CN1950506A - 核酸纯化芯片 - Google Patents

Abstract

本发明提供从细胞材料如血中提取和纯化核酸(DNA、RNA等)的新***。这种提取和纯化***依赖于新的整体式微流控装置和使用这些装置的方法。这样的装置包含整体整合在单芯片上的很多组件，还包含新的核酸结合材料。本发明还涉及制备这种新的核酸结合材料的方法。

Description

核酸纯化芯片

相关申请的交叉引用

本申请要求享有于2003年12月30日提交的、序列号为60/533,297的以下美国临时专利申请的优先权。

技术领域

本发明一般地涉及生物技术，具体地涉及用于提取和纯化核酸的基于芯片的微流控(microfluidic)方法和装置。

背景技术

基因组学有广泛的应用领域，如犯罪分析、临床诊断等。其应用于诸如农业、保健、环境监测和药学研究等的领域。在大多数情况下，基因组DNA从来自人血的白细胞获得。用于获得这种DNA的方法通常要求从各自生物来源分离核酸。对于从血中纯化人DNA来说，DNA开始时限制于白细胞内。为了提取和纯化该DNA，必须用一种或多种不同方法打开(裂解)细胞膜，这些方法包括化学、渗透压、热、电和物理方法。

在医院或实验室从血中获得这种DNA的当前技术仍然非常费力并且要求很多经常是手工的步骤。以前的步骤是裂解血细胞，其中细胞被破裂打开并且其核酸被释放入可用于纯化的溶液和相应区域中。细胞膜破裂和释放核内容物的方法意味着其它生物分子也将在溶液中存在。这些分子中的一些，如蛋白质和金属复合物(例如血红蛋白)以不期望的方式与核酸结合，进而干扰典型的后续处理步骤如PCR扩增(聚合酶链式反应)。因此，需要从碎片材料中分离DNA的步骤。之后，任何DNA纯化***的要求都是必须分离核酸，同时洗去这些抑制剂。所有这些步骤一般都是手工操作，需要大量时间。因此，开发能自动进行这些操作、使用更少样品的一些方法是重要的。

生产能以自动方式处理和加工微升μl(或更小)体积的人全血以提供纯化的基因组DNA作为输出的微流控芯片将是有用的。最理想的是，这种DNA样品制备微流控芯片是集成微混合器、微过滤器、微反应器等的装置。输出应该具有与现在使用的常规宏观***相似的产率和纯度。分子生物学技术的当前趋势要求测试方法保持良好产率结果但减少测试时间、试剂体积和成本。而且，自动化水平增加更常见。还有小型化的要求，使得测试不需限制于中心实验室、而可以是便携的，以便用于现场应用或护理点测试。

对于芯片设计，在过去10年中已经多次公开单个的过滤器、阀、混合器和反应器组件，但对于不同组件的这些设计有专门的应用，排斥了它们用于一般性目的的组合。实现DNA样品制备/纯化要求的所有这些组件的集成仍是一种大挑战。尽管在聚合物衬底上集成多个组件之前已经被公开，这些一般用于微阵列、PCR***。用于从血中进行DNA样品制备/纯化的全微流控方案技术的唯一已知实例已经被Kim等人公开。见Kim et al.，″A Disposable DNA Sample Preparation Mierofluidie Chip forNucleic Acid Probe Assay，″IEEE-MEMS 2002，pp.133-136。其将硅过滤器和玻璃反应器集成在PDMS衬底上(衬底包括混合器)。Kim等人报告的方案是在聚合物衬底上集成微机械组件的变换方式。不同的组件是结合物(binder)(由玻璃制造)和过滤器(由硅、镍和PDMS制造)。连接衬底不同于传统互连(interconnect)衬底，因为互连形成微混合器。

当前用于核酸纯化的典型操作方案涉及很多步骤，其中多种试剂被加入样品中，并且样品被离心以分离沉淀组分和溶液。这种方法非常复杂，很多情况下仍是手工进行。因为核酸已知选择性结合一些表面，大量研究集中于这些类型的相互作用。已经发现适用于核酸结合的多种表面，并且这种结合技术使用硅胶珠结合、偶联抗体、硅烷、合成核酸、聚赖氨酸、聚-T-DNA、某些酸和碱。

最近已经开发了几种方法和装置，以试图改进微型装置中的基因组分析***。美国专利No.6,379,929公开了在微加工衬底中等温扩增核酸的方法和组合物。也公开了在微加工衬底中分析等温扩增核酸的方法和组合物。提供的微加工衬底和等温扩增和检测方法意图用于多种诊断方法，尤其是与特征为基因序列或基因表达改变的疾病相关的那些。然而，这些仅关注核酸扩增，而没有考虑DNA提取和纯化。

美国专利No.6,368,871描述了用于操作流体样品中材料(如颗粒、细胞、大分子、如蛋白质、核酸或其它成分)的装置和方法。所述装置包含具有很多微结构(柱形物)和该结构上绝缘膜的衬底。向所述结构施加电压诱导分离样品中的材料。所述装置和方法可用于广泛的应用，如介电电泳(DEP)或使目标材料与流体样品中其它材料分离。这些技术使用柱形结构，向其施加电压以利于混合。

美国专利No.6,168,948提供小型化集成核酸诊断装置和***，其包括核酸提取区，该区包括核酸结合位点。该专利公开的小型化核酸提取和样品精制装置包含多孔的穿流可变形塞子用于结合核酸，或在小室内具有样品结合位点的结构。在形成微流体通道以后形成或添加该塞子，使之成为装配物或原位合成方法。为此原因，它不能被描述为是整体的，或描述为具有由整体设计产生的批量制造优点。

发明内容

本发明涉及用于从细胞中提取和纯化DNA的装置和方法。这种装置和方法提供从细胞材料中***地取出和分离核酸。典型地，细胞材料从血(即白细胞)中获得。

在一些实施方案中，本发明涉及微流控装置。本发明的装置在设计和构造上是整体式的。在一些实施方案中，所述微流控装置包含硅衬底、引入微升量和更多材料的入口、混合器、反应室、核酸结合材料和从装置取出材料的出口。

结合材料选择性与核酸结合。在一些实施方案中，通过首先用热氧化物工艺处理硅衬底，然后用等离子体蚀刻工艺等离子体蚀刻氧化硅表面(等离子体处理)，从而制备结合材料。在另一些或其它实施方案中，通过用等离子体增强化学气相沉积(PECVD)工艺在衬底上沉积基于硅烷的氧化硅来制造本发明的结合材料。

在一些实施方案中，本发明涉及用新工艺制造的整体式微流控装置。这种装置提供从细胞材料中提取和纯化DNA，但以新的、成本有效的方式构造，并且包含以新的且高效的方式生产的新结合材料。

在一些实施方案中，本发明涉及处理核酸的方法。在这些实施方案中，使细胞材料破裂(裂解)以释放内容物，并分离内容物中的核酸部分。这些方法典型地使用化学技术以裂解细胞材料。部分通过在受控条件下选择性与结合材料结合实现核酸内容物分离，其中所述结合材料是本发明的新结合材料。

本发明不同于Kim等人的那些，其设计是整体式的并且在硅上。这意味着没有多种组件的组装。它还意味着通过将微通道内的大部分流体流维持在衬底平面内(低死体积)，使仅仅入口和出口流过渡成与衬底平面垂直的流(高死体积)，从而使得死体积更小。整体集成到硅上还提供组件间热绝缘的可能性，导致在更高温度下降低稳态功率消耗，反应器内均匀的温度谱，通过改变与衬底连接的热沉快速改变***温度，快速热循环，和由不同的同时温度区组成的***。

前面已经大致概述了本发明特征，从而使下面对本发明的详细描述可以更好理解。本发明另外的特征和优点将在下面描述，它们形成本发明权利要求的主题。

附图说明

为了更完全理解本发明及其优点，参考以下说明并结合附图，其中：

图1A和B是举例说明本发明两个实施方案的***示意图，其中两者之间的差异在于过滤器组件的存在(B)或缺少(A)；

图2是根据本发明的提取和纯化核酸的通用化方法的流程图；

图3说明结合和洗脱机制，其中核酸在高盐条件下(A)与结合材料结合，并在低盐条件下(B)洗脱；

图4示意性举例说明本发明一种实施方案的平面截面图，它设计具有硅—玻璃结合结构；

图5说明本发明一些实施方案的芯片，包含很多组件；

图6A和B说明凝胶电泳板，其中在给定泳道中条带的存在(或缺少)反映四种不同制备的结合材料之一的结合能力；

图7说明根据本发明实施方案的温度和结合效率之间的关系；和

图8说明包含由不同方法和/或处理制备的结合材料的装置在不同温度下的核酸洗脱效率。

具体实施方式

本发明涉及从细胞提取和纯化DNA(或其它核酸)的装置和方法。总起来说或分开来说，这些装置和方法可以形成提供提取和纯化这些核酸的***。

提供以下定义以更好理解本发明。

“核苷”是与核糖或脱氧核糖以糖苷键结合的嘌呤或嘧啶。“核苷酸”是核苷的磷酸酯。寡核苷酸是经磷酸二酯键连接的、高达20个核苷酸或“单体”的线性“序列”。“核酸”是经3’，5’磷酸二酯键连接的、核苷酸的线性聚合物(如寡聚体，但更长)。脱氧核糖核酸“DNA”中，糖基是脱氧核糖，核苷酸碱基是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。核糖核酸“RNA”具有作为糖基的核糖和相同的核苷酸碱基，只是尿嘧啶代替胸腺嘧啶。单链DNA具有碱基A、G、T和C的“序列”。例如当形成双螺旋时，通过相邻链上碱基之间的氢键一起维持这种二级结构。请注意在这种碱基配对中，A总与T键合，C总与G键合。

“基因组DNA”是在生物体的“基因组”(即特定生物的染色体中所有的遗传材料)中发现的DNA；其大小一般表示为碱基对总数，并作为生存必需的信息传递给后代。该词用于区分其它类型DNA，如质粒内发现的DNA。“基因组学”表示基因组研究，它包括基因组作图、基因测序和基因功能。

“基因测序”表示确定DNA片段、基因、染色体或全基因组中碱基对的相对顺序。很多基因测序方法的关键是电泳分离技术，如“凝胶电泳”、“毛细管电泳”和“盘状电泳”。

“PCR”，即聚合酶链式反应，是体外扩增DNA的***，其中在过量脱氧核升酸和Taq聚合酶(热稳定DNA聚合酶)存在下，将与待扩增的目标DNA的两个区域互补的两条合成寡核苷酸引物(一条引物对应一条链)加到目标DNA中。在一系列温度循环中，DNA重复变性、退火到引物上并从引物延伸子链。因为子链在后续循环中用作模板，扩增以指数方式发生。

“活性离子蚀刻”(RIE)或“深活性离子蚀刻“(DRIE)表示这么一种技术，其中射频(RF)或微波辐射偶联入低压气体使气体分子解离成更具活性的物质，待蚀刻衬底(典型地基于硅)被偏置以诱导离子轰击。通常使用含碳(C)和卤素如氟(F)、氯(Cl)或溴(Br)的化合物作为气体。当化合物在等离子体中解离时，生成高活性卤素原子或卤素化合物和可沉积到衬底上而阻断高活性的聚合物。离子被加速到通过施加或诱导偏置而蚀刻的衬底上，从而去除垂直于离子运动方向的衬底表面的聚合物，聚合物包被与离子运动方向平行的衬底表面并阻断这些表面的蚀刻。离子轰击还可以激活或加速化学蚀刻反应。RIE因此具有以较高相对速率蚀刻与离子运动方向垂直的表面、以较低相对速率蚀刻与离子运动方向平行的表面的能力，导致各向异性的蚀刻。

“微机电***”(MEMS)源于微机械结构(含有移动部分)和微电子的集成。

根据本发明，“热氧化物工艺”涉及在氧(O₂)和/或蒸汽(H₂O)存在下将硅|晶片|加热至600℃-1250℃的温度。这种升高的温度增强氧化剂扩散，并导致氧化物显著厚于室温空气中硅氧化产生的2nm天然氧化物。

“化学气相沉积”(CVD)表示从气相化学前体的材料沉积。

根据本发明，“整体式”或“整体集成”意思是指所有组件已经用通用技术设计、同时制造于共同衬底上并引导流体流位于衬底晶片表面的平面内。

参考图1，可以在***示意图中观察本发明。如图1A所示，通过阀将多种输入物(血、裂解剂、高盐溶液、醇、空气和低盐溶液)引入本发明的微流控装置。首先通过阀将血和裂解剂引入混合器或混合室。经混合，裂解剂破裂血内白细胞(WBC)和红细胞(RBC)的细胞膜，释放WBC内含有的核酸材料。裂解以后，阀将核酸(与血和血细胞的其它废料一起)在高盐条件下导向结合室，其中包含由结合材料组成的结合物。高盐溶液流确保核酸选择性与结合材料结合，但废料通过并作为废物流出。核酸仍与结合材料结合的情况下，用醇(如乙醇)漂洗结合物，然后任选地空气干燥(强制对流)，最后用低盐溶液洗脱。因此，血与裂解剂接触，WBC和RBC一起在混合器内裂解。细胞内容物释放，DNA(来自WBC)与结合物结合。在此实施方案中，结合之前细胞可以仅用一个混合器裂解，从而实现裂解、结合和洗脱的程序。

作为替代方案，所述***可以使用在引入裂解剂之前能捕获白细胞但允许红细胞和其它材料通过的过滤器。这种实施方案表示于图1B。其中血被引入并与磷酸盐缓冲液(PBS)一起混合，随后通过过滤器。漂洗除去RBC和其它材料以后，如上述裂解WBC并传入结合室以进一步纯化。该实施方案因此允许在暴露于结合材料之前进行初步纯化。

以不同方式观察，本发明是从细胞材料中提取和纯化核酸的方法。这种方法一般包括一系列步骤。参考图2，步骤2001是血液稀释步骤，以降低粘度并使混合物更易在下面所述装置的微通道和微室中流动。通过添加磷酸盐缓冲液(PBS)或其它相似溶液可以实现稀释。步骤2002是裂解步骤，其中裂解剂被加入稀释血溶液中以破裂细胞膜并从WBC中释放核酸材料。请注意DNA仅发现于血中的WBC，因为RBC无核。这些裂解剂典型地是化学裂解剂(化学裂解)，也可以使用但其它类型裂解，如超声裂解、热裂解、电裂解和机械破碎细胞膜(称为机械裂解)。步骤2003是在高盐含量条件下将释放的核酸结合到结合材料上的步骤。这通过小心控制溶液内的盐含量(即浓度)和通过提供特殊处理的结合表面(结合材料)而实现。释放的核酸经流体流和阀的组合被导向结合材料/室。步骤2004是洗脱步骤，当盐含量条件被改变到低盐含量或水的条件时而实现。

图3说明在高盐条件下结合到结合材料或衬底、在低盐条件下洗脱(涉及去结合过程)的过程。也可以增加另外的步骤，如过滤、洗涤、漂洗和干燥。这些洗涤步骤可以包括高盐洗涤以使结合更强、醇洗涤以清除碎片或其它废料，以及任选地空气干燥以清除醇。这些方法以其自己的权利使用代表本发明实施方案的新装置。

在一些实施方案中，本发明涉及微流控装置。在一些实施方案中，所述微流控装置包含硅衬底、用于引入微升量材料的入口、混合器、反应室、核酸结合材料和从用于装置中取出材料的出口。这些装置典型地包含已经被整体集成的组件。

所述结合材料选择性结合核酸。在一些实施方案中，通过首先用热氧化物工艺处理硅衬底，然后用等离子体蚀刻工艺等离子体蚀刻氧化硅表面而制备结合材料。在另一些或其它实施方案中，通过用等离子体增强化学气相沉积(PECVD)工艺将基于硅烷的氧化硅沉积到衬底上来制造本发明的结合材料，使用或不使用后续的等离子体蚀刻工艺。在另一些或其它实施方案中，其它类型的化学气相沉积(CVD)工艺如正硅酸四乙基酯(TEOS)可以用于沉积氧化硅，使用或不使用后续的等离子体蚀刻工艺。

在一些实施方案中，本发明涉及引入新的功能性设计的微流控装置。这些装置提供从细胞材料中提取和纯化DNA，但以新的、成本有效的方式构造。这些装置包含整体式设计和新结合材料。

作为微流样品处理***总体观察，本发明的装置和方法提供设计用于核酸制备(如纯化)的整体式芯片。更具体地，本发明提供从血(一般是人血，但也可以是其它哺乳动物和非哺乳动物的血)提取和纯化DNA和/或RNA(核酸)。对于本发明的装置，功能性微流控组件典型地集成到单个衬底上。这些组件具有的功能包括混合、过滤、结合等。尽管本发明已经证明成功用于DNA提取，但其应用不限于DNA提取，可以用于能选择性直接或通过中间介导物质或分子间接结合本发明结合物的任何物质的纯化。

如本发明所用，整体集成提供这样的装置，其中所有组件已经被用共同技术设计并使用晶片表面平面内的流体流，除了流体入口和出口处流可以垂直于晶片表面或在该表面内。组件的这种整体式设计提供更容易的制造和操作。

本发明相对于当前所用宏观***的优点是：全自动操作，小尺寸和功率消耗，便于便携应用。相对于非整体微观方案的优点是：容易装配和封装；更小死体积、整体大小；改进的热设计(由于硅的热性质和几何微机械可能性)；可选地添加另外的感测功能，因为所有组件都能容易地与电读出线路通过界面连接；和可选地使***部分或全自动化。

表面条件、表面积、流动谱、使用的化学物、pH和温度——所有都极影响本发明提取和纯化核酸的能力。因此，本发明方法提供对这些参数的仔细控制。这对于本发明装置的设计和操作是特别实际的。

本发明还涉及能提供从细胞材料中提取和纯化核酸的整体微流控装置。图4显示本发明装置实施方案的平面截面示意图，其中设计有硅—玻璃结合结构。在这个具体的实施方案中，装置400在衬底405中形成，并被玻璃晶片401覆盖。覆盖物401是透明的，允许光达到通道406。402和403是提供入口和出口的硅背侧开口。通过使诸如发生堵塞、流速、跨通道宽度的流速均一性、流体界面和流体界面通过***的进程的事项可以检测，光进出装置使得能够光学感测装置性能。光可以进出装置也使得能够经荧光、光吸收或可以通过玻璃观察窗的其它类型光学技术而光学检测反应产物。

根据本发明，对于典型的装置实施方案，阅读器涉及图5所示装置500。根据图5，血和磷酸盐缓冲液(PBS)可以分别经入口501和503引入混合器502。流体然后直接流入过滤器504，在此捕获WBC，但允许RBC通过并经出口508流出。请注意过滤器504可以省略，正如以上***描述中所提及(见图1A)。此后，裂解缓冲液经入口505引入并裂解被过滤器捕获的WBC。WBC裂解以后，释放的DNA通过过滤器504。此时，阀506将操作关闭通道507。DNA和其它成分和溶液将进入结合物513并与结合物表面结合。核酸与结合物513结合以后，可以通过入口509泵入高盐溶液使得结合更强，然后经入口510泵入醇以洗涤结合物并使结合物洁净，这有利于结合物内的核酸。此后，任选的可以使用强制对流干燥结合物，尤其是干燥(即除去)醇，因为醇将影响用于核酸纯化后反应如PCR的核酸质量。最后的步骤是经入口512泵低盐溶液以释放DNA。此时，阀515将操作关闭通道516。然后，DNA将从出口514被洗脱。任选地，可以增加热绝缘槽519和电阻加热器520以热影响裂解/结合/洗脱过程。此外，可以经真空或迫使压缩空气通过入口511产生上述强制对流以干燥结合物。与传统天然对流比较，这种方法更快并更容易控制。

处理顺序和样品(血)和/或试剂引入位置具有灵活性。在一些实施方案中，样品和试剂可以引入微通道交叉点、直接进入反应器或通过个或多个混合器——这依赖于需要的混合水平和涉及的流速。

在一些实施方案中，使用传统MEMS制造技术在硅晶片或硅/玻璃晶片组合上制造芯片。所有组件如混合器、过滤器和结合物位于一个芯片上，以实现样品制备、处理和纯化需要的某些功能。这些组件包括通道、输入端、输出端、反应器、混合器、过滤器、结合物、电阻温度传感器和电阻加热器。而且，衬底上的热绝缘特征提供独立的组件热操作。

上述装置组件的重要方面是结合物设计。结合物是直接负责DNA或RNA分离和纯化的组件。当包括核酸和其它碎片或废物的溶液经过结合物时，结合物将选择性结合核酸并使其它材料流过。在随后的步骤中，结合物将在某种工程化条件下释放核酸。因此，结合物表面在这种芯片中是重要的。对于这种表面，本发明可以使用一或更多的几种不同设计，包括但不限于硅胶珠结合、酸、碱、硅烷、聚赖氨酸、偶联抗体、合成核酸和聚-T DNA。在一些示例性实施方案中，根据制造工艺，结合物室表面的制备可以包括用热氧化物工艺随后用CHF₃和O₂等离子体蚀刻处理，或作为替代方案用等离子体增强化学气相沉积(PECVD)基于硅烷的氧化硅。这些工艺产生核酸结合和洗脱方面良好的表面。使用这种表面，不需额外的处理步骤对芯片表面进行改性。等离子体处理步骤可以在晶片前侧氮化物剥离工艺中实现，这是无论何种方式芯片制造必要的步骤。

在一些实施方案中，结合物(结合材料)设计有等离子体处理的表面，还考虑温度如何影响结合过程。在一些实施方案中，它具有加热器和结合物外部的温度传感器，以提供不同和/或均匀的温度，产生更好的结合条件。还考虑了热绝缘。在此情况下，通过衬底上热绝缘特征使施加的热可以是局部的，从而使衬底不同部分处于不同温度。

本发明的微流样品处理***集成所有样品制备过程，如混合、过滤、结合、洗脱以及单独的热控制。它是已经证明成功用于DNA提取的通用***，但其应用不限于DNA提取。整体集成意味着所有组件已经用共同技术设计并使用位于晶片表面平面内的流体流。已经引入热绝缘特征，使得芯片不同区域是热独立的。

结合材料的表面是上述结合效率的重要因素。结合的另一个重要因素是表面积。可以使用不同方法增加结合表面积。一种这样的方法是引入一些微机械特征，如增加柱形物(微结构)的数目，这增加结合物表面积的垂直面积。为了确认，这些柱形物(或其它类似微结构)的设计和排列(放置)必须考虑更容易流动的模式、更少气泡、更低堵塞水平和其它相关问题。另一种方法是通过化学或物理方法使表面更粗糙以增加表面积。表面粗糙化可以用于增加玻璃晶片401或硅晶片405上的可用于结合的表面积。粗糙化玻璃表面的技术包括活性离子蚀刻、等离子体蚀刻和湿法蚀刻。在所有这些情况下，可以增加表面粗糙度，但可能出现不均匀的突起，如在蚀刻期间由玻璃中气泡、反应产物或非挥发性成分天然微掩盖玻璃表面所产生的那些。相似的技术可以用于增加硅的表面粗糙度。此外，通过调节工艺以增加bosch DRIE工艺中产生的天然槽形结构(scalloping)，深度活性离子蚀刻(DRIE)以后可以在通道侧壁实现硅表面粗糙化。

本发明相对于当前使用的从细胞中提取DNA的商业提取试剂盒的其他优点包括：降低试剂需要量(每个样品～2ml比每个样品～400ml)、更小血样要求(每次提取～1μl比每次提取～3001μl)和提取时间减少(每次＜2小时比每次～1天)。

提供以下实施例以说明本发明的具体实施方案。本领域技术人员应该明白，以下实施例中公开的方法仅代表本发明的示例性实施方案。然而根据本公开内容，本领域技术人员应该知道，在不偏离本发明的实质和范围的情况下，可以对所述具体实施方案进行很多改变并仍然获得一样或相似结果。

实施例1

本实施例说明本发明的微流核酸纯化芯片可以被制造。这种芯片可以通过以下步骤制造：

步骤1：裸硅片经热氧化氧化得到厚度约0.5μm的氧化物。然后将0.15μm厚的低压化学气相沉积的化学计量的氮化硅层沉积到氧化硅上。

步骤2：然后掩盖前述步骤的晶片用于DRIE。掩模层可以是光刻胶，但RIE深度超过约40μm时这可能需要变为另一种材料。在硅蚀刻以后除去光刻胶。

步骤3：用DRIE在硅晶片的前侧蚀刻前述步骤晶片的通道。

步骤4：接下来，用光刻胶选择性掩盖前述步骤硅晶片的背侧，用活性离子蚀刻在氮化硅和氧化硅中蚀刻背侧流体入口和出口的开口。然后除去光刻胶。

步骤5：接着，将硅晶片前侧保护在一侧卡盘中，并在氢氧化钾溶液中通过DRIE蚀刻晶片，直至背侧孔到达前侧被蚀刻的特征的底部。

步骤6：然后经等离子体蚀刻(CHF₃和O₂)除去晶片前侧的氮化硅，暴露下面的氧化硅。

步骤7：接着，将约1μm厚的Al层溅射到玻璃晶片上。

步骤8：然后用光刻胶选择性掩盖溅射的Al，并用标准的基于磷酸的铝湿法蚀刻剂进行蚀刻，正如半导体工业所用。

步骤9：最后从玻璃晶片上去除光刻胶，将玻璃晶片阳极结合到硅晶片的前侧。结合之前使玻璃晶片与硅晶片对准。

经上述工艺制造的所得两晶片装置包含蚀刻在硅晶片前侧的微流体通道。这些经蚀刻在硅晶片背侧的孔与外部相通。流体通道大小从2μm宽到超过5mm宽之间变化。典型的通道约10μm宽。典型的过滤器由约2-3μm柱形物间隔的柱形物组成，柱形物宽和深约10μm。用玻璃加帽晶片封闭通道。

在另外的实施方案中，连接微流体结构与外部的孔可以通过在阳极结合之前在玻璃晶片上钻孔来产生。这种情况下不需要上述步骤5，其中硅晶片前侧保护在一侧卡盘中，并且在氢氧化钾溶液中通过DRIE蚀刻晶片，直至背侧孔到达在前侧被蚀刻的特征的底部。在替代方案或其它实施方案中，不需要铝层步骤(步骤7和8)，因为铝层用作加热器、温度传感器或流动传感器，没必要用于本发明的所有实施方案。在一些或其它实施方案中，通过打开硅背侧的大区域，大到足以使线结合工具出入结合垫，从而实现与铝层的结合垫连接。

最后，值得注意的是，反应室和过滤室典型具有约0.4μl体积，混合器具有约0.15μl死体积。背侧孔典型是晶片背侧的1mm×1mm开口，具有与各向异性湿法蚀刻<100>硅相关的特征性54°斜率。

实施例2

本实施例用于说明进一步等离子体处理对本发明实施方案中使用的热氧化物法制造的结合材料的影响。

在这个实施例中，通过比较四种不同结合材料的洗脱物来评价热氧化物法生成的结合材料的纯化效率：

—单独热氧化物。

—热氧化物+过氧化氢/硫酸(“Piranha”，包含3∶1的浓硫酸：30％ H₂O₂)清洗。

—热氧化物+等离子体蚀刻。

—热氧化物+等离子体蚀刻+过氧化氢/硫酸(“Piranha”)清洗。

其中等离子体处理包含CHF₃+O₂环境。

在对于四种不同制备的结合物的每一种相同的测试条件下用典型高盐离液条件如6M盐酸胍溶液将DNA与各种结合材料结合，然后在洁净的6M盐酸胍溶液中漂洗材料。然后在低盐条件下使用1×TE缓冲液(10mM Tris-Cl和1mM EDTA)洗脱DNA和并用PCR扩增。

图6A表示PCR后的凝胶电泳板，其中泳道4和5对应来自用单独热氧化物的装置的洗脱物。结果表明在所用条件下很少或没有发生核酸的可逆性结合，因为泳道4和5对应洗脱物并且在测试中不能看到与DNA片段相关的带。为了比较，在泳道2和3中可以清除看到带。图6B显示凝胶电泳板，其中泳道4和5对应用热氧化物+过氧化氢/硫酸清洗的装置的洗脱物。另外，没有看见核酸带——这提示很少或没有观察到DNA与结合材料的可逆性结合。

图6A，泳道2和3对应用热氧化物+等离子体蚀刻结合材料的装置的洗脱物。带指示存在核酸，并且这样处理的结合材料成功结合核酸。图6B中显示，泳道2和3是来自热氧化物+等离子体蚀刻+过氧化氢/硫酸清洗结合材料的装置的洗脱物。可以看到，存在核酸，这指示核酸分析物与结合材料之间的可逆性结合事件。

因此，显而易见，根据本发明，不经进一步处理，热氧化物制造的结合材料单独不足以用作本试验中调查的200碱基对片段的DNA的结合材料。等离子体处理已经显示是用于活化热氧化物制造的结合材料的合适处理。

实施例3

本实施例用于说明温度对洗脱效率的影响。

实验在1cm×1cm见方的具有热氧化硅的硅上进行。氧化物表面通过使用CHF₃和O₂进行CHF₃等离子体蚀刻工艺。将5μg纯DNA稀释于8μl 6M盐酸胍溶液中。然后将DNA置于硅片表面，将第二个硅片置于顶上，形成三明治排列。然后将小片置于控制湿度的气密容器中保温15分钟。然后在新鲜盐酸胍中漂洗小片三次(每次100μl)，随后用70％乙醇漂洗三次(每次100μl)，然后使样品在室温干燥，随之进行洗脱。洗脱晶片四次(总计280μl)，每次用70μl新鲜的10×TE缓冲液(如前述)，每次5分钟，在4-80℃之间的控制温度下，如图7所示。洗脱DNA的量用嵌入染料Picogreen^TM定量。

参考图7，柱形图显示洗脱DNA的量如何随温度变化，约55℃时显示最大，65℃-80℃稳定增加。对于4℃-80℃之间进行的试验，80℃下达到DNA的最大洗脱。一般来说，温度增加将导致扩散增加并弱化分子间键，最大洗脱效率应出现在较高温度。不限于任何理论，图7中约55℃的峰被认为是次级机制的指示。

上述硅片上进行的实验结果适用于微机械结合反应器。反应器和装置衬底是热绝缘的，以允许独立的热操作。电阻加热器和电阻温度传感器制造在热绝缘结合反应器之上的玻璃上(即围绕反应器的加热器)。这导致结合物处的温度可以被电控制并独立于衬底。微机械加工的结合反应器用实施例1所述工序制造。反应器能在80℃操作，衬底与热沉连接以确保***的其余部分在室温操作，或在独立于结合物温度的温度下操作。

实施例4

本实施例用于说明硅烷沉积的结合材料经或不经同时等离子体处理时的结合效率。将这些结果(即结合效率)与热氧化物+等离子体处理结合材料的结合效率进一步比较，并将所有这些作为三个温度的函数。

实验在1cm×1cm见方的具有热氧化硅和基于硅烷的PECVD氧化硅的硅上进行，在400℃进行沉积。热氧化硅表面通过使用CHF₃和O₂进行CHF₃等离子体蚀刻处理，基于硅烷的PECVD氧化物样品分成两组，其中一组也经受CHF₃和O₂蚀刻处理。将5μg纯DNA稀释于8μl 6M盐酸胍溶液中。然后将DNA置于硅片表面，将第二个硅片(与第一个具有相同氧化物类型)置于顶上，形成三明治排列。然后将小片置于控制湿度的气密容器中并在不同温度下保温15分钟。然后在新鲜盐酸胍中漂洗小片三次(每次100μl)，随后用70％乙醇漂洗三次(每次100μl)。然后使样品在室温干燥，随之进行洗脱。洗脱晶片三次(总计210μl)，每次用70μl新鲜的10×TE缓冲液(如前述)。第一次洗脱进行20分钟，第二次15分钟，第三次5分钟。所有洗脱均在室温进行。洗脱DNA的量用嵌入染料Picogreen^TM定量。

参考图8，其中x-轴是以摄氏度计的结合温度，y-轴是洗脱DNA的纳克(ng)数。结果显示三种不同结合温度下洗脱的DNA量(ng)。对于热氧化硅和不经等离子体蚀刻处理的基于硅烷的PECVD氧化物，最大结合效率在4℃实现。与经等离子体蚀刻的基于硅烷的PECVD氧化物的结合在所有条件下都低，并且不随结合温度的改变而增强。通过冷却与沉淀热连接的热沉而冷却***衬底到4℃，从而将这些结果引入微机械加工的结合物。

本文引用的所有专利和出版物经引用并入此处。可以理解，上述实施方案的某些上述结构、功能和操作不是实施本发明所必需的，仅仅是为了示例性实施方案的完整性而包括在说明书中。此外，可以理解，上述引用专利和出版物的具体结构、功能和操作可以与本发明结合而实施，但它们对于实施不是关键的。因此应该理解，可以在具体描述以外实施本发明，而实际上不偏离所附权利要求限定的本发明的实质和范围。

Claims (28)

1.用于微流核酸处理的装置，包含：

a)硅衬底；

b)能提供引入微升量材料的至少一个出口，所述材料选自哺乳动物血、缓冲盐溶液、裂解剂、盐水溶液、醇、空气及其组合；

c)混合器，位于混合室内，并能将血与缓冲盐溶液混合；

d)裂解室，可以向其中递送裂解剂以裂解细胞膜；

e)能从装置中取出材料的至少一个出口；

f)结合物室，包含能在合适条件下结合核酸的结合材料：和

g)能指导流通过装置的至少一个阀。

2.权利要求1的装置，还包含过滤器，其位于过滤室内并具有足够大以捕获白细胞、足够小以允许红细胞通过的孔径。

3.权利要求1的装置，其中所述装置在设计和构造上是整体式的。

4.权利要求1的装置，其中所述混合室和裂解室是相同的。

5.权利要求2的装置，其中所述裂解室和过滤室是相同的。

6.权利要求1的装置，还包含至少一个光学上可通过的通道。

7.权利要求1的装置，还包含用于形成电连接的结合垫。

8.权利要求1的装置，还包含玻璃晶片覆盖物。权利要求1的装置，还包含用于选择性加热装置区域的加热装置。

9.经包括以下步骤的方法制造的核酸结合材料：

a)提供硅衬底；

b)用热氧化物工艺处理硅衬底，以提供氧化硅表面；和

c)用等离子体蚀刻剂工艺等离子体蚀刻氧化硅表面。

10.权利要求10的核酸结合材料，其中所述等离子体蚀刻剂工艺包括CHF₃和O₂等离子体蚀刻处理的组合。经包括以下步骤的方法制造的核酸结合材料：

a)提供衬底；和

b)用等离子体增强化学气相沉积工艺将基于硅烷的氧化硅沉积到衬底上。

11.权利要求12的核酸结合材料，其中所述衬底包含硅。

12.处理核酸的方法，包括以下步骤：

a)在混合室中混合微升量的哺乳动物血和盐水溶液以产生稀释的血混合物；

b)使稀释的血混合物和裂解剂流入反应室，其中所述裂解剂使细胞壁破裂并释放白细胞中所含的核酸；和

c)使包含释放的核酸的混合物流过结合室，其中所述结合室包含在高盐含量条件下选择性结合核酸的结合材料。

13.权利要求14的方法，还包括使所述稀释的血混合物通过过滤器过滤的步骤，以将含核酸的白细胞与红细胞分离。

14.权利要求14的方法，还包括用漂洗剂漂洗与所述结合材料结合的核酸的步骤。

15.权利要求16的方法，其中所述漂洗剂是乙醇。

16.权利要求14的方法，还包括用干燥方法干燥与结合材料结合的核酸的步骤。

17.权利要求18的方法，其中所述干燥方法是强制对流。

18.权利要求18的方法，其中所述干燥方法包含空气流。

19.权利要求14的方法，还包括用低盐溶液处理与结合材料结合的核酸的步骤，以使核酸游离于结合材料并使得可以收集它。

20.用于微流核酸处理的整体式装置，包含：

a)将细胞材料引入装置的器件；

b)将裂解剂引入装置的器件；

c)使细胞材料与裂解剂混合以实现细胞膜裂解并释放细胞组分的器件；

d)选择性结合核酸的手段；

e)漂洗结合的核酸的手段；

f)干燥结合的核酸的手段；和

g)去结合并洗脱核酸的手段。

21.权利要求22的装置，其中所述细胞材料和裂解剂经入口引入。

22.权利要求22的装置，其中使细胞材料与裂解剂混合的器件包含卷曲的毛细管微混合器。

23.权利要求22的装置，其中选择性结合核酸的器件包含权利要求10的结合材料。

24.权利要求22的装置，其中选择性结合核酸的器件包含权利要求12的结合材料。

25.权利要求22的装置，其中选择性结合核酸的手段包括使用高盐溶液。

26.权利要求22的装置，其中干燥结合的核酸的手段包括强制对流干燥。

27.权利要求22的装置，其中去结合并洗脱核酸的手段包括用低盐溶液漂洗。

28.权利要求22的装置，其中去结合并洗脱核酸的手段包括用高纯水漂洗。

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