WO2014157918A1 - 조절 t 세포로의 분화 유도 및 증식 촉진을 통한 면역 반응 억제용 약학 조성물 - Google Patents

조절 t 세포로의 분화 유도 및 증식 촉진을 통한 면역 반응 억제용 약학 조성물 Download PDF

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김나연
김은정
임건일
임정연
전은주
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Definitions

  • the present invention provides a novel medicament of (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] amine
  • Method for preventing or treating various immune diseases including Graft-Versus-Host Disease (GVHD) through induction of differentiation and promotion of proliferation of regulated T cells, and immunoregulation of activated regulatory T cells
  • GVHD Graft-Versus-Host Disease
  • Immunity refers to the action of recognizing and removing foreign antigens present in the body to protect itself from foreign substances. Immune responses can be largely divided into cellular and humoral immune responses. In humoral immune responses, antibodies secreted from B cells recognize and neutralize foreign antigens or recognize them as non-self. By binding to the surface of other cells, they help phagocytosis by macrophages, or activate the complement system to boost specific immune responses. In the cellular immune response, cytotoxic T cells (Tc cells) directly neutralize foreign antigens or secrete cytokines such as IL-2 and IFN-gamma to activate macrophages. As such, the ability to identify magnetic and non-magnetic antigens in the immune response is absolutely critical for the body's defense system.
  • Tc cells directly neutralize foreign antigens or secrete cytokines such as IL-2 and IFN-gamma to activate macrophages.
  • graft-Versus-Host Disease is called.
  • new cells (grafts) engrafted in the bone marrow recognize the patient's tissue (host) as heterogeneous, and the bone marrow cells of the allogeneic donor are recognized as the recipient's tissue, skin, digestive organ, liver, To damage the organ.
  • the antigen-presenting cells of the patient activate T cells in the transplanted bone marrow cells to differentiate into Th1 cells and increase the secretion of cytokines such as IL-2 and IFN-gamma. As cytotoxic T cells and natural killer cells are activated, these cells attack the patient's organs, resulting in graft-versus-host disease.
  • graft-versus-host disease The main cause of graft-versus-host disease is allograft bone marrow transplantation or transplantation of hematopoietic stem cells, and graft-versus-host disease occurs due to hematopoietic stem cell transplantation. Therefore, in order to prevent graft-versus-host disease and to ensure long-term survival of the graft, it is necessary to avoid the immune system of the recipient that recognizes the external antigen or suppress the immune response.
  • autoimmune disease is a disease in which the immune system is sensitive to a part of an individual's own body, and the body destroys itself due to a defect in the ability to distinguish between self and non-self, and also requires treatment to suppress an immune response. Do.
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, insulin dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, lupus, psoriasis, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, myasthenia gravis, multiple myositis, dermatitis, autoimmune thrombocytopenia, vasculitis syndrome, systemic Erythematous lupus and the like.
  • immune diseases such as graft rejection, graft-versus-host disease, allergic diseases and autoimmune diseases.
  • cyclosporin A has the best clinical effects and is widely used for graft-versus-host disease, autoimmune diseases, transplant rejection and various inflammatory diseases. Cyclosporin A, however, can be used to treat diseases by completely inhibiting the activation of T cells when used at high doses. However, cyclosporin A has the disadvantage of showing significant side effects including kidney toxicity. In addition, in order to compensate for the decrease in the drug effect caused by the use of low doses, a combination of 2-3 different immunosuppressive agents is used, but there is a precondition that the mechanism of action and the toxic site of the two substances must be different for the combination administration. . Therefore, there is a need for the development of more effective immunosuppressive agents that can replace existing immunosuppressive agents.
  • T cells one of the cell populations that play a central role in the immune system, are produced by the human thymus and are divided into CD4 positive helper T cells and CD8 positive cytotoxic T cells.
  • the cells undergo a series of differentiation and differentiate into T cells with unique characteristics, such as Th1 (T helper type 1), Th2 (T helper type 2), Th17 (T helper type 17), and regulatory T cells (regulatory T cells).
  • cell Treg cell).
  • Regulatory T cells have the property of controlling the inflammatory response by inhibiting the function of abnormally activated immune cells, and is known to be able to treat immune diseases through the action of increasing the activity of regulatory T cells.
  • Regulatory T cells use CD4 + CD25 + as markers and express the transcription factor Foxp3.
  • regulatory T cells are already differentiated cells with immunosuppressive functions and are already stimulated by autoantigens in the thymus. Since regulatory T cells make up about 5% of thymic T lymphocytes and about 10-15% of CD4 + T lymphocytes present in peripheral organs, it is very difficult to obtain therapeutically effective amounts of regulatory T cells and effectively What is desired is a method of obtaining regulatory T cells.
  • Korean Patent Laid-Open No. 10-2009-0018593 provides a novel indole or indazole compound having an activity of inhibiting cell necrosis and a therapeutic agent for cell necrosis associated with the same.
  • the patent document discloses only the indole or indazole compounds for the activity of inhibiting cell necrosis, and only discloses the association with some cell necrosis-related diseases such as liver disease and neurodegenerative disease.
  • cell necrosis-related diseases such as liver disease and neurodegenerative disease.
  • the present inventors have studied to provide a compound having an excellent immunosuppressive effect that can replace or supplement the existing immunosuppressive agents, the compound of Korea Patent Publication No. 10-2009-0018593, which was previously known as a cell necrosis inhibitor, (Tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] amine regulates from undifferentiated T cells
  • the present invention has been completed by discovering that it can promote differentiation and proliferation into T cells and exhibit excellent immunosuppressive effects, and thus can be widely applied to treatment of transplant rejection, graft-versus-host disease, allergic disease and autoimmune disease. .
  • an object of the present invention is (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] It provides a pharmaceutical composition for inhibiting immune response, including an amine, a pharmaceutically acceptable salt or isomer thereof.
  • Yet another object of the present invention is (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] It provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of immune diseases, such as transplant rejection, graft-versus-host disease, allergic diseases, autoimmune diseases and inflammatory diseases, including amines, pharmaceutically acceptable salts or isomers thereof.
  • immune diseases such as transplant rejection, graft-versus-host disease, allergic diseases, autoimmune diseases and inflammatory diseases, including amines, pharmaceutically acceptable salts or isomers thereof.
  • Yet another object of the present invention is (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] It is to provide a composition for inducing differentiation from undifferentiated T cells to regulatory T cells and / or for promoting the proliferation of regulatory T cells comprising an amine, a pharmaceutically acceptable salt or isomer thereof.
  • Another object of the present invention is (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indole- to undifferentiated T cells
  • It provides a method of obtaining regulatory T cells through inducing differentiation and / or promoting growth into regulatory T cells comprising the step of treating a composition comprising 7-yl] amine, a pharmaceutically acceptable salt or isomer thereof.
  • Another object of the present invention is (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indole- to undifferentiated T cells Transplant rejection, including graft-versus-host disease, allergic disease, autoimmune disease and inflammatory disease, including regulatory T cells obtained by treating a composition comprising 7-yl] amine, a pharmaceutically acceptable salt or isomer thereof It is to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of immune diseases.
  • the present invention for achieving this purpose is (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indole-7-
  • a pharmaceutical composition for use in inhibiting an immune response such as by inducing differentiation into regulatory T cells and / or by activating regulatory T cells by promoting proliferation, including general amines, pharmaceutically acceptable salts or isomers thereof do.
  • the invention provides (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] It provides a pharmaceutical composition for inhibiting immune response, comprising an amine, a pharmaceutically acceptable salt or isomer thereof.
  • the invention provides (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] Graft rejection response, graft-versus-host disease, allergic disease, autoimmune disease and inflammatory disease, etc., by suppressing the immune response through activation of regulatory T cells, including amines, pharmaceutically acceptable salts or isomers thereof. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases.
  • the invention provides (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl ]
  • a composition for inducing differentiation from undifferentiated T cells into regulatory T cells and / or promoting the proliferation of regulatory T cells, comprising an amine, a pharmaceutically acceptable salt or isomer thereof.
  • the invention provides (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indole to undifferentiated T cells
  • a method for obtaining regulatory T cells through inducing differentiation and / or promoting growth into regulatory T cells comprising treating a composition comprising a -7-yl] amine, a pharmaceutically acceptable salt or isomer thereof.
  • the invention provides (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indole to undifferentiated T cells Transplant rejection, including graft-versus-host disease, allergic disease, autoimmune disease and inflammatory disease, including regulatory T cells obtained by treating a composition comprising a -7-yl] amine, a pharmaceutically acceptable salt or isomer thereof It provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of immune diseases, such as.
  • the compound (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] amine according to the invention is It can form a pharmaceutically acceptable salt.
  • Such “pharmaceutically acceptable salts” include acids that form non-toxic acid addition salts containing pharmaceutically acceptable anions, such as inorganic acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, and the like; Organic carbon acids such as tartaric acid, formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, salicylic acid and the like; Acid addition salts formed by sulfonic acids such as methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid and the like.
  • inorganic acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroio
  • alkali or alkaline earth metal salts formed by pharmaceutically acceptable base addition salts such as lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, and the like; Amino acid salts such as lysine, arginine and guanidine; Organic salts such as dicyclohexylamine, N-methyl-D-glucamine, tris (hydroxymethyl) methylamine, diethanolamine, choline, triethylamine and the like.
  • the compound (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] amine according to the invention is It can be converted to its salts by conventional methods known in the art, and the preparation of the salts can be easily carried out by those skilled in the art without further explanation.
  • isomer refers to a compound or salt thereof that has the same chemical formula or molecular formula but is optically or stericly different.
  • the compound (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] amine according to the invention is Since it may have an asymmetric carbon center, it may exist as optical isomers (R or S isomers), racemates, diastereomeric mixtures, individual diastereoisomers, etc., and geometric isomers (trans, cis isomers) may also be present. All these isomers and mixtures thereof are also within the scope of the present invention.
  • the present invention relates to (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] amine, pharmaceutical It is characterized by providing a composition comprising a salt or isomer thereof is acceptable for suppressing the immune response.
  • immunosuppression or “inhibition of immune response” refers to suppressing an immune response that is not favorable to a living body caused by an external or self antigen.
  • the compound (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] amine of the present invention is It can be used to suppress the immune rejection response that may occur in the transplantation of all cells, tissues and organs.
  • skin, blood, cornea, liver, lung, intestine, pancreas, heart, kidney, bone marrow, stem cells and progenitor cells can be used to suppress the immune rejection reaction, preferably skin transplantation, It can be used to suppress immune rejection responses that may occur during bone marrow transplantation, stem cell transplantation, transfusion, and organ transplantation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be usefully used for the treatment and prevention of transplant rejection and / or graft-versus-host disease by inhibiting an immune response against transplanted organs, tissues or cells.
  • treatment means stopping or delaying the progression of a disease when used in a subject exhibiting symptoms of onset
  • preventing means stopping or showing signs of development when used in a subject who is not at risk of developing the disease. Means to delay.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is also useful for the treatment and prevention of various immune hypersensitivity diseases, preferably allergic diseases, autoimmune diseases and inflammatory diseases caused by immune hypersensitivity reactions.
  • allergic diseases include allergic rhinitis, asthma, atopic dermatitis, and the like.
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, insulin dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, lupus, psoriasis, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, myasthenia gravis, multiple myositis, dermatitis, autoimmune thrombocytopenia, vasculitis syndrome, And systemic lupus erythematosus.
  • compounds of the invention (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indole-
  • a mouse model of a donor mouse was implanted with a bone marrow and spleen cells of a donor mouse, and a homoimmune mouse model was prepared, and the compound of the present invention (tetrahydropyran- Immune graft rejection was determined by administering 4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] amine.
  • the compound of the invention (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] Survival was significantly increased in the amine treated group compared to the non-amine treated group, and significant results were also observed in the weight and graft versus host response evaluation (FIGS. 1 and 2). In the mouse model of the disease-free diseased mice, colonic villi and mucosal destruction were found, whereas the group treated with the compound of the present invention was similar to normal colon tissue findings (FIG. 3).
  • the group treated with the compound of the present invention was dose- and time-dependently produced in intracellular reactive oxygen species (ROS) compared to the group not treated. It was significantly inhibited (FIG. 4), and the expression of high-mobility group protein B1 (hereinafter referred to as HMGB1), which is a marker of immunomodulatory function, was significantly inhibited (FIG. 5).
  • ROS reactive oxygen species
  • the compound of the invention (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H- in a homoimmunized mouse model Indole-7-yl] amine reduced the immunorejection, inhibited ROS and HMGB1 production and inhibited cell necrosis. Furthermore, as a result of examining the possibility of modulating the immune response at the cellular level, the group treated with the compound of the present invention showed that CD4 + CD25 + Foxp3 + immunoregulatory cells (regulatory T cells) increased by 6 times or more compared to the other group.
  • IFN-r is a cytokine that causes graft-versus-host disease secreted by T cells of transplanted donors.
  • the compound of the present invention tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1 It was found that dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] amine inhibited the activation of transplanted T cells through upregulation of regulatory T cells and IL-4.
  • the compound of the present invention (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indole-7- General amines increase regulatory T cells, inhibit the activation of transplanted T cells and control the inflammatory response through immunosuppression of increased regulatory T cells, and also the expression of reactive oxygen species (ROS) and HMGB1 in cells It can be seen that by having the effect of suppressing the immune response. Therefore, the compound of the present invention can be usefully used as a pharmaceutical composition for inhibiting immune response, and furthermore, immunity such as transplant rejection, graft-versus-host disease, allergic disease, autoimmune disease and inflammatory disease that require suppression of immune response. It can be widely applied to the treatment of diseases.
  • ROS reactive oxygen species
  • Active compounds of the invention (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] amine
  • the immunosuppressive pharmaceutical composition comprising as a component can be used together with other known immunosuppressive agents.
  • other immunosuppressive agents that may be used in combination include, but are not limited to, cyclosporin A, rapamycin, tacrolimus, sacrolimus, methotrexate, azathioprine, mycophenolate mofetil, or various steroid agents. .
  • a pharmaceutical composition for inducing differentiation from undifferentiated T cells to regulatory T cells and / or for promoting the proliferation of regulatory T cells comprising an amine, a pharmaceutically acceptable salt or isomer thereof.
  • regulatory T cell refers to a cell capable of modulating a T cell response, which is a cell expressing the transcription factor Foxp3 using CD4 + CD25 + as a marker.
  • the regulatory T cells have the property of controlling the inflammatory response by inhibiting the function of abnormally activated immune cells, and may exhibit therapeutic effects against these diseases by inhibiting immune tolerance, autoimmune diseases, and chronic inflammatory responses.
  • Foxp3 factor is known to play an important role in the differentiation and activity of these cells.
  • the compounds of the present invention (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] amine
  • Regulatory T cells induced by can be used to inhibit the immune rejection response that may occur in the transplantation of all cells, tissues and organs.
  • skin, blood, cornea, liver, lung, intestine, pancreas, heart, kidney, bone marrow, stem cells and progenitor cells can be used to suppress the immune rejection reaction, preferably skin transplantation, It can be used to suppress immune rejection responses that may occur during bone marrow transplantation, stem cell transplantation, transfusion, and organ transplantation.
  • regulatory T cells induced by the compounds of the present invention can be usefully used in the treatment and prevention of transplant rejection or graft-versus-host disease by inhibiting the immune response to transplanted organs, tissues or cells.
  • regulatory T cells induced by the compounds of the present invention can be usefully used for the treatment and prevention of various immune hypersensitivity diseases caused by immune hypersensitivity reactions.
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, insulin dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, lupus, psoriasis, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, myasthenia gravis, multiple myositis, dermatitis, autoimmune thrombocytopenia, vasculitis syndrome, systemic iris Reflective lupus; and the like.
  • immunity exhibited the effect of inhibiting the proliferation of T cells and allogeneic immune response, cells from the regulatory T cells in vitro experiment induced by the compound treatment of the present invention, the in vivo graft versus host disease control in a mouse model T cells It was confirmed that it affects the regulating function (FIGS. 11-14).
  • a compound of the present invention or a composition comprising the same modulates a therapeutically effective amount necessary for the treatment of immune diseases and chronic inflammatory diseases by inducing differentiation from undifferentiated T cells into regulatory T cells and / or by promoting the proliferation of regulatory T cells. It can be usefully used to produce and concentrate large quantities of T cells.
  • the pharmaceutical composition for inducing differentiation from undifferentiated T cells comprising a compound of the present invention to regulatory T cells and / or for promoting the proliferation of regulatory T cells is characterized by anti-CD3 antibody, anti It may further include -CD28 antibody and TGF-beta, and may further include a conventional differentiation inducing agent retinoic acid or retinal to further enhance the differentiation and proliferation promoting effect.
  • Regulatory T cells differentiated by the compounds of the present invention exhibit phenotypes of CD4 + , CD25 + and Foxp3 + , and have the ability to modulate and inhibit immune responses in homoimmunoreactive cells and GVHD mice.
  • the present invention provides a transplant rejection reaction, graft-versus-host disease, allergic disease, autoimmune disease and inflammatory disease, including regulatory T cells obtained by obtaining a compound of the present invention or a composition comprising the same, in an undifferentiated T cell.
  • compositions for the treatment of immune diseases are provided.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, excipient, or combination thereof as necessary with the compound of the present invention.
  • the pharmaceutical composition facilitates the administration of the compound into the organism.
  • Various techniques for administering a compound exist, including oral, injection, aerosol, parenteral, and topical administration, but the scope of the present invention is not limited thereto.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not significantly irritate the living body and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • the additives may improve the preparation, compressibility, appearance and taste of the formulation, and include, for example, stabilizers, surfactants, lubricants, solubilizers, buffers, sweeteners, bases, adsorbents, binders, binders, suspensions.
  • Dosage of amine depends on the doctor's prescription depending on factors such as the patient's weight, sex, age, health condition, diet, the specific nature of the disease, the time of administration of the drug, the method of administration, the drug mixture and the severity of the disease. .
  • dosages required for adult treatment typically range from about 1.0 mg to 2,000 mg per day, depending on the frequency and intensity of administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be usefully used as a pharmaceutical composition for suppressing immune response, and furthermore, it can be widely applied to the treatment of transplant rejection, graft-versus-host disease, allergic disease and autoimmune disease, etc. have.
  • it can be usefully used to obtain a large amount of a therapeutically effective amount of regulatory T cells required for the treatment of immune diseases and chronic inflammatory diseases, and according to the present invention
  • the obtained regulatory T cells can be widely applied to the treatment of transplant rejection, autoimmune diseases such as graft-versus-host disease, and chronic inflammatory diseases that require immune response suppression.
  • Figure 2 shows the clinical GVHD score (A), survival rate (B) and weight (C) according to the days after transplantation after transplantation of bone marrow and spleen cells of the donor mouse to the irradiated recipient mice for the production of GVHD mouse model Indicates.
  • ⁇ GVHD mice prepared by bone marrow and spleen cell transplantation; ⁇ GVDH-induced mice by bone marrow transplantation, not splenocytes; ⁇ administered Compound A 0.3mg / kg to the GVHD mouse model, ⁇ to GVHD mouse model. The case where 1 mg / kg of Compound A is administered is shown.
  • FIG. 3 shows the results of H & E staining of each colon tissue of GVHD mice not treated with Compound A and GVHD mice treated with Compound A.
  • FIG. 4 shows the generation of reactive oxygen species (ROS) of (A) and (B) 7 days after the treatment for GVHD mice not treated with Compound A and GVHD mice treated with Compound A by dose.
  • ROS reactive oxygen species
  • FIG. 5 shows the expression levels of HMGB1 at 7 days after treatment (A) and 14 days after treatment (B) for GVHD mice not treated with Compound A and GVHD mice treated with Compound A by dose.
  • FIG. 6 shows that spleens are isolated from GVHD mice not treated with Compound A and GVHD mice treated with Compound A, respectively, and then analyzed for control T cells (CD4 + CD25 + Foxp3 +) and CD4 + IFN-r cells through flow cytometry. One result is shown.
  • Figure 7 is treated with anti-CD3 (aCD3) and anti-CD28 (aCD28) to CD4 + cells isolated from splenocytes of the mouse, further treated with TGF-beta, and compound A 40uM Or 80 uM further treated, the graph showing the degree of differentiation into regulatory T cells (CD4 + CD25 + Foxp3 + ), respectively.
  • aCD3 anti-CD3
  • aCD28 anti-CD28
  • Figure 9 Compound A 40uM or 80uM in the process of inducing regulatory T cell differentiation by treating anti-CD3 and anti-CD28 to CD4 + T cells isolated from splenocytes of the mouse or further treated with TGF-beta Single treatment group, Retinoic acid (hereinafter referred to as RA) 0.1 uM single treatment group, Retinal 1 uM addition group, RA 0.1 uM and Compound A 40 uM or 80 uM treatment group, and Retinal 1 uM and Compound A Divided into 40uM or 80uM treatment group, the effect on the differentiation into regulatory T cells in each group was confirmed by flow cytometry.
  • RA Retinoic acid
  • 10 is a compound A treatment group, retinal alone treatment group in the process of inducing regulatory T cell differentiation by treating anti-CD3, anti-CD28 and TGF-beta to CD4 + T cells isolated from spleen cells of the mouse , RA alone treatment group, Compound A and retinal combined treatment group, Compound A and RA combined treatment group, it is a graph showing the degree of differentiation into regulatory T cells (CD4 + CD25 + Foxp3 + ), respectively.
  • FIG. 11 shows regulatory T cells induced with aCD3 and aCD28 addition, regulatory T cells induced with aCD3, aCD28 and TGF-beta addition (denoted TGF-beta Tregs), aCD3, aCD28, TGF- ⁇ and RA addition Regulatory T cells (labeled RA Tregs), regulatory T cells induced by the addition of aCD3, aCD28, TGF- ⁇ and Compound A 40 uM and regulatory T cells induced by aCD3, aCD28, TGF- ⁇ and Compound A 80 uM (Compound A Tregs) , T cell proliferation inhibitory effect was confirmed by [ 3 H] Thymidine analysis.
  • Figure 12 shows regulatory T cells induced by aCD3 and aCD28 addition, regulatory T cells induced by aCD3, aCD28 and TGF-beta addition (labeled TGF-beta Tregs), aCD3, aCD28, TGF- ⁇ and RA addition Regulatory T cells (labeled RA Tregs), regulatory T cells induced by the addition of aCD3, aCD28, TGF- ⁇ and Compound A 40 uM and regulatory T cells induced by aCD3, aCD28, TGF- ⁇ and Compound A 80 uM (Compound A Tregs) Inhibition of allogeneic immune cell proliferation was confirmed by [ 3 H] Thymidine analysis.
  • FIG. 13 shows the results of comparative analysis of differentiation-inducing effects of T cells according to the concentration of Compound A in alloimmune cells.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • mice with different MHC classes were purchased from Orient Bio and passed the regulations of the Catholic University Laboratory Animal Lab Management Committee. It was.
  • the awarded mouse BALB / c (H-2kd) was irradiated with whole body radiation at 800 cGy (radiation source: X-ray Mevatron MXE-2), and bone marrow 5 X of donor mouse C57BL / 6 (H-2 kb) within 24 hours.
  • 10 6 and spleen 5 X 10 6 cells were isolated and transplanted into a vein of the same donor mouse to induce a graft-versus-host rejection model.
  • the bone marrow transplanted mice were observed and evaluated twice a week according to the evaluation criteria (Table 1) of 10 points out of a total of 2 points, weight, posture, activity, hair condition, and skin density.
  • Compound of the invention (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indol-7-yl] amine as experimental group GVHD group treated with (LG Life Science, Daejeon, Korea, hereinafter referred to as Compound A) and GVHD group not treated with the compound were divided into control groups, each group of spleens were separated and separated into single cells, followed by regulatory T cells.
  • Expression of CD4 + CD25 + Foxp3 + which is the phenotype of, CD4 + IFN-r cells and CD4 + IL-4 cells were reacted with fluorescent monoclonal antibodies and analyzed using a flow cytometer.
  • CDNA was synthesized with 1 ug of RNA using AMV reverse transcriptase and random hexamers for 1 hour at 45 ° C.
  • the synthesized 1 ug cDNA template was prepared by mixing primer S, primer AS and distilled water, and real-time PCR was performed using SYBR Green. PCR conditions were 95 ° C. 15 sec, 60 ° C. 10 sec, and 72 ° C. using HMGB1 (5'-GAT GGG CAA AGG AGA TCC TAA G-3 'and 5'-TCA CTT TTT TGT CTC CCC TTT GGG-3') 35 cycles were carried out under the condition of 30 seconds. Fluorescence data were measured using Rad CFX96 Real-Time System (Bio-Rad Laboratories).
  • Reaction was performed for 30 minutes with IgG and washed three times in TBS. It was left in 3 ⁇ g / ml horseradish peroxidase streptoavidin for 30 minutes, developed with DAB and hydrogen peroxide, and then stained with Meyer's hematoxylin or 1% methyl green.
  • the compound of the present invention (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5- (1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) methyl-1H-indole through the GVHD mouse model
  • the purpose of this study was to investigate the inhibitory effect of -7-yl] amine on immunorejection.
  • the group treated with the compound of the present invention significantly increased the survival rate compared to the group not, and significant results were also observed in the weight and graft versus host response evaluation (FIGS. 1 and 2).
  • H & E staining of colon tissue showed histological findings of villi and mucosal destruction of the colon in the GVHD group not treated with the compound of the present invention, but similar to normal colon tissue in the group treated with the compound of the present invention. Observation was made (FIG. 3).
  • ROS plays a very important role in regulating human cell function and contributes to the protective action of immune cells in the immune system. In cells showing apoptosis, ROS are produced by the mitochondria, thereby oxidizing HMGB1. Eventually, immune tolerance occurs through oxidized HMGB1.
  • the present inventors found that in the GVHD mouse model, the immune rejection response was reduced by the compound of the present invention, ROS and HMGB1 production inhibition and tissue cell necrosis were suppressed, and thus the possibility of modulating the immune response in the animal model of immune disease was observed.
  • spleens were sacrificed at the expense of the experimental group treated with the compound of the present invention and the control group, and then separated into single cells, and the immunomodulation function was examined through flow cytometry.
  • CD4 + CD25 + Foxp3 + immunoregulatory cells (regulatory T) were increased by 6 times or more.
  • CD4 + IL-4 cells were increased, more than half of the CD4 + IFN-r cells were confirmed that the result (Fig. 6).
  • the donor T cells transplanted after high dose irradiation are activated and proliferated by the host antigen presenting cells to secrete IFN-r, which is known as a representative GVHD-induced cytokine. It indicates that compounds inhibit IFN-r through upregulation of regulatory T cells and IL-4. Therefore, it can be seen that the compound of the present invention can suppress the immune response by inhibiting the activation of the transplanted T cells.
  • CD4 + T cells 5 ⁇ 10 5 isolated from mouse splenocytes were dispensed into 24-well plates coated with 1 ⁇ g / mL of anti-CD3 (aCD3) and 1 ⁇ g / anti-CD28 (aCD28).
  • Control T cell differentiation was induced for 3 days by treatment with mL and TGF-beta 5 ng / mL.
  • CD4 + T cells were isolated from mouse spleen cells and stimulated with aCD3, aCD28, and TGF-beta to create a differentiation environment for regulatory T cells, and then treated with Compound A.
  • aCD3, aCD28, and TGF-beta were treated with Compound A.
  • Compound A was found to promote differentiation into Foxp3 + Treg cells by regulating TGF-beta signals (FIGS. 7 and 8).
  • Example 7 In beat Comparison of Regulatory T Cell Amplification with Retinal / Ltinoic Acid and Compound A, a Conventional Regulatory T Cell Amplifier
  • RA is known to increase differentiation into Foxp3 + Tregs in the presence of TGF-beta. Since the results of Example 6 showed that Compound A strongly increased Foxp3 + expression, the experiment was performed to compare Compound A with generally known effects of RA.
  • CD4 + T cells 5 ⁇ 10 5 isolated from mouse splenocytes were dispensed into 24 well plates coated with anti-CD3 (aCD3) at 1 ⁇ g / mL, and 1 ⁇ g / anti-CD28 (aCD28).
  • aCD3 anti-CD3
  • aCD28 anti-CD28
  • Compound A 40uM or 80uM alone treatment group (2) Retinoic acid (RA) in the process of inducing regulatory T cell differentiation for 3 days by treatment with a concentration of mL and TGF-beta 5 ng / mL.
  • iTreg cells induced T cell proliferation (aCD3 + aCD28 + stimulation) and the activity of allogeneic immune cells (B6 CD4 + and 2000cGy B). / c APC allo response) was evaluated.
  • Treg cells induced by addition of aCD3 and aCD28 (2) Treg cells induced by addition of aCD3, aCD28 and TGF-beta (named TGF-beta Tregs), (3) aCD3, aCD28, TGF- Treg cells induced by ⁇ and RA additions (named RA Tregs), (4) aCD3, aCD28, TGF- ⁇ and Treg cells induced by addition of Compound A 40 uM (named Compound A Tregs), and (5) aCD3, Treg cells (named Compound A Tregs) derived from aCD28, TGF- ⁇ , and Compound A 80 uM were prepared and analyzed by a leukocyte mixed culture method.
  • CD4 + T cells 1 ⁇ 10 5 in mice were seeded in round-bottomed 96 well plates coated with 1 ⁇ g / mL of aCD3 and stimulated at a concentration of 1 ⁇ g / mL of aCD28 to propagate CD4 + T cells.
  • CD4 + T cells 1 ⁇ 10 5 in mice were seeded in round-bottomed 96 well plates coated with 1 ⁇ g / mL of aCD3 and stimulated at a concentration of 1 ⁇ g / mL of aCD28 to propagate CD4 + T cells.
  • aCD3 1 ⁇ g / mL of aCD28
  • the reaction to the spleen cells (donor) 1 X 10 5 and 20Gy of the same type received the irradiation of the spleen cells (recipient) can by the spleen 1 by incubation with the X 10 5 donor cells woman allogeneic immune responses in splenocytes Induced.
  • Treg induced by Compound A inhibits T cell proliferation according to T cell proliferation and homoimmune response than TGF-beta Treg and RA Treg (FIGS. 11 and 12).
  • C57BL / 6 were added to irradiated cells in the spleen of CD4 + T cells, 1 X 10 6 separated and 20Gy in BALBc presented antigenic cells (APC) in 48-well plates and incubated at 37 °C for 5 days.
  • APC antigenic cells
  • Compound A was compared and treated at various concentrations before incubation while incubating the splenocytes by antigen-presenting cells under conditions that induce an homoimmune response. After incubation for 5 days, anti-mouse CD4 PerCP, CD25 APC and FoxP3 PE fluorescence-labeled antibodies were added for flow cytometry and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. After washing with PBS it was measured by flow cytometry (FACs Calibur).

Abstract

본 발명은 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민의 새로운 의약용도에 관한 것으로, 상기 화합물을 활성 성분으로 함유하는 면역 반응 억제용 및/또는 미분화 T 세포로부터 조절 T 세포로의 분화 유도 및/또는 조절 T 세포의 증식 촉진용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

조절 T 세포로의 분화 유도 및 증식 촉진을 통한 면역 반응 억제용 약학 조성물
본 발명은 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민의 새로운 의약용도에 관한 것으로, 특히 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민의 조절 T 세포의 분화 유도 및 증식 촉진 작용, 활성화된 조절 T 세포의 면역조절작용 등을 통한 이식편대숙주질환(Graft-Versus-Host Disease, GVHD)을 비롯한 각종 면역 질환을 예방 또는 치료하는 방법, 이러한 방법에 사용하기 위한 약학 조성물 및 이 약학 조성물을 사용하여 면역 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 조절 T 세포를 수득하는 방법에 관한 것이다.
면역이란 체내에 존재하는 외부 항원 물질을 인식 및 제거하여 외부 물질로부터 자기를 보호하는 작용을 말한다. 면역 반응은 크게 세포성 면역 반응과 체액성 면역 반응으로 구분할 수 있는데, 체액성 면역 반응에서는 B 세포에서 분비된 항체가 외부 항원을 인식하여 이를 중화시키거나, 비-자기(non-self)로 인식된 다른 세포의 표면에 결합함으로써 대식 세포에 의한 식균 작용을 돕거나, 보체계를 활성화 시켜 특정 면역반응을 증대시킨다. 세포성 면역 반응에서는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell, Tc cell)가 직접 외부 항원을 무력화시키거나, IL-2, IFN-gamma 와 같은 사이토카인을 분비하여 대식 세포를 활성화시킨다. 이와 같이 면역 반응에서 자기와 비-자기 항원을 식별하는 능력은 체내 방어 체계를 위해 절대적으로 중요하다.
그런데, 동종 또는 이종의 세포, 조직 또는 기관 등의 이식이라는 특수한 상황에 있어서는, 유익한 외부 이식편(graft)의 생체 거부를 방지하기 위하여 면역 반응을 억제하는 것이 필요하다. 예를 들어, 백혈병, 골수종, 림프종 및 재생불량성 빈혈과 같은 혈액암의 치료를 위하여 동종의 골수 이식 또는 조혈모세포의 이식이 효과적인 치료법으로 사용되고 있는데, 이식편을 비-자기 항원으로 인식하여 면역 거부 반응을 일으킬 경우 공여자에서 유래한 이식편이 수여자의 조직, 피부, 장기 등을 손상시키게 되며 심하면 사망에까지 이르게 할 수 있다. 이와 같이 이식편이 면역 거부 반응을 일으켜 숙주 조직을 손상시키는 질환을 이식편대숙주질환(Graft-Versus-Host Disease, GVHD)이라 한다. 예를 들어, 줄기세포 이식의 경우, 골수에 생착된 새로운 세포 (이식편)가 환자의 조직(숙주)를 이종으로 인식하여 동종 공여자의 골수세포가 수여자의 조직, 피부, 소화기관, 간 등의 장기를 손상시키는 것을 말한다. 이식편대숙주질환의 발병 과정을 살펴보면, 환자의 항원제시세포가, 이식되는 골수세포 중의 T 세포를 활성화시켜 Th1 세포로 분화시키고 IL-2, IFN-gamma 등의 사이토카인 분비를 증가시켜, 이에 의해 세포독성 T 세포 및 자연살해세포 등이 활성화되면서 이들 세포가 환자의 장기를 공격하여 이식편대숙주질환이 발생하게 된다. 이식편대숙주질환의 주요 발생 원인은 동종 골수 이식 또는 조혈모세포의 이식으로, 특히 조혈모세포 이식에 의해 이식편대숙주질환이 발생하여 15~30%가 사망하는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 이식편대숙주질환의 발생을 막고 이식편이 장기간 생존하기 위해서는 외부 항원을 인지하는 수여자의 면역체계를 피하거나 면역 반응을 억제할 수 있어야 한다.
또한, 알러지 반응과 같은 면역과민반응에 있어서, 개체의 면역학적 반응이 침입 이물질보다 더 큰 손상을 유발하는 경우에는 면역 반응을 억제하는 것이 필요하다. 이러한 알러지성 질환의 예로는 알러지성 비염, 천식, 아토피 피부염 등을 들 수 있다. 또한, 자가면역질환은 면역계가 개체 자신의 신체의 일부에 민감하게 되어 자기와 비-자기를 구분하는 능력에 결함이 생기면서 스스로 신체를 파괴하는 질환으로, 역시 면역 반응을 억제하기 위한 치료가 필요하다. 이러한 자가면역질환의 예로는, 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 루푸스, 건선, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 다발성 근육염, 피부근염, 자가면역혈구감소증, 맥관염 증후군, 전신 홍반성 낭창 등을 들 수 있다. 전 세계계적으로 면역과민반응으로 인한 질환이 증가하고 있으나, 이러한 질환들의 발생에 대한 근본적인 원인 규명이 충분히 이루어지지 않은 상태이다. 따라서, 면역 반응의 억제는 이식 거부 반응, 이식편대숙주질환, 알러지성 질환 및 자가면역질환 등의 면역질환으로 고통받는 환자의 치료에 유용한 치료법으로 널리 사용되고 있다. 현재, 면역 반응 억제를 위한 많은 화합물 면역억제제가 개발되어 있으나 사이클로스포린 에이가 가장 우수한 임상효과를 나타내고 있으며 이식편대숙주질환을 비롯하여 자가면역질환, 이식 거부 반응 및 다양한 염증질환에 널리 쓰이고 있다. 그러나 사이클로스포린 에이는 고용량으로 사용할 경우 T 세포의 활성화를 완벽하게 억제하여 질병을 치료할 수 있으나, 신장독성을 포함하여 상당한 부작용을 나타내는 단점을 가지고 있어, 저용량으로 사용하는 것을 권장하고 있다. 또한, 저용량 사용으로 인해 나타나는 약효의 감소를 보충하기 위하여 2-3종의 다른 면역억제제와 병용 투여를 실시하고 있으나, 병용 투여를 위해서는 두 물질의 작용기전과 독성 부위가 상이해야 한다는 선행조건이 있다. 따라서, 기존의 면역억제제를 대체할 수 있는 보다 효과적인 면역억제제의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나인 T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 CD4 양성인 조력 T 세포(helper T cell, Th cell) 와 CD8 양성인 세포독성 T 세포로 구분되고, 이 중 조력 T 세포는 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하여 Th1 (T helper type 1), Th2 (T helper type 2), Th17(T helper type 17), 및 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg cell) 등이 된다. 조절 T 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, 조절 T 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료할 수 있는 것으로 알려져 있다. 조절 T 세포는 CD4+CD25+를 표지자로 사용하고 있으며, 전사 인자 Foxp3을 발현한다. 면역관용과 자가면역질환에서 조절 T 세포의 중요성은 Foxp3 돌연변이를 가진 scurfy mouse에서 분명하게 드러나는데, Foxp3 돌연변이를 가진 scurfy mouse는 CD4+T 세포의 과도한 활성과 염증성 사이토카인의 과도한 생성으로 생후 한달 만에 죽게되며 (Sakaguchi S. et al., Cell 2008, 133:775-787), 사람에서도 Foxp3 유전자의 돌연변이 유전질환인 IPEX (Immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome)의 원인이 되어 제1형 당뇨, 알레르기, 염증성 장질환 등 많은 자가면역질환을 일으키게 된다 (Itoh M. et al., J Immunol 1999, 162:5317-5326). 따라서, 조절 T 세포를 활성화시키거나 조절 T 세포를 유효성분으로 하는 약제를 투여하여 자가면역질환을 비롯한 각종 면역질환 및 만성 염증 질환을 치료할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나, 흉선에서 생산되는 다른 T 림프구에 비해 조절 T 세포는 이미 면역 억제 기능을 지닌 분화된 세포이며, 흉선에서 이미 자가항원에 의해 자극을 받은 세포이다. 조절 T 세포는 흉선 T 림프구의 5% 정도를 차지하며, 말초 기관에 존재하는 CD4+T 림프구의 10~15% 정도를 차지하기 때문에, 치료학적 유효량의 조절 T 세포를 얻는 것이 매우 어려우며, 효과적으로 다량의 조절 T 세포를 수득하는 방법이 요망된다.
한편, 한국특허공개 제10-2009-0018593호는 세포괴사(necrosis)를 저해하는 활성을 가지는 신규한 인돌 또는 인다졸 화합물 및 이를 포함하는 세포괴사 관련 질환 치료제를 제공하고 있다. 그러나, 상기 특허문헌에서는 상기 인돌 또는 인다졸 화합물이 세포괴사를 저해하는 활성에 대해서만 개시하면서, 간 질환, 신경퇴행성 질환 등 일부 세포괴사 관련 질환과의 관련성만을 하고 개시하고 있을 뿐, 상기 화합물이 조절 T 세포에 관련이 있다거나, 면역 반응 억제에 효능이 있다거나 면역과민반응 관련 질환의 치료에 사용될 수 있는 가능성에 대해서는 전혀 언급하지 않고 있다.
이에, 본 발명자들은 기존의 면역억제제를 대체 또는 보조할 수 있는 우수한 면역 억제 효능을 가지는 화합물을 제공하고자 연구한 결과, 기존에 세포괴사 저해제로 알려져 있던 한국특허공개 제10-2009-0018593호의 화합물 특히 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민이 미분화 T 세포로부터 조절 T 세포로의 분화 및 증식을 촉진시키고, 우수한 면역 억제 효능을 나타내어 이식 거부 반응, 이식편대숙주질환, 알러지성 질환 및 자가면역질환 등의 치료에 폭넓게 적용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는, 면역 반응 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는, 이식 거부 반응, 이식편대숙주질환, 알러지성 질환, 자가면역질환 및 염증 질환 등의 면역질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는, 미분화 T 세포로부터 조절 T 세포로의 분화 유도용 및/또는 조절 T 세포의 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미분화 T세포에 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포로의 분화 유도 및/증식 촉진을 통한 조절 T 세포의 수득 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미분화 T세포에 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는 조성물을 처리하여 수득한 조절 T 세포를 포함하는 이식 거부 반응, 이식편대숙주질환, 알러지성 질환, 자가면역질환 및 염증 질환 등의 면역질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는, 조절 T 세포로의 분화 유도 및/또는 증식 촉진에 의한 조절 T 세포의 활성화 등을 통한 면역반응 억제에 사용되기 위한 약학 조성물을 제공한다.
일 양태로서, 본 발명은 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는, 면역 반응 억제용 약학 조성물을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는, 조절 T 세포의 활성화 등을 통한 면역반응 억제에 의해, 이식 거부 반응, 이식편대숙주질환, 알러지성 질환, 자가면역질환 및 염증 질환 등의 면역질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는, 미분화 T 세포로부터 조절 T 세포로의 분화 유도 및/또는 조절 T 세포의 증식 촉진용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 미분화 T세포에 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포로의 분화 유도 및/증식 촉진을 통한 조절 T 세포의 수득 방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 미분화 T세포에 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는 조성물을 처리하여 수득한 조절 T 세포를 포함하는 이식 거부 반응, 이식편대숙주질환, 알러지성 질환, 자가면역질환 및 염증 질환 등의 면역질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민을 제조하는 방법은 한국특허공개 제10-2009-0018593호에 개시된 방법을 참고할 수 있으며, 상기 특허문헌은 전체가 본 명세서 내에 참조로 포함된다.
본 발명에 따른 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민은 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이러한 "약학적으로 허용되는 염"은 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 황산, 염산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산; 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산 부가염이 포함된다. 또한, 약학적으로 허용되는 염기 부가염, 예를 들어, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염; 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염; 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린, 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다. 본 발명에 따른 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 그의 염으로 전환될 수 있으며, 염의 제조는 별도의 설명이 없이도 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
본 명세서에서 '이성체(isomer)'는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 광학적 또는 입체적으로 다른 화합물 또는 그의 염을 의미한다. 본 발명에 따른 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민은 비대칭 탄소중심을 가질 수 있으므로, 광학 이성체(R 또는 S 이성체), 라세미체, 부분 입체 이성체 혼합물, 개개 부분 입체 이성체 등으로 존재할 수 있으며, 기하 이성체(트랜스, 시스형 이성체)도 존재할 수 있다. 이들 모든 이성체 및 그의 혼합물 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
이하에서 별도의 설명이 없는 한, 본 발명에 따른 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민의 약학적으로 허용되는 그의 염 및 이성체는 모두 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명은 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는 조성물을 면역 반응 억제 용도로 제공함을 특징으로 한다.
본 명세서에서 "면역억제" 또는 "면역 반응 억제" 란 외부 또는 자기 항원에 의해 유발되는 생체에 유리하지 않은 면역 반응을 억제시키는 것을 말한다.
본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민은, 모든 세포, 조직 및 기관의 이식에서 발생할 수 있는 면역 거부 반응을 억제하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 피부, 혈액, 각막, 간, 폐, 장, 췌장, 심장, 신장, 골수, 줄기세포 및 전구세포 등의 이식시 면역 거부 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있으며, 바람직하게는 피부 이식, 골수 이식, 줄기세포 이식, 수혈 및 장기 이식시 발생할 수 있는 면역 거부 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 약학 조성물은 이식된 장기, 조직 또는 세포에 대한 면역 반응을 억제시킴으로써, 이식 거부 반응 및/또는 이식편대숙주질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 "치료" 란 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미하며, "예방" 이란 발병 증상을 보이지는 않지만 그러한 위험성이 높은 개체에 사용될 때 발병 징후를 중단 또는 지연시키는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 면역과민반응에 의해 유발되는 각종 면역과민성 질환들, 바람직하게는 알러지성 질환, 자가면역질환 및 염증질환의 치료 및 예방에도 유용하다. 상기 알러지성 질환의 예로는 알러지성 비염, 천식, 아토피 피부염 등을 들 수 있다. 또한, 자가면역질환의 예로는, 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 루푸스, 건선, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 다발성 근육염, 피부근염, 자가면역혈구감소증, 맥관염 증후군, 전신 홍반성 낭창 등을 들 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민이 면역 반응 억제 효과가 있는지 알아보기 위하여, 방사선을 조사한 수여 마우스에 공여 마우스의 골수 및 비장 세포를 이식하여 동종면역반응 마우스 모델을 제작하고, 본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민을 투여하여 면역 이식 거부반응 여부를 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민을 처리한 그룹이 그렇지 않은 그룹에 비해 생존율이 상당히 증가하였고, 몸무게와 이식편대숙주반응평가에서도 의미 있는 결과가 관찰되었으며 (도 1 및 2), 조직학적 소견에서도 대장조직의 H&E 염색 결과 본 발명의 화합물을 처리하지 않은 질환 마우스 모델에서는 대장의 융모 및 점막 파괴 소견이 나타났음에 반하여, 본 발명의 화합물을 처리한 그룹에서는 정상적인 대장 조직 소견과 유사하게 관찰 되었다 (도 3).
또한, 동종면역반응 마우스 모델에서 산화적 스트레스에 의한 면역 반응을 관찰한 결과, 본 발명의 화합물을 처리한 그룹이 그렇지 않은 그룹에 비하여 세포 내 활성 산소종(ROS)의 생성도가 용량 및 시간 의존적으로 유의미하게 억제되었으며 (도 4), 면역조절 기능의 표지인 고이동성그룹단백질 B1(High-mobility group protein, 이하, HMGB1으로 지칭함)의 발현이 유의미하게 억제됨이 관찰되었다 (도 5).
이와 같이, 동종면역반응 마우스 모델에서 본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민에 의해 면역이식거부반응이 감소되고 ROS 및 HMGB1 생성억제 그리고 조직내 세포괴사가 억제됨을 확인하였다. 나아가 세포 수준에서 면역 반응의 조절 가능성을 살펴본 결과, 본 발명의 화합물을 처리한 그룹에서 그렇지 않은 그룹에 비하여 CD4+CD25+Foxp3+ 면역조절세포(조절 T 세포)가 6배 이상 증가하고 CD4+IL-4 세포가 증가하는 반면, CD4+IFN-r는 절반 이상 감소하는 결과를 확인하였다 (도 6). IFN-r는 이식된 공여자의 T 세포가 분비하는 대표적인 이식편대숙주질환을 유발하는 사이토카인으로, 본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민이 조절 T 세포와 IL-4의 상향 조절을 통해 이식된 T 세포의 활성화를 억제함을 알 수 있었다.
이러한 실험결과로부터, 본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민은 조절 T 세포를 증가시키고, 증가된 조절 T 세포의 면역억제작용을 통해 이식된 T 세포의 활성화를 억제하고 염증 반응을 제어하며, 또한 세포 내 활성 산소종(ROS) 및 HMGB1의 발현을 감소시킴으로써 면역 반응을 억제하는 효능을 가짐을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 면역 반응 억제용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있고, 나아가 면역 반응 억제를 필요로 하는 이식 거부 반응, 이식편대숙주질환, 알러지성 질환, 자가면역질환 및 염증질환 등의 면역질환치료에 폭넓게 적용될 수 있다.
본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민을 활성성분으로서 포함하는 면역억제용 약학 조성물은 기존에 알려진 다른 면역억제제와 함께 사용할 수 있다. 병용 가능한 다른 면역억제제의 예로는, 사이클로스포린 에이, 라파마이신, 타크롤리무스, 사크롤리무스, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸, 또는 각종 스테로이드제제 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로, (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는, 미분화 T 세포로부터 조절 T 세포로의 분화 유도용 및/또는 조절 T 세포의 증식 촉진용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 "조절 T 세포"란 T 세포 반응을 조정할 수 있는 세포를 말하며, CD4+CD25+를 표지자로 사용하고, 전사 인자 Foxp3을 발현하는 세포이다. 상기 조절 T 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있으며, 면역관용과 자가면역질환, 그리고 만성 염증 반응을 억제하여 이들 질환에 대한 치료효과를 나타낼 수 있다. 특히 Foxp3 인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민에 의해 유도된 조절 T 세포는, 모든 세포, 조직 및 기관의 이식에서 발생할 수 있는 면역 거부 반응을 억제하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 피부, 혈액, 각막, 간, 폐, 장, 췌장, 심장, 신장, 골수, 줄기세포 및 전구세포 등의 이식시 면역 거부 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있으며, 바람직하게는 피부 이식, 골수 이식, 줄기세포 이식, 수혈 및 장기 이식시 발생할 수 있는 면역 거부 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 화합물에 의해 유도된 조절 T 세포는 이식된 장기, 조직 또는 세포에 대한 면역 반응을 억제시킴으로써, 이식 거부 반응 또는 이식편대숙주질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물에 의해 유도된 조절 T 세포는 면역과민반응에 의해 유발되는 각종 면역과민성 질환들의 치료 및 예방에도 유용하게 사용될 수 있다. 자가면역질환의 예로는, 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 루푸스, 건선, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 다발성 근육염, 피부근염, 자가면역혈구감소증, 맥관염 증후군, 전신 홍반성 낭창 등을 들 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민이 마우스의 비장세포에서 분리한 CD4+T 세포로부터 조절 T 세포로의 분화를 촉진시키는 것을 확인하였고 (도 7 및 도 8), 이러한 효과는 종래에 조절 T 세포의 분화 촉진제로 알려진 레티날 또는 레티노산만큼이나 우수한 효과이며, 나아가 레티날 또는 레티노산과 본 발명의 화합물을 병합하여 처리할 경우 조절 T 세포로의 분화 효과가 더욱 촉진되는 것을 확인하였다 (도 9 및 도 10). 또한, 본 발명의 화합물 처리에 의하여 유도된 조절 T 세포는 인 비트로 실험에서 T 세포 및 동종면역반응 세포의 증식을 억제하는 효과를 나타내었고, 인 비보 이식편대숙주질환 마우스 모델에서 조절 T 세포의 면역조절 기능에 영향을 미친다는 것이 확인되었다 (도 11 내지 도 14).
따라서, 본 발명의 화합물 또는 이를 포함하는 조성물은 미분화 T 세포로부터 조절 T 세포로 분화를 유도하고/거나 조절 T 세포의 증식을 촉진시킴으로써, 면역질환 및 만성 염증 질환의 치료에 필요한 치료학적 유효량의 조절 T 세포를 다량 생산 및 농축하는 데 유용하게 사용할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 화합물을 포함하는 미분화 T 세포로부터 조절 T 세포로의 분화 유도용 및/또는 조절 T 세포의 증식 촉진용 약학적 조성물은 조절 T 세포로의 분화를 위하여 항-CD3 항체, 항-CD28항체 및 TGF-beta를 더욱 포함할 수 있으며, 분화 및 증식 촉진 효과를 더욱 향상시키기 위하여 종래의 분화유도제인 레티노산 또는 레티날을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물에 의하여 분화된 조절 T 세포는 CD4+, CD25+ 및 Foxp3+ 의 표현형을 나타내게 되며, 동종면역반응 세포 및 GVHD 마우스에서 면역 반응을 조절 및 억제하는 기능성을 가진다.
나아가, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이를 포함하는 조성물을 미분화 T 세포에수득처리함으로써 수득된 조절 T 세포를 포함하는, 이식 거부 반응, 이식편대숙주질환, 알러지성 질환, 자가면역질환 및 염증질환 등의 면역질환치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 화합물과 함께 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 생물체 내로 화합물이 투여되는 것을 용이하게 한다. 화합물을 투여하는 다양한 기술들이 존재하며, 여기에는 경구, 주사, 에어로졸, 비경구 및 국소 투여 등이 포함되지만, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 생체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 또한, 상기 첨가제는 제제의 제조, 압축성, 외관 및 맛을 향상시킬 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 계면활성제, 활택제, 가용화제, 완충제, 감미제, 기제, 흡착제, 교미제, 결합제, 현탁화제, 경화제, 항산화제, 광택제, 착향제, 향미제, 안료, 코팅제, 습윤제, 습윤 조정제, 충전제, 소포제, 청량화제, 저작제, 정전 방지제, 착색제, 당의제, 등장화제, 연화제, 유화제, 점착제, 점증제, 발포제, pH조절제, 부형제, 분산제, 붕해제, 방수제, 방부제, 보존제, 용해 보조제, 용제, 유동화제 등을 필요에 따라 첨가할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민의 투여량은 환자의 체중, 성, 나이, 건강상태, 식이, 질병의 특수한 성질, 약제의 투여시간, 투여방법, 약제혼합 및 질환의 중증도 등과 같은 요인에 따라 의사의 처방에 따른다. 그러나, 성인 치료에 필요한 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 1.0 mg 내지 2,000mg 범위가 보통이다. 성인에게 근육 내 또는 정맥 내 투여 시 일회 투여량으로 분리하여 하루에 보통 약 1.0 mg 내지 300mg의 전체 투여량이면 충분할 것이나, 일부 환자의 경우 더 높은 일일 투여량이 바람직할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 면역 반응 억제용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있고, 나아가 면역 반응 억제를 필요로 하는 이식 거부 반응, 이식편대숙주질환, 알러지성 질환 및 자가면역질환 등의 치료에 폭넓게 적용될 수 있다. 또한, 미분화 T 세포로부터 조절 T 세포로의 분화 및 증식을 촉진시킴으로써, 면역질환 및 만성 염증 질환의 치료에 필요한 치료학적 유효량의 조절 T 세포를 다량 수득하는 데 유용하게 사용할 수 있고, 본 발명에 의하여 수득된 조절 T 세포는 면역 반응 억제를 필요로 하는 이식 거부 반응, 이식편대숙주질환과 같은 자가면역질환, 및 만성 염증 질환 등의 치료에 폭넓게 적용될 수 있다.
도 1은 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민(이하, 화합물 A로 표시)을 처리하지 않은 GVHD 마우스 및 화합물 A를 처리한 GVHD 마우스의 사진을 나타낸다.
도 2는 GVHD 마우스 모델의 제조를 위하여 방사선을 조사한 수여 마우스에 공여 마우스의 골수 및 비장 세포를 이식한 후, 이식 경과 일수에 따른 임상적 GVHD 점수 (A), 생존율 (B) 및 몸무게 (C) 를 나타낸다. ■ 는 골수 및 비장 세포 이식으로 제조한 GVHD 마우스, ● 는 비장 세포가 아닌 골수 이식으로 GVDH가 유도되지 않은 마우스, △ 는 GVHD 마우스 모델에 화합물 A 0.3mg/kg을 투여, ▼ 는 GVHD 마우스 모델에 화합물 A 1mg/kg을 투여한 경우를 나타낸다.
도 3은 화합물 A를 처리하지 않은 GVHD 마우스 및 화합물 A를 처리한 GVHD 마우스의 각 대장 조직의 H&E 염색 결과를 나타낸다.
도 4는 화합물 A를 처리하지 않은 GVHD 마우스 및 화합물 A를 용량 별로 처리한 GVHD 마우스에 대하여, 처리 7일 후 (A) 및 14일 후 (B) 의 활성산소종(ROS) 생성도를 나타낸다.
도 5는 화합물 A를 처리하지 않은 GVHD 마우스 및 화합물 A를 용량 별로 처리한 GVHD 마우스에 대하여, 처리 7일 후 (A) 및 14일 후 (B)의 HMGB1의 발현 정도를 나타낸다.
도 6은 화합물 A를 처리하지 않은 GVHD 마우스 및 화합물 A를 처리한 GVHD 마우스에서 각각 비장을 분리한 후, 유세포분석을 통하여 조절 T 세포(CD4+CD25+Foxp3+) 및 CD4+IFN-r세포를 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 마우스의 비장세포에서 분리한 CD4+ 세포에 anti-CD3(aCD3) 및 anti-CD28(aCD28)를 처리한 경우, 여기에 TGF-beta를 추가로 처리한 경우, 및 여기에 화합물 A 40uM 또는 80uM를 추가로 처리한 경우, 각각 조절 T 세포(CD4+CD25+Foxp3+)로의 분화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 마우스의 비장세포에서 분리한 CD4+ 세포에 anti-CD3 및 anti-CD28를 처리한 경우, 여기에 TGF-beta를 추가로 처리한 경우, 및 여기에 화합물 A 40uM 또는 80uM를 추가로 처리한 경우, 각각 분화된 세포의 Fopx3+발현 정도를 유세포 분석기로 확인한 결과이다.
도 9는 마우스의 비장세포에서 분리한 CD4+T세포에 anti-CD3 및 anti-CD28을 처리하거나 여기에 TGF-beta를 추가로 처리하여 조절 T 세포 분화를 유도하는 과정에서, 화합물 A 40uM 또는 80uM 단독 처리군, 레티노산(Retinoic acid, 이하, RA로 표시) 0.1uM 단독 처리군, 레티날(Retinal) 1uM 첨가 그룹, RA 0.1uM 및 화합물 A 40uM 또는 80uM 처리군, 및 레티날 1uM 및 화합물 A 40uM 또는 80uM 처리군으로 나누어, 각 군에서 조절 T 세포로의 분화에 대한 영향을 유세포 분석기로 확인한 결과이다.
도 10은 마우스의 비장세포에서 분리한 CD4+T세포에 anti-CD3, anti-CD28 및 TGF-beta를 처리하여 조절 T 세포 분화를 유도하는 과정에서, 화합물 A 단독 처리군, 레티날 단독 처리군, RA 단독처리군, 화합물 A 및 레티날 병합 처리군, 및 화합물 A 및 RA 병합 처리군으로 나누어, 각각 조절 T 세포(CD4+CD25+Foxp3+)로의 분화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 11은 aCD3 및 aCD28 첨가로 유도된 조절 T 세포, aCD3, aCD28 및 TGF-beta 첨가로 유도된 조절 T 세포(TGF-beta Treg로 표시), aCD3, aCD28, TGF-β 및 RA 첨가로 유도된 조절 T 세포(RA Treg로 표시), aCD3, aCD28, TGF-β 및 화합물 A 40uM 첨가로 유도된 조절 T 세포 및 aCD3, aCD28, TGF-β 및 화합물 A 80uM로 유도된 조절 T 세포(화합물 A Treg로 표시)에 대하여, T 세포 증식 억제 효과를 [3H]Thymidine 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 12는 aCD3 및 aCD28 첨가로 유도된 조절 T 세포, aCD3, aCD28 및 TGF-beta 첨가로 유도된 조절 T 세포(TGF-beta Treg로 표시), aCD3, aCD28, TGF-β 및 RA 첨가로 유도된 조절 T 세포(RA Treg로 표시), aCD3, aCD28, TGF-β 및 화합물 A 40uM 첨가로 유도된 조절 T 세포 및 aCD3, aCD28, TGF-β 및 화합물 A 80uM로 유도된 조절 T 세포(화합물 A Treg로 표시)에 대하여, 동종면역반응세포 증식 억제 효과를 [3H]Thymidine 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 13은 동종면역세포에서 화합물 A의 농도에 따른 조절 T 세포로의 분화 유도효과를 농도별로 비교 분석한 결과이다.
도 14는 이식편대숙주질환(GVHD) 마우스 모델에 화합물 A를 투여했을 때 농도에 따른 조절 T 세포로의 분화 촉진효과를 농도별로 비교 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 동종면역반응 마우스 모델의 확립
MHC class가 서로 다른 C57BL/6(H-2kb)와 BALB/c(H-2kd) 마우스 6~8주령을 오리엔트 바이오에서 구입하여 가톨릭대학교 실험동물연구실 관리위원회의 규정을 통과한 후 관리를 받아 사용하였다. 수여 마우스인 BALB/c(H-2kd)는 800cGy로 전신 방사선을 조사(방사선 소스: X-ray Mevatron MXE-2)하였고, 24시간 이내에 공여 마우스인 C57BL/6(H-2kb)의 골수 5 X 106 와 비장 5 X 106 세포를 분리하여 동종의 수여 마우스의 정맥으로 이식하여 이식편대숙주거부반응 모델을 유도하였다. 상기 골수 이식한 마우스는 하여 무게, 자세, 활동성, 털 상태, 피부 밀도를 각 2점씩 총 10점 만점의 평가 기준(표 1)에 의하여 일주일에 2회씩 관찰 및 평가하였다.
표 1
Figure PCTKR2014002504-appb-T000001
실시예 2. 유세포분석 (FACs 분석)
실험군으로 본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민 (LG 생명과학, 대전, 한국, 이하 화합물 A로 지칭)을 처리한 GVHD 그룹 및 대조군으로 상기 화합물을 처리하지 않은 GVHD 그룹을 나누어서, 각 그룹의 비장을 분리하고 단일세포로 분리한 뒤 조절 T세포의 표현형이라 할 수 있는 CD4+CD25+Foxp3+의 발현과, CD4+IFN-r 세포 및 CD4+IL-4 세포를, 형광을 띄는 단일클론 항체를 이용하여 반응시키고 유세포분석기를 사용하여 분석하였다.
실시예 3. 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS) 측정
각 그룹의 동물을 희생하여 비장을 분리하고 단일세포로 분리한 뒤 PBS(phosphate buffer saline)에 두 번 세척하였다. 3uM carboxy-H2DCFDA 시약을 사용하여 10분 동안 37℃에서 반응하고 PBS로 세척하여 유세포분석기를 사용하여 540nm파장으로 분석하였다.
실시예 4. RT-PCR
세포로부터 TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 1 ug의 RNA를 가지고 AMV 역전사효소와 랜덤 헥사머(random hexamers)를 함께 이용하여 45℃에서 1시간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 이렇게 합성된 1 ug cDNA 주형으로 primer S, primer AS 그리고 증류수를 혼합하여 혼합물을 만들고 SYBR Green를 사용하여 실시간 PCR를 수행하였다. PCR 조건은 HMGB1(5'-GAT GGG CAA AGG AGA TCC TAA G-3' 그리고 5'-TCA CTT TTT TGT CTC CCC TTT GGG-3')을 사용하여 95℃ 15초, 60℃ 10초 그리고 72℃ 30초의 조건으로 35cycle 진행하였다. 형광 데이터들은 Rad CFX96 Real-Time System (Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 측정되었다.
실시예 5. 면역조직화학염색 (Immunocytochemistry)
파라핀에 포매된 조직으로부터 4 μm의 연속 절편을 얻어 자일렌에서 3회 처리하여 파라핀을 제거하고 95%, 90%, 70% 에탄올에서 단계적으로 함수하였다. 0.5% 과산화수소에서 내인성 퍼옥시다아제(endogenous peroxidase)를 제거한 후 정상 염소 혈청으로 30분간 처리하고 일차 항체를 3% BSA (bovine serum albumin)가 포함된 PBS에 제조 회사의 지시대로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 위의 연구에서 발현의 차이를 보이는 유전자에 대하여 발현 단백에 대한 일차항체 반응 후 TBS(Tris-buffer saline)에서 3번 세척하고 3% BSA에 희석한 5 μg/ml biotinylated anti-mouse/anti-rabbit IgG에 30분간 반응시키고 3회 TBS에서 세척하였다. 3 μg/ml horseradish peroxidase streptoavidin에서 30분간 방치시키고 DAB와 과산화수소를 이용하여 발색 한 후 Meyer's hematoxylin 이나 1% methyl green에서 대조 염색하였다.
실험 결과
1. 본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민에 의한 마우스 모델에서 면역이식거부반응 억제
본 발명에서는 GVHD 마우스모델을 통하여 본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민에 의한 면역거부반응의 억제효과를 관찰하고자 하였다. 이러한 실험 결과로, 본 발명의 화합물을 처리한 그룹이 그렇지 않은 그룹에 비해 생존율이 상당히 증가하였고, 몸무게와 이식편대숙주반응평가에서도 의미 있는 결과를 관찰할 수 있었다 (도 1 및 2). 조직학적 소견에서도 대장조직의 H&E 염색결과, 본 발명의 화합물을 처리하지 않은 GVHD 그룹에서는 대장의 융모 및 점막 파괴 소견을 보였으나, 본 발명의 화합물을 처리한 그룹에서는 정상적인 대장 조직 소견과 비슷함을 관찰하였다 (도 3).
2. 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민에 의한 산화적 스트레스 조절
ROS는 인체 세포기능 조절에 대단히 중요한 역할을 하며 면역체계에서 면역세포의 방어 작용에 기여한다. 세포사멸을 보이는 세포에서는 미토콘드리아에 의해 ROS가 생성되고 이로 인해 HMGB1이 산화된다. 결국에는 산화된 HMGB1를 통해 면역관용을 일으키게 된다.
이에, 본 연구자들은 GVHD 마우스 모델을 통하여 산화적 스트레스에 의한 면역반응을 관찰하고자 하였다. 그 결과, 본 발명의 화합물을 처리한 그룹이 대조 그룹에 비하여 세포 내 활성산소의 생성도가 용량 및 시간 의존적으로 유의미하게 억제됨을 관찰하였다 (도 4).
3. 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민에 의한 HMGB1생성 억제
HMGB1의 방출은 염증 및 면역조절 기능의 가능성이 있음이 널리 알려져 왔다. 그러므로 본 연구에서는 GVHD 마우스 모델에서 본 발명의 화합물을 처리한 실험군과 대조군에서 동물을 희생시키고 비장 세포로부터 RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하여 실시간 PCR로 HMGB1의 발현을 비교 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 화합물을 처리한 그룹이 대조군에 비해 HMGB1 방출이 시간 의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다 (도 5).
4. 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민에 의한 면역기능 조절
본 발명자들은 GVHD 마우스 모델에서 본 발명의 화합물에 의해 면역이식거부반응이 감소되고 ROS 및 HMGB1 생성억제 그리고 조직내 세포괴사가 억제됨을 발견하였으므로, 나아가 면역질환동물모델에서의 면역반응의 조절 가능성을 관찰하고자 하였다. 이에, 본 발명의 화합물을 처리한 실험군과 대조군의 마우스를 희생하여 비장을 분리하고 단일 세포로 분리한 뒤 유세포분석을 통해 면역조절 기능을 조사 한 결과, 본 발명의 화합물을 처리한 그룹이 대조군에 비해 CD4+CD25+Foxp3+ 면역조절세포(조절 T)는 6배 이상 증가된 유의미한 결과를 관찰할 수 있었다. 또한 CD4+IL-4 세포는 증가하였고, CD4+IFN-r 세포가 절반 이상이 감소된 결과를 확인하였다 (도 6). GVHD 마우스 모델에서 고용량의 방사선 조사 이후 이식되는 공여자의 T 세포가 숙주의 항원제시세포에 의해 활성화되고 증식하여, 대표적인 GVHD 유발 사이토카인으로 알려진 IFN-r를 분비하게 되는데, 상기 실험 결과는 본 발명의 화합물이 조절 T 세포와 IL-4의 상향 조절을 통해 IFN-r를 억제한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 화합물이 이식된 T 세포의 활성화를 억제함으로써 면역 반응을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6. 인 비트로 실험에서 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민에 의한 조절 T 세포로의 분화 유도 효과 확인
본 발명의 화합물이 Lymphoctye Th 세포 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 실험하였다. 마우스의 비장세포에서 분리된 CD4+T세포 5 X 105을 anti-CD3(aCD3)가 1 μg/mL로 코팅(coating) 처리된 24 웰 플레이트에 분주하고, anti-CD28(aCD28) 1 μg/mL과 TGF-beta 5 ng/mL 의 농도로 처리하여 3일 동안 조절 T 세포 분화를 유도하였다. 본 발명의 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민 (이하, 화합물 A로 명명) (LG 생명과학, 대전, 한국)을 조절 T 세포 분화시키기 전에 40uM 과 80uM 의 농도로 처리하였다. 유세포 분석을 위해 anti-mouse CD4 PerCP, CD25 APC 와 FoxP3 PE 형광이 라벨된 항체를 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 씻어준 후 유세포 분석기 (FACs Calibur) 로 측정하였다.
이와 같이, 마우스의 비장세포에서 CD4+T 세포를 분리한 뒤 aCD3, aCD28, 및 TGF-beta로 자극하여 조절 T 세포의 분화 환경을 조성한 후 화합물 A를 처리한 결과, 화합물 A를 처리하지 않은 대조군에 비하여 약 2배 가까이 조절 T세포로의 분화를 촉진하여 Fopx3+발현을 높였으며, 화합물 A 농도에 의존적으로 조절 T세포로의 분화가 증가하였다. 특히, 화합물 A는 TGF-beta signals을 조절하여 Foxp3+Treg세포로의 분화를 촉진하는 것을 알 수 있었다 (도 7 및 도 8).
실시예 7. 인 비트로 실험에서 기존 조절 T 세포 증폭제인 레티날/래티노산과 화합물 A에 의한 조절 T 세포 증폭 비교 및 병합치료 효과 확인
RA는 TGF-beta의 존재 하에 Foxp3+Treg로의 분화를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 실시예 6의 실험결과에서 화합물 A가 특히 Foxp3+ 표현을 강하게 증가시키는 것을 알 수 있었기 때문에, 일반적으로 알려진 RA의 효과와 화합물 A를 비교하는 실험을 실시하였다.
마우스의 비장세포에서 분리된 CD4+T세포 5 X 105을 anti-CD3(aCD3)가 1 μg/mL로 코팅(coating) 처리된 24 well plate에 분주하고, anti-CD28(aCD28) 1 μg/mL과 TGF-beta 5 ng/mL의 농도로 처리하여 3일 동안 조절 T 세포 분화를 유도하는 과정에서, (1) 화합물 A 40uM 또는 80uM 단독 처리군, (2) 레티노산(Retinoic acid, RA) 0.1uM 단독 처리군, (3) 레티날(Retinal) 1uM 첨가 그룹, (4) RA 0.1uM 및 화합물 A 40uM 또는 80uM 처리군, 및 (5) 레티날 1uM 및 화합물 A 40uM 또는 80uM 처리군으로 나누어, 각 군에서 조절 T 세포로의 분화에 대한 영향을 비교하였다.
이와 같이, CD4+T 세포에 aCD3, aCD28, 및 TGF-beta의 존재 하에 각 화합물들을 단독으로 또는 병합하여 처리한 결과, 화합물 A를 단독으로 처리한 경우 레티날 또는 RA 를 처리한 경우와 유사한 정도로 Fopx3+ 발현이 증가되었다. 또한, RA 및 화합물 A를 병합 처리한 경우와, 레티날 및 화합물 A를 병합 처리한 경우에는, 각각을 단독으로 처리한 경우보다 Fopx3+발현이 증가되었다. 이는 Th 세포 분화에 있어서 화합물 A가 조절 T 세포로의 분화를 촉진시키는 것을 더욱 입증해주는 것이다 (도 9 및 도 10).
실시예 8. 화합물 A로 유도된 T 조절세포의 동종면역반응세포 증식억제 효과 확인
화합물 A로 유도된 조절 T 세포(이하, ‘iTreg’로 지칭)의 기능을 확인하기 위해서, iTreg 세포가 T 세포 증식(aCD3+aCD28+ 자극) 및 동종면역반응세포의 활성(B6 CD4+와 2000cGy B/c APC의 allo response)을 억제하는지를 평가하였다. 이를 위하여, (1) aCD3 및 aCD28 첨가로 유도된 Treg 세포, (2) aCD3, aCD28 및 TGF-beta 첨가로 유도된 Treg 세포(TGF-beta Treg로 명명), (3) aCD3, aCD28, TGF-β 및 RA 첨가로 유도된 Treg 세포(RA Treg 로 명명), (4) aCD3, aCD28, TGF-β 및 화합물 A 40uM 첨가로 유도된 Treg 세포(화합물 A Treg 로 명명), 및 (5) aCD3, aCD28, TGF-β 및 화합물 A 80uM로 유도된 Treg 세포(화합물 A Treg 로 명명)를 준비하고 백혈구 혼합 배양법으로 비교 분석하였다.
첫 번째로, T 세포 증식에 대한 분석을 실시하였다. 마우스의 CD4+T세포 1 X 105을 aCD3가 1 μg/mL로 코팅(coating) 처리된 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 분주하고 aCD28 1 μg/mL의 농도로 자극하여 CD4+ T세포가 증식되는 환경을 조성하였다.
두 번째로, 반응할 비장세포(donor) 1 X 105와 20Gy 방사선 조사를 받은 동종의 비장세포(recipient) 1 X 105를 함께 배양하여 공여자 비장 세포에 의한 수여자의 비장세포에 동종면역 반응을 유도하였다.
위와 같은 조건으로 실시한 96 웰 플레이트에 생체 외에서 유도된 다섯 가지의 조절 T 세포를 각 웰당 1 X 105 씩 CD4+T세포와 1:1 비율로 처리하여 3~4일 동안 37℃에서 배양하였다. 그리고 [3H]Thymidine을 첨가하여 수확하기 전에 8~14시간 배양 한 후 Tomtec harvesting machine을 이용하여 여과하여 얻은 세포의 radioactivity를 Microbeta liquid scintillation counter를 이용하여 측정하였다.
실험 결과, 화합물 A로 유도된 Treg이 TGF-beta Treg, RA Treg보다 T 세포 증식및 동종면역반응에 따른 T 세포 활성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다 (도 11 및 도 12).
실시예 9. 인 비트로 실험에서 화합물 A에 의한 조절 T 세포 분화 영향 확인
C57BL/6 의 비장세포에서 분리된 CD4+ T세포 1 X 106와 20Gy에서 조사한 BALBc 항원제시세포 (APC)를 48웰 플레이트에 첨가하여 5일 동안 37℃에서 배양하였다. 항원제시 세포에 의한 비장세포에 동종면역 반응을 유도하는 조건으로 배양하면서 화합물 A는 배양 전에 다양한 농도로 처리하여 비교 분석하였다. 5일 배양 후 수확하여 유세포 분석을 위해 anti-mouse CD4 PerCP, CD25 APC 와 FoxP3 PE 형광이 라벨된 항체들을 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 씻어준 후 유세포 분석기 (FACs Calibur) 로 측정하였다.
그 결과, 화합물 A의 농도가 증가할수록 조절 T 세포가 증가함을 확인할 수 있었다 (도 13).
실시예 10. 인 비보 이식편대숙주질환(GVHD) 마우스 모델에서의 화합물 A에 의한 조절 T 세포 증가 효과 확인
MHC class가 서로 다른 C57BL/6(H-2kb)와 BALB/c(H-2kd) 마우스 6~8주령을 사용하였으며 수여마우스인 BALB/c(H-2kd)는 8Gy로 전신방사선을 조사하였고, 24시간 이내에 공여마우스인 C57BL/6(H-2kb)의 골수 5 X 106와 비장 5 X 106 세포를 분리하여 정맥으로 이식하여 이식편대숙주거부반응 모델(GVHD 모델)을 유도하였다. 이러한 GVHD 모델에게 화합물 A를 정맥내로 일주일에 4 회씩 2주 동안 주입하였다. 마우스를 희생하여 단일 세포로 분리한 뒤 유세포분석을 통해 비장에 존재하는 면역조절 기능을 조사한 결과, 화합물 A를 투여한 그룹에서 CD4+CD25+Foxp3+ 조절 T 세포가 증가함을 확인할 수 있었다 (도 14).

Claims (11)

  1. (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는, 면역 반응 억제용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 피부, 혈액, 각막, 간, 폐, 장, 췌장, 심장, 신장, 골수, 줄기세포 또는 전구세포의 이식에 대한 면역 거부 반응을 억제하기 위한 것인, 면역 반응 억제용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 이식편대숙주질환, 알러지성 질환, 자가면역질환 또는 염증 질환의 치료 및 예방에 사용되는 것인, 면역 반응 억제용 약학 조성물.
  4. (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민, 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성체를 포함하는, 미분화 T 세포로부터 조절 T 세포로의 분화 유도 및/또는 조절 T 세포의 증식 촉진용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 항-CD3 항체, 항-CD28항체 및 TGF-beta를 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 레티노산(Retinoic acid, RA) 또는 레티날(Retinal)을 추가로 포함하는 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 조절 T 세포는 CD4+, CD25+ 및 Foxp3+의 표현형을 나타내는 것인 조성물.
  8. 생체 외에서 미분화 T세포에 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 조절 T 세포로의 분화를 유도하는 방법.
  9. 생체 외에서 미분화 T세포에 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 조절 T 세포의 증식을 촉진하는 방법.
  10. 생체 외에서 미분화 T세포에 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 조절 T 세포의 분화 유도 및 증식 촉진을 통해 조절 T 세포를 수득하는 방법.
  11. 제10항의 방법에 의해 수득된 조절 T 세포를 포함하는, 이식 거부 반응, 이식편대숙주질환, 알러지성 질환, 자가면역질환 및 염증질환 등의 면역질환치료용 조성물.
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