視でのウェル底面の面積が1ウェルあたり3.5cm2)を使用する場合は、1ウェルあたりの量を0.5mL以上、1.5mL以下、好ましくは約1.3mLとすることができる。また、6ウェルプレート(平面視でのウェル底面の面積が1ウェルあたり9.6cm2)を使用する場合には、1ウェルあたりの量を下限は1.5mL以上、2mL以上、又は3mL以上とすることができ、また上限は6.0mL以下、5mL以下、4mL以下とすることができる。さらに、125mL三角フラスコ(容量が125mLの三角フラスコ)を使用する場合は、容器当たりの量を下限は10mL以上、15mL以上、20mL以上、25mL以上、又は30mL以上とすることができ、また上限は50mL以下、45mL以下、又は40mL以下とすることができる。また、容量が500mLの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は100mL以上、105mL以上、110mL以上、115mL以上、又は120mL以上とすることができ、また上限は150mL以下、145mL以下、140mL以下、135mL以下、130mL以下、又は125mL以下とすることができる。さらに、容量が1000mLの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は250mL以上、260mL以上、270mL以上、280mL以上、又は290mL以上とすることができ、また上限は350mL以下、340mL以下、330mL以下、320mL以下、又は310mL以下とすることができる。さらに、例えば容量が2Lのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、1バッグ当たりの量を下限は100mL以上、200mL以上、300mL以上、400mL以上、500mL以上、600mL以上、700mL以上、800mL以上、900mL以上、又は1000mL以上とすることができ、上限は2000mL以下、1900mL以下、1800mL以下、1700mL以下、1600mL以下、1500mL以下、1400mL以下、1300mL以下、1200mL以下、又は1100mL以下とすることができる。また、容量が10Lのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、1バッグ当たりの量を下限は500mL以上、1L以上、2L以上、3L以上、4L以上、又は5L以上とすることができ、上限は10L以下、9L以下、8L以下、7L以下、又は6L以下とすることができる。
(播種密度)
浮遊培養に際して、新たな培地に播種する細胞の密度(播種密度)は、培養時間や培養後の細胞状態、培養後に必要な細胞数を勘案して適宜調整することができる。限定はしないが、通常、下限は0.01×105 cells/mL以上、0.1×105cells/mL以上、1×105 cells/mL以上、又は2×105cells/mL以上、そして、上限は20×105cells/mL以下、又は10×105 cells/mL以下の範囲にあればよい。
浮遊培養に際して、新たな培地に播種する細胞の密度(播種密度)は、培養時間や培養後の細胞状態、培養後に必要な細胞数を勘案して適宜調整することができる。限定はしないが、通常、下限は0.01×105 cells/mL以上、0.1×105cells/mL以上、1×105 cells/mL以上、又は2×105cells/mL以上、そして、上限は20×105cells/mL以下、又は10×105 cells/mL以下の範囲にあればよい。
(培養条件)
培養温度、時間、CO2濃度等の培養条件は特に限定しない。当該分野における常法の範囲で行えばよい。例えば培養温度は下限が20℃以上、又は35℃以上、そして上限が45℃以下、又は40℃以下であればよいが、好ましくは37℃である。また、培養時間は下限が0.5時間以上又は6時間以上、そして上限が7日間以下、120時間以下、96時間以下、72時間以下、又は48時間以下の範囲にあればよい。培養時のCO2濃度は、下限が4%以上、又は4.5%以上、そして上限が10%以下、又は5.5%以下であればよいが、好ましくは5%である。また、適当な頻度で培地交換を行うことができる。培地交換の頻度は培養する細胞種によって異なるが、例えば、5日に1回以上、4日に1回以上、3日に1回以上、2日に1回以上、1日に1回以上、又は1日に2回以上で行えばよいがそれらに限定されない。培地交換は、回収工程と同様の方法で細胞を回収した後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度培養すればよい。なお、培地交換の頻度や方法等については、上記の頻度や方法には限定されず、適宜最適な方法を採用すればよい。
培養温度、時間、CO2濃度等の培養条件は特に限定しない。当該分野における常法の範囲で行えばよい。例えば培養温度は下限が20℃以上、又は35℃以上、そして上限が45℃以下、又は40℃以下であればよいが、好ましくは37℃である。また、培養時間は下限が0.5時間以上又は6時間以上、そして上限が7日間以下、120時間以下、96時間以下、72時間以下、又は48時間以下の範囲にあればよい。培養時のCO2濃度は、下限が4%以上、又は4.5%以上、そして上限が10%以下、又は5.5%以下であればよいが、好ましくは5%である。また、適当な頻度で培地交換を行うことができる。培地交換の頻度は培養する細胞種によって異なるが、例えば、5日に1回以上、4日に1回以上、3日に1回以上、2日に1回以上、1日に1回以上、又は1日に2回以上で行えばよいがそれらに限定されない。培地交換は、回収工程と同様の方法で細胞を回収した後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度培養すればよい。なお、培地交換の頻度や方法等については、上記の頻度や方法には限定されず、適宜最適な方法を採用すればよい。
また、培養終了のタイミング及び培地交換のタイミングは、例えば、培地中の乳酸濃度に基づいて決定することもできる。乳酸は、培養中に細胞により産生され、培地中に蓄積される。細胞が産生した乳酸或いは元から培地中に含まれていた乳酸は、細胞にダメージを与え、その結果、多能性幹細胞の未分化性維持を阻害し、増殖、特に継代後の細胞増殖能を低下させるなどの悪影響を与えることが知られている。そこで、培地中の乳酸濃度に基づいて培養終了のタイミング及び/又は培地交換のタイミングを決定することで、乳酸による未分化性維持の阻害作用、乳酸による細胞増殖能の低下作用を回避することができる。
特に、プロテインキナーゼCβ(PKCβ)阻害剤及びタンキレース(TNKS)阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する場合、乳酸による上記作用を低減することができる。換言すると、プロテインキナーゼCβ(PKCβ)阻害剤及びタンキレース(TNKS)阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する場合、通常の細胞培養よりも高濃度の乳酸であっても未分化性を維持できるか、細胞増殖能を維持することができる。具体的には、培地中の乳酸濃度が5mM以上に達しても、好適に培養を行うことができる。また培地中の乳酸濃度が7mM以上に達しても、9mM以上に達しても、10mM以上に達しても、11mM以上に達しても、12mM以上に達しても、好適に培養を行うことができる。
一方、培地中の乳酸濃度は15mM以下までとすることが好ましい。特に、培地中の乳酸濃度は、14mM以下、13mM以下、12mM以下、10mM以下とすることが好ましい。培地中の乳酸濃度がこの範囲であれば、培地pHの著しい低下を抑制でき、細胞に対する上記作用を回避することができる。
以上のように、プロテインキナーゼCβ(PKCβ)阻害剤及びタンキレース(TNKS)阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する場合、培養終了のタイミング及び培地交換のタイミングを、培地中の乳酸濃度が例えば15mMに達するまで、14mM以下に達するまで、13mM以下に達するまで、12mM以下に達するまで、10mM以下に達するまでとすることができる。なお、他の実施形態としては、培養終了のタイミング及び培地交換のタイミングを、培地中の乳酸濃度がこの範囲よりも低い時点とすることもできる。
(培養方法)
培養中の培地の流動状態は問わない。静置培養でもよいし、流動培養でもよいが、好ましくは流動培養である。
培養中の培地の流動状態は問わない。静置培養でもよいし、流動培養でもよいが、好ましくは流動培養である。
「静置培養」とは、培養容器内で培地を静置した状態で培養することをいう。接着培養では、通常、この静置培養が採用される。
「流動培養」とは、培地を流動させる条件下で培養することをいう。流動培養の場合、細胞の凝集を促進するように培地を流動させる方法が好ましい。そのような培養方法として、例えば、旋回培養法、揺動培養法、撹拌培養、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
「旋回培養法」(振盪培養法を含む)とは、旋回流による応力(遠心力、求心力)により細胞が一点に集まるように培地が流動する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に沿って円、楕円、扁平した円、扁平した楕円等の閉じた軌道を描くように旋回させることにより行う。
旋回速度は特に限定されないが、下限は1rpm以上、10rpm以上、50rpm以上、60rpm以上、70rpm以上、80rpm以上、83rpm以上、85rpm以上、又は90rpm以上とすることができる。一方、上限は200rpm以下、150rpm以下、120rpm以下、115rpm以下、110rpm以下、105rpm以下、100rpm以下、95rpm以下、又は90rpm以下とすることができる。旋回培養に使用するシェーカーの振幅は特に限定されないが、下限は、例えば1mm以上、10mm以上、20mm以上、又は25mm以上とすることができる。一方、上限は、例えば200mm以下、100mm以下、50mm以下、30mm以下、又は25mm以下とすることができる。旋回培養の際の回転半径も特に限定されないが、好ましくは振幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は例えば5mm以上又は10mm以上であり、上限は例えば100mm以下又は50mm以下とすることができる。特に、後述する細胞凝集塊の製造方法等では、旋回条件を前記範囲にすることで、適切なサイズの細胞凝集塊を製造することが容易となるため好ましい。
「揺動培養法」とは、揺動(ロッキング)撹拌のような直線的な往復運動により培地に揺動流を付与する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば1往復を1回とした場合、下限は1分間に2回以上、4回以上、6回以上、8回以上、又は10回以上、一方、上限は1分間に15回以下、20回以下、25回以下、又は50回以下で揺動すればよい。揺動の際、垂直面に対して若干の角度、すなわち誘導角度を培養容器につけることが好ましい。揺動角度は特に限定されないが、例えば、下限は0.1°以上、2°以上、4°以上、6°以上、又は8°以上、一方、上限は20°以下、18°以下、15°以下、12°以下又は10°以下とすることができる。後述する細胞凝集塊の製造方法等では、揺動条件を前記範囲とすることで、適切なサイズの細胞凝集塊を製造することが容易となるため好ましい。
さらに、上記旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。
「撹拌培養法」とは、培養容器は静置させたままでスターラ―バーや撹拌翼のような撹拌手段を用いて容器内の培地を撹拌する条件で培養する方法をいう。例えば、撹拌翼の付いたスピナーフラスコ状の培養容器を用いることで撹拌培養を達成し得る。そのような培養容器は市販されており、それらを利用することもできる。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、細胞培養組成物の量として、メーカー推奨の量を好適に使用することができる。撹拌手段による撹拌速度は特に限定されないが、下限は1rpm以上、10rpm以上、30rpm以上、50rpm以上、又は70rpm以上、90rpm以上、110rpm以上、130rpm以上とすることができる。一方、上限は200rpm以下、又は150rpm以下とすることができる。
また、「撹拌培養法」においては、培養中の細胞にかかる剪断応力を制御することが好ましい。多能性幹細胞を含む動物細胞は、一般的に、他の細胞と比較して物理的ストレスに弱い場合が多い。そのため、攪拌培養に際して細胞に負荷される剪断応力が大きすぎると、細胞が物理的なダメージを受け、増殖能が低下したり、多能性幹細胞であれば未分化性を維持できなくなったりする場合がある。
攪拌培養において細胞に負荷される剪断応力は、限定されないが、例えば翼先端速度に依存する。翼先端速度とは、攪拌翼先端部の周速であり、翼径[m]×円周率×回転数[rps]=翼先端速度[m/s]として求めることができる。なお、翼径が、攪拌翼の先端形状により複数求められる場合には、最も大きな距離とすることができる。
特に、プロテインキナーゼCβ(PKCβ)阻害剤及びタンキレース(TNKS)阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する場合、負荷される剪断応力に上記作用を低減することができる。換言すると、プロテインキナーゼCβ(PKCβ)阻害剤及びタンキレース(TNKS)阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する場合、通常の細胞培養よりも高い剪断応力が負荷される条件であっても未分化性を維持できるか、細胞増殖能を維持することができる。具体的には、翼先端速度が0.23m/s以上といった非常に大きな値であっても、多能性幹細胞の未分化性を維持しながら攪拌培養することができる。
また、翼先端速度は、0.05m/s以上とすることが好ましく、0.08m/s以上とすることが好ましく、0.10m/s以上とすることが好ましく、0.13m/s以上とすることが好ましく、0.17m/s以上とすることが好ましく、0.20m/s以上とすることが好ましく、0.23m/s以上とすることが好ましく、0.25m/s以上とすることが好ましく、0.30m/s以上とすることが好ましい。翼先端速度をこの範囲とすることで、多能性幹細胞の未分化を維持しながら、細胞同士の過凝集を抑制することができる。
さらに、翼先端速度は、1.37m/s以下とすることが好ましく、1.00m/s以下とすることが好ましく、0.84m/s以下とすることが好ましく、0.50m/s以下とすることが好ましく、0.42m/s以下とすることが好ましく、0.34m/s以下とすることが好ましく0.30m/s以下とすることが好ましい。翼先端速度をこの範囲とすることで、多能性幹細胞の未分化を維持しながら、培養系内の培地流動状態を安定化することができる。
本工程で細胞の数をどこまで増やすか、また細胞の状態をどこに合わせるかについては、培養する細胞の種類、細胞凝集の目的、培地の種類や培養条件に応じて適宜定めればよい。
本態様の浮遊培養方法により製造される個々の細胞凝集塊のサイズは、特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最大幅のサイズの下限が30μm以上、40μm以上、50μm以上、60μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上、又は100μm以上であればよい。一方、その上限は1000μm以下、900μm以下、800μm以下、700μm以下、600μm以下、500μm以下、400μm以下、又は300μm以下であればよい。この範囲の細胞凝集塊は、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。
本態様の浮遊培養方法により製造される細胞凝集塊の集団のうち、重量基準で下限が30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、又は100%が上記のサイズ範囲内の細胞凝集塊であることが好ましい。
本態様の浮遊培養方法により製造される細胞凝集塊の集団は、該集団を構成する細胞のうち生細胞の割合(生存率)が、例えば50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上であることが好ましい。上記の範囲の生存率の細胞凝集塊は、凝集状態を維持しやすく、細胞の増殖に好ましい状態である。
(工程後処理)
本工程後は、常法により培養液と細胞を分離し、細胞を回収する。この時、細胞は、剥離又は分散処理によって単一の細胞として回収することが好ましい。具体的な方法については、後述の回収工程で詳述する。回収した細胞は、そのまま、又は必要に応じてバッファ(PBSバッファを含む)、生食、又は培地(次の工程で使用する培地か基礎培地が好ましい)で洗浄後、次の工程に供すればよい。
本工程後は、常法により培養液と細胞を分離し、細胞を回収する。この時、細胞は、剥離又は分散処理によって単一の細胞として回収することが好ましい。具体的な方法については、後述の回収工程で詳述する。回収した細胞は、そのまま、又は必要に応じてバッファ(PBSバッファを含む)、生食、又は培地(次の工程で使用する培地か基礎培地が好ましい)で洗浄後、次の工程に供すればよい。
2-2-2.浮遊培養工程
「浮遊培養工程」は、上述した多能性幹細胞分化抑制剤又はその有効成分であるPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程である。
「浮遊培養工程」は、上述した多能性幹細胞分化抑制剤又はその有効成分であるPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程である。
本工程での細胞培養方法は、基本的に前述の「2-2-1.維持培養工程」に記載の培養方法に準ずる。したがって、ここでは維持培養工程に既述の方法と共通する説明については省略し、本工程に特徴的な点についてのみ詳述する。
(細胞)
本工程で使用する細胞は、限定はしないが、維持培養工程後に調製された細胞が好ましい。細胞の種類も、維持培養工程に記載のように、多能性幹細胞であり、iPS細胞やES細胞のような多能性幹細胞は特に好ましい。また培地に播種する際の細胞の状態は、単一細胞の状態であることが好ましい。 また、本工程で使用する多能性幹細胞は、一つの細胞でも良いし、複数細胞からなる細胞集団(多能性幹細胞集団)でもよい。前記多能性幹細胞が多能性幹細胞集団の場合、前記集団において多能性幹細胞マーカー(例えばOCT4、SOX2、Nanog)を発現する及び/または多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合(比率)は、例えば90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、100%以下である。
本工程で使用する細胞は、限定はしないが、維持培養工程後に調製された細胞が好ましい。細胞の種類も、維持培養工程に記載のように、多能性幹細胞であり、iPS細胞やES細胞のような多能性幹細胞は特に好ましい。また培地に播種する際の細胞の状態は、単一細胞の状態であることが好ましい。 また、本工程で使用する多能性幹細胞は、一つの細胞でも良いし、複数細胞からなる細胞集団(多能性幹細胞集団)でもよい。前記多能性幹細胞が多能性幹細胞集団の場合、前記集団において多能性幹細胞マーカー(例えばOCT4、SOX2、Nanog)を発現する及び/または多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合(比率)は、例えば90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、100%以下である。
(培地)
本工程は、PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む培地で培養することに特徴があり、この点において、維持培養工程で使用する培地と相違する。培地の種類は、PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含み、かつ細胞を増殖及び/又は維持できる培地であれば、限定はしない。
本工程は、PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む培地で培養することに特徴があり、この点において、維持培養工程で使用する培地と相違する。培地の種類は、PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含み、かつ細胞を増殖及び/又は維持できる培地であれば、限定はしない。
本工程で培地中に含まれるPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤の濃度は、上記1-3.構成の欄に記載した通りとする。本工程開始時における培地中のPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤の濃度が前記範囲内にあればPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤の添加方法については特に限定はしない。例えば、培地に1種以上のPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を総量で前記濃度範囲となるように直接投与して調製してもよい。
(培養方法)
本工程では、浮遊培養を行う。したがって、培養方法は、培地を流動する流動培養が好ましい。PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む培地で多能性幹細胞を浮遊培養することによって、多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。
本工程では、浮遊培養を行う。したがって、培養方法は、培地を流動する流動培養が好ましい。PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む培地で多能性幹細胞を浮遊培養することによって、多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。
本工程では、培養途中の多能性幹細胞の一部を取り出し、未分化状態を維持しているか確認することができる。例えば、培養中に取り出した多能性幹細胞に発現する多能性幹細胞マーカーの発現を測定することで、未分化状態を維持しているか確認することができる。多能性幹細胞マーカーとしては、上述したように、例えば、Alkaline Phosphatase、Nanog、OCT4、SOX2、TRA-1-60、c-Myc、KLF4、LIN28、SSEA-4、SSEA-1等が例示できる。これら多能性幹細胞マーカーの検出方法も、上述したように、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。
培養中に取り出した多能性幹細胞のなかで多能性幹細胞マーカーの陽性率が、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは91%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは94%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、より好ましくは100%以下の場合、未分化を維持していると判断することができる。
また、本工程において、培養途中で取り出した多能性幹細胞における三胚葉マーカー(内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー)の発現を測定することで、未分化状態を維持しているか確認することができる。すなわち、これら内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカーの陽性率がいずれも、好ましくは20%以下、より好ましくは10%以下、より好ましくは9%以下、より好ましくは8%以下、より好ましくは7%以下、より好ましくは6%以下、より好ましくは5%以下、より好ましくは4%以下、より好ましくは3%以下、より好ましくは2%以下、より好ましくは1%以下、より好ましくは検出限界以下の場合、未分化を維持していると判断することができる。
内胚葉系細胞マーカーとは、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、SOX17、FOXA2、CXCR4、AFP、GATA4、EOMES等を挙げることができる。なお内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路(膀胱、尿道の大部分、尿管の一部)などへと分化する。
中胚葉系細胞マーカーとは、中胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、T(BRACHYURY)、MESP1、MESP2、FOXF1、HAND1、EVX1、IRX3、CDX2、TBX6、MIXL1、ISL1、SNAI2、FOXC1及びPDGFRα等を挙げることができる。なお中胚葉系細胞は、体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管(血管内皮も含む)、血液(血液細胞も含む)、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺(精巣、子宮、性腺上皮)などへと分化する。
外胚葉系細胞マーカーとは、外胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、FGF5、NESTIN、SOX1、PAX6等を挙げることができる。なお外胚葉系細胞は、皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺(乳腺、汗腺を含む)、感覚器(口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺)水晶体、末梢神経系などを形成する。また、外胚葉の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。
これら三胚葉マーカー(内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー)の発現は、当該技術分野において任意の検出方法により測定することができる。三胚葉マーカー(内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー)の発現を測定する方法としては、限定はしないが、例えば定量的リアルタイムPCR解析、RNA-Seq法、ノーザンハイブリダイゼーション又はDNAアレイを利用したハイブリダイゼーション法等が挙げられる。定量的リアルタイムPCR解析においては、測定対象のマーカー遺伝子の発現量を内部標準遺伝子の発現量に対する相対発現量に換算し、当該相対発現量に基づいてマーカー遺伝子の発現量を評価できる。内部標準遺伝子としては、例えば、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)遺伝子やβ-アクチン(ACTB)遺伝子を挙げることができる。
2-2-3.回収工程
「回収工程」は、維持培養工程又は浮遊培養工程後の培養液から培養した細胞を回収する工程で、本発明の方法における選択工程である。
「回収工程」は、維持培養工程又は浮遊培養工程後の培養液から培養した細胞を回収する工程で、本発明の方法における選択工程である。
本明細書において「(細胞の)回収」とは、培養液と細胞とを分離して細胞を取得することをいう。細胞の回収方法は、当該分野の細胞培養法で使用される常法に従えばよく、特に限定はしない。
浮遊培養の工程の後、細胞は培養液中に浮遊した状態で存在する。したがって、細胞の回収は、静置状態又は遠心分離により上清の液体成分を除去することで達成できる。また、濾過フィルターや中空糸分離膜等を用いて回収することもできる。静置状態で液体成分を除去する場合、培養液の入った容器を静置状態5分程度置き、沈降した細胞や細胞凝集塊を残して上清を除去すればよい。また遠心分離は、遠心力によって細胞がダメージを受けない遠心加速度と処理時間で行えばよい。例えば、遠心加速度の下限は、細胞を沈降できれば特に限定はされないが、例えば100×g以上、300×g以上、800×g以上、又は1000×g以上であればよい。一方、上限は細胞が遠心力によるダメージを受けない、又は受けにくい速度であればよく、例えば1400×g以下、1500×g以下、又は1600×g以下であればよい。また処理時間の下限は、上記遠心加速度により細胞を沈降できる時間であれば特に限定はされないが、例えば30秒以上、1分以上、3分以上、又は5分以上であればよい。また、上限は、上記遠心加速度により細胞がダメージを受けない、又は受けにくい時間であればよく、例えば10分以下、8分以下、6分以下、又は30秒以下であればよい。フィルトレーションで液体成分を除去する場合、例えば、不織布やメッシュフィルターに培養液を通して濾液を除去し、残った細胞凝集塊を回収すればよい。また、中空糸分離膜で液体成分を除去する場合、例えば、細胞濃縮洗浄システム(カネカ社)のような中空糸分離膜を備えた装置を用いて培養液と細胞を分離し、回収すればよい。
回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法は、限定しない。例えば前述の維持培養工程における「工程後処理」に記載の洗浄方法と同様に行えばよい。洗浄液には、バッファ(PBSバッファを含む)、生食、又は培地(基礎培地が好ましい)を使用すればよい。
(単一細胞化)
本明細書において「単一細胞化」とは、単層細胞片や細胞凝集塊等のように複数の細胞が互いに接着又は凝集した細胞集合体を分散させて、単一の遊離した細胞状態にすることをいう。
本明細書において「単一細胞化」とは、単層細胞片や細胞凝集塊等のように複数の細胞が互いに接着又は凝集した細胞集合体を分散させて、単一の遊離した細胞状態にすることをいう。
単一細胞化は、剥離剤及び/又はキレート剤を使用する。剥離剤は限定しないが、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼの他、市販のAccutase(商標登録)、Accumax(商標登録)、TrypLETM Express Enzyme(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)、TrypLETM Select Enzyme(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)、ディスパーゼ(商標登録)等を利用することができる。例えば、単一細胞化にトリプシンを使用する場合、溶液中の濃度の下限は、細胞集合体を分散できる濃度であれば特に限定はされないが、例えば0.15体積%以上、0.18体積%以上、0.20体積%以上、又は0.24体積%以上であればよい。一方、溶液中の濃度の上限は、細胞そのものが溶解される等の影響を受けない濃度であれば特に限定はされないが、0.30体積%以下、0.28体積%以下、又は0.25体積%以下であればよい。また処理時間は、トリプシンの濃度によって左右されるものの、その下限は、トリプシンの作用によって細胞集合体が十分に分散される時間であれば特に限定はされず、例えば5分以上、8分以上、10分以上、12分以上、又は15分以上であればよい。一方、処理時間の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない時間であれば特に限定はされず、例えば30分以下、28分以下、25分以下、22分以下、20分以下、又は18分以下であればよい。なお、市販の剥離剤を使用する場合には、添付のプロトコルに記載の、細胞を分散させて単一状態にできる濃度で使用すればよい。前記剥離剤及び/又はキレート剤による処理後に物理的に軽く処理することで、単一細胞化を促進できる。この物理的処理は限定しないが、例えば、細胞を溶液ごと複数回ピペッティングする方法が挙げられる。さらに、必要に応じて、細胞をストレーナーやメッシュに通過させてもよい。
単一細胞化した細胞は、静置又は遠心分離により剥離剤を含む上清を除去して回収することができる。回収した細胞は、必要に応じて洗浄してもよい。遠心分離の条件や洗浄方法については上記と同様に行えばよい。
3.細胞凝集塊製造方法及びその方法で得られる細胞凝集塊
3-1.概要
上述した「2.多能性幹細胞集団の製造方法」を適用することで、生産物として細胞凝集塊を得ることができる。本製造方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。
3-1.概要
上述した「2.多能性幹細胞集団の製造方法」を適用することで、生産物として細胞凝集塊を得ることができる。本製造方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。
3-2.細胞凝集塊製造方法
本態様の細胞凝集塊製造方法における基本工程は、上述した「2.多能性幹細胞集団の製造方法」に準ずる。すなわち、必須の工程として浮遊培養工程を、また選択工程として維持培養工程、及び回収工程を含む。各工程の説明は、前述の通りである。
本態様の細胞凝集塊製造方法における基本工程は、上述した「2.多能性幹細胞集団の製造方法」に準ずる。すなわち、必須の工程として浮遊培養工程を、また選択工程として維持培養工程、及び回収工程を含む。各工程の説明は、前述の通りである。
3-3.細胞凝集塊
本態様の細胞凝集塊製造方法により、未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。
本態様の細胞凝集塊製造方法により、未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。
本態様の細胞凝集塊製造方法により製造される個々の細胞凝集塊のサイズは、特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最大幅のサイズの下限が30μm以上、40μm以上、50μm以上、60μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上、又は100μm以上であればよい。一方、その上限は1000μm以下、900μm以下、800μm以下、700μm以下、600μm以下、500μm以下、400μm以下、300μm以下、又は200μm以下であればよい。因みにヒトiPS細胞1個が約10μmの寸法である。この範囲の細胞凝集塊は、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。
本態様の細胞凝集塊製造方法により製造される細胞凝集塊の集団のうち、重量基準で下限が10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、又は100%が上記のサイズ範囲内の細胞凝集塊であることが好ましい。上記のサイズ範囲内の細胞凝集塊を20%以上含む細胞凝集塊の集団では、個々の細胞凝集塊において、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。
本態様の細胞凝集塊製造方法により製造される細胞凝集塊の集団は、該集団を構成する細胞のうち生細胞の割合(生存率)が、例えば50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上であることが好ましい。上記の範囲の生存率の細胞凝集塊は、凝集状態を維持しやすく、細胞の増殖に好ましい状態である。
細胞凝集塊を構成する細胞が多能性幹細胞の場合、多能性幹細胞マーカーを発現している及び/又は多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合で細胞凝集塊を構成する多能性幹細胞の未分化性を判断してもよい。例えば、多能性幹細胞マーカーの陽性率は、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは91%以上、より好ましくは92%以上、より好ましくは93%以上、より好ましくは94%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、より好ましくは100%以下とすることができる。多能性幹細胞マーカーが前記陽性率の範囲内にある細胞凝集塊は、未分化状態を維持した多能性幹細胞集団から構成されており、より均質な細胞集団であるといえる。
なお、多能性幹細胞マーカーは、当該技術分野において任意の検出方法により検出することができる。細胞マーカーを検出する方法としては、限定はしないが、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーにおいて、検出試薬として蛍光標識抗体を用いる場合、ネガティブコントロール(アイソタイプコントロール)と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出されたときに、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。フローサイトメトリーによって解析した蛍光標識抗体について陽性を呈する細胞の比率は、「陽性率」と記載されることがある。また、蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)、フィコエリスリン(PE)、アロフィコシアニン(APC)等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において、細胞凝集塊を構成する細胞は、単一種、又は2種以上の細胞で構成されていてもよい。例えば、iPS細胞のみで構成される細胞凝集塊であってもよいし、iPS細胞とES細胞で構成された細胞凝集塊であってもよい。
3-4.効果
本態様の細胞凝集塊製造方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。
本態様の細胞凝集塊製造方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。
4.多能性幹細胞塊の製造方法
4-1.概要
上述した「2.多能性幹細胞集団の製造方法」を用いて、多能性幹細胞凝集塊を製造することができる。本製造方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。
4-1.概要
上述した「2.多能性幹細胞集団の製造方法」を用いて、多能性幹細胞凝集塊を製造することができる。本製造方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。
4-2.多能性幹細胞塊の製造方法
本態様の多能性幹細胞塊の製造方法における基本工程は、上述した「2.多能性幹細胞集団の製造方法」に準ずる。すなわち、必須の工程として、PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む培地で浮遊培養する工程(第一工程)を含み、また選択工程として、維持培養工程、及び回収工程を含む。各工程の説明は、原則として上述した「2.多能性幹細胞集団の製造方法」に記載の通りである。
本態様の多能性幹細胞塊の製造方法における基本工程は、上述した「2.多能性幹細胞集団の製造方法」に準ずる。すなわち、必須の工程として、PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む培地で浮遊培養する工程(第一工程)を含み、また選択工程として、維持培養工程、及び回収工程を含む。各工程の説明は、原則として上述した「2.多能性幹細胞集団の製造方法」に記載の通りである。
前述の第一工程の培養時間は、好ましくは0.5時間以上、より好ましくは12時間以上、好ましくは7日間以下、6日間以下、5日間以下、4日間以下、より好ましくは72時間以下、より好ましくは48時間以下、最も好ましくは24時間以下である。また、前述の維持培養工程の培養時間は、好ましくは0.5時間以上、より好ましくは12時間以上、24時間以上、48時間以上、好ましくは7日間以下、6日間以下、5日間以下、より好ましくは4日間以下、最も好ましくは72時間以下である。
第一工程中に、第一工程と維持培養工程の間に、及び/又は維持培養工程中に、適当な頻度で培地交換を行うことができる。特に、第一工程と維持培養工程との間において、培地交換を行う。培地交換の頻度は培養する細胞種によって異なるが、例えば、5日に1回以上、4日に1回以上、3日に1回以上、2日に1回以上、1日に1回以上、1日に2回以上で行えばよいがそれらに限定されない。なお、培地交換の頻度や方法等については、上記の頻度や方法には限定されず、適宜最適な方法を採用すればよい。
4-3.多能性幹細胞凝集塊
本態様の多能性幹細胞塊の製造方法によれば、適切なサイズの多能性幹細胞凝集塊を、多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ製造することができる。例えば、本態様の多能性幹細胞集団培養方法により得られた多能性幹細胞集団において、多能性幹細胞マーカー(例えばOCT4、SOX2、NANOG)を発現する及び/または多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合(比率)は、例えば90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、100%以下である。
本態様の多能性幹細胞塊の製造方法によれば、適切なサイズの多能性幹細胞凝集塊を、多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ製造することができる。例えば、本態様の多能性幹細胞集団培養方法により得られた多能性幹細胞集団において、多能性幹細胞マーカー(例えばOCT4、SOX2、NANOG)を発現する及び/または多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合(比率)は、例えば90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、100%以下である。
4-4.効果
本態様の細胞凝集塊製造方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。
本態様の細胞凝集塊製造方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。
5.浮遊培養用培地
5-1.概要
本態様は、細胞の浮遊培養用培地である。本態様の浮遊培養用培地を使用すれば、培地中で多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。
5-1.概要
本態様は、細胞の浮遊培養用培地である。本態様の浮遊培養用培地を使用すれば、培地中で多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。
5-2.構成
本態様の細胞の浮遊培養用培地は、上述した「1.多能性幹細胞分化抑制剤」に記載の分化抑制剤、又はその有効成分であるPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を少なくとも含み、浮遊培養における多能性幹細胞の未分化状態を維持するための細胞増殖用培地で構成される。
本態様の細胞の浮遊培養用培地は、上述した「1.多能性幹細胞分化抑制剤」に記載の分化抑制剤、又はその有効成分であるPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を少なくとも含み、浮遊培養における多能性幹細胞の未分化状態を維持するための細胞増殖用培地で構成される。
本態様の浮遊培養用培地の組成は、上述した「1.多能性幹細胞分化抑制剤」の「1-2.用語の定義」における「培養及び培地」の項に詳述している。
分化抑制剤、その有効成分であるPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤の構成、並びに分化抑制剤中の含有濃度については、上述した「1.多能性幹細胞分化抑制剤」の「1-3.構成」において詳述している。
浮遊培養用培地は、少なくとも細胞培養時は液体培地として使用されるが、保存用としては、例えば、粉末化され、調合された固体状態であってもよい。この場合、培地として使用する前に滅菌水等に溶解し、適当な濃度に希釈した後、使用すればよい。
また、浮遊培養用培地は、使用前まで凍結して保存し、使用時に解凍して使用することができる。
5-3.効果
本態様の浮遊培養用培地を用いて細胞を浮遊培養すれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。
本態様の浮遊培養用培地を用いて細胞を浮遊培養すれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。
6.多能性幹細胞分化抑制キット
6-1.概要
本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤を含むキットは、PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤からなる多能性幹細胞分化抑制剤を含む、多能性幹細胞の培養に使用されるキットである。本多能性幹細胞分化抑制キットを用いることで、多能性幹細胞の未分化状態を維持しながら浮遊培養により多能性幹細胞を増殖することができる。
6-1.概要
本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤を含むキットは、PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤からなる多能性幹細胞分化抑制剤を含む、多能性幹細胞の培養に使用されるキットである。本多能性幹細胞分化抑制キットを用いることで、多能性幹細胞の未分化状態を維持しながら浮遊培養により多能性幹細胞を増殖することができる。
6-2.構成
多能性幹細胞分化抑制キットは、必須の構成要素としてPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤からなる多能性幹細胞分化抑制剤を、また選択的構成要素として培地、及び/又はプロトコルを包含する。
多能性幹細胞分化抑制キットは、必須の構成要素としてPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤からなる多能性幹細胞分化抑制剤を、また選択的構成要素として培地、及び/又はプロトコルを包含する。
プロトコルには、本多能性幹細胞分化抑制キットの使用方法が記載されている。具体的には、多能性幹細胞分化抑制キットに含まれるPKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤の培地への添加量や、その他の成分に関する添加量、未分化を維持する好適な浮遊培養方法等が記載されている。
以下、実施例により、本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤、多能性幹細胞集団の製造方法を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
<参考例1:ヒトiPS細胞WTC-11株の接着培養>
iMatrix-511 Silk(ニッピ社)を0.25μg/cm2でコーティングした細胞培養用ディッシュに、ヒトiPS細胞WTC-11株(コリエルインスティチュート社)を播種し、37℃、5%CO2雰囲気下で接着培養を行った。培地はStemFit(登録商標)AK02N(味の素社)を使用し、毎日培地交換を行った。細胞播種時のみROCK阻害剤(Y-27632(富士フィルム和光純薬社))を最終濃度が10μMとなるように培地に添加した。
iMatrix-511 Silk(ニッピ社)を0.25μg/cm2でコーティングした細胞培養用ディッシュに、ヒトiPS細胞WTC-11株(コリエルインスティチュート社)を播種し、37℃、5%CO2雰囲気下で接着培養を行った。培地はStemFit(登録商標)AK02N(味の素社)を使用し、毎日培地交換を行った。細胞播種時のみROCK阻害剤(Y-27632(富士フィルム和光純薬社))を最終濃度が10μMとなるように培地に添加した。
<比較例1:ヒトiPS細胞WTC-11株の浮遊培養>
参考例1の手順で接着培養したヒトiPS細胞WTC-11株をDulbecco’s PBS(ナカライテスク社)で洗浄後、0.5 mM EDTA solution in Dulbecco’s PBS(ナカライテスク社)で5分間処理した。EDTA solutionを吸引した後、StemFit(登録商標)AK02N培地をディッシュに加え、セルスクレイパーによって細胞を剥離させた後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632(富士フィルム和光純薬社)を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり1×105個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用6ウェルプレート(住友ベークライト社)に1ウェルあたり4mLの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー(オプティマ社)上で90rpmの速度で水平面に沿って旋回幅(直径)が25mmの円を描くように旋回させ、37℃、5%CO2環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養0日目とし、培養5日目に継代を行い、培養10日目まで浮遊培養を行った。培養2、4、7、9日目に培地交換を行った。培地交換の方法としては、ウェルから培養上清だけを3 mL吸引除去した後、Y-27632を含まないStemFit(登録商標)AK02N培地3mLをウェルに添加した。培養5日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。Dulbecco’s PBS で洗浄後、細胞凝集塊にAccutaseを1mL添加して37℃で10分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり1×105個の細胞を含むように調製し、培養0日目と同様に細胞を播種して浮遊培養を継続した。培養10日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。細胞凝集塊の位相差画像を図1に示した。図1より、細胞凝集塊を形成したことが確認できた。
参考例1の手順で接着培養したヒトiPS細胞WTC-11株をDulbecco’s PBS(ナカライテスク社)で洗浄後、0.5 mM EDTA solution in Dulbecco’s PBS(ナカライテスク社)で5分間処理した。EDTA solutionを吸引した後、StemFit(登録商標)AK02N培地をディッシュに加え、セルスクレイパーによって細胞を剥離させた後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632(富士フィルム和光純薬社)を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり1×105個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用6ウェルプレート(住友ベークライト社)に1ウェルあたり4mLの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー(オプティマ社)上で90rpmの速度で水平面に沿って旋回幅(直径)が25mmの円を描くように旋回させ、37℃、5%CO2環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養0日目とし、培養5日目に継代を行い、培養10日目まで浮遊培養を行った。培養2、4、7、9日目に培地交換を行った。培地交換の方法としては、ウェルから培養上清だけを3 mL吸引除去した後、Y-27632を含まないStemFit(登録商標)AK02N培地3mLをウェルに添加した。培養5日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。Dulbecco’s PBS で洗浄後、細胞凝集塊にAccutaseを1mL添加して37℃で10分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり1×105個の細胞を含むように調製し、培養0日目と同様に細胞を播種して浮遊培養を継続した。培養10日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。細胞凝集塊の位相差画像を図1に示した。図1より、細胞凝集塊を形成したことが確認できた。
<比較例2:ヒトiPS細胞WTC-11株の浮遊培養へのTNKS阻害剤添加>
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地をTNKS阻害剤であるIWR-1-endo(富士フィルム和光純薬社)を最終濃度10μMで含むように調製した点を除いて、比較例1と同じ手順で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地をTNKS阻害剤であるIWR-1-endo(富士フィルム和光純薬社)を最終濃度10μMで含むように調製した点を除いて、比較例1と同じ手順で浮遊培養を実施した。
<比較例3:ヒトiPS細胞WTC-11株の浮遊培養へのPKCβ阻害剤添加>
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地をPKCβ阻害剤であるGo6983(富士フィルム和光純薬社)を最終濃度10μMで含むように調製した点を除いて、比較例1と同じ手順で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地をPKCβ阻害剤であるGo6983(富士フィルム和光純薬社)を最終濃度10μMで含むように調製した点を除いて、比較例1と同じ手順で浮遊培養を実施した。
<実施例1:ヒトiPS細胞WTC-11株の浮遊培養へのTNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤添加>
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地をIWR-1-endo及びGo6983をそれぞれ最終濃度10μMで含むように調製した点を除いて、比較例1と同じ手順で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地をIWR-1-endo及びGo6983をそれぞれ最終濃度10μMで含むように調製した点を除いて、比較例1と同じ手順で浮遊培養を実施した。
<実施例2:定量的リアルタイムPCR解析>
以下に示す手順で定量的リアルタイムPCR解析を行った。参考例1の培養5日目の細胞、及び比較例1、2、実施例1の培養10日目の細胞をDulbecco’s PBSで洗浄し、Monarch Total RNA Miniprep Kit(ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン社)を用いてtotal RNAを精製した。精製方法はキット付属の使用マニュアルに従った。微量分光光度計で1000ng分のtotal RNAを分取した。分取したRNAに対し、ReverTra Ace(登録商標)(東洋紡社)1μL、5x RT buffer(東洋紡社)4μL、10mM dNTPs Mixture(東洋紡社)2μL、RNase inhibitor(10units/μL)(東洋紡社)1μL、Random primer(25pmol/μL)(東洋紡社)1μL、RNase Free dH2Oを添加して20μLに調製し、SimpliAmp Thermal Cycler(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いてcDNA合成を行った。cDNA合成の反応条件は、30℃で10分反応後、42℃で60分反応、99℃で5分反応を連続して行い、4℃に冷却した。合成したcDNA溶液を滅菌水で5倍に希釈した。希釈したcDNA溶液を0.5μL/well、滅菌水を3.98μL/well、THUNDERBIRD(登録商標)Probe qPCR Mix(東洋紡社)を5μL/well、Taqman(商標登録) probeを0.5μL/well、50X ROX reference dye(東洋紡社)を0.02μL/wellをとなるように反応プレートに添加して混合した。TaqmanプローブはGAPDH、OCT4、T、SOX17、PAX6を用いた。TaqMan(商標登録) QuantStudio3 リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて定量的リアルタイムPCR解析を実施した。反応条件を表1に示す。
以下に示す手順で定量的リアルタイムPCR解析を行った。参考例1の培養5日目の細胞、及び比較例1、2、実施例1の培養10日目の細胞をDulbecco’s PBSで洗浄し、Monarch Total RNA Miniprep Kit(ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン社)を用いてtotal RNAを精製した。精製方法はキット付属の使用マニュアルに従った。微量分光光度計で1000ng分のtotal RNAを分取した。分取したRNAに対し、ReverTra Ace(登録商標)(東洋紡社)1μL、5x RT buffer(東洋紡社)4μL、10mM dNTPs Mixture(東洋紡社)2μL、RNase inhibitor(10units/μL)(東洋紡社)1μL、Random primer(25pmol/μL)(東洋紡社)1μL、RNase Free dH2Oを添加して20μLに調製し、SimpliAmp Thermal Cycler(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いてcDNA合成を行った。cDNA合成の反応条件は、30℃で10分反応後、42℃で60分反応、99℃で5分反応を連続して行い、4℃に冷却した。合成したcDNA溶液を滅菌水で5倍に希釈した。希釈したcDNA溶液を0.5μL/well、滅菌水を3.98μL/well、THUNDERBIRD(登録商標)Probe qPCR Mix(東洋紡社)を5μL/well、Taqman(商標登録) probeを0.5μL/well、50X ROX reference dye(東洋紡社)を0.02μL/wellをとなるように反応プレートに添加して混合した。TaqmanプローブはGAPDH、OCT4、T、SOX17、PAX6を用いた。TaqMan(商標登録) QuantStudio3 リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて定量的リアルタイムPCR解析を実施した。反応条件を表1に示す。
定量的リアルタイムPCR解析に使用したTaqman(商標登録) probeのAssay IDを以下に示した。
GAPDH:Hs02786624_g1
OCT4:Hs01088114_m1
T:Hs00610080_m1
SOX17:Hs00751752_s1
PAX6:Hs04260367_gH
遺伝子発現を測定した結果を表2及び図2に示した。
GAPDH:Hs02786624_g1
OCT4:Hs01088114_m1
T:Hs00610080_m1
SOX17:Hs00751752_s1
PAX6:Hs04260367_gH
遺伝子発現を測定した結果を表2及び図2に示した。
表2及び図2に示すように、接着培養を行った参考例1では、T(中胚葉マーカー遺伝子)、SOX17(内胚葉マーカー遺伝子)、及びPAX6(外胚葉マーカー遺伝子)の発現量が低く、多能性幹細胞の未分化状態が維持されていた。
一方、浮遊培養を行った比較例1では、T、SOX17、及びPAX6の発現量が参考例1と比較して増加した。このことから、浮遊培養においては、中胚葉、内胚葉及び外胚葉への自発的分化が起きており、多能性幹細胞の未分化状態を維持できていないことが示された。また、TNKS阻害剤を添加して浮遊培養を行った比較例2では、T及びSOX17の発現量については、参考例1と同程度まで抑制できたものの、PAX6発現量は参考例1よりも高かった。また、PKCβ阻害剤を添加して浮遊培養を行った比較例3では、PAX6発現量については、参考例1と同程度まで抑制できたものの、T及びSOX17の発現量は比較例1よりも高くなった。TNKS阻害剤とPKCβ阻害剤を両方添加した実施例1では、T、SOX17及びPAX6のいずれの発現量も参考例1と同程度であった。
上記結果から、TNKS阻害剤は、中胚葉及び内胚葉への自発的分化を効果的に抑制できるが、外胚葉分化に対する抑制効果は弱いことが示された。また、PKCβ阻害剤は、外胚葉への自発的分化は抑制できるものの、中胚葉及び内胚葉分化を促進してしまうことが示された。一方、TNKS阻害剤とPKCβ阻害剤の両方を添加して浮遊培養を行うと中胚葉、内胚葉及び外胚葉全てに対する自発的分化を抑制できることが明らかになった。
つまり、多能性幹細胞の中胚葉、内胚葉及び外胚葉への自発的分化を効果的に抑制し、多能性幹細胞の未分化状態を維持するためには、TNKS阻害剤とPKCβ阻害剤のいずれか片方を添加するだけでは不十分であり、TNKS阻害剤とPKCβ阻害剤の両方を添加することで初めて、中胚葉、内胚葉及び外胚葉の全てに対する自発的分化を抑制し、多能性幹細胞の未分化状態を維持できることが明らかになった。
<参考例2:ヒトiPS細胞201B7株の接着培養>
Vitronectin(VTN-N)Recombinant Human Protein,Truncated(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を0.5μg/cm2でコーティングした細胞培養用ディッシュに、ヒトiPS細胞201B7株(京都大学iPS細胞研究所)を播種し、37℃、5%CO2雰囲気下で接着培養を行った。培地はStemFit(登録商標)AK02N(味の素社)を使用し、毎日培地交換を行った。細胞播種時のみY-27632(富士フイルム和光純薬社)を最終濃度が10μMとなるように培地に添加した。
Vitronectin(VTN-N)Recombinant Human Protein,Truncated(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を0.5μg/cm2でコーティングした細胞培養用ディッシュに、ヒトiPS細胞201B7株(京都大学iPS細胞研究所)を播種し、37℃、5%CO2雰囲気下で接着培養を行った。培地はStemFit(登録商標)AK02N(味の素社)を使用し、毎日培地交換を行った。細胞播種時のみY-27632(富士フイルム和光純薬社)を最終濃度が10μMとなるように培地に添加した。
<比較例4:ヒトiPS細胞201B7株の浮遊培養>
参考例2と同じ手順で接着培養したヒトiPS細胞201B7株をAccutase(イノベーティブセルテクノロジー社)で5分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用6ウェルプレートに1ウェルあたり4mLの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で83rpmの速度で水平面に沿って旋回幅(直径)が25mmの円を描くように旋回させ、37℃、5%CO2環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養0日目とし、培養4日目に継代を行い、培養8日目まで浮遊培養を行った。培地交換は毎日行った。培地交換の方法としては、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、StemFit(登録商標)AK02N培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻した。培地交換時に、培養1日目及び5日目は培地にY-27632を最終濃度5μMとなるように添加し、培養2日目及び6日目は培地にY-27632を最終濃度2μMとなるように添加した。培養4日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。細胞凝集塊にAccutaseを1mL添加して37℃で10分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製し、培養0日目と同様に細胞を播種して浮遊培養を継続した。培養8日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。細胞凝集塊の位相差画像を図3に示した。図3より、細胞凝集塊を形成したことが確認できた。
参考例2と同じ手順で接着培養したヒトiPS細胞201B7株をAccutase(イノベーティブセルテクノロジー社)で5分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用6ウェルプレートに1ウェルあたり4mLの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で83rpmの速度で水平面に沿って旋回幅(直径)が25mmの円を描くように旋回させ、37℃、5%CO2環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養0日目とし、培養4日目に継代を行い、培養8日目まで浮遊培養を行った。培地交換は毎日行った。培地交換の方法としては、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、StemFit(登録商標)AK02N培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻した。培地交換時に、培養1日目及び5日目は培地にY-27632を最終濃度5μMとなるように添加し、培養2日目及び6日目は培地にY-27632を最終濃度2μMとなるように添加した。培養4日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。細胞凝集塊にAccutaseを1mL添加して37℃で10分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製し、培養0日目と同様に細胞を播種して浮遊培養を継続した。培養8日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。細胞凝集塊の位相差画像を図3に示した。図3より、細胞凝集塊を形成したことが確認できた。
<比較例5:ヒトiPS細胞201B7株の浮遊培養へのTNKS阻害剤及びPKC阻害剤添加>
PKCβ以外のPKCアイソザイムを阻害するPKC阻害剤に分化抑制効果があるかどうかを確認するために、以下の方法で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、表3に示す組み合わせでTNKS阻害剤とPKC阻害剤(PKCβ以外のPKCアイソザイムの活性を阻害する)を添加した点を除いて、比較例4と同じ手順で浮遊培養を実施した。
PKCβ以外のPKCアイソザイムを阻害するPKC阻害剤に分化抑制効果があるかどうかを確認するために、以下の方法で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、表3に示す組み合わせでTNKS阻害剤とPKC阻害剤(PKCβ以外のPKCアイソザイムの活性を阻害する)を添加した点を除いて、比較例4と同じ手順で浮遊培養を実施した。
<実施例3:ヒトiPS細胞201B7株の浮遊培養へのTNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤添加>
実施例1で使用したGo6983以外のPKCβ阻害剤を使用した場合にも、分化抑制効果があるかどうかを確認するために、以下の方法で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、表4に示す組み合わせでTNKS阻害剤とPKCβ阻害剤を添加した点を除いて、比較例4と同じ手順で浮遊培養を実施した。
実施例1で使用したGo6983以外のPKCβ阻害剤を使用した場合にも、分化抑制効果があるかどうかを確認するために、以下の方法で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、表4に示す組み合わせでTNKS阻害剤とPKCβ阻害剤を添加した点を除いて、比較例4と同じ手順で浮遊培養を実施した。
<実施例4:定量的リアルタイムPCR解析>
以下に示す手順で定量的リアルタイムPCR解析を行った。参考例2の培養4日目の細胞、及び比較例4、5、実施例3の培養8日目の細胞をTRIzolTM Reagent(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて溶解させた。PureLink(登録商標)RNA Miniキット(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて、TRIzolTM Reagentで溶解させた溶液からtotal RNAを単離及び精製した。精製したRNAをBioSpec-nano(島津製作所社)を用いて濃度測定し、500ng分取した。分取したRNAに対し、ReverTra Ace(登録商標)qPCR RT Master mix(東洋紡社)を2μLとRnase Free dH2Oを添加して10μLに調製し、SimpliAmp Thermal Cycler(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いてcDNA合成を行った。cDNA合成の反応条件は、37℃で15分反応後、50℃で5分反応、98℃で5分反応を連続して行い、4℃に冷却した。合成したcDNA溶液を10mM Tris-HCl pH8.0(ナカライテスク社)で100倍に希釈し、384well PCRプレート(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)に5μL/wellで添加した。KOD SYBR(登録商標)qPCR Mix(東洋紡社)、50μMに調製したForwardプライマー、50μMに調製したReverseプライマー、DEPC処理水(ナカライテスク社)を100:1:1:48の割合で混合し、この混合液を15μL/wellで前記384well PCRプレートに添加して混合した。プライマーはGAPDH、OCT4、T、SOX17、PAX6を用いた。384well PCRプレートを遠心分離してウェル内の気泡を除去し、QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて定量的リアルタイムPCR解析を実施した。反応条件を表5に示す。
以下に示す手順で定量的リアルタイムPCR解析を行った。参考例2の培養4日目の細胞、及び比較例4、5、実施例3の培養8日目の細胞をTRIzolTM Reagent(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて溶解させた。PureLink(登録商標)RNA Miniキット(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて、TRIzolTM Reagentで溶解させた溶液からtotal RNAを単離及び精製した。精製したRNAをBioSpec-nano(島津製作所社)を用いて濃度測定し、500ng分取した。分取したRNAに対し、ReverTra Ace(登録商標)qPCR RT Master mix(東洋紡社)を2μLとRnase Free dH2Oを添加して10μLに調製し、SimpliAmp Thermal Cycler(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いてcDNA合成を行った。cDNA合成の反応条件は、37℃で15分反応後、50℃で5分反応、98℃で5分反応を連続して行い、4℃に冷却した。合成したcDNA溶液を10mM Tris-HCl pH8.0(ナカライテスク社)で100倍に希釈し、384well PCRプレート(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)に5μL/wellで添加した。KOD SYBR(登録商標)qPCR Mix(東洋紡社)、50μMに調製したForwardプライマー、50μMに調製したReverseプライマー、DEPC処理水(ナカライテスク社)を100:1:1:48の割合で混合し、この混合液を15μL/wellで前記384well PCRプレートに添加して混合した。プライマーはGAPDH、OCT4、T、SOX17、PAX6を用いた。384well PCRプレートを遠心分離してウェル内の気泡を除去し、QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて定量的リアルタイムPCR解析を実施した。反応条件を表5に示す。
定量的リアルタイムPCR解析に使用したプライマーの塩基配列を以下に示した。
ACTB(Forward):5’-CCTCATGAAGATCCTCACCGA-3’(配列番号1)
ACTB(Reverse):5’-TTGCCAATGGTGATGACCTGG-3’(配列番号2)
OCT4(Forward):5’-AGTGGGTGGAGGAAGCTGACAAC-3’(配列番号3)
OCT4(Reverse):5’-TCGTTGTGCATAGTCGCTGCTTGA-3’(配列番号4)
SOX2(Forward):5’-CACCAATCCCATCCACACTCAC-3’(配列番号5)
SOX2(Reverse):5’-GCAAAGCTCCTACCGTACCAC-3’(配列番号6)
NANOG(Forward):5’-AGCCTCCAGCAGATGCAAGAACTC-3’(配列番号7)
NANOG(Reverse):5’-TTGCTCCACATTGGAAGGTTCCCA-3’(配列番号8)
T(Forward):5’-TCACAAAGAGATGATGGAGGAAC-3’(配列番号9)
T(Reverse):5’-ACATGCAGGTGAGTTGTCAG-3’(配列番号10)
SOX17(Forward):5’-ATCTGCACTTCGTGTGCAAG-3’(配列番号11)
SOX17(Reverse):5’-GAGTCTGAGGATTTCCTTAGCTC-3’(配列番号12)
PAX6(Forward):5’-AGGAATGGACTTGAAACAAGG-3’(配列番号13)
PAX6(Reverse):5’-GCAAAGCTTGTTGATCATGG-3’(配列番号14)
遺伝子発現を測定した結果を表6及び図4に示した。
ACTB(Forward):5’-CCTCATGAAGATCCTCACCGA-3’(配列番号1)
ACTB(Reverse):5’-TTGCCAATGGTGATGACCTGG-3’(配列番号2)
OCT4(Forward):5’-AGTGGGTGGAGGAAGCTGACAAC-3’(配列番号3)
OCT4(Reverse):5’-TCGTTGTGCATAGTCGCTGCTTGA-3’(配列番号4)
SOX2(Forward):5’-CACCAATCCCATCCACACTCAC-3’(配列番号5)
SOX2(Reverse):5’-GCAAAGCTCCTACCGTACCAC-3’(配列番号6)
NANOG(Forward):5’-AGCCTCCAGCAGATGCAAGAACTC-3’(配列番号7)
NANOG(Reverse):5’-TTGCTCCACATTGGAAGGTTCCCA-3’(配列番号8)
T(Forward):5’-TCACAAAGAGATGATGGAGGAAC-3’(配列番号9)
T(Reverse):5’-ACATGCAGGTGAGTTGTCAG-3’(配列番号10)
SOX17(Forward):5’-ATCTGCACTTCGTGTGCAAG-3’(配列番号11)
SOX17(Reverse):5’-GAGTCTGAGGATTTCCTTAGCTC-3’(配列番号12)
PAX6(Forward):5’-AGGAATGGACTTGAAACAAGG-3’(配列番号13)
PAX6(Reverse):5’-GCAAAGCTTGTTGATCATGG-3’(配列番号14)
遺伝子発現を測定した結果を表6及び図4に示した。
表6及び図4に示したように、浮遊培養を行った比較例4では、接着培養(参考例2)と比較してPAX6の発現量が増加しており、外胚葉への自発的分化が起きていることが示された。TNKS阻害剤及びPKC阻害剤(PKCβ以外のPKCアイソザイムの活性を阻害する)を添加した比較例5-1から5-4は、PAX6発現量が比較例4と同程度であった。TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を添加した実施例3-1から3-3は、PAX6の発現量が比較例4よりも低く、参考例2と同程度であった。
比較例5-1から5-4で添加した4種類のPKC阻害剤は、いずれもPKCβの阻害効果はない。一方、実施例3で添加したLY-333531はPKCβの選択的阻害剤であり、Go6983及びGF109203XはPKCβを含む複数のPKCアイソザイムの活性を阻害する広域阻害剤である。これらのことから、外胚葉への自発的分化抑制にはPKCβの阻害が効果的であり、PKCβ阻害剤は、多能性幹細胞の外胚葉への分化抑制剤として有用であることが明らかとなった。
<参考例3:フローサイトメトリー解析用細胞の調製>
接着培養した細胞集団の未分化性をフローサイトメトリー解析するため、参考例2と同じ手順で4日間培養を行い、細胞を調製した。
接着培養した細胞集団の未分化性をフローサイトメトリー解析するため、参考例2と同じ手順で4日間培養を行い、細胞を調製した。
<比較例6:フローサイトメトリー解析用細胞の調製>
浮遊培養した細胞集団の未分化性をフローサイトメトリー解析するため、比較例4と同じ手順で8日間培養を行い、細胞を調製した。
浮遊培養した細胞集団の未分化性をフローサイトメトリー解析するため、比較例4と同じ手順で8日間培養を行い、細胞を調製した。
<比較例7:フローサイトメトリー解析用細胞の調製>
TNKS阻害剤及びPKC阻害剤(PKCβ以外のPKCアイソザイムの活性を阻害する)を添加して浮遊培養した細胞集団の未分化性をフローサイトメトリー解析するため、比較例5と同じ手順で8日間培養を行い、細胞を調製した。使用したTNKS阻害剤とPKC阻害剤(PKCβ以外のPKCアイソザイムの活性を阻害する)の組み合わせを表7に示す。
TNKS阻害剤及びPKC阻害剤(PKCβ以外のPKCアイソザイムの活性を阻害する)を添加して浮遊培養した細胞集団の未分化性をフローサイトメトリー解析するため、比較例5と同じ手順で8日間培養を行い、細胞を調製した。使用したTNKS阻害剤とPKC阻害剤(PKCβ以外のPKCアイソザイムの活性を阻害する)の組み合わせを表7に示す。
<実施例5:フローサイトメトリー解析用細胞の調製>
TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を添加して浮遊培養した細胞集団の未分化性をフローサイトメトリー解析するため、実施例3-2及び3-3と同じ手順で8日間培養を行い、細胞を調製した。使用したTNKS阻害剤とPKCβ阻害剤の組み合わせを表8に示す。
TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を添加して浮遊培養した細胞集団の未分化性をフローサイトメトリー解析するため、実施例3-2及び3-3と同じ手順で8日間培養を行い、細胞を調製した。使用したTNKS阻害剤とPKCβ阻害剤の組み合わせを表8に示す。
<実施例6:フローサイトメトリー解析>
以下に示す手順でフローサイトメトリー解析を行った。参考例3、比較例6、比較例7、及び実施例5で得た細胞を、Accutaseで処理し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄した。その後、4%PFA(パラホルムアルデヒド)により室温で20分間固定後、PBSで3回洗浄し、冷メタノールにより-20℃で一晩透過処理を行った。PBSで3回洗浄後、3%FBS(ウシ胎仔血清)/PBSにより室温で1時間ブロッキングした。その後、細胞のサンプルを2つに分けてそれぞれ50μLずつに再懸濁した。一方に蛍光標識済抗OCT4、抗SOX2、及び抗NANOG抗体をそれぞれ加えて混合し、もう一方に蛍光標識済アイソタイプコントロール抗体を加えて混合し、4℃、遮光状態で1時間染色した。使用した抗体とその添加量を表9に示した。
以下に示す手順でフローサイトメトリー解析を行った。参考例3、比較例6、比較例7、及び実施例5で得た細胞を、Accutaseで処理し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄した。その後、4%PFA(パラホルムアルデヒド)により室温で20分間固定後、PBSで3回洗浄し、冷メタノールにより-20℃で一晩透過処理を行った。PBSで3回洗浄後、3%FBS(ウシ胎仔血清)/PBSにより室温で1時間ブロッキングした。その後、細胞のサンプルを2つに分けてそれぞれ50μLずつに再懸濁した。一方に蛍光標識済抗OCT4、抗SOX2、及び抗NANOG抗体をそれぞれ加えて混合し、もう一方に蛍光標識済アイソタイプコントロール抗体を加えて混合し、4℃、遮光状態で1時間染色した。使用した抗体とその添加量を表9に示した。
そして、3%FBS(ウシ胎仔血清)/PBSで1回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をGuava easyCyte 8HT(ルミックス社)にて解析した。アイソタイプコントロール抗体で処理したサンプルについて、前記FSC/SSCドットプロットにて抽出した細胞集団において、より蛍光強度が強い細胞集団が1.0%以下となるすべての領域を選択した。抗OCT4、抗SOX2、及び抗NANOG抗体で処理したサンプルについて、前記FSC/SSCドットプロットにて抽出した細胞集団において、前記領域内に含まれる細胞の割合を算出し、これをOCT4、SOX2、及びNANOGが陽性を呈する細胞の比率とした。その結果を表10及び図5に示した。
表10及び図5に示すように、接着培養を行った参考例3は未分化マーカーであるOCT4、SOX2、及びNANOGについて、陽性を呈する細胞の比率が90%以上であり、未分化状態を維持した多能性幹細胞集団が得られた。一方、浮遊培養を行った比較例6及び、TNKS阻害剤及びPKC阻害剤を添加して浮遊培養を行った比較例7ではOCT4が陽性を呈する細胞の比率が低下したことから、自発的に分化した細胞集団が出現しており、多能性幹細胞の未分化状態を維持できていなかった。TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を添加して浮遊培養を行った実施例5は、OCT4、SOX2、及びNANOGについて、陽性を呈する細胞の比率が90%以上であり、自発的分化を抑制して未分化状態を維持した細胞集団が得られたと考えられた。これらの結果からも、TNKS阻害剤とPKCβ阻害剤を使用した浮遊培養により、自発的分化を抑制し、未分化状態を維持した多能性幹細胞集団を取得可能であることが明らかになった。
<参考例4:ヒトiPS細胞201B7株の接着培養>
参考例2と同じ手順で接着培養を実施した。
参考例2と同じ手順で接着培養を実施した。
<比較例8:ヒトiPS細胞201B7株の浮遊培養>
参考例2と同じ手順で接着培養したヒトiPS細胞201B7株をAccutaseで5分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用12ウェルプレート(住友ベークライト社)に1ウェルあたり1mLの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で98rpmの速度で水平面に沿って旋回幅(直径)が25mmの円を描くように旋回させ、37℃、5%CO2環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養0日目とし、培養5日目に継代を行い、培養10日目まで浮遊培養を行った。培地交換は毎日行った。培地交換の方法としては、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、StemFit(登録商標)AK02N培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻した。培地交換時に、培養1日目及び6日目は培地にY-27632を最終濃度5μMとなるように添加し、培養2日目及び7日目は培地にY-27632を最終濃度2μMとなるように添加した。培養5日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。細胞凝集塊にAccutaseを1mL添加して37℃で10分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製し、培養0日目と同様に細胞を播種して浮遊培養を継続した。
参考例2と同じ手順で接着培養したヒトiPS細胞201B7株をAccutaseで5分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用12ウェルプレート(住友ベークライト社)に1ウェルあたり1mLの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で98rpmの速度で水平面に沿って旋回幅(直径)が25mmの円を描くように旋回させ、37℃、5%CO2環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養0日目とし、培養5日目に継代を行い、培養10日目まで浮遊培養を行った。培地交換は毎日行った。培地交換の方法としては、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、StemFit(登録商標)AK02N培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻した。培地交換時に、培養1日目及び6日目は培地にY-27632を最終濃度5μMとなるように添加し、培養2日目及び7日目は培地にY-27632を最終濃度2μMとなるように添加した。培養5日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。細胞凝集塊にAccutaseを1mL添加して37℃で10分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製し、培養0日目と同様に細胞を播種して浮遊培養を継続した。
<比較例9:ヒトiPS細胞201B7株の浮遊培養へのPORCN阻害剤及びPKCβ阻害剤添加>
実施例1で使用したTNKS阻害剤はWNTシグナルの阻害剤効果を持つことが知られている。そこで、TNKS阻害剤以外にWNTシグナルの阻害効果を持つPorcupine(PORCN)阻害剤を使用した場合にも、分化抑制効果があるかどうかを確認するために、以下の方法で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、PORCN阻害剤としてIWP-2(富士フィルム和光純薬社)又はWNT-C59(ケイマンケミカル社)を添加し、PKCβ阻害剤としてGF109203X又はLY-333531を添加した点を除いて、比較例8と同じ手順で浮遊培養を実施した。
実施例1で使用したTNKS阻害剤はWNTシグナルの阻害剤効果を持つことが知られている。そこで、TNKS阻害剤以外にWNTシグナルの阻害効果を持つPorcupine(PORCN)阻害剤を使用した場合にも、分化抑制効果があるかどうかを確認するために、以下の方法で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、PORCN阻害剤としてIWP-2(富士フィルム和光純薬社)又はWNT-C59(ケイマンケミカル社)を添加し、PKCβ阻害剤としてGF109203X又はLY-333531を添加した点を除いて、比較例8と同じ手順で浮遊培養を実施した。
<実施例7:ヒトiPS細胞201B7株の浮遊培養へのTNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤添加>
実施例1で使用したIWR-1-endo以外のTNKS阻害剤を使用した場合にも、分化抑制効果があるかどうかを確認するために、以下の方法で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、TNKS阻害剤としてIWR-1-endo又はXAV939(富士フィルム和光純薬社)を添加し、PKCβ阻害剤としてGF109203X又はLY-333531を添加した点を除いて、比較例8と同じ手順で浮遊培養を実施した。
実施例1で使用したIWR-1-endo以外のTNKS阻害剤を使用した場合にも、分化抑制効果があるかどうかを確認するために、以下の方法で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、TNKS阻害剤としてIWR-1-endo又はXAV939(富士フィルム和光純薬社)を添加し、PKCβ阻害剤としてGF109203X又はLY-333531を添加した点を除いて、比較例8と同じ手順で浮遊培養を実施した。
<実施例8:定量的リアルタイムPCR解析>
参考例4の培養4日目の細胞、並びに比較例8、比較例9、及び実施例7の培養10日目の細胞に対し、実施例4と同じ手順で定量的リアルタイムPCR解析を実施した。遺伝子発現を測定した結果を表11及び12並びに図6及び7に示した。
参考例4の培養4日目の細胞、並びに比較例8、比較例9、及び実施例7の培養10日目の細胞に対し、実施例4と同じ手順で定量的リアルタイムPCR解析を実施した。遺伝子発現を測定した結果を表11及び12並びに図6及び7に示した。
表11及び12並びに図6及び7に示したように、接着培養を行った参考例4では、T、SOX17、及びPAX6の発現量が低く、多能性幹細胞の未分化状態が維持されていた。一方、浮遊培養を行った比較例8では、T及びSOX17の発現量が増加したことから、中胚葉及び内胚葉への自発的分化が起きており、多能性幹細胞の未分化状態を維持できていなかった。PORCN阻害剤及びPKCβ阻害剤を添加して浮遊培養を行った比較例9では、比較例8よりもT及びSOX17の発現量が低かったことから、PORCN阻害剤は中胚葉及び内胚葉への自発的分化を抑制することが示された。また、TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を添加して浮遊培養を行った実施例7は、比較例9と比較してT及びSOX17の発現量がさらに低かったことから、PORCN阻害剤よりもTNKS阻害剤の方がより強力に中胚葉及び内胚葉への自発的分化を抑制できることが示された。PORCN阻害剤とTNKS阻害剤のいずれもWNTシグナルの阻害効果を持つが、PKCβ阻害剤との組み合わせにおける中胚葉及び内胚葉への自発的分化抑制においてはTNKS阻害剤の方が効果的であることが明らかになった。
<参考例5:ヒトiPS細胞201B7株の接着培養>
参考例2と同じ手順で接着培養を実施した。
参考例2と同じ手順で接着培養を実施した。
<比較例10:ヒトiPS細胞201B7株の浮遊培養>
比較例8と同じ手順で浮遊培養を実施した。培養8日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。細胞凝集塊の位相差画像を図8に示した。図8より、細胞凝集塊を形成したことが確認できた。
比較例8と同じ手順で浮遊培養を実施した。培養8日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。細胞凝集塊の位相差画像を図8に示した。図8より、細胞凝集塊を形成したことが確認できた。
<実施例9:ヒトiPS細胞201B7株の浮遊培養におけるTNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤の濃度検討>
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、TNKS阻害剤としてIWR-1-endoを最終濃度30μM、10μM、3μM、1μM、300nM、100nMのうちいずれかの濃度で添加し、PKCβ阻害剤としてGo6983又はLY-333531を最終濃度10μM、100nM、30nMのいずれかの濃度で添加した点を除いて、比較例8と同じ手順で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、TNKS阻害剤としてIWR-1-endoを最終濃度30μM、10μM、3μM、1μM、300nM、100nMのうちいずれかの濃度で添加し、PKCβ阻害剤としてGo6983又はLY-333531を最終濃度10μM、100nM、30nMのいずれかの濃度で添加した点を除いて、比較例8と同じ手順で浮遊培養を実施した。
<実施例10:定量的リアルタイムPCR解析>
参考例5の培養4日目の細胞、並びに比較例10及び実施例9の培養10日目の細胞に対し、実施例4と同じ手順で定量的リアルタイムPCR解析を実施した。遺伝子発現を測定した結果を表13及び14並びに図9から11に示した。
参考例5の培養4日目の細胞、並びに比較例10及び実施例9の培養10日目の細胞に対し、実施例4と同じ手順で定量的リアルタイムPCR解析を実施した。遺伝子発現を測定した結果を表13及び14並びに図9から11に示した。
表13及び14並びに図9から11に示すように、接着培養を行った参考例5では、T、SOX17、及びPAX6の発現量が低く、多能性幹細胞の未分化状態が維持されていた。一方、浮遊培養を行った比較例10では、T、SOX17、及びPAX6の発現量が増加したことから、中胚葉、内胚葉、及び外胚葉への自発的分化が起きており、多能性幹細胞の未分化状態を維持できていなかった。TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を添加して浮遊培養を行った実施例9において、TNKS阻害剤を最終濃度30μM以下、100nM以上の濃度範囲で添加すると、T及びSOX17の発現量は比較例10と比較して低く、中胚葉及び内胚葉への自発的分化を抑制した。また、実施例9において、PKCβ阻害剤を最終濃度10μM以下、30nM以上の濃度範囲で添加すると、PAX6の発現量は比較例10と比較して低く、外胚葉への自発的分化を抑制した。
<比較例11:ヒトiPS細胞201B7株の接着培養におけるTNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤添加>
参考例2において、接着培養の播種培地及び培地交換培地に対し、XAV939を最終濃度10μMとGF109203Xを最終濃度5μMで添加する条件と、添加しない条件の2通りで接着培養を実施した。培養4日目の細胞の位相差画像を図12に示した。図12より、XAV939とGF109203Xを添加した条件では、大半の細胞が死滅したことが確認できた。培養4日目に細胞をAccutaseで5分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。播種生細胞数に対する培養4日目の生細胞数を増幅率と定義すると、XAV939とGF109203Xを添加した条件の増幅率は2.11×10-2であった。このことから、接着培養において、TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を添加すると、多能性幹細胞の生存及び増殖に悪影響を及ぼすことが示された。
参考例2において、接着培養の播種培地及び培地交換培地に対し、XAV939を最終濃度10μMとGF109203Xを最終濃度5μMで添加する条件と、添加しない条件の2通りで接着培養を実施した。培養4日目の細胞の位相差画像を図12に示した。図12より、XAV939とGF109203Xを添加した条件では、大半の細胞が死滅したことが確認できた。培養4日目に細胞をAccutaseで5分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。播種生細胞数に対する培養4日目の生細胞数を増幅率と定義すると、XAV939とGF109203Xを添加した条件の増幅率は2.11×10-2であった。このことから、接着培養において、TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を添加すると、多能性幹細胞の生存及び増殖に悪影響を及ぼすことが示された。
<実施例11:ヒトiPS細胞201B7株の浮遊培養におけるTNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤添加>
比較例4において、浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、XAV939を最終濃度10μMとGF109203Xを最終濃度5μMで添加する条件と、添加しない条件の2通りで浮遊培養を実施した。培養4日目の細胞の位相差画像を図13に示した。図13より、XAV939とGF109203Xを添加した条件は、無添加条件と同様に細胞凝集塊を形成し、同じ形態を示した。培養4日目に細胞をAccutaseで10分間処理して剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。比較例9と同様に増幅率を算出すると、XAV939とGF109203Xを添加した条件の増幅率は2.68であった。比較例11と実施例11の増幅率比較を図14に示した。これらのことから、実施例11のTNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を浮遊培養で添加した場合では、比較例11の接着培養で確認された生存及び増殖への悪影響が顕著に改善されることが明らかになった。
比較例4において、浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、XAV939を最終濃度10μMとGF109203Xを最終濃度5μMで添加する条件と、添加しない条件の2通りで浮遊培養を実施した。培養4日目の細胞の位相差画像を図13に示した。図13より、XAV939とGF109203Xを添加した条件は、無添加条件と同様に細胞凝集塊を形成し、同じ形態を示した。培養4日目に細胞をAccutaseで10分間処理して剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。比較例9と同様に増幅率を算出すると、XAV939とGF109203Xを添加した条件の増幅率は2.68であった。比較例11と実施例11の増幅率比較を図14に示した。これらのことから、実施例11のTNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を浮遊培養で添加した場合では、比較例11の接着培養で確認された生存及び増殖への悪影響が顕著に改善されることが明らかになった。
<比較例12:ヒトiPS細胞1231A3株の長期浮遊培養>
参考例2と同じ手順で接着培養したヒトiPS細胞1231A3株をAccutase(イノベーティブセルテクノロジー社)で5分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用6ウェルプレートに1ウェルあたり4mLの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で90rpmの速度で水平面に沿って旋回幅(直径)が25mmの円を描くように旋回させ、37℃、5%CO2環境下で浮遊培養を行った。
細胞を播種した日を培養0日目とし、培養4、8、16及び20日目に継代を行い、培養24日目まで浮遊培養を行った。培地交換は毎日行った。培地交換の方法としては、先ず、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、StemFit(登録商標)AK02N培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻すことで培地交換した。培地交換時に、培養1、5、9、13,17,21日目は、培地にY-27632を最終濃度5μMとなるように添加し、培養2、6、10,14,18,22日目は、培地にY-27632を最終濃度2μMとなるように添加した。培養4、8、12、16、20日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。細胞凝集塊にAccutaseを1mL添加して37℃で10分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製し、培養0日目と同様に細胞を播種して浮遊培養を継続した。培養8,16、24日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。細胞凝集塊の位相差画像を図15に示した。図15より、細胞凝集塊を形成したことが確認できたが、その形状は歪であった。
参考例2と同じ手順で接着培養したヒトiPS細胞1231A3株をAccutase(イノベーティブセルテクノロジー社)で5分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用6ウェルプレートに1ウェルあたり4mLの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で90rpmの速度で水平面に沿って旋回幅(直径)が25mmの円を描くように旋回させ、37℃、5%CO2環境下で浮遊培養を行った。
細胞を播種した日を培養0日目とし、培養4、8、16及び20日目に継代を行い、培養24日目まで浮遊培養を行った。培地交換は毎日行った。培地交換の方法としては、先ず、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、StemFit(登録商標)AK02N培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻すことで培地交換した。培地交換時に、培養1、5、9、13,17,21日目は、培地にY-27632を最終濃度5μMとなるように添加し、培養2、6、10,14,18,22日目は、培地にY-27632を最終濃度2μMとなるように添加した。培養4、8、12、16、20日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。細胞凝集塊にAccutaseを1mL添加して37℃で10分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製し、培養0日目と同様に細胞を播種して浮遊培養を継続した。培養8,16、24日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。細胞凝集塊の位相差画像を図15に示した。図15より、細胞凝集塊を形成したことが確認できたが、その形状は歪であった。
<実施例12:ヒトiPS細胞1231A3株の長期浮遊培養におけるTNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤添加>
浮遊培養の培地にTNKS阻害剤としてIWR-1-endoを20μM、PKCβ阻害剤添加としてLY-333531を1μM添加し、培地交換及び継代の直前に培養上清のサンプリングを行い、王子計測機器社製多機能バイオセンサBF-7Dを用いて、乳酸濃度の測定を行った以外は、比較例12と同様に培養を行った。
細胞凝集塊の位相差画像を図16に示した。図16より、球状の綺麗な細胞凝集塊を形成したことを確認できた。また、図17に比較例12と実施例12で行った定量的リアルタイムPCR解析の結果(使用したプライマー及び解析条件は実施例4参照)の推移を示した。図17に示した通り、実施例12では未分化マーカーであるOCT4の相対遺伝子発現量が長期培養においても高く維持されていることが分かった。また、実施例12においては、内胚葉マーカーであるSOX17の相対遺伝子発現量が長期培養においても低く維持されていることが分かる。一方、図18に比較例12と実施例12における未分化マーカーであるOCT4の陽性率の推移を示す。図18から、実施例12においては、未分化マーカーであるOCT4の陽性率が長期培養においても高く維持されていることが分かる。
浮遊培養の培地にTNKS阻害剤としてIWR-1-endoを20μM、PKCβ阻害剤添加としてLY-333531を1μM添加し、培地交換及び継代の直前に培養上清のサンプリングを行い、王子計測機器社製多機能バイオセンサBF-7Dを用いて、乳酸濃度の測定を行った以外は、比較例12と同様に培養を行った。
細胞凝集塊の位相差画像を図16に示した。図16より、球状の綺麗な細胞凝集塊を形成したことを確認できた。また、図17に比較例12と実施例12で行った定量的リアルタイムPCR解析の結果(使用したプライマー及び解析条件は実施例4参照)の推移を示した。図17に示した通り、実施例12では未分化マーカーであるOCT4の相対遺伝子発現量が長期培養においても高く維持されていることが分かった。また、実施例12においては、内胚葉マーカーであるSOX17の相対遺伝子発現量が長期培養においても低く維持されていることが分かる。一方、図18に比較例12と実施例12における未分化マーカーであるOCT4の陽性率の推移を示す。図18から、実施例12においては、未分化マーカーであるOCT4の陽性率が長期培養においても高く維持されていることが分かる。
図15~18に示した比較例12と実施例12の結果から、TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を含む培地を使用することで、多能性幹細胞を長期間にわたり浮遊培養を行っても、未分化性を維持できることが明らかとなった。さらに、図19に比較例12と実施例12における到達生細胞密度の推移を示した。図19から、実施例12においては、多能性幹細胞を長期間にわたり浮遊培養を行っても、増殖性を維持できていることが分かった。さらにまた、図20に実施例12の培地交換及び継代直前における培地中の乳酸濃度を測定した結果を示した。図20から、実施例12においては、継代直前における培地中の乳酸濃度が10mMを超えて12mM程度まで高くなっていることが分かった。以上の図17~20に示した結果から、TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を含む培地を使用することで、培地中の乳酸濃度が比較的高くなっても、多能性幹細胞の未分化性と増殖能を維持できることが分かった。
<実施例13:攪拌型リアクターによる長期浮遊培養>
浮遊培養用の培養容器をABLE社製のiPS細胞培養用シングルユースバイオリアクター(30mL)を用い、30mLの細胞懸濁液を播種し、135rpm、すなわち0.23m/sの翼先端速度で攪拌し、培養3、6、9、12日目に継代を行い、培養15日目まで浮遊培養を行った。本例では、培地交換時に、培養1、4、7、10、13日目は培地にY-27632を最終濃度6.9μMとなるように添加し、培養2、5、8、11、14日目は培地にY-27632を最終濃度3.71μMとなるように添加した以外は、実施例12と同様に培養を行った。
浮遊培養用の培養容器をABLE社製のiPS細胞培養用シングルユースバイオリアクター(30mL)を用い、30mLの細胞懸濁液を播種し、135rpm、すなわち0.23m/sの翼先端速度で攪拌し、培養3、6、9、12日目に継代を行い、培養15日目まで浮遊培養を行った。本例では、培地交換時に、培養1、4、7、10、13日目は培地にY-27632を最終濃度6.9μMとなるように添加し、培養2、5、8、11、14日目は培地にY-27632を最終濃度3.71μMとなるように添加した以外は、実施例12と同様に培養を行った。
<参考例6:ヒトiPS細胞1231A3株の長期接着培養>
参考例2と同じ手順で接着培養したヒトiPS細胞1231A3株をAccutase(イノベーティブセルテクノロジー社)で5分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。その後、実施例13と同じ培養日数と継代数とした以外は、参考例2と同じ手順での培養と継代を繰り返し行った。
図21に実施例13と参考例6で行った定量的リアルタイムPCR解析の結果(使用したプライマー及び解析条件は実施例4参照)の推移を示した。なお、図21においてデータが欠損しているポイントは、検出限界値以下であったことを意味している。図21に示したように、実施例13では浮遊培養でありながら、未分化マーカーの相対遺伝子発現量が長期培養においても、参考例6の接着培養と同等に高く維持されていることが分かる。また、実施例13においては、代表的な三胚葉マーカーの相対遺伝子発現量が長期培養においても、参考例6の接着培養と同様に低く維持されていることが分かる。また、図22に実施例13で得られた細胞についてG-Band解析した結果を示した(株式会社日本遺伝子研究所に委託)。図22に示す通り、実施例13における浮遊培養によっても、継代3世代及び継代5世代ともに新たな核型異常が発生することは無いことが分かった。
以上の図21及び22に示した結果から、TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を含む培地を使用することで、多能性幹細胞に対して高い剪断応力を負荷する攪拌培養条件であっても、核型異常を生じることなく、多能性幹細胞の未分化性を維持することができることが分かった。
参考例2と同じ手順で接着培養したヒトiPS細胞1231A3株をAccutase(イノベーティブセルテクノロジー社)で5分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。その後、実施例13と同じ培養日数と継代数とした以外は、参考例2と同じ手順での培養と継代を繰り返し行った。
図21に実施例13と参考例6で行った定量的リアルタイムPCR解析の結果(使用したプライマー及び解析条件は実施例4参照)の推移を示した。なお、図21においてデータが欠損しているポイントは、検出限界値以下であったことを意味している。図21に示したように、実施例13では浮遊培養でありながら、未分化マーカーの相対遺伝子発現量が長期培養においても、参考例6の接着培養と同等に高く維持されていることが分かる。また、実施例13においては、代表的な三胚葉マーカーの相対遺伝子発現量が長期培養においても、参考例6の接着培養と同様に低く維持されていることが分かる。また、図22に実施例13で得られた細胞についてG-Band解析した結果を示した(株式会社日本遺伝子研究所に委託)。図22に示す通り、実施例13における浮遊培養によっても、継代3世代及び継代5世代ともに新たな核型異常が発生することは無いことが分かった。
以上の図21及び22に示した結果から、TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を含む培地を使用することで、多能性幹細胞に対して高い剪断応力を負荷する攪拌培養条件であっても、核型異常を生じることなく、多能性幹細胞の未分化性を維持することができることが分かった。
<実施例14:長期浮遊培養後のiPS細胞の分化能評価>
凍結保存した実施例13の細胞を解凍し、最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632、20μMのIWR-1-endo、1μMのLY-333531を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用6ウェルプレートに1ウェルあたり4mLの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で90rpmの速度で水平面に沿って旋回幅(直径)が25mmの円を描くように旋回させ、37℃、5%CO2環境下で4日間の浮遊培養を行った。
培地交換は毎日行った。培地交換の方法としては、先ず、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻すことで培地交換を行った。ただし、培地交換時に、培養開始から1日後は培地中のY-27632の最終濃度を6.9μMに減らし、培養2日後は培地中のY-27632の最終濃度を3.71μMに減らし、培養3日後は培地中のY-27632の最終濃度を2.53μMに減らした。
次いで、培地及び培地中の添加剤を表15に示すように変化させながら、三胚葉それぞれへの分化誘導を行った。
凍結保存した実施例13の細胞を解凍し、最終濃度10μMのY-27632を含むStemFit(登録商標)AK02N培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度10μMのY-27632、20μMのIWR-1-endo、1μMのLY-333531を含むStemFit(登録商標)AK02N培地を用いて1mLあたり2×105個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用6ウェルプレートに1ウェルあたり4mLの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で90rpmの速度で水平面に沿って旋回幅(直径)が25mmの円を描くように旋回させ、37℃、5%CO2環境下で4日間の浮遊培養を行った。
培地交換は毎日行った。培地交換の方法としては、先ず、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、5分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻すことで培地交換を行った。ただし、培地交換時に、培養開始から1日後は培地中のY-27632の最終濃度を6.9μMに減らし、培養2日後は培地中のY-27632の最終濃度を3.71μMに減らし、培養3日後は培地中のY-27632の最終濃度を2.53μMに減らした。
次いで、培地及び培地中の添加剤を表15に示すように変化させながら、三胚葉それぞれへの分化誘導を行った。
本実施例では、中胚葉マーカーとしてCDX2、心原性中胚葉マーカーとしてPDGFRa、内胚葉マーカーとしてSOX17、外胚葉マーカーとしてPAX6について定量的リアルタイムPCR解析を行った。定量的リアルタイムPCR解析に使用したプライマーや解析条件は実施例4と同様である。なお心原性中胚葉マーカーであるPDGFRaについては以下のプライマーセットを使用した。
PDGFRa(Forward):5’-GCTGAGCCTAATCCTCTGCC-3’(配列番号15)
PDGFRa(Reverse):5’-ACTGCTCACTTCCAAGACCG-3’(配列番号16)
PDGFRa(Forward):5’-GCTGAGCCTAATCCTCTGCC-3’(配列番号15)
PDGFRa(Reverse):5’-ACTGCTCACTTCCAAGACCG-3’(配列番号16)
<参考例7:接着培養されたiPS細胞の分化能評価>
凍結保存した参考例6の細胞を解凍し、参考例2と同様に接着培養を行った。ただし、内径6cmの培養皿、培地量は4.2mL、播種密度は1.5×104cells/cm2とし、4日間の培養とした。接着培養後、ヒトiPS細胞1231A3株をAccutase(イノベーティブセルテクノロジー社)で5分間処理して細胞を培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。その後、実施例14と同様に三胚葉への分化誘導をそれぞれ実施した。
図23に定量的リアルタイムPCR解析によって三胚葉マーカーの相対遺伝子発現量を測定した結果を示した。図23に示したように、実施例14において長期浮遊培養されたiPS細胞は三胚葉それぞれへの分化誘導能を有していることが明らかとなった。
凍結保存した参考例6の細胞を解凍し、参考例2と同様に接着培養を行った。ただし、内径6cmの培養皿、培地量は4.2mL、播種密度は1.5×104cells/cm2とし、4日間の培養とした。接着培養後、ヒトiPS細胞1231A3株をAccutase(イノベーティブセルテクノロジー社)で5分間処理して細胞を培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。その後、実施例14と同様に三胚葉への分化誘導をそれぞれ実施した。
図23に定量的リアルタイムPCR解析によって三胚葉マーカーの相対遺伝子発現量を測定した結果を示した。図23に示したように、実施例14において長期浮遊培養されたiPS細胞は三胚葉それぞれへの分化誘導能を有していることが明らかとなった。
<実施例12~14について>
以上に示したように、TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を含む培地を使用することで多能性幹細胞の大量調製法として期待される浮遊培養を、その増殖性、未分化性、分化誘導能を維持しながら長期にわたって培養できることが示された。実施例12~14にて使用した多能性幹細胞には、フィーダーフリーで樹立される等、臨床用多能性幹細胞と同等の製法で提供されるものが含まれている。したがって、臨床用多能性幹細胞についてもまた、実施例12~14によって示されたように増殖性、未分化性、分化誘導能を維持しながら大量に調整できることが期待できる。
以上に示したように、TNKS阻害剤及びPKCβ阻害剤を含む培地を使用することで多能性幹細胞の大量調製法として期待される浮遊培養を、その増殖性、未分化性、分化誘導能を維持しながら長期にわたって培養できることが示された。実施例12~14にて使用した多能性幹細胞には、フィーダーフリーで樹立される等、臨床用多能性幹細胞と同等の製法で提供されるものが含まれている。したがって、臨床用多能性幹細胞についてもまた、実施例12~14によって示されたように増殖性、未分化性、分化誘導能を維持しながら大量に調整できることが期待できる。
Claims (20)
- PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む液体培地中で、多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞集団の製造方法。
- 前記液体培地中のPKCβ阻害剤含有濃度が、25nM以上15μM以下である請求項1記載の方法。
- 前記液体培地中のTNKS阻害剤含有濃度が、90nM以上40μM以下である請求項1記載の方法。
- 前記液体培地中のPKCβ阻害剤とTNKS阻害剤の含有濃度の比率が167:1以上1:1600以下の範囲である請求項1記載の方法。
- 前記液体培地が、L-アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも1つを含有する請求項1記載の方法。
- 前記液体培地が、FGF2及び/又はTGF-β1を含む請求項1記載の方法。
- 前記液体培地が、ROCK阻害剤を含有する請求項1記載の方法。
- 前記ROCK阻害剤が、Y-27632である請求項7記載の方法。
- 前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を形成する工程を含む請求項1記載の方法。
- 前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を回収する工程を含む請求項1記載の方法。
- 前記多能性幹細胞集団は、OCT4が陽性を呈する細胞の比率が90%以上であり、SOX2が陽性を呈する細胞の比率が90%以上であり、Nanogが陽性を呈する細胞の比率が90%以上である請求項1記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、ES細胞及び/又は人工多能性幹細胞である請求項1記載の方法。
- 上記液体培地中の乳酸濃度が5~15mMになるまで上記浮遊培養する請求項1記載の方法。
- 上記浮遊培養は、翼先端速度を0.05m/s以上1.37m/s以下とした攪拌培養である請求項1記載の方法。
- 請求項1乃至14の何れか一項記載の方法により製造される多能性幹細胞集団。
- PKCβ阻害剤及びTNKS阻害剤を含む、多能性幹細胞分化抑制剤。
- 前記PKCβ阻害剤含有濃度が、50nM以上200mM以下である請求項16記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
- 前記TNKS阻害剤含有濃度が、180nM以上113mM以下である請求項16記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
- 前記分化抑制剤中のPKCβ阻害剤とTNKS阻害剤の含有濃度の比率が、167:1以上1:1600以下の範囲である請求項16記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
- 請求項16乃至19の何れか一項記載の多能性幹細胞分化抑制剤を含む多能性幹細胞分化抑制キット。
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