WO2019219841A1 - Mikrofluidische vorrichtung und verfahren zur nutzung desselben zur trennung, aufreinigung und konzentration von komponenten von fluidischen medien - Google Patents

Mikrofluidische vorrichtung und verfahren zur nutzung desselben zur trennung, aufreinigung und konzentration von komponenten von fluidischen medien Download PDF

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Claudia Gärtner
Richard Klemm
Christian Moche
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the invention relates to a microfluidic device and to a method for using the same for the separation, purification and concentration of components of fluidic media.
  • the invention relates to a microfluidic device and a method for the preparation of blood samples and a method for purifying nucleic acids and method for combining said methods with a detection method of the biological ingredients.
  • Separating, purifying, fractionating and concentrating components from liquid or gaseous media, and splitting individual constituents followed by separating, refining, fractionating and concentrating components is conventionally associated with numerous manipulations.
  • the main technologies are centrifugation and column- or particle-based techniques.
  • the sample to be separated is applied to liquid density gradients and different fractions are obtained corresponding to the size.
  • Long-term handling steps and centrifugation, often also ultracentrifugation, are disturbing here.
  • a connection of sample components to porous surfaces which serve as sheu len.
  • centrifugation the sample is driven through this column, manual washing steps with repeated centrifugation steps make this process consuming.
  • Pressure-driven columns with specific or semi-specific binding of target molecules or fractionation according to size of the target components and their subsequent elution via pressure-driven liquid inflow are further techniques.
  • the object of the invention is therefore a microfluidic device that is easy to adjust forth and is adaptable to both the sample volumes to be processed as well as the pre and subsequent processes. In addition, it is an object to provide a method for their use.
  • the present invention describes a microfluidic device with a fluidic channel system with at least one fluidic interface.
  • the microfluidic device is designed as a closed unit and has at least one inserted functional element, which is preferably designed as a porous functional element. Through the porousgnacsele ment a sample and / or medium can be performed. Subsequently, the functional element can be used to direct further liquids or gases. That the functional element can sequentially perform various tasks in the processing of fluids in a microfluidic system.
  • the microfluidic device has at least one structured component which forms the main or basic component of the microfluidic device.
  • the structured component is usually formed as a flat and / or often cuboid body, which is preferably produced by injection molding before.
  • this structured component structures are introduced.
  • this includes a microfluidic channel system.
  • the channels or part thereof are preferably introduced on the top and / or bottom of the structured component.
  • the structured component may further comprise liquid reservoirs, channel tapers, valves, switch manifolds, venting membranes, chambers, cavities, and / or reaction cavities either incorporated in the structured component or inserted into cavities provided therefor.
  • the microfluidic device also has at least one component applied to the structured component.
  • the component can also be designed and designated as a cover plate. This component is placed on the top and / or bottom of the structured component.
  • the component may be formed a partially transparent or partially light-tight plate.
  • the component may also be formed as a foil, which on the top and / or bottom, for. glued, bonded, pressed or welded, in order to close the microfluidic structures fluid-tight and, if necessary, gas-tight.
  • a film is preferably made of synthetic material and has a very small thickness compared to the width and catches, which allows high flexibility. A preferred thickness is less than / equal to 1mm here.
  • a plate against has a lower flexibility, since the thickness is greater compared to the width and catches. therefore plates are preferably used with a thickness of greater than or equal than 1mm.
  • the microfluidic device according to the invention contains at least one porous functional element.
  • the at least one functional element can be realized for example by a filter, a membrane, a frit, or a functional paper or similar elements.
  • the one or more functional elements may contain reagents, ie the one or more filters, membranes, frits, functional papers may contain reagents or reagents may be applied thereto. All these examples of functional elements are at least partially passable for fluids. They can be membranes and / or filters for size exclusion, such as laser-structured membranes (track etch) with well-defined pore size, silicon sieve, filter paper with a coarse mesh.
  • Functional elements that use the size exclusion and / or connection to the surface of the functional element are various elements such as porous three-dimensional structures such as frits, silicon membranes, silica membranes, three-dimensionally aggregated particles, filter mats made of various materials, silica mats, PET filters, thin-layer chromatography material or plasma All of these functional elements may additionally be provided with reagents to implement a specific binding of target molecules to these functional elements and to realize a targeted detachment of the target molecules from functional elements.
  • the microfluidic device has at least one fluidic interface.
  • two fluidic interfaces are arranged on the microfluidic device.
  • the at least one fluidic interface can be arranged vertically, horizontally and / or at any angle to the microfluidic device and the media addition and / or the admission with positive or negative pressure, as well as simply for venting serve.
  • microfluidic device can be closed by using at least one integrated valve, at least one external switch or at least one valve or at least one cap.
  • microfluidic device used in particular for the separation, purification, fractionation and concentration of components of a supplied medium or a sample.
  • microfluidic device comprise a plurality of functional elements and may optionally also have one or more fluid reservoirs.
  • the microfluidic device is operated by a corresponding method, whereby in addition to separation, purification, fractionation and concentration of components, intervening reaction steps can be carried out in order to obtain, separate and concentrate desired target components.
  • a particularly advantageous embodiment of the microfluidic device is designed as a functional unit or as a microfluidic system.
  • microfluidic device can be done both manually and by means of simp cher devices or devices which are coupled to the microfluidic device or closed to, for example, to supply pressure or process media.
  • a method for the purification of nucleic acids in which a sample is supplied via the fluidic interface (4.1) and in a Christskam number (6) is mixed with reagents. The cells in the sample then lyse. The sample is then passed over a functional element, while the output (4.2) is closed and unwanted molecules either directly with the sample in a waste reservoir (7) or by flushing the functional element (5) with reagents from the liquid reservoirs (8) while the target molecules, nucleic acids, remain on the functional element (5) and are first detached from one of the liquid reservoirs (8) by a special reagent, the fluid outlet (4.3) at the waste reservoir (7) being closed in advance and the outlet (4.2) open and the nucleic acids obtained can be removed from the fluidic system via the now open outlet (4.2).
  • the nucleic acids are DNA or RNA.
  • a sample is supplied via the fluidic interface (4.1) and filtered via a functional element (5), so that the cells remain behind and undesired components enter the waste reservoir (7), whose fluidic interface (4.3) is opened, which is made possible by closing the fluidic interfaces (4.2 and 4.3) behind the second functional element (5) in the direction of flow, and then by contacting the cells with reagents in the cavity (6) above the first functional element.
  • a sample is preferably supplied via the fluidic interface (4.1) and filtered via a functional element (5), so that the cells remain behind and unwanted components enter the waste reservoir (7) whose fluidic interface (4.3) is opened, which is made possible by closing the fluidic interfaces (4.2 and 4.3) behind the second functional element (5) in the direction of flow, and then by contacting the cells with reagents in the cavity (6) above the first functional element.
  • the purified nucleic acid can be subjected to subsequent amplification and detection.
  • the purified nucleic acid may be an RNA and then first subjected to a Rever sen transcription and then an amplification and detection.
  • the purified nucleic acid may be a DNA and amplified and detected by qPCR and / or amplified and detected by isothermal amplification.
  • the purified nucleic acid may be DNA that is pre-amplified in a first chamber (20) by nonspecific PCR and subsequently detected in a specific qPCR.
  • the purified nucleic acid may be RNA that is subjected to a Rever sen transcription in a first chamber (20) and in a second chamber (20) amplified and detected by qPCR.
  • the purified nucleic acid may be RNA which is subjected to both reverse transcription and qPCR (one-step RT-PCR) in a chamber (20).
  • qPCR chambers (20) may be arranged to run the qPCR in parallel PCR chambers.
  • the qPCR can be a duplex PCR with internal control amplification and / or the qPCR can be a multiplex PCR with internal control amplification.
  • FIG. 1a shows a first embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 1b shows the first embodiment according to FIG. 1a in a sectional view along a not-drawn finie from the entrance to the exit;
  • FIG. 2a shows a second embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 2b shows the second embodiment according to FIG. 2a in a sectional illustration along a not-shown finie from the entrance to the exit;
  • FIG. 3a shows a third embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 3b shows the third embodiment according to FIG. 3a in a sectional view along the fin 3b
  • FIG. 3c shows the third embodiment according to FIG. 3a in a sectional view along the fin 3cd
  • FIG. 3d shows the third embodiment with caps according to FIG. 3a in a sectional representation along the fin 3 cd
  • FIG. 3b shows the third embodiment according to FIG. 3a in a sectional view along the fin 3b
  • FIG. 3c shows the third embodiment according to FIG. 3a in a sectional view along the fin 3cd
  • FIG. 3d shows the third embodiment with caps according to FIG. 3a in a sectional representation along the fin 3 cd
  • FIG. 4a shows a fourth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 4b shows the fourth embodiment according to FIG. 4a in a sectional view along the fin 4b
  • FIG. 4c shows the fourth embodiment according to FIG. 4a in a sectional view along the fin 4cd
  • FIG. 4d shows the fourth embodiment with caps according to FIG. 4a in a sectional view along the fin 4cd
  • FIG. 5a shows a fifth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 5b shows the fifth embodiment according to FIG. 5a in a sectional view along the line 5b
  • FIG. 5c shows the fifth embodiment according to FIG. 5a in a sectional view along the line 5cd
  • FIG. 5d shows the fifth embodiment with caps according to FIG. 5a in a sectional view along the line 4cd
  • FIG. 5b shows the fifth embodiment according to FIG. 5a in a sectional view along the line 5b
  • FIG. 5c shows the fifth embodiment according to FIG. 5a in a sectional view along the line 5cd
  • FIG. 5d shows the fifth embodiment with caps according to FIG. 5a in a sectional view along the line 4cd
  • FIG. 5e shows the fifth embodiment with caps according to FIG. 5a in a sectional view along the line 5e;
  • FIG. 6a a sixth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 6b the sixth embodiment of Figure 6a in a sectional view along the not a drawn line from the entrance to the exit.
  • FIG. 6c shows the sixth embodiment with caps according to FIG. 6a in a sectional view along the non-drawn line from the input to the output;
  • FIG. 7a a seventh embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 7b the seventh embodiment of Figure 7a in a sectional view along the not a drawn Finie by the liquid reservoirs.
  • FIG. 7c shows the seventh embodiment with caps according to FIG. 7a in a sectional representation along the not-shown finie from the input to the output;
  • FIG. 8b the eighth embodiment of Figure 8a in a sectional view taken along the not-recorded Finie by the liquid reservoirs.
  • FIG. 8c shows the eighth embodiment with caps according to FIG. 8a in a sectional illustration along the not-shown finie from the input to the output;
  • FIG. 9a a ninth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 9b the ninth embodiment of Figure 9a in a sectional view along the not a drawn Finie by the liquid reservoirs.
  • FIG. 9c shows the ninth embodiment with caps according to FIG. 9a in a sectional view along the not-shown finie from the entrance to the exit;
  • FIG. 10a shows a tenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 10 b shows the tenth embodiment according to FIG. 10 a in a sectional view along the not-shown fin through the liquid reservoirs;
  • FIG. 10c shows the tenth embodiment with caps according to FIG. 10a in a sectional view along the not-shown finie from the entrance to the exit;
  • FIG. 1 a shows an eleventh embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 1b shows the eleventh embodiment according to FIG. 1a in a sectional view along the not-drawn line through the liquid reservoirs
  • FIG. 1 c shows the eleventh embodiment with caps according to FIG. 1 a in a sectional view along the non-drawn line from the entrance to the exit;
  • FIG. 12 a shows a twelfth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 13 a shows a thirteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 13b shows a thirteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in cross-section 1;
  • FIG. 13c shows a fourteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in cross-section 2;
  • FIG. 14 a shows a fourteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 14b shows a fourteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in cross-section 1;
  • FIG. 14 c shows a fourteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in cross-section 2;
  • 15a shows a fifteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 15b shows a fifteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in cross-section 1;
  • 15c shows a fourteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in cross-section 2;
  • FIG. 16 a shows a sixteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 16b shows a sixteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in cross-section 1;
  • FIG. 17 a shows a seventeenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 17 b shows a seventeenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in cross-section 1;
  • FIG. 18 a shows an eighteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIG. 19 shows a nineteenth embodiment of the microfluidic device according to the invention in a plan view
  • FIGS. 1 and 2 The basic version of the microfluidic device is shown in FIGS. 1 and 2.
  • the microfluidic device has two fluidic interfaces 4.1. and 4.2.
  • a structured component 1 is designed as a planar or cuboidal component and has its own NEN sides or end faces two fluidic interfaces on 4.1. and 4.2. on.
  • a fluidic channel system 2 is integrated or incorporated into the structured component 1 tur.
  • Another component 3 closes an upper side of the structured component 1, so that the fluidic channel system 2 and the fluidic structures are liquid-tight and, when gases are used as the medium, also sealed in a gastight manner.
  • a functional element 5, preferably a porous functional element 5, is arranged, which is located on or in the structured component 1.
  • the porous functional element 5 can be flowed through both vertically, see FIG. 1b, and horizontally, see FIG. 2b. A bidirectional flow in both directions is possible.
  • the functional element 5 can either be directly connected to the structured component 1 via the manufacturing process of the structured component 1, e.g. in the injection molding process by inserting the functional element, be integrated or subsequently introduced into the micro fluidic device.
  • the functional element 5 has been inserted into a cavity 6 and is suspended from above, i.
  • the channel 2 extends first in extension of the fluidic interface 4.1, to then continue to run on the underside of the structured component 1. Again, the channel 2 is closed by a further component 3. On the underside of the structured component 1, a cavity is formed, in which the functional element 5 is inserted or is, so that it can be flowed through horizontally and the opposite fluidic interface 4.2 flows to be issued there.
  • the method for using the microfluidic device is such that a sample is introduced via the fluidic interface 4.1, with some predetermined constituents of the sample remaining in the functional element 5. This is achieved via the predetermined particle size of the functional element 5. Subsequently, the functional element 5 can be rinsed out, wherein different reagents or fragrances are rinsed through the functional element 5. Thereupon, the target component can be flushed out of the functional element 5, which can be done by special reagents, pressure, temperature or a combination of these methods.
  • a reprinting with a displacement medium particularly advantageous here are e.g. Oils or higher viscous media than the previous fluids, wherein the same fluids are used, after the detachment of the target component from the functional element 5, to achieve a quantitative flushing of the target component.
  • the target component in the eluate obtained can not only be purified but also enriched in comparison with the original medium. Flow through with different media thus also allows fractionation, i. the elution under defenceli cher components of the original medium from the functional element. 5
  • FIGS. 3a-3d Another embodiment of the microfluidic device is shown in FIGS. 3a-3d.
  • the micro fluidic device has been supplemented with reagent reservoirs 8.
  • the structural Component 1 includes a fluidic channel system 2, and the further component 3 on the underside, that the fluidic structures liquid-tight and gas-tight vesch drownt when using gases as a medium and a functional element 5, preferably a porous functional element, which is on or in the structured component 1, as well as three fluidic interfaces 4.1, 4.2, 4.3, the functional element 5 being supplied both by the sample (medium) supplied via the fluidic interface 4.1 located at the top and by the reagents stored in the reagent reservoirs 8 can be flowed through in any order and by selectively closing the Ver fluidic interfaces 4.1, 4.2 and 4.3 with caps 11 (see Fig.
  • the reagent reservoirs 8 may be formed as blisters, wherein pre-defined liquids are kept in encapsulated containers. That is, the three reagent reservoirs 8 may contain different types of liquids and / or different amounts thereof in order to be able to add them specifically for the treatment of the sample.
  • the press on pressing the blister (A press) to open the encapsulated container, so that the liquid can be safely supplied to the channel system 2 and the functional element 5.
  • the liquid can be kept in a waste chamber 7 of the micro-fluidic device or guided through the fluidic interface 4.3 at the top to the outside, wherein by closing the fluidic interfaces 4.1 and 4.3, each with a cap 11, the liquid speed via the fluidic interface 4.2 , which is then opened, can be removed.
  • a target liquid can be removed, whereas when applying the sample through the fluidi cal interface 4.1 this is then closed by a cap.
  • the functional element 5 may either be directly connected to the structured component 1 during the manufacturing process of the structured component, e.g. in the injection molding process by inserting the functional element 5, be integrated or introduced later.
  • the method for using the microfluidic device is such that the sample is introduced via the fluidic interface 4.1, the fluidic interface 4.1 is closed after the sample has been introduced, and the fluidic interface 4.3 for removing the waste is closed by a cap 11 , Components of the sample remain in the functional element 5. Thereafter, the functional element 5 can be rinsed out, in which case various reagents or fragrances are rinsed through the functional element 5. In the next step, the target component is rinsed out of the functional element 5, which can be done by special reagents, pressure, tempera ture or a combination of these methods, wherein the unwanted fractions are stored either in the waste chamber 7 or from the microfluidic device via the fluidic interface 4.3 be rinsed out.
  • Target components are then obtained via the fluidic interface 4.2, wherein a reprinting with a displacer after the detachment of the target component from the functional element 5 is particularly advantageous in order to obtain a quantitative flushing out of the target component, so that the target component in the resulting eluate not via this method only purified, but can also be enriched in comparison to the original medium.
  • the flow through with different media also allows fractionation, ie the elution of different components of the original medium from the functional element.
  • the microfluidic device may have valves in the fluidic channel system 2, which may be manufacturedstal tet as diaphragm valves, rotary valves or other valves, and serve the channel system 2 or parts thereof to selectively close, for example.
  • the microfluidic device can have a preceding reaction space 6, as in FIG. Reference source could not be found.
  • the structured component 1 a fluidic channel system 2, which is arranged on the underside of the structured component 1 tur.
  • the underside of the structured component 1 and the fluidic channel system 2 introduced therein is liquid-tight with the further component 3 and also gas-tight when the gas is used as a medium.
  • the microfluidic device according to FIGS. 4a-4d has a plurality of reagent reservoirs 8, of which at least one can provide a liquid supply in front of the cavity 6. Likewise, a liquid supply to the cavity 6 but before the functional element 5 is possible, which is not shown here. Three further reagent reservoirs 8 are arranged to allow fluid or reagent delivery to the functional element 5, i. the reagent reservoirs 8 deliver their media into the functional element 5. The addition can be delayed.
  • the microfluidic device according to FIG. 4a-4d has further fluidic interfaces on which a fluidic interface 4.3 is connected behind a chamber 7 and a further fluidic interface 4.2 parallel to the chamber 7.
  • the sample passes through the subsequently to be closed fluidic interface 4.1 (Fig. 4d) into the cavity 6 and is there mixed with a reagent from a reagent reservoir 8. Then, the resulting liquid is passed through the functional element 5, wherein the functional element 5 can be flowed through both the media from the cavity / reaction space 6 and by reagents from other reagent reservoirs 8 in any order.
  • the liquid can be held in the waste chamber 7 in the microfluidic device or be discharged to the outside via the fluidic interface 4.3 connected to the chamber 7 at the top of the structured component 1.
  • liquid can then be withdrawn via the opened fluidic interface 4.2, for example for removal of a target fluid. whereas, when the sample is applied through the fluidic interface 4.1, it is subsequently closed.
  • the micro fluidic device may have an additional functional element 5, as shown in Fig. 5a-d.
  • a plurality of reagent reservoirs 8 are present, which can supply liquids or media in front of the first functional element 5 or can supply the second functional element 5 with liquids.
  • the first and second functional element 5 are connected in series.
  • the microfluidic device has two chambers 7, one of which is coupled to the first functional element 5 and having a fluidic interface 4.4.
  • a first fluidic interface 4.1 is arranged on the upper side of the structured component 1 and via the channel system 2 with the first functional element 5, which is flowed through vertically.
  • the second functional element 5 is arranged, which is connected to the second chamber 7.
  • the second Kam mer 7 is connected to the fluidic interface 4.3, wherein before the second chamber 7 a Ka nala livingeist is arranged to the fluidic interface 4.2.
  • the structured component 1 is here covered with two other components 3, the liquidi cal channel system 2 liquid-tight and close when using gases as a medium gas-tight ver.
  • the upper component 3 does not completely cover the upper side of the structured component 1, so that the plurality of fluidic interfaces 4.1, 4.2, 4.3 and 4.4 are not covered by the upper component 3.
  • the lower component completely covers the structured component 1.
  • the sample passes through the subsequently to be closed fluidic interface 4.1 in the cavity / reaction chamber 6, in which the first functional element 5 is arranged. Particles are retained by the first functional element 5 and passed through the fluidic channel system 2 by closing the fluidic interface 4.1 to the second functional element 5 and from there via the chamber 7 to the fluidic interface 4.3 or directly from the microfluidic Vorrich device via the fluidic interface 4.4 led out.
  • the microfluidic device has two functional elements 5, which are connected in series.
  • the first functional element 5 is arranged in a cavity 6 and is flowed through from above, ie vertically.
  • the first functional element 5 is coupled to a reagent reservoir 8.
  • the second functional element 5 is arranged on the underside and coupled via the channel system 2 with the output of the first functional element 5, wherein a further reagent reservoir 8 is interposed for additional liquid addition.
  • the first functional element 5 receives the sample via the fluidic interface 4.1, which then either runs independently through the first functional element 5 or through reagents from the reagent reservoir 8 further into the second functional element 5 is driven.
  • the second functional element 5 the eluate is then removed via the fluidic interface 4.2 from the microfluidic device.
  • reagents from the reagent reservoir 8, which in front of the first functional element 5 into the fluidic channel system 2 or from the reagent reservoir 8, which meets only before the second functional element 5 in the fluidic channel system 2, are moved.
  • the first functional element 5 is a unit for generating plasma or serum from blood and the second functional element 5 serves to remove hemolyzed red blood cells.
  • this embodiment according to FIGS. 6a-6c makes it possible to give larger volumes of the sample via the first functional element 5 and remove interfering components by the second functional element 5, so that both the problem of generating larger plasma / Serum quantities on a microfluidic chip can be remedied by a further step and, in addition, blood samples which already show aging effects or which have generally already lysed red blood cells can be used.
  • the microfluidic device has two functional elements 5 connected in series behind one another, wherein the first functional element 5 is acted upon by the sample via the fluidic interface 4.1.
  • the sample then either runs independently through the first functional element 5 running or is driven by reagents from the first associated reagent reservoir 8 further into the second functional element 5.
  • the eluate can then be discharged from the device via the fluidic interface 4.2, whereby reagents from the reagent reservoir 8, before the first functional element 5 into the fluidic channel system 2 or from the reagent reservoir, only before the second Functional element 5 meets in the fluidic channel system 2, can be moved.
  • the first functional element 5 is a unit for generating plasma or serum from blood, wherein the second functional element 5 is used for the extraction of nucleic acids from the recovered plasma / serum.
  • the reagent reservoir 8 connected to the first functional element 5 is connected for diluting and expelling the recovered plasma / serum.
  • the reagent reservoirs 8 connected upstream of the second functional element 5 are used to expel unwanted components and are used to detach the target component.
  • a heat supply can be effected, whereby the detachment can be intensified.
  • the fluid management within the microfluidic device is made possible by the opening and closing of the corresponding fluidic interfaces 4.1, 4.2 and 4.3, so that the target fraction can be obtained cleanly via one of the fluidic interface 4.2 or 4.3 or directly into adjoining areas of the fluidic channel system 2 can be transported.
  • FIGS. 8a-8c The microfluidic device according to FIGS. 8a-8c will now be described. Here are mistakes! Reference source could not be found, three wireless 5, wherein the first functional element 5 is acted upon via the fluidic interface 4.1 with the sample.
  • the sample then either runs independently through the first functional element 5 or is driven further by reagents from the first reagent reservoir 8 to the second functional element 5, wherein the process step is repeated on the second functional element 5 and the eluate is passed on to the third functional element 5 , wherein a part remains on the third functional element 5 and unwanted components can be washed out through the reagents of the reagents reservoire 8 and either remain in the waste chamber 7 or be discharged to the fluidic interface 4.2 or 4.3.
  • the desired component can be obtained by closing the part of the fluidic channel system 2, which is directly connected to the waste reservoir 7, via the fluidic interface 4.2 or be passed to a further processing function in the fluidic channel system 2.
  • FIGS. 9a-9c which is similar to FIG. 8a-8c constructed, with an additional detection space 6 is present.
  • the detec tion space is covered by an at least partially transparent region of the component 3 or the structured component 1 is at least partially transparent in the region of the detection space 6 in order to make a visual inspection of the state of the eluate can.
  • the sample then either runs independently by the functional element 5 or is driven by reagents from the first reagent reservoir 8 to the second functional element 5, wherein the process step on the second functional element 5 is repeated and then the eluate is passed through the third functional element 5, wherein a Part of the eluate remains on the third functional element 5 and unwanted components on the reagents of the reagents reservoire 8 are washed out and either remain in the waste chamber 7 or be removed.
  • the desired component can be obtained by closing the part of the fluidic channel system 2, which is directly connected to the waste reservoir 7, and either removed via the fluidic interface 4.2 or passed to another function in the fluidic channel system 2.
  • the eluate then passes through the fluidic interface, output 4.2, from the device, wherein reagents from the reagent reservoir 8, which is connected to the first functional element 5 to the fluidic channel system 2 or from the reagents zienreservoir, the only before the second functional element 5 meets the fluidic channel system 2, can be moved.
  • the first functional element 5 is a unit for generating plasma or serum from blood.
  • the second functional element 5 is used for the extraction of nucleic acids from the plasma / serum obtained.
  • the reagent reservoir 8 connected to the first functional element 5 is provided for diluting and expelling the recovered plasma / serum.
  • the functional element 5 upstream reagent reservoirs 8 are used to drive unwanted ter components and to detach the target component.
  • the detachment of the target component can also be enhanced by temperature supply, wherein the fluid guide is made possible by the opening and closing of the corresponding fluidic interfaces, so that the Zielfftress can be obtained cleanly via a fluidic interface 4.2 or 4.3 or directly in closing areas of the fluidic channel system 2 can be transported.
  • FIG. 10A-10c is similar to the embodiment according to FIGS. 9a-9c.
  • a second detection space 6 available.
  • indicator solutions from one of the reagent reservoirs 8 optically recognizable reactions, for example color changes, can be produced, which can then be observed in one of the two detection spaces 6.
  • FIG. 11 a lc is similar to the embodiment according to FIG. 10 a - 10 c.
  • an array of reagents is arranged in the second detection space, which act a reaction of the eluate be, which can then be perceived optically.
  • the embodiment according to FIG. 12 exemplarily displays measuring windows 13, which are e.g. can be read optically and preferably have several depths to extend the dynamic range of the measurement.
  • concentration determinations of eluted samples e.g. the determination of the concentration of eluted nucleic acids or protein.
  • one measuring window 13 is arranged behind the second and third functional element 5.
  • FIGS. 13a-13c shows a fluidic system with a directly coupled syringe pump 14, 15, which is formed integrally with the structured component 1 or can be manufactured separately.
  • the syringe pump includes a body 14 and a plunger 15.
  • the syringe pump can be operated via the plunger 15 and both for the storage of fluids, for the reception of waste during use of the fluidic system as well as for the control and control of the fluids during use of the fluidic system can be used.
  • the syringe pump is connected to the channel system 2.
  • FIGS. 14a-14c additionally contains, in addition to the components of embodiment FIG. 13, a rotary valve 16 which can switch the individual regions of the fluidic network or channel strands starting from the syringe pump 14, so that sections are separated or together fluidly can be controlled.
  • FIG. 4b shows a sectional view along the line 14b
  • FIG. 14c shows a view along the line 14c.
  • the embodiment according to FIGS. 15a-15c includes a fluidic system similar to the embodiment of FIG. 14, which, instead of a reaction chamber or detection chamber 12, as shown in FIG. 14a, with a downstream reagent array, contains a plurality of parallel reaction chambers 20, eg for PCR (Polymerase Chain Reaction), Real Time PCR, Quantitative Real Time PCR (qPCR) or a combined reverse transcription with PCR (PCR, Real Time PCR, qPCR).
  • the filling of the chambers 20 takes place in parallel or successively and is achieved in each case by a vent at the end of this fluidic network area by a gas-permeable membrane 23, wherein alternatively a closed air reservoir through the compressibility of air, Boyle-Mariotte effect, can be used. Both in the channel system 2 and in the reaction chambers 6 reagents may be presented.
  • the embodiment of FIGS. 16a, 16b includes an additional chamber 20 which may contain reagents, preferably reagents for PCR or reverse transcription.
  • reagents may be present in one or more of the chambers 6 and PCR chambers 20, in particular dry reagents for reverse transcription or PCR (RT-PCR, qPCR, PCR).
  • the embodiment according to FIGS. 17 a, 17 b additionally includes the option of closing the PCR chamber 20, each with a membrane valve 21, which is particularly advantageous in order to keep the fluids in the PCR chamber 20 even at high temperatures.
  • the embodiment according to FIG. 18a includes by way of example a series of diaphragm valves 21, which serve for fluid control in the fluidic system and are arranged at different locations in the channel system 2 in order to close part of the channel system 2 and thus to control the fluid flow inside the microfluidic device enable.
  • FIG. 19 shows a number of functional elements that sequentially process the sample from the fluid inlet.
  • the sample is introduced into the fluid inlet 4.1 and then reaches a reaction space 6 which may contain mixing elements and reagents and into which reagents reservoir 8 may be added to react with the sample.
  • this mixture passes tointerventionslement 5 to receive by means of flow with different fluids from the reagent reservoirs 8, the purified target molecules whose volume can then be measured on the measuring loops 22 on the second rotary valve 16 and then with each one defined Volume can reach the next reaction chamber 6, wherein it may be submitted to dry or liquid reagents Kings NEN. Subsequently, this mixture enters the parallel reaction cavities 6, e.g. for a PCR (qPCR, RT-PCR, PCR) 20 can be used.
  • the fluid control takes place via the fuel pump 14, the rotary valves 16 and the selective emptying of the reagent reservoirs 8.
  • the embodiment according to FIG. 19 can be used in such a way that the output channels and / or the input channels from the reaction / PCR combs 20 are separated by a gel method. be sealed by welding, heat sealing or pressure and so the liquids remain in the chambers 20 during the temperature cycles of a PCR.
  • a nucleic acid-containing sample is sucked into the reaction chamber 6 via the fluidic interface 4. 1 by means of the integrated syringe pump 14.
  • the sample is mixed with lysis buffer from the reagent reservoirs 8 and actively lysed.
  • the sample lysate is sucked through the element by the integrated syringe pump 14 via the rotary valve 16.
  • the sample is cleaned in the functional element 5 by Waschpuf fer from the reagent reservoirs 8 so that clean nucleic acid remains in the functional element 5.
  • Excess sample and washing buffer are sucked off by means of the syringe pump 14 and remain in this as waste.
  • the mixture of eluate and PCR reagent is pressed via the rotary valve 16 into the PCR / qPCR / RT-PCR chambers 6/20 and these are flooded homogeneously.
  • the PCR chambers 6/20 can subsequently be closed thermally at the chamber inlet and outlet, and then the temperature cycle is carried out with amplification and optical detection.
  • an isothermal amplification of the nucleic acid takes place.
  • the purified nucleic acid is RNA that undergoes reverse transcription prior to amplification.
  • microfluidic device or fluidic functional unit according to the invention can be used as an independent component, but at the same time also be part of an expanded fluidic network. This is the case in particular with microfluidic chips, which cover further functions and cover the microfluidic device according to the invention and the method according to the invention for the operation of which only partial areas.
  • Fluidic interfaces are elements that can be used to introduce or apply media, to bleed, to close or open to pressurize or create negative pressure, and also to interface with an instrument or for use by a manual operator.
  • These fluidic interfaces may be of any shape, such as holes, recesses, mini luer, luer, luer-lok, olive or other geometries, and in a venting variant with gas-permeable but liquid-tight components, e.g. gas-permeable membranes, be closed.
  • valves on the functional element in the form of diaphragm valves, rotary valves or passive valves e.g. via channel tapers, or surface modifications of the base material.
  • the valves are mostly operated by a corresponding operating device, alternatively, a manual operation for some embodiments is possible.
  • the elements can be connected to it directly in the production process of the structured element, for example as insert parts by injection molding (insert molding) or subsequently inserted.
  • the parts of the fluidic network described as cavity 6, 7 can be designed as a chamber, channel, etc. and do not necessarily have to be in the geometric dimensions before or after this chamber, e.g. the channel cross sections differ.
  • the reagent reservoirs 8 shown in the various embodiments can also be embodied as fluidic interfaces and fed via external reagent reservoirs, eg from an operating device.
  • the fluid transport on the functional element can be effected via external pressure or vacuum admission, pressurization of reagent reservoirs, integrated pump valves, surface forces, capillary forces, etc.
  • the present invention describes a microfluidic device with a fluidic system with at least one fluidic interface and at least one introduced porous functional element through which a sample is passed and th thereafter further liquids or gases can be directed.
  • the entire device has at least one structured component and at least one component applied to the structured component, as well as the preferably porous functional element.
  • the functional unit according to the invention serves for the separation, purification, fractionation and concentration of components.
  • Special embodiments of the functional unit include a plurality of functional elements and also have liquid reservoirs on the micro fluidic device.
  • the microfluidic device is to be operated with a corresponding method.
  • the operation of the system can be done both manually and by means of simple devices or devices.
  • PCR chamber 20 this can be synonymous with a chamber for the various forms of PCR, such as Real Time PCR, quantitative PCR, combined reverse transcription, reverse transcription or isothermal methods of amplification of nucleic acids such as NASBA, RCT etc . his.
  • Fluidic interface e.g. Exit for waste, vent

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung und aufein Verfahren zur Nutzung desselben zur Trennung, Aufreinigung und Konzentration von Komponenten von fluidischen Medien. Insbesondere betrifft die Erfindung einemikrofluidische Vorrichtungund ein Verfahren zur Aufbereitung von Blutproben. Dazu wird eine mikrofluidische Vorrichtungangegeben,umfassend: eine strukturierte Komponente (1), die als flächiger Körper ausgebildet ist, ein mikrofluidisches Kanalsystem (2), das in der strukturierten Komponente (1) ausgebildet ist, wenigstens ein auf einer Oberfläche derstrukturierten Komponente (1) aufgebrachtes Bauteil (3),wenigstens ein poröses Funktionselement (5), und wenigstens eine fluidische Schnittstelle (4.1, 4.2, 4.3), die an der strukturierten Komponente (1) zur Zufuhr von Medien in das mikrofluidische Kanalsystem (2) angeordnet ist.

Description

Mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zur Nutzung derselben zur Trennung, Aufreinigung und Konzentration von Komponenten von fluidischen Medien,
Die Erfindung bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung und auf ein Verfahren zur Nutzung desselben zur Trennung, Aufreinigung und Konzentration von Komponenten von fluidi- schen Medien. Insbesondere betrifft die Erfindung eine mikrofluidische Vorrichtung und eine Ver fahren zur Aufbereitung von Blutproben sowie ein Verfahren zum Aufreinigen von Nukleinsäuren und Verfahren zur Kombination der genannten Verfahren mit einem Nachweisverfahren der biologi- schen Inhaltsstoffe.
Hintergrund
Das Trennen, Aufreinigen, Fraktionieren und Konzentrieren von Komponenten aus flüssigen oder gasförmigen Medien und eine Aufspaltung einzelner Bestandteile mit anschließendem Trennen, Auffeinigen, Fraktionieren und Konzentrieren von Komponenten ist konventionell mit zahlreichen Handhabungsschritten verbunden.
Während in der Chemie Destillationskolonnen, Schüttelkolben oder Membranen zum Einsatz kommen und in der Regel große Volumina gehandhabt werden, sind z.B. in den Lebenswissenschaf ten kleinere Volumina zu handhaben und andere Technologien im Einsatz.
In den Lebenswissenschaften sind die Haupttechnologien Zentrifugation und säulen- oder par- tikelbasierte Techniken. Hier wird beispielsweise auf flüssige Dichtegradienten die zu trennende Probe aufgetragen und entsprechend der Größe werden unterschiedliche Fraktionen erhalten. Lang wierige Handhabungsschritte und die Zentrifugation, häufig auch Ultrazentrifugation, sind hier stö rend. Alternativ erfolgt eine Anbindung von Probenbestandteilen an poröse Oberflächen, die als Säu len dienen. Über Zentrifugation wird die Probe durch diese Säule getrieben, manuelle Waschschritte mit wiederholten Zentrifugationsschritten machen dieses Verfahren aufwändig. Druckgetriebene Säu len mit spezifischer oder semi-spezifischer Anbindung von Zielmolekülen bzw. eine Fraktionierung nach Größe der Zielkomponenten und deren anschließende Elution über druckgetriebenen Flüssig keitszufluss sind weitere Techniken. Alternativ können zu Flüssigkeiten oder Gase auch Partikel hin zugegeben werden, an die sich je nach Oberflächenbeschaffenheit der Partikel Komponenten der Probe binden und über Reagenzien, durch Temperatureinwirkung oder eine Kombination von Rea genzien und Temperatureinwirkung wieder abgelöst werden können. Für diese Verfahren stehen gro ße Automaten bereit, die insbesondere für die Aufreinigung von Nukleinsäuren eingesetzt werden.
Um die Trennung und Aufreinigung von zumeist kleineren Volumina einfacher zu gestalten gibt es einige Entwicklungen in Bereich der Mikrofluidik, Elemente wie Membranen, Filter oder Frit ten zum Trennen und Auffeinigen zu nutzen. Häufig sind diese allerdings schwierig zu bedienen, erlauben nicht den Einsatz der gewünschten Probenmenge und haben wenig Möglichkeiten einer ausreichenden Reinigung der gewonnenen Komponenten für Folgeprozesse. Zudem sind die notwen digen Prozesse zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse z.B. im Bereich des Arbeitens mit Blut oder der Extraktion von Nukleinsäuren nicht vollständig abgebildet, so dass derzeit kein System für einen Routineeinsatz verfügbar ist. Die Aufgabe der Erfindung ist es daher eine mikrofluidische Vorrichtung, die einfach her stellbar ist und sowohl an die zu verarbeitenden Probenmengen als auch an die Vor- und Folgepro zesse anpassbar ist. Außerdem ist es eine Aufgabe ein Verfahren zu deren Verwendung anzugeben.
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine mikrofluidische Vorrichtung mit einem fluidischen Kanalsystem mit mindestestens einer fluidischen Schnittstelle. Die mikrofluidische Vorrichtung ist als abgeschlossene Einheit ausgebildet und weist zumindest ein eingebrachtes Funktionselement auf, welches vorzugsweise als poröses Funktionselement ausgebildet ist. Durch das poröse Funktionsele ment kann eine Probe und/oder Medium geführt werden. Anschließend können durch das Funktions- element weitere Flüssigkeiten oder Gase gelenkt werden. D.h. das Funktionselement kann sequentiell verschiedene Aufgaben bei der Be- und Verarbeitung von Fluiden in einem mikrofluidischen System ausführen.
Dabei weist die mikrofluidische Vorrichtung mindestens eine strukturierte Komponente auf, die den Haupt- oder Basisbestandteil der mikrofluidischen Vorrichtung bildet. Die strukturierte Komponente ist meist als flächiger und/oder häufig quaderförmiger Körper ausgebildet, der vor zugsweise mittels Spritzguss herstellbar ist. In diese strukturierte Komponente sind Strukturen einge bracht. Dazu zählet insbesondere ein mikrofluidisches Kanalsystem. Die Kanäle oder Teil davon sind vorzugsweise auf der Ober- und/oder Unterseite der strukturierten Komponente eingebracht. Die strukturierte Komponente kann darüber hinaus Flüssigkeitsreservoire, Kanal Verjüngungen, Ventile, Schalter Verteiler, Entlüftungsmembranen, Kammern, Hohlräume und/oder Reaktionskavitäten auf- weisen, die entweder in die strukturierte Komponente eingebracht sind, oder in dafür vorgesehene Hohlräume eingesetzt wurden.
Die mikrofluidische Vorrichtung weist zudem wenigstens ein auf der strukturierten Kompo nente aufgebrachtes Bauteil auf. Das Bauteil kann auch als Abdeckplatte ausgebildet und bezeichnet werden. Dieses Bauteil ist auf der Oberseite und/oder Unterseite der strukturierten Komponente auf gebracht. Das Bauteil kann eine teilweise transparente oder teilweise lichtdichte Platte ausgebildet sein. Das Bauteil kann jedoch auch als Folie ausgebildet sein, die auf die Ober und/oder Unterseite z.B. aufgeklebt, gebondet, gepresst oder verschweißt wird, um die mikrofluidischen Strukturen flüs sigkeitsdicht und bei Bedarf auch gasdicht zu verschließen. Eine Folie ist vorzugsweise aus Kunst stoff ausgebildet und weist eine sehr geringe Dicke im Vergleich zur Breite und Fänge auf, die eine hohe Flexibilität ermöglicht. Eine bevorzugte Dicke ist hier geringer/gleich als lmm. Eine Platte hin gegen weist eine geringere Flexibilität auf, da die Dicke im Vergleich zur Breite und Fänge größer ist. daher werden Platten bevorzugt mit einer Dicke von größer/gleich als lmm eingesetzt.
Außerdem enthält die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung wenigstens ein poröses Funktionselement. Das wenigstens eine Funktionselement kann beispielsweise durch einen Filter, eine Membran, eine Fritte, oder ein Funktionspapier oder ähnliche Elemente realisiert sein. Dabei können das eine oder die mehreren Funktionselemente Reagenzien enthalten, d.h. der eine oder die mehrere Filter, Membranen, Fritten, Funktionspapiere können Reagenzien enthalten oder es können darauf Reagenzien aufgebracht sein. All diese Beispiele der Funktionselemente sind für Fluide we nigstens teilweise passierbar. Es kann sich um Membranen und/oder Filter zum Größenausschluss handeln, wie laserstrukturierte Membranen (Track-Etch) mit genau definierter Porengröße, Silizium- siebe, Filterpapier mit einem grobmaschigen Netz. Funktionselemente die den Größenausschluss und / oder Anbindung an die Oberfläche des Funktionselements nutzen sind verschiedene Elemente wie z.B. poröse dreidimensionale Strukturen wie Fritten, Siliziummembranen, Silikamembranen, dreidi- mensional aggregierte Partikel, Filtermatten aus diversen Materialien, Silikamatten, PET-Filter, Dünnschichtchromatographiematerial oder Plasma-/Serumgenerierungsmembranen sein, um einige Beispiele zu nennen.Alle diese Funktionselemente können zusätzlich mit Reagenzien versehen wer den, um eine spezifische Anbindung von Zielmolekülen an diese Funktionselemente umzusetzen und ein gezieltes Ablösen der Zielmoleküle von Funktionselementen zu realisieren.
Zur Zufuhr von Medien weist die mikrofluidische Vorrichtung wenigstens eine fluidische Schnittstelle auf. Vorzugsweise sind an der mikrofluidische Vorrichtung zwei fluidische Schnittstelle angeordnet, Die wenigstens eine fluidische Schnittstelle kann vertikal, horizontal und/oder in einem beliebigen Winkel zur mikrofluidischen Vorrichtung angeordnet sein und der Medienzugabe und/oder der Beaufschlagung mit positivem oder negativem Druck, sowie einfach zur Entlüftung dienen.
Zudem kann die mikrofluidische Vorrichtung durch Verwendung von wenigstens einem inte- grierten Ventil, von wenigstens einem externen Schalter oder wenigstens einem Ventil oder wenigs- tens einer Kappe verschlossen werden.
Die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung dient insbesondere der Trennung, Auffei- nigung, Fraktionierung und Konzentration von Komponenten eines zugeführten Mediums oder einer Probe.
Besondere Ausführungsformen der mikrofluidischen Vorrichtung beinhalten mehrere Funkti- onselemente und können optional zudem ein oder mehrere Flüssigkeitsreservoire aufweisen.
Erfindungsgemäß wird die mikrofluidische Vorrichtung mit einem entsprechenden Verfahren betrieben, wobei durch den erfindungsgemäßen Gebrauch neben Trennung, Aufreinigung, Fraktio- nierung und Konzentration von Komponenten auch zwischengeschaltete Reaktionsschritte erfolgen können, um gewünschte Zielkomponenten erhalten, abtrennen und oder aufkonzentrieren zu können.
Eine besonders vorteilhafte Ausführung der mikrofluidischen Vorrichtung ist als Funktions- einheit oder als mikrofluidisches System ausgebildet.
Der Betrieb des mikrofluidischen Vorrichtung kann sowohl händisch als auch mittels einfa cher Vorrichtungen oder Geräte erfolgen, die an die mikrofluidische Vorrichtung gekoppelt oder an geschlossen werden, um bspw. Druck oder Prozessmedien zuzuführen.
In einer Ausgestaltung wird ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren angegeben, bei dem eine Probe über die fluidische Schnittstelle (4.1) zugeführt wird und in einer Reaktionskam mer (6) mit Reagenzien versetzt wird. Die in der Probe befindliche Zellen lysieren dann. Die Probe wird anschließend über ein Funktionselement geführt, während der Ausgang (4.2) verschlossen ist und ungewünschte Moleküle entweder direkt mit der Probe in ein Abfallreservoir (7) gelangen oder durch ein Spülen des Funktionselements (5) mit Reagenzien aus den Flüssigkeitsreservoiren (8) ab gelöst werden, während die Zielmoleküle, Nukleinsäuren, am Funktionselement (5) verbleiben und erst durch ein spezielles Reagenz aus einem der Flüssigkeitsreservoire (8) abgelöst werden, wobei vorab der Fluidausgang (4.3) am Abfallreservoir (7) geschlossen und der Ausgang (4.2) geöffnet wird und die gewonnenen Nukleinsäuren aus dem fluidischen System über den jetzt geöffneten Aus- gang (4.2) entnommen werden können.
Vorzugsweise handelt es sich bei den Nukleinsäuren um DNA oder um RNA handelt.
Bei einem anderen Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren wird eine Probe über die fluidische Schnittstelle (4.1) zugeführt und über ein Funktionselement (5) gefiltert, so dass die Zellen zurück bleiben und ungewünschte Komponenten in das Abfallreservoir (7) gelangen, dessen fluidi- sche Schnittstelle (4.3) geöffnet ist, was durch ein Verschließen der fluidischen Schnittstellen (4.2 und 4.3) hinter dem in Strömungsrichtung zweiten Funktionselement (5) ermöglicht wird, anschlie- ßend erfolgt durch Kontakt der Zellen zu Reagenzien im Hohlraum (6) über dem ersten Funktions- element (5) eine Lyse der Zellen, gefolgt von einem Transport des Lysates durch Fluide aus einem der mit dem ersten Funktionselement (5) verbundenen Reagenzienreservoire (8), gefolgt von einem Transport des Lysates zum zweiten Funktionselement (5), wobei nun die fluidische Schnittstelle (4.3) hinter dem zweiten Funktionselement (5) geöffnet ist und die anderen fluidischen Schnittstellen ge schlossen sind, wobei sich die Zielmoleküle und weitere Moleküle an das Funktionselement (5) bin den und durch Spülen mit Fluiden aus den Reagenzienreservoiren (8) ein Ablösen ungewünschter Moleküle erfolgt und letztlich nach Schließen der fluidischen Schnittstelle (4.3) und Öffnen des Flu- idausgangs (4.2) ein Loslösen der Nukleinsäuren durch ein Reagenz und ein Austreiben des Eluats und die Entnahme aus dem Fluidausgang (4.2) erfolgt.
Bevorzugt wird bei einem Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren eine Probe über die fluidische Schnittstelle (4.1) zugeführt und über ein Funktionselement (5) gefiltert, so dass die Zellen zurück bleiben und ungewünschte Komponenten in das Abfallreservoir (7) gelangen, dessen fluidi- sche Schnittstelle (4.3) geöffnet ist, was durch ein Verschließen der fluidischen Schnittstellen (4.2 und 4.3) hinter dem in Strömungsrichtung zweiten Funktionselement (5) ermöglicht wird, anschlie- ßend erfolgt durch Kontakt der Zellen zu Reagenzien im Hohlraum (6) über dem ersten Funktions- element (5) eine Fyse der Zellen, gefolgt von einem Transport des Fysates durch Fluide aus einem der mit dem ersten Funktionselement (5) verbundenen Reagenzienreservoire (8), einem Transport des Fysates zum zweiten Funktionselement (5), wobei nun die fluidische Schnittstelle (4.3) hinter dem zweiten Funktionselement (5) geöffnet ist und die anderen fluidischen Schnittstellen geschlossen sind, wobei sich die Zielmoleküle und weitere Moleküle an das Funktionselement (5) binden, durch Spülen mit Fluiden aus den Reagenzienreservoiren (8) erfolgt ein Ablösen ungewünschter Moleküle und letztlich erfolgt nach Schließen der fluidischen Schnittstelle (4.3) und Öffnen des Fluidausgangs (4.2) ein Foslösen der Nukleinsäuren durch ein Reagenz und ein Austreiben des Eluats und die Ent nahme aus dem Fluidausgang (4.2), wobei es sich bei der Nukleinsäure um DNA handelt oder es sich bei der Nukleinsäure um RNA handelt.
Die aufgereinigte Nukleinsäure kann einer anschließenden Amplifikation und Detektion un terzogen werden.
Die aufgereinigte Nukleinsäure kann eine RNA sein und anschließend zunächst einer Rever sen Transkription und anschließend einer Amplifikation und Detektion unterzogen werden.
Alle Reagenzien können in flüssiger oder trockener Form auf dem mikrofluidischen System vorgelegt sein. Die aufgereinigte Nukleinsäure kann eine DNA sein und mittels qPCR amplifiziert und nach gewiesen wird und/oder kann mittels isothermaler Amplifikation amplifiziert und nachgewiesen wer den.
Die aufgereinigte Nukleinsäure kann DNA sein, die in einer ersten Kammer (20) mittels einer unspezifischen PCR voramplifiziert und anschließend in einer spezifischen qPCR nachgewiesen wird.
Die aufgereinigte Nukleinsäure kann RNA sein, die in einer ersten Kammer (20) einer Rever sen Transkription unterworfen wird und in einer zweiten Kammer (20) mittels qPCR amplifiziert und nachgewiesen wird.
Die aufgereinigte Nukleinsäure kann RNA sein, die in einer Kammer (20) sowohl der Rever sen Transkription als auch der qPCR (one-step-RT-PCR) unterworfen wird.
Es können mehrere parallele qPCR-Kammem (20) angeordnet sein, um die qPCR in paralle len PCR-Kammem ablaufen zu lassen.
Die qPCR kann als Duplex-PCR mit interner Kontroll- Amplifikation und/oder die qPCR kann als Multiplex-PCR mit interner Kontroll- Amplifikation ablaufen.
Bevorzugt handelt es sich um eine konventionelle PCR, die optional anschließend über einen Array mittels Hybridisierung nachgewiesen werden kann.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Figuren näher beschrieben. In den Figuren zeigen:
Fig. la eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. lb die erste Ausführungsform gemäß Fig. la in einer Schnittdarstellung entlang einer nicht ein gezeichneten Finie vom Eingang zum Ausgang;
Fig. 2a eine zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. 2b die zweite Ausführungsform gemäß Fig. 2a in einer Schnittdarstellung entlang einer nicht eingezeichneten Finie vom Eingang zum Ausgang;
Fig. 3a eine dritte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. 3b die dritte Ausführungsform gemäß Fig. 3a in einer Schnittdarstellung entlang der Finie 3b; Fig. 3c die dritte Ausführungsform gemäß Fig. 3a in einer Schnittdarstellung entlang der Finie 3cd; Fig. 3d die dritte Ausführungsform mit Kappen gemäß Fig. 3a in einer Schnittdarstellung entlang der Finie 3 cd;
Fig. 4a eine vierte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. 4b die vierte Ausführungsform gemäß Fig. 4a in einer Schnittdarstellung entlang der Finie 4b; Fig. 4c die vierte Ausführungsform gemäß Fig. 4a in einer Schnittdarstellung entlang der Finie 4cd; Fig. 4d die vierte Ausführungsform mit Kappen gemäß Fig. 4a in einer Schnittdarstellung entlang der Finie 4cd; Fig. 5a eine fünfte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. 5b die fünfte Ausführungsform gemäß Fig. 5a in einer Schnittdarstellung entlang der Linie 5b; Fig. 5c die fünfte Ausführungsform gemäß Fig. 5a in einer Schnittdarstellung entlang der Linie 5cd; Fig. 5d die fünfte Ausführungsform mit Kappen gemäß Fig. 5a in einer Schnittdarstellung entlang der Linie 4cd;
Fig. 5e die fünfte Ausführungsform mit Kappen gemäß Fig. 5a in einer Schnittdarstellung entlang der Linie 5e;
Fig. 6a eine sechste Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. 6b die sechste Ausführungsform gemäß Fig. 6a in einer Schnittdarstellung entlang der nicht ein gezeichneten Linie vom Eingang zum Ausgang;
Fig. 6c die sechste Ausführungsform mit Kappen gemäß Fig. 6a in einer Schnittdarstellung entlang der nicht eingezeichneten Linie vom Eingang zum Ausgang;
Fig. 7a eine siebte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. 7b die siebte Ausführungsform gemäß Fig. 7a in einer Schnittdarstellung entlang der nicht ein gezeichneten Finie durch die Flüssigkeitsreservoire;
Fig. 7c die siebte Ausführungsform mit Kappen gemäß Fig. 7a in einer Schnittdarstellung entlang der nicht eingezeichneten Finie vom Eingang zum Ausgang;
Fig. 8a eine achte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. 8b die achte Ausführungsform gemäß Fig. 8a in einer Schnittdarstellung entlang der nicht einge zeichneten Finie durch die Flüssigkeitsreservoire;
Fig. 8c die achte Ausführungsform mit Kappen gemäß Fig. 8a in einer Schnittdarstellung entlang der nicht eingezeichneten Finie vom Eingang zum Ausgang;
Fig. 9a eine neunte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. 9b die neunte Ausführungsform gemäß Fig. 9a in einer Schnittdarstellung entlang der nicht ein gezeichneten Finie durch die Flüssigkeitsreservoire;
Fig. 9c die neunte Ausführungsform mit Kappen gemäß Fig. 9a in einer Schnittdarstellung entlang der nicht eingezeichneten Finie vom Eingang zum Ausgang;
Fig. lOa eine zehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. lOb die zehnte Ausführungsform gemäß Fig. lOa in einer Schnittdarstellung entlang der nicht eingezeichneten Finie durch die Flüssigkeitsreservoire;
Fig. lOc die zehnte Ausführungsform mit Kappen gemäß Fig. lOa in einer Schnittdarstellung entlang der nicht eingezeichneten Finie vom Eingang zum Ausgang;
Fig. l la eine elfte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht; Fig. l lb die elfte Ausführungsform gemäß Fig. l la in einer Schnittdarstellung entlang der nicht ein gezeichneten Linie durch die Flüssigkeitsreservoire;
Fig. l lc die elfte Ausführungsform mit Kappen gemäß Fig. l la in einer Schnittdarstellung entlang der nicht eingezeichneten Linie vom Eingang zum Ausgang;
Fig. l2a eine zwölfte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in ei- ner Aufsicht;
Fig. l3a eine dreizehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. 13b eine dreizehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung im Querschnitt 1;
Fig. l3c eine vierzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung im Querschnitt 2;
Fig. l4a eine vierzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. l4b eine vierzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung im Querschnitt 1;
Fig. l4c eine vierzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung im Querschnitt 2;
Fig. l5a eine fünfzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. 15b eine fünfzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung im Querschnitt 1;
Fig. l5c eine vierzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung im Querschnitt 2;
Fig. l6a eine sechzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. 16b eine sechzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung im Querschnitt 1;
Fig. l7a eine siebzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. l7b eine siebzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung im Querschnitt 1;
Fig. l8a eine achtzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Fig. 19 eine neunzehnte Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer Aufsicht;
Die Grundausführung der mikrofluidischen Vorrichtung ist in den Fig. 1 und 2 gezeigt. Die mikrofluidische Vorrichtung weist zwei fluidische Schnittstellen auf 4.1. und 4.2 auf. Eine struktu- rierte Komponente 1 ist als flächiges oder quaderförmiges Bauelement ausgebildet und weist an sei- nen Seiten oder Stirnseiten zwei fluidische Schnittstellen auf 4.1. und 4.2. auf. Weiter ist in die struk turierte Komponente 1 ein fluidisches Kanalsystem 2 integriert oder eingebracht. Ein weiteres Bauteil 3 verschließt eine Oberseite der strukturierten Komponente 1 , so dass das fluidische Kanalsystem 2 und die fluidischen Strukturen flüssigkeitsdicht und bei Nutzung von Gasen als Medium auch gas- dicht verschlossen sind.
Außerdem ist ein Funktionselement 5, vorzugsweise ein poröses Funktionselement 5, ange- ordnet, das sich an bzw. in der strukturierten Komponente 1 befindet. Das poröse Funktionselement 5 kann sowohl vertikal, siehe Fig. lb, als auch horizontal, siehe Fig. 2b durchströmt werden. Auch eine bidirektionale Durchströmung in beide Richtungen ist möglich. Das Funktionselement 5 kann entwe- der direkt mit der strukturierten Komponente 1 über den Fertigungsprozess der strukturierten Kom ponente 1, z.B. im Spritzgussprozess durch Einlegen des Funktionselements, integriert werden oder nachträglich in die mikro fluidische Vorrichtung eingebracht werden. In Fig. 1 ist das Funktionsele- ment 5 in einen Hohlraum 6 eingesetzt worden und wird von oben, d.h. vertikal durchströmt, wobei der Kanal 2 nach dem Funktionselement 5 auf der Unterseite der strukturierten Komponente 1 ausge bildet ist und dort von einem weiteren Bauteil 3 analog zum oberen Bauteil 3 verschlossen ist. Über dem Funktionselement 5 verbleibt ein Hohlraum 6, in den das Medium seitlich kommend von der fluidischen Schnittstelle 4.1. einströmt.
Alternativ erstreckt sich in Fig.2b der Kanal 2 zuerst in Verlängerung der fluidischen Schnitt stelle 4.1, um dann auf der Unterseite der strukturierten Komponente 1 weiter zu verlaufen. Auch hier ist der Kanal 2 von einem weiteren Bauteil 3 verschlossen. Auf der Unterseite der strukturierten Komponente 1 ist ein Hohlraum ausgebildet, in den das Funktionselement 5 eingesetzt ist oder wird, so dass dieses horizontal durchströmt werden kann und zur gegenüberliegenden fluidischen Schnitt stelle 4.2 strömt, um dort ausgegeben zu werden.
Das Verfahren zur Nutzung der mikrofluidischen Vorrichtung sieht derart aus, dass eine Pro be über die fluidische Schnittstelle 4.1 eingeführt wird, wobei einige vorbestimmte Bestandteile der Probe im Funktionselement 5 verbleiben. Dies wird über die vorbestimmte Partikelgröße des Funkti- onselements 5 erreicht. Anschließend kann ein Ausspülen des Funktionselements 5 erfolgen, wobei verschiedene Reagenzien oder Fuft durch das Funktionselement 5 gespült werden. Daraufhin kann ein Herausspülen der Zielkomponente aus dem Funktionselement 5 erfolgen, was durch spezielle Reagenzien, Druck, Temperatur oder eine Kombination dieser Methoden erfolgen kann.
Besonders vorteilhaft ist ein Nachdrücken mit einem Verdrängermedium, besonders vorteil haft hierbei sind z.B. Öle oder höher viskose Medien als die vorherigen Fluide, wobei auch gleiche Fluide einsetzbar sind, nach dem Ablösen der Zielkomponente vom Funktionselement 5, um ein quantitative Herausspülen der Zielkomponente zu erzielen.
Über dieses Verfahren kann die Zielkomponente in dem erhaltenen Eluat nicht nur gereinigt, sondern auch im Vergleich zum Ursprungsmedium angereichert vorliegen. Das Durchströmen mit unterschiedlichen Medien ermöglicht somit auch ein Fraktionieren, d.h. das Eluieren unterschiedli cher Bestandteile des Ursprungsmediums aus dem Funktionselement 5.
Eine weitere Ausführungsform der mikrofluidischen Vorrichtung ist in Fig. 3a-3d dargestellt. Hier ist die mikro fluidische Vorrichtung mit Reagenzienreservoiren 8 ergänzt worden. Die struktu- rierten Komponente 1 enthält ein fluidisches Kanalsystem 2, und das weitere Bauteil 3 an der Unter seite, dass die fluidischen Strukturen flüssigkeitsdicht und bei Nutzung von Gasen als Medium auch gasdicht veschließt und ein Funktionselement 5, vorzugsweise ein poröses Funktionselement, das sich an bzw. in der strukturierten Komponente 1 befindet, sowie drei fluidischen Schnittstellen 4.1, 4.2, 4.3, wobei das Funktionselement 5 sowohl durch die über die an der Oberseite befindliche fluidi- sche Schnittstelle 4.1 zugeführte Probe (Medium) als auch durch die in den Reagenzienreservoiren 8 gelagerten Reagenzien in beliebiger Reihenfolge durchströmt werden kann und durch selektives Ver schließen der fluidischen Schnittstellen 4.1, 4.2 und 4.3 mit Kappen 11 (siehe Fig. 3d) der Fluidfluss bzw. die Abgabe vom Fluid gesteuert werden kann. Die Reagenzienreservoiren 8 können als Blister ausgebildet sein, wobei in eingekapselten Behältern vordefinierte Flüssigkeiten vorgehalten werden. D.h. die drei Reagenzienreservoiren 8 können verschiedene Arten von Flüssigkeiten enthalten und/oder auch verschiedene Mengen davon, um diese gezielt für die Behandlung der Probe zugeben zu können. Am Blistersitz 9 sind kleine Spitzen 10 vorhanden, die beim Betätigen des Blisters (Ein drücken) ein Öffnen der eingekapselten Behälter bewirken, sodass die Flüssigkeit sicher dem Kanal system 2 bzw. dem Funktionselement 5 zugeführt werden kann.
Die Flüssigkeit kann in einer Abfallkammer 7 der mikro fluidischen Vorrichtung gehalten werden oder über die fluidische Schnittstelle 4.3 an der Oberseite nach außen geführt werden, wobei durch Verschließen der fluidischen Schnittstellen 4.1 und 4.3 mit jeweils einer Kappe 11 die Flüssig keit auch über die fluidische Schnittstelle 4.2, die dann geöffnet ist, entnommen werden kann. Somit kann eine Zielflüssigkeit entnommen werden, wohingegen bei Aufbringen der Probe durch die fluidi sche Schnittstelle 4.1 diese anschließend durch eine Kappe verschlossen wird.
Das Funktionselement 5 kann entweder direkt mit der strukturierten Komponente 1 während des Fertigungsprozesses der strukturierten Komponente, z.B. im Spritzgussprozess durch Einlegen des Funktionselements 5, integriert werden oder nachträglich eingebracht werden.
Das Verfahren zur Nutzung der mikrofluidischen Vorrichtung sieht derart aus, dass die Probe über die fluidische Schnittstelle 4.1 eingeführt wird, die fluidische Schnittstelle 4.1 nach Zuführung der Probe verschlossen wird, wobei auch die fluidische Schnittstelle 4.3 zum Herausführen des Ab falls durch eine Kappe 11 verschlossen ist. Bestandteile der Probe verbleiben im Funktionselement 5. Anschließend kann ein Ausspülen des Funktionselement 5 erfolgen, wobei verschiedene Reagenzien oder Fuft durch das Funktionselement 5 gespült werden. Im nächsten Schritt erfolgt ein Herausspülen der Zielkomponente aus dem Funktionselement 5, was durch spezielle Reagenzien, Druck, Tempera tur oder eine Kombination dieser Methoden erfolgen kann, wobei die ungewünschten Fraktionen entweder in der Abfallkammer 7 gelagert werden oder aus der mikrofluidischen Vorrichtung über die fluidische Schnittstelle 4.3 herausgespült werden. Zielkomponenten werden dann über die fluidische Schnittstelle 4.2 erhalten, wobei ein Nachdrücken mit einem Verdrängermedium nach dem Ablösen der Zielkomponente vom Funktionselement 5 besonders vorteilhaft ist, um ein quantitatives Heraus spülen der Zielkomponente zu erhalten, so dass über dieses Verfahren die Zielkomponente in dem erhaltenen Eluat nicht nur gereinigt, sondern auch im Vergleich zum Ursprungsmedium angereichert werden kann. Das Durchströmen mit unterschiedlichen Medien ermöglicht zudem ein Fraktionieren, d.h. das Eluieren unterschiedlicher Bestandteile des Ursprungsmediums aus dem Funktionselement 5. In einer besonderen Ausgestaltung kann die mikrofluidische Vorrichtung Ventile im fluidi- schen Kanalsystem 2 aufweisen, die als Membranventile, Drehventile oder andere Ventile ausgestal tet sein können, und dazu dienen das Kanalsystem 2 oder Teile davon gezielt zu verschließen, um bspw. einen Abschnitt der mikrofluidischen Vorrichtung für eine bestimmte Zeit oder Reaktion oder Bearbeitungsvorgang abzukoppeln und somit die Flüssigkeit innerhalb des mikrofluidische Vorrich tung gezielt in andere Bereiche des Kanalsystems bzw. zu anderen weiteren Funktionselementen 5 oder zu einer bestimmten fluidischen Schnittstelle 4.1, 4.2, 4.3 zu lenken.
In einer besonderen Ausgestaltung kann die mikrofluidische Vorrichtung einen vorgeschalte ten Reaktionsraum 6, wie in Fig. 4a Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden wer- den.dargestellt, aufweisen. In der in Figur 4a-4d gezeigten mikrofluidischen Vorrichtung weist die strukturierte Komponente 1 , ein fluidisches Kanalsystem 2 auf, welches auf der Unterseite der struk turierten Komponente 1 angeordnet ist. Die Unterseite der strukturierten Komponente 1 und das darin eingebrachte fluidische Kanalsystem 2 ist mit dem weiteren Bauteil 3 flüssigkeitsdicht und bei Nut zung von Gasen als Medium auch gasdicht veschlossen.
Zwischen der als Eingang dienenden fluidischen Schnittstelle 4.1, die auf der Oberseite der strukturierten Komponente 1 angeordnet ist, und dem Funktionselement 5, welches vorzugsweise ein poröses Funktionselement 5 ist, ist ein Hohlraum bzw. eine Reaktionskammer 6 als Bestandteil des fluidischen Systems angeordnet. Die mikrofluidische Vorrichtung gemäß Fig. 4a-4d weist mehrere Reagenzienreservoire 8 auf, wovon wenigstens eines eine Flüssigkeitszufuhr vor dem Hohlraum 6 bereitstellen kann. Ebenso ist eine Flüssigkeitszufuhr nach dem Hohlraum 6 aber vor dem Funktions element 5 möglich, die hier nicht dargestellt ist. Drei weitere Reagenzienreservoire 8 sind so ange ordnet, dass eine Flüssigkeits- oder Reagenzienzufuhr zum Funktionselement 5 ermöglicht wird, d.h. die Reagenzienreservoire 8 geben ihre Medien in das Funktionselement 5 ab. Die Zugabe kann zeit versetzt erfolgen.
Die mikrofluidische Vorrichtung gemäß Fig. 4a-4d weist weitere fluidische Schnittstellen auf wovon eine fluidische Schnittstelle 4.3 hinter eine Kammer 7 geschaltet ist und eine weitere fluidi sche Schnittstelle 4.2 parallel zu der Kammer 7.
Die Probe gelangt über die anschließend zu verschließende fluidische Schnittstelle 4.1 (Fig. 4d) in den Hohlraum 6 und wird dort mit einem Reagenz aus einem Reagenzienreservoir 8 versetzt. Dann wird die resultierende Flüssigkeit über das Funktionselement 5 geleitet, wobei das Funktions- element 5 sowohl über die Medien aus dem Hohlraum / Reaktionsraum 6 als auch durch Reagenzien aus weiteren Reagenzienreservoiren 8 in beliebiger Reihenfolge durchströmt werden kann.
Durch selektives Verschließen der fluidischen Schnittstellen 4.1, 4.2, 4.3 mit Kappen 11 kann der Fluidfluss gesteuert werden.
Die Flüssigkeit kann in der Abfallkammer 7 in der mikrofluidische Vorrichtung gehalten werden oder über die mit der Kammer 7 verbundene fluidische Schnittstelle 4.3 an der Oberseite der strukturierten Komponente 1 nach außen abgeführt werden.
Durch Verschließen von der fluidischen Schnittstellen 4.1 und 4.3 kann dann Flüssigkeit über die geöffnete fluidische Schnittstelle 4.2 entnommen werden, z.B. für eine Entnahme einer Zielflüs- sigkeit, wohingegen bei Aufbringen der Probe durch die fluidische Schnittstelle 4.1 diese anschlie- ßend verschlossen wird.
In einer besonderen Ausgestaltung kann die mikro fluidische Vorrichtung eine zusätzliche Funktionselement 5 aufweisen, wie in Fig. 5a-d dargestellt. In dieser Ausgestaltung sind mehrere Reagenzienreservoire 8 vorhanden, die Flüssigkeiten oder Medien vor dem ersten Funktionselement 5 zuführen können oder dem zweiten Funktionselement 5 Flüssigkeiten zuführen können. Das erste und zweite Funktionselement 5 sind hintereinandergeschaltet. Die mikrofluidische Vorrichtung weist zwei Kammern 7 auf, von denen eine mit dem ersten Funktionselement 5 gekoppelt ist und mit einer fluidischen Schnittstelle 4.4. Eine erste fluidischen Schnittstelle 4.1 ist auf der Oberseite der struktu- rierten Komponente 1 angeordnet und über das Kanalsystem 2 mit dem ersten Funktionselement 5, welches vertikal durchströmt wird. An der Unterseite der strukturierten Komponente 1 ist das zweite Funktionselement 5 angeordnet, welches mit der zweiten Kammer 7 verbunden ist. Die zweite Kam mer 7 ist mit der fluidischen Schnittstelle 4.3 verbunden, wobei vor der zweiten Kammer 7 eine Ka nalabzweigung zu der fluidischen Schnittstelle 4.2 angeordnet ist.
Die strukturierte Komponente 1 ist hier mit zwei weiteren Bauteilen 3 bedeckt, die das fluidi sche Kanalsystem 2 flüssigkeitsdicht und bei Nutzung von Gasen als Medium auch gasdicht ver schließen. Dabei deckt das obere Bauteil 3 die Oberseite der strukturierten Komponente 1 nicht voll ständig ab, sodass die mehreren fluidischen Schnittstelle 4.1, 4.2, 4.3 und 4.4 nicht von dem oberen Bauteil 3 bedeckt sind. Das untere Bauteil deckt die strukturierte Komponente 1 vollständig ab.
Die Probe gelangt über die anschließend zu verschließende fluidische Schnittstelle 4.1 in den Hohlraum / Reaktionskammer 6, in dem das erste Funktionselement 5 angeordnet ist. Partikel werden durch das erste Funktionselement 5 zurückgehalten und durch das fluidische Kanalsystem 2 durch ein Verschließen der fluidische Schnittstelle 4.1 zum zweiten Funktionselement 5 geführt und von dort über die Kammer 7 zur fluidische Schnittstelle 4.3 oder direkt der aus der mikrofluidische Vorrich tung über die fluidische Schnittstelle 4.4 herausgeführt. Anschließend erfolgt durch eine Reagenzien zuführung eine Reaktion mit Partikeln, so dass nun kleinere Partikel über ein Öffnen des fluidischen Kanalsystems 2 zum zweiten Funktionselement 5 gelangen und Zielmoleküle auf diesem gehalten werden können und anschließend nach Zuführung von Reagenzien aus den Reagenzienreservoire 8 Zielmoleküle eluiert werden können, wohingegen zu verwerfende Fraktionen in der zweiten Kammer oder auch Abfallreservoir 7 gelagert oder aus der mikrofluidische Vorrichtung gespült werden kön nen.
In der Ausgestaltung gemäß Fig. 6a-6c weist die mikrofluidische Vorrichtung zwei Funkti- onselemente 5 auf, die hintereinandergeschaltet sind. Das erste Funktionselement 5 ist in einem Hohlraum 6 angeordnet und wird von oben, also vertikal durchströmt. Das erste Funktionselement 5 ist mit einem Reagenzienreservoir 8 gekoppelt. Das zweite Funktionselement 5 ist an der Unterseite angeordnet und über das Kanalsystem 2 mit dem Ausgang des ersten Funktionselements 5 gekoppelt, wobei ein weiteres Reagenzienreservoir 8 zur zusätzlichen Flüssigkeitszugabe dazwischengeschaltet ist.
Das erste Funktionselement 5 empfängt über die fluidische Schnittstelle 4.1 die Probe, die dann entweder bereits selbständig durch das erste Funktionselement 5 läuft oder durch Reagenzien aus dem Reagenzienreservoir 8 weiter in das zweite Funktionselement 5 getrieben wird. Durch das zweite Funktionselement 5 wird das Eluat dann über die fluidische Schnittstelle 4.2 aus der mikroflu- idische Vorrichtung abgeführt. Dabei können Reagenzien aus dem Reagenzienreservoir 8, das vor dem ersten Funktionselement 5 in das fluidische Kanalsystem 2 oder aus dem Reagenzienreservoir 8, das erst vor dem zweiten Funktionselement 5 in das fluidische Kanalsystem 2 trifft, bewegt werden.
Dabei ist das erste Funktionselement 5 eine Einheit zur Generierung von Plasma oder Serum aus Blut und das zweite Funktionselement 5 dient zur Entfernung hämolysierter roter Blutkörper chen.
Diese Ausgestaltung gemäß Fig. 6a-6c ermöglicht durch die Kombination von zwei Funkti- onselementen 5, größere Volumina der Probe über das erste Funktionselement 5 zu geben und durch das zweite Funktionselement 5 störende Komponenten zu entfernen, so dass sowohl das Problem der Erzeugung größerer Plasma/Serummengen auf einem mikrofluidischen Chip durch eine weiteren Schritte behoben wird und zudem auch Blutproben, die bereits Alterungseffekte aufweisen oder ge nerell schon lysierte rote Blutkörperchen aufweisen, genutzt werden können.
In der Ausgestaltung gemäß Fig. 7a-7c weist die mikrofluidische Vorrichtung zwei hinterei- nander geschalteten Funktionselemente 5, wobei das erste Funktionselement 5 über die fluidische Schnittstelle 4.1 mit der Probe beaufschlagt wird.
Die Probe läuft dann entweder selbständig durch das erste Funktionselement 5 läuft oder wird durch Reagenzien aus dem ersten zugeordneten Reagenzienreservoir 8 weiter in das zweite Funkti- onselement 5 getrieben.
Durch das zweite Funktionselement 5 kann das Eluat dann über die fluidische Schnittstelle 4.2, aus der Vorrichtung abgeführt werden, wobei Reagenzien aus dem Reagenzienreservoir 8, das vor dem ersten Funktionselement 5 in das fluidische Kanalsystem 2 oder aus dem Reagenzienreser voir, das erst vor dem zweiten Funktionselement 5 in das fluidische Kanalsystem 2 trifft, bewegt werden können.
Bei dieser Anordnung ist das erste Funktionselement 5 eine Einheit zur Generierung von Plasma oder Serum aus Blut, wobei das zweite Funktionselement 5 der Extraktion von Nukleinsäuren aus dem gewonnenen Plasma / Serum dient.
Dabei ist das mit dem ersten Funktionselement 5 verbundene Reagenzienreservoir 8 zum Verdünnen und Austreiben des gewonnenen Plasmas / Serums angeschlossen.
Die dem zweiten Funktionselement 5 vorgeschalteten Reagenzienreservoire 8 werden zum Austreiben ungewünschter Komponenten genutzt und zum Ablösen der Zielkomponente eingesetzt.
Um hier eine Verbesserung der Ablösung der Zielkomponente zu erreichen kann eine Wär mezufuhr erfolgen, wodurch die Ablösung verstärkt werden kann.
Die Fluidführung innerhalb der mikrofluidische Vorrichtung wird durch das Öffnen und Ver schließen der entsprechenden fluidischen Schnittstellen 4.1, 4.2 und 4.3 ermöglicht, so dass die Ziel fraktion sauber über eine der fluidischen Schnittstelle 4.2 oder 4.3 gewonnen werden kann bzw. di rekt in sich anschließende Bereiche des fluidischen Kanalsystem 2 transportiert werden kann.
Im Folgenden wird die mikrofluidische Vorrichtung gemäß Fig. 8a-8c beschrieben. Hier sindFehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden, drei hintereinander geschalteten Funk- tionselemente 5 angeordnet, wobei das erste Funktionselement 5 über die fluidische Schnittstelle 4.1 mit der Probe beaufschlagt wird.
Die Probe läuft dann entweder selbständig durch das erste Funktionselement 5 oder wird durch Reagenzien aus dem ersten Reagenzienreservoir 8 weiter zu dem zweiten Funktionselement 5 getrieben wird, wobei sich der Prozessschritt am zweiten Funktionselement 5 wiederholt und an schließend das Eluat über das dritte Funktionselement 5 geleitet wird, wobei ein Teil auf dem dritten Funktionselement 5 verbleibt und ungewünschte Komponenten über die Reagenzien der Reagenzien reservoire 8 ausgewaschen werden können und entweder in der Abfallkammer 7 verbleiben oder eine der fluidischen Schnittstelle 4.2 oder 4.3 abgeführt werden.
Die Wunschkomponente kann durch Verschließen des Teils des fluidischen Kanalsystems 2, das mit dem Abfallreservoir 7 direkt verbunden ist, über die fluidische Schnittstelle 4.2 gewonnen werden oder zu einer weiteren Bearbeitung Funktion im fluidischen Kanalsystem 2 geleitet werden.
Im Folgenden wird die mikro fluidische Vorrichtung gemäß Fig. 9a-9c beschrieben, die ähn lich wir Fig. 8a-8c aufgebaut ist, wobei ein zusätzlicher Detektionsraum 6 vorhanden ist. Der Detek tionsraum ist von einem wenigstens teilweise transparenten Bereich des Bauteils 3 bedeckt oder die strukturierte Komponente 1 ist im Bereich des Detektionsraum 6 wenigstens teilweise transparent, um eine optische Überprüfung des Zustandes des Eluats vornehmen zu können.
Auch hier sind drei hintereinander geschaltete Funktionselement 5 angeordnet, wobei das ers te Funktionselement 5 über die fluidische Schnittstelle 4.1 mit der Probe beaufschlagt wird.
Die Probe läuft dann entweder bereits selbständig durch das Funktionselement 5 oder wird durch Reagenzien aus dem ersten Reagenzienreservoir 8 weiter zum zweiten Funktionselement 5 getrieben, wobei sich der Prozessschritt am zweiten Funktionselement 5 wiederholt und anschließend das Eluat über das dritte Funktionselement 5 geleitet wird, wobei ein Teil des Eluats auf dem dritten Funktionselement 5 verbleibt und ungewünschte Komponenten über die Reagenzien der Reagenzien reservoire 8 ausgewaschen werden und entweder in der Abfallkammer 7 verbleiben oder abgeführt werden.
Die Wunschkomponente kann durch Verschließen des Teils des fluidischen Kanalsystems 2, das mit dem Abfallreservoir 7 direkt verbunden ist, gewonnen und entweder über die fluidische Schnittstelle 4.2 entnommen werden oder zu einer weiteren Funktion im fluidischen Kanalsystem 2 geleitet werden.
Durch das zweite Funktionselement 5 gelangt das Eluat dann über die fluidische Schnittstelle, Ausgang 4.2, aus der Vorrichtung, wobei Reagenzien aus dem Reagenzienreservoir 8, das vor dem ersten Funktionselement 5 an das fluidische Kanalsystem 2 angeschlossen ist oder aus dem Reagen zienreservoir, das erst vor dem zweiten Funktionselement 5 auf das fluidische Kanalsystem 2 trifft, bewegt werden können.
Das erste Funktionselement 5 ist dabei eine Einheit zur Generierung von Plasma oder Serum aus Blut. Das zweite Funktionselement 5 dient der Extraktion von Nukleinsäuren aus dem gewonne nen Plasma / Serum. Das mit dem ersten Funktionselement 5 verbundene Reagenzienreservoir 8 ist zur Verdünnung und zum Austreiben des gewonnenen Plasmas / Serums vorgesehen. Die dem zwei- ten Funktionselement 5 vorgeschalteten Reagenzienreservoire 8 dienen zum Austreiben ungewünsch ter Komponenten und zum Ablösen der Zielkomponente. Die Ablösung der Zielkomponente kann durch Temperaturzufuhr ebenfalls verstärkt werden, wobei die Fluidführung durch das Öffnen und Verschließen der entsprechenden fluidischen Schnittstellen ermöglicht wird, so dass die Zielffaktion sauber über eine fluidische Schnittstelle 4.2 oder 4.3 gewonnen werden kann bzw. direkt in sich an schließende Bereiche des fluidischen Kanalsystems 2 transportiert werden kann.
Die Ausgestaltung gemäß Fig. lOa- lOc ähnelt der Ausführung gemäß Fig. 9a-9c. Hier ist zu sätzlich ein zweiter Detektionsraum 6 vorhanden. Durch Zugabe von Indikatorlösungen aus einem der Reagenzienreservoire 8 lassen sich optisch erkennbare Reaktionen, bspw. Farbwechsel, erzeugen, die dann in einem der beiden Detektionsraume 6 beobachtet werden können.
Die Ausgestaltung gemäß Fig. l la- l lc ähnelt der Ausführung gemäß Fig. lOa-lOc. Hier ist im zweiten Detektionsraum ein Array mit Reagenzien angeordnet, die eine Reaktion des Eluats be wirken, die dann optisch wahrgenommen werden kann.
Die Ausgestaltung gemäß Fig. 12 zeigt exemplarisch Messfenster 13 an, die z.B. optisch aus gelesen werden können und vorzugsweise über mehrere Messtiefen verfügen, um den dynamischen Bereich der Messung zu erweitern. Besonders vorteilhaft ist dabei die Nutzung für Konzentrationsbe stimmungen eluierter Proben, z.B. der Konzentrationsbestimmung eluierter Nukleinsäuren oder Pro tein. Es ist jeweils ein Messfenster 13 hinter dem zweiten und dritten Funktionselement 5 angeordnet.
Die Ausführungsform gemäß Fig. l3a-l3c zeigt ein fluidisches System mit einer direkt ange koppelten Spritzenpumpe 14, 15, die einstückig mit der strukturierten Komponente 1 gebildet ist oder separat gefertigt sein kann. Die Spritzenpumpe enthält einen Körper 14 und einen Stößel 15. Die Spritzenpumpe kann über den Stößel 15 bedient werden und sowohl für die Lagerung von Fluiden, für die Aufnahme von Abfall während der Nutzung der fluidischen Systems als auch zur Steuerung und Kontrolle der Fluide während der Nutzung des fluidischen Systems zum Einsatz kommen kann. Die Spritzenpumpe ist an das Kanalsystem 2 angeschlossen.
Die Ausführungsform gemäß Fig. l4a - l4c beinhaltet zusätzlich zu den Komponenten von Ausführungsform Fig. 13 noch ein Drehventil 16, das die einzelnen Bereiche des fluidischen Netz werkes oder Kanalstränge hier exemplarisch ausgehend von der Spritzenpumpe 14 schalten kann, so dass Abschnitte getrennt oder gemeinsam fluidisch kontrolliert werden können. Fig. l4b zeigt eine Schnittansicht entlang der Linie l4b und Fig. l4c eine Ansicht entlang der Linie l4c.
Die Ausführungsform gemäß Fig. l5a-l5c beinhaltet ein fluidisches System ähnlich der Aus führungsform gemäß Fig. 14, das anstelle einer Reaktionskammer oder Detektionskammer 12, wie in Fig. l4a, mit nachgeschaltetem Reagenzienarray, mehrere parallele Reaktionskammem 20 beinhaltet, die z.B. für die PCR (Polymerasekettenreaktion), Real Time PCR, quantititative Real Time PCR (qPCR) oder eine kombinierte Reverse Transkription mit PCR (PCR, Real Time PCR, qPCR) genutzt werden können. Die Befüllung der Kammern 20 erfolgt parallel oder sukzessive und wird jeweils durch eine Entlüftung am Ende dieses fluidischen Netzwerkbereiches durch eine gaspermeable Membran 23 erreicht, wobei alternativ auch ein geschlossenes Luftreservoir durch die Kompressibili tät der Luft, Boyle-Mariotte-Effekt, Einsatz finden kann. Sowohl im Kanalsystem 2 als auch in den Reaktionsräumen 6 können Reagenzien vorgelegt sein. Die Ausführungsform gemäß Fig. l6a,l6b beinhaltet eine zusätzliche Kammer 20, die Rea genzien enthalten kann, vorzugsweise Reagenzien für eine PCR oder Reverse Transkription.
Bei den Ausführungsformen entsprechend den vorherigen Abbildungen können in einer oder mehreren der Kammern 6 und PCR-Kammem 20 Reagenzien vorgelagert sind, insbesondere Tro- ckenreagenzien für die Reverse Transkription oder PCR (RT-PCR, qPCR, PCR).
Ausführungsform gemäß Fig. l7a, l7b beinhaltet zusätzlich die Option des Verschlusses der PCR-Kammer 20 mit jeweils einem Membranventil 21, was besonders vorteilhaft ist, um die Fluide auch bei hohen Temperaturen in den PCR-Kammem 20 zu halten.
Ausführungsform gemäß Fig. l8a beinhaltet exemplarisch eine Reihe von Membranventilen 21, die der Fluidsteuerung im fluidischen System dienen und an verschiedenen Stellen im Kanalsys- tem 2 angeordnet sind, um Teil des Kanalsystem 2 zu verschließen und somit eine Steuerung des Fluidstromes innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung zu ermöglichen.
Ausführungsform gemäß Fig. 19 zeigt eine Reihe von Funktionselementen, die sequentiell die Probe vom Fluideingang prozessieren. Die Probe wird in den Fluideingang 4.1 eingegeben und ge langt dann in einen Reaktionsraum 6, der Mischelemente und Reagenzien enthalten kann und in den aus den Reagenzienreservoiren 8 Flüssigkeit zum Reagieren mit der Probe gegeben werden können.
Über die Drehventile 16 gelangt diese Mischung zum Funktionslement 5, um mittels Durch strömen mit verschiedenen Fluidien aus den Reagenzienreservoiren 8 die gereinigten Zielmoleküle zu erhalten, deren Volumen anschließend über die Messschleifen 22 am zweiten Drehventil 16 ab gemessen werden kann und die dann mit jeweils einem definierten Volumen zur nächsten Reaktions kammer 6 gelangen können, wobei darin ggf. Trocken- oder Flüssigreagenzien vorgelegt sein kön nen. Anschließend gelangt diese Mischung in die parallelen Reaktionskavitäten 6, die z.B. für eine PCR (qPCR, RT-PCR, PCR) 20 genutzt werden können. Die Fluidsteuerung erfolgt über die Sprit zenpumpe 14, die Drehventile 16 und das selektive Ausleeren der Reagenzienreservoire 8.
Dabei kann die Ausführungsform gemäß Fig. 19 derart genutzt werden, dass durch ein Sie gelverfahren die Ausgangskanäle und/oder die Eingangskanäle aus den Reaktions- / PCR-Kammem 20 z.B. durch Schweißen, Hitzesiegelung oder Druck versiegelt werden und so die Flüssigkeiten auch während der Temperaturzyklen einer PCR in den Kammern 20 verbleiben.
Bei einem Verfahren gemäß Fig. 19 wird eine nukleinsäurehaltige Probe über die fluidische Schnittstelle 4.1 mittels der integrierten Spritzenpumpe 14 in die Reaktionskammer 6 angesaugt. In dieser Reaktionskammer 6 wird die Probe mit Lysepuffer aus den Reagenzienreservoiren 8 gemischt und aktiv lysiert. Das Probenlysat wird durch die integrierte Spritzenpumpe 14 über das Drehventil 16 durch das Element gesaugt. Im Weiteren wird die Probe im Funktionselement 5 durch Waschpuf fer aus den Reagenzienreservoiren 8 gereinigt so, dass saubere Nukleinsäure im Funktionselement 5 verbleibt. Überständige Probe und Waschpuffer werden mittels der Spritzenpumpe 14 abgesaugt und verbleiben in dieser als Abfall. Durch ein Verdrängungspuffer aus den Reagenzienreservoiren 8 wer den verbliebene Bestandteile der Waschpuffer entfernt und anschließend mit dem Elutionspuffer aus den Reagenzienresrevoiren 8 geflutet. Nach einer Inkubation des Elutionspuffers im Funktionsele- ment 5 wird dieser durch Druck aus den verbleibenden Reagenzienreservoiren über das Drehventil 16 in die Messschleife 22 gepumpt und so das gewünschte Volumen genau im fluidichen Kanalsystem 2 platziert. Eine mit Entlüftung versehene Abfallstruktur 7 dient dazu als Überlauf für das überständige Eluat. Das gewonnene Nukleinsäureeluat wird anschließend mit PCR-Reagenz oder Puffer aus dem Reagenzienreservoiren 8 aus der Messschleife 22 gespült und in die Reaktionskammer 6 transpor tiert. Diese kann getrocknete PCR-Reagenzien enthalten, welche in der Reaktionskammer 6 in Sus- pension gebracht werden. Durch weiteren Druck aus den Reagenzienreservoiren 8 wird das Gemisch aus Eluat und PCR-Reagenz über das Drehventil 16 in die PCR/ qPCR /RT-PCR Kammern 6/20 ge drückt und diese homogen geflutet. Die PCR Kammern 6/20 können in einer bevorzugten Variante anschließend thermisch am Kammereingang und -ausgang verschlossen werden, und anschließend erfolgt der Temperaturzyklus mit Amplifikation und optischer Detektion.
In eine bevorzugten Variante erfolgt eine isothermale Amplifikation der Nukleinsäure.
In einer weiteren bevorzugten Variante handelt es sich bei der aufgereinigten Nukleinsäure um RNA, die vor der der Amplifikation eine Reverse Transkription durchläuft.
Die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung oder fluidische Funktionseinheit kann als eigenständiges Bauteil genutzt werden, aber gleichzeitig auch Bestandteil eines erweiterten fluidi- schen Netzwerkes sein. Dies ist insbesondere bei mikrofluidischen Chips der Fall, die weitere Funk tionen abdecken und die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung und die erfindungsgemäßen Verfahren zu deren Betrieb nur Teilbereiche abdecken.
Fluidische Schnittstellen sind Elemente, die zur Einbringung oder Ausbringung von Medien, zum Entlüften, zum Verschließen oder Öffnen zur Beaufschlagung mit Druck oder zum Anlegen eines Unterdrucks und auch zur Verbindung mit Schnittstellen eines Gerätes oder zur Nutzung durch einen händischen Bediener verwendet werden können. Diese fluidischen Schnittstellen können eine beliebige Form aufweisen, beispielsweise als Löcher, Vertiefungen, Mini Luer-, Luer-, Luer-Lok-, Olivenanschlüssen oder andere Geometrien aufweisen und bei einer Entlüftungsvariante mit gas durchlässigen aber flüssigkeitsdichten Komponenten, z.B. gaspermeablen Membranen, verschlossen sein.
Der Verschluss fluidischer Schnittstellen kann generell über zusätzliche Elemente wie Kap pen erfolgen, oder unter Nutzung von Ventilen auf dem Funktionselement in Form von Membran ventilen, Drehventilen oder passiven Ventilen, z.B. über Kanalverjüngungen, oder Oberflächenmodi fikationen des Grundmaterials. Die Ventile werden dabei zumeist durch ein entsprechendes Betriebs gerät bedient, alternativ ist eine händische Bedienung für einige Ausführungsformen möglich.
Die Elemente (Filter, Membranen, Fritten, Papier oder ähnliche Elemente) können direkt im Fertigungsprozess des strukturierten Elements mit diesem verbunden werden, beispielsweise als Ein- legeteile im Spritzguss (Insert-Molding) oder nachträglich eingefügt werden.
Die als Hohlraum 6, 7 beschriebenen Teile des fluidischen Netzwerkes können als Kammer, Kanal etc. ausgestaltet sein und müssen sich nicht notwendigerweise in den geometrischen Dimensi onen vor oder nach dieser Kammer, z.B. den Kanalquerschnitten, unterscheiden.
Die in den verschiedenen Ausführungsformen dargestellten Reagenzienreservoire 8 können auch als fluidische Schnittstellen ausgebildet sein und über externe Reagenzienreservoire, z.B. von einem Betriebsgerät gespeist werden. Der Fluidtransport auf dem Funktionselement kann über externe Druck- oder Vakuumbeauf- schlagung, Druckbeaufschlagung von Reagenzienreservoiren, integrierte Pumpventile, Oberflächen kräfte, Kapillarkräfte etc. erfolgen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine mikrofluidische Vorrichtung mit einem fluidischen System mit mindestestens einer fluidischen Schnittstelle und zumindest einem eingebrachten porösen Funktionselement, durch das eine Probe geführt wird und durch das anschließend weitere Flüssigkei ten oder Gase gelenkt werden können. Dabei weist die ganze Vorrichtung mindestens ein strukturier tes Bauteil und mindestens ein auf dem strukturierten Bauteil aufgebrachtes Bauteil auf sowie das vorzugsweise poröse Funktionselement.
Die erfindungsgemäße Funktionseinheit dient der Trennung, Aufreinigung, Fraktionierung und Konzentration von Komponenten.
Besondere Ausführungsformen der Funktionseinheit beinhalten mehrere Funktionselemente und weisen zudem Flüssigkeitsreservoire auf der mikro fluidischen Vorrichtung auf.
Erfindungsgemäß ist die mikrofluidische Vorrichtung mit einem entsprechenden Verfahren zu betreiben.
Der Betrieb des Systems kann sowohl händisch als auch mittels einfacher Vorrichtungen oder Geräte erfolgen.
Wird von einer PCR-Kammer 20 gesprochen, kann dies gleichbedeutend mit einer Kammer für die verschiedenen Formen der PCR, wie Real Time PCR, quantitative PCR, kombinierte Reverse Transkription, Reverse Transkription oder auch isothermalen Verfahren der Amplifikation von Nuk leinsäuren wie NASBA, RCT etc. sein.
1 Strukturiertes Bauteil / strukturierte Komponente
2 Fluidisches Netzwerk / Kanalsystem
3 Bauteil
4 Fluidische Schnittstelle
4.1 Fluidische Schnittstelle - Eingang
4.2 Fluidische Schnittstelle - Ausgang
4.3 Fluidische Schnittstelle - z.B. Ausgang für Abfall, Entlüftung
5 Funktionselement / poröses Element (Filter/Membran/Fritte/Papier oder ähnliches Element)
6 Hohlraum / Reaktionsraum - Bestandteil des fluidischen Systems / Kanalsystems
7 Hohlraum / Abfallkammer
8 Reagenzienreservoir / z.B. Blister 20 PCR- / qPCR- / RT-PCR-Kammer
9 Blistersitz 21 Membran ventil
10 Durchstechelemete 22 Volumenmesselement (Messschleife) 11 Kappe 23 Entlüftungsmembran
12 Detektionsraum
13 Messfeld
14 Körper Spritzenpumpe
15 Stößel Spritzenpumpe
16 Drehventil
17 Drehventilsitz
18 Drehventilkörper
19 Drehventilkappe

Claims

Ansprüche
1. Mikro fluidische Vorrichtung, umfassend:
eine strukturierte Komponente (1), die als flächiger Körper ausgebildet ist,
ein mikrofluidisches Kanalsystem (2), das in der strukturierten Komponente (1) ausgebildet ist, wenigstens ein auf einer Oberfläche der strukturierten Komponente (1) aufgebrachtes Bauteil
(3),
wenigstens ein poröses Funktionselement (5), und
wenigstens eine fluidische Schnittstelle (4.1, 4.2, 4.3), die an der strukturierten Komponente (1) zur Zufuhr von Medien in das mikrofluidische Kanalsystem (2) angeordnet ist.
2. Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, weiter aufweisend: wenigstens ein Flüssigkeitsre- servoir (8, 16), eine Kanalverjüngung, ein Ventil, einen Schalter, ein Verteiler, ein Drehventil, eine Entlüftungsmembran, eine Kammer (7), einen Hohlraum (7) und/oder eine Reaktionskavität (6), oder eine Kombination davon.
3. Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Bauteil (3) auf einer Oberseite und/oder Unterseite der strukturierten Komponente (1) aufgebracht ist, um mikrofluidische Struktu- ren flüssigkeitsdicht und gasdicht zu verschließen.
4. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Bauteil (3) wenigs- tens teilweise transparente und/oder wenigstens teilweise lichtdichte Bereiche aufweist.
5. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Bauteil (3) als Folie ausgebildet ist, die auf der Ober- und/oder Unterseite der strukturierten Komponente (1) aufgeklebt ist.
6. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei wenigstens zwei fluidi- sche Schnittstellen (4.1, 4.2, 4.3) an der strukturierten Komponente (1) angeordnet sind, wobei we- nigstens eine der fluidischen Schnittstellen (4.1, 4.2, 4.3) vertikal, horizontal und/oder in einem beliebigen Winkel zu einer Strömungsrichtung des Kanalsystems (3) und/oder zu einer Oberfläche der strukturierten Komponente (1) der mikro fluidischen Vorrichtung angeordnet ist, wobei die we nigstens eine fluidische Schnittstelle (4.1, 4.2, 4.3) zur Medienzuführ, Probenzufuhr, Medienzugabe und/oder der Beaufschlagung mit positivem oder negativem Druck und/oder zur Entlüftung vorge- sehen ist.
7. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die wenigstens eine flui- dische Schnittstelle (4.1, 4.2, 4.3) und/oder das Kanalsystems (3) und/oder Teile davon von wenigs- tens einem integrierten Ventil, von wenigstens einem externen Schalter oder wenigstens einem Ventil und/oder wenigstens einer Kappe (11) verschließbar ist, wobei die Ventile als Membranven tile oder Drehventile ausgestaltet sind.
8. Mikro fluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei zusätzlich mindestens eine Spritzenpumpe (14) mit zugehörigem Stößel (15) und/oder Kolben integriert ist.
9. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 - 8, wobei das Kanalsystem (2) mit einem Drehventil (16) fluidisch steuerbar ist und Kanäle über mindestens ein Drehventil (16) ver bunden werden können, um ein Öffnen und Schließen des fluidischen Netzwerkes und/ das Abmes sen von Volumina über Messchleifen (22) zu ermöglichen.
10. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 - 9, wobei das Kanalsystem (2) mit Dreh- und Membranventilen (16, 21) fluidisch steuerbar ist, wobei diese ein Öffnen und/oder Schließen eines Teil des fluidischen Netzwerkes (2) ermöglichen und/oder bei dem ein Fluidstrom im Kanalsystem (2) über Membranventile (21) steuerbar ist, d.h. die Membranventile das Öffnen oder Schließen eines Kanals ermöglichen.
11. Mikro fluidisches Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 - 10, das in den Reaktionskammern (6) und/oder PCR- Kammern (20) vorgelegte Reagenzien enthält und/oder in den Reaktionskam- mem (6) und/oder PCR Kammern (20) vorgelegte Trockenreagenzien enthält.
12. Mikro fluidisches Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 - 11, wobei in Strömungsrichtung in den dem Funktionselement (5) nachgeschalteten PCR-Kammem (20) ein vollständiger Mastermix einschließlich Primern bzw. Primern und Probes vorgelegt ist, wobei die parallelen PCR-Kammern (20) unterschiedliche Primer enthalten, oder
wobei in Strömungsrichtung in einer der den Funktionselementen (5) nachgeschalteten Kammer (6) ein Mastermix ohne Primer und Probes vorgelegt ist und die nachfolgend vom Fluid erreichten pa rallelen PCR-Kammem (20) die unterschiedliche Primer bzw. Primer und Probes enthalten.
13. Mikro fluidisches Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 - 12, wobei in Strömungsrichtung eine der den Funktionselementen (5) nachgeschalteten Kammern (6) die Reagenzien für eine Rever se Transkription vorgelegt sind und die nachfolgend vom Fluid erreichten parallelen PCR- Kammem (20) die unterschiedliche Primer bzw. Primer und Probes mit Mastermix enthalten.
14. Mikrofluidisches Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 - 13, wobei in Strömungsrichtung eine der den Funktionselementen (5) nachgeschalteten Kammern (6) die Reagenzien für eine Rever se Transkription vorgelegt sind, ebenso wie der Mastermix für die PCR ohne Primer bzw. Primer und Probes und die nachfolgend vom Fluid erreichten parallelen PCR- Kammern (20) die unter schiedliche Primer bzw. Primer und Probes enthalten.
15. Mikro fluidisches Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 - 14, wobei in Strömungsrichtung eine der den Funktionselementen (5) nachgeschalteten Kammern (6) die Reagenzien für eine Rever se Transkription vorgelegt sind, in einer folgenden Kammer der Matermix für die PCR ohne Primer bzw. Primer und Probes und die nachfolgend vom Fluid erreichten parallelen PCR- Kammern (20) die unterschiedliche Primer bzw. Primer und Probes enthalten.
16. Mikrofluidisches Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 - 14, wobei in Strömungsrichtung eine der den Funktionselementen (5) nachgeschalteten Kammern (6) die Reagenzien für eine Rever se Transkription vorgelegt sind ebenso wie der Mastermix für die PCR ohne Primer bzw. Primer und Probes und die nachfolgend vom Fluid erreichten parallelen PCR- Kammern (20) die unter schiedliche Primer bzw. Primer und Probes enthalten.
17. Mikrofluidisches Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 - 16, wobei die Reagenzien außer halb der Fluidreservoire (8) trocken in der mikrofluidischen Vorrichtung vorgelegt sind und/oder die Reagenzien trocken und flüssig in der mikrofluidischen Vorrichtung vorgelegt sind.
18. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die mikrofluidische Vorrichtung zur Trennung, Aufreinigung, Fraktionierung und/oder Konzentration von Komponen ten eines zugeführten Mediums oder einer Probe vorgesehen ist und/oder in der mikrofluidischen Vorrichtung zwischengeschaltete Reaktionsschritte durch Zugabe von Reagenzien erfolgen können, um Zielkomponenten erhalten, abtrennen und oder aufkonzentrieren zu können.
19. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die mikrofluidische Vorrichtung zur Trennung, Aufreinigung, Fraktionierung und/oder Konzentration von Komponen ten eines zugeführten Mediums oder einer Probe vorgesehen ist und/oder in der mikrofluidischen Vorrichtung zwischengeschaltete Reaktionsschritte durch Zugabe von Reagenzien erfolgen können, um Zielkomponenten erhalten, abtrennen und oder aufkonzentrieren zu können, wobei es sich bei den Zielmolekülen um Nukleinsäuren handelt.
20. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die mikrofluidische Vorrichtung mehrere Funktionselemente (5), insbesondere poröse Funktionselemente (5), und/oder ein oder mehrere Flüssigkeitsreservoire aufweist, die vor und/oder zwischen die mehrere Funkti- onselemente (5) geschaltet sind.
21. Mikro fluidische Vorrichtung nach Anspruch 20, wobei ein erstes Funktionselement (5) zur Ge- nerierung von Plasma oder Serum aus Blut eingerichtet ist und ein zweites Funktionselement (5), welches dem ersten Funktionselement (5) nachgeschaltet ist, zur Entfernung hämolysierter roter Blutkörperchen dient.
22. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die mikro fluidische Vorrichtung als Funktionseinheit oder als mikrofluidisches System ausgebildet ist und/oder mit einer oder mehreren anderen mikro fluidischen Einheiten koppelbar ist, um Medien von diesen zu erhalten oder an diese abzugeben.
23. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei der Betrieb der mikro- fluidischen Vorrichtung sowohl manuell als auch mittels angeschlossener Vorrichtungen oder Gerä te erfolgen kann, die an die mikrofluidische Vorrichtung gekoppelt oder angeschlossen sind, um Über- und/oder Unterdrück oder Prozessmedien zuzuführen.
24. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die strukturierte Kom ponente (1) mittels Spritzguss herstellbar ist.
25. Verfahren zum Verarbeiten eine Blutprobe mit einer mikro fluidischen Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-24, wobei die Probe einem ersten Funktionselement (5) zugeführt wird und das Funktionselement (5) aus der Blutprobe Plasma oder Serum erzeugt und ein zweites Funktionsele- ment (5), welches dem ersten Funktionselement (5) nachgeschaltet ist, hämolysierte rote Blutkör perchen entfernt.
26. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, insbesondere mittels einer mikro fluidischen Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1-24, bei dem eine Probe über die fluidische Schnittstelle (4.1) zugeführt wird und in einer Reaktionskammer (6) mit Reagenzien versetzt wird, die in der Probe befindliche Zellen lysieren, die Probe anschließend über ein Funktionselement geführt wird, während der Ausgang (4.2) verschlossen ist und ungewünschte Moleküle entweder direkt mit der Probe in ein Abfallreservoir (7) gelangen oder durch ein Spülen des Funktionselements (5) mit Re agenzien aus den Flüssigkeitsreservoiren (8) abgelöst werden, während die Zielmoleküle, Nuklein säuren, am Funktionselement (5) verbleiben und erst durch ein spezielles Reagenz aus einem der Flüssigkeitsreservoire (8) abgelöst werden, wobei vorab der Fluidausgang (4.3) am Abfallreservoir (7) geschlossen und der Ausgang (4.2) geöffnet wird und die gewonnenen Nukleinsäuren aus dem fluidischen System über den jetzt geöffneten Ausgang (4.2) entnommen werden können.
27. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, insbesondere mittels einer mikro fluidischen Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1-24, bei dem eine Probe über die fluidische Schnittstelle (4.1) zugeführt wird und in einer Reaktionskammer (6) mit Reagenzien versetzt wird, die in der Probe befindliche Zellen lysieren, die Probe anschließend über ein Funktionselement (5) geführt wird, während der Ausgang (4.2) verschlossen ist und ungewünschte Moleküle entweder direkt mit der Probe in ein Abfallreservoir (7) gelangen oder durch ein Spülen des Funktionselements (5) mit Reagenzien aus den Flüssigkeitsreservoiren (8) abgelöst werden, während die Zielmoleküle, Nukle- insäuren, am Funktionselement (5) verbleiben und erst durch ein spezielles Reagenz aus einem der Flüssigkeitsreservoire (8) abgelöst werden, wobei vorab der Fluidausgang (4.3) am Abfallreservoir (7) geschlossen und der Ausgang (4.2) geöffnet wird und die gewonnenen Nukleinsäuren aus dem fluidischen System über den geöffneten Ausgang (4.2) entnommen werden können, wobei es sich bei den Nukleinsäuren um DNA handelt.
28. Verfahren zur Auffeinigung von Nukleinsäuren, insbesondere mittels einer mikro fluidischen Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1-24, bei dem eine Probe über die fluidische Schnittstelle
(4.1) zugeführt wird und in einer Reaktionskammer (6) mit Reagenzien versetzt wird, die in der Probe befindliche Zellen lysieren, die Probe anschließend über ein Funktionselement (5) geführt wird, während der Ausgang (4.2) verschlossen ist und ungewünschte Moleküle entweder direkt mit der Probe in das Abfallreservoir (7) gelangen oder durch ein Spülen des Funktionselements (5) mit Reagenzien aus den Flüssigkeitsreservoiren (8) abgelöst werden, während die Zielmoleküle, Nukle- insäuren, am Funktionselement (5) verbleiben und erst durch ein spezielles Reagenz aus einem der Flüssigkeitsreservoire (8) abgelöst werden, wobei vorab der Fluidausgang (4.3) am Abfallreservoir (7) geschlossen und der Ausgang (4.2) geöffnet wird und die gewonnenen Nukleinsäuren aus dem fluidischen System über den jetzt geöffneten Ausgang (4.2) entnommen werden können, wobei es sich bei den Nukleinsäuren um RNA handelt.
29. Verfahren zur Auffeinigung von Nukleinsäuren, insbesondere mittels einer mikro fluidischen Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1-24, bei dem eine Probe über die fluidische Schnittstelle
(4.1) zugeführt wird und über ein Funktionselement (5) gefiltert wird, so dass die Zellen zurück bleiben und ungewünschte Komponenten in das Abfallreservoir (7) gelangen dessen fluidische Schnittstelle (4.3) geöffnet ist, was durch ein Verschließen der fluidischen Schnittstellen (4.2 und 4.3) hinter dem in Strömungsrichtung zweiten Funktionselement (5) ermöglicht wird, anschließend erfolgt durch Kontakt der Zellen zu Reagenzien im Hohlraum (6) über dem ersten Funktionsele- ment (5) eine Lyse der Zellen, gefolgt von einem Transport des Lysates durch Fluide aus einem der mit dem ersten Funktionselement (5) verbundenen Reagenzienreservoire (8), gefolgt von einem Transport des Lysates zum zweiten Funktionselement (5), wobei nun die fluidische Schnittstelle (4.3) hinter dem zweiten Funktionselement (5) geöffnet ist und die anderen fluidischen Schnittstel- len geschlossen sind, wobei sich die Zielmoleküle und weitere Moleküle an das Funktionselement (5) binden und durch Spülen mit Fluiden aus den Reagenzienreservoiren (8) ein Ablösen unge- wünschter Moleküle erfolgt und letztlich nach Schließen der fluidischen Schnittstelle (4.3) und Öff- nen des Fluidausgangs (4.2) ein Loslösen der Nukleinsäuren durch ein Reagenz und ein Austreiben des Eluats und die Entnahme aus dem Fluidausgang (4.2) erfolgt.
30. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, insbesondere mittels einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1-24, bei dem eine Probe über die fluidische Schnittstelle (4.1) zugeführt wird und über ein Funktionselement (5) gefiltert wird, so dass die Zellen zurück bleiben und ungewünschte Komponenten in das Abfallreservoir (7) gelangen, dessen fluidische Schnittstelle (4.3) geöffnet ist, was durch ein Verschließen der fluidischen Schnittstellen (4.2 und 4.3) hinter dem in Strömungsrichtung zweiten Funktionselement (5) ermöglicht wird, anschließend erfolgt durch Kontakt der Zellen zu Reagenzien im Hohlraum (6) über dem ersten Funktionsele- ment (5) eine Fyse der Zellen, gefolgt von einem Transport des Fysates durch Fluide aus einem der mit dem ersten Funktionselement (5) verbundenen Reagenzienreservoire (8), einem Transport des Fysates zum zweiten Funktionselement (5), wobei nun die fluidische Schnittstelle (4.3) hinter dem zweiten Funktionselement (5) geöffnet ist und die anderen fluidischen Schnittstellen geschlossen sind, wobei sich die Zielmoleküle und weitere Moleküle an das Funktionselement (5) binden, durch Spülen mit Fluiden aus den Reagenzienreservoiren (8) erfolgt ein Ablösen ungewünschter Moleküle und letztlich erfolgt nach Schließen der fluidischen Schnittstelle (4.3) und Öffnen des Fluidaus- gangs (4.2) ein Foslösen der Nukleinsäuren durch ein Reagenz und ein Austreiben des Eluats und die Entnahme aus dem Fluidausgang (4.2), wobei es sich bei der Nukleinsäure um DNA handelt oder es sich bei der Nukleinsäure um RNA handelt.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 - 30, in Kombination mit einem Verfahren nach 25.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 26-31, wobei die aufgereinigte Nukleinsäure einer an schließenden Amplifikation und Detektion unterzogen wird; und/oder
wobei die aufgereinigte Nukleinsäure eine RNA ist und anschließend zunächst einer Rever sen Transkription und anschließend einer Amplifikation und Detektion unterzogen wird; und/oder wobei alle Reagenzien in flüssiger oder trockener Form auf dem mikrofluidischen System vorgelegt sind; und/oder
wobei die aufgereinigte Nukleinsäure eine DNA ist und mittels qPCR amplifiziert und nachgewiesen wird; und/oder
wobei die aufgereinigte Nukleinsäure eine DNA ist und mittels isothermaler Amplifikation amplifiziert und nachgewiesen wird; und/oder
wobei die aufgereinigte Nukleinsäure eine DNA ist, die in einer ersten Kammer (20) mittels einer unspezifischen PCR voramplifiziert und anschließend in einer spezifischen qPCR nachgewie sen wird; und/oder wobei die aufgereinigte Nukleinsäure eine RNA ist, die in einer ersten Kammer (20) einer Reversen Transkription unterworfen wird und in einer zweiten Kammer (20) mittels qPCR amplifi- ziert und nachgewiesen wird; und/oder
wobei die aufgereinigte Nukleinsäure eine RNA ist, die in einer Kammer (20) sowohl der Reversen Transkription als auch der qPCR (one-step-RT-PCR) unterworfen wird; und/oder
wobei mehrere parallele qPCR-Kammem (20) vorliegen, um die qPCR in parallelen PCR- Kammem ablaufen zu lassen; und/oder
wobei die qPCR als Duplex-PCR mit interner Kontroll- Amplifikation abläuft; und/oder wobei die qPCR als Multiplex-PCR mit interner Kontroll- Amplifikation abläuft; und/oder wobei es sich um eine konventionelle PCR handelt, die optional anschließend über einen Ar- ray mittels Hybridisierung nachgewiesen wird.
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