CN110121645B

CN110121645B - 使用纳米孔的电流测量装置和电流测量方法

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Publication number: CN110121645B
Application number: CN201780080594.3A
Authority: CN
Inventors: 松井一真; 后藤佑介; 赤堀玲奈; 横井崇秀; 藤冈满
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2017-01-10
Filing date: 2017-01-10
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2037-01-10
Also published as: JPWO2018131064A1; WO2018131064A1; GB201909581D0; GB2573433A; JP6877466B2; US20190353636A1; CN110121645A; GB2573433B; US11448638B2

Abstract

一种电流测量装置，具备第一槽(11)、第二槽(12)、具有连通第一槽和第二槽的纳米孔(2)且配置于第一槽与前述第二槽之间的薄膜(3)、设于第一槽的第一电极(13)以及设于第二槽的第二电极(14)，纳米孔的壁面具有防止填充于第一槽和/或第二槽的溶液(1)所含的离子的脱离吸附的防离子吸附结构(8)，通过在第一电极与第二电极之间施加电压来测量通过纳米孔的离子电流。

Description

使用纳米孔的电流测量装置和电流测量方法

技术领域

本发明涉及测量待测物通过纳米孔时的离子电流的电流测量装置和电流测量方法。

背景技术

在第二代DNA测序仪领域中，作为不进行延伸反应、荧光标记，直接电气性地测量DNA碱基序列的方法，纳米孔测序仪受到了关注。纳米孔测序仪中，对通过埋在薄膜内的纳米孔的离子电流进行测量。此时，如果DNA通过纳米孔，则由于构成DNA的碱基的不同，纳米孔的闭合方式会不同，电流值产生差异，因此能够确定碱基序列。

根据构成纳米孔的材料，纳米孔测序方式主要有生物纳米孔方式和固态纳米孔方式这两种。生物纳米孔方式是以埋入于脂质双层膜的修饰蛋白(耻垢分枝杆菌孔蛋白A(Mycobacterium smegmatis porin A，MspA)等)孔作为检测部，固态纳米孔方式是以在无机材料中加工而成的孔作为检测部。与生物纳米孔方式相比，固态纳米孔方式作为试剂依赖度和预处理工序少、读取成本低的方式而备受瞩目。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Bezrukov,S.M.,等,电流噪音揭示的开放蛋白离子通道中的质子化动力学和可电离位点的数量(Current noise reveals protonation kinetics andnumber of ionizable sites in an open protein ion channel),Phys.Rev.Lett.70(15),p.2352-2355(1993)。

非专利文献2：Morton,D.,等,基于耻垢分枝杆菌孔蛋白(MspA)的生物传感器的定制聚合物膜(Tailored Polymeric Membranes for Mycobacterium Smegmatis Porin A(MspA)Based Biosensors),J Mater Chem B Mater Biol Med.3(25),p.5080-5086(2015)。

发明内容

发明所要解决的课题

图26显示的是纳米孔测序时的理想电流波形。将无DNA通过时的离子电流称为基础电流，将DNA通过时的离子电流称为封闭电流。这里，如果基础电流包含噪声，则该噪声与封闭电流重叠，因此，正在进行针对测量基础电流阶段降低所含噪声的研究开发。

非专利文献1提到了基础电流所含的矩形波的噪声(以下称为随机电报噪声(Random telegraph noise，RTN))。图27为显示具有RTN的基础电流的实验结果的图。如果基础电流包含这样的RTN，则存在下述问题：作为矩形波噪声的RTN与作为矩形波信号的封闭电流重叠，产生信号分析错误。

非专利文献2提到了生物纳米孔方式中降低RTN的方法。表明生物纳米孔方式中，RTN由于脂质双层膜与修饰蛋白孔的相互作用而增大。可是，关于固态纳米孔方式中产生的RTN，其原因尚不明确，降低方法也不明确。

用于解决课题的方法

作为一个方式，本发明的电流测量装置具备第一槽、第二槽、具有使第一槽和第二槽连通的纳米孔且配置于第一槽与第二槽之间的薄膜、设于第一槽的第一电极以及设于第二槽的第二电极，纳米孔的壁面具有防止填充于第一槽和/或第二槽的溶液所含的离子的脱离吸附的防离子吸附结构，通过在第一电极与第二电极之间施加电压来测量通过纳米孔的离子电流。

此外，作为一个方式，本发明的电流测量方法具有：使设在薄膜中的纳米孔的壁面与导入至由该薄膜分隔的第一槽和第二槽中的至少一个槽内的作为含有第II族元素离子的溶液或酸性溶液的第一溶液接触的工序，以及在设于第一槽的第一电极与设于第二槽的第二电极之间施加电压而测量通过纳米孔的离子电流的工序。

发明效果

根据本发明，能够减少通过设于无机材料薄膜的纳米孔的离子电流的RTN。

通过以下实施方式的说明来明确上述以外的课题、构成和效果。

附图说明

图1为显示正在发生RTN的情形的示意图。

图2为显示降低RTN进行测量的一个实施例的示意图。

图3为显示正在发生RTN的情形的示意图。

图4为显示降低RTN进行测量的一个实施例的示意图。

图5为显示电流测量装置的构成例的截面示意图。

图6为显示使用电流测量装置的测量例的截面示意图。

图7为显示通过接触液体而形成防离子吸附结构的步骤的一个例子的截面示意图。

图8为显示形成防离子吸附结构的其他步骤的一个例子的截面示意图。

图9为显示用第二溶液替换第一溶液的方法的例子的说明图。

图10为显示电流测量装置的构成例的截面示意图。

图11为显示具备纳米孔阵列的电流测量装置的构成例的截面示意图。

图12为显示电流测量装置的构成例的概要图。

图13为显示电流测量装置的另一构成例的概要图。

图14为显示电流测量装置的另一构成例的示意图。

图15为显示含有第I族元素的溶液中基础电流的例子的图。

图16为显示由基础电流波形得到的功率谱密度的实验结果的图。

图17为显示用各种元素测量时的C_lf值的实验结果的图。

图18为显示改变pH进行测量时的C_lf值的实验结果的图。

图19为显示使纳米孔开孔时第一溶液中基础电流的例子的图。

图20为显示实施了RTN降低步骤时基础电流的实验结果的图。

图21为显示对第一溶液中的第II族元素浓度的下限进行验证的结果的图。

图22为显示改变施加电压的方向而测量基础电流时的实验结果的图。

图23为显示对将第一溶液仅配置于薄膜一侧时的噪声降低效果进行验证的结果的图。

图24为显示设置防阳离子吸附结构而测量生物聚合物的结果的图。

图25为显示实施了RTN防止步骤时基础电流的实验结果的图。

图26为显示理想的基础电流和封闭电流的图。

图27为显示具有RTN的基础电流的实验结果的图。

具体实施方式

对于用于说明本实施方式的全部图中具有同一功能的部件给予同一符号，尽可能省略其重复说明。此外，本发明不应理解为限定于以下所示实施方式记载的内容。本领域技术人员容易理解，在不脱离本发明的思想以及宗旨的范围内，可以对其具体构成进行改变。

为了使发明易于理解，存在附图等所示各构成的位置、大小、形状、范围等不表示实际的位置、大小、形状、范围等的情况。因此，本发明不一定限定于附图等中公开的位置、大小、形状、范围等。

本说明书中引用的出版物、专利公报直接构成本说明书的说明的一部分。

除非在上下文中特殊指明，否则，本说明书中用单数形式表示的构成要素均包括其复数形式。

以下的说明中，“第一溶液”是指含有第II族元素离子的溶液或酸性溶液。“第二溶液”是指含有第I族元素离子的溶液，或者第一溶液为pH5.5以下的酸性溶液的情况下，pH高于该值的溶液。此外，“第三溶液”是指电解质的种类、浓度与第一溶液不同的溶液，也可以是与第二溶液等同的溶液。

这里，首先进行RTN的产生机理的推定和验证，基于产生机理来研究解决方法。一般认为，RTN是由于在某2个以上的状态间迁移，形成对应于各状态的2个以上离散电流值而产生的噪声。例如，认为在半导体设备的电流测量中观察到的RTN是因为在层间绝缘膜中形成的膜缺陷处发生电子的结合或解离，形成对应于电子的结合状态和解离状态这两个状态的电流值，从而产生RTN。在上述缺陷的数量单一的情况下，一般认为迁移两个能级；在具有多个缺陷的情况下，包括多个这样的迁移两个能级的RTN，观察到迁移多个能级的的复合RTN形式。纳米孔测序仪中报告的RTN一般多为迁移多个能级的情况，相当于复合RTN。

图1为显示正在发生RTN的情形的示意图，图2为显示降低RTN进行测量的一个实施例的示意图。我们认为，如图1所示，对于薄膜3中制作的固态纳米孔(以下简单地称为纳米孔)2，溶液1中所含的质子、阳离子、阴离子等离子对于形成纳米孔时等产生的缺陷进行结合或解离，从而也确认到同样的现象。即，如果将结合或解离的离子记为X，将结合之前离子的脱离吸附点记为R，将两者结合的状态记为RX，则重复该结合或解离的状态的反应可以表示为

在产生这样的现象的表面发生上述RTN。因此如图2所示，通过在形成纳米孔2的薄膜的壁面和其附近设置防离子吸附结构8，能够不发生X的吸附，抑制RTN。上述假设的验证将通过后述实验结果进行说明。

更具体地对质子、阳离子、阴离子等离子的结合或解离的反应点进行说明，在纳米孔一般使用的SiN膜等中，表面被氧化，露出硅醇基等，该硅醇基就成为反应点。如图3所示，在这样的部位发生下述反应：

其中，M表示第I族元素。特别是由于溶液1中的质子(H⁺)和阳离子(M⁺)反复脱离吸附，从而产生RTN。

此时，如图4所示，一旦溶液1中含有容易吸附硅醇基的阳离子9而强烈吸附，则阳离子的脱离、吸附、置换等反应受到抑制，因此能够减少RTN。以这种方式，在离子脱离吸附的纳米孔壁面的反应点，预先吸附了选择系数大、容易吸附的离子，从而防止其他离子的脱离吸附，将这种表面结构称为防离子吸附结构。

容易吸附硅醇基的阳离子的顺序由选择系数来确定，因此，作为一个例子，如果一旦与含有第II族元素离子(M²⁺)的溶液或酸性溶液(第一溶液)接触，则纳米孔壁面被M²⁺或H⁺覆盖，这些阳离子9强烈吸附，因此能够抑制Li⁺、Na⁺、K⁺、Rb⁺、Cs⁺等其他阳离子种5、质子4的吸附，减少RTN。

以RTN的形式观测到的离子的脱离吸附在电流集中的纳米孔壁面和纳米孔附近发生，因而防离子吸附结构优选设在例如距离纳米孔壁面、纳米孔的距离为100nm以下的区域。防离子吸附结构需要根据形成薄膜和纳米孔的壁面的材质的不同，选择具有防阴离子吸附结构或防阳离子吸附结构或其双方。例如，在表面具有胺基等的情况下，具有置换阴离子的功能，使溶液中所含的Cl离子、Br离子等阴离子脱离吸附。另一方面，在表面具有羧基、硅醇基等的情况下，具有置换阳离子的功能，使溶液中所含的Cs离子、Na离子等阳离子脱离吸附。进一步，对于防阴离子吸附结构和防阳离子吸附结构，需要分别根据选择系数来选择成为防离子吸附结构的素材的元素，如果是防阳离子吸附结构，则选择第II族元素、H等，如果是防阴离子吸附结构，则为具有PO₄、SO₄、ClO₄、I、NO₃等的结构为好。

一般，纳米孔中使用的薄膜3的材料多使用氮化硅、氧化硅、氧化铪、二硫化钼、石墨烯，这些材料含有氧元素，具有表面氧化的性质，具有多数情况下表面带负电的性质(例如如果是氮化硅、氧化硅，则硅醇基容易带负电；如果是石墨烯，则羧基、羟基容易带负电)，因而多数情况下具有吸附阳离子的性质。因此，纳米孔中，一般防离子吸附结构优选选择防阳离子吸附结构。防阳离子吸附结构例如可以在薄膜材料中或者薄膜表面由含有第II族元素的碳酸钙、氧化钙、硅酸钙等形成，或者也可以通过使含有第II族元素的化合物等在SiN、SiO₂等薄膜表面析出、通过成矿作用对碳酸钙等进行化学修饰而形成。

更优选防阳离子吸附结构的形成方法为图4所示那样的、使含有容易吸附的阳离子9的第一溶液与形成有纳米孔的壁面接触的方法，可以使用该方法简便地改变纳米孔壁面的表面结构。此外，该方法能够不大幅改变纳米孔的厚度、孔径等而抑制RTN，能够不改变测量作为待测物的DNA等生物聚合物时的碱基分析能力等传感器特性地进行应用。

接下来，详细地对本实施例中使用的抑制RTN而进行测量的步骤进行说明。图5为显示根据本实施例的电流测量装置的构成例的截面示意图，显示用防离子吸附结构8覆盖薄膜3的形成有纳米孔2的壁面和其附近而测量电流的情形。

具有纳米孔2的薄膜3的一面与配置于第一槽11的溶液1接触，另一面与配置于第二槽12的溶液1接触，第一槽11和第二槽12被薄膜3隔开，通过纳米孔2连通。第一槽11、第二槽12中填充有含有电解质的溶液1，第一电极13和第二电极14分别设于第一槽11、第二槽12，第一电极13与第一槽11内的溶液接触，第二电极14与第二槽12内的溶液接触。通过利用电源装置15在第一电极13与第二电极14之间施加电压，能够利用电流计16测量通过纳米孔2的电流。

第一电极13、第二电极14等电极优选由能够与溶液1中的电解质进行电子转移反应(法拉第反应)的材质制作，典型地，为由卤化银或碱金属卤化银制作的电极。从电位稳定性和可靠性的观点出发，优选在电极中使用银/银氯化银。电极可以由成为极化电极的材质制作，例如可以由金、铂等制作。这种情况下，为了确保稳定的离子电流，优选在溶液中添加能够辅助电子转移反应的物质，例如铁***或亚铁***等。或者，优选将能够进行电子转移反应的物质，例如二茂铁类固定于该极化电极表面。

电极的结构可以是电极全部由前述材质构成，或者也可以是前述材质被覆于铜、铝等基材的表面。电极的形状没有特别限定，优选与溶液接触的表面积大的形状。电极与布线接合，从而向测定电路输送电信号。电源装置15可以以能够控制施加电压的方式与个人电脑17相连，对于电流计16，也可以通过与个人电脑等装置相连而构成将测量到的电流作为数据保存的测量***。电流计16还可以具有通过施加电压而对电极间流动的电流进行扩增的放大器和ADC(Analog to Digital Converter，模数转换器)。

本实施例中的纳米孔2设于无机材料薄膜3中，无机材料只要是能够通过半导体微细加工技术形成的材质即可，典型地，为氮化硅、氧化硅、氧化铪、二硫化钼、石墨烯等，优选为作为能够通过半导体工艺量产的Si的化合物的氮化硅、氧化硅等。不过，即使是测量DNA时的碱基分析能力高的石墨烯等膜，也会发生因离子的吸附解吸导致的RTN，因而本实施例也能够适用于这样的二维材料的膜。作为支撑薄膜3的结构10，例如使用以725μm厚度的硅支撑基板支撑厚度1μm以下、面积100μm²以下的SiN薄膜的设备。

薄膜3中设置的纳米孔2可以通过能够大量生产的半导体工艺形成，也可以利用TEM电子射线形成，以缩小孔径。更优选使用以能够高精度、迅速、廉价地形成孔径小的纳米孔2的方式，通过对薄膜3施加高电压，利用绝缘破坏而形成的纳米孔2。

本实施例中处理的RTN是由于原子半径1nm以下的阳离子的脱离吸附而产生的，因此是在测量通过阳离子尺寸100倍左右以下的、尺寸较小的纳米孔2的电流时更显著地表现的现象。因此，尤其在纳米孔2的直径为0.1nm(设计极限)以上100nm以下、长度为0.1nm(设计极限)以上100nm以下的情况下发挥RTN降低效果，在纳米孔2的直径为0.1nm(设计极限)以上10nm以下、长度为0.1nm(设计极限)以上50nm以下的情况下进一步显著地获得RTN降低效果，在纳米孔2的直径为0.1nm(设计极限)以上5nm以下、长度为0.1nm(设计极限)以上20nm以下的情况下，该降低效果变得更为显著。例如，纳米孔2的直径为0.1nm(设计极限)以上5nm以下、长度为0.1nm(设计极限)以上20nm以下的情况下，如果不使用本实施例的RTN抑制步骤而进行测量，则如后述实验结果(图15)所示，对于基础电流1nA，由于RTN而产生1nA的变动，因此使测量精度显著降低，变得极难作为传感器来使用。因此，本方法尤其应用在直径为0.1nm(设计极限)以上100nm以下、长度为0.1nm(设计极限)以上100nm以下的较小的纳米孔中是有效的。

此外，优选根据测量内容更严格地确定纳米孔的直径，例如，对直径10nm左右的生物聚合物、微珠等进行分析的情况下，为100nm以下，优选为50nm以下，具体地，大约为0.9nm以上10nm以下等。例如直径约为1.4nm的ssDNA(单链DNA)的分析中使用的纳米孔的直径优选为1.4nm-10nm左右，更优选为1.4nm-2.5nm左右。此外，例如直径约为2.6nm的dsDNA(双链DNA)的分析中使用的纳米孔的直径优选为3nm～10nm左右，更优选为3nm～5nm左右。

同样地，优选根据测量内容更严格地确定纳米孔的厚度，可以为0.1nm以上200nm以下，更优选为0.1nm以上100nm以下。作为待测物，对生物聚合物等进行分析的情况下，设为构成生物聚合物的单体单元的2倍以上、优选设为3倍以上、更优选设为5倍以上的大小。例如生物聚合物由核酸构成的情况下，厚度优选设为3个碱基以上的大小，例如约1nm以上。另一方面，从纳米孔传感器的分析能力的观点来看，为了掌握生物聚合物的形状、构成物质(如果是DNA，则为碱基的种类等)，优选纳米孔的厚度薄。例如为了测量生物聚合物大小1-10μm左右的链球菌等，掌握其连成直链状的形状，纳米孔的厚度优选设为200nm以下，更优选为100nm以下。进一步，为了对生物聚合物由核酸构成的DNA的碱基种类等进行分析，因为各碱基的间隔短至0.5nm左右，所以纳米孔的厚度优选设为30nm以下，更优选为10nm以下。由此，能够以高分析能力对生物聚合物的形状、构成物质等进行分析。此外，纳米孔的形状基本为圆形，也可以设为椭圆形、多边形。

作为使用本实施例的电流测量装置的测量例，有由流经纳米孔2的电流值鉴定溶液中所含的离子种类等，通过利用本方法抑制RTN，能够提高测定精度。图6为显示使用了本实施例的测量装置的测量例的截面示意图。图6显示的是使DNA等生物聚合物51通过纳米孔2而测量封闭电流的例子。

在这样的测量中，如果测量信号中含有RTN，则无法确定由RTN导致的变动和由封闭电流导致的变动的区别，因此，RTN降低效果尤其在封闭电流测量的情况下得以发挥。成为分析对象的生物聚合物51只要是通过纳米孔2时使电气特性，尤其是电阻值变化的对象物即可，是由核酸构成的。具体地，为RNA(单链RNA或双链RNA)、DNA(单链DNA或双链DNA)、PNA(肽核酸)、寡核苷酸、适配体以及它们的组合(例如杂合核酸)。

生物聚合物51可以是生物体中存在的物质，也可以是由生物体中存在的物质衍生出的物质。例如，含有自然界不存在的序列、构成要素的聚合物，例如也包括poly(A)、poly(T)等序列、人工合成的聚合物分子、通过PCR等核酸扩增技术制备的核酸、克隆至载体中的核酸等。这些生物聚合物的制备方法在本技术领域是众所周知的，本领域技术人员可以根据生物聚合物的种类选择适当的制备方法。本实施例中，生物聚合物的分析是指构成生物聚合物的核酸的特性分析。例如，是指构成生物聚合物的核酸单体的序列顺序分析(序列确定)、核酸长度的确定、单碱基多态性检测、生物聚合物数的确定、生物聚合物中的结构多态性(拷贝数多态性、***、缺失等)检测等。

在薄膜的纳米孔中设置防离子吸附结构而测量电流的步骤有多个，例如可以是下述步骤：在设置防离子吸附结构后，使溶液流入薄膜上下，测量电流。或者也可以是下述步骤：在通过半导体工艺等在薄膜中设置纳米孔后，通过使用液相中的化学反应等的表面修饰，设置防离子吸附结构，测量电流。或者也可以是下述步骤：使溶液流入薄膜上下，通过绝缘破坏使纳米孔开孔后，通过使用液相中的化学反应等的表面修饰，设置防离子吸附结构，测量电流。

防阳离子吸附结构的更优选形成方法是图4所示那样的使作为含有第II族元素离子的溶液或酸性溶液的第一溶液与具有纳米孔的壁面接触的方法。使用该方法，能够简便地改变纳米孔壁面的表面结构，形成防阳离子吸附结构。此外，该方法能够不大幅改变纳米孔的厚度、孔径等地抑制RTN，能够不改变测量DNA等生物聚合物时的碱基分析能力等传感器特性来进行应用。

图7为显示通过接触液体在纳米孔壁面形成防离子吸附结构的步骤的一个例子的截面示意图。最初，通过半导体工艺等在薄膜3中设置纳米孔2后，如图7(A)所示使用该薄膜3组装测量装置。接下来，可以如图7(B)所示在测量装置的第一槽11和第二槽12中导入作为含有第II族元素离子的溶液或酸性溶液的第一溶液21，使薄膜3的表面和纳米孔2的壁面与第一溶液21接触，形成防离子吸附结构8，其后例如在第一槽11中注入试样，测量流经纳米孔2的离子电流。以这种方式通过接触液体改变表面状态的情况下，通过对膜表面赋予能量，能够更有效地形成可以大幅改变膜表面状态的防离子吸附结构8，因此在接触液体后优选对膜施加1秒以上等时间、0.1V以上等的电压。

在纳米孔壁面中形成防阳离子吸附结构进行电流测量的更优选方法是将通过接触液体改变壁面表面状态的方法与通过绝缘破坏使纳米孔开孔的方法进行组合。图8为说明该电流测量方法的截面示意图。具体的测量步骤的一个例子是下述步骤：如图8(A)所示使第一溶液21充满薄膜3两侧的第一槽11和第二槽12后，如图8(B)所示，通过在第一电极13与第二电极14之间施加1[V]以上的电位差，通过绝缘破坏在薄膜3中使纳米孔2开孔，其后测量通过纳米孔2的离子电流。如果以这种方式进行绝缘破坏，则施加了更高的电压，因此能够改变膜表面状态并长时间维持，此外，能够同时进行纳米孔2的开孔和防阳离子吸附结构8的形成，因此能够更简便地制作具有纳米孔2和防阳离子吸附结构8的薄膜。

在上述提及的那样的步骤中，在通过对薄膜赋予施加电压带来的能量来改变表面状态、形成防离子吸附结构的情况下，表面状态改变时施加的电压的方向与测量通过纳米孔的离子电流时电压的方向优选是一致的。具体地，例如使图7(B)中第二电极14的电位以0[V]为基准时，相对于第一电极13施加正的电压+V₁[V]，从而对膜表面赋予能量的情况下，优选测量通过纳米孔2的离子电流时也对第一电极13施加正的电压+V₂[V]从而测量离子电流。

如图8(B)那样通过绝缘破坏在薄膜中使纳米孔开孔的情况也是同样的，将第二电极14的电位以0[V]为基准时，相对于第一电极13施加正的电压+V₁[V]从而通过绝缘破坏在薄膜中使纳米孔开孔的情况下，优选测量通过纳米孔2的离子电流时也对第一电极13施加正的电压+V₂[V]从而测量离子电流。

此外，也可以使电压的方向相反，将第一电极13设为负的电压，例如图7(B)中将第二电极14的电位以0[V]为基准时，相对于第一电极13施加负的电压－V₁[V]从而对膜表面赋予能量的情况下，优选测量通过纳米孔2的离子电流时也对第一电极13施加负的电压－V₂[V]从而测量离子电流。

以下，对于以这种方式改变表面状态时，即在形成防离子吸附结构时，使施加的电压的方向与测量通过纳米孔2的离子电流时电压的方向一致的理由进行说明。例如设为第一溶液21使用含有第II族元素的CaCl₂水溶液，将图7(B)中第二电极14的电位以0[V]为基准，相对于第一电极13施加正的电压+V₁[V]从而对膜表面赋予能量的情况下，在溶液中电离的带正电的Ca²⁺离子会被吸引至第二电极14侧，因此，在图7(B)显示的薄膜3的上侧，反应容易进行，与薄膜3的下侧相比，上侧的防阳离子吸附结构8的鲁棒性较高。

其后，在测量通过纳米孔2的离子电流时，假设对第一电极13施加负的电压－V₂[V]，则吸附于薄膜3上侧的Ca2+离子会被第一电极13吸引而脱离，从而防阳离子吸附结构8消失，RTN变得容易发生。此外，在对第一电极13施加负的电压－V₂[V]时，则在薄膜3下侧，溶液中所含的阳离子会被第一电极13侧强烈吸引，而薄膜3下侧的防阳离子吸附结构8的鲁棒性比薄膜3上侧低，因此RTN变得容易发生。因此，上述例子中，在测量通过纳米孔2的离子电流时，优选对第一电极13施加正的电压+V₂[V]。

作为第一溶液21的候选，为含有Mg、Ca、Sr、Ba等第II族元素的溶液或酸性溶液，前者是将第II族元素吸附于纳米孔2表面的方法，后者是将质子吸附于纳米孔2表面的方法。作为第一溶液21所含的阴离子，可以使用电离的阴离子类，优选根据与电极材质的相性来选定。例如，使用卤化银作为电极材质的情况下，优选使用I、Br、Cl等卤化物的离子作为阴离子。此外，阴离子也可以是谷氨酸离子等所代表的有机阴离子类。

吸附阳离子的情况下，优选使用一般认为在阳离子交换树脂等中选择系数大的阳离子，例如可以使用第II族元素离子等。其中，特别是如果选择Ca、Sr、Ba等作为选择系数大的阳离子，则更容易吸附于膜表面，使RTN降低。在溶液中含有这样的第II族元素的阳离子等的情况下，优选其浓度高。已经判明，下限值为10mM则可获得RTN降低效果，优选调节至10mM以上饱和浓度以下。

吸附质子的情况下，优选使用RTN降低效果好的pH5.5以下的酸性溶液，更优选调节至pH1等更低的pH。即，第一溶液21所含的[H⁺]浓度优选设为10^-5.5M以上饱和浓度以下。此时，可以是含有第II族元素的酸性溶液，或者也可以是碱金属元素和第II族元素均不含有的HCl等溶液。

另一方面，已知在使用第一溶液21降低RTN而测量DNA等生物聚合物的情况下，如果溶液中含有第II族元素，则会与DNA等生物聚合物强烈相互作用，Tm值大幅变动，存在下述可能性，即，形成立体结构，DNA等生物聚合物通过纳米孔的行为发生变化，或者无法通过纳米孔。此外，已知pH低的酸性溶液会引起DNA的脱嘌呤反应等，无法维持原来的结构。

因此，在使第一溶液与纳米孔壁面接触后，优选对第一溶液导入含有第I族元素离子的第二溶液，使第一溶液的浓度下降。以这种方式，即使导入新的第二溶液，因为第I族元素的选择系数小，所以也能够维持防阳离子吸附结构，防止第I族元素的吸附，维持抑制RTN的状态。第二溶液中所含的第I族元素的替代阳离子可以使用由有机物构成的有机阳离子类，例如也可以使用铵离子等所代表的电离的阳离子。

在第一溶液为pH5.5以下的酸性溶液的情况下，第二溶液必须比第一溶液pH高，可以为pH5.5以上。pH值的上限如下确定。测定溶液的pH值上限根据设备的耐受极限和成为测定对象的生物聚合物的耐受极限来确定。使用半导体纳米孔中典型使用的硅晶圆为基板，开始硅的蚀刻的pH14附近是设备的耐受极限。这样的蚀刻速度是已知的(Lloyd D.Clark,等，氢氧化铯(CsOH)：用于微加工硅的有用蚀刻剂(Cesium Hydroxide(CsOH):A UsefulEtchant for Micromachining Silicon),Technical Digest,Solid-State Sensor andActuator Workshop,IEEE,1988)。其中，经常作为薄膜材质采用的氮化硅即使在高碱性区域的pH也不会被蚀刻，但作为基础的硅或氧化硅却被蚀刻，因此优选设定14作为pH的上限值。即，第二溶液所含的[H⁺]浓度优选设为10^-14M以上10^-5.5M以下。对于其他半导体材质，根据其材质的设备耐受极限来同样地确定。

另一方面，确认到在溶液中的氢氧化钠(NaOH)为0.3M以上的情况下，生物聚合物(尤其是DNA等)的长链被切断。已知有浓度依赖性，在阳离子种类不同的氢氧化物溶液中也是同样的结果。在生物聚合物为DNA的情况下，优选为pH12以下。另外，如果测定溶液与大气接触，则会发生与大气中的二氧化碳反应、pH慢慢向酸性侧转变的现象。为了减少该二氧化碳的影响，可以将pH设定为比初始状态更高的碱性侧，或者提高pH调节剂的浓度。pH调节剂的浓度越高越好，优选为50mM以上，更优选为100mM以上。

此外，关于第二溶液中所含的第I族元素的种类，在使用水作为溶剂的情况下，例如已知1mol/kg氯化碱金属水溶液的导电率在25℃时为LiCl：7.188Sm^-1、NaCl：8.405Sm^-1、KCl：10.84Sm^-1、RbCl：11.04Sm^-1、CsCl：10.86Sm^-1，因而优选导电率高的K、Rb、Cs等，更优选为在水中的溶解度最大因此能够通过提高浓度来增加导电率的Cs。另一方面，担心有下述权衡：第I族元素中，K和Rb，尤其是Cs的选择系数大，RTN容易增加。不过，通过由第一溶液替换为含有Cs的第二溶液的步骤，能够兼顾生物聚合物分析时的信号量的扩增和RTN的降低。

关于离子浓度，从信噪比的观点出发，优选设置电解质浓度的下限。根据Venta,K.等在“固态纳米孔中短链单链DNA均聚物的分化(Differentiation of Short,Single-Stranded DNA Homopolymers in Solid-State Nanopores,)，ACS Nano,7,4629(2013)”中的记载，可见在含有1M离子的溶液下，碱基间的封闭电流量差为500pA左右。该封闭电流量差与纳米孔的导电率正相关，在使用水作为溶剂的情况下，已知如Ralph M.M.Smeets等在“离子传输的盐依赖性和穿过固态纳米孔的DNA易位(Salt Dependence of Ion Transportand DNA Translocation through Solid-State Nanopores),Nano Lett.6,89,2006”中公开的那样，导电率与电解质浓度大体呈线性应答直至1mM左右。因此，如果使电解质浓度减少1个数量级，则封闭电流量差也减少1个数量级。因此，碱基间的封闭电流量差按100mM为50pA、10mM为5pA、1mM为0.5pA逐渐减小。另一方面，作为测量时产生的高频电流噪声，大体分为来自设备的噪声和来自放大器的噪声两种，即使通过降低容量等对策降低来自设备的噪声，也难以降低至低于来自放大器的噪声。因此，根据来自放大器的噪声来定义电解质浓度的下限，如Adrian Balan等在“MHz带宽下固态纳米孔中DNA易位的信噪比性能的改善(Improving Signal-to-Noise Performance for DNA Translocation in Solid-StateNanopores at MHz Bandwidths),Nano Lett.14,7215,(2014)”中公开的那样，在经常使用的频带(5-10kHz)中，来自放大器的噪声约为1pA。因此，作为具有统计学意义的信噪比，往往定义为5，因而电解质浓度的下限必须为10mM。另一方面，不存在妨碍电解质浓度上限的要件，可以允许至饱和浓度。即，测定溶液的离子浓度为10mM以上、饱和浓度以下。

关于第二溶液的导入步骤，通过在含有第一溶液的状态下对薄膜赋予能量，能够使膜表面状态大幅改变，因此优选在对第一溶液中的薄膜施加0.1V以上等的电压后导入第二溶液。更优选为下述步骤：在与第一溶液接触的状态下对薄膜施加高电压，通过绝缘破坏使纳米孔开孔后，导入第二溶液，这种情况下，由于施加了更高的电压，因此能够有效地改变膜表面状态，形成防阳离子吸附结构，能够长时间抑制RTN。

在导入第二溶液时优选使第一溶液的浓度充分降低，优选导入第二溶液后的第一溶液的浓度为20％以下，更优选为10％以下，具体地，可以为0.01％-1％等。关于导入步骤的详细信息，例如使第一溶液的溶液量为100μL左右，如果导入1000μL左右的第二溶液，则能够充分使第一溶液的浓度降低。

图9为显示用第二溶液替换第一溶液的方法的例子的说明图。例如将溶液槽的容量设为100μL左右，如图9所示在溶液槽中设置注入口31a和排出口31b。在第一槽11和第二槽12中注入第一溶液21，使薄膜3和纳米孔2的壁面与第一溶液21接触而形成防阳离子吸附结构8后，利用移液器32等将第二溶液22由注入口31a导入。通过该操作可以使第一溶液21从排出口31b溢出，因此如果回收溢出的溶液，则能够更有效地降低第一溶液21的浓度。或者，如果在回收原本加入的100μL的溶液槽内的第一溶液21并减少至10μL左右后，导入1000μL左右第二溶液22，则能够更有效地降低第一溶液21的浓度。可以是将第一溶液21全部回收后使第二溶液22流入，这更能防止第一溶液21的残留。另一方面，在导入溶液时容易在纳米孔2附近产生气泡，因此使纳米孔2附近的第一溶液21残留而使第二溶液22流入更能够抑制导入第二溶液22时气泡的产生。此外，在溶液槽中可以具有能够测量浓度的检测器，从而能够判别第一溶液21是否充分替换为第二溶液22。

也可以是含有第II族元素离子或者酸性的第一溶液以无需大量准备的方式，仅充满第一槽11和第二槽12中的一个槽，另一槽充满电解质的种类、浓度与第一溶液21不同的第三溶液。以这种方式使第一溶液仅充满一侧的槽也能够通过与纳米孔的壁面接触来设置防阳离子吸附结构8，因此可获得降低RTN的效果。此外，如果设为这样的配置，则具有下述优点：尤其在使纳米孔阵列化的结构中，无需大量准备第一溶液，在溶液的价格为第一溶液＞第三溶液的情况下，能够低成本化。更优选第三溶液中含有第I族元素离子，使第一溶液和第三溶液与薄膜和纳米孔的壁面接触后，向第一溶液导入第二溶液。

图10为显示适合于实施上述步骤的测量装置的构成例的截面示意图。第一槽11中充满作为含有第II族元素离子的溶液或者酸性溶液的第一溶液21，第二槽12中充满含有第I族元素离子的第三溶液23。这种情况下，含有Cs等第I族元素离子的第二溶液22可以在形成防阳离子吸附结构8后仅导入至第一槽11。充满第二槽12的第三溶液23中已经含有第I族元素，因此无需导入新的第二溶液22。如果设为这样的构成，则仅需将溶液的导入机构设于充满第一溶液的第一槽11，因此装置构成变得简单。

更优选的步骤为下述步骤：第一槽11中充满作为含有第II族元素离子的溶液或者酸性溶液的第一溶液21，第二槽12中充满含有第I族元素离子的第三溶液23，在这种状态下，对薄膜3施加高电压而通过绝缘破坏设置纳米孔2后，仅在第一槽11中导入第二溶液22。这种情况下，对薄膜3施加了更高的电压，因此能够有效地改变膜表面状态，形成防阳离子吸附结构8，长时间抑制RTN。在以这种方式通过对膜赋予通过施加电压产生的能量、改变表面状态的情况下，优选使表面状态改变时施加的电压的方向与测量通过纳米孔2的离子电流时电压的方向一致。

举一个具体的测量步骤的例子，在通过绝缘破坏使纳米孔2开孔时，第一槽11中充满第一溶液21，第二槽12中充满第三溶液23，将设于第一槽11的第一电极13的电位以0[V]为基准相对于设于第二槽12的第二电极14施加正的电压+V₁[V]，从而对膜表面赋予能量。然后，在测量通过纳米孔2的离子电流时，优选向第一槽11导入第二溶液22，通过对第二电极14施加正的电压+V₂[V]来测量离子电流。此外，在得到生物聚合物的封闭电流时，第一槽11中优选含有生物聚合物51。

此外，更优选将使用第三溶液23的上述构成应用于使纳米孔2阵列化的结构中。图11为显示具备纳米孔阵列的测量装置的构成例的截面示意图。第一槽11和第二槽12被形成有多个纳米孔2的薄膜3隔开。第一槽11相对于多个纳米孔2构成1个公共槽。另一方面，第二槽12分隔为对应于各纳米孔的多个单个槽。公共槽中配置有1个第一电极(公共电极)13，各单个槽中各配置有1个单个电极。

认为纳米孔阵列中是下述构成：如图11所示，存在充满相对于薄膜3的各纳米孔2独立设置的各单个槽的溶液，和充满对于各纳米孔2而言公共的公共槽的溶液。此时，优选以分别充满各纳米孔2的溶液的电位互不相同的方式配置，各单个槽通过绝缘性的分隔壁41相互隔开。该绝缘性的分隔壁41的素材可以为固体、液体、气体中的任一种，例如为固体的情况下，用PMMA等树脂隔开，优选为耐化学性高的聚酰亚胺、特氟龙(注册商标)等。此外，在分隔壁41为液体的情况下且分别充满各纳米孔2的溶液的溶剂为水的情况下，例如可以使用不与水混合的有机溶剂等。此外，也可以通过将分隔壁41设为空气、N₂等气体来绝缘。

以这种方式设有公共溶液的构成与使充满纳米孔2上下的溶液全部为不同溶液的构成相比具有溶液的导入机构变得简单的优点，此外，还具有下述优点：仅通过只在公共溶液中含有生物聚合物，能够在全部纳米孔中同时取得生物聚合物的封闭电流。此时通过如图11所示构成那样，以充满被分隔壁41分隔成的单个槽的单个溶液为第三溶液23，以充满公共槽的公共溶液为第一溶液21，仅在第一溶液21中导入第二溶液22即可，在获得生物聚合物的封闭电流时，第二溶液22中优选含有生物聚合物。

此外，为了增大生物聚合物分析时的信号量，第三溶液所含的第I族元素优选为Cs。关于Cs离子浓度，从信噪比的观点出发，优选在电解质浓度中设置下限。本实施例的情况下，电解质浓度的下限必须为10mM。另一方面，不存在妨碍电解质浓度的上限的要因，可允许至饱和浓度。即，测定溶液的Cs离子浓度为10mM以上、饱和浓度以下。优选为0.1M以上饱和浓度以下。图11所示那样的纳米孔阵列结构中，具有能够飞跃性地提高测量通量的优点。该纳米孔阵列结构中，优选使纳米孔2有规律地排列。配置多个纳米孔的间隔可以根据所使用的电极、电气测定体***的能力、半导体工艺的加工极限等设为0.1μm～10μm，优选设为0.5μm～4μm。

接下来，详细地对用于实现包括上述提及的向第一溶液导入第二溶液的步骤的电流测量的装置的构成例进行说明。

图12为显示具有向第一溶液21导入第二溶液22的机构的测量装置的构成例的概要图。至少有在导入了第一溶液21的溶液槽中导入第二溶液22的注入口31a，以能够通过导入第二溶液22来将第一溶液21排出至外部的方式设有排出口31b为好。可以从排出口31b设有排出用流路102，进一步可以将排出用流路102连接至废液槽103。此外，注入用流路104可以连接于导入第二溶液22的注入口31a，注入用流路104优选连接于存储第二溶液22的第三槽105。

此外，优选具有输送第二溶液22的流体控制部101。具体地，流体控制部101可以是由泵送出的结构，也可以由阀(バルブ)、阀门(弁)构成。此外，流体控制部101可以设于注入用流路104、排出用流路102、第三槽105、废液槽103中的任一部件，例如可以是设于排出用流路102、废液槽103并使废液槽103、排出用流路102为负压而输送第二溶液22的机构。流体控制部101使溶液例如以10mL/s以下的流量流入。优选以100μL/s以下、更优选以10μL/s以下的比较缓慢的流入速度流入，从而防止薄膜3由于薄膜3附近的湍流、水压而损坏。该流体控制部101可以以能够在任意时刻将第二溶液22导入具有第一溶液21的溶液槽的方式与个人电脑17等连接而控制。

图12的例子中，充满薄膜3两侧的溶液均设为第一溶液21，因此导入第二溶液22的机构优选为导入薄膜3两侧的机构。更优选为下述构成：仅薄膜3一侧，例如第一槽11充满第一溶液21，第二槽12中充满第三溶液23。如果是该构成，则存在可以不具有在第三溶液23中导入第二溶液22的机构的优点，装置机构变得简单。各自充满的第三溶液23优选含有第I族元素，更优选该第I族元素为Cs。

图13为显示具有向第一溶液21导入第二溶液22的机构的测量装置的另一构成例的概要图。更优选如本例那样准备存储第一溶液21的第四槽106，具有与第二溶液22同样地导入第一溶液21的机构。

以下说明优选该构成的理由。例如存在下述情况：当本实施例的测量***由某使用者使用时，如果为图12所示构成，则在薄膜3两侧导入了溶液、薄膜3两侧的液槽充满溶液的状态下由销售者交付给使用者。可是，如果以薄膜3两侧的液槽充满溶液的状态出货或长时间放置，则由于充满薄膜3两侧的溶液的电位差，产生在薄膜3中开孔等问题(Matsui,K.,Yanagi,I.,Goto,Y.和Takeda,K.，通过电荷中和防止纳米孔膜的介电击穿(Prevention ofdielectric breakdown of nanopore membranes by charge neutralization).Sci.Rep.5,17819(2015))，或者产生由于充满的溶液而薄膜3被氧化或因蚀刻而开孔等问题。因此，更优选以如图示的例子那样仅在薄膜3的一侧导入了溶液的状态、任何槽中均未导入溶液的干燥状态来出货。这种情况下，将溶液导入薄膜3一侧或者两侧是由使用者来进行的。因此，通过如图13那样准备存储第一溶液21的第四槽106，能够实现由使用者在薄膜3两侧充满溶液的机构。第三槽105与注入用流路104之间和第四槽106与注入用流路104之间分别设有流体控制部101a、101b。

图14为显示本实施例的测量装置的另一构成例的示意图。具有纳米孔2的薄膜3优选纳米孔2如图14那样阵列化，以能够提高通量。单个充满设于第二槽12的多个单个槽的溶液可以设为第一溶液21等，但优选充满第三溶液23。如果是该构成，则可以没有在第三溶液23中导入第二溶液22的机构，装置机构变得简单。充满单个槽的第三溶液23优选含有第I族元素，更优选该第I族元素为Cs。

对在图14所示测量装置中导入溶液的步骤的一个例子进行说明。首先，从图14所示状态开始，使用流体控制部101a介由注入用流路104将第一溶液21从第四槽106导入至第一槽11。此时第一溶液21也可以导入至排出用流路102或废液槽103。通过该操作，薄膜3的纳米孔2与第一溶液21接触，在多个纳米孔2的壁面形成防离子吸附结构。这里，优选在配置于第一槽11的第一电极(公共电极)13与配置于第二槽12划分成的多个单个槽的多个第二电极(单个电极)14之间施加电压，从而有效地形成防离子吸附结构。其后，使用流体控制部101b，介由注入用流路104将第二溶液22从第三槽105导入至第一槽11。此时，将充满第一槽11的第一溶液21介由排出用流路102导入至废液槽103，第一槽11内部大部分被第二溶液22替换。此时，第二溶液22也可以导入至排出用流路102或废液槽103。

以上给出了具有第三槽105和第四槽106且具有阵列设备的测量装置中的溶液导入步骤，也可以例如在图12、图13所示测量装置中，通过与本步骤同样的步骤导入溶液。此外，使用图14说明的溶液导入步骤只是一个例子，不一定要通过上述步骤。例如导入第一溶液21、第二溶液22的量等不限定于上述量。此外，图14的例子中，在导入第一溶液21前，纳米孔2已经开孔，但更优选对不具有纳米孔2的薄膜3导入第一溶液，并通过绝缘破坏使纳米孔2开孔。

第一槽11、第二槽12、第三槽105、第四槽106、废液槽103等溶液槽的素材例如可以为PMMA，也可以由耐化学性优异的特氟龙等构成。关于各溶液槽的容量，例如使用100mL以下的槽。注入用流路104、排出用流路102等流路的素材例如可以为PMMA，也可以是耐化学性优异的特氟龙等。作为注入用流路104、排出用流路102，例如使用全长1m以下、直径1cm以下的部件。

第一溶液21、第二溶液22、第三溶液23等溶液可以与记载了使用步骤、使用量等的说明书一起提供。作为溶液的溶剂，可以使用能够使生物聚合物稳定分散且电极不会在溶剂中溶解、不会阻碍与电极的电子授受的溶剂。可列举例如水、醇类(甲醇、乙醇、异丙醇等)、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等。在以作为生物聚合物的核酸为测定对象的情况下，最优选的溶剂为水。各溶液可以是以液体充满各溶液槽的状态提供的形态，也可以是提供封入了各溶液的包装、液槽，根据需要对第一至第四槽进行补充、替换的形态。此外，各溶液可以以能够立刻使用的状态(液体)提供，也可以作为用于在使用时用适当的溶剂稀释的浓缩液提供，或者还可以是用于在使用时用适当的溶剂进行再构成的固形状态(例如粉末等)。这样的溶液的方式和制备是本领域技术人员能够理解的。

测量电流的***和导入溶液的***不一定必须设于同一装置内，例如可以作为分为电流测量装置和溶液导入装置的独立装置来提供。

以下给出验证本实施例的效果的实验例。

如前述那样，假定RTN来自在具有纳米孔的壁面和其附近处的离子的脱离吸附现象，例如，一般在纳米孔中使用的SiN薄膜中，认为RTN是来自由于阳离子在硅醇基表面的脱离吸附而产生的现象。已知一般硅醇基的选择系数为Li＜Na＜K＜Rb＜Cs＜第II族元素(Ca、Ba等)，认为Li等难以吸附于硅醇基的阳离子种会稳定于在从硅醇基表面脱离的状态，另一方面，Ca、Ba等容易吸附于硅醇基的阳离子种会稳定于在吸附于硅醇基表面的状态。

图15为显示含有第I族元素的溶液中基础电流的例子的图。图8所示测量装置的第一槽11和第二槽12中分别充满含有浓度1M的LiCl、NaCl、KCl、RbCl、CsCl的中性溶液，通过绝缘破坏在膜厚5～10nm左右的SiN薄膜中使1～10nm左右的纳米孔2开孔。其后，在第一电极13与第二电极14之间施加0.2V的电压，测量通过纳米孔而流动的离子电流。由图15的结果判明，RTN按Li＜Na＜K＜Rb＜Cs的关系增大，可见是支持本假设的。

而评价RTN时，有时不仅使用基础电流的波形，还使用功率谱密度。纳米孔测序仪中报告的RTN一般多为迁移多个能级的情况，相当于包括多个迁移两个能级的RTN的复合RTN。已知迁移两个能级的RTN的功率谱密度是在对数表示中按1/f²成比例衰减的洛伦兹型，被称为1/f²噪声。另一方面，复合RTN中观测到具有各种时间常数的1/f²噪声重合的状态，因此，功率谱密度成为多个洛伦兹曲线的重合，对数表示中按1/f^α(0＜α＜2，α≈1)成比例衰减，由下述式表示(Heerema S.J.等，石墨烯纳米孔中的1/f噪声(1/f noise ingraphene nanopores),Nanotech.26(7),074001(2015))。

[式1]

S(f)＝C_lf·I²/f^α

f：频率

S(f)：功率谱密度

C_lf：低频噪声系数

I：电流值

α：系数

此时，可以通过比较C_lf来评价噪声量，C_lf越大则意味着噪声越大。因此，通过由图15所示基础电流波形得到图16那样的功率谱密度，由功率谱密度算出C_lf＝S(1Hz)/I²，能够定量评价噪声量。

图17为显示用各种元素测量时的C_lf值的实验结果的图。图17中，使用调节至中性的1M LiCl、1M NaCl、1M KCl、1M RbCl、1M CsCl、1M MgCl₂、1M CaCl₂，通过绝缘破坏在SiN薄膜中使纳米孔开孔后，实验次数N＝3次，得到C_lf，比较其平均值。结果判明，对于第I族元素，C_lf为Li＜Na＜K＜Rb＜Cs，此外还判明，与Cs相比，Ca、Ba等第II族元素的C_lf减小。该结果支持我们对于RTN的假设。

此外还判明，DNA测量溶液一般使用调节至中性的含有第I族元素的溶液，尤其在含有的第I族元素为K、Rb、Cs时，导电率高，其中，Cs在水中的溶解度也高，能够通过增加浓度进一步提高导电率。然而，如图15、图17所示，判明测量溶液所含的RTN为Li＜Na＜K＜Rb＜Cs。即，确认到，以往的方法中，存在通过Cs实现信号量的增大则RTN增大的悖论，通过本实施例的RTN降低方法第一次得到了兼顾。

接下来，认为如果RTN产生机理的假设是正确的，则在pH低的条件下，饱和存在的H以吸附于硅醇基的状态而稳定化。因此，在1～8的范围内改变1M CsCl的pH，通过绝缘破坏在SiN薄膜中使纳米孔开孔后，实验次数N＝3次，得到C_lf，比较其平均值。图18为显示改变pH进行测量时的C_lf值的实验结果的图。如图18所示，判明与pH7～8左右的中性条件相比，C_lf在pH5.5以下大幅减少。该结果依然支持上述假设。

接下来，对RTN降低的条件进行汇总，由图17和图18可见，在第II族元素或酸性溶液中，RTN减少。图19为显示利用作为上述提及的第II族元素的1M MgCl₂、1M CaCl₂、1MSrCl₂、1M BaCl₂或酸性溶液的1M CsCl(pH1)使纳米孔开孔时的基础电流的例子的图。测定基础电流时的施加电压为0.3V。根据图19，由电流波形也能够确认到确实具有RTN降低效果。在第II族元素中进行比较，Mg在Mg、Ca、Sr、Ba四种中硅醇基的选择系数小，存在容易发生RTN的倾向，因此如果是Ca、Sr、Ba，则更能够减少RTN。此外，对于利用酸性溶液进一步降低RTN而言，如图18所示，存在pH越低则C_lf越小的倾向，优选在pH5.5以下的范围内选择更低的pH。

图20显示的是，介由图19所示含有第II族元素离子的溶液或酸性溶液对SiN膜施加高电压，通过绝缘破坏形成纳米孔后，导入1M CsCl(pH8)溶液之后的基础电流。测定基础电流时的施加电压为0.3V。如图20所示，在导入容易产生RTN的Cs后，RTN也受到抑制，因而判明将纳米孔壁面被第II族元素或H覆盖，能够防止Cs等其他阳离子种类的脱离吸附。通过以上的实验，在进行RTN产生机理验证的同时，判明了其抑制方法。

图21为显示在利用第II族元素降低了RTN的情况下，对第II族元素浓度的下限进行验证的结果的图。图21显示的是，在不含CaCl₂的1M CsCl、含有10mM CaCl₂的1M CsCl、含有100mM CaCl₂的1M CsCl、含有1M CaCl₂的1M CsCl这4个条件下，通过绝缘破坏使纳米孔开孔，其后导入不含CaCl₂的1M CsCl溶液后的基础电流。测定基础电流时的施加电压为0.3V。如由该结果可见，在溶液中含有第II族元素的情况下，如果含有10mM以上，则具有RTN抑制效果，第II族元素的浓度优选调节至10mM以上饱和浓度以下。

图22为显示对施加电压的方向进行验证的结果的图。图22(A)显示的是，介由CaCl₂溶液对SiN膜施加正的高电压(+5～10V)，通过绝缘破坏形成纳米孔后，施加正电压(+0.2V)和负电压(－0.2V)时的基础电流。这里，施加电压的方向是，正电压的情况下，与形成纳米孔时方向相同，负电压的情况下，与形成纳米孔时方向相反。如图22(A)所示，判明与施加负电压时相比，施加正电压更能抑制RTN的产生。此外，图22(B)显示的是，介由CaCl₂溶液对SiN膜施加正的高电压(+5～10V)，通过绝缘破坏形成纳米孔后，导入CsCl溶液，施加正电压(+0.2V)和负电压(－0.2V)时的基础电流。可见这种情况下，也可以通过使测量离子电流时的施加电压与形成纳米孔时方向相同来抑制RTN的产生。如由该结果可见，判明在形成了防离子吸附结构时，优选施加的电压的方向与测量通过纳米孔的离子电流时的电压施加方向一致。

图23为显示对于配置于薄膜两侧的2个溶液中将第一溶液仅配置于薄膜一侧时的噪声降低效果进行验证的结果的图。图23显示的是，使1M CaCl₂溶液充满一侧、使1M CsCl溶液充满另一侧，通过绝缘破坏使纳米孔开孔，在含有1M CaCl₂溶液的溶液槽中导入1MCsCl溶液而测量离子电流时的基础电流。如由该结果可见，判明即使第一溶液仅充满一侧的情况下，也能够通过与纳米孔壁面接触而设置防阳离子吸附结构8，因此可获得RTN降低效果。

与图23的实验同样地使第一溶液仅配置于薄膜一侧，且与图22的实验同样地使构成防离子吸附结构时施加电压的方向与测量通过纳米孔的离子电流时施加电压的方向一致，测量作为生物聚合物的ssDNA。图24为显示此时的实验结果的图。该实验中，通过绝缘破坏使纳米孔开孔时，溶液是负电压侧设为1M CaCl₂溶液、高电压侧(+5～10V)设为1M CsCl溶液。纳米孔开孔后，在含有1M CaCl₂溶液的溶液槽(施加负电压一侧)中导入含有DNA的1MCsCl溶液，在高电压侧施加+0.2V的电压。此时如图24所示，DNA带负电，因此向高电压侧电泳，通过纳米孔而产生封闭电流。如由该结果可见，判明使第一溶液仅充满一侧，且使构成防离子吸附结构时施加电压的方向与测量通过纳米孔的离子电流时施加电压的方向一致，则能够测量生物聚合物。

截止至图24的实验中，通过绝缘破坏形成纳米孔时使用第一溶液从而形成防离子吸附结构，抑制RTN。图25为显示通过使第一溶液与已经形成的纳米孔接触来形成防离子吸附结构，抑制RTN的结果的图。图25(A)为设置防离子吸附结构前在CsCl溶液中进行测量，发生RTN时的基础电流；图25(B)为导入CaCl₂溶液而形成防离子吸附结构，抑制了RTN时的基础电流；图25(C)为在再次导入CsCl溶液维持防离子吸附结构的状态下抑制了RTN时的基础电流。如由该结果可见，判明对于不具有防离子吸附结构的薄膜导入第一溶液，也能够构建防离子吸附结构，抑制RTN。

以上的实验例中，例示了膜表面具有硅醇基的SiN膜中的实验结果，当然，阳离子的脱离吸附现象不限定于SiN膜，即使膜的材质为石墨烯等时，在羧基表面等也同样地发生因阳离子的脱离吸附现象所导致的RTN，能够应用本方法。此外，以上的实验例中，通过与溶液接触来设置防阳离子吸附结构，但防阳离子吸附结构的形成方法例如也可以是在薄膜的材料中或者表面由含有第II族元素的碳酸钙、氧化钙、硅酸钙等形成，或者也可以使含有第II族元素的化合物等在SiN、SiO₂等薄膜表面析出、通过成矿作用对碳酸钙等进行化学修饰从而制作。

其中，本发明不限定于上述实施例，还包括各种变形例。例如，上述实施例是为了易于理解地说明本发明而详细地进行说明的例子，不限定为一定具备所说明的全部构成。此外，也可以将某实施例的一部分构成替换为其他实施例的构成，此外，还可以在某实施例的构成中加入其他实施例的构成。此外，还可以对于各实施例的一部分构成进行其他构成的追加、去除、替换。

符号说明

2 纳米孔，

3 薄膜，

8 防离子吸附结构，

11 第一槽，

12 第二槽，

13 第一电极，

14 第二电极，

15 电源装置，

21 第一溶液，

22 第二溶液，

23 第三溶液，

41 分隔壁，

51 生物聚合物，

101 流体控制部，

105 第三槽，

106 第四槽。

Claims

1.一种电流测量装置，

具备：

第一槽，

第二槽，

具有使所述第一槽与所述第二槽连通的纳米孔且配置于所述第一槽与所述第二槽之间的含Si薄膜，

设于所述第一槽的第一电极，以及

设于所述第二槽的第二电极；

所述纳米孔的壁面具有阻碍填充于所述第一槽和/或所述第二槽的溶液所含的第一离子的吸附且吸附了第二离子的防离子吸附结构；

通过在所述第一电极与所述第二电极之间施加电压来测量通过所述纳米孔的离子电流。

2.根据权利要求1所述的电流测量装置，所述防离子吸附结构防止所述溶液所含的第一离子中的阳离子的脱离吸附。

3.根据权利要求1所述的电流测量装置，所述纳米孔的直径为0.1nm以上100nm以下，长度为0.1nm以上100nm以下。

4.根据权利要求1所述的电流测量装置，在所述第一槽或所述第二槽中导入作为待测物的生物聚合物，测量该生物聚合物通过所述纳米孔时的离子电流的变化。

5.一种电流测量方法，具有：

使设在含Si薄膜中的纳米孔的壁面与导入至由该薄膜分隔的第一槽和第二槽中的至少一个槽内的、作为含有第II族元素离子的溶液或酸性溶液的第一溶液接触的工序，以及

在设于所述第一槽的第一电极与设于所述第二槽的第二电极之间施加电压而测量通过所述纳米孔的离子电流的工序。

6.根据权利要求5所述的电流测量方法，所述纳米孔是由于在所述第一电极与所述第二电极之间施加电压并且使所述薄膜绝缘破坏而开孔的纳米孔。

7.根据权利要求6所述的电流测量方法，在使所述纳米孔开孔时，所述第一槽和所述第二槽中的至少一个槽内充满所述第一溶液。

8.根据权利要求7所述的电流测量方法，通过在所述第一电极与所述第二电极之间施加电压并使所述薄膜绝缘破坏而使所述纳米孔开孔时的电压的方向与在所述第一电极与所述第二电极之间施加电压并测量通过所述纳米孔的电流时的电压的方向是一致的。

9.根据权利要求5所述的电流测量方法，所述第II族元素为Ca、Sr、Ba中的任一种。

10.根据权利要求5所述的电流测量方法，所述第II族元素离子浓度为10mM以上饱和浓度以下。

11.根据权利要求5所述的电流测量方法，在测量所述离子电流的工序之前，具有在导入有所述第一溶液的槽内导入含有第I族元素离子的第二溶液的工序。

12.根据权利要求11所述的电流测量方法，具有在导入所述第二溶液之前，在所述第一电极与所述第二电极之间施加电压的工序。

13.根据权利要求12所述的电流测量方法，导入所述第二溶液之前在所述第一电极与所述第二电极之间施加电压时的电压的方向与在所述第一电极与所述第二电极之间施加电压并测量通过所述纳米孔的电流时的电压的方向是一致的。

14.根据权利要求11所述的电流测量方法，所述第二溶液所含的第I族元素为Cs，其离子浓度为10mM以上饱和浓度以下。

15.根据权利要求5所述的电流测量方法，所述第一溶液导入至所述第一槽和所述第二槽中的一个槽内，另一槽内导入有含有第I族元素离子的第三溶液。

16.根据权利要求15所述的电流测量方法，所述第三溶液所含的第I族元素为Cs，其离子浓度为10mM以上饱和浓度以下。

17.根据权利要求5所述的电流测量方法，

所述纳米孔是通过在所述第一电极与所述第二电极之间施加电压并使所述薄膜绝缘破坏而开孔的纳米孔，

使所述纳米孔开孔时，所述第一槽和所述第二槽中的至少一个槽内充满作为所述第一溶液的酸性溶液，

在测量所述离子电流的工序之前，具有在含有所述第一溶液的液槽中导入[H⁺]浓度比所述第一溶液小且含有第I族元素离子的第二溶液的工序。

18.根据权利要求17所述的电流测量方法，所述第一溶液所含的[H⁺]浓度为10^-5.5M以上饱和浓度以下。

19.根据权利要求17所述的电流测量方法，所述第二溶液所含的[H⁺]浓度为10^-14M以上10^-5.5M以下。

20.根据权利要求1所述的电流测量装置，

所述第一槽和所述第二槽中充满作为含有第II族元素离子的溶液或酸性溶液的第一溶液，

并且，具有：

加入了含有第I族元素离子的第二溶液的第三槽，

使所述第三槽与所述第一槽或所述第二槽连接的注入用流路，以及

用于介由所述注入用流路将所述第二溶液从所述第三槽注入所述第一槽或所述第二槽的流体控制部。

21.根据权利要求1所述的电流测量装置，具有：

加入了含有第I族元素离子的第二溶液的第三槽，

加入了作为含有第II族元素离子的溶液或酸性溶液的第一溶液的第四槽，

使所述第三槽和所述第四槽与所述第一槽或所述第二槽连接的注入用流路，

用于介由所述注入用流路将所述第一溶液从所述第四槽注入所述第一槽或所述第二槽的第一流体控制部，以及

用于介由所述注入用流路将所述第二溶液从所述第三槽注入所述第一槽或所述第二槽的第二流体控制部。

22.根据权利要求1所述的电流测量装置，

所述薄膜具有多个所述纳米孔，

所述第二槽被分隔成分别对应于多个所述纳米孔的多个单个槽，

所述多个单个槽分别设有所述第二电极，

所述多个单个槽中充满含有第I族元素离子的第三溶液，

并且，具有：

使所述第四槽与所述第一槽连接的注入用流路，以及

用于介由所述注入用流路将所述第一溶液从所述第四槽注入所述第一槽的流体控制部。