WO2020121697A1 - ナノポア形成方法及び分析方法 - Google Patents

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present disclosure relates to a nanopore formation method and an analysis method.
  • the nanopore device is equipped with holes (nanopores) of the same size as the molecules and particles to be detected in the membrane, fill the chambers above and below the membrane with aqueous solution, and contact the aqueous solution in both chambers. It is provided with electrodes.
  • the detection target is introduced into one side of the chamber, passed through the nanopores by applying a potential difference between the electrodes and electrophoresed, and the time change of the ionic current (blocking signal) flowing between both electrodes is measured to detect the detection target. It is possible to detect the passage of an object and analyze the structural characteristics of the detection target.
  • Non-Patent Document 1 a silicon nitride film (SiNx film) is used as a membrane, and a TEM (transmission electron microscope) device is used to reduce the irradiation area of an electron beam to a small area on the membrane. It is disclosed that nanopores having a diameter of 10 nm or less are formed by controlling energy and current.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Documents 2 to 4 disclose nanopore forming methods utilizing dielectric breakdown of a membrane.
  • the upper and lower chambers sandwiching a non-perforated SiNx membrane are filled with an aqueous solution, the electrodes are immersed in the aqueous solution of each chamber, and a high voltage is continuously applied between both electrodes.
  • the current value between the electrodes suddenly rises (dielectric breakdown of the membrane) and the preset cut-off current value is reached, it is judged that the nanopores are formed, and by stopping the application of high voltage, the nanopores are stopped. To form.
  • the present nanopore forming method has an advantage that the manufacturing cost is significantly reduced and the throughput is improved as compared with the nanopore forming using the TEM device.
  • the present nanopore formation method can shift to measurement of a detection target without removing the membrane from the chamber after forming the nanopore in the membrane. Therefore, there is an advantage that the nanopore is not exposed to pollutants in the air and noise during measurement is reduced.
  • An application of measurement using nanopores is decoding the base sequence of DNA (DNA sequencing). That is, it is a method of determining the sequence of four types of bases in a DNA chain by detecting a change in ionic current when DNA passes through a nanopore.
  • Non-Patent Document 5 Another application of measurement using nanopores is detection and counting of specific objects in aqueous solution.
  • PNA and PEG are bound only to DNA having a specific sequence present in an aqueous solution, and a change in ionic current when DNA modified with PNA and PEG passes through a nanopore is measured.
  • the dielectric breakdown voltage the breakdown voltage against the voltage applied to the membrane
  • the dielectric breakdown voltage it is desirable to use a membrane that is unlikely to cause dielectric breakdown even if a voltage required for measurement is applied for a long time.
  • a high voltage is applied to the membrane due to static electricity generated during setup before measurement, and the membrane causes dielectric breakdown (Non-Patent Document 6).
  • the dielectric breakdown voltage is high. Therefore, a membrane that is resistant to dielectric breakdown even when a high voltage is applied is desirable.
  • Non-Patent Documents 2 to 4 attempts to form nanopores using dielectric breakdown for a SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3) having a high dielectric breakdown voltage, a single nanopore is formed. I found it difficult to do.
  • the present disclosure provides a technique for stably forming a single nanopore on a membrane having a high dielectric breakdown voltage by dielectric breakdown.
  • the nanopore formation method of this indication arrange
  • a single nanopore can be stably formed on a membrane having a high dielectric breakdown voltage by dielectric breakdown.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows the apparatus structure for the nanopore formation method which concerns on 1st Embodiment. It is a figure which shows the result of the comparative example 1. It is a figure which shows the result of the comparative example 2. It is a figure which shows the result of the comparative example 3. It is a figure which shows the result of the comparative example 4. 5 is a diagram showing the results of Example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the result of Experimental example 2.
  • FIG. 1A is a schematic diagram showing the configuration of an apparatus for the method for forming nanopores according to the first embodiment.
  • the apparatus for the nanopore forming method includes a Si substrate 100, a SiNx film 101, a SiO 2 film 102, a SiNx film 103, an O-ring 104, a first chamber 105, and a second chamber.
  • the Si substrate 100, the SiNx film 101, the SiO 2 film 102, and the SiNx film 103 are arranged in this order.
  • An O-ring 104 is arranged on each of the upper surface of the SiNx film 103 and the lower surface of the Si substrate 100, and the O-ring 104 closes the first chamber 105 and the second chamber 106.
  • the SiNx film 101 has a SiNx membrane 113 (film) as shown in the dotted frame of FIG.
  • the SiNx membrane 113 is where the nanopores are formed, the Si substrate 100 and the SiO 2 film 102 do not exist above and below the SiNx membrane 113, and the upper and lower surfaces are in contact with the first aqueous solution 107 and the second aqueous solution 108, respectively.
  • the SiO 2 film 102 and the SiNx film 103 are for adjusting the region (size) of the SiNx membrane 113 and are not essential. That is, the SiO 2 film 102 and the SiNx film 103 may or may not be provided.
  • the Si substrate 100 also exists as a member that supports the SiNx film 101 and the SiNx membrane 113. Therefore, the Si substrate 100 may be a member made of another material other than Si.
  • FIG. 1B is a schematic view showing another configuration of the apparatus for the nanopore forming method.
  • the Si substrate 100 is not used, and the SiO 2 film 102 and the SiNx film 103 are not arranged, and the SiNx film 101 is directly attached to the first chamber 105 and the second chamber 106. It may be set up. That is, it suffices that the upper and lower first aqueous solution 107 and second aqueous solution 108 are separated via the target SiNx membrane 113.
  • the composition ratio x of the SiNx membrane 113 is 1 ⁇ x ⁇ 4/3.
  • the composition ratio x is an average value of a plurality of values measured in the thickness direction from the front surface or the back surface of the film by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis or secondary ion mass spectrometry (SIMS).
  • XPS X-ray photoelectron spectroscopy
  • SIMS secondary ion mass spectrometry
  • SiNx membrane 113 only a part of the SiNx film 101 is referred to as a SiNx membrane 113, and the SiNx film 101 and the SiNx membrane 113 are formed in the same film forming process. It is a single film made of the same member as described above. Therefore, in the SiNx film 101, the composition ratio x of the region other than the SiNx membrane 113 part is the same as the composition ratio x of the SiNx membrane 113 part.
  • the SiO 2 film 102 and the SiNx film 103 on the Si substrate 100 are removed by etching, and the SiNx film 101 on the Si substrate 100 is removed.
  • XPS measurement is performed every time the SiNx film 101 is etched from the surface in the depth direction, whereby the composition ratio x at each depth in the film can be measured. Then, the measured composition ratio x may be considered as the composition ratio of the SiNx membrane 113.
  • composition ratio x may be measured at any position on the SiNx film 101 in the horizontal direction.
  • the measurement interval in the thickness direction (depth direction) of the SiNx film 101 can be set to 0.2 to 3 nm, for example.
  • the first chamber 105 is provided with an aqueous solution introducing port 114 and an aqueous solution outlet 115, and the first aqueous solution 107 is introduced from the aqueous solution introducing port 114.
  • An aqueous solution introducing port 116 and an aqueous solution outlet 117 are provided in the second chamber 106, and the second aqueous solution 108 is introduced from the aqueous solution introducing port 116. Details of the first aqueous solution 107 and the second aqueous solution 108 will be described later.
  • the electrode 109 (first electrode) is arranged so as to contact the first aqueous solution 107 in the first chamber 105, and the electrode 110 (second electrode) is arranged in contact with the second aqueous solution 107 in the second chamber 106. It is placed in contact with the aqueous solution 108.
  • the electrodes 109 and 110 are connected to the control unit 112 by the wiring 111.
  • the electrodes 109 and 110 are, for example, silver/silver chloride electrodes.
  • control unit 112 includes a power supply for applying a voltage to the electrodes 109 and 110 and an ammeter for measuring the current between the electrodes 109 and 110, and controls these.
  • the control unit 112 also performs control such that the voltage application is stopped when the current value between the electrodes 109 and 110 reaches a predetermined threshold current.
  • control unit 112 includes an input unit for the user to set the threshold current, a storage unit for storing information input to the input unit, measurement results, etc., a display unit for displaying measurement conditions, measurement results, etc. May have.
  • the method for forming nanopores according to the present embodiment is a method for forming nanopores by a dielectric breakdown method as in the methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Documents 2 to 4 using the setup of FIG.
  • the dielectric breakdown method is to measure a current flowing between the electrodes 109 and 110 while continuously applying a constant voltage to the electrodes 109 and 110, and the dielectric breakdown of the SiNx membrane 113 causes a rapid increase in the current value between the electrodes. It is a method of forming the nanopores in the SiNx membrane 113 by determining that the nanopores are formed when the preset threshold current is reached and stopping the application of the voltage.
  • the SiNx membrane 113 is arranged between the first aqueous solution 107 and the second aqueous solution 108, the electrode 109 is brought into contact with the first aqueous solution 107, and the electrode 110 is removed. Contacting with the second aqueous solution 108 and applying a voltage to the electrodes 109 and 110.
  • the pH of each of the first aqueous solution 107 and the second aqueous solution 108 is 10 or more.
  • a KCl aqueous solution can be used as the first aqueous solution 107 and the second aqueous solution 108.
  • a single nanopore can be formed by using an aqueous solution of LiCl, NaCl, CaCl 2 , MgCl 2 , CsCl or the like other than the KCl aqueous solution.
  • the concentration of the first aqueous solution 107 and the second aqueous solution 108 may be, for example, 1M, but may be higher than 1M (for example, 1M or more and 3M or less) or less than 1M (for example, 0.001M or more). If the pH is 10 or more (when the film thickness of the SiNx membrane is 20 nm or more, it is higher than pH 11), a single nanopore can be formed.
  • a SiNx membrane 113 having a thickness of 20 nm and a composition ratio x of 1 ⁇ x ⁇ 4/3 is used as the SiNx membrane 113, and the SiO 2 film 102 has a thickness of 250 nm and SiNx.
  • the thickness of the film 103 was 100 nm.
  • a 1M KCl aqueous solution adjusted to pH 7.5 was introduced as the first aqueous solution and the second aqueous solution, respectively.
  • the predetermined threshold current is set to 0.3 ⁇ 10 ⁇ 6 A, and when the current value reaches 0.3 ⁇ 10 ⁇ 6 A, the control unit 112 is set to stop the application of the voltage to the electrodes 109 and 110. 0 V was applied to 109 and 20 V was applied to the electrode 110 to try to form nanopores.
  • FIG. 2A is a graph showing the interelectrode current value (A) when voltage is applied in Comparative Example 1. As shown in FIG. 2( a ), when the voltage application time was about 230 s, the inter-electrode current value drastically increased and reached 0.3 ⁇ 10 ⁇ 6 A.
  • FIG. 2B is a TEM photograph of the SiNx membrane after the dielectric breakdown in Comparative Example 1.
  • the left side of FIG. 2B is a photograph of the entire view of the SiNx membrane seen from above.
  • the TEM photographs of FIG. 2 and the like show that the lighter the color, the thinner the film.
  • a part of the SiNx membrane has a bright portion.
  • An enlarged photograph of this portion is the photograph on the right side of FIG. From the photograph on the right side of FIG. 2B, it was found that no holes were formed and only a thin film region having a diameter of about 10 nm was formed.
  • Comparative Example 2 Comparative Example 2 was the same as Comparative Example 1 except that the predetermined threshold current was set to 1 ⁇ 10 ⁇ 6 A, with respect to the SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3), the nanopore by the dielectric breakdown method was used. Tried to form. Further, in the same manner as in Comparative Example 1, the current value when voltage was applied was measured, and the TEM observation of the SiNx membrane after dielectric breakdown was performed. Results are shown in FIG.
  • FIG. 3A is a graph showing the current value when voltage is applied in Comparative Example 2. As shown in FIG. 3A, when the voltage application time was about 240 s, the inter-electrode current value rapidly increased and reached 1 ⁇ 10 ⁇ 6 A.
  • FIG. 3B is a TEM photograph of the SiNx membrane after the dielectric breakdown in Comparative Example 2.
  • a portion of the SiNx membrane has a bright color, as indicated by the arrow.
  • An enlarged photograph of this portion is the photograph on the right side of FIG. From the photograph on the right side of FIG. 3B, it can be seen that a large thin film region is formed as compared with the case of FIG. 2B, but it was also found that no holes were formed. That is, it was found that when the pH 7.5 aqueous solution was used, nanopores were not formed even after the dielectric breakdown of the SiNx membrane.
  • Comparative Example 3 was the same as Comparative Example 1 except that the threshold current was set to 3 ⁇ 10 ⁇ 6 A, and nanopores were formed on the SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3) by the dielectric breakdown method. Tried. Further, in the same manner as in Comparative Example 1, the current value when voltage was applied was measured, and the TEM observation of the SiNx membrane after dielectric breakdown was performed. The results are shown in Fig. 4.
  • FIG. 4A is a graph showing the current value when voltage is applied in Comparative Example 3. As shown in FIG. 4A, when the voltage application time was about 270 s, the inter-electrode current value rapidly increased and reached 3 ⁇ 10 ⁇ 6 A.
  • FIG. 4B is a TEM photograph of the SiNx membrane after the dielectric breakdown in Comparative Example 3.
  • a part of the SiNx membrane has a bright color, as indicated by the arrow.
  • An enlarged photograph of this portion is the photograph on the right side of FIG. From the photograph on the right side of FIG. 4B, it can be seen that a large thin film region is formed as compared with the case of FIG. 3B, but it was also found that no hole was formed. That is, it was found that when the pH 7.5 aqueous solution was used, nanopores were not formed even after the dielectric breakdown of the SiNx membrane.
  • the threshold current is set to be smaller than 0.3 ⁇ 10 ⁇ 6 A, for example, 0.1 ⁇ 10 ⁇ 6 A or less, the nanopores are naturally formed. Was not done.
  • Comparative example 4 In Comparative Example 4, formation of nanopores by a dielectric breakdown method was tried in the same manner as in Comparative Example 1 except that the threshold current was set to 6.5 ⁇ 10 ⁇ 6 A. Further, in the same manner as in Comparative Example 1, the current value when voltage was applied was measured, and the TEM observation of the SiNx membrane after dielectric breakdown was performed. Results are shown in FIG.
  • FIG. 5A is a graph showing the current value when voltage is applied in Comparative Example 4. As shown in FIG. 5( a ), when the voltage application time was about 220 s, the interelectrode current value sharply increased and reached 6.5 ⁇ 10 ⁇ 6 A.
  • FIG. 5B is a TEM photograph of the SiNx membrane after the dielectric breakdown in Comparative Example 4. In the photograph on the left side of FIG. 5B, it can be seen that a portion of the SiNx membrane has a bright color, as indicated by the arrow. An enlarged photograph of this portion is the photograph on the right side of FIG.
  • the number of nanopores existing in the membrane be one. Another problem is that holes of various sizes are created. Because, if only holes smaller than the molecules or particles to be detected are created, the molecules or particles to be detected cannot pass through the holes, and as a result, it is impossible to detect or count the molecules or particles to be detected. Because.
  • Comparative Examples 1 to 4 As shown in Comparative Examples 1 to 4 (FIGS. 2 to 5), when the threshold current value is set low, holes are not opened in the SiNx membrane, and when the threshold current value is set high, the holes are opened, but different sizes are set. It was found that a plurality of holes were formed. In addition, even if the threshold current value (3 ⁇ 10 ⁇ 6 A) of Comparative Example 3 and the threshold current value of Comparative Example 4 (6.5 ⁇ 10 ⁇ 6 A) were set to a threshold current value, an experiment was conducted. , The SiNx membrane has no holes or a plurality of holes having different sizes are formed. That is, it was found that it is not possible to form a single nanopore in the SiNx membrane simply by directly applying the methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Documents 2 to 4.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Documents 2 to 4 show that a single nanopore can be formed on the SiNx membrane by the method of causing dielectric breakdown as described above.
  • Non-Patent Document 2 by filling both sides of a SiNx membrane with a KCl aqueous solution having a pH of 10 and a concentration of 1M, applying a voltage to the SiNx membrane, and setting a threshold current value for stopping the voltage application to about 100 nA. , Forming a single nanopore with a diameter of about 3 nm. It is also described that a single nanopore can be formed on a SiNx membrane by the same method even when the pH is set to 2, 4, 7, 10 or 13.5.
  • Non-Patent Document 3 by filling a KN aqueous solution having a pH of 8 and a concentration of 1 M on both sides of the SiNx membrane, applying a voltage to the SiNx membrane, and setting a threshold current value for stopping the voltage application to about 95 nA, It forms a single nanopore.
  • Comparative Examples 1 to 4 we filled both sides of the SiNx membrane with an aqueous KCl solution having a pH of 7.5 and a concentration of 1M, applied a voltage to the SiNx membrane, and set a threshold current value for stopping the voltage application. Multiple values were investigated between about 100 nA or less and 10 ⁇ A, but it was impossible to form a single nanopore. Further, even if the pH of the 1 M KCl aqueous solution used was set to 7 or 8, the tendency of the above-mentioned experimental results did not change, and it was impossible to form a single nanopore.
  • composition ratio x of the SiNx membrane is smaller than 1, as a result of attempting to form nanopores by the dielectric breakdown method, as the first aqueous solution 107 and the second aqueous solution 108, an aqueous solution having a pH of less than 10 was used. However, a single nanopore was formed.
  • Example 1 a method of forming a single nanopore in a SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3) by a dielectric breakdown method will be described.
  • the pH of the first aqueous solution 107 and the second aqueous solution 108 is 10 or more.
  • Example 1 In Example 1, as in Comparative Example 1, using the setup of FIG. 1A, an attempt was made to form nanopores by a dielectric breakdown method on a SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3) having a thickness of 20 nm. It was
  • FIG. 6A is a graph showing the current value when voltage is applied in the first embodiment. As shown in FIG. 6A, when the voltage application time was about 4 s, the interelectrode current value rapidly increased and reached 1 ⁇ 10 ⁇ 6 A.
  • FIG. 6B is a TEM photograph of the SiNx membrane after dielectric breakdown in Example 1.
  • the photograph on the left side of FIG. 6B is a photograph of the entire view of the SiNx membrane seen from above. As shown by the arrow in the photograph on the left side of FIG. 6B, it can be seen that a part of the SiNx membrane has a bright part. An enlarged photograph of this portion is the photograph on the right side of FIG. In the photograph on the right side of FIG. 6B, there was a portion where an amorphous pattern derived from SiNx could not be seen, and it was found that holes (nanopores) were opened. Further, from the photograph on the left side of FIG. 6B, it was found that only one hole was formed in the SiNx membrane.
  • the threshold current was set to 1 ⁇ 10 ⁇ 6 A, and the pH of the aqueous solution was changed in seven steps of 1, 3, 7.5, 11, 11.4, 12.5 and 13.1. Then, we tried to form nanopores by the dielectric breakdown method. The other conditions are the same as in Experimental Example 1 above.
  • FIG. 7 is a TEM photograph of the SiNx membrane after dielectric breakdown when the pH of the aqueous solution was changed. As shown in FIG. 7, when the pH is higher than 11, it can be seen that there is a portion in which the amorphous pattern is not visible in the SiNx membrane and the nanopore is open. The number of nanopores formed was one for each SiNx membrane. On the other hand, it was found that when the pH was 11 or less, only the thin film region was formed in the SiNx membrane and the holes were not opened.
  • Si is etched with a highly alkaline solution under high temperature. Therefore, when pores are formed in a SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3) by an insulation breakdown method in an aqueous solution having a pH of 10 or more, Si is temporarily more than N after insulation breakdown. A local thin film region composed of a very large proportion may be formed, but at the same time, etching of Si by an alkaline aqueous solution also occurs immediately, so that a hole is formed without leaving a local thin film region. To be done. Since SiNx (1 ⁇ x ⁇ 4/3) is not etched even in an alkaline aqueous solution, the entire membrane is not etched as a result, and holes can be locally formed. It should be noted that a high temperature is required to quickly etch Si with an alkaline solution, which is covered by Joule heat of a large current flowing after dielectric breakdown.
  • the SiNx membrane particularly the membrane in which the composition ratio x is in the range of 1 ⁇ x ⁇ 4/3, has an excellent breakdown voltage (dielectric breakdown voltage) against an applied voltage.
  • dielectric breakdown voltage is high because the object is measured while applying a voltage to the membrane.
  • a membrane that is less susceptible to dielectric breakdown even if a voltage required for measurement is applied for a longer period of time is desirable for nanopore measurement.
  • a high voltage is applied to the membrane due to static electricity generated during setup before measurement, and the membrane causes dielectric breakdown (Non-Patent Document 6).
  • the dielectric breakdown voltage is high.
  • the withstand voltage of the SiNx membrane having a thickness of 30 nm shown in Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3 is broken down in about 1000 seconds when 16 V is applied in a KCl aqueous solution having a pH of 7 and a concentration of 1 M. ing.
  • the SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3) of the present embodiment when the thickness is 20 nm, in a KCl aqueous solution having a pH of 7 and a concentration of 1 M, when 16 V is applied, it takes 1000 seconds until dielectric breakdown occurs.
  • the SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3) of the present embodiment is applied with the same voltage even though it is thinner than the SiNx membrane shown in Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3.
  • the SiNx membrane has a very high dielectric breakdown voltage and a long time before dielectric breakdown. From the results of our research, it is also known that as x of SiNx becomes smaller than 1, the dielectric breakdown voltage becomes lower (that is, when the same voltage is applied, the time until dielectric breakdown becomes shorter). ..
  • Example 2 In Example 2, as in Experimental Example 1, using the setup of FIG. 1, formation of nanopores by a dielectric breakdown method was attempted for a SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3) having a thickness of 20 nm.
  • a 1M KCl aqueous solution adjusted to pH 13.1 was introduced into the first chamber 105 and the second chamber 106, respectively. Further, the predetermined threshold current is set to 1 ⁇ 10 ⁇ 6 A, and when the current value reaches 1 ⁇ 10 ⁇ 6 A, the control unit 112 is set so that the voltage application by the power supply is stopped, and the electrode 109 is set to 0 V, 18V was applied to 110. Other conditions are the same as in Experimental Example 1.
  • Example 3 In Example 3, an attempt was made to form nanopores by a dielectric breakdown method in the same manner as in Example 2 except that the threshold current was 0.5 ⁇ 10 ⁇ 6 A. Moreover, the current value at the time of voltage application was measured, and TEM observation of the SiNx membrane after dielectric breakdown was performed. In the same manner as in Example 2, the effective diameter d eff of the nanopore was obtained. The results are shown in FIG. 8(b).
  • Example 4 In Example 4, an attempt was made to form nanopores by a dielectric breakdown method in the same manner as in Example 2 except that the threshold current was 0.3 ⁇ 10 ⁇ 6 A. Moreover, the current value at the time of voltage application was measured, and TEM observation of the SiNx membrane after dielectric breakdown was performed. In the same manner as in Example 2, the effective diameter d eff of the nanopore was obtained. The results are shown in FIG. 8(c).
  • 8A to 8C are graphs showing current values when a voltage is applied, the middle part is a TEM photograph showing the whole view of the SiNx membrane after dielectric breakdown, and the lower part is an enlargement of the formed nanopore. It is a photograph.
  • the effective diameter d eff of the nanopore formed in Example 2 is 18.8 nm
  • the effective diameter d eff of the nanopore formed in Example 3 is It was 13.2 nm
  • the effective diameter d eff of the nanopore formed in Example 4 was 5.94 nm.
  • the size of the nanopores formed can be adjusted by adjusting the current threshold value for stopping the voltage application. From the result of our research, it was found that the effective diameter d eff of the nanopore can be formed from about 1 nm to 200 nm or more by adjusting the current threshold value by the method of this embodiment. It was also found that even if the effective diameter d eff is increased, only a single nanopore is formed on the SiNx membrane.
  • the KCl aqueous solution was used as the first aqueous solution 107 and the second aqueous solution 108.
  • a single nanopore can be formed by using an aqueous solution of LiCl, NaCl, CaCl 2 , MgCl 2 , CsCl, or the like other than the KCl aqueous solution.
  • the concentrations of the first aqueous solution 107 and the second aqueous solution 108 can be set to, for example, 1 M as in the above-described Experimental Examples 1 to 3, but may be higher than 1 M (eg, 1 M or more and 3 M or less), or 1 M or more.
  • a single nanopore can be formed as long as it is thin (for example, 0.001 M or more and 1 M or less) and has a pH of 10 or more (more than pH 11 when the SiNx membrane has a film thickness of 20 nm or more).
  • a SiNx membrane having a high withstand voltage (1 ⁇ x ⁇ 4/3) is used.
  • the film density of the SiNx membrane is in the range of 2.8 g/cm 3 or more and 3.2 g/cm 3 or less.
  • Those having a particularly high dielectric strength are suitable for nanopore measurement.
  • the pH of the aqueous solution is 10 or more (SiNx membrane
  • the current flowing between the electrodes is measured while continuously applying a constant voltage to the membrane, and the current value between the electrodes rapidly increases.
  • a single nanopore can be formed by stopping the application of the voltage when a preset threshold current is reached (that is, the film has a dielectric breakdown).
  • SiNx membranes with high dielectric strength (1 ⁇ x ⁇ 4/3) those with an etching rate of 0.5 nm/min or less due to hydrofluoric acid diluted to 1/200 have particularly high dielectric strength and are capable of measuring nanopores. Suitable for Of course, even if the etching rate by the hydrofluoric acid diluted to 1/200 is 0.5 nm/min or more, the pH of the aqueous solution is 10 or more (the film thickness of the SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3) is 20 nm). In the above case, if the pH is higher than 11, it is possible to form a single nanopore by the dielectric breakdown method.
  • the thickness of the SiNx membrane 113 can be 5 nm or more and 100 nm or less.
  • the dielectric breakdown voltage becomes lower as the film thickness of the SiNx membrane 113 becomes thinner, but especially when it becomes less than 5 nm, the rate of decrease of the dielectric breakdown voltage of the SiNx membrane 113 with respect to the film thickness decrease becomes large. As a result, the nanopore measurement may be hindered. Further, when the film thickness of the SiNx membrane 113 is larger than 100 nm, the voltage required for the dielectric breakdown exceeds 100 V, so that very large Joule heat is generated at the same time as the dielectric breakdown, and the SiNx membrane 113 is significantly deteriorated.
  • Non-Patent Document 7 a method of applying 20 V to a SiNx membrane in a KCl aqueous solution having a pH of 7.5 and a concentration of 1 M, and stopping the voltage application when the current flowing between the electrodes reaches 10 ⁇ 6 A, A nanopore forming method in which a local thin film region is formed in a membrane, and then, as a second step, the local thin film region is penetrated by repeating pulse voltage application of 10 V and current measurement when 0.1 V is applied. Is disclosed. Compared to the present embodiment, the method of Non-Patent Document 7 requires a second step, and thus the time required to form the nanopore becomes longer.
  • the nanopore forming method of the present embodiment takes less time to form the nanopores as compared with the method described in Non-Patent Document 7, and in the present embodiment, there are variations in the size of the nanopores formed. It was found that the size is small and the adjustable range of the size of the nanopore that can be formed is wide.
  • a voltage is applied to the SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3) in an aqueous solution having a pH of 10 or more (the film thickness of the SiNx membrane is 20 nm or more).
  • a single nanopore is applied to the SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3), which has a high withstand voltage and is suitable for nanopore measurement, by applying a voltage in an aqueous solution having a pH higher than 11) and causing dielectric breakdown. It can be stably formed.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing the structure of the laminated film according to the second embodiment.
  • the film 118 is laminated on the upper surface of the SiNx film 101 (1 ⁇ x ⁇ 4/3).
  • the film 119 is laminated on the lower surface of the SiNx film 101.
  • the films 120 and 121 are laminated on both surfaces of the SiNx film 101.
  • the film 122 is arranged between the two SiNx films 101.
  • the films 118 to 122 are, for example, SiO 2 film, HfO 2 film, Al 2 O 3 film, HfAlO x film, ZrAlO x film, Ta 2 O 5 film, SiC film, SiCN film, carbon film, and composition ratio x is 1 It is composed of a SiNx film outside the range of ⁇ x ⁇ 4/3 or a composite thereof.
  • the films 118 to 121 may be, for example, HMDS films for the purpose of preventing non-specific adsorption of the measurement target on the surface.
  • the SiNx membrane (1 ⁇ x ⁇ 4/3) and the other membranes are laminated, if the pH is less than 10, a single membrane is formed on the membrane by the above-mentioned dielectric breakdown method. Cannot form nanopores.
  • the pH of the aqueous solution is 10 or more (value greater than pH 11 when the film thickness of the SiNx membrane 113 is 20 nm or more)
  • the SiNx film (1 ⁇ x ⁇ 4/3) is included in the laminated film. Can form a single nanopore.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing an example of voltage application in the third embodiment.
  • the control unit 112 controls a power supply (not shown) so that the voltage applied between the electrodes 109 and 110 increases stepwise.
  • t s indicates the application time of a certain voltage
  • V s indicates the amount of voltage increase.
  • the nanopore forming method of the present embodiment for example, by shortening t s or increasing V s , it is possible to shorten the time until the nanopores are formed. Further, the nanopore forming method according to the present embodiment is effective when it is unclear how much voltage the membrane to be used will cause dielectric breakdown. The size of the nanopore can be adjusted by adjusting the threshold current for cutting off the applied voltage.
  • the control unit 112 further includes a voltmeter (not shown) for measuring the voltage between the electrodes 109 and 110.
  • the voltage between the electrodes 109 and 110 is measured while controlling the voltage so that the current flowing between the electrodes 109 and 110 is constant, and after dielectric breakdown occurs, the electrodes are This is different from the first embodiment in that the current supply between the electrodes 109 and 110 is stopped when the voltage between 109 and 110 reaches a predetermined threshold voltage value.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing an example of voltage application in the fourth embodiment.
  • the control unit 112 measures the voltage value while applying a voltage between the electrodes 109 and 110 so that the current flowing between the electrodes 109 and 110 is constant, and then, after the dielectric breakdown, the control unit 112 rapidly The control unit 112 stops the current supply between the electrodes 109 and 110 at the time when the inter-electrode voltage decreases and reaches a predetermined threshold voltage.
  • a single nanopore can be formed in the SiNx membrane 113 also by such a method.
  • the nanopore forming method according to the fifth embodiment will be described.
  • only one of the first aqueous solution 107 and the second aqueous solution 108 has a pH of 10 or more (when the thickness of the SiNx membrane 113 is 20 nm or more, the pH is greater than 11), and the other has a pH of 10 or more. It is less than the first embodiment. Even in such a configuration, a single nanopore can be formed in the SiNx membrane 113 by the dielectric breakdown method.
  • the pH of the aqueous solution on the side in contact with the negative electrode can be 10 or more.
  • a 1 M KCl aqueous solution adjusted to pH 7.5 is introduced into the first chamber 105
  • a 1 M KCl aqueous solution adjusted to pH 13 is introduced into the second chamber 106
  • a potential difference is applied to the electrodes 109 and 110.
  • a voltage can be applied to the SiNx membrane 113 by holding it.
  • the electrode 109 has a higher potential than the electrode 110 (for example, the electrode 109 has 20 V and the electrode 110 has 0 V)
  • the electrode 109 has a lower potential than the electrode 110 (for example, the electrode 109).
  • the time until the nanopores are formed is shorter than that when 109 is set to -20V and the electrode 110 is set to 0V.
  • one of the first aqueous solution 107 and the second aqueous solution 108 has a pH of 10 or higher, and the other aqueous solution has a pH of less than 10.
  • the SiNx membrane having the composition ratio x of 1 ⁇ x ⁇ 4/3 has a pH of 7 or more when the pH of the first aqueous solution 107 and the pH of the second aqueous solution 108 are smaller than 10.
  • the above-mentioned dielectric breakdown method has a property that nanopores are not formed.
  • a single nanopore can be stably formed.
  • either the first aqueous solution 107 or the second aqueous solution 108 is replaced with the aqueous solution containing the measurement object. After that, when the current value is measured while applying the voltage between the electrodes 109 and 110, the current value greatly changes when the measurement target passes through the nanopore.
  • the structure begins to dissociate when the pH of the aqueous solution becomes 9.5 or higher.
  • DNA begins to decompose in an acidic aqueous solution. Therefore, when the measurement target contains double-stranded DNA, the pH of the aqueous solution containing the measurement target is preferably 9 or less, and the pH may be in the range of 7 to 8 depending on the situation. ..
  • the first aqueous solution 107 or the second aqueous solution 108 having a pH of 10 or more is added to a pH of 7 to 9 or a pH of 7 to 8
  • the measurement object can be introduced into the aqueous solution.
  • the measurement object is put in advance in the first aqueous solution 107 or the second aqueous solution 108 in the first chamber 105 or the second chamber 106.
  • the nanopore can be measured as it is without replacing the aqueous solution in the first chamber 105 or the second chamber 106, and the time from the nanopore formation to the end of the nanopore measurement can be shortened. can do.
  • the pH of the aqueous solution in one of the first chamber 105 and the second chamber 106 is adjusted to 7-9, and depending on the situation, the pH is adjusted to 7-8.
  • the DNA will not dissociate even if an object to be measured containing the DNA having the double helix structure is previously placed therein. Therefore, after the nanopores are formed, the nanopores can be measured as they are without replacing the aqueous solution in the first chamber 105 or the second chamber 106, and the time from the formation of the nanopores to the end of the nanopore measurement can be shortened. it can.
  • the present disclosure is not limited to the above-described embodiments and includes various modifications.
  • the above-described embodiments have been described in detail in order to explain the present disclosure in an easy-to-understand manner, and it is not necessary to include all the configurations described.
  • part of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment.
  • the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.
  • a part of the configuration of each embodiment may be added, deleted, or replaced with a part of the configuration of another embodiment.

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Abstract

絶縁破壊耐圧の高いメンブレンに対して、絶縁破壊により単一のナノポアを安定して形成する技術を提供する。本開示のナノポア形成方法は、第１の水溶液及び第２の水溶液間にＳｉＮｘ膜を配置することと、第１の電極を前記第１の水溶液に接触させ、第２の電極を前記第２の水溶液に接触させることと、前記第１の電極及び前記第２の電極に電圧を印加することと、を含み、前記ＳｉＮｘ膜は、組成比が１＜ｘ＜４／３であり、前記第１の水溶液及び前記第２の水溶液の少なくともいずれか一方は、ｐＨ１０以上であることを特徴とする。

Description

ナノポア形成方法及び分析方法
　本開示は、ナノポア形成方法及び分析方法に関する。
　水溶液中に存在する分子や粒子の検出や解析を行う手段として、ナノポアデバイスを用いた技術が検討されている。ナノポアデバイスは、メンブレンに、検出対象となる分子や粒子と同程度の大きさの孔（ナノポア）を設け、メンブレンの上下に設けられたチャンバを水溶液で満たし、両チャンバ中の水溶液に接触するよう電極を設けたものである。チャンバの片側に検出対象物を導入し、電極間に電位差を与えて電気泳動させることによりナノポアを通過させ、両電極間に流れるイオン電流（封鎖信号）の時間変化を計測することで、検出対象物の通過を検出したり、検出対象物の構造的な特徴を解析したりすることができる。
　ナノポアデバイスの製造において、機械的強度が高いこと等の理由から、半導体基板や半導体材料を半導体プロセスにより加工してナノポアを形成する方法が注目を集めている。このようなナノポア形成方法として、例えば非特許文献１には、メンブレンとしてシリコン窒化膜（ＳｉＮｘ膜）を用い、ＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）装置を用いて、電子ビームの照射面積をメンブレン上に小さく絞り、エネルギーや電流をコントロールすることで、直径が１０ｎｍ以下のナノポアを形成することが開示されている。
　また、特許文献１、非特許文献２～４には、メンブレンの絶縁破壊を利用したナノポア形成方法が開示されている。これらの方法においては、まず、孔の空いていないＳｉＮｘメンブレンを挟む上下のチャンバに水溶液を満たし、各チャンバの水溶液中に電極を浸し、両電極間に高電圧を印加し続ける。電極間の電流値が急激に上昇して（メンブレンが絶縁破壊して）、予め設定したカットオフ電流値に到達したところでナノポアが形成されたと判断し、高電圧の印加を停止することで、ナノポアを形成する。本ナノポア形成方式は、ＴＥＭ装置を用いたナノポア形成に比べ、製造コストが大幅に削減され、スループットが向上するという利点がある。また、本ナノポア形成方式は、メンブレンにナノポアを形成した後、メンブレンをチャンバから取り外すことなく検出対象物の測定に移行できる。そのため、ナノポアが大気中の汚染物質に曝されることがなく、測定時のノイズが少なくなるという利点がある。
　ナノポアを用いた測定の用途として、ＤＮＡの塩基配列の解読（ＤＮＡシーケンシング）がある。すなわち、ＤＮＡがナノポアを通過する際のイオン電流の変化を検出することで、ＤＮＡ鎖中の４種塩基の配列の決定をするという方法である。
　ナノポアを用いた測定の別の用途としては、水溶液中の特定対象物の検出及び計数がある。例えば非特許文献５には、水溶液中に存在する特定配列のＤＮＡのみにＰＮＡとＰＥＧとを結合させ、ＰＮＡ及びＰＥＧが修飾されたＤＮＡがナノポアを通過する際のイオン電流の変化を測定することで、特定配列を有するＤＮＡの検出や計数を行うことが開示されている。
　このようなナノポア計測においては、メンブレンに電圧を印加しながら対象物の計測を行なうため、メンブレンへの印加電圧に対する破壊耐圧（以後、絶縁破壊耐圧と称する）が高いことが望ましい。つまり、ナノポア計測において、計測に必要な電圧を長時間印加しても絶縁破壊されにくいメンブレンを用いることが望ましい。また、計測前のセットアップ時に発生した静電気によって高電圧がメンブレンに印加され、メンブレンが絶縁破壊するという現象も知られている（非特許文献６）。このような静電気由来の高電圧による絶縁破壊を防ぐためにも、絶縁破壊耐圧が高いことが望ましい。従って、高電圧が印加されても絶縁破壊されにくいメンブレンが望ましい。
国際公開第２０１３／１６７９５５号
Jacob K Rosenstein, et al., Nature Methods, Vol.9, No.5, 487-492 (2012) Harold Kwok, et al., PloS ONE, Vol.9, No.3, e92880. (2013) Kyle Briggs, et al., Nanotechnology, Vol.26, 084004 (2015) Kyle Briggs, et al., Small, 10(10):2077-86 (2014) Trevor J. Morin, et al., PLoS ONE 11(5):e0154426. doi:10.1371/journal.pone.0154426(2016) Kazuma Matsui, et al., Japanese Journal of Applied Physics, Vol.57, No.4 (2018) Itaru Yanagi, et al., Scientific Report, 8, 10129 (2018).
　しかしながら、非特許文献２～４の方法によって、絶縁破壊耐圧の高いＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）に対して絶縁破壊を利用したナノポアの形成を試みても、単一のナノポアを形成することが困難であることが分かった。
　そこで、本開示は、絶縁破壊耐圧の高いメンブレンに対して、絶縁破壊により単一のナノポアを安定して形成する技術を提供する。
　本開示のナノポア形成方法は、第１の水溶液及び第２の水溶液間にＳｉＮｘ膜を配置することと、第１の電極を前記第１の水溶液に接触させ、第２の電極を前記第２の水溶液に接触させることと、前記第１の電極及び前記第２の電極に電圧を印加することと、を含み、前記ＳｉＮｘ膜は、組成比が１＜ｘ＜４／３であり、前記第１の水溶液及び前記第２の水溶液の少なくともいずれか一方は、ｐＨ１０以上であることを特徴とする。
　本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
　本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではないことを理解する必要がある。
　本開示によれば、絶縁破壊耐圧の高いメンブレンに対して、絶縁破壊により単一のナノポアを安定して形成することができる。
　上記以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
第１の実施形態に係るナノポア形成方法のための装置構成を示す模式図である。 比較例１の結果を示す図である。 比較例２の結果を示す図である。 比較例３の結果を示す図である。 比較例４の結果を示す図である。 実施例１の結果を示す図である。 実験例２の結果を示す図である。 実験例３の結果を示す図である。 第２の実施形態に係る積層膜の構造を示す模式図である。 第３の実施形態に係る電圧印加方法を説明する図である。 第４の実施形態に係る電圧印加方法を説明する図である。
　本実施の形態を説明するための全図において同一機能を有するものは同一の符号を付すようにし、その繰り返しの説明は可能な限り省略するようにしている。以下、本開示の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。実施例に記載するデバイスの構造及び材料は、本開示の思想を具現化するための一例であり、材料及び寸法などを厳密に特定するものではない。また実施例に記載する具体的な電圧値や電流値、電圧印加時間は、本開示の思想を具現化するための一例であり、それらを厳密に特定するものではない。
［第１の実施形態］
　図１（ａ）は、第１の実施形態に係るナノポア形成方法のための装置の構成を示す模式図である。図１（ａ）に示すように、ナノポア形成方法のための装置は、Ｓｉ基板１００、ＳｉＮｘ膜１０１、ＳｉＯ２膜１０２、ＳｉＮｘ膜１０３、Ｏリング１０４、第１のチャンバ１０５、第２のチャンバ１０６、電極１０９及び１１０（第１の電極及び第２の電極）、配線１１１、並びに制御部１１２を備える。
　Ｓｉ基板１００、ＳｉＮｘ膜１０１、ＳｉＯ２膜１０２及びＳｉＮｘ膜１０３は、この順に配置される。ＳｉＮｘ膜１０３の上面及びＳｉ基板１００の下面には、それぞれＯリング１０４が配置され、これらＯリング１０４により第１のチャンバ１０５及び第２のチャンバ１０６が密閉される。
　ＳｉＮｘ膜１０１は、図１（ａ）の点線枠内に示すように、ＳｉＮｘメンブレン１１３（膜）を有する。ＳｉＮｘメンブレン１１３は、ナノポアが形成される箇所であり、その上下にＳｉ基板１００及びＳｉＯ２膜１０２が存在せず、上面及び下面がそれぞれ第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８に接触する。
　なお、上述の構造のうち、ＳｉＯ２膜１０２及びＳｉＮｘ膜１０３は、ＳｉＮｘメンブレン１１３の領域（大きさ）を調整するためのものであり、必須ではない。つまり、ＳｉＯ２膜１０２及びＳｉＮｘ膜１０３があっても無くてもよい。また、Ｓｉ基板１００も、ＳｉＮｘ膜１０１及びＳｉＮｘメンブレン１１３を支持する部材として存在している。そのため、Ｓｉ基板１００は、Ｓｉ以外の別の材料で構成された部材であっても良い。
　図１（ｂ）は、ナノポア形成方法のための装置の他の構成を示す模式図である。図１（ｂ）に示されるように、Ｓｉ基板１００を用いず、そしてＳｉＯ２膜１０２及びＳｉＮｘ膜１０３も配置せず、ＳｉＮｘ膜１０１を第１のチャンバ１０５と第２のチャンバ１０６に直接するセットアップでもよい。すなわち、対象となるＳｉＮｘメンブレン１１３を介して上下の第１の水溶液１０７と第２の水溶液１０８とが分離されていればよい。
　ＳｉＮｘメンブレン１１３の組成比ｘは、１＜ｘ＜４／３である。組成比ｘは、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）分析又は二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）により、膜の表面もしくは裏面から厚み方向に複数箇所測定した値の平均値とする。なお、図１（ａ）のような場合、ＳｉＮｘメンブレン１１３の領域が小さいと組成比ｘの測定が困難な場合もある。その場合は、ＳｉＮｘ膜１０１のうち、ＳｉＮｘメンブレン１１３部分以外の領域の組成比ｘを測定することで、ＳｉＮｘメンブレン１１３の組成比ｘを知ることができる。図１（ａ）及び図１（ｂ）から分かるように、ＳｉＮｘ膜１０１の一部をＳｉＮｘメンブレン１１３と称しているだけであり、ＳｉＮｘ膜１０１とＳｉＮｘメンブレン１１３は、同一の成膜工程で形成された同一部材からなる単一の膜である。従って、ＳｉＮｘ膜１０１のうち、ＳｉＮｘメンブレン１１３の部分以外の領域の組成比ｘと、ＳｉＮｘメンブレン１１３の部分の組成比ｘは同じである。
　ＳｉＮｘメンブレン１１３の組成比ｘの測定方法として、例えば、図１（ａ）の場合、Ｓｉ基板１００上のＳｉＯ２膜１０２及びＳｉＮｘ膜１０３をエッチングにより除去し、Ｓｉ基板１００上のＳｉＮｘ膜１０１を露出させた後、ＳｉＮｘ膜１０１を表面から深さ方向にエッチングするごとにＸＰＳ測定をすることで、膜中の各深さでの組成比ｘを計測することができる。そして、この計測された組成比ｘを、ＳｉＮｘメンブレン１１３の組成比と考えてよい。
　なお、組成比ｘを測定する場所は、水平方向に関してはＳｉＮｘ膜１０１の任意の箇所でよい。また、ＳｉＮｘ膜１０１の厚み方向（深さ方向）における測定間隔は、例えば０．２～３ｎｍ間隔とすることができる。
　第１のチャンバ１０５には、水溶液導入口１１４及び水溶液出口１１５が設けられ、水溶液導入口１１４から第１の水溶液１０７が導入される。第２のチャンバ１０６には、水溶液導入口１１６及び水溶液出口１１７が設けられ、水溶液導入口１１６から第２の水溶液１０８が導入される。第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８の詳細については後述する。
　電極１０９（第１の電極）は、第１のチャンバ１０５内の第１の水溶液１０７に接触するように配置され、電極１１０（第２の電極）は、第２のチャンバ１０６内の第２の水溶液１０８に接触するように配置される。電極１０９及び１１０は、配線１１１により制御部１１２に接続される。電極１０９及び１１０は、例えば銀／塩化銀電極である。
　図示は省略しているが、制御部１１２は、電極１０９及び１１０に電圧を印加するための電源や、電極１０９及び１１０間の電流を測定するための電流計を備え、これらを制御する。また、制御部１１２は、例えば、電極１０９及び１１０間の電流値が所定の閾値電流に到達した時点で、電圧の印加を停止するといった制御を行う。さらに、制御部１１２は、ユーザが上記閾値電流を設定するための入力部や、入力部に入力された情報や測定結果等を記憶する記憶部、測定条件や測定結果等を表示する表示部などを有していてもよい。
　本実施形態に係るナノポア形成方法は、図１のセットアップを用いて、特許文献１や非特許文献２～４に記載の方法と同様に絶縁破壊方式によりナノポアを形成する方法である。絶縁破壊方式とは、一定の電圧を電極１０９及び１１０に印加し続けながら、電極１０９及び１１０間に流れる電流を計測し、ＳｉＮｘメンブレン１１３の絶縁破壊により電極間の電流値が急激に上昇して、予め設定した所定の閾値電流に到達した時点でナノポアが形成されたと判断し、電圧の印加を停止することで、ＳｉＮｘメンブレン１１３にナノポアを形成する方法である。
　換言すれば、本実施形態のナノポア形成方法は、第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８間にＳｉＮｘメンブレン１１３を配置することと、電極１０９を第１の水溶液１０７に接触させ、電極１１０を第２の水溶液１０８に接触させることと、電極１０９及び１１０に電圧を印加することと、を含む。
　本実施形態において、第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８は、それぞれｐＨ１０以上とする。第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８として、例えばＫＣｌ水溶液を用いることができる。ＫＣｌ水溶液以外に、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣｓＣｌ等の水溶液を用いても、単一のナノポア形成が可能である。
　第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８の濃度は、例えば１Ｍとすることができるが、１Ｍより濃くても（例えば１Ｍ以上３Ｍ以下）よいし、１Ｍより薄くても（例えば０．００１Ｍ以上１Ｍ以下）よく、ｐＨが１０以上（ＳｉＮｘメンブレンの膜厚が２０ｎｍ以上の場合は、ｐＨ１１より大きい）であれば、単一のナノポアを形成可能である。
　以下、絶縁破壊方式によるナノポア形成について実験内容を交えてより詳細に説明する。
＜実験例１：絶縁破壊方式によるナノポア形成＞
（比較例１）
　比較例１においては、図１のセットアップを用いて、上記の絶縁破壊方式によりナノポアの形成を試みた。
　具体的には、図１（ａ）のセットアップで、ＳｉＮｘメンブレン１１３として、厚みを２０ｎｍ、組成比ｘを１＜ｘ＜４／３のＳｉＮｘメンブレンを用い、ＳｉＯ２膜１０２の厚みを２５０ｎｍ、ＳｉＮｘ膜１０３の厚みを１００ｎｍとした。第１のチャンバ１０５及び第２のチャンバ１０６には、それぞれ第１の水溶液及び第２の水溶液として、ｐＨ７．５に調整された濃度１ＭのＫＣｌ水溶液を導入した。
　所定の閾値電流を０．３×１０－６Ａとして、電流値が０．３×１０－６Ａに到達したら電極１０９及び１１０に対する電圧の印加を停止するように制御部１１２に設定し、電極１０９に０Ｖ、電極１１０に２０Ｖを印加して、ナノポアの形成を試みた。
　電圧印加時の電流値を測定し、また、絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ観察を行った。結果を図２に示す。
　図２（ａ）は、比較例１における電圧印加時の電極間電流値（Ａ）を示すグラフである。図２（ａ）に示すように、電圧印加時間が約２３０ｓとなった際に、電極間電流値が急激に上昇し、０．３×１０－６Ａに到達した。
　図２（ｂ）は、比較例１における絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ写真である。図２（ｂ）の左側は、ＳｉＮｘメンブレンの全景を上面から見た写真である。以下、図２等のＴＥＭ写真では、色が明るい部分ほど膜が薄い部分であることを示している。図２（ｂ）の左側の写真において矢印で示すように、ＳｉＮｘメンブレンの一部に色が明るい部分があることが分かる。この部分の拡大写真が、図２（ｂ）の右側の写真である。図２（ｂ）の右側の写真を見ると、孔は開いておらず、直径が約１０ｎｍの薄膜領域が形成されているだけであることが分かった。もし孔があいている場合は、孔があいている領域に、ＳｉＮｘに由来する非晶質の模様は見えない。つまり、ｐＨ７．５の水溶液を用いると、ＳｉＮｘメンブレンが絶縁破壊した後にも、ナノポアが形成されておらず、ナノポア形成が妨げられていることが分かった。
（比較例２）
　比較例２においては、所定の閾値電流を１×１０－６Ａに設定したこと以外は比較例１と同様にして、ＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）に対し、絶縁破壊方式によるナノポアの形成を試みた。また、比較例１と同様に、電圧印加時の電流値を測定し、絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ観察を行った。結果を図３に示す。
　図３（ａ）は、比較例２における電圧印加時の電流値を示すグラフである。図３（ａ）に示すように、電圧印加時間が約２４０ｓとなった際に、電極間電流値が急激に上昇し、１×１０－６Ａに到達した。
　図３（ｂ）は、比較例２における絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ写真である。図３（ｂ）の左側の写真において、矢印で示すように、ＳｉＮｘメンブレンの一部に色が明るい部分があることが分かる。この部分の拡大写真が、図３（ｂ）の右側の写真である。図３（ｂ）の右側の写真を見ると、図２（ｂ）の場合と比べて大きな薄膜領域が形成されていることが分かるが、やはり孔は開いていないことが分かった。つまり、ｐＨ７．５の水溶液を用いると、ＳｉＮｘメンブレンが絶縁破壊した後にも、ナノポアが形成されていないことが分かった。
（比較例３）
　比較例３においては、閾値電流を３×１０－６Ａに設定したこと以外は比較例１と同様にして、ＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）に対し、絶縁破壊方式によるナノポアの形成を試みた。また、比較例１と同様に、電圧印加時の電流値を測定し、絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ観察を行った。結果を図４に示す。
　図４（ａ）は、比較例３における電圧印加時の電流値を示すグラフである。図４（ａ）に示すように、電圧印加時間が約２７０ｓとなった際に、電極間電流値が急激に上昇し、３×１０－６Ａに到達した。
　図４（ｂ）は、比較例３における絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ写真である。図４（ｂ）の左側の写真において、矢印で示すように、ＳｉＮｘメンブレンの一部に色が明るい部分があることが分かる。この部分の拡大写真が、図４（ｂ）の右側の写真である。図４（ｂ）の右側の写真を見ると、図３（ｂ）の場合と比べて大きな薄膜領域が形成されていることが分かるが、やはり孔は開いていないことが分かった。つまり、ｐＨ７．５の水溶液を用いると、ＳｉＮｘメンブレンが絶縁破壊した後にも、ナノポアが形成されていないことが分かった。
　なお、図示は省略しているが、閾値電流を０．３×１０－６Ａよりも小さく、例えば０．１×１０－６Ａもしくはそれ以下に設定しても、ナノポアは当然のことながら形成されなかった。
（比較例４）
　比較例４においては、閾値電流を６．５×１０－６Ａに設定したこと以外は比較例１と同様にして、絶縁破壊方式によるナノポアの形成を試みた。また、比較例１と同様に、電圧印加時の電流値を測定し、絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ観察を行った。結果を図５に示す。
　図５（ａ）は、比較例４における電圧印加時の電流値を示すグラフである。図５（ａ）に示すように、電圧印加時間が約２２０ｓとなった際に、電極間電流値が急激に上昇し、６．５×１０－６Ａに到達した。
　図５（ｂ）は、比較例４における絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ写真である。図５（ｂ）の左側の写真において、矢印で示すように、ＳｉＮｘメンブレンの一部に色が明るい部分があることが分かる。この部分の拡大写真が、図５（ｂ）の右側の写真である。
　図５（ｂ）の右側の写真において、矢印で示すように、ＳｉＮｘに由来する非晶質の模様が見えない部分が存在し、孔があいている部分があることが分かった。しかしながら、異なる大きさの孔が複数形成されてしまうことが分かった。ナノポアを通過する分子や粒子の検出もしくは計数を行う場合、メンブレンに複数のナノポアが開いていると、検出対象の分子や粒子が同時に異なるナノポアに入ってしまうことがある。そのような場合、ナノポアを通過するイオン電流の変化が複雑になり、その結果、検出対象の分子や粒子の検出もしくは計数の精度が落ちることになる。
　従って、メンブレンに存在するナノポアの数は１つであることが望ましい。また色々な大きさの孔ができてしまうのも問題である。なぜならば、検出対象の分子や粒子よりも小さな孔だけができてしまった場合、検出対象の分子や粒子が孔を通過できず、その結果、検出対象の分子や粒子の検出や計数が不可能になるからである。
　比較例１～４（図２～５）に示したように、閾値電流値を低く設定すると、ＳｉＮｘメンブレンに孔は開口せず、閾値電流値を高く設定すると、孔は開くが、異なる大きさの孔が複数形成されてしまうことが分かった。また、比較例３の閾値電流値（３×１０－６Ａ）と比較例４の閾値電流値（６．５×１０－６Ａ）の間の閾値電流値に設定して実験を行っても、ＳｉＮｘメンブレンに孔が開口しないか、もしくは、異なる大きさの孔が複数形成されてしまうかのどちらかの結果となることが分かった。すなわち、特許文献１や非特許文献２～４に記載されている方法をそのまま適用するだけでは、ＳｉＮｘメンブレンに単一のナノポアを形成することが不可能であることが分かった。
　一方で、特許文献１や非特許文献２～４には、上記のように絶縁破壊を生じさせる方法によって、ＳｉＮｘメンブレンに単一のナノポアを形成できることが示されている。例えば非特許文献２においては、ｐＨ１０、濃度１ＭのＫＣｌ水溶液をＳｉＮｘメンブレンの両側に満たし、ＳｉＮｘメンブレンに電圧を印加し、その電圧印加を停止するための閾値電流値を約１００ｎＡと設定することで、直径が約３ｎｍの単一のナノポアを形成している。また、ｐＨを２、４、７、１０又は１３．５とした場合においても、同様の方法によりＳｉＮｘメンブレンに対し単一のナノポアを形成できることが記載されている。
　非特許文献３においては、ｐＨ８、濃度１ＭのＫＣｌ水溶液をＳｉＮｘメンブレンの両側に満たし、ＳｉＮｘメンブレンに電圧を印加し、その電圧印加を停止するための閾値電流値を約９５ｎＡと設定することで、単一のナノポアを形成している。
　非特許文献４においては、ｐＨ１０、濃度１ＭのＫＣｌ水溶液をＳｉＮｘメンブレンの両側に満たし、ＳｉＮｘメンブレンに電圧を印加し、その電圧印加を停止するための閾値電流値を（閾値電流値）÷（絶縁破壊前に観測されている電極間電流）＝１／２±０．１と規定することで、単一のナノポアを形成している。
　一方我々は、比較例１～４のように、ｐＨ７．５、濃度１ＭのＫＣｌ水溶液をＳｉＮｘメンブレンの両側に満たし、ＳｉＮｘメンブレンに電圧を印加し、その電圧印加を停止するための閾値電流値を約１００ｎＡ以下から１０μＡまでの間で複数の値を検討したが、単一のナノポアを形成することは不可能であった。また、使用する１ＭのＫＣｌ水溶液のｐＨを７又は８に設定しても、前述の実験結果の傾向は変わることは無く、単一のナノポアを形成することは不可能であった。
　この違いの原因に関して鋭意研究を行なった結果、下記のことが分かった。すなわち、ＳｉＮｘメンブレンの組成比ｘが１＜ｘ＜４／３の範囲にある場合、ｐＨが１０よりも小さい水溶液中では、上記のような絶縁破壊方式では、単一のナノポアが形成できず、図２～５に示すような結果になることが分かった。
　ＳｉＮｘメンブレンの組成比ｘが１よりも小さい場合についても同様にして、絶縁破壊方式によりナノポア形成を試みた結果、第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８としてｐＨが１０よりも小さい水溶液を用いても、単一のナノポアは形成された。
　そこで、以下の実施例１を参照しつつ、絶縁破壊方式によりＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）に単一のナノポアを形成する方法を説明する。具体的には、本実施形態に係るナノポア形成方法においては、第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８のｐＨを１０以上とする。
（実施例１）
　実施例１において、比較例１と同様に、図１（ａ）のセットアップを用いて、厚さ２０ｎｍのＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）に対し、絶縁破壊方式によるナノポアの形成を試みた。
　本実施例１においては、ＳｉＮｘメンブレンの組成比ｘを約ｘ＝１．１３とし、第１の水溶液及び第２の水溶液として、ｐＨ１３．１に調整された濃度１ＭのＫＣｌ水溶液をそれぞれ第１のチャンバ１０５及び第２のチャンバ１０６に導入した。また、閾値電流を１×１０－６Ａに設定した。その他の条件は上記比較例１と同様にして、絶縁破壊方式によりナノポアの形成を行った。
　組成比ｘは、Ｓｉ基板１００上のＳｉＮｘ膜１０１を露出させた後、Ｓｉ基板１００上のＳｉＮｘ膜１０１を表面から深さ方向にエッチングするごとにＸＰＳ測定して求めた値の平均値でとした。具体的には、ＸＰＳ装置として、アルバック・ファイ社製のＰＨＩ　５０００　ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅ　ＩＩ（「ＰＨＩ」は登録商標）を用い、Ｘ線源をＡｌ　Ｋαとして、深さ方向の測定間隔を約０．７～０．８ｎｍとし、測定点数２６点の平均値を求めた。その結果、ｘ＝１．１３であった。なお、本実施例１ではｘ＝１．１３の場合の例を記述しているが、これまでも述べたとおり、ＳｉＮｘメンブレンの組成比ｘは１＜ｘ＜４／３の範囲であればよい。
　また、比較例１と同様に、電圧印加時の電流値を測定し、絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ観察を行った。
　図６（ａ）は、実施例１における電圧印加時の電流値を示すグラフである。図６（ａ）に示すように、電圧印加時間が約４ｓとなった際に、電極間電流値が急激に上昇し、１×１０－６Ａに到達した。
　図６（ｂ）は、実施例１における絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ写真である。図６（ｂ）の左側の写真は、ＳｉＮｘメンブレンの全景を上面から見た写真である。図６（ｂ）の左側の写真において、矢印で示すように、ＳｉＮｘメンブレンの一部に色が明るい部分があることが分かる。この部分の拡大写真が、図６（ｂ）の右側の写真である。図６（ｂ）の右側の写真には、ＳｉＮｘに由来した非晶質の模様が見えない部分が存在しており、孔（ナノポア）が開口していることが分かった。また、図６（ｂ）の左側の写真から、ＳｉＮｘメンブレン中に孔は一つだけ形成されていることが分かった。
＜実験例２：ｐＨの変更＞
　実験例１と同様に、図１のセットアップを用いて、厚さ２０ｎｍのＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）に対し、絶縁破壊方式によるナノポアの形成を試みた。
　本実験例２においては、閾値電流を１×１０－６Ａに設定し、水溶液のｐＨを１、３、７．５、１１、１１．４、１２．５及び１３．１の７段階で変更して、それぞれ絶縁破壊方式によりナノポア形成を試みた。その他の条件は上記実験例１と同様である。
　また、実験例１と同様に、絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ観察を行った。結果を図７に示す。
　図７は、水溶液のｐＨを変化させた場合の絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ写真である。図７に示すように、ｐＨが１１よりも大きい場合に、ＳｉＮｘメンブレン中に非晶質の模様は見えない部分が存在しており、ナノポアが開口していることが分かる。また、形成されたナノポアは、それぞれ各ＳｉＮｘメンブレンに１つずつであった。一方で、ｐＨが１１以下の場合には、ＳｉＮｘメンブレン中に薄膜領域が形成されるのみであり、孔は開口していないことが分かった。
　なお、我々のさらなる研究の結果、ＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）の膜厚を２０ｎｍよりも薄くすることで、水溶液のｐＨを１０以上１１以下の範囲としても、絶縁破壊方式により、ＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）に単一のナノポアを形成できることが分かった。
　また、ＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）の膜厚が２０ｎｍ以上の厚さでも、ｐＨが１１よりも高い水溶液中では、絶縁破壊方式により単一のナノポアを形成できることが分かった。
　このように、ｐＨが１０以上の水溶液中で（ＳｉＮｘメンブレンの膜厚が２０ｎｍ以上の場合は、ｐＨ１１より大きい水溶液中で）、ＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）に対し、絶縁破壊方式により孔を形成できる理由を以下に簡単に説明する。
　例えば比較例２のように、ｐＨ７．５の水溶液中では、絶縁破壊後に電極間電流が閾値電流に到達した場合でも、孔は開いておらず、局所的な薄膜領域が形成されるだけである。この局所的な薄膜領域の膜の組成は、Ｓｉの方がＮよりも非常に多い比率となっていることが我々の研究で分かった。
　そしてＳｉは、高温下の高アルカリ溶液でエッチングされることが知られている。従って、ｐＨが１０以上の水溶液中で、ＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）に対し、絶縁破壊方式により孔の形成を行うと、絶縁破壊後に一時的に、Ｓｉの方がＮよりも非常に多い比率で構成されている局所的な薄膜領域が形成されるかもしれないが、それと同時に、アルカリ水溶液によるＳｉのエッチングもすぐに起こるため、局所的な薄膜領域が残ることなく孔が形成される。なお、ＳｉＮｘ（１＜ｘ＜４／３）は、アルカリ水溶液中でもエッチングされないため、結果的にメンブレン全体がエッチングされることは無く、局所的に孔を形成することができる。なお、Ｓｉをアルカリ溶液ですばやくエッチングするには高温が必要であるが、それは絶縁破壊後に流れる大きな電流のジュール熱によってまかなわれている。
　上述のように、ＳｉＮｘメンブレン、特に組成比ｘが１＜ｘ＜４／３の範囲のメンブレンは、印加電圧に対する破壊耐圧（絶縁破壊耐圧）に優れている。ナノポア計測においては、メンブレンに電圧を印加しながら対象物の計測を行なうため、絶縁破壊耐圧が高いことが望ましい。つまり、より長時間、計測に必要な電圧を印加しても絶縁破壊されにくいメンブレンが、ナノポア計測にとって望ましい。また、計測前のセットアップ時において発生した静電気によって、高電圧がメンブレンに印加され、メンブレンが絶縁破壊するという現象も知られている（非特許文献６）。その静電気由来の高電圧による絶縁破壊を防ぐためにも、絶縁破壊耐圧が高いことが望ましい。つまり、高電圧が印加されても絶縁破壊されにくいメンブレンが望ましい。
　実際、非特許文献２及び非特許文献３に示されている厚み３０ｎｍのＳｉＮｘメンブレンの絶縁耐圧は、ｐＨ７、濃度１ＭのＫＣｌ水溶液中で、１６Ｖが印加されたときに約１０００秒で絶縁破壊されている。一方、本実施形態のＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）は、その厚みが２０ｎｍの場合、ｐＨ７、濃度１ＭのＫＣｌ水溶液中で、１６Ｖが印加された場合、絶縁破壊に至るまで１０００秒よりもはるかに長い時間が掛かる。つまり、本実施形態のＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）は、非特許文献２及び非特許文献３に示されているＳｉＮｘメンブレンよりも厚みが薄いにもかかわらず、同電圧を印加したときには、絶縁破壊に至るまでの時間が長く、非常に絶縁耐圧の高いＳｉＮｘメンブレンであるといえる。また我々の研究の結果から、ＳｉＮｘのｘが１よりも小さくなるにつれて、絶縁耐圧が低くなる（つまり同電圧を印加したときに、絶縁破壊に至るまでの時間が短くなる）ことも分かっている。
＜実験例３：閾値電流の変更＞
　次に、閾値電流の値を変更した場合のナノポア形成について説明する。
（実施例２）
　実施例２において、実験例１と同様に、図１のセットアップを用いて、厚さ２０ｎｍのＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）に対し、絶縁破壊方式によるナノポアの形成を試みた。
　本実施例２においては、第１の水溶液及び第２の水溶液として、ｐＨ１３．１に調整された濃度１ＭのＫＣｌ水溶液をそれぞれ第１のチャンバ１０５及び第２のチャンバ１０６に導入した。また、所定の閾値電流を１×１０－６Ａとして、電流値が１×１０－６Ａに到達したら電源による電圧の印加を停止するように制御部１１２に設定し、電極１０９に０Ｖ、電極１１０に１８Ｖを印加した。その他の条件は実験例１と同様である。
　電圧印加時の電流値を測定し、また、絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ観察を行った。また、形成されたナノポアの形状を円形と仮定して、ナノポアの直径（実効直径ｄｅｆｆ）を、面積Ｓ＝π×（１／２ｄｅｆｆ）×（１／２ｄｅｆｆ）の式から逆算した。図８（ａ）に結果を示す。
（実施例３）
　実施例３においては、閾値電流を０．５×１０－６Ａとしたこと以外は実施例２と同様にして、絶縁破壊方式によるナノポアの形成を試みた。また、電圧印加時の電流値を測定し、絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ観察を行った。実施例２と同様にして、ナノポアの実効直径ｄｅｆｆを求めた。図８（ｂ）に結果を示す。
（実施例４）
　実施例４においては、閾値電流を０．３×１０－６Ａとしたこと以外は実施例２と同様にして、絶縁破壊方式によるナノポアの形成を試みた。また、電圧印加時の電流値を測定し、絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンのＴＥＭ観察を行った。実施例２と同様にして、ナノポアの実効直径ｄｅｆｆを求めた。図８（ｃ）に結果を示す。
　図８（ａ）～（ｃ）の上段は、電圧印加時の電流値を示すグラフであり、中段は絶縁破壊後のＳｉＮｘメンブレンの全景を示すＴＥＭ写真であり、下段は形成されたナノポアの拡大写真である。
　図８（ａ）～（ｃ）の下段に示すように、実施例２において形成されたナノポアの実効直径ｄｅｆｆは１８．８ｎｍであり、実施例３において形成されたナノポアの実効直径ｄｅｆｆは１３．２ｎｍであり、実施例４において形成されたナノポアの実効直径ｄｅｆｆは５．９４ｎｍであった。このように、電圧印加を停止するための電流閾値を調整することで、形成されるナノポアの大きさを調整することができる。我々の研究の結果から、本実施形態の方法で電流閾値を調整することで、ナノポアの実効直径ｄｅｆｆは、約１ｎｍから２００ｎｍ以上まで形成可能であることが分かった。また、実効直径ｄｅｆｆが大きくなっても、ＳｉＮｘメンブレンに単一のナノポアのみ形成されることが分かった。
　上記のように、実験例１～３では、第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８としてＫＣｌ水溶液を用いた。しかし、ＫＣｌ水溶液以外に、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣｓＣｌ等の水溶液を用いても、単一のナノポア形成が可能である。
　第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８の濃度は、上記実験例１～３のように例えば１Ｍとすることができるが、１Ｍより濃くても（例えば１Ｍ以上３Ｍ以下）よいし、１Ｍより薄くても（例えば０．００１Ｍ以上１Ｍ以下）よく、ｐＨが１０以上（ＳｉＮｘメンブレンの膜厚が２０ｎｍ以上の場合は、ｐＨ１１より大きい）であれば、単一のナノポアを形成することができる。
　本実施形態では、絶縁耐圧の高いＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）を用いているが、その中でもＳｉＮｘメンブレンの膜密度が２．８ｇ／ｃｍ３以上３．２ｇ／ｃｍ３以下の範囲のものは、特に絶縁耐圧が高く、ナノポア計測に好適である。もちろんながら、ＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）の膜密度が２．８ｇ／ｃｍ３以上３．２ｇ／ｃｍ３以下の範囲外であっても、水溶液のｐＨが１０以上（ＳｉＮｘメンブレンの膜厚が２０ｎｍ以上の場合は、ｐＨ１１より大きい値）であれば、一定の電圧をメンブレンに印加し続けながら、電極間に流れる電流を計測し、その電極間の電流値が急激に上昇して（つまり膜が絶縁破壊して）予め設定した閾値電流に到達したら電圧の印加を停止するという方法で、単一のナノポアを形成することができる。
　絶縁耐圧の高いＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）のうち、特に１／２００に希釈されたフッ酸によるエッチングレートが０．５ｎｍ／ｍｉｎ以下のものは、特に絶縁耐圧が高く、ナノポア計測に好適である。もちろんながら、１／２００に希釈されたフッ酸によるエッチングレートが０．５ｎｍ／ｍｉｎ以上であっても、水溶液のｐＨが１０以上（ＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）の膜厚が２０ｎｍ以上の場合は、ｐＨ１１より大きい値）であれば、絶縁破壊方式により、単一のナノポアを形成することができる。
　絶縁耐圧の高いＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）は、その膜応力が通常６００ＭＰａ以上の引張応力となる。非特許文献２で使用されているＳｉＮｘメンブレンは、２５０ＭＰａ以下の引張応力であることが記載されているので、ＳｉＮｘの組成比ｘは１よりも小さいと考えられる。
　ＳｉＮｘメンブレン１１３の膜厚は、５ｎｍ以上１００ｎｍ以下とすることができる。ＳｉＮｘメンブレン１１３の膜厚が薄くなるにつれて絶縁破壊耐圧は低くなっていくが、特に５ｎｍ未満となると、膜厚の減少に対するＳｉＮｘメンブレン１１３の絶縁破壊耐圧の減少率が大きくなる。その結果、ナノポア計測に支障をきたす恐れがある。また、ＳｉＮｘメンブレン１１３の膜厚が１００ｎｍより大きくなると、絶縁破壊に必要な電圧が１００Ｖを超えるため、絶縁破壊と同時に非常に大きなジュール熱が発生し、ＳｉＮｘメンブレン１１３の劣化が顕著となる。
　ここで、非特許文献７には、ｐＨ７．５、濃度１ＭのＫＣｌ水溶液中でＳｉＮｘメンブレンに２０Ｖを印加し、電極間を流れる電流が１０－６Ａになったら電圧印加を止めるという方法で、メンブレンに局所的な薄膜領域を形成し、その後第２の工程として、１０Ｖのパルス電圧印加と０．１Ｖ印加時の電流計測を繰り返すことで、その局所的な薄膜領域を貫通させるというナノポア形成方法が開示されている。非特許文献７の方法は、本実施形態と比較すると、第２の工程がある分、ナノポア形成までに掛かる時間が長くなってしまう。また、非特許文献７には、同じ条件で複数回実験したときのナノポアのｄｅｆｆのばらつきが大きく、ｄｅｆｆ＝０（つまりナノポアが形成されていない場合）も存在してしまうことが記載されている。
　非特許文献７に記載の方法でナノポア形成を試みた結果、ｄｅｆｆが約２０ｎｍから３０ｎｍの範囲外では、単一のナノポアの形成が難しいことが分かった。従って、本実施形態のナノポア形成方法は、非特許文献７に記載の方法と比較して、ナノポア形成に掛かる時間が少なく、また、本実施形態においては、形成されるナノポアの大きさのばらつきが小さく、形成できるナノポアの大きさの調整範囲も広いことが分かった。
　以上のように、本実施形態のナノポア形成方法によれば、ｐＨが１０以上の水溶液中でＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）に電圧を印加し（ＳｉＮｘメンブレンの膜厚が２０ｎｍ以上の場合は、ｐＨ１１より大きい水溶液中で電圧を印加し）、絶縁破壊させることによって、絶縁耐圧が高くナノポア計測に好適であるＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）に対し、単一のナノポアを安定して形成することができる。
［第２の実施形態］
　次に、第２の実施形態に係るナノポア形成方法について説明する。本実施形態は、図１のＳｉＮｘ膜１０１に他の膜が積層された積層膜を用いる点で、第１の実施形態と異なる。
　図９は、第２の実施形態に係る積層膜の構造を示す模式図である。図９（ａ）の場合、膜１１８がＳｉＮｘ膜１０１（１＜ｘ＜４／３）の上面に積層されている。図９（ｂ）の場合、膜１１９がＳｉＮｘ膜１０１の下面に積層されている。図９（ｃ）の場合、膜１２０及び１２１がＳｉＮｘ膜１０１の両面に積層されている。図９（ｄ）の場合、２つのＳｉＮｘ膜１０１の間に膜１２２が配置されている。
　膜１１８～１２２は、例えば、ＳｉＯ２膜、ＨｆＯ２膜、Ａｌ２Ｏ３膜、ＨｆＡｌＯｘ膜、ＺｒＡｌＯＸ膜、Ｔａ２Ｏ５膜、ＳｉＣ膜、ＳｉＣＮ膜、カーボン膜、組成比ｘが１＜ｘ＜４／３の範囲外のＳｉＮｘ膜、もしくはこれらの合成物から構成される。また、膜１１８～１２１は、例えば、表面への計測対象物の非特異吸着防止を目的としたＨＭＤＳ膜であってもよい。
　このように、ＳｉＮｘメンブレン（１＜ｘ＜４／３）とそれ以外の膜が積層されている場合にも、ｐＨが１０よりも小さい場合には、上述の絶縁破壊方式によりメンブレンに単一のナノポアを形成できない。しかしながら、水溶液のｐＨが１０以上（ＳｉＮｘメンブレン１１３の膜厚が２０ｎｍ以上の場合は、ｐＨ１１より大きい値）であれば、ＳｉＮｘ膜（１＜ｘ＜４／３）が含まれた積層膜に対して単一のナノポアを形成することができる。
［第３の実施形態］
　次に、第３の実施形態に係る単一のナノポア形成方法について説明する。本実施形態は、電極１０９及び１１０間に印加する電圧を、一定ではなく時間と共に変化させる点で、第１の実施形態と異なる。
　図１０は、第３の実施形態における電圧印加の例を示す模式図である。図１０に示す例においては、制御部１１２は、電極１０９及び１１０間に印加される電圧が段階的に上昇するように、電源（図示せず）を制御する。図１０中のｔｓは、ある値の電圧の印加時間を示し、Ｖｓは電圧の上昇量を示す。
　本実施形態に係るナノポア形成方法によれば、例えばｔｓを短くすることで、もしくはＶｓを大きくすることで、ナノポアが形成されるまでの時間を短くすることができる。また、本実施形態に係るナノポア形成方法は、使用するメンブレンが、どのくらいの電圧を何秒かければ絶縁破壊が起こるか不明な場合に有効である。なお、ナノポアの大きさの調整は、印加電圧を遮断するための閾値電流の調整によって可能である。
［第４の実施形態］
　次に、第４の実施形態に係る単一のナノポア形成方法について説明する。本実施形態において、制御部１１２は、電極１０９及び１１０間の電圧を測定するための電圧計（図示せず）をさらに備える。本実施形態のナノポア形成方法においては、電極１０９及び１１０の間に流れる電流が一定になるように電圧を制御しながら電極１０９及び１１０の間の電圧を測定し、絶縁破壊が起こった後、電極１０９及び１１０間の電圧が所定の閾値電圧値に到達したら、電極１０９及び１１０間の電流供給を停止する点で、第１の実施形態と異なる。
　図１１は、第４の実施形態における電圧印加の例を示す模式図である。図１１に示すように、制御部１１２は、電極１０９及び１１０の間に流れる電流が一定になるように電極１０９及び１１０間に電圧を印加しつつ電圧値を測定し、絶縁破壊後に急激に電極間電圧が下がり、所定の閾値電圧に到達した時点で、制御部１１２は、電極１０９及び１１０間の電流供給を停止する。このような方法によっても、ＳｉＮｘメンブレン１１３に単一のナノポアを形成することができる。
［第５の実施形態］
　次に、第５の実施形態に係るナノポア形成方法について説明する。本実施形態は、第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８のいずれか一方のみがｐＨ１０以上（ＳｉＮｘメンブレン１１３の厚みが２０ｎｍ以上の場合はｐＨが１１より大きい値）であり、もう一方はｐＨ１０未満である点で、第１の実施形態と異なる。このような構成においても、絶縁破壊方式により、単一のナノポアをＳｉＮｘメンブレン１１３に形成することができる。
　本実施形態において、負極となる電極に接する側の水溶液をｐＨ１０以上とすることができる。例えば、第１のチャンバ１０５にｐＨ７．５に調整した濃度１ＭのＫＣｌ水溶液を導入し、第２のチャンバ１０６にｐＨ１３に調整した濃度１ＭのＫＣｌ水溶液を導入して、電極１０９及び１１０に電位差を持たせてＳｉＮｘメンブレン１１３に電圧を印加することができる。この際、電極１０９が電極１１０に対して高い電位（例えば、電極１０９が２０Ｖ、電極１１０が０Ｖ）となるようにすると、電極１０９が電極１１０に対して低い電位となるように（例えば、電極１０９を－２０Ｖ、電極１１０を０Ｖ）することと比較して、ナノポアが形成されるまでの時間がより短くなる。
　理由を以下に示す。まず、水溶液中のＯＨ－は、電圧の印加により正極側に向かって移動し、ＳｉＮｘメンブレン１１３に対するＯＨ－の衝突が、ナノポアの形成に寄与していると考えられる。ｐＨが高い水溶液はＯＨ－を多く含むため、負極側にｐＨが高い水溶液を配置することで、電圧の印加により、正極側、すなわちＳｉＮｘメンブレン１１３の方へ向かうＯＨ－を多くすることができるので、ナノポアが形成されるまでの時間が短くなる。
　以上のように、本実施形態のナノポア形成方法においては、第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８のいずれか一方をｐＨ１０以上とし、他の一方の水溶液をｐＨ１０未満とする。このような構成を有することにより、本実施形態は、ナノポアが形成されるまでの時間を短縮することができる。
　また、上述のように、組成比ｘが１＜ｘ＜４／３のＳｉＮｘメンブレンは、第１の水溶液１０７のｐＨ及び第２の水溶液１０８のｐＨが１０よりも小さい場合、特にｐＨが７以上８以下の場合では、上記のような絶縁破壊方式では、ナノポアが形成されないという性質を有する。しかし、本実施形態のように、第１の水溶液１０７及び第２の水溶液１０８のいずれか一方をｐＨ１０以上とすることで、単一のナノポアを安定して形成することができる。
［第６の実施形態］
　第６の実施形態においては、第１～第５の実施形態に記載のナノポア形成方法により形成したナノポアを用いた分析方法について説明する。
　まず、第１～第５の実施形態のいずれかの方法でナノポアを形成した後、第１の水溶液１０７又は第２の水溶液１０８のいずれかを、計測対象物を含有する水溶液で置換する。その後、電極１０９及び１１０間に電圧を印加しながら電流値を測定すると、計測対象物がナノポアを通過した際に、電流値が大きく変化する。
　この電流値の変化の回数をカウントすることで、上記水溶液中に含まれる計測対象物の計数が可能である。また、電流値の変化の様子を観測することで、計測対象物の構造的、電気的な特徴を把握することができる。
　なお、計測対象物が２重螺旋構造のＤＮＡを含む場合、水溶液のｐＨが９．５以上となると、その構造が乖離し始める。また、ＤＮＡは酸性の水溶液中では分解が始まってしまう。そのため、計測対象物が２重螺旋構造のＤＮＡを含む場合、計測対象物が含有された水溶液のｐＨは９以下とすることが望ましく、さらに状況に応じてｐＨが７～８の範囲としてもよい。従って、第１～第５の実施形態の方法でナノポアを形成した後、ｐＨが１０以上である第１の水溶液１０７又は第２の水溶液１０８を、ｐＨが７～９、あるいはｐＨが７～８の水溶液で置換した後に、計測対象物を水溶液中に導入することができる。
　第１～第４の実施形態の方法でナノポアを形成する際には、第１のチャンバ１０５又は第２のチャンバ１０６中の第１の水溶液１０７又は第２の水溶液１０８に予め計測対象物を入れておくことで、ナノポアが形成された後に、第１のチャンバ１０５又は第２のチャンバ１０６の水溶液を置換することなく、そのままナノポア計測することができ、ナノポア形成からナノポア計測終了までの時間を短縮することができる。
　また、第５の実施形態の方法でナノポアを形成する際には、第１のチャンバ１０５又は第２のチャンバ１０６の一方の水溶液のｐＨを７～９、状況に応じてｐＨ７～８に調整しておくことで、その中に予め２重螺旋構造のＤＮＡを含む計測対象物を入れておいても、ＤＮＡが乖離することがない。従って、ナノポアが形成された後に、第１のチャンバ１０５又は第２のチャンバ１０６の水溶液を置換することなく、そのままナノポア計測することができ、ナノポア形成からナノポア計測終了までの時間を短縮することができる。
［変形例］
　本開示は、上述した実施例に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施例は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施例の一部を他の実施例の構成に置き換えることができる。また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることもできる。また、各実施例の構成の一部について、他の実施例の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。
１００…Ｓｉ基板
１０１…ＳｉＮｘ膜
１０２…ＳｉＯ２膜
１０３…ＳｉＮｘ膜
１０４…Ｏリング
１０５…第１のチャンバ
１０６…第２のチャンバ
１０７…第１の水溶液
１０８…第２の水溶液
１０９、１１０…電極
１１１…配線
１１２…制御部
１１３…ＳｉＮｘメンブレン
１１４、１１６…水溶液導入口
１１５、１１７…水溶液出口
１１８～１２２…膜

Claims (15)

  1. 　第１の水溶液及び第２の水溶液間にＳｉＮｘ膜を配置することと、
    　第１の電極を前記第１の水溶液に接触させ、第２の電極を前記第２の水溶液に接触させることと、
    　前記第１の電極及び前記第２の電極に電圧を印加することと、を含み、
    　前記ＳｉＮｘ膜は、組成比が１＜ｘ＜４／３であり、
    　前記第１の水溶液及び前記第２の水溶液の少なくともいずれか一方は、ｐＨ１０以上であることを特徴とするナノポア形成方法。
  2. 　請求項１のナノポア形成方法において、
    　前記第１の水溶液及び前記第２の水溶液の少なくともいずれか一方は、ｐＨ１１よりも大きいことを特徴とするナノポア形成方法。
  3. 　請求項１のナノポア形成方法において、
    　前記第１の電極及び前記第２の電極間を流れる電流が所定の閾値電流に到達した時点で、前記電圧の印加を停止することをさらに含むことを特徴とするナノポア形成方法。
  4. 　請求項１のナノポア形成方法において、
    　前記ＳｉＮｘ膜の膜密度は、２．８ｇ／ｃｍ３以上３．２ｇ／ｃｍ３以下であることを特徴とするナノポア形成方法。
  5. 　請求項１のナノポア形成方法において、
    　前記ＳｉＮｘ膜の応力は、６００Ｍｐａ以上であることを特徴とするナノポア形成方法。
  6. 　請求項１のナノポア形成方法において、
    　前記ＳｉＮｘ膜は、１／２００に希釈されたＨＦ水溶液によるエッチングレートが０．５ｎｍ／ｍｉｎ以下であることを特徴とするナノポア形成方法。
  7. 　請求項１のナノポア形成方法において、
    　前記ＳｉＮｘ膜の膜厚は、５ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることを特徴とするナノポア形成方法。
  8. 　請求項１のナノポア形成方法において、
    　前記第１の水溶液及び前記第２の水溶液は、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣｓＣｌのうちの少なくとも１種が溶解していることを特徴とするナノポア形成方法。
  9. 　請求項１のナノポア形成方法において、
    　前記第１の水溶液がｐＨ１０以上であり、前記第２の水溶液がｐＨ１０未満である場合、前記電圧は、前記第１の水溶液の電位が前記第２の水溶液の電位よりも低くなるように、前記第１の電極及び前記第２の電極に印加されることを特徴とするナノポア形成方法。
  10. 　請求項１のナノポア形成方法において、
    　前記ＳｉＮｘ膜の表面もしくは内部に、前記ＳｉＮｘ膜と異なる膜が積層されていることを特徴とするナノポア形成方法。
  11. 　ナノポアを用いて測定対象物を分析する方法であって、
    　第１の水溶液及び第２の水溶液間にＳｉＮｘ膜を配置することと、
    　第１の電極を前記第１の水溶液に接触させ、第２の電極を前記第２の水溶液に接触させることと、
    　前記第１の水溶液又は前記第２の水溶液に測定対象物を含有させることと、
    　前記第１の電極及び前記第２の電極に電圧を印加することにより、前記ＳｉＮｘ膜に前記ナノポアを形成することと、
    　前記測定対象物が前記ナノポアを通過する際の前記第１の電極及び前記第２の電極間の電流値を測定することで、前記測定対象物の分析を行なうことと、を含み、
    　前記ＳｉＮｘ膜は、組成比が１＜ｘ＜４／３であり、
    　前記第１の水溶液及び前記第２の水溶液の少なくともいずれか一方は、ｐＨ１０以上であることを特徴とする分析方法。
  12. 　請求項１１の分析方法において、
    　前記第１の水溶液がｐＨ１０以上であり、前記第２の水溶液がｐＨ１０未満である場合、前記測定対象物は、前記第２の水溶液に含有されることを特徴とする分析方法。
  13. 　ナノポアを用いて測定対象物を分析する方法であって、
    　第１の水溶液及び第２の水溶液間にＳｉＮｘ膜を配置することと、
    　第１の電極を前記第１の水溶液に接触させ、第２の電極を前記第２の水溶液に接触させることと、
    　前記第１の電極及び前記第２の電極に電圧を印加することにより、前記ＳｉＮｘ膜に前記ナノポアを形成することと、
    　前記ナノポアの形成後、前記第１の水溶液及び前記第２の水溶液の少なくとも一方を、前記測定対象物を含有した水溶液に置換することと、
    　前記測定対象物が前記ナノポアを通過する際の前記第１の電極及び前記第２の電極間の電流値を測定することで、前記測定対象物の分析を行なうことと、を含み、
    　前記ＳｉＮｘ膜は、組成比が１＜ｘ＜４／３であり、
    　前記第１の水溶液及び前記第２の水溶液の少なくともいずれか一方は、ｐＨ１０以上であることを特徴とする分析方法。
  14. 　第１の水溶液及び第２の水溶液間に膜を配置することと、
    　第１の電極を前記第１の水溶液に接触させ、第２の電極を前記第２の水溶液に接触させることと、
    　前記第１の電極及び前記第２の電極に電圧を印加することと、
    　前記第１の電極及び前記第２の電極間を流れる電流が所定の閾値電流に到達した時点で、前記電圧の印加を停止することと、を含み、
    　前記膜は、前記第１の水溶液のｐＨ及び前記第２の水溶液のｐＨが７以上８以下の場合には、単一のナノポアが形成されないという性質を有し、
    　前記第１の水溶液及び前記第２の水溶液の少なくともいずれか一方は、前記ナノポアの形成時においてｐＨ１０以上であることを特徴とするナノポア形成方法。
  15. 　請求項１４のナノポア形成方法において、
    　前記膜は、ＳｉＮｘ膜を含むことを特徴とするナノポア形成方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112079330A (zh) * 2020-09-07 2020-12-15 深圳市儒翰基因科技有限公司 固态纳米孔制造方法和包括固态纳米孔的传感器
WO2023276129A1 (ja) * 2021-07-01 2023-01-05 株式会社日立ハイテク ナノポア形成方法
JP7440375B2 (ja) 2020-08-19 2024-02-28 株式会社日立製作所 孔形成方法及び孔形成装置

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022134179A (ja) * 2021-03-03 2022-09-15 株式会社日立製作所 ポア形成方法、およびポア形成装置

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04120733A (ja) * 1990-09-12 1992-04-21 Casio Comput Co Ltd シリコン窒化膜の成膜方法
JP2000193672A (ja) * 1998-12-25 2000-07-14 Olympus Optical Co Ltd 走査型プロ―ブ顕微鏡用カンチレバ―およびその作製方法
JP2011199062A (ja) * 2010-03-19 2011-10-06 Fujitsu Ltd キャパシタ及び半導体装置
US20150060276A1 (en) * 2012-03-13 2015-03-05 Peking University Nanopore Control With Pressure and Voltage
WO2015097765A1 (ja) * 2013-12-25 2015-07-02 株式会社日立製作所 穴形成方法、測定装置及びチップセット
WO2016129111A1 (ja) * 2015-02-13 2016-08-18 株式会社日立製作所 メンブレンデバイスおよびその製造方法
US20180080072A1 (en) * 2014-12-31 2018-03-22 Coyote Bioscience Co., Ltd. Detection of nucleic acid molecules using nanopores and tags
JP2018187626A (ja) * 2012-05-07 2018-11-29 ジ ユニバーシティ オブ オタワ 高電界を用いたナノポアの作製

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001028343A (ja) * 1999-07-15 2001-01-30 Hitachi Ltd 薄膜処理方法及び液晶表示装置
EP3268736B1 (en) * 2015-03-12 2021-08-18 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Nanopore forming method and uses thereof
WO2016181465A1 (ja) 2015-05-11 2016-11-17 株式会社日立製作所 分析デバイス及び分析方法
US11035039B2 (en) 2015-07-31 2021-06-15 Versum Materials Us, Llc Compositions and methods for depositing silicon nitride films
EP3359705B1 (en) 2015-10-06 2021-12-08 Versum Materials US, LLC Methods for depositing a conformal metal or metalloid silicon nitride film
JP6579948B2 (ja) * 2015-12-24 2019-09-25 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体ポリマを分析するための測定試薬及び分析デバイス
GB2565954B (en) * 2016-06-10 2022-09-07 Hitachi High Tech Corp Method and apparatus for analyzing biomolecules
CN110121645B (zh) * 2017-01-10 2022-03-11 株式会社日立高新技术 使用纳米孔的电流测量装置和电流测量方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04120733A (ja) * 1990-09-12 1992-04-21 Casio Comput Co Ltd シリコン窒化膜の成膜方法
JP2000193672A (ja) * 1998-12-25 2000-07-14 Olympus Optical Co Ltd 走査型プロ―ブ顕微鏡用カンチレバ―およびその作製方法
JP2011199062A (ja) * 2010-03-19 2011-10-06 Fujitsu Ltd キャパシタ及び半導体装置
US20150060276A1 (en) * 2012-03-13 2015-03-05 Peking University Nanopore Control With Pressure and Voltage
JP2018187626A (ja) * 2012-05-07 2018-11-29 ジ ユニバーシティ オブ オタワ 高電界を用いたナノポアの作製
WO2015097765A1 (ja) * 2013-12-25 2015-07-02 株式会社日立製作所 穴形成方法、測定装置及びチップセット
US20180080072A1 (en) * 2014-12-31 2018-03-22 Coyote Bioscience Co., Ltd. Detection of nucleic acid molecules using nanopores and tags
WO2016129111A1 (ja) * 2015-02-13 2016-08-18 株式会社日立製作所 メンブレンデバイスおよびその製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATSUI, KAZUMA ET AL.: "Static charge outside chamber induces dielectric breakdown of solid- state nanopore membranes", JAPANESE JOURNAL OF APPLIED PHYSICS, vol. 57, no. 4, 19 March 2018 (2018-03-19), pages 046702.1 - 046702.8 *
YANAGI, ITARU ET AL.: "Two- step breakdown of a SiN membrane for nanopore fabrication: Formation of thin portion and penetration", THE 79TH JSAP AUTUMN MEETING , 2018 [PROCEEDINGS, 18 September 2018 (2018-09-18), pages 11 - 025 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7440375B2 (ja) 2020-08-19 2024-02-28 株式会社日立製作所 孔形成方法及び孔形成装置
CN112079330A (zh) * 2020-09-07 2020-12-15 深圳市儒翰基因科技有限公司 固态纳米孔制造方法和包括固态纳米孔的传感器
WO2023276129A1 (ja) * 2021-07-01 2023-01-05 株式会社日立ハイテク ナノポア形成方法

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