WO2019190293A1 - 뇌 표적 지속성 단백질 결합체, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

뇌 표적 지속성 단백질 결합체, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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문미진
김정아
정성엽
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    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Definitions

  • the present invention is directed to brain targetable sustained protein conjugates and methods for their preparation.
  • the present invention also relates to novel brain target peptides and uses thereof.
  • the blood-brain barrier is a structure composed of tight junctions between the endothelial cells of the cerebrovascular and astrocytes that strengthen the blood vessels. It does not come out easily into the real thing. For this reason, many drugs developed for the treatment of brain diseases have a problem that the cerebrovascular barrier does not pass well. Almost 100% of the macromolecular drugs and more than 98% of the small-molecule drugs do not pass the BBB. Only small molecules with very few drugs, high lipid solubility and molecular weight below 400-500 daltons actually pass through BBB. In addition, of the small molecules that pass through the BBB, only a few pass through the BBB in a pharmaceutically significant amount.
  • brain diseases such as depression, affective disorders, chronic pain, and epilepsy, respond to small molecule drugs that cross the BBB.
  • brain diseases such as depression, affective disorders, chronic pain, and epilepsy, respond to small molecule drugs that cross the BBB.
  • brain diseases such as Alzheimer's disease, stroke / nerve protection, brain and spinal cord injury, brain cancer, HIV infection of the brain, various ataxia-producing disorders, amyotrophic lateral sclerosis, ALS), Huntington disease, childhood inborn genetic error that affects the brain, Parkinson's disease, and multiple sclerosis do not respond to conventional lipid-soluble small molecular weight drugs. Do not.
  • One object of the present invention is to provide a brain targeted sustained conjugate comprising a biocompatible material capable of crossing the cerebrovascular barrier, maintaining bioactive activity and extending the half-life of the bioactive material.
  • one object of the present invention is to provide a brain target sustained conjugate, in which the physiologically active substance and the brain target peptide are each independently linked to a immunoglobulin Fc region by a peptidic linker or a non-peptidyl linker.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the brain target sustained conjugate, an expression vector comprising the same, a host cell comprising the polynucleotide or the expression vector, and a kit comprising one or more thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a composition, such as a pharmaceutical composition, comprising the brain target sustained conjugate.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preparing the brain target sustained conjugate.
  • Still another object of the present invention is a brain target peptide, a polynucleotide encoding the same, an expression vector comprising the polynucleotide, the host cell comprising the polynucleotide or an expression vector comprising the same; And it provides a kit comprising one or more of these.
  • One aspect for implementing the present invention is a brain target sustained conjugate, comprising a biocompatible material capable of crossing the cerebrovascular barrier, maintaining bioactive potency, and extending the half-life of the bioactive substance.
  • the present invention relates to a brain target sustained conjugate, in which the physiologically active substance and the brain target peptide are each independently linked to a immunoglobulin Fc region by a peptidic linker or a non-peptidyl linker.
  • the conjugate is characterized in that the bioactive material is linked to each other by the immunoglobulin Fc region of the brain target peptide fused to the immunoglobulin Fc region.
  • the binder is characterized by the following formula (1):
  • X is a bioactive substance
  • Y is brain target peptide (BTP)
  • L 1 and L 2 are peptidic or nonpeptidic linkers
  • the peptidic linker comprises 0 to 1000 amino acids
  • F is an immunoglobulin constant region comprising an FcRn binding site.
  • the F or immunoglobulin Fc region may be in dimeric form.
  • the sustained conjugate is characterized by the passage of a bioactive substance into brain tissue through the cerebrovascular barrier.
  • the brain target peptide comprises a peptide, protein or antibody having an amino acid sequence capable of crossing the cerebral vascular barrier.
  • the brain target peptide crosses the cerebrovascular barrier via a pathway by passive transport or by a receptor-mediated transport. Characterized in that but is not limited thereto. Examples are peptides, proteins or antibodies that can cross the cerebral vascular barrier and are not particularly limited in type and size.
  • the brain target peptide is characterized by crossing the cerebrovascular barrier via a pathway by receptor mediated delivery.
  • the pathway by receptor-mediated transport is insulin receptor, transferrin receptor, low density lipoprotein receptor (low). density lipoprotein receptor, low density lipoprotein receptor-related protein, leptin receptor, nicotinic acetylcholine receptor, glutathione transporter, calcium-dependent potassium Cerebral vessels by receptor mediated delivery pathways through any one selected from the group consisting of a calcium-activated potassium channel, and a receptor for advanced glycation endproducts (RAGEs), and ligands of the receptors and antibodies that bind to the receptor or ligand Characterized by passing through the barrier, but not limited thereto It doesn't work.
  • RAGEs receptor for advanced glycation endproducts
  • the brain target peptide may be selected from the group consisting of peptides, proteins, or antibodies that cross the cerebrovascular barrier through these pathways, or may be some peptide sequences isolated from the peptides, proteins, or antibodies, but are not limited thereto.
  • the bioactive substance is a toxin; Or GLP-1 (Glucagon like peptide-1) receptor agonists; Glucagon receptor agonists; Gastric inhibitory polypeptide (GIP) receptor agonists; Fibroblast growth factor receptor agonists; Cholecystokinin receptor agonists; Gastrin receptor agonists; Melanocortin receptor agonists; Human growth hormone; Growth hormone releasing hormone; Growth hormone releasing peptide; Interferon; Interferon receptors; Colony stimulator (granulocyte colony stimulator); Interleukin; Interleukin receptors; enzyme; Interleukin binding proteins; Cytokine binding proteins; Macrophage activators; Macrophage peptides; B cell factor; T cell factor; Protein A; Allergic inhibitors; Cell necrosis glycoprotein; Immunotoxins; Lymphotoxin; Tumor necrosis factor; Tumor suppressor; Metastatic growth factor; Alpha
  • the toxin is selected from the group consisting of maytansine or derivatives thereof, auristatin or derivatives thereof, duocarmycin or derivatives thereof, and pyrrolobenzodiazepine or derivatives thereof,
  • Glucagon like peptide-1 (GLP-1) receptor agonists are selected from the group consisting of native exendin-3 or native exendin-4, and analogs thereof,
  • FGF receptor agonists are selected from the group consisting of FGF1 or analogs thereof, FGF19 or analogs thereof, FGF21 or analogs thereof, and FGF23 or analogs thereof,
  • Interferon is selected from the group consisting of interferon-alpha, interferon-beta and interferon-gamma,
  • the interferon receptor is selected from the group consisting of interferon-alpha receptors, interferon-beta receptors, interferon-gamma receptors, and water soluble type I interferon receptors,
  • Interleukins include interleukin-1, interleukin-2, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-5, interleukin-6, interleukin-7, interleukin-8, interleukin-9, interleukin-10, interleukin-11, interleukin-12, Interleukin-13, interleukin-14, interleukin-15, interleukin-16, interleukin-17, interleukin-18, interleukin-19, interleukin-20, interleukin-21, interleukin-22, interleukin-23, interleukin-24, interleukin- 25, interleukin-26, interleukin-27, interleukin-28, interleukin-29, and interleukin-30,
  • Interleukin receptors are interleukin-1 receptors or interleukin-4 receptors,
  • Enzymes include beta-glucosidase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, iduronidase, and iduronate 2-sulfatase ( iduronate-2-sulfatase, galactose-6-sulfatase, acid alpha-glucosidase, acid ceramidase, acid sphingomyelinase sphingomyelinsase, galactocerebrosidsase, arylsulfatase A, arylsulfatase B, beta-hexosaminidase A, beta-hexosaminidase B, heparin-N -Heparin N-sulfatase, alpha-D-mannosidase, beta-glucuronidase, N-acetylgalactosamine-6-sulfatase ( N-acetylgalactosamine
  • the interleukin binding protein is IL-18bp
  • Cytokine binding protein is TNF (Tumor necrosis factor) binding protein
  • Nerve growth factor nerve growth factor, ciliary neurotrophic factor, axogenesis factor-1, brain-natriuretic peptide, glial derived neurotrophic factor factor, netrin, neutrophil inhibitor factor, neurotrophic factor, and neuturin,
  • Myostatin receptor is selected from the group consisting of TNFR (P75), TNFR (P55), IL-1 receptor, VEGF receptor, and B cell activator receptor,
  • Myostatin receptor antagonists are IL1-Ra,
  • Cell surface antigens are selected from the group consisting of CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45 and CD69,
  • the antibody fragments are characterized in that they are selected from the group consisting of scFv, Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fd.
  • the GLP-1 receptor agonist is exendin-4 with the N-terminal amine groups of native exendin-4 and native exendin-4 removed.
  • Exendin-4 in which the N-terminal amine group of the native exendin-4 is substituted with a hydroxyl group, exendin-4 in which the N-terminal amine group of the native type exendin-4 is modified with a dimethyl group, Exendin-4, in which the N-terminal amine group of din-4 is substituted with a carboxyl group, exendin-4 from which the alpha carbon of the first amino acid (histidine) of native exendin-4 is removed; And exendin-4 in which the twelfth amino acid (lysine) of exendin-4 is substituted with serine and exendin-4 in which the twelfth amino acid (lysine) of exendin-4 is substituted with arginine. It is characterized by.
  • L 1 is connected to the N-terminus or C-terminus of X
  • L 2 is characterized in that it is connected to the N-terminus or C-terminus region of Y.
  • L 1 is connected to the N-terminus or C-terminus of X
  • L 2 is connected to the N-terminus region of Y.
  • FL 2 -Y of Formula 1 is a brain target long-acting conjugate, which is a structure represented by the following formula (2):
  • F a and F b are each a single strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region, thereby binding the Fc fragment.
  • F a is covalently linked to L 1 ,
  • Each BTP a1 ,..., BTP an is the same or different brain target peptide
  • Each BTP b1 ,..., BTP bn ' is the same or different brain target peptide
  • Each L 2a1 ,..., L 2an is the same or different peptidic linker
  • each L 2b1 ,..., L 2bn ' is the same or different peptidic linker
  • n and n ' are each independently a natural number.
  • each L 2a1 ,..., L 2an is the same or different peptide linkers
  • each L 2b1 ,..., L 2bn ' Are the same or different peptide linkers, wherein n and n 'are each independently a natural number.
  • L 1 is linked to the N-terminus of F a
  • L 2a1 and L 2b1 are linked to the C-terminus of F a and F b , respectively It is done.
  • XL 1 -FL 2 -Y of Formula 1 is characterized in that the structure represented by the following formula (3):
  • X is a bioactive substance
  • L 1a and L 1b are each independently a peptidic linker or a nonpeptidic linker
  • F a and F b are each a single strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region, thereby binding the Fc fragment.
  • F a and F b are covalently linked to L 1a and L 1b , respectively,
  • Each BTP a1 ,..., BTP an is the same or different brain target peptide
  • Each BTP b1 ,..., BTP bn ' is the same or different brain target peptide
  • Each L 2a1 ,..., L 2an is independently a peptidic or non- peptidyl linker
  • Each L 2b1 ,..., L 2bn ' is each independently a peptidic or non-peptidyl linker
  • n and n ' are each independently a natural number.
  • Each L 2a1 ,..., L 2an is the same or different peptidic linker
  • Each L 2b1 ,..., L 2bn ' is the same or different peptidic linker
  • n and n ' are each independently characterized as a natural number.
  • XL 1 -FL 2 -Y of Formula 1 is characterized in that the structure represented by the formula (4):
  • X is a bioactive substance
  • L 1 is a peptidic linker or non-peptidyl linker
  • F a and F b are each a single strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region, thereby binding the Fc fragment.
  • F a is covalently linked to L 1 ,
  • Each BTP a1 ,..., BTP an is the same or different brain target peptide
  • Each BTP b1 ,..., BTP bn ' is the same or different brain target peptide
  • Each L 2a1 ,..., L 2an is independently a peptidic or non- peptidyl linker
  • Each L 2b1 ,..., L 2bn ' is each independently a peptidic or non-peptidyl linker
  • n and n ' are each independently a natural number.
  • Each L 2a1 ,..., L 2an is the same or different peptidic linker
  • Each L 2b1 ,..., L 2bn ' is the same or different peptidic linker
  • n and n ' are each independently characterized as a natural number.
  • L 1 is connected to the N-terminus of F a
  • L 2a1 and L 2b1 are connected to the C-terminus of F a and F b , respectively.
  • F is F a and F b
  • L 2 -Y is (L 2a - Ya ) n and (L 2b - Yb ) n '
  • X is a bioactive substance
  • L 1 is a peptidic linker or non-peptidyl linker
  • F a and F b are immunoglobulin Fc regions comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, respectively, specifically F a and F b are one strand of polypeptide comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, respectively As a chain, F a and F b are linked together by disulfide bonds in the hinge region, whereby the conjugate comprises an Fc fragment, F a is covalently linked to L 1 ,
  • Y a and Y b are brain target peptides, each of the same or different types of brain target peptides,
  • L 2a and L 2b are each a peptidic linker, and L 2a and L 2b are the same kind or different kinds from each other.
  • n and n ' are each independently one or more natural numbers.
  • X is X a and X b
  • L 1 is L 1a and L 1b
  • F is F a and F b
  • L 2 -Y is (L 2a -Y a ) n and (L 2b -Y b ) n '
  • X is a bioactive material
  • L 1a and L 1b are each independently a peptidic linker or a nonpeptidic linker, specifically a peptidic linker,
  • the peptidic linker may comprise 0 to 1000 amino acids
  • F a and F b are each a single strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region, thereby binding the Fc fragment.
  • F a and F b are covalently linked to L 1a and L 1b , respectively,
  • Y a and Y b are brain target peptides, which are the same or different types
  • L 2a and L 2b are each a peptidic linker, and L 2a and L 2b are the same kind or different kinds from each other.
  • n and n ' are each independently one or more natural numbers.
  • each of the BTP a1, ⁇ , an BTP is a brain targeting peptide, such as one another
  • each of the BTP b1, ⁇ , BTP bn ' is L 2a1 ,..., L 2an are peptidic linkers
  • L 2b1 ,..., L 2bn ' are peptidic linkers.
  • each of the BTP a1, ⁇ , each other, and the other is an BTP brain targeting peptide
  • each BTP b1, ⁇ , BTP bn ' is an BTP brain targeting peptide
  • each BTP b1, ⁇ , BTP bn ' is an BTP brain targeting peptide
  • each L 2a1 ,..., L 2an is a peptidic linker
  • each L 2b1 ,..., L 2bn ' is a peptidic linker.
  • a binder according to any one of the preceding embodiments, wherein n n ', and L 2a1 ⁇ L 2b1 ,..., L 2an ⁇ L 2bn ' , and / or BTP a1 ⁇ BTP b1 , ⁇ , BTP an ⁇ BTP bn ' is satisfied.
  • each of the BTP a1, ⁇ , an BTP is a brain targeting peptide, such as one another
  • each of the BTP b1, ⁇ , BTP bn ' is L 2a1 ,..., L 2an are peptidic linkers
  • L 2b1 ,..., L 2bn ' are peptidic linkers.
  • each of the BTP a1, ⁇ , each other, and the other is an BTP brain targeting peptide
  • each BTP b1, ⁇ , BTP bn ' is an BTP brain targeting peptide
  • each BTP b1, ⁇ , BTP bn ' is an BTP brain targeting peptide
  • each L 2a1 ,..., L 2an is a peptidic linker
  • each L 2b1 ,..., L 2bn ' is a peptidic linker.
  • n and n ' are each independently 1 to 5, that is, characterized in that 1, 2, 3, 4, or 5.
  • the L 1 is characterized in that connected to the amine group or thiol group of X.
  • L 1 , L 1a , or L 1b is an N-terminal amine group of X, an amine group located in the side chain of lysine, or a -SH group located in the side chain of cysteine (thiol group). It is characterized in that connected to).
  • the brain target peptide is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, It comprises a amino acid sequence selected from the group consisting of 38, 40, and 85.
  • the bioactive substance X is characterized in that a polypeptide consisting of 2 to 1000 amino acids.
  • L 1 , L 1a , or L 1b is characterized in that the non-peptidyl linker of 0.5 to 100 kDa size.
  • the non-peptidyl linker is characterized in that polyethylene glycol.
  • L 1 , L 1a , or L 1b is characterized in that it is a peptidic linker comprising 0 to 1000 amino acids.
  • L 2 is a peptidic linker
  • the peptidic linker is (GS) m, (GGS) m, (GGGS) m, or (GGGGS) m, wherein m is 1 to 10.
  • the L 2 is a peptidic linker, and (GS) m, (GGS) m, (GGGS) m, or (GGGGS) m, m is 1 To 10 is characterized in that.
  • the brain target long-acting conjugate according to any one of the preceding embodiments is a fusion protein fused at the gene level, wherein L 1a and L 1b are respectively expressed in the C-terminal region of X and the N-terminal region of F a and F b .
  • L 2a and L 2b are linked to the C-terminal regions of F a and F b , respectively.
  • the L 1 and L 2 are peptidic linkers, (GS) m, (GGS) m, (GGGS) m, or (GGGGS) m, m is from 1 to 10, characterized in that the brain target long-acting conjugate is in the form of a fusion protein.
  • the bioactive substance is a therapeutic enzyme
  • the conjugate is in the form of a fusion protein
  • the fusion protein is more stable than the therapeutic enzyme to which the Fc region is not fused. Is increased, and the binding force to the lysosomal receptor is reduced.
  • one of L 1 and L 2 is characterized in that the peptidic linker, the other is a non-peptidyl linker.
  • both L 1 and L 2 are characterized in that the peptidic linker.
  • L 1 is a non-peptidic linker or a peptidic linker
  • L 2 is a peptidic linker
  • the peptidic linker comprises 0 to 1000 amino acids.
  • the brain-target long-acting conjugate of Formula 1 may have one end of L 1 at a lysine residue or a cysteine residue at X, and the other end of L 1 at the N-terminal of F. And N-terminus of Y and C-terminus of F are linked by L 2 .
  • non-peptidyl linker is polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinylethyl It is characterized in that it is selected from the group consisting of ethers, biodegradable polymers, lipid polymers, chitin, hyaluronic acid, fatty acids, polymer polymers, low molecular weight compounds, nucleotides and combinations thereof.
  • L 1 and L 2 of Formula 1 are peptidic linkers, X and F, or F and Y are covalent chemistry It is characterized by being bound to each other by L 1 and L 2 by a bond, a non-covalent chemical bond or a combination thereof, wherein L 1 and L 2 comprise 0 to 1000 amino acids.
  • the peptidic linker is 0 amino acids, it is characterized by being bound by a peptide bond which is a covalent chemical bond.
  • L 1 and L 2 of Formula 1 are peptidic linkers
  • L 1 and L 2 are composed of 0 amino acids.
  • X and F, or F and Y are bound by peptide bonds;
  • X and F, and F and Y are bound by peptide bonds.
  • any one of L 1 and L 2 of Formula 1 is a peptidic linker, the other of which is a non-peptidyl linker
  • the peptidic linker is It is a linker containing 0 to 1000 amino acids
  • the non-peptidyl linker is a brain-targeted sustained conjugate, which is polyethylene glycol.
  • F of Formula 1 is characterized in that it comprises an immunoglobulin Fc region.
  • the immunoglobulin Fc region comprises 1 to 4 domains selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 domains.
  • the immunoglobulin Fc region further comprises a hinge region.
  • immunoglobulin Fc region is derived from IgG, IgA, IgD, IgE or IgM.
  • the immunoglobulin Fc region is characterized in that the Fc region of IgG.
  • the immunoglobulin Fc region is characterized in that the immunoglobulin constant region is derived from IgG1 or IgG4.
  • the immunoglobulin Fc region is characterized in that the IgG4 Fc region.
  • the immunoglobulin Fc region is characterized in that the nonglycosylated IgG4 Fc region of the human sequence.
  • each domain of the immunoglobulin Fc region is a hybrid of domains with different origins derived from immunoglobulins selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE, IgM It features.
  • the immunoglobulin Fc region is a dimer or multimer consisting of short-chain immunoglobulins consisting of domains of the same origin.
  • the immunoglobulin Fc region comprises a sequence of a native immunoglobulin Fc region or is characterized in that it comprises a mutated sequence thereof.
  • the immunoglobulin Fc region is selected from the group consisting of substitution, addition, deletion, modification and at least one amino acid in a native immunoglobulin Fc region. It is characterized in that the deformation selected from the group consisting of a combination thereof can occur.
  • the immunoglobulin Fc region is characterized in that chain exchange function may not occur.
  • the F is characterized in that a dimeric form in which two strands of a polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain are connected to each other by disulfide bonds.
  • the hinge region constituting the immunoglobulin Fc region comprises or consists essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or is the amino acid of SEQ ID NO: 14
  • the second amino acid serine (Ser, S) in the sequence is characterized in that the proline (Pro, P) is mutated.
  • the CH2 domain constituting the immunoglobulin Fc region comprises or consists essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, or is the amino acid of SEQ ID NO: 15 Asparagine (Asn, N), the 67th amino acid in the sequence, is characterized in that it is mutated to glutamine (Gln, Q).
  • F is in the form of a dimer in which two strands of a polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain derived from IgG are disulfide bonds with each other, wherein the hinge region
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or a sequence in which the second amino acid serine (Ser, S) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 is changed to proline (Pro, P) and / or the CH2 domain is a sequence
  • An amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or a sequence in which asparagine (Asn, N), the 67th amino acid in amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, is mutated to glutamine (Gln, Q) and / or the CH3 domain is It is characterized by including the amino acid sequence.
  • conjugate according to any one of the preceding embodiments wherein the strand of polypeptide chain comprising the immunoglobulin constant region constituting said F is substituted with proline for the second amino acid in SEQ ID NO: 105;
  • the 71st amino acid is substituted with glutamine;
  • the second amino acid is substituted with proline, and the 71st amino acid is substituted with glutamine.
  • the stranded polypeptide chain comprising the immunoglobulin constant region constituting said F is characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID 106.
  • conjugate according to any one of the preceding embodiments, wherein the conjugate has two immunoglobulin Fc regions (dimeric form Fc regions bound by the monomeric Fc region) and the bioactive material that binds to each of the one immunoglobulin region ( Only to the monomeric Fc region) or to both immunoglobulin regions (each of the dimeric form of the Fc region).
  • the chemical bond between the two immunoglobulin constant region chains may be a covalent bond, more specifically a disulfide bond, even more specifically the hinge of two immunoglobulin Fc regions It is characterized in that the disulfide bond formed in the region.
  • a first immunoglobulin Fc region wherein the brain target peptide is linked to the C-terminal region of an immunoglobulin Fc region of one molecule via a peptidic linker (eg, peptide bond) as described above, and (ii) the peptidicity described above
  • the second immunoglobulin Fc region wherein the brain target peptide is linked to the C-terminal region of one molecule of the immunoglobulin Fc region via a linker (eg, peptide binding), forms a dimer via chemical bonds,
  • One molecule of the immunoglobulin Fc region is connected to the N-terminal region of one molecule, or one bioactive substance is connected to each of the N-terminal regions of both molecules.
  • conjugate according to any one of the preceding embodiments, wherein the conjugate is in the form of a fusion protein in which the first immunoglobulin Fc region and the second immunoglobulin Fc region are described above, wherein the immunoglobulin Fc region is in- It may be a frame fused, the immunoglobulin Fc region is characterized in that the form comprising a hinge region, CH2 domain, and CH3 domain.
  • the chemical bond between the first immunoglobulin Fc region and the second immunoglobulin Fc region in the conjugate may be specifically covalent, more specifically disulfide, More specifically, it is characterized by a disulfide bond formed in the hinge region of two immunoglobulin Fc regions.
  • Another embodiment embodying the present invention is a polynucleotide encoding the brain target sustained conjugate, an expression vector comprising the same, and a host cell comprising the polynucleotide or expression vector.
  • the polynucleotide is a polynucleotide encoding a brain target sustained conjugate, which is in the form of a fusion protein consisting of an amino acid sequence.
  • Another embodiment embodying the present invention is a composition comprising said brain target sustained conjugate.
  • the composition is characterized in that the pharmaceutical composition.
  • Another embodiment embodying the present invention is the use of said brain target sustained conjugate in the manufacture of a medicament.
  • Another embodiment embodying the present invention is a method of making the brain target sustained conjugate.
  • the preparation method is
  • the preparation method is
  • the preparation method is
  • the preparation method is
  • the non-peptidyl polymer is physiologically active through the terminal by reacting any reactive functional group of L 1 , a non-peptidyl polymer having the same or different reactive functional groups at both ends, with X being a free bioactive substance. Obtaining XL 1 , a linker covalently linked to the material; And
  • step (b) is characterized in that for connecting the reactive functional group of the unreacted end of the linker to Fa of the formula (2):
  • F a and F b are each a single strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region, thereby binding the Fc fragment.
  • F a is covalently linked to L 1 ,
  • Each BTP a1 ,..., BTP an is the same or different brain target peptide
  • Each BTP b1 ,..., BTP bn ' is the same or different brain target peptide
  • Each L 2a1 ,..., L 2an is independently a peptidic or non- peptidyl linker
  • Each L 2b1 ,..., L 2bn ' is each independently a peptidic or non-peptidyl linker
  • n and n ' are each independently a natural number.
  • the reactive functional group is selected from the group consisting of aldehyde group, maleimide group and succinimide derivative.
  • the aldehyde group is characterized in that the propionaldehyde group or butylaldehyde group.
  • the succinimide derivative is succinimidyl carboxymethyl, succinimidyl valerate, succinimidyl methylbutanoate, succinimidyl methylpropionate, succinimidyl butanoate, succinate Imidyl propionate, N-hydroxysuccinimide or succinimidyl carbonate.
  • the reactive functional groups at both ends are characterized in that the aldehyde group.
  • the non-peptidyl polymer is characterized in that each of the terminal has an aldehyde group and maleimide group as a reactive functional group.
  • the non-peptidyl polymer is characterized in that each of the terminal has an aldehyde group and succinimide group as a reactive functional group.
  • the preparation method is X-L 1a of Formula 3 - F a - (L 2a1 -BTP a1) - whil - an expression cassette encoding the X and - (BTP an L 2an) - L 1b Culturing a host cell comprising an expression cassette encoding F b- (L 2b1 -BTP b1 ) —... — (L 2bn ' -BTP bn ' ); And obtaining a conjugate of Formula 3 from the cultured host cell or its culture:
  • X is a bioactive substance
  • L 1a and L 1b are peptidic linkers
  • F a and F b are each a single strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region, thereby binding the Fc fragment.
  • F a and F b are covalently linked to L 1a and L 1b , respectively,
  • Each BTP a1 ,..., BTP an is the same or different brain target peptide
  • Each BTP b1 ,..., BTP bn ' is the same or different brain target peptide
  • Each L 2a1 ,..., L 2an is a peptidic linker
  • Each L 2b1 ,..., L 2bn ' is a peptidic linker
  • n and n ' are each independently a natural number.
  • the conjugate is X-L 1a - F a - (L 2a1 -BTP a1) - whil - (L 2an - BTP an) and X - L 1b -F b- (L 2b1 -BTP b1 )-...-(L 2bn ' -BTP bn' ) is expressed in the form of a fusion protein and a bond between F a and F b is formed in the refolding process It is characterized by forming a conjugate.
  • Another embodiment embodying the present invention is a novel brain target peptide.
  • the brain target peptide is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, and It comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of 85, or characterized in that consisting essentially of.
  • Another aspect for implementing the present invention is an isolated polynucleotide encoding the brain target peptide, a recombinant expression vector comprising the same, a host cell comprising the polynucleotide or the recombinant expression vector, and a kit comprising one or more thereof to be.
  • the brain target sustained conjugate comprising the brain target peptide and the bioactive substance of the present invention has the effect of crossing the cerebrovascular barrier, maintaining physiological activity, and significantly increasing blood half-life in vivo.
  • the brain target sustained conjugate is also improved in stability, it can be used as a therapeutic agent for brain-related diseases.
  • a novel brain target peptide may be provided to prepare a novel brain target sustained conjugate, which may be used as a therapeutic agent for brain related diseases.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of transcytosis experiments to confirm the degree of passage of the blood brain barrier of the brain target peptides (blood brain barrier).
  • Figure 2 is a diagram showing the results confirmed by performing a brain distribution experiment in the brain vascular barrier passage of the brain target peptides in the mouse.
  • Figure 3 is a diagram confirming the degree of cerebral vascular barrier passage of the brain target peptides to which the immunoglobulin Fc region is bound and the immunoglobulin Fc region alone.
  • Figure 4 is a diagram showing the results of the extracellular passage experiment for confirming the degree of passage of the cerebrovascular barrier of the brain target sustained conjugate containing a GIP derivative which is a bioactive substance.
  • FIG. 5 is a diagram confirming whether or not to maintain the biological activity of the bioactive substance bisulfurase in the brain target sustained conjugate containing the bioactive substance bisulfurase.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating brain distribution of a fusion protein to which an immunoglobulin Fc region and a brain target peptide are linked.
  • Figure 7 shows the results of SDS-PAGE confirmation of the recombinant protein iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP22.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of in vitro enzyme activity of the iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP22 fusion protein and the iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP28 conjugate.
  • FIG. 10 is a diagram confirming the brain tissue distribution of the iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP22 fusion protein.
  • 11 is an experimental result confirming the in vivo efficacy of the iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP22 fusion protein and the iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP28 conjugate.
  • amino acids referred to herein as abbreviations are described according to the IUPAC-IUB nomenclature.
  • One aspect of embodying the present invention provides a brain target sustained conjugate comprising a brain target peptide and a bioactive substance.
  • the brain target sustained conjugate may be a brain target peptide and a bioactive substance linked by a peptidic linker and / or a non-peptidyl linker, respectively, based on an immunoglobulin Fc region, but is not limited thereto. Do not.
  • the brain target sustained conjugate of the present invention is characterized in that the brain target peptide is linked to an immunoglobulin Fc region that is not a physiologically active substance by a peptidic linker (including direct fusion through peptide bonds) or a non-peptidyl linker.
  • X is a bioactive substance
  • Y is a brain target peptide
  • L 1 and L 2 are peptidic or nonpeptidic linkers
  • the peptidic linker comprises 0 to 1000 amino acids
  • F is an immunoglobulin constant region comprising an FcRn binding site.
  • Such a continuous conjugate form of the present invention is characterized in that the brain target peptide and the bioactive material is bound around the Fc region.
  • the brain target peptide that binds to the immunoglobulin Fc region may be bound to the immunoglobulin Fc region by a peptidic linker, and the physiologically active substance may be bound to a non-peptidyl linker, or to the brain target peptide. Both physiologically active substances may be characterized by binding to an immunoglobulin Fc region with a peptidic linker, but are not particularly limited thereto.
  • Both types of brain target peptides and bioactive substances may bind with peptidic linkers and / or non-peptidyl linkers, but are not limited thereto.
  • the peptidic linker may be a linker comprising 0 to 1000 amino acids, but peptidic linkers capable of forming the conjugates of the present invention are included without limitation. If the peptidic linker comprises 0 amino acids, it may be a linkage in the form of a peptide bond.
  • FL 2 -Y of Formula 1 of the brain target sustained conjugate may be a brain target sustained conjugate, which is a structure represented by the following Formula 2:
  • F a and F b are each a strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region to comprise an Fc fragment, F a Is covalently linked to L 1 ,
  • Each BTP a1 ,..., BTP an is the same or different brain target peptide
  • Each BTP b1 ,..., BTP bn ' is the same or different brain target peptide
  • Each L 2a1 ,..., L 2an is independently a peptidic or non- peptidyl linker
  • Each L 2b1 ,..., L 2bn ' is each independently a peptidic or non-peptidyl linker
  • n and n ' are each independently a natural number.
  • each L 2a1 ,..., L 2an is the same or different peptide linkers
  • each L 2b1 ,..., L 2bn ' is the same as each other.
  • L 1 may be linked to the N-terminus of F a
  • L 2a1 and L 2b1 may be linked to the C-terminus of F a and F b , respectively.
  • XL 1 -FL 2 -Y of Formula 1 may be a structure represented by the following formula (3). That is, the conjugate may be represented by the following Formula 3:
  • X is a bioactive substance
  • L 1a and L 1b are each independently a peptidic linker or a nonpeptidic linker
  • F a and F b are each a single strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region, thereby binding the Fc fragment.
  • F a and F b are covalently linked to L 1a and L 1b , respectively,
  • Each BTP a1 ,..., BTP an is the same or different brain target peptide
  • Each BTP b1 ,..., BTP bn ' is the same or different brain target peptide
  • Each L 2a1 ,..., L 2an is independently a peptidic or non- peptidyl linker
  • Each L 2b1 ,..., L 2bn ' is each independently a peptidic or non-peptidyl linker
  • n and n ' are each independently a natural number.
  • each L 2a1 ,..., L 2an are the same or different peptide linkers, and each L 2b1 ,..., L 2bn ' is the same as each other. Or other peptidic linker, wherein n and n 'are each independently a natural number.
  • each L is a peptidic linker, and the conjugate represented by Formula 3 may be in the form of a fusion protein, but is not particularly limited thereto.
  • L 1a and L 1b in Formula 3 are each connected to the N-terminus of F a and F b
  • / or L 2a1 and L 2b1 are each connected to the C-terminus of F a and F b
  • L 1a and L 1b may each be linked to the C-terminus of X- and / or L 2a1 and L 2b1 may be linked to the N-terminus of a brain target peptide (BTP) linked thereto, but specifically It is not limited.
  • BTP brain target peptide
  • XL 1 -FL 2 -Y of Formula 1 may be a structure represented by the following formula (4):
  • X is a bioactive substance
  • L 1 is a peptidic linker or non-peptidyl linker
  • F a and F b are each a single strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region, thereby binding the Fc fragment.
  • F a is covalently linked to L 1 ,
  • Each BTP a1 ,..., BTP an is the same or different brain target peptide
  • Each BTP b1 ,..., BTP bn ' is the same or different brain target peptide
  • Each L 2a1 ,..., L 2an is independently a peptidic or non- peptidyl linker
  • Each L 2b1 ,..., L 2bn ' is each independently a peptidic or non-peptidyl linker
  • n and n ' are each independently a natural number.
  • each L 2a1 ,..., L 2an are the same or different peptide linkers, and each L 2b1 ,..., L 2bn ' is the same as each other. Or other peptidic linkers, wherein n and n 'are each independently natural numbers, but are not particularly limited thereto.
  • L 1 is connected to the N-terminus of F a
  • / or L 2a1 and L 2b1 are respectively connected to the C-terminus of F a and F b
  • / or L 1 is N- of X And / or L 2a1 and L 2b1 may be linked to the N-terminus of the brain target peptide (BTP) linked thereto, respectively, but is not particularly limited thereto.
  • n n '
  • L 2a1 L 2b1
  • L 2an L 2bn '
  • n and n ' are each independently two or more natural numbers, two or more brain target peptides of the same or different type may be linked, and the two or more brain target peptides may be connected by tandem. It may be, but is not limited thereto.
  • n and n ' may be a natural number of 1 or 2 or more, n and n' may be the same natural number or different natural numbers, but is not limited thereto.
  • n and n ' may be 1 to 10, or 1 to 5, for example, may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, respectively, but the brain target persistence of the present invention
  • F is F a and F b
  • L 2 -Y is (L 2a - Ya ) n and (L 2b - Yb ) n '
  • the combination may be represented by Formula 5 below:
  • X is a bioactive substance
  • L 1 is a peptidic linker or non-peptidyl linker, specifically a non-peptidyl linker,
  • F a and F b are each a single strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region, thereby binding the Fc fragment.
  • F a is covalently linked to L 1 ,
  • Y a and Y b are brain target peptides, which are the same or different types
  • L 2a and L 2b are each a peptidic linker, and L 2a and L 2b are the same kind or different kinds from each other.
  • n and n ' are each independently one or more natural numbers.
  • n and n ' are each independently two or more natural numbers, two or more brain target peptides of the same or different type may be linked, and the two or more brain target peptides may be connected by tandem. It may be, but is not limited thereto.
  • n and n ' may be a natural number of 1 or 2 or more, n and n' may be the same natural number or different natural numbers, but is not limited thereto. n and n 'may be 1 to 10, or 1 to 5, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, but is not particularly limited thereto. .
  • the brain target sustained conjugate may be one in which the N-terminal region of X and the N-terminal region of F are linked by L 1 , and the N-terminal region of Y and C-terminal region of F may be linked by L 2 .
  • the brain target long-acting conjugate is that one end of L 1 is connected to the lysine residue or cysteine residue of X, and the other end of L 1 is connected to the N-terminal region of F, and L 2 is the N-terminal region of Y.
  • the C-terminal region of F may be linked to each other.
  • L 1 of the brain target persisted conjugate is coupled to the N- terminal region of the F
  • L 2 may be linked to the C- terminal region of the F
  • the L 1 will attached to the N- terminal domain of a F
  • L 2a and L 2b may be linked to the C-terminal regions of F a and F b , respectively.
  • the L 1 may be linked to an amine group or a thiol group of X
  • L 1 is connected to an N-terminal amine group of X, an amine group located in the side chain of lysine, or a -SH group (thiol group) located in the side chain of cysteine. It may be, but is not limited thereto.
  • N-terminal region refers to the amino terminus of a peptide or protein, and refers to a position capable of binding to a linker, including a non-peptidyl linker, for the purposes of the present invention.
  • linker including a non-peptidyl linker
  • examples include, but are not limited to, the amino acid residues around the N-terminus as well as the last amino acid residue in the N-terminal region, specifically including the first to twenty amino acid residues from the last. can do. However, it is not particularly limited thereto.
  • C-terminal region refers to the carboxyl terminus of a peptide or protein and refers to a position capable of binding to a linker, including a non-peptidyl linker, for the purposes of the present invention.
  • linker including a non-peptidyl linker
  • it may include not only the last amino acid residue of the C-terminal region but also all of the amino acid residues around the C-terminal region, specifically, the first to the 20th amino acid residue from the last. It may include. However, it is not particularly limited thereto.
  • X is X a and X b
  • L 1 is L 1a and L 1b
  • F is F a and F b
  • L 2 -Y is (L 2a -Y a ) n and (L 2b- Y b ) n '
  • the binder may be represented by the following Chemical Formula 6:
  • X is a bioactive material
  • L 1a and L 1b are each independently a peptidic linker or a nonpeptidic linker, specifically a peptidic linker,
  • the peptidic linker may comprise 0 to 1000 amino acids
  • F a and F b are each a single strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region, thereby binding the Fc fragment.
  • F a and F b are covalently linked to L 1a and L 1b , respectively,
  • Y a and Y b are brain target peptides, which are the same or different types
  • L 2a and L 2b are each a peptidic linker, and L 2a and L 2b are the same kind or different kinds from each other.
  • n and n ' are each independently one or more natural numbers.
  • n and n ' may be 1 to 5, that is, 1, 2, 3, 4, or 5, but are not particularly limited thereto.
  • n may be n ', but is not limited thereto.
  • L 1 , L 1a , or L 1b may be linked to an N-terminal amine group of X, an amine group located in the side chain of lysine, or a -SH group (thiol group) located in the side chain of cysteine, but specifically It is not limited.
  • the conditions of ⁇ BTP bn ' and a ⁇ b may be satisfied, wherein each of BTP a1 ,..., BTP an are the same brain target peptides, and each of BTP b1 ,...
  • BTP bn ' are the same brain target peptides, and each L 2a1 ,..., L 2an is a peptidic linker, and each L 2b1 ,..., L 2bn ' is a peptidic linker.
  • BTP a1 ,..., BTP an are different brain target peptides, and each BTP b1 ,..., BTP bn ' are different brain target peptides, each L 2a1 L 2an is a peptidic linker, and each of L 2b1 ,..., L 2bn ' may be a peptidic linker, but is not limited thereto.
  • the brain target sustained conjugate is a fusion protein fused at the gene level, wherein L 1 is a C-terminal region of X, specifically L 1a and L 1b are linked to a C-terminal region of each X, and L 2a And L 2b may be linked to the C-terminal regions of F a and F b , respectively, but are not particularly limited thereto.
  • L 1 (L 1a and L 1b ) and L 2 (L 2a and L 2b ) are peptidic linkers.
  • (GS) m, (GGS) m, (GGGS) m, or (GGGGS) m, m may be 1 to 10, but is not particularly limited thereto.
  • brain target sustained conjugate includes a brain target peptide and a bioactive substance, wherein the brain target peptide and the bioactive substance are directly or indirectly connected to a substance including an immunoglobulin constant region and having an FcRn binding site, respectively. Refers to a conjugate having a structure.
  • "brain target sustained enzyme conjugate” may be used interchangeably with “brain target sustained conjugate” or “persistent conjugate”.
  • the sustained conjugate may be mixed with the "persistent conjugate", and the bioactive substance included in the sustained conjugate includes an immunoglobulin constant region, which may increase the active duration of the bioactive substance, and binds to an FcRn binding site. It refers to a material in combination with a biocompatible material having a peptide linker and / or non-peptidyl linker comprising 0 to 1000 amino acids.
  • the brain target sustained conjugate is capable of delivering a bioactive substance through brain cerebrovascular barrier to brain tissue, but is not particularly limited thereto.
  • the components constituting the brain target sustained conjugate are described in more detail as follows.
  • a "brain target peptide” includes a peptide, or protein, or antibody comprising an amino acid sequence capable of crossing the cerebrovascular barrier.
  • the brain target peptide corresponds to one moiety constituting the brain target sustained conjugate of the present invention.
  • the brain target peptide is a sequence separated from a known peptide, protein, or antibody, may have an activity that can cross the brain vascular barrier through the BBB.
  • amino acid refers to an amino acid moiety comprising any naturally-occurring or non-naturally occurring or synthetic amino acid residue, that is, one, two, three or more carbon atoms, Typically, it refers to any moiety comprising at least one carboxyl residue and at least one amino residue directly linked by one ( ⁇ ) carbon atom.
  • the brain target peptide of the present invention may be characterized by passing through the cerebrovascular barrier through a pathway by passive transport or through a receptor-mediated transport, but is not limited thereto.
  • Examples are peptides, proteins or antibodies that can cross the cerebral vascular barrier and are not particularly limited in type and size.
  • the brain target peptide may be through the cerebrovascular barrier through a pathway by receptor mediated delivery.
  • the brain target peptide may be to pass through the cerebrovascular barrier through a pathway by receptor mediated delivery.
  • the brain target peptides include insulin receptors; Transferrin receptor; Low density lipoprotein receptors; Low density lipoprotein receptor-related protein; Leptin receptor; Nicotinic acetylcholine receptor; Glutathione transporters; Calcium-activated potassium channel; And receptor for advanced glycation endproducts (RAGE); And a ligand of the receptors, and any one selected from the group consisting of an antibody that binds to the receptor or ligand, can pass through the cerebrovascular barrier by a receptor mediated delivery pathway, but is not particularly limited thereto.
  • peptides, proteins, antibodies that cross the cerebrovascular barrier through this pathway may be selected from the group consisting of peptides, proteins, antibodies that cross the cerebrovascular barrier through this pathway, or may be some peptide sequences isolated from the peptides, proteins, or antibodies, but is not limited thereto.
  • HAITYPRH peptide BTP1 peptide
  • THR peptide BTP2 peptide
  • Angiopep-2 peptide BTP3 peptide
  • ApoB peptide BTP4 peptide
  • sequence Peptides, such as ApoE peptide (BTP5 peptide) of the number 10 may be used, but the peptide included in the brain target sustained conjugate of the present invention, which can deliver the bound FL 2- Y structure through the BBB into the brain Included without limitation.
  • BTP6 peptide of SEQ ID NO: 20, BTP7 peptide of SEQ ID NO: 22, BTP8 peptide of SEQ ID NO: 24, BTP9 peptide of SEQ ID NO: 26, BTP10 peptide of SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 BTP11 peptide, SEQ ID NO: 32 BTP12 peptide, SEQ ID NO: 34 BTP13 peptide, SEQ ID NO: 36, BTP14 peptide of SEQ ID NO: 38, BTP15 peptide of SEQ ID NO: 38, BTP16 peptide of SEQ ID NO: 40, or SEQ ID NO: 85 May be, but is not limited to, BTP17 peptide.
  • the brain target peptide is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoe-2-aminoe-2-aminoe-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • Angiopep-2 TFFYGGSRGKRNNFKTEEY- OH (SEQ ID NO: 41),
  • Leptin 30 YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVL (SEQ ID NO: 47),
  • RVG29 YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG- OH (SEQ ID NO: 48)
  • MiniAp-4 [Dap] (&) KAPETALD (&) (SEQ ID NO .: 51),
  • G23 HLNILSTLWKYRC (SEQ ID NO: 52),
  • g7 GFtGFLS (O- ⁇ -Glc) -NH 2 (SEQ ID NO: 53),
  • TGN TGNYKALHPHNG (SEQ ID NO: 54),
  • PhPro may be (Phenylproline) 4 -NH 2 (SEQ ID NO: 57), but is not limited thereto.
  • & is J. Pept.
  • '&' refers to a connecting point.
  • the first '&' in a single chain refers to the position of one end of the chemical bond
  • the second '&' refers to the site to which the chemical bond is attached.
  • "& Ala-Ala-Phe-Leu-Pro &" indicates that a chemical bond is formed between alanine and proline to form a cyclic peptide.
  • symbols such as & 1 and & 2 can be used to indicate the location where the chemical bond is formed.
  • a chemical bond is formed between Asp and Met, and a chemical bond is formed between Asp and Dpr.
  • [Dap] stands for diaminopropionic acid (diaminopropionic acid).
  • the "physiologically active substance” may be a constituent that forms a moiety of the brain-targeted sustained conjugate, and is a concept that collectively refers to a substance having a certain physiological activity in vivo.
  • the bioactive substance X is 2 to 1000 amino acids, 2 to 950, 2 to 900, 2 to 850, 2 to 800, 2 to 750, 2 to 700, 5 to 700 amino acids, 5 to 650, 5 to 600, 5 to 550, 5 to 500, 5 to 450, 5 to 400, 5 to 350, 5 To 300, 5 to 250, 5 to 200, 5 to 150, 5 to 100, 5 to 90, 5 to 80, 5 to 70, 5 to 60 , 5 to 50, 5 to 40, 5 to 30, 5 to 25, or may be a polypeptide consisting of about 5 to 20, but is not limited thereto.
  • the polypeptides constituting the physiologically active substance include all peptides, oligopeptides, polypeptides or proteins.
  • the bioactive substance may be a toxin or a bioactive polypeptide, and is a cytokine, interleukin, interleukin binding protein, enzyme, antibody, growth factor, transcription regulator, blood factor, vaccine which is used for the purpose of treating or preventing human diseases.
  • cytokine interleukin
  • interleukin binding protein enzyme, antibody, growth factor, transcription regulator, blood factor, vaccine which is used for the purpose of treating or preventing human diseases.
  • Physiologically active peptides secreted by the small intestine and pancreas that have therapeutic effects on structural proteins, ligand proteins or receptors, cell surface antigens, receptor antagonists, diabetes and obesity, G protein-coupled receptors (GPCRs) agonists or antagonists
  • Active polypeptides, analogs thereof may be exemplified, but are not limited thereto.
  • analog of X is a substance capable of exhibiting the same kind of activity as X.
  • the agonist of X, derivatives of X, fragments of X, fragment of X include all variants and the like.
  • toxins maymaysine and / or derivatives thereof, auristatin and / or derivatives thereof, duocarmycin and / or derivatives thereof, pyrrolobenzodiazepine and / or its effective in killing cancer cells. Although it may be selected from derivatives, toxins which are effective in killing cancer cells are included without limitation.
  • the physiologically active polypeptides include GLP-1 receptor agonists, glucagon receptor agonists, Gastric inhibitory polypeptide (GIP) receptor agonists, Fibroblast growth factors (FGF) receptor agonists (FGF1, FGF19, FGF21, FGF23, etc.), Cholecystokinin receptor agonists, gastrin receptor agonists, melanocortin receptor agonists, human growth hormone, growth hormone-releasing hormone, growth hormone-releasing peptides, interferons and interferon receptors (e.g. interferon -Alpha, -beta and -gamma, soluble type I interferon receptors, etc., colony stimulating factors, interleukins (e.g.
  • interleukin-1 interleukin-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 , -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24,- 25, -26, -27, -28, -29, -30, etc.
  • interleukin receptors eg IL-1 receptor, IL-4 receptor, etc.
  • enzymes eg betaglucose
  • Beta-glucosidase alpha-galactosidase, beta-galactosidase, iduronidase, iduroonid 2-sulfatase
  • Galactose-6-sulfatase acid alpha-glucosidase, acid ceramidase, acid sphingomyelinsase, galactose Cerebrosidase, ary
  • Axogenesis factor-1 brain-natriuretic peptide, glial derived neurotrophic factor, netrin, neutrophil inhibitor factor ), Neurotrophic factor, neuturin, parathyroid hormone, relaxin, secretin, somatomedin, insulin-like growth factor, corticosteroid, glucagon, Cholecystokinin, pancreatic polypeptide, gastrin releasing peptide, corticotropin releasing factor, thyroid stimulating hormone, autotaxin, lactoferrin, myostatin, activity-dependent neuroprotective protein (ADNP), BACE1 (beta-) secretase1), APP (Amyloid Precursor Protein), NCAM (Neural cell adhesion molecule), Amyloid beta, Tau, receptor for advanced glycation endproducts, RAGE (alpha-synuclein), or Their agonists or antagonists, their receptors (e.g.
  • TNFR TNFR
  • P55 TNFR
  • IL-1 receptors VEGF receptors
  • B cell activator receptors B cell activator receptors, etc.
  • receptor antagonists e.g. IL1-Ra, etc.
  • Cell surface antigens e.g., CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69, etc.
  • monoclonal antibodies e.g., CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69, etc.
  • monoclonal antibodies e.g., CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69, etc.
  • monoclonal antibodies e.g., CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69, etc.
  • monoclonal antibodies e.g., CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a
  • iduronate-2-sulfatase is a sulfatase enzyme related to Hunter syndrome (MPS-II), and heparin sulfate and dermatan. It is an enzyme necessary for the lysosomal degradation of dermatan sulfate.
  • "idursulfase” which is a tablet form of human iduronate 2-sulfatase as “iduronate-2-sulfatase” can be used.
  • the bisulfurase may be, for example, bisulfurase alpha or bisulfur beta, but is not limited thereto.
  • the iduronate 2-sulfatase enzyme may be prepared or prepared by methods known in the art. Specifically, animal cells in which an animal cell expression vector is inserted may be cultured and purified from the culture, or commercially available. Available enzymes can be purchased and used, but are not limited thereto.
  • physiologically active polypeptides applicable in the present invention may be natural, or may be produced by genetic recombination in prokaryotic cells such as E. coli or yeast cells, yeast cells, insect cells or animal cells, and may also be active or equivalent to natural types. It may be an analog retaining homogeneous activity, such as but not limited to a derivative in which a mutation is made at one or more amino acid positions.
  • the GLP-1 receptor agonist is a native type exendin-4, an exendin-4 derivative from which an N-terminal amine group of exendin-4 is removed, and an N-terminal amine group of exendin-4 is a hydroxyl group.
  • the present invention provides a brain-targeted sustained conjugate, wherein the bioactive substance is bound to the immunoglobulin Fc region of the brain target peptide fused with the immunoglobulin Fc region.
  • F refers to a substance including an immunoglobulin constant region and including an FcRn binding site. Specifically, it corresponds to one moiety constituting the brain target sustained conjugate of the present invention.
  • the F may be an immunoglobulin Fc region containing an FcRn binding site.
  • immunoglobulin Fc regions are biodegradable polypeptides that are metabolized in vivo, they are safe for use as carriers of drugs.
  • the immunoglobulin Fc region is advantageous in terms of preparation, purification and yield of the conjugate because of its relatively low molecular weight compared to the whole immunoglobulin molecule, and also removes Fab portions showing high heterogeneity because the amino acid sequence varies from antibody to antibody, It is also expected that the homogeneity of the substance will be greatly increased and the likelihood of inducing blood antigens will be lowered.
  • the brain target peptide conjugate fused with an immunoglobulin Fc region used in the present invention is linked to the immunoglobulin Fc region with a peptide bond to produce a sustained conjugate in an expression host.
  • the expression host may be a microorganism, such as E. coli, which can produce a protein by transforming with an external gene, and there are no limitations such as yeast, insect cells, and animal cells.
  • the "immunoglobulin constant region” may be a constituent of a moiety of the brain target sustained conjugate, except for the heavy chain and the light chain variable region and the light chain constant region (CL1) of immunoglobulin. Constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) moieties. It may also include a hinge portion in the heavy chain constant region.
  • the immunoglobulin constant region may be an immunoglobulin Fc region.
  • the immunoglobulin constant region of F may include one to four domains selected from the group consisting of immunoglobulin CH1, CH2, CH3, and CH4 domains.
  • Immunoglobulin constant regions of the present invention are 1) CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain and CH4 domain, 2) CH1 domain and CH2 domain, 3) CH1 domain and CH3 domain, 4) CH2 domain and CH3 domain, 5) CH1 domain
  • a combination of one or two or more of the CH2 domain, the CH3 domain and the CH4 domain with an immunoglobulin hinge region (or a portion of the hinge region) (eg, a combination of the CH2 domain with the CH3 domain and the hinge region (or a portion thereof)) , 6) heavy chain constant region may be a dimer of each domain and light chain constant region.
  • the hinge region of the present invention includes not only the natural hinge region but also some of the known hinge regions.
  • the immunoglobulin constant region of F may include a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, but is not particularly limited thereto.
  • immunoglobulin Fc regions of the present invention include naturally occurring amino acid sequences as well as their sequence derivatives.
  • Amino acid sequence derivatives mean that one or more amino acid residues in a natural amino acid sequence have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • IgG Fc amino acid residues 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322 or 327 to 331 which are known to be important for binding can be used as suitable sites for modification.
  • various kinds of derivatives are possible, such as a site capable of forming disulfide bonds, a few amino acids at the N-terminus in the native Fc, or a methionine residue may be added at the N-terminus of the native Fc. Do.
  • complement binding sites such as C1q binding sites may be removed, or ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) sites may be removed to eliminate effector function.
  • ADCC antibody dependent cell mediated cytotoxicity
  • Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art (H. Neurode, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly.
  • it may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation and amidation. may be modified.
  • the immunoglobulin constant region derivatives described above may exhibit biological activity equivalent to that of the immunoglobulin constant region region of the present invention and may enhance structural stability against heat, pH, etc. of the immunoglobulin constant region.
  • the immunoglobulin Fc region may be one in which chain exchange function may not occur.
  • the F specifically, the immunoglobulin Fc region may be in the form of a dimer in which two strands of a polypeptide chain including a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain are connected to each other by disulfide bonds.
  • the hinge region constituting the immunoglobulin Fc region includes or consists essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or is the second amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, serine (Ser, S ) May be mutated to proline (Pro, P), but is not particularly limited thereto.
  • the CH2 domain constituting the immunoglobulin Fc region comprises or consists essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, or asparagine (Asn, N, the 67th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15). ) May be mutated to glutamine (Gln, Q), but is not particularly limited thereto.
  • the F is in the form of a dimer in which two strands of a polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain derived from IgG are disulfide bonds with each other, wherein the hinge region is represented by SEQ ID NO: 14
  • An amino acid sequence or a sequence in which the second amino acid serine (Ser, S) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 is mutated to proline (Pro, P) and / or the CH2 domain is an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15
  • the 67th amino acid asparagine (Asn, N) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 comprises a mutated glutamine (Gln, Q) and / or the CH3 domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 It may be, but is not particularly limited thereto.
  • one strand of the polypeptide chain comprising the immunoglobulin constant region constituting the F has a second amino acid substituted with proline in SEQ ID NO: 105;
  • the 71st amino acid is substituted with glutamine;
  • the second amino acid may be substituted with proline, and the 71st amino acid may be substituted with glutamine.
  • one strand of the polypeptide chain including the immunoglobulin constant region constituting the F may include the amino acid sequence of SEQ ID 106, but is not particularly limited thereto.
  • immunoglobulin constant regions may be obtained from natural forms isolated in vivo from animals such as humans, cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats or guinea pigs, or may be transformed animal cells or microorganisms. It may be a recombinant or derivative thereof obtained from.
  • the method of obtaining from the natural form may be a method of separating the whole immunoglobulin from a human or animal living body, and then processing the protease. Papain is cleaved into Fab and Fc and pepsin is cleaved into pF'c and F (ab) 2 . This may be separated by Fc or pF'c using size-exclusion chromatography and the like.
  • the human-derived Fc region is a recombinant immunoglobulin Fc region obtained from a microorganism.
  • the immunoglobulin constant region may be a natural sugar chain, an increased sugar chain compared to the natural form, a reduced sugar chain or a sugar chain removed from the natural form.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms can be used to increase or decrease such immunoglobulin Fc sugar chains.
  • the immunoglobulin Fc region in which the sugar chain is removed from the Fc is significantly reduced in binding strength with the complement (c1q), and antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity is reduced or eliminated, thereby not causing an unnecessary immune response in vivo. Do not.
  • a form more consistent with its original purpose as a carrier of the drug would be an immunoglobulin constant region wherein the sugar chains have been removed or unglycosylated.
  • “Deglycosylation” refers to an Fc region in which sugar is removed by an enzyme
  • aglycosylation refers to a non-glycosylated immunoglobulin constant region produced in a prokaryote, more specifically, in Escherichia coli. it means.
  • the immunoglobulin Fc region may be a human or animal origin, such as cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, preferably human origin.
  • the immunoglobulin Fc region may be an Fc region derived from IgG, IgA, IgD, IgE, IgM or combinations thereof or hybrids thereof.
  • it may be derived from IgG or IgM, which is most abundant in human blood, and may be derived from IgG known to enhance half-life of ligand binding proteins.
  • the combination (combination) means that, when forming a dimer or multimer, the polypeptide encoding the single-chain immunoglobulin Fc region of the same origin forms a bond with the single-chain polypeptide of different origin. That is, it is possible to prepare dimers or multimers from two or more fragments selected from the group consisting of Fc fragments of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc and IgE.
  • hybrid is a term used to mean that there is a sequence corresponding to two or more immunoglobulin Fc fragments of different origins within an immunoglobulin Fc region of a single chain.
  • various types of hybrids are possible. That is, hybridization of a domain consisting of 1 to 4 domains from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc and IgD Fc is possible, and may include a hinge.
  • IgG can also be divided into subclasses of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 and combinations or hybridization thereof are also possible in the present invention.
  • it may be an IgG2 and IgG4 subclass, and in a specific example, may be, but is not limited to, an Fc region of IgG4 having little effector function such as Complementdependent cytotoxicity (CDC).
  • the immunoglobulin Fc region is an IgG1 Fc region or an IgG4 Fc region, but is not limited thereto.
  • L 1 and / or L 2 ′′ refers to a linker that binds a brain target peptide or a bioactive substance to an immunoglobulin Fc region as one component of a moiety of the brain target sustained conjugate.
  • the linker is basically a linker.
  • the term "linker” refers to a linker that connects two fusion partners using covalent bonds, etc. In addition to linking the fusion partners, the linker plays a role of providing a certain sized gap between the fusion partners, or provides flexibility or rigidity. It may play a role in providing, but is not particularly limited thereto.
  • one of L 1 and L 2 of Formula 1 may be characterized in that the peptidic linker, the other is a non-peptidyl linker.
  • one of the L 1 and L 2 may be a peptidic linker, another may be a non-peptidyl linker, both L 1 and L 2 may be a peptidic linker, on the other hand the L 1 And both L 2 may be non-peptidyl linkers, but are not particularly limited thereto.
  • the non-peptidyl linker is polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, Polyoxyethylated polyols, polyvinyl alcohols, polysaccharides, dextran, polyvinyl ethyl ethers, biodegradable polymers, lipid polymers, chitin, hyaluronic acid, fatty acids, polymer polymers, low molecular compounds, nucleotides and combinations thereof It may be selected. However, this is not limitative.
  • the peptidic linker when L 1 is a non-peptidyl linker and L 2 is a peptidic linker, the peptidic linker may include 0 to 1000 amino acids. In another embodiment, L 1 is a non-peptidyl linker, and L 2 is a peptidic linker, and when F contains 0 amino acids, F and brain target peptide Y are directly fused (eg, peptide bonds). Can be formed.
  • L 1 and L 2 of Formula 1 when any one or both of the L 1 and L 2 of Formula 1 is a peptidic linker, X and F, or F and Y is a covalent chemical bond, a non-covalent chemical bond, or a combination thereof And are bonded to each other by L 1 and L 2 , and L 1 and L 2 include 0 to 1000 amino acids. If the peptidic linker is 0 amino acids, it may be bound by a peptide bond which is a covalent chemical bond.
  • L 1 and L 2 of Formula 1 when any one or both of L 1 and L 2 of Formula 1 is a peptidic linker, L 1 and L 2 is composed of 0 amino acids, (i) X and F, or F And Y are bound by peptide bonds; Or (ii) X and F, and F and Y may be bound by peptide bonds.
  • peptide linker includes a polymer of peptide bonds or amino acids connecting two fusion partners.
  • the peptidic linker may comprise 0 to 1000 amino acid sequences, more specifically 0 to 900, 0 to 800, 0 to 700, 0 to 600, 0 To 500, 0 to 400, 0 to 300, 0 to 250, 0 to 200, 0 to 150, 0 to 100, 0 to 90, 0 to 80 , 0 to 70, 0 to 60, 0 to 50, 0 to 40, 0 to 30, 0 to 25, 0 to 20, 0 to 15, Or 0 to 10 amino acid sequences, but is not particularly limited thereto.
  • examples of the peptidic linker include a GGGGS (SEQ ID NO: 58) motif, a GS motif, a GGGS (SEQ ID NO: 59) motif, or a GGSG (SEQ ID NO: 60) motif consisting of an amino acid sequence in a repeating form.
  • the motif may be repeated 1 to 10 times, but is not particularly limited thereto.
  • L2 is a peptidic linker
  • L2 is (GS) m, (GGS) m, (GGGS) m, or (GGGGS) m
  • m may be 1 to 10, but is not limited thereto.
  • any one of L 1 and L 2 of Formula 1 is a peptidic linker
  • the other is a non-peptidyl linker
  • the peptidic linker is a linker comprising 0 to 1000 amino acids
  • the non-peptidyl linker may be characterized as being polyethylene glycol. However, this is not limitative.
  • non-peptidyl linker refers to a biocompatible linker in which two or more repeating units are linked, and the repeating units are connected to each other through any covalent bonds, not peptide bonds.
  • the non-peptidyl linkers and X and Y are linked by respective reactors, wherein the reactors of the non-peptidyl linkers are aldehyde groups, maleimide groups and succinimide derivatives. ) May be selected.
  • L1 is a non-peptidyl polymer having both terminal functional groups, and both terminal functional groups are amine-reactive groups or thiol-reactive groups , and both terminal functional groups are the same kind or different. It may be of a kind, but is not limited thereto.
  • Non-peptide polymers which are non-peptidyl linkers usable in the present invention include polyethylene glycol, polypropylene glycol, copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, polyoxy ethylated polyols, polyvinyl alcohols, polysaccharides, dextran, polyvinyl ethyl ether , Biodegradable polymers such as PLA (polylactic acid) and PLGA (polylactic-glycolic acid), lipid polymers, chitins, hyaluronic acid, oligonucleotides and combinations thereof It may be selected from, for example, polyethylene glycol, but is not limited thereto. Derivatives thereof known in the art and derivatives which can be easily prepared at the technical level in the art are included in the scope of the present invention.
  • Non-peptidyl linkers that can be used in the present invention can be used without limitation as long as they are polymers resistant to proteolytic enzymes in vivo.
  • the molecular weight of the non-peptidyl polymer ranges from greater than zero to about 100 kDa, such as from about 0.5 to about 100 kDa, from about 1 to about 100 kDa, or from about 1 to about 20 kDa, but is not limited thereto.
  • the term "about” includes all of the values of ⁇ 0.5, ⁇ 0.4, ⁇ 0.3, ⁇ 0.2, ⁇ 0.1, and the like, and includes all values in the range equivalent to or similar to those following the term about, It is not limited.
  • non-peptidyl linker may be used not only one kind of polymer but also a combination of different kinds of polymers.
  • the non-peptidyl polymer which is a non-peptidyl linker used in the present invention before forming the conjugate so that the immunoglobulin Fc region and the bioactive material can form a covalent bond, the non-peptidyl linker is F and X or Y It can have a functional group that can be combined with a functional group of.
  • the non-peptidyl linker may have at least two terminal functional groups, specifically two or three terminal functional groups, and even more specifically two terminal functional groups.
  • the functional group may be selected from the group consisting of aldehyde group, maleimide group, and succinimide derivative, but is not limited thereto.
  • an aldehyde group may be exemplified as a propion aldehyde group or a butyl aldehyde group, but is not limited thereto.
  • succinimidyl valerate succinimidyl methylbutanoate
  • succinimidyl methylpropionate succinimidyl butanoate
  • succinimidyl propionate N-hydroxysuccini Mead
  • hydroxy succinimidyl succinimidyl carboxymethyl or succinimidyl carbonate
  • Both terminal functional groups of the non-peptidyl linker may be the same or different from each other.
  • one end may have a maleimide group and the other end may have an aldehyde group, such as a propion aldehyde group, or a butyl aldehyde group.
  • an aldehyde group such as a propion aldehyde group, or a butyl aldehyde group.
  • both or three terminals of the non-peptide linker may be a homogeneous functional non-peptide polymer in which all of the aldehyde groups are aldehyde groups.
  • the non-peptidyl linker may be a non-peptidyl polymer having a propion aldehyde group at both ends, specifically, a PEG having a propion aldehyde group at both ends, but is not particularly limited thereto.
  • the non-peptidyl linker When the non-peptidyl linker has functional groups of reactive aldehyde groups at both ends, it is effective to minimize nonspecific reactions and to bind bioactive polypeptides and immunoglobulins at each end of the non-peptidyl polymer, respectively.
  • the final product resulting from reductive amination with aldehyde bonds is much more stable than linked with amide bonds.
  • the aldehyde functional group selectively reacts to the N-terminus at low pH and can form covalent bonds with lysine residues at high pH, for example pH9.0 conditions.
  • the conjugate has an immunoglobulin Fc region consisting of two chains (a dimeric form of an Fc region bound to a monomeric Fc region), and a bioactive substance that binds to each of them is bound to only one immunoglobulin region (monomer Fc region) or It can bind to both immunoglobulin regions (each of the dimeric form of the Fc region).
  • the chemical bond may be a covalent bond, more specifically, a disulfide bond, and even more specifically, may be a disulfide bond formed in the hinge region of two immunoglobulin Fc regions, but is not particularly limited thereto.
  • a first immunoglobulin Fc region wherein the brain target peptide is linked to the C-terminal region of an immunoglobulin Fc region of one molecule via a peptidic linker (eg, peptide bond) as described above
  • a second immunoglobulin Fc region wherein the brain target peptide is linked to the C-terminal region of an immunoglobulin Fc region of one molecule via a peptidic linker (eg, peptide bond), forms a dimer through chemical bonding
  • one molecule of a bioactive substance may be linked to the N-terminal region of one molecule, or one bioactive substance may be connected to each of the N-terminal regions of both molecules.
  • the first immunoglobulin Fc region and the second immunoglobulin Fc region may be in the form of a fusion protein, wherein the immunoglobulin Fc region may be fused in-frame through a peptide bond with a brain target peptide, and the immunoglobulin Fc region may be hinged. Region, CH2 domain, and CH3 domain, but are not particularly limited thereto.
  • the chemical bond between the first immunoglobulin Fc region and the second immunoglobulin Fc region may be specifically a covalent bond, more specifically a disulfide bond, and even more specifically, formed in the hinge region of two immunoglobulin Fc regions. It may be a disulfide bond, but is not particularly limited thereto.
  • Another embodiment embodying the present invention provides an isolated polynucleotide encoding the conjugate, an expression vector comprising the polynucleotide, and a host cell comprising the expression vector.
  • the isolated polynucleotide encoding the conjugate comprises a polynucleotide sequence having at least 75%, specifically at least 85%, more specifically at least 90%, more specifically at least 95% sequence identity with the sequence. Include in the category.
  • Recombinant vectors according to the invention are typically constructed as vectors for cloning or vectors for expression and can be constructed with prokaryotic or eukaryotic cells as host cells.
  • vector refers to a nucleic acid construct that is a recombinant vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and that includes an essential regulatory element operably linked to express a nucleic acid insert.
  • the brain target sustained conjugate of the present invention can be obtained.
  • the polynucleotide encoding the conjugate may be operably linked to a promoter.
  • the method for transforming a recombinant vector comprising a polynucleotide according to the present invention is not limited to the above examples, and transformation or transfection methods commonly used in the art may be used without limitation.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing a recombinant vector comprising a polynucleotide according to the present invention into a host cell.
  • Suitable hosts for the present invention are not particularly limited as long as they allow expression of the polynucleotide according to the present invention.
  • Specific examples of hosts that may be used in the present invention include bacteria of the genus Escherichia , such as E. coli ; Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) and Bacillus (Bacillus), such as bacteria belonging to the genus; Bacteria of the genus Pseudomonas , such as Pseudomonas putida ; Pichia pastoris , Saccharomyces cerevisiae ), Schizosaccharomyces yeast such as pombe ); Insect cells such as Spodoptera luciferda (SF9); And animal cells such as CHO, COS, BSC and the like.
  • the present invention provides a composition comprising the brain target sustained conjugate.
  • the composition may be a pharmaceutical composition.
  • the present invention provides the use of the brain-targeted sustained conjugate in the manufacture of a medicament.
  • the present invention provides a method for preparing the brain target sustained conjugate.
  • the preparation method is
  • the preparation method is
  • L 1 of (a) is a peptidic linker
  • L 2 of (b) may be characterized in that the non-peptidyl linker.
  • the preparation method is
  • L 1 of (a) is a non-peptidyl linker
  • L 2 of (b) may be characterized in that the peptidic linker.
  • the preparation method is
  • the non-peptidyl polymer is physiologically active through the terminal by reacting any reactive functional group of L 1 , which is a non-peptidyl polymer having the same or different reactive functional groups at both ends, with X being a free physiologically active substance. Obtaining XL 1 , a linker covalently linked to the material; And
  • the step (b) may be to connect the reactive functional group of the unreacted end of the linker to Fa of the formula (2).
  • F a and F b are each a single strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region, thereby binding the Fc fragment.
  • F a is covalently linked to L 1 ,
  • Each BTP a1 ,..., BTP an is the same or different brain target peptide
  • Each BTP b1 ,..., BTP bn ' is the same or different brain target peptide
  • Each L 2a1 ,..., L 2an is independently a peptidic or non- peptidyl linker
  • Each L 2b1 ,..., L 2bn ' is each independently a peptidic or non-peptidyl linker
  • n and n ' are each independently a natural number.
  • the reactive functional group may be selected from the group consisting of aldehyde group, maleimide group and succinimide derivative.
  • the aldehyde group may be a propionaldehyde group or a butylaldehyde group.
  • the succinimide derivatives include succinimidyl carboxymethyl, succinimidyl valerate, succinimidyl methylbutanoate, succinimidyl methylpropionate, succinimidyl butanoate, succinimidyl propionate, N-hydroxy Succinimide or succinimidyl carbonate.
  • Reactive functional groups at both ends of the non-peptidyl polymer may be all aldehyde groups.
  • the non-peptidyl polymer may have an aldehyde group and a maleimide group at each end thereof as reactive functional groups.
  • the non-peptidyl polymer may have an aldehyde group and a succinimide group at each end thereof as reactive functional groups.
  • the preparation method is the X-L 1a of Formula 3 - F a - (L 2a1 -BTP a1) - whil - an expression cassette encoding the X and - (BTP an L 2an) - L 1b - F b - culturing the host cell comprising an expression cassette encoding the (L 2b1 -BTP b1) - whil - - ( 'BTP bn' L 2bn); And it may be to include a step of obtaining a conjugate of the formula (3) from the cultured host cell or its culture.
  • X is a bioactive substance
  • L 1a and L 1b are peptidic linkers
  • F a and F b are each a single strand of polypeptide chain comprising a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, where F a and F b are linked to each other with disulfide bonds in the hinge region, thereby binding the Fc fragment.
  • F a and F b are covalently linked to L 1a and L 1b , respectively,
  • Each BTP a1 ,..., BTP an is the same or different brain target peptide
  • Each BTP b1 ,..., BTP bn ' is the same or different brain target peptide
  • Each L 2a1 ,..., L 2an is a peptidic linker
  • Each L 2b1 ,..., L 2bn ' is a peptidic linker
  • n and n ' are each independently a natural number.
  • the conjugate is X-L 1a - F a - (L 2a1 -BTP a1) - whil - (L 2an - BTP an) and X - L 1b -F b- (L 2b1 -BTP b1 )-...-(L 2bn ' -BTP bn ' ) is expressed in the form of a fusion protein and the bond between F a and F b is formed during the refolding process. It may be to form a conjugate.
  • Another embodiment embodying the present invention provides the brain target peptide, an isolated polynucleotide encoding the brain target peptide, an expression vector comprising the polynucleotide, and a transformant comprising the expression vector.
  • the brain target peptide includes both the form of the peptide itself, a salt thereof (eg, a pharmaceutically acceptable salt of the peptide), or a solvate thereof.
  • the brain target peptide may be in any pharmaceutically acceptable form.
  • the kind of the salt is not particularly limited. However, it is preferable that the form is safe and effective for an individual such as a mammal, but is not particularly limited thereto.
  • pharmaceutically acceptable means a substance that can be effectively used for a desired use without causing excessive toxicity, irritation, or allergic reactions within the scope of medical judgment.
  • salts includes salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases.
  • suitable acids include hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid , Benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid and the like.
  • Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium, potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium and the like.
  • solvate refers to a complex of a peptide or a salt thereof according to the present invention with a solvent molecule.
  • the isolated polynucleotide encoding the brain target peptide is a polynucleotide sequence having at least 75%, specifically at least 85%, more specifically at least 90%, more specifically at least 95% sequence identity with the sequence. It is included in the scope of the invention.
  • a sustained conjugate comprising a brain target peptide and a bioactive polypeptide, comprising a immunoglobulin constant region, wherein the biocompatible material, brain target peptide and bioactive material having an FcRn binding site are linked by a peptidic linker. Fusion proteins with immunoglobulin Fc regions and brain target peptides were prepared.
  • An IgG4 Fc region including a hinge region was selected as a biocompatible material capable of increasing the half-life of the bound bioactive polypeptide, and the IgG4 Fc region including the hinge region and the brain target peptide were expressed at the gene level. Each was inserted into the vector.
  • the IgG4 Fc region including the hinge region and the brain target peptide may be linked or directly fused by a peptide linker.
  • the IgG4 Fc region including the hinge region may include a fusion protein including the IgG4 Fc region and the brain target peptide.
  • Synthesized (synthesized in Bioeer) (Table 2).
  • the immunoglobulin Fc region and the brain target peptide prepared by a method in which the N-terminus of the brain target peptide is linked with a peptide linker or directly fused to the C-terminus of the IgG4 Fc region are linked. Fusion proteins were prepared.
  • the gene encoding the brain target peptide fused with the synthesized immunoglobulin Fc region contained NdeI and BamHI at both ends and inserted into a pET22b expression vector digested with NdeI and BamHI.
  • An expression vector into which the gene encoding the brain target peptide fused with the immunoglobulin Fc region was inserted was inserted into the BL21 (DE3) strain to express a sustained fusion protein linked to the immunoglobulin Fc region and the brain target peptide.
  • Additional brain target peptides were designed and synthesized, including the above BTP1 to BTP5, to explore various brain target peptides that fused to immunoglobulin Fc regions (Table 3).
  • Example 3 brain target Peptide Extracellular discharge analysis( Transcytosis assay)
  • BBB brain brain barrier
  • a brain distribution test was performed in mice to determine the extent of brain target peptides passing through the blood brain barrier. After administration at 2 mg / head through CCA (common carotid artery) of the mouse, the brain of the mouse was isolated, cut into fragments, and confirmed the degree of passage of the cerebrovascular barrier of the brain target peptide under the microscope using fluorescence of FITC. (FIG. 2).
  • the brain targeting peptides of the present invention can be targeted to the brain not only in vitro but also in vivo, and bioactive substances bound to the brain targeting peptides also pass through the BBB to effectively deliver to the brain. It suggests that possible.
  • the conjugates of the present invention in the form of a sustained conjugate, increase the persistence in vivo and suggest that targeting the brain can be performed more efficiently as the persistence increases.
  • Example 5 immunoglobulins Fc Area and brain target Peptides Containing Fusion protein Expression vector preparation
  • Expression vectors were prepared to express additional fusion proteins.
  • An IgG4 Fc region including a hinge region was selected as a biocompatible material capable of increasing the half-life of the bound bioactive polypeptide, and the IgG4 Fc region including the hinge region and the brain target peptide were expressed at the gene level. Each was inserted into the vector.
  • the IgG4 Fc region including the hinge region and the brain target peptide are specifically linked by a peptide linker or directly fused to each other by IgG4 Fc region including the hinge region having the sequence shown in Table 4 and the Fc CH3. Fusion proteins in which brain target peptides were linked by peptide bonds in the C-terminal direction of the region were synthesized (synthesized by Korea Bionear) (Table 4). As can be seen in the sequence of Table 4 below, the immunoglobulin Fc region and the brain target peptide prepared by a method in which the N-terminus of the brain target peptide is linked with a peptide linker or directly fused to the C-terminus of the IgG4 Fc region are linked. Fusion proteins were prepared.
  • the gene encoding the brain target peptide fused with the synthesized immunoglobulin Fc region contained NdeI and BamHI at both ends and inserted into a pET22b expression vector digested with NdeI and BamHI.
  • An expression vector into which the gene encoding the brain target peptide fused with the immunoglobulin Fc region was inserted was inserted into the BL21 (DE3) strain to express the brain target peptide continuous fusion protein fused with the immunoglobulin Fc region.
  • Example 6 immunoglobulin Fc Area and two or more brain targets Peptide Expression vector preparation of linked fusion proteins
  • Expression vectors were prepared to express additional fusion proteins to increase receptor binding capacity.
  • An IgG4 Fc region including a hinge region was selected as a biocompatible material capable of increasing the half-life of the bound bioactive polypeptide, and the site-specific mutation of the linker and the brain target peptide at the gene level in the constructed expression vector ( site-directed mutagenesis) using the PCR technique. Specifically, between the C-terminus of the immunoglobulin Fc region and the N-terminus of the brain target peptide or between the C-terminus of the brain target peptide and the site containing BamH I of the vector using the primers of SEQ ID NO: A linker and brain target peptide were inserted into the.
  • a fusion protein (Table 6) including two or more cloned brain target peptides was constructed.
  • These fusion proteins have the sequence shown in Table 6, for example, in the Fc-BTP22 conjugate, two units of the BTP5 peptide of Table 2 bind to the C-terminal direction of the CH3 region of the Fc fragment via a linker.
  • the C-terminus of the immunoglobulin Fc region and the N-terminus of the brain target peptide were prepared by the method of direct linkage or fusion with a peptide linker.
  • two or more brain target peptides in which the brain target peptides are connected in tandem form one unit of brain target peptides in a linker.
  • Recombinant strain culture and 2X LB medium containing 30% glycerol were mixed at a ratio of 1: 1 (v / v), and each 1 ml was dispensed into cryo-tubes and stored at -140 ° C. This was used as a cell stock for the production of recombinant fusion proteins.
  • Fermentation proceeded when the nutrients in the culture was limited, supplemented with additional feeding (feeding solution) to proceed with the oil value culture.
  • the growth of the strains was monitored by OD values, introduced at IPTG with a final concentration of 0.5 mM at an OD value of 120 or more.
  • the culture was further proceeded to about 23-25 hours after introduction, and after completion of the culture, the recombinant strain was harvested using a centrifuge and stored at -80 ° C until use.
  • Example 8 immunoglobulin Fc Area and brain target Peptide Recovery and refolding of fused fusion proteins
  • Cells were disrupted and refolded to convert the fusion proteins fused to the immunoglobulin Fc region and brain target peptide expressed in Example 7 into soluble form.
  • Cell pellets corresponding to 200 ml of each culture were resuspended in 200 ml lysis buffer (50 mM Tris pH 9.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.2 M sodium chloride and 0.5% Triton X-100).
  • Cells were disrupted by performing at 15,000 psi pressure using a microfluidizer processor M-110EH (AC Technology Corp. Model M1475C). Crushed cell lysates were centrifuged at 12,200 g at 4 ° C.
  • the sample was centrifuged at 12,200 g for 30 minutes at 4 ° C., the supernatant was collected, filtered through a 0.22 ⁇ m filter (satorius), and the pH of the sample was adjusted to pH 7.5 using 50% HCl. .
  • a ProteinA-sepharose (GE healthcare) column equilibrated with 10 mM Tris (pH 7.0) with buffer, immunoglobulin Fc region and brain using 100 mM sodium citrate (pH 3.3) and 10% glycerol buffer The conjugate protein to which the target peptide was fused was eluted.
  • Example 11 immunoglobulin Fc Area and brain target Peptide Identify brain distribution of linked fusion proteins
  • a brain distribution test was conducted in mice to determine the degree of passage of the blood brain barrier of the fusion proteins to which the immunoglobulin Fc region and the brain target peptide are linked. After intravenous injection (10 mg / kg) of the mouse, the brain of the mouse was separated 2 hours later, and the concentration of the fusion proteins linked to the immunoglobulin Fc region and the brain target peptide was measured. The degree of passage was confirmed (FIG. 3).
  • the cerebral vascular barrier passage of the immunoglobulin Fc region and the brain target peptides was measured at a higher concentration in the brain compared to the immunoglobulin Fc region, indicating a higher degree of passage.
  • concentration of the fusion protein was higher in the brain than in the case of only one connection, and a high T / S ratio was confirmed.
  • the fusion proteins in which the immunoglobulin Fc region of the present invention and the brain target peptide are fused can be effectively passed through the BBB to the brain.
  • the fusion protein of the present invention in the form of a sustained conjugate increases the persistence in vivo and suggests that as the persistence increases, targeting to the brain can be performed more efficiently.
  • a brain targeted sustained conjugate comprising a typical size protein as a bioactive substance
  • a brain targeted sustained conjugate comprising bisulfurase (about 72 kDa) was prepared.
  • a monopegylated conjugate in which polyethyleneglycol was linked as a linker to bisulfurase was prepared as follows.
  • 10K butyl-ALD (2) PEG (10 kDa polyethylene glycol, each of which hydrogen at both ends is modified with a butyl aldehyde group, Japan NOF Co.)
  • the molar ratio of bisulfurase: 10K butyl-ALD (2) PEG was 1:10, and the bisulfurase concentration was 10 mg / mL, and reacted at 4 ° C. for about 2 hours.
  • reaction was performed by adding a 20 mM NaBH 3 CN (sodium cyanoborohydirde) reducing agent to 0.1 M potassium phosphate (pH 6.0) buffer.
  • the reaction solution was purified with bisulfase-10 K PEG, a monopegylated conjugate, using a Source 15Q (GE, USA) column using sodium phosphate (pH 6.0) and a NaCl concentration gradient.
  • Example 13 Brain Targeted Sustained Conjugates Idusulfaze -10 kDa PEG- Fc - BTP22 Preparation of the conjugate
  • the bicepsulfase-10 kDa PEG conjugate was linked to the Fc fragment containing the brain target peptide to prepare a brain target sustained conjugate.
  • a reaction solution of Dulbecco's phosphate buffer (DPBS) and 10 mM NaBH 3 CN was added as a reducing agent.
  • the reaction solution was applied to a Source 15Q (GE, USA) column using sodium phosphate buffer (pH 6.0) and a NaCl concentration gradient, using a concentration gradient between ammonium sulfate and sodium phosphate (pH 6.0).
  • Source 15ISO GE, USA
  • the desired brain target sustained conjugate was bisulfase-10K PEG-Fc-BTP22. It is mixed with bisulfase-Fc-BTP22.
  • a brain-targeted sustained conjugate comprising a peptide of typical size as a physiologically active substance
  • a brain-targeted sustained conjugate of an artificial GIP derivative having GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide) receptor stimulating activity consisting of 40 amino acid residues was prepared. It was.
  • a monopegylated conjugate in which polyethylene glycol was linked to the artificial GIP derivative as a linker was prepared as follows.
  • the GIP derivative-10K PEG conjugate was linked to the Fc fragment containing the brain target peptide to prepare a brain target sustained conjugate.
  • the molar ratio of GIP derivative-10 K PEG and Fc-BTP22 purified in Example 14 was 1: 2, and the total reaction concentration was 4.55 mg / mL and the reaction was carried out at 4 ° C for 16 hours.
  • the reaction solution used was a solution in which 20 mM NaBH 3 CN was added as DPBS and a reducing agent.
  • reaction solution was applied to a Source 15ISO (GE, USA) column using sodium phosphate buffer (pH 7.5) and an ammonium sulfate concentration gradient, and once again to the same column with the same buffer to the desired brain.
  • transcytosis experiment was performed.
  • Human cerebral endothelial cells, hCMEC / D3 cells were cultured on microporous membranes at 5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 for 10 days.
  • the protein concentration was measured using an ELISA kit.
  • the GIP derivative-10K PEG-Fc-BTP22 of Example 15 showed a cerebrovascular barrier transit effect compared to the control, it was confirmed that the passage rate also increased with time (Fig. 4). Similar cerebrovascular barrier permeability was seen for bisulfase-10K PEG-Fc-BTP22 of Example 13 (not shown).
  • the enzyme activity of free bisulfase and bisulfase-10K PEG-Fc-BTP22, which did not form a conjugate was 23.4 ⁇ 1.94 and 10.8 ⁇ 1.39 nmol / min / ⁇ g, respectively.
  • the value of enzyme activity was calculated as the specific activity per equivalent weight ( ⁇ g) of bisulfurase, that is, the number of enzyme reactions per hour in weight for free bisulfurase, and for bisulfase-10K PEG-Fc-BTP22. It is divided by the converted weight occupied by the bisulfur moiety in the conjugate.
  • Example 18 immunoglobulin Fc Area and brain target Peptide Construction of Linked Fusion Protein Expression Vectors
  • Expression vectors were prepared as follows to express additional fusion proteins.
  • An IgG4 Fc region including a hinge region was selected as a biocompatible material capable of increasing the half-life of the bound bioactive polypeptide, and the IgG4 Fc region including the hinge region and the brain target peptide were expressed at the gene level. Each was inserted into the vector.
  • the IgG4 Fc region including the hinge region and the brain target peptide are specifically linked by a peptide linker or directly fused to each other by IgG 4 Fc region including the hinge region having the sequence shown in Table 7 and the Fc CH3. Fusion proteins in which brain target peptides were linked by peptide bonds in the C-terminal direction of the region were synthesized (synthesized by Korea Bionear Corporation) (Table 7). As can be seen from the sequence of Table 7, the immunoglobulin Fc region and the brain target peptide prepared by the N-terminus of the brain target peptide are linked to the peptide linker or directly fused to the C-terminus of the IgG4 Fc region. Fusion proteins were prepared.
  • the gene encoding the brain target peptide fused with the synthesized immunoglobulin Fc region contained NdeI and BamHI at both ends and inserted into a pET22b expression vector digested with NdeI and BamHI.
  • An expression vector into which the gene encoding the brain target peptide fused with the immunoglobulin Fc region was inserted was inserted into the BL21 (DE3) strain to express a sustained fusion protein linked to the immunoglobulin Fc region and the brain target peptide.
  • Example 19 immunoglobulin Fc Area and brain target Peptide Identify brain distribution of linked fusion proteins
  • a brain distribution test was conducted in mice to determine the degree of passage of the blood brain barrier of the fusion proteins to which the immunoglobulin Fc region and the brain target peptide are linked. After intravenous injection (10 mg / kg) of the mouse, the brain of the mouse was separated 2 hours later, and the concentration of the fusion proteins linked to the immunoglobulin Fc region and the brain target peptide was measured. The degree of passage was confirmed (FIG. 6).
  • the cerebral vascular barrier passage of the immunoglobulin Fc region and the brain target peptides was measured at a higher concentration in the brain compared to the immunoglobulin Fc region, indicating higher passage.
  • Expression vector (IDS cDNA, Cat No. EX-C0003-M02, Gencopoeia) into which a native type of iduronate-2-sulfatase (IDS, SEQ ID NO: 102) is inserted to produce an enzyme fusion protein ) And a synthesized linker (SEQ ID NO: 17) and IgG4 Fc regions (SEQ ID NOs: 11, 12, and 13) using overlapping PCR to prepare a fusion protein expression vector. Since the overlapping PCR technique PCR amplifies each enzyme and linker-Fc separately, the PCR products produced include overlapping sequences. The PCR conditions for amplifying the fusion protein were repeated 25 times with the first 95 ° C. 1 minute, 57 ° C. 30 seconds, and 68 ° C. 3 minutes. 25 times amplification was repeated.
  • the IDS PCR product includes a linker-Fc sequence on the 3 'side
  • the linker-Fc PCR product will contain the sequence of IDS on the 5 'side.
  • the second PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 86 and 89 to obtain a PCR product having the sequence of IDS-Fc, followed by KpnI and XhoI restriction enzymes.
  • the overlapping sequence was cleaved and the PCR product obtained was inserted into the X0GC vector to construct a vector expressing the IDS-Fc fusion protein (pX0GC-enzyme-Fc).
  • Site-directed mutagenesis PCR was used to remove chain exchange and N-glycosylation sites in the Fc region of the constructed fusion protein.
  • Serine the second amino acid of the Fc region involved in chain exchange using the primers of SEQ ID NOs: 90 and 91, was replaced with proline, and N-glycosylation using the primers of SEQ ID NOs: 92 and 93 Asparagine, which is the 71st amino acid of the Fc region, was replaced with glutamine.
  • the first PCR and the second PCR were performed to construct a vector expressing the IDS-Fc-BTP22 fusion protein in the X0GC vector.
  • the enzyme fusion protein expression vector prepared in the above example was named pX0GC-IDS-Fc-BTP22 vector and has the following sequence (Table 11).
  • the recombinant expression vector pX0GC-IDS-Fc-BTP22 prepared above was introduced into the DG44 / CHO cell line (CHO / dhfr-) (purchased from Dr. Chasin of Columbia University), in which the nucleic acid biosynthesis process was incomplete because the DHFR gene was damaged.
  • CHO / dhfr- obtained from Dr. Chasin of Columbia University
  • the iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP22 fusion protein was expressed from the transformant.
  • the DG44 / CHO cell line was cultured to cover about 80 to 90% of the bottom of the culture vessel, and the cells were washed three times with Opti-MEM (Lifetechnology, Cat. No. 51985034).
  • the cultured cells were washed three times with DMEM-F12 (Lifetechnology, Cat. No. 11330) medium containing 10% FBS, and then the medium was added and cultured again for 48 hours. Trypsin was added to the cultured cells to separate the cultured cells, and they were selected as a selection medium (Hypoxanthine-Thymidine) without 10% FBS and 1 mg / ml of G418 (Cellgro, cat. No. 61-234). -RG) and MEM- ⁇ medium (WELGENE Co., cat. No. LM008-02)). Transformed cells were selected from the isolated cells by incubating the selection medium at 2 or 3 day intervals until only the transformed cells survived to form colonies.
  • DMEM-F12 Lifetechnology, Cat. No. 11330
  • Trypsin was added to the cultured cells to separate the cultured cells, and they were selected as a selection medium (Hypoxanthine-Thymidine) without 10% FBS and 1 mg / m
  • a limiting dilution method was performed to secure a single clone. Specifically, each of the transformed cells diluted to a ratio of 0.7 cells per well in a 96 well plate was dispensed, and cultured for 2 to 3 weeks to confirm whether a monoclonal appeared. When the wells of the monoclonal clusters are searched, the monoclonals are transferred to a 24-well plate, and the cell growth rate and the expression level of the bisulfurase derivatives of each clone are analyzed by ELISA method. The clones with the best expression were selected. The selected cell lines were adapted to suspension culture using serum-free medium (EX-CELL CHO medium, Sigma, USA, cat. No. 63289C).
  • the culture medium cultured in (3) above was bound to a rProtein A sepharose fast flow (GE healthcare, USA) column equilibrated with 20 mM tris (pH 7.5) and glycerol buffer, and then 0.1M sodium citrate ( Elution was carried out using a buffer consisting of sodium citrate (pH 3.0-4.0), sodium chloride and glycerol.
  • the eluted sample was subjected to Source 15ISO (GE healthcare, USA) using a concentration gradient of ammonium sulfate and tris (pH 7.5) to obtain the recombinant protein iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP22.
  • SDS-PAGE of the purified recombinant protein iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP22 was shown in FIG. 7.
  • the molar ratio of the purified mono-PEGylated bisulfurase and immunoglobulin Fc-BTP28 is 1: 10-15, and the total protein concentration is 10-20 mg / ml, which is 2-8.
  • the reaction was carried out at ° C for 16 hours. In this case, 0.1 M potassium phosphate (pH 6.0) and 20 mM sodium cyanoborohydride were added as a reducing agent.
  • Example 22 Iduronate 2- Sulfatase - Fc - BTP22 Fusion protein And Iduronate Of 2-sulfatase-10kDa PEG-Fc-BTP28 conjugate in vitro Enzyme Activity Check
  • the specific activities of the iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP22 fusion protein and the iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP28 conjugate were 45.0 ⁇ 11.4 and 41.2 ⁇ 1.2 nmol / min / ⁇ g, respectively. It was confirmed that.
  • the enzyme activity of the iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP22 fusion protein and the iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP28 conjugate was 95.5, 87.4% compared to the iduronate 2-sulfatase. After preparation of the conjugate and the fusion protein, the enzyme activity was confirmed to be of similar level.
  • Example 23 Iduronate 2- Sulfatase - Fc - BTP22 Fusion protein Check brain tissue distribution
  • BBB blood brain barrier
  • Example 24 Iduronate 2- Sulfatase Knockout In the mouse Iduronate 2- Sulfatase -Fc-BTP22 Fusion protein And Iduronate 2- Sulfatase - 10kDa PEG- Fc - BTP28 In vivo following administration of the conjugate ( in vivo Efficacy test
  • mice were divided into seven groups. Ready.
  • Test group group 2: brain-targeted sustained iduronate 2-sulfatase excipient administration, group 3: iduronate 2-sulfatase 0.5 mg / kg once a week intravenously, group 4: iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP22 fusion protein 2 mg / kg (once a week, intravenous), group 5: iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP22 fusion protein 4 mg / kg (once a week, Subcutaneous administration), group 6: conjugate of iduronate 2-sulfatase-Fc-BTP28 2 mg / kg (once weekly, intravenously), group 7: conjugate of iduronate 2-
  • GAG glycosaminoglycan
  • Example 25 immunoglobulin Fc Regions and different brain targets Peptide Preparation of two or more linked fusion proteins
  • Expression vectors were prepared as follows to express additional fusion proteins.
  • An IgG4 Fc region including a hinge region was selected as a biocompatible material capable of increasing the half-life of the bound bioactive polypeptide, and the two or more brain target peptides different from the IgG4 Fc region including the hinge region were genes. Fusion at the level was inserted into the expression vector respectively.
  • the IgG4 Fc region including the hinge region and two or more brain target peptides different from each other are specifically linked by a peptide linker or directly fused to each other, and have a sequence as shown in Table 13 below. Fusion proteins in which two or more brain target peptides were linked by peptide bonds in the C-terminal direction of the region and the Fc CH3 region were prepared using the following Primer (Table 12). Specifically, in order to insert the BTP16 sequence and the linker into the Fc-BTP28 expression vector, Fc-BTP29 was used using the primers of SEQ ID NOs: 107 and 108, and Fc-BTP30 was determined by using the primers of SEQ ID NOs: 109 and 110. Prepared using the technique.
  • the immunoglobulin Fc region and the brain target peptide prepared by a method in which the N-terminus of two or more brain target peptides are linked or directly fused to the C-terminus of the IgG4 Fc region by a peptide linker. To which the fusion protein was bound.
  • An expression vector into which the gene encoding the brain target peptide fused with the immunoglobulin Fc region was inserted was inserted into the BL21 (DE3) strain to express a sustained fusion protein linked to the immunoglobulin Fc region and the brain target peptide.
  • Cells were disrupted and refolded in order to change the fusion proteins fused with the immunoglobulin Fc region and brain target peptide expressed in (1) to soluble form.
  • Cell pellets corresponding to 200 ml of each culture were resuspended in 200 ml lysis buffer (50 mM Tris pH 9.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.2 M sodium chloride and 0.5% Triton X-100).
  • Cells were disrupted by performing at 15,000 psi pressure using a microfluidizer processor M-110EH (AC Technology Corp. Model M1475C). Crushed cell lysates were centrifuged at 12,200 g at 4 ° C.
  • the sample was centrifuged at 12,200 g for 30 minutes at 4 ° C., the supernatant was collected, filtered through a 0.22 ⁇ m filter (satorius), and the pH of the sample was adjusted to pH 7.5 using 50% HCl. .
  • a ProteinA-sepharose (GE healthcare) column equilibrated with 10 mM Tris (pH 7.0) with buffer, immunoglobulin Fc region and brain using 100 mM sodium citrate (pH 3.3) and 10% glycerol buffer The conjugate protein to which the target peptide was fused was eluted.
  • the sustained conjugate prepared above is capable of passage of the cerebrovascular barrier by the brain target peptide bound to the Fc region, and maintains the physiological activity of the bound physiologically active substance to provide a persistent binder with improved persistence and stability, thereby providing a new BBB. It may provide a platform for development of therapeutics that can pass.

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Abstract

본 발명은 뇌 표적 펩타이드 및 생리활성 물질을 포함하는 뇌 표적 지속형 결합체에 관한 것으로, 뇌혈관 장벽을 통과하고, 지속성과 안정성이 향상된 생리활성 물질을 포함하는 지속형 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 뇌 표적 펩타이드 및 생리활성 물질을 포함하는 뇌 표적 지속형 결합체는 뇌혈관 장벽을 통과하여 뇌 질환에 관련된 질병의 치료가 가능하고, 또한 생리활성 물질의 활성이 생체 내에서 유지되고 혈중 반감기가 증가되는 뇌 표적 펩타이드 및 생리활성 물질을 포함하는 뇌 표적 지속형 결합체를 제공한다.

Description

뇌 표적 지속성 단백질 결합체, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물
본 발명은 뇌 표적 가능한 지속형 단백질 결합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규한 뇌 표적 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
뇌로의 효과적인 치료 약제 전달의 필요성이 대두되고 있으나, 뇌에 대한 새로운 약제의 개발은 나머지 신체에 비하여 훨씬 느린 속도로 진행되고 있다. 이러한 느린 진행은 대부분의 약제가 뇌혈관 장벽(blood-brain barrier, BBB)을 형성하는 뇌 모세관 벽(brain capillary wall)을 통하여 뇌 내로 침투할 수 없는 상황에 상당 부분 기인한다. 뇌혈관 장벽(blood-brain barrier, BBB)이란 뇌혈관의 내피세포 간의 조밀한 연결(tight junction) 및 이를 더욱 강화하는 성상세포(astrocyte)로 이루어진 구조물로서, 혈관 내부의 물질이 혈관벽을 통과하여 뇌 실질 내로 쉽게 나오지 않게 해 주는 기능을 한다. 이런 이유로 뇌질환 치료제로 개발된 상당수의 약이 뇌혈관 장벽의 통과가 잘 이루어지지 않는 문제점을 갖고 있다. 거의 100%의 거대-분자 약제 및 98% 이상의 소형-분자 약제는 BBB를 통과하지 못한다. 극히 일부의 약제, 높은 지질 용해도 및 400-500 달톤(dalton) 이하의 분자량을 보유하는 소형 분자만이 BBB를 실제로 통과한다. 또한, BBB를 통과하는 소형 분자 중에서, 극히 일부만 약학적으로 유의한 양으로 BBB를 통과한다.
소수의 뇌 질환, 예를 들면, 우울증, 정동 장애, 만성 통증, 간질만이 BBB를 통과하는 소형 분자 약제에 반응한다. 훨씬 많은 뇌 질환, 예를 들면, 알츠하이머병, 뇌졸중/신경 보호, 뇌와 척수 손상, 뇌암, 뇌의 HIV 감염, 다양한 실조증 유발성 장애(ataxia-producing disorder), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis,ALS), 헌팅턴병(Huntington disease), 뇌에 영향을 주는 유년기 선천성 유전자 오류(childhood inborn genetic error), 파킨슨병(Parkinson's disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis)은 통상적인 지질-용해성 소형 분자량 약제에 반응하지 않는다.
현재 뇌혈관 장벽을 통과하여 약물 등을 전달해 줄 수 있는 전달체(carrier)에 대한 개발이 활발하게 진행 중이다. 한편, 특정한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 뇌혈관 장벽을 통과하며 약물이나 siRNA 등을 전달하는 기능을 갖고 있다고 알려져 있으나, 여전히 특정 구조체의 크기가 큰 생리활성 물질의 전달 가능성이 있는지에 대한 연구는 미비한 상태이다(Kumar et al., Nature. 2007, 448:39-43). 또한, 효과적인 소형 분자 약제가 존재하는 극소수의 뇌 질환에 대해서도 새롭고 향상된 약제에 관한 개발과 연구가 더욱 필요하다.
본 발명의 하나의 목적은 뇌 혈관 장벽을 통과하고, 생리활성 효력을 유지하고, 생리활성 물질의 반감기를 연장시킬 수 있는 생체 적합성 물질이 포함된, 뇌 표적 지속형 결합체를 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 생리 활성 물질과 뇌 표적 펩타이드가 각각 독립적으로 면역글로불린 Fc 영역에 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커로 연결된, 뇌 표적 지속형 결합체를 제공하는 것이다.
보다 더 구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 면역글로불린 Fc 영역이 융합된 뇌 표적 펩타이드의 면역글로불린 Fc 영역에 생리활성 물질이 상호 결합에 의해 연결된, 뇌 표적 지속형 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 뇌 표적 지속형 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 이들 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 뇌 표적 지속형 결합체를 포함하는 조성물, 예컨대 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약제의 제조에 있어서 상기 뇌 표적 지속형 결합체의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 뇌 표적 지속형 결합체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 뇌 표적 펩타이드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주세포; 및 이들 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태는, 뇌 혈관 장벽을 통과하고, 생리활성 효력을 유지하고, 생리활성 물질의 반감기를 연장시킬 수 있는 생체 적합성 물질이 포함된, 뇌 표적 지속형 결합체이다.
하나의 구체예로서, 본 발명은 생리 활성 물질과 뇌 표적 펩타이드가 각각 독립적으로 면역글로불린 Fc 영역에 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커로 연결된, 뇌 표적 지속형 결합체에 관한 것이다.
앞선 구체예에 따른 결합체에서, 상기 결합체는 면역글로불린 Fc 영역이 융합된 뇌 표적 펩타이드의 면역글로불린 Fc 영역에 생리활성 물질이 상호 결합에 의해 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다:
[화학식 1]
X-L1-F-L2-Y
여기에서,
X 는 생리 활성 물질이며,
Y는 뇌 표적 펩타이드 (BTP)이고,
L1 및 L2는 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
L1 및 L2가 펩타이드성 링커일 때, 상기 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하며,
F는 FcRn 결합부위를 포함하는 면역글로불린 불변 영역임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 F 혹은 면역글로불린 Fc 영역은 이량체 형태일 수 있다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 지속형 결합체는 뇌 혈관 장벽을 통과하여, 뇌 조직 내로 생리 활성 물질이 전달되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 뇌 표적 펩타이드는 뇌 혈관 장벽을 통과 가능한 아미노산 서열을 가지는, 펩타이드, 단백질 또는 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 뇌 표적 펩타이드는 수동전달(passive transport)에 의한 경로 또는 수용체 매개 전달(receptor-mediated transport)에 의한 경로를 통해 뇌 혈관 장벽을 통과하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 예로 뇌 혈관 장벽을 통과할 수 있는 펩타이드, 단백질 또는 항체로 특별히 그 종류 및 크기에 제한을 두지 않는다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 뇌 표적 펩타이드는 수용체 매개 전달에 의한 경로를 통해 뇌 혈관 장벽을 통과하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 수용체 매개 전달(receptor-mediated transport)에 의한 경로는 인슐린 수용체(insulin receptor), 트랜스페린 수용체(transferrin receptor), 저밀도 지질단백질 수용체(low density lipoprotein receptor), 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질(Low density lipoprotein receptor-related protein), 렙틴 수용체(leptin receptor), 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor), 글루타티온 수송체(Glutathione transporter), 칼슘의존성 칼륨통로(calcium-activated potassium channel), 및 RAGE (receptor for advanced glycation endproducts), 및 상기 수용체들의 리간드 및 상기 수용체 또는 리간드에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 통하여 수용체 매개 전달 경로에 의해 뇌 혈관 장벽을 통과하는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 뇌 표적 펩타이드는 이러한 경로를 통해 뇌혈관 장벽을 통과하는 펩타이드, 단백질, 또는 항체로 이루어진 군에서 선택되거나, 상기 펩타이드, 단백질, 또는 항체로부터 분리된 일부 펩타이드 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 생리 활성 물질은 톡신; 또는 GLP-1(Glucagon like peptide-1) 수용체 아고니스트; 글루카곤 수용체 아고니스트; GIP(Gastric inhibitory polypeptide) 수용체 아고니스트; FGF(Fibroblast growth factor) 수용체 아고니스트; 콜레키스토키닌 (Cholecystokinin) 수용체 아고니스트; 가스트린(gastrin) 수용체 아고니스트; 멜라노코르틴(melanocortin) 수용체 아고니스트; 인간 성장호르몬; 성장호르몬 방출 호르몬; 성장호르몬 방출 펩타이드; 인터페론; 인터페론 수용체; 콜로니 자극인자 (과립구 콜로니 자극인자); 인터루킨; 인터루킨 수용체; 효소; 인터루킨 결합 단백질; 사이토카인 결합 단백질; 마크로파지 활성인자; 마크로파지 펩타이드; B 세포인자; T 세포인자; 단백질 A; 알러지 억제인자; 세포 괴사 당단백질; 면역독소; 림포독소; 종양 괴사인자; 종양 억제인자; 전이 성장인자; 알파-1 안티트립신; 알부민; 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin); 아포리포 단백질-E; 적혈구 생성 인자; 고 당쇄화 적혈구 생성인자; 안지오포이에틴(angiopoietin); 헤모글로빈; 트롬빈(thrombin); 트롬빈 수용체 활성 펩타이드; 트롬보모듈린(thrombomodulin); 혈액인자 VII; 혈액인자 VIIa; 혈액인자 VIII; 혈액인자 IX; 혈액인자 XIII; 플라즈미노겐 활성인자; 피브린-결합 펩타이드; 유로키나제; 스트렙토키나제; 히루딘(hirudin); 단백질 C; C-반응성 단백질; 레닌 억제제; 콜라게나제 억제제; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; 렙틴; 혈소판 유래 성장인자; 상피세포 성장인자; 표피세포 성장인자; 안지오스타틴(angiostatin); 안지오텐신(angiotensin); 골 형성 성장인자; 골 형성 촉진 단백질; 칼시토닌; 인슐린; 아트리오펩틴; 연골 유도인자; 엘카토닌(elcatonin); 결합조직 활성인자; 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor); 여포 자극 호르몬; 황체 형성 호르몬; 황체 형성 호르몬 방출 호르몬; 신경 성장인자류; 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1); 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide); 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor); 네트린(netrin); 중성구 억제인자(neurophil inhibitor factor); 신경영양인자; 뉴트린(neuturin); 부갑상선 호르몬; 릴랙신; 시크레틴; 소마토메딘; 인슐린 유사 성장인자; 부신피질 호르몬; 글루카곤; 콜레시스토키닌; 췌장 폴리펩타이드; 가스트린 방출 펩타이드; 코티코트로핀 방출인자; 갑상선 자극호르몬; 오토탁신(autotaxin); 락토페린(lactoferrin); 미오스타틴(myostatin); ADNP(activity-dependent neuroprotective protein), BACE1(beta-secretase1), APP(Amyloid Precursor Protein), NCAM(Neural cell adhesion molecule), 아밀로이드 베타(Amyloid beta), 타우(Tau), RAGE(receptor for advanced glycation endproducts), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), 또는 이들의 아고니스트 또는 안타고니스트; 수용체류, 수용체 아고니스트; 세포표면항원; 단일클론 항체; 다중클론 항체; 항체 단편; 바이러스 유래 백신 항원; 하나 이상의 수용체 아고니스트를 활성화 시키는 하이브리드 폴리펩타이드 또는 키메릭 (chimeric) 폴리펩타이드; 및 이들의 아날로그를 포함하는 군으로 이루어진 군에서 선택된 생리활성 물질인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서,
상기 톡신은 메이탄신(Maytansine) 또는 이의 유도체, 오리스타틴 (Auristatin) 또는 이의 유도체, 듀오카마이신(Duocarmycin) 또는 이의 유도체, 및 PBD(Pyrrolobenzodiazepine) 또는 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택되고,
GLP-1(Glucagon like peptide-1) 수용체 아고니스트는 천연형 엑센딘-3 또는 천연형 엑센딘-4, 및 이들의 아날로그로 이루어진 군에서 선택된 것이며,
FGF 수용체 아고니스트는 FGF1 또는 이의 아날로그, FGF19 또는 이의 아날로그, FGF21 또는 이의 아날로그, 및 FGF23 또는 이의 아날로그로 이루어진 군에서 선택되고,
인터페론은 인터페론-알파, 인터페론-베타 및 인터페론-감마로 이루어진 군에서 선택되고,
인터페론 수용체는 인터페론-알파 수용체, 인터페론-베타 수용체, 인터페론-감마 수용체, 및 수용성 타입 I 인터페론 수용체로 이루어진 군에서 선택되고,
인터루킨은 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-6, 인터루킨-7, 인터루킨-8, 인터루킨-9, 인터루킨-10, 인터루킨-11, 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-14, 인터루킨-15, 인터루킨-16, 인터루킨-17, 인터루킨-18, 인터루킨-19, 인터루킨-20, 인터루킨-21, 인터루킨-22, 인터루킨-23, 인터루킨-24, 인터루킨-25, 인터루킨-26, 인터루킨-27, 인터루킨-28, 인터루킨-29, 및 인터루킨-30으로 이루어진 군에서 선택되고,
인터루킨 수용체는 인터루킨- 1 수용체 또는 인터루킨-4 수용체이고,
효소는 베타글루코시다제(beta-glucosidase), 알파갈락토시다제(alpha-galactosidase), 베타갈락토시다제(beta-galactosidase), 이두로니다제(iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제(Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제(acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제(acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidsase), 아릴설파타제(arylsulfatase) A, 아릴설파타제 B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, 베타-헥소사미니다제 B, 헤파린-N-설파타제(heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제(alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제(lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제(alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파아제(lipase), 우리카제(Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제(Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), 알파-갈락토시다제-A, 아갈시다제 알파(agalsidase alpha), 아갈시다제 베타, 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase), 뷰티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 및 이미글루세라제(imiglucerase)로 이루어진 군에서 선택되고,
인터루킨 결합 단백질은 IL-18bp이고,
사이토카인 결합 단백질은 TNF (Tumor necrosis factor) 결합 단백질이고,
신경 성장인자류는 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(cilliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neurophil inhibitor factor), 신경영양인자, 및 뉴트린(neuturin)으로 이루어진 군에서 선택되고,
미오스타틴 수용체는 TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, 및 B 세포 활성인자 수용체로 이루어진 군에서 선택되고,
미오스타틴 수용체 안타고니스트는 IL1-Ra이고,
세포표면 항원은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45 및 CD69로 이루어진 군에서 선택되고,
항체 단편류는 scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 GLP-1 수용체 아고니스트는 천연형 엑센딘-4, 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 제거된 엑센딘-4, 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹으로 치환된 엑센딘-4, 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 디메틸기로 수식된 엑센딘-4, 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 카르복실기로 치환된 엑센딘-4, 천연형 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산(히스티딘)의 알파 탄소가 제거된 엑센딘-4; 및 상기 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(라이신)이 세린으로 치환된 엑센딘-4 및 상기 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(라이신)이 알지닌으로 치환된 엑센딘-4로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 L1은 F의 N-말단 영역에 연결되고, L2는 F의 C-말단 영역에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1은 X의 N-말단 또는 C-말단에 연결되고, L2는 Y의 N-말단 또는 C-말단 영역에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1은 X의 N-말단 또는 C-말단에 연결되고, L2는 Y의 N-말단 영역에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 화학식 1의 F-L2-Y는 하기 화학식 2로 표시되는 구조인 것인, 뇌 표적 지속형 결합체인 것을 특징으로 한다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000001
여기에서,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며
이 때 n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn '은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며, 이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 L1은 Fa의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조인 것을 특징으로 한다:
[화학식 3]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000002
여기에서,
X는 생리 활성 물질이고,
L1a 및 L1b는 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn '은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서,
각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1a 및 L1b는 각각 Fa 및 Fb의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서,
상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 4로 표시되는 구조인 것을 특징으로 한다:
[화학식 4]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000003
여기에서,
X는 생리 활성 물질이고,
L1은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn '은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서,
각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서,
L1은 Fa의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, n=n'이고 각각 L2a1 = L2b1, ······, L2an = L2bn '과 BTPa1 = BTPb1, ······, BTPan = BTPbn'의 조건을 만족하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 화학식 1에서 F는 Fa 및 Fb이며, L2-Y는 (L2a-Ya)n 및 (L2b-Yb)n'로서, 하기 화학식 5로 표시되는 결합체인 것을 특징으로 한다:
[화학식 5]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000004
여기서,
상기 X는 생리 활성 물질이며,
L1은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이고,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역, 구체적으로 Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
Ya 및 Yb는 뇌 표적 펩타이드로, 각각 서로 같은 종류 또는 다른 종류의 뇌 표적 펩타이드고,
L2a 및 L2b 각각은 펩타이드성 링커로, 상기 L2a 및 L2b는 서로 같은 종류 또는 다른 종류이며,
n 및 n'은 각각 독립적으로 1이상의 자연수임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 화학식 1에서 X는 Xa 및 Xb이고, L1은 L1a 및 L1b이며, F는 Fa 및 Fb이며, L2-Y는 (L2a-Ya)n 및 (L2b-Yb)n'로서, 하기 화학식 6으로 표시되는 결합체인 것을 특징으로 한다:
[화학식 6]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000005
여기서, 상기 X는 생리 활성 물질이고,
L1a 및 L1b는 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며, 구체적으로는 펩타이드성 링커이며,
상기 펩타이드성 링커는 0개 내지 1000개의 아미노산을 포함할 수 있으며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
Ya 및 Yb는 뇌 표적 펩타이드로, 이들은 서로 같거나 다른 종류이고,
L2a 및 L2b 각각은 펩타이드성 링커로, 상기 L2a 및 L2b는 서로 같은 종류 또는 다른 종류이며,
n 및 n'은 각각 독립적으로 1이상의 자연수임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn '은 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn '은 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, n=n'이고, BTPa1 ≠ BTPb1, ······, BTPan ≠ BTPbn' 중 어느 하나의 요건을 만족하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 n=n'이고, 각각 L2a1 ≠ L2b1, ······, L2an ≠ L2bn ', 및/또는 BTPa1 ≠ BTPb1, ······, BTPan ≠ BTPbn'의 조건을 만족하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn '은 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn '은 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 n 및 n'은 각각 독립적으로 1 내지 5, 즉 1, 2, 3, 4, 또는 5인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 L1은 X의 아민기 또는 티올기에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1, L1a, 또는 L1b는 X의 N-말단 아민기, 라이신의 측쇄에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 측쇄에 위치한 -SH 기 (티올기)에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 뇌 표적 펩타이드 (BTP)는 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 및 85로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 생리활성 물질인 X는 2개 내지 1000개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, L1, L1a, 또는 L1b는 0.5 내지 100 kDa 크기의 비펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, L1, L1a, 또는 L1b는 0개 내지 1000개의 아미노산을 포함하는 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L2는 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 펩타이드성 링커는 (GS)m, (GGS)m, (GGGS)m, 또는 (GGGGS)m이며, m은 1 내지 10인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 L2는 펩타이드성 링커이며, (GS)m, (GGS)m, (GGGS)m, 또는 (GGGGS)m이며, m은 1 내지 10인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체는 유전자 수준에서 융합된 융합 단백질로, 상기 L1a 및 L1b는 각각 X의 C-말단 영역 및 Fa 및 Fb의 N-말단 영역에 연결된 것이고, L2a 및 L2b는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단 영역에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 L1 및 L2는 펩타이드성 링커이며, (GS)m, (GGS)m, (GGGS)m, 또는 (GGGGS)m이며, m은 1 내지 10이며, 상기 뇌 표적 지속형 결합체는 융합 단백질 형태인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 생리 활성 물질은 치료학적 효소이고, 상기 결합체는 융합 단백질 형태이며, 상기 융합 단백질은 Fc 영역이 융합되지 않은 치료학적 효소에 비해 안정성이 증가되고, 리소좀 수용체에 대한 결합력이 감소된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1 및 L2 중 하나는 펩타이드성 링커이고, 또 다른 하나는 비펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1 및 L2 모두 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1은 비펩타이드성 링커 또는 펩타이드성 링커이고, L2는 펩타이드성 링커일 때, 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 화학식 1의 뇌 표적 지속형 결합체는 L1에 의해 X의 N-말단 및 F의 N-말단이 연결된 것이고, L2에 의해 Y의 N-말단 및 F의 C-말단이 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 지속형 결합체에서, 상기 화학식 1의 뇌 표적 지속형 결합체는 L1의 일 말단은 X의 라이신 잔기 또는 시스테인 잔기 등에, L1의 다른 말단은 F의 N-말단에 연결된 것이고, L2에 의해 Y의 N-말단 및 F의 C-말단이 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히알루론산, 지방산, 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 화학식 1의 상기 L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, 상기 X와 F, 또는 F와 Y는 공유 화학결합, 비공유 화학결합 또는 이들의 조합으로 L1 및 L2 에 의해 서로 결합되고, L1 및 L2 가 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다. 펩타이드성 링커가 0개의 아미노산일 경우는 공유 화학결합인 펩타이드 결합에 의해 결합된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 화학식 1의 상기 L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, L1 및 L2 는 0개의 아미노산으로 이루어진 것으로, (i) X와 F, 또는 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것이고; 또는 (ii) X와 F, 및 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것인, 뇌 표적 지속형 결합체를 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 화학식 1의 L1 및 L2 중 어느 하나는 펩타이드성 링커이고, 이 중 다른 하나는 비펩타이드성 링커일 때, 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 링커이며, 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌 글리콜인 것인, 뇌 표적 지속형 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 화학식 1의 F는 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 내지 4개의 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG의 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 상기 면역글로불린 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 유래인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 서열의 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 면역글로불린 Fc 영역의 서열을 포함하거나, 이의 변이된 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 천연형 면역글로불린 Fc 영역에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어날 수 있는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 사슬 교환 기능이 일어나지 않을 수 있는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 F는 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬 두 개가 서로 이황화 결합으로 연결된 이량체 형태인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역을 구성하는 힌지 영역은 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 필수적으로 구성되는 것이거나, 혹은 상기 서열번호: 14의 아미노산 서열에서 2 번째 아미노산인 세린(Ser, S)이 프롤린 (Pro, P)으로 변이된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역을 구성하는 CH2 도메인은 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 필수적으로 구성되는 것이거나, 혹은 상기 서열번호: 15의 아미노산 서열에서 67번째 아미노산인 아스파라긴 (Asn, N)이 글루타민 (Gln, Q)으로 변이된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 F는 IgG 유래의 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬 두 개가 서로 이황화 결합으로 연결된 이량체 형태로서, 상기 힌지 영역이 서열번호: 14의 아미노산 서열, 혹은 상기 서열번호: 14의 아미노산 서열에서 2 번째 아미노산인 세린(Ser, S)이 프롤린 (Pro, P)으로 변이된 서열을 포함하고/하거나 상기 CH2 도메인이 서열번호: 15의 아미노산 서열 또는 상기 서열번호: 15의 아미노산 서열에서 67번째 아미노산인 아스파라긴 (Asn, N)이 글루타민 (Gln, Q)으로 변이된 서열을 포함하고/하거나 CH3 도메인이 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 F를 구성하는 면역글로불린 불변영역을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호: 105에서 2번째 아미노산이 프롤린으로 치환되거나; 71번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나; 또는 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 F를 구성하는 면역글로불린 불변영역을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 결합체는 2개의 면역글로불린 Fc 영역 (단량체 Fc 영역이 결합한 이량체 형태의 Fc 영역)을 가지며 각각에 결합하는 생리활성 물질은 1군데의 면역글로불린 영역 (단량체 Fc 영역)에만 결합되거나 2군데의 면역글로불린 영역 모두(이량체 형태의 Fc 영역 각각)에 결합되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 2개의 면역글로불린 불변 영역 사슬 간의 화학 결합은 공유결합일 수 있고, 보다 구체적으로 이황화 결합일 수 있고, 더욱 더 구체적으로는 두 면역글로불린 Fc 영역의 힌지 영역에서 형성되는 이황화 결합인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 결합체는
(i) 상기한 펩타이드성 링커 (예, 펩타이드 결합)를 통하여 뇌 표적 펩타이드가 한 분자의 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단 부위에 연결된, 제1 면역글로불린 Fc 영역, 및 (ii) 상기한 펩타이드성 링커 (예, 펩타이드 결합)를 통하여 뇌 표적 펩타이드가 한 분자의 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단 부위에 연결된, 제2 면역글로불린 Fc 영역이 화학결합을 통하여 이량체를 형성하고, 이러한 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역 두 분자 중 한 분자의 N-말단 영역에 한 분자의 생리활성 물질이 연결되거나, 또는 두 분자 모두의 N-말단 영역 각각에 생리활성 물질이 하나씩 연결된 형태인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 결합체는 상기한 제1 면역글로불린 Fc 영역 및 제2 면역글로불린 Fc 영역은 융합 단백질 형태로서, 면역글로불린 Fc 영역이 뇌 표적 펩타이드와 펩타이드 결합을 통하여 in-frame 융합된 것일 수 있으며, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 형태인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 결합체에서 상기 제1 면역글로불린 Fc 영역 및 제2 면역글로불린 Fc 영역 간의 화학 결합은 구체적으로 공유결합일 수 있으며, 보다 구체적으로 이황화 결합일 수 있고, 더욱 더 구체적으로는 두 면역글로불린 Fc 영역의 힌지 영역에서 형성되는 이황화 결합인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 뇌 표적 지속형 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
하나의 구체예로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열로 구성되는 융합 단백질 형태인 뇌 표적 지속형 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 뇌 표적 지속형 결합체를 포함하는 조성물이다.
하나의 구체예로서, 상기 조성물은 약학적 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 약제의 제조에 있어서 상기 뇌 표적 지속형 결합체의 용도이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 뇌 표적 지속형 결합체의 제조 방법이다.
하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(a) 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 뇌 표적 지속형 결합체를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(i) (a) 생리활성 물질인 X, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L1, 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 F가 결합된, X-L1-F, 및 (b) 뇌 표적 펩타이드인 Y, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L2가 결합된 L2-Y를 제조하는 단계; 및
(ii) 상기 (a) X-L1-F 및 (b) L2-Y를 연결하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(i) (a) 생리활성 물질인 X 및 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L1이 결합된, X-L1, 및 (b) 뇌 표적 펩타이드인 Y, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L2 및 F가 결합된 F-L2-Y를 제조하는 단계; 및
(ii) 상기 (a) X-L1 및 (b) F-L2-Y를 연결하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(a) 양 말단에 각각 같거나 서로 다른 반응성 작용기가 위치하는 비펩타이드성 중합체인 L1의 어느 한 반응성 작용기를 유리된 생리활성 물질인 X와 반응시켜 상기 말단을 통하여 비펩타이드성 중합체가 생리활성 물질에 공유결합으로 연결된 연결체인 X-L1를 얻는 단계; 및
(b) 상기 연결체의 반응하지 않은 말단의 반응성 작용기를 F-L2-Y에 연결시켜 X-L1-F-L2-Y를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 (b) 단계는 상기 연결체의 반응하지 않은 말단의 반응성 작용기를 하기 화학식 2의 Fa에 연결시키는 것을 특징으로 한다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000006
여기에서,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn '은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 반응성 작용기는 알데히드기, 말레이미드기 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 알데히드기는 프로피온알데히드기 또는 부틸알데히드기인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 석신이미드 유도체는 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 양 말단의 반응성 작용기는 모두 알데히드기인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데하이드기와 말레이미드기를 반응성 작용기로 갖는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데하이드기와 석신이미드기를 반응성 작용기로 갖는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은 하기 화학식 3의 X - L1a - Fa - (L2a1-BTPa1) - ...... - (L2an - BTPan)를 코딩하는 발현 카세트 및 X - L1b - Fb - (L2b1-BTPb1) - ...... - (L2bn ' - BTPbn ')를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 하기 화학식 3의 결합체를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
[화학식 3]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000007
여기에서,
X는 생리활성 물질이고,
L1a 및 L1b는 펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 결합체는 X - L1a - Fa - (L2a1-BTPa1) - ...... - (L2an - BTPan) 및 X - L1b - Fb - (L2b1-BTPb1) - ...... - (L2bn ' - BTPbn')이 융합 단백질 형태로 발현되고 재접힘 과정에서 Fa 및 Fb 간의 결합이 형성되어 상기 결합체를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는, 신규한 뇌 표적 펩타이드이다.
하나의 구체예에서, 상기 뇌 표적 펩타이드 (BTP)는 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 및 85로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 뇌 표적 펩타이드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주세포, 및 이들 중 하나 이상을 포함하는 키트이다.
본 발명의 뇌 표적 펩타이드와 생리활성 물질을 포함하는 뇌 표적 지속형 결합체는 생체 내에서 뇌혈관 장벽을 통과하고, 생리활성을 유지하고, 혈중 반감기가 현저히 증가되는 효과가 있다. 상기 뇌 표적 지속형 결합체는 안정성 역시 개선되어, 뇌 관련 질환의 치료제로 이용될 수 있다. 또한 신규한 뇌 표적 펩타이드를 제공하여, 신규한 뇌 표적 지속형 결합체를 제조하여, 뇌 관련 질환의 치료제로 이용될 수 있다.
도 1은 뇌 표적 펩타이드들의 뇌 혈관 장벽 (blood brain barrier) 통과 정도를 확인하기 위한 통과세포외배출 (transcytosis) 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 뇌 표적 펩타이드들의 뇌 혈관 장벽 통과 정도를 마우스에서 뇌 분포 실험을 수행하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 뇌 표적 펩타이드들과 면역글로불린 Fc 영역 단독의 뇌 혈관 장벽 통과 정도를 확인한 도이다.
도 4는 생리 활성 물질인 GIP 유도체를 포함하는 뇌 표적 지속형 결합체의 뇌 혈관 장벽 통과 정도를 확인하기 위한 통과세포외배출 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 생리 활성 물질인 이두설파제를 포함하는 뇌 표적 지속형 결합체에서 생리 활성 물질인 이두설파제의 생리 활성 유지 여부를 확인한 도이다.
도 6은, 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결되어 있는 융합 단백질의 뇌 분포 (brain distribution)를 확인한 도이다.
도 7은 재조합 단백질 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22의 SDS-PAGE 확인 결과를 나타낸다.
도 8은 이두로네이트 2-설파타제-10kDa PEG-Fc-BTP28 결합체의 SDS-PAGE 확인 결과를 나타낸다.
도 9는 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질 및 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체의 in vitro 효소 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질의 뇌 조직 분포를 확인한 도이다.
도 11은 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체의 생체 내 효능을 확인한 실험 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반을 통하여, 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한, Dap (다이아미노프로피오닉산, diaminopropionic acid) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한, 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
본 발명을 구현하기 하나의 양태는 뇌 표적 펩타이드와 생리 활성 물질을 포함하는 뇌 표적 지속형 결합체를 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 뇌 표적 지속형 결합체는 면역글로불린 Fc 영역을 중심으로, 각각 펩타이드성 링커 및/또는 비펩타이드성 링커에 의해 연결된 뇌 표적 펩타이드 및 생리 활성 물질이 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체는 생리 활성 물질이 아닌 면역글로불린 Fc 영역에 뇌 표적 펩타이드가 펩타이드성 링커 (펩타이드 결합을 통한 직접 융합을 포함한다) 또는 비펩타이드성 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 보다 구체적인 양태는, 하기 화학식 1을 갖는 뇌 표적 지속형 결합체를 제공한다:
[화학식 1]
X-L1-F-L2-Y
여기에서,
X는 생리 활성 물질이며,
Y는 뇌 표적 펩타이드이고,
L1 및 L2는 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
L1 및 L2가 펩타이드성 링커일 때, 상기 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하며,
F는 FcRn 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 불변 영역임.
이와 같은 본 발명의 지속형 결합체 형태는 Fc 영역을 중심으로 뇌 표적 펩타이드와 생리 활성 물질이 결합된 것을 특징으로 한다.
구체적으로는, 면역글로불린 Fc 영역에 결합하는 뇌 표적 펩타이드는 면역글로불린 Fc 영역과 펩타이드성 링커로 결합하고, 생리 활성 물질은 비펩타이성 링커로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 혹은 뇌 표적 펩타이드와 생리 활성 물질 모두 면역글로불린 Fc 영역에 펩타이드성 링커로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
뇌 표적 펩타이드와 생리 활성 물질 두 종류 모두 펩타이드성 링커 및/또는 비펩타이드성 링커로 결합할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 펩타이드성 링커는 0개 내지 1000개의 아미노산을 포함하는 링커일 수 있으나, 본 발명의 결합체를 형성할 수 있는 펩타이드성 링커는 제한 없이 포함된다. 상기 펩타이드성 링커가 0개의 아미노산을 포함하는 경우, 이는 펩타이드 결합 형태의 연결일 수 있다.
상기 뇌 표적 지속형 결합체의 화학식 1의 F-L2-Y는 하기 화학식 2로 표시되는 구조인 것인, 뇌 표적 지속형 결합체일 수 있다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000008
여기에서,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되어 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn '은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 2에서 각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn '은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며, 이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 뇌 표적 지속형 결합체에서, 상기 L1은 Fa의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것일 수 있다.
상기 화학식 2의 뇌 표적 지속형 결합체에서, n=n'이고 각각 L2a1 = L2b1, ······, L2an = L2bn '과 BTPa1 = BTPb1, ······, BTPan = BTPbn '의 조건을 만족할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조일 수 있다. 즉, 상기 결합체는 하기 화학식 3으로 표시되는 것일 수 있다:
[화학식 3]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000009
여기에서,
X는 생리 활성 물질이고,
L1a 및 L1b는 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn '은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 3에서 각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn '은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며, 이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 화학식 3에서 각 L은 펩타이드성 링커로서 상기 화학식 3으로 표시되는 결합체는 융합 단백질 형태일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 3에서 상기 L1a 및 L1b는 각각 Fa 및 Fb의 N-말단에 연결된 것이고/것이거나, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것이고/것이거나, 상기 L1a 및 L1b는 각각 X-의 C-말단에 연결된 것이고/것이거나, 상기 L2a1 및 L2b1는 이에 연결되는 뇌 표적 펩타이드 (BTP)의 N-말단에 연결된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 4로 표시되는 구조일 수 있다:
[화학식 4]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000010
여기에서,
X는 생리 활성 물질이고,
L1은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn '은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 4에서 각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn '은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며, 이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 4에서 L1은 Fa의 N-말단에 연결된 것이고/것이거나, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것이고/것이거나, L1은 X의 N-말단에 연결된 것이고/것이거나, L2a1 및 L2b1는 각각 이에 연결되는 뇌 표적 펩타이드 (BTP)의 N-말단에 연결된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 화학식(들)에서, n=n'이고, 각각 L2a1 = L2b1, ······, L2an = L2bn '과 BTPa1 = BTPb1, ······, BTPan = BTPbn '의 조건을 만족하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 n 및 n'가 각각 독립적으로 2 이상의 자연수일 경우, 동일하거나 다른 종류의 뇌 표적 펩타이드가 2개 이상 연결되어 있는 것일 수 있으며, 상기 2이상의 뇌 표적 펩타이드는 종렬 (tandem)로 연결되어 있는 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 n 및 n'은 1 또는 2이상의 자연수일 수 있으며, n 및 n'은 동일한 자연수이거나, 서로 상이한 자연수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. n 및 n'은 1 내지 10, 또는 1 내지 5일 수 있으며, 그 예로, 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있으나, 본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체의 한 모이어티(moiety)를 구성하는 일 부분으로 결합된 Fc 영역 및 생리 활성 물질을 BBB를 통과하여, 뇌로 전달시킬 수 있는 개수는 제한없이 포함된다.
상기 화학식 1에서 F는 Fa 및 Fb이며, L2-Y는 (L2a-Ya)n 및 (L2b-Yb)n'로서, 상기 결합체는 하기 화학식 5로 표시되는 것일 수 있다::
[화학식 5]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000011
여기에서,
상기 X는 생리 활성 물질이며,
L1은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며, 구체적으로는 비펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
Ya 및 Yb는 뇌 표적 펩타이드로, 이들은 서로 같거나 다른 종류이고,
L2a 및 L2b 각각은 펩타이드성 링커로, 상기 L2a 및 L2b는 서로 같은 종류 또는 다른 종류이며,
n 및 n'은 각각 독립적으로 1이상의 자연수임.
상기 n 및 n'가 각각 독립적으로 2 이상의 자연수일 경우, 동일하거나 다른 종류의 뇌 표적 펩타이드가 2개 이상 연결되어 있는 것일 수 있으며, 상기 2이상의 뇌 표적 펩타이드는 종렬 (tandem)로 연결되어 있는 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 n 및 n'은 1 또는 2이상의 자연수일 수 있으며, n 및 n'은 동일한 자연수이거나, 서로 상이한 자연수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. n 및 n'은 1 내지 10, 또는 1 내지 5일 수 있으며, 그 예로, 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 뇌 표적 지속형 결합체는 L1에 의해 X의 N-말단 영역 및 F의 N-말단 영역이 연결된 것이고, L2에 의해 Y의 N-말단 영역 및 F의 C-말단 영역이 연결된 것일 수 있다. 또한, 상기 뇌 표적 지속형 결합체는 L1의 일 말단은 X의 라이신 잔기 또는 시스테인 잔기 등에, L1의 다른 말단은 F의 N-말단 영역에 연결된 것이고, L2에 의해 Y의 N-말단 영역 및 F의 C-말단 영역이 연결된 형태일 수 있다.
상기 뇌 표적 지속형 결합체의 L1은 F의 N-말단 영역에 연결되고, L2는 F의 C-말단 영역에 연결된 것일 수 있으며, 상기 L1은 Fa의 N-말단 영역에 연결된 것이고, L2a 및 L2b는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단 영역에 연결된 것일 수 있다. 상기 L1은 X의 아민기 또는 티올기에 연결된 것일 수 있으며, L1은 X의 N-말단 아민기, 라이신의 측쇄에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 측쇄에 위치한 -SH 기 (티올기)에 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "N-말단 영역"은 펩타이드 또는 단백질의 아미노 말단을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 비펩타이드성 링커를 비롯한 링커와 결합할 수 있는 위치를 말한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, N-말단 영역의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 N-말단 주위의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "C-말단 영역"은 펩타이드 또는 단백질의 카르복실 말단을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 비펩타이드성 링커를 비롯한 링커와 결합할 수 있는 위치를 말한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, C-말단 영역의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 C-말단 영역 주위의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 1에서 X는 Xa 및 Xb이고, L1은 L1a 및 L1b이며, F는 Fa 및 Fb이며, L2-Y는 (L2a-Ya)n 및 (L2b-Yb)n'로서, 상기 결합체는 하기 화학식 6으로 표시되는 것일 수 있다:
[화학식 6]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000012
여기서, 상기 X는 생리 활성 물질이고,
L1a 및 L1b은 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며, 구체적으로는 펩타이드성 링커이며,
상기 펩타이드성 링커는 0개 내지 1000개의 아미노산을 포함할 수 있으며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
Ya 및 Yb는 뇌 표적 펩타이드로, 이들은 서로 같거나 다른 종류이고,
L2a 및 L2b 각각은 펩타이드성 링커로, 상기 L2a 및 L2b는 서로 같은 종류 또는 다른 종류이며,
n 및 n'은 각각 독립적으로 1이상의 자연수임.
상술한 화학식(들)에서 상기 n 및 n'은 1 내지 5, 즉 1, 2, 3, 4, 또는 5일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 여기서 n=n'일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 L1, L1a, 또는 L1b는 X의 N-말단 아민기, 라이신의 측쇄에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 측쇄에 위치한 -SH 기 (티올기)에 연결된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상술한 화학식(들)에서 상기 n=n'이고, 각각 L2a1 = L2b1, ······, L2an = L2bn', BTPa1 = BTPb1, ······, BTPan = BTPbn' 의 조건을 만족할 수 있으며, 이때 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn '은 펩타이드성 링커일 수 있거나; 또는 상기 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상술한 화학식(들)에서 상기 n=n'이고, BTPa1 ≠ BTPb1, ······, BTPan ≠ BTPbn ' 중 어느 하나의 요건을 만족하는 것일 수 있으며, 예컨대 각각 L2a1 ≠ L2b1, ······, L2an ≠ L2bn ', BTPa1 ≠ BTPb1, ······, BTPan ≠ BTPbn ' 및 a≠b의 조건을 만족할 수 있으며, 이때 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn '은 펩타이드성 링커일 수 있거나; 또는 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn '은 펩타이드성 링커일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 뇌 표적 지속형 결합체는 유전자 수준에서 융합된 융합단백질로, 상기 L1은 X의 C-말단 영역, 구체적으로는 L1a 및 L1b는 각각의 X의 C-말단 영역에 연결된 것이고, L2a 및 L2b는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단 영역에 연결된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 뇌 표적 지속형 융합단백질에서, 상기 L1 (L1a 및 L1b) 및 L2 (L2a 및 L2b)는 펩타이드성 링커이다. 그 예로, (GS)m, (GGS)m, (GGGS)m, 또는 (GGGGS)m이며, m은 1 내지 10일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "뇌 표적 지속형 결합체"는 뇌 표적 펩타이드 및 생리활성 물질을 포함하며, 면역글로불린 불변 영역을 포함하고 FcRn 결합 부위을 갖는 물질에 뇌 표적 펩타이드 및 생리활성 물질이 각각 직간접적으로 연결된 구조를 가지는 결합체를 말한다. 본 발명에서, "뇌 표적 지속형 효소 결합체"는 "뇌표적 지속형 결합체" 또는 "지속형 결합체"와 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 지속형 결합체는 "지속성 결합체"와 혼용될 수 있으며, 상기 지속형 결합체에 포함되는 생리활성 물질이, 생리활성 물질의 활성 지속 시간을 늘려 줄 수 있는, 면역글로불린 불변 영역을 포함하며 FcRn 결합부위를 갖는 생체 적합성 물질과 상기 0개 내지 1000개의 아미노산을 포함하는 펩타이드성 링커 및/또는 비펩타이드성 링커와 결합한 물질을 의미한다.
상기 뇌 표적 지속형 결합체는 뇌 혈관 장벽을 통과하여, 뇌 조직 내로 생리활성 물질을 전달할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 뇌 표적 지속형 결합체를 구성하는 요소들을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서, "뇌 표적 펩타이드"는 뇌 혈관 장벽을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 또는 단백질, 또는 항체를 포함한다. 상기 뇌 표적 펩타이드는 본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체를 구성하는 하나의 모이어티에 해당한다.
또한, 상기 뇌 표적 펩타이드는 공지의 펩타이드, 단백질, 또는 항체로부터 분리된 일부 서열로서, BBB를 통과하여 뇌 혈관 장벽을 통과할 수 있는 활성을 보유한 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "아미노산"은 임의의 자연-발생 또는 비-자연 발생 또는 합성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 모이어티(moiety), 다시 말하면, 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 탄소 원자, 전형적으로, 1개의 (α) 탄소원자에 의해 직접적으로 연결된 적어도 하나의 카르복실 잔기와 적어도 하나의 아미노 잔기를 포함하는 임의의 모이어티를 의미한다.
본 발명의 뇌 표적 펩타이드는 수동전달(passive transport)에 의한 경로 또는 수용체 매개 전달(receptor-mediated transport)에 의한 경로를 통해 뇌 혈관 장벽을 통과하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 예로 뇌 혈관 장벽을 통과할 수 있는 펩타이드, 단백질 또는 항체로 특별히 그 종류 및 크기에 제한을 두지 않는다.
한편, 상기 뇌 표적 펩타이드는 수용체 매개 전달에 의한 경로를 통해 뇌혈관 장벽을 통과하는 것일 수 있다.
한편, 상기 뇌 표적 펩타이드는 수용체 매개 전달에 의한 경로를 통해 뇌 혈관 장벽을 통과하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 뇌 표적 펩타이드는 인슐린 수용체(insulin receptor); 트랜스페린 수용체(transferrin receptor); 저밀도 지질단백질 수용체(low density lipoprotein receptor); 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질(Low density lipoprotein receptor-related protein); 렙틴 수용체(leptin receptor); 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor); 글루타티온 수송체(Glutathione transporter); 칼슘의존성 칼륨통로(calcium-activated potassium channel); 및 RAGE (receptor for advanced glycation endproducts); 및 상기 수용체들의 리간드, 및 상기 수용체 또는 리간드에 결합하는 항체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 통하여 수용체 매개 전달 경로에 의해 뇌 혈관 장벽을 통과할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 이러한 경로를 통해 뇌혈관 장벽을 통과하는 펩타이드, 단백질, 항체로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 또는, 상기 펩타이드, 단백질, 또는 항체로부터 분리된 일부 펩타이드 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 서열번호 2의 HAITYPRH 펩타이드(BTP1 펩타이드), 서열번호 4의 THR 펩타이드 (BTP2 펩타이드), 서열번호 6의 Angiopep-2 펩타이드 (BTP3 펩타이드), 서열번호 8의 ApoB 펩타이드 (BTP4 펩타이드), 서열번호 10의 ApoE 펩타이드(BTP5 펩타이드) 등의 펩타이드가 이용될 수 있으나, 본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체에 포함되어, 결합된 F-L2-Y 구조체를 BBB를 통과하여 뇌 내로 전달 시킬 수 있는 펩타이드는 제한 없이 포함된다.
또 하나의 구체예로서, 서열번호: 20의 BTP6 펩타이드, 서열번호: 22의 BTP7 펩타이드, 서열번호: 24의 BTP8 펩타이드, 서열번호: 26의 BTP9 펩타이드, 서열번호: 28의 BTP10 펩타이드, 서열번호: 30의 BTP11 펩타이드, 서열번호: 32의 BTP12 펩타이드, 서열번호: 34의 BTP13 펩타이드, 서열번호: 36의 BTP14 펩타이드, 서열번호: 38의 BTP15 펩타이드, 서열번호: 40의 BTP16 펩타이드, 또는 서열번호: 85의 BTP17 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 구체예로서, 상기 뇌 표적 펩타이드는
(1) Angiopep-2 : TFFYGGSRGKRNNFKTEEY-OH (서열번호: 41),
(2) ApoB(3371-3409) : SVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGS (서열번호: 42),
(3) ApoE(159-167)2 : (LRKLRKRLL)2 (서열번호: 10),
(4) 펩타이드-22 : Ac-C(&)MPRLRGC(&)-NH2 (서열번호: 43),
(5) THR : THRPPMWSPVWP-NH2 (서열번호: 44),
(6) THR retro- enantio : pwvpswmpprht-NH2 (서열번호: 45),
(7) CRT : C(&)RTIGPSVC(&)(서열번호: 46),
(8) Leptin 30 : YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVL(서열번호: 47),
(9) RVG29 : YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG-OH(서열번호: 48)
(10) DCDX : GreirtGraerwsekf-OH (서열번호: 49)
(11) Apamin : C(&1)NC(&2)KAPETALC(&1)-ARRC(&2)QQH-NH2 (서열번호: 50),
(12) MiniAp-4 : [Dap](&)KAPETALD(&)(서열번호: 51),
(13) GSH : γ-L-glutamyl-CG-OH
(14) G23 : HLNILSTLWKYRC(서열번호: 52),
(15) g7 : GFtGFLS(O-β-Glc)-NH2 (서열번호: 53),
(16) TGN : TGNYKALHPHNG (서열번호: 54),
(17) TAT(47-57) : YGRKKRRQRRR-NH2 (서열번호: 55),
(18) SynB1 : RGGRLSYSRRRFSTSTGR (서열번호: 56),
(19) Diketopiperazines : &(N-MePhe)-(N-MePhe)Diketopiperazines, 또는
(20) PhPro : (Phenylproline)4-NH2(서열번호: 57)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열에서 &은 J. Pept. Res., 2005, 65, 550-555 (J.Spengler et al.)에 기재된 고리형 펩타이드에 대한 명명법에 따른 기호로서, '&'은 연결 위치(connecting point)를 말한다. 예를 들어, 단일 쇄에서 첫 번째로 기재된 '&'은 화학 결합의 일 말단의 위치를, 두 번째로 기재된 '&'은 상기 화학 결합이 부착되는 부위를 말한다. 예컨대, "&Ala-Ala-Phe-Leu-Pro&"은 알라닌과 프롤린 간에 화학 결합이 형성되어 고리형 펩타이드를 형성함을 나타낸다. 2 이상의 화학 결합이 존재할 경우, 해당 화학 결합이 형성되는 위치를 나타내기 위하여 &1, &2와 같은 기호를 사용할 수 있다. 예를 들어, &1Asp(&2)-Trp-Phe-Dpr(&2)-Leu-Met&1과 같이 표시된 경우, Asp 및 Met 간에 화학 결합이 형성되고, Asp 및 Dpr 간에 화학 결합이 형성되는 것을 말한다. 한편, [Dap]은 다이아미노프로피오닉산(diaminopropionic acid)을 나타낸다.
본 발명에서, "생리 활성 물질"은 상기 뇌 표적 지속형 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 생체 내에서 어떤 생리 작용을 가지는 물질을 총칭하는 개념으로서, 다양한 생리활성을 가진다. 상기 생리활성 물질인 X는 2개 내지 1000개의 아미노산, 2개 내지 950개, 2개 내지 900개, 2개 내지 850개, 2개 내지 800개, 2개 내지 750개, 2개 내지 700개, 5개 내지 700개 의 아미노산, 5개 내지 650개, 5개 내지 600개, 5개 내지 550개, 5개 내지 500개, 5개 450개, 5개 400개, 5개 내지 350개, 5개 내지 300개, 5개 내지 250개, 5개 내지 200개, 5개 내지 150개, 5개 내지 100개, 5개 내지 90개, 5개 내지 80개, 5개 내지 70개, 5개 60개, 5개 내지 50개, 5개 내지 40개, 5개 내지 30개, 5개 내지 25개, 또는 5개 내지 20개 내외로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 생리 활성 물질을 구성하는 폴리펩타이드는 펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 모두 포함한다.
상기 생리활성 물질은 톡신 또는 생리활성 폴리펩타이드일 수 있고, 인간의 질병을 치료 또는 예방할 목적으로 사용되는 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원, 수용체 안타고니스트, 당뇨 및 비만에 치료효과를 보이는 소장 및 췌장에서 분비되는 생리활성 펩타이드, GPCR (G protein-coupled receptors) 아고니스트 혹은 안타고니스트 등과 같은 다양한 생리활성 폴리펩타이드, 이들의 아날로그들을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "X의 아날로그"는 X와 동일한 종류의 활성을 나타낼 수 있는 물질로서, X의 아고니스트(agonist), X의 유도체(derivatives), X의 단편(fragments), X의 변이체(variants) 등을 모두 포함한다.
구체적으로 톡신은 암세포 사멸에 효과적인 메이탄신 (maytansine) 및/또는 이의 유도체, 오리스타틴 (auristatin) 및/또는 그 유도체, 듀오카마이신 (duocarmycin) 및/또는 그 유도체, PBD (pyrrolobenzodiazepine) 및/또는 그 유도체 중에서 선택될 수 있으나, 암세포 사멸에 효력을 보이는 톡신은 제한 없이 포함된다.
구체적으로, 생리활성 폴리펩타이드는 GLP-1 수용체 아고니스트, 글루카곤 수용체 아고니스트, GIP (Gastric inhibitory polypeptide) 수용체 아고니스트, FGF (Fibroblast growth factors) 수용체 아고니스트 (FGF1, FGF19, FGF21, FGF23 등), 콜레시스토키닌 (Cholecystokinin) 수용체 아고니스트, 가스트린 (gastrin) 수용체 아고니스트, 멜라노코르틴 (melanocortin) 수용체 아고니스트, 인간 성장호르몬, 성장호르몬 방출 호르몬, 성장호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류와 인터페론 수용체류 (예: 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 수용성 타입 I 인터페론 수용체 등), 콜로니 자극인자, 인터루킨류(예: 인터루킨-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30 등)와 인터루킨 수용체류(예: IL-1 수용체, IL-4 수용체 등), 효소류 (예: 베타글루코시다제 (beta-glucosidase), 알파갈락토시다제 (alpha-galactosidase), 베타갈락토시다제 (beta-galactosidase), 이두로니다제 (iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제 (Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제 (acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제 (acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제 (acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제 (galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 (arylsulfatase) A, B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, B, 헤파린-N-설파타제 (heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제 (alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제 (beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 (N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파아제 (lipase), 우리카제 (Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제 (Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase), 알파-갈락토시다제-A, 아갈시다제 알파(agalsidase alpha), 베타, 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase), 뷰티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파제(lipase), 유리케이즈(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤라제(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 및 마이엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase) 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질류(예: IL-18bp, TNF-결합 단백질 등), 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin), 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포이에틴류(angiopoietin), 헤모글로빈, 트롬빈(thrombin), 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린(thrombomodulin), 혈액인자 VII, 혈액인자 VIIa, 혈액인자 VIII, 혈액인자 IX, 혈액인자 XIII, 플라즈미노겐 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘(hirudin), 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴(angiostatin), 안지오텐신(angiotensin), 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌(elcatonin), 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor), 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류(예: 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(cilliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neurophil inhibitor factor), 신경영양인자, 뉴트린(neuturin), 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 시크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신(autotaxin), 락토페린(lactoferrin), 미오스타틴(myostatin), ADNP(activity-dependent neuroprotective protein), BACE1(beta-secretase1), APP(Amyloid Precursor Protein), NCAM(Neural cell adhesion molecule), 아밀로이드 베타(Amyloid beta), 타우(Tau), RAGE(receptor for advanced glycation endproducts), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), 또는 이들의 아고니스트 또는 안타고니스트, 이들의 수용체류(예: TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, B 세포 활성인자 수용체 등), 수용체 길항물질(예: IL1-Ra 등), 세포표면항원(예: CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류(예: scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd), 바이러스 유래 백신 항원, 하나 이상의 수용체 아고니스트를 활성화 시키는 하이브리드 폴리펩타이드 혹은 키메릭 (chimeric) 폴리펩타이드 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "이두로네이트 2-설파타제(iduronate-2-sulfatase)"는, 헌터 증후군(Hunter syndrome, MPS-II)에 관계된 설파타제 효소로서, 헤파란 설페이트(heparin sulfate) 및 데르마탄 설페이트(dermatan sulfate)의 리소좀 분해에 필요한 효소이다. 본 발명의 한 구체적인 형태에서는 "이두로네이트 2-설파타제(iduronate-2-sulfatase)"로 사람 이두로네이트 2-설파타제의 한 정제 형태인 "이두설파제(idursulfase)"를 사용할 수 있으며, 상기 이두로네이트 2-설파타제에 포함됨은 자명하다. 상기 이두설파제는 예를 들어 이두설파제 알파 또는 이두설파제 베타일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 이두로네이트 2-설파타제 효소는 당업계에서 알려진 방법으로 준비 또는 제조할 수 있으며, 구체적으로, 동물세포 발현 벡터를 삽입한 동물세포를 배양하여, 배양물로부터 정제할 수 있고, 또는 상업적으로 이용 가능한 효소를 구입하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 적용 가능한 생리활성 폴리펩타이드는 천연형이거나, 대장균과 같은 원핵세포나 효모세포, 곤충세포 또는 동물세포와 같은 진핵세포에서 유전자 재조합에 의해 생산된 것일 수 있으며, 또한 천연형과 동등한 활성 또는 동종의 활성을 보유하는 아날로그일 수 있으며, 예컨대 하나 이상의 아미노산 위치에서 돌연변이가 일어난 유도체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 상기 GLP-1 수용체 아고니스트는 천연형 엑센딘-4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 제거된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 디메틸기로 수식된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산(히스티딘)의 알파 탄소를 제거 (deletion)한 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(라이신)이 세린으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 및 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(라이신)이 알지닌으로 치환된 엑센딘-4 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 하나의 구체예로서, 생리활성 물질이 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드의 면역글로불린 Fc 영역에 상호결합으로 결합된 것을 특징으로 하는, 뇌 표적 지속형 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명에서 "F"는 면역글로불린 불변 영역을 포함하며, FcRn 결합부위를 포함하는 물질을 말한다. 구체적으로, 본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체를 구성하는 하나의 모이어티에 해당한다. 그 예로, 상기 F는 FcRn 결합부위를 함유하는 면역글로불린 Fc 영역일 수 있다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에, 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드 결합체는 면역글로불린 Fc 영역과 펩타이드 결합으로 연결되어 발현 숙주에서 지속형 결합체로 생산된다. 발현 숙주는 외부 유전자로 형질전환시켜 단백질을 생산할 수 있는 대장균과 같은 미생물일 수 있으며, 효모, 곤충세포, 동물세포등 제한이 없다.
본 발명에서, "면역글로불린 불변영역"은 뇌 표적 지속형 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2 (CH2)및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함한다. 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다.
상기 면역글로불린 불변 영역은 면역글로불린 Fc 영역일 수 있다.
상기 F의 면역글로불린 불변 영역은 면역글로불린 CH1, CH2, CH3, 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 도메인을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 면역글로불린 불변영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합 (예컨대, CH2 도메인과 CH3 도메인 그리고 힌지 영역 (또는 그 일부)와의 조합), 6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 본 발명의 힌지 영역은 천연의 힌지 영역 뿐 아니라, 공지의 힌지 영역의 일부를 모두 포함한다.
구체적으로, 상기 F의 면역글로불린 불변 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO97/34631호, 국제특허공개 제WO96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 면역글로불린 불변 영역 유도체는 본 발명의 면역글로불린 불변 영역 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 면역글로불린 불변 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
예컨대, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 사슬 교환 기능이 일어나지 않을 수 있는 것일수 있다.
또한, 상기 F, 구체적으로 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬 두 개가 서로 이황화 결합으로 연결된 이량체 형태일 수 있다.
상기 면역글로불린 Fc 영역을 구성하는 힌지 영역은 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 필수적으로 구성되는 것이거나, 혹은 상기 서열번호: 14의 아미노산 서열에서 2 번째 아미노산인 세린(Ser, S)이 프롤린 (Pro, P)으로 변이된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 면역글로불린 Fc 영역을 구성하는 CH2 도메인은 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 필수적으로 구성되는 것이거나, 혹은 상기 서열번호: 15의 아미노산 서열에서 67번째 아미노산인 아스파라긴 (Asn, N)이 글루타민 (Gln, Q)으로 변이된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
보다 더 구체적으로, 상기 F는 IgG 유래의 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬 두 개가 서로 이황화 결합으로 연결된 이량체 형태로서, 상기 힌지 영역이 서열번호: 14의 아미노산 서열, 혹은 상기 서열번호: 14의 아미노산 서열에서 2 번째 아미노산인 세린(Ser, S)이 프롤린 (Pro, P)으로 변이된 서열을 포함하고/하거나 상기 CH2 도메인이 서열번호: 15의 아미노산 서열 또는 상기 서열번호: 15의 아미노산 서열에서 67번째 아미노산인 아스파라긴 (Asn, N)이 글루타민 (Gln, Q)으로 변이된 서열을 포함하고/하거나 CH3 도메인이 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
구체적으로, 상기 F를 구성하는 면역글로불린 불변영역을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호: 105에서 2번째 아미노산이 프롤린으로 치환되거나; 71번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나; 또는 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 F를 구성하는 면역글로불린 불변영역을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 이러한 면역글로불린 불변 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 불변 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 불변 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 면역글로불린 불변 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합 (combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 그 예로 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래일 수 있으며, 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래일 수 있다. 한편, 본 발명에서 조합(combination)이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 그 예로, IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 구체적인 예로, 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 실시 형태의 한 예로 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 화학식 1의 "L1 및/또는 L2"는 상기 뇌 표적 지속형 결합체의 모이어티 (moiety)를 이루는 일 구성요소로, 면역글로불린 Fc 영역에 뇌 표적 펩타이드 또는 생리활성 물질을 결합시키는 링커를 의미한다. 상기 링커(linker)란 기본적으로는 두 개의 융합 파트너를 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미한다. 링커는 융합 파트너를 연결하는 역할 외에도 융합 파트너 사이에 일정한 크기의 간격을 부여하는 역할을 수행하거나, 유연성 또는 강직정을 제공하는 역할을 수행할 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 구체예로서, 상기 화학식 1의 L1 및 L2 중 하나는 펩타이드성 링커이고, 또 다른 하나는 비펩타이드성 링커인 것을 특징으로 할 수 있다. 또는, 상기 L1 및 L2 중 하나는 펩타이드성 링커이고, 또 다른 하나는 비펩타이드성 링커일 수 있고, 상기 L1 및 L2 모두가 펩타이드성 링커일 수 있으며, 다른 한편으로는 상기 L1 및 L2 중 모두가 비펩타이드성 링커일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 구체예로서, 상기 화학식 1의 상기 L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 비펩타이드성 링커일 때, 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히알루론산, 지방산, 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 구체예로서, 상기 L1은 비펩타이드성 링커이고, L2는 펩타이드성 링커일 때, 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 또 하나의 구체예로서, 상기 L1은 비펩타이드성 링커이고, L2는 펩타이드성 링커로 0개의 아미노산을 포함하는 것일 경우 F와 뇌 표적 펩타이드인 Y는 직접 융합 (예, 펩타이드 결합)에 의해 형성될 수 있다.
또 하나의 구체예로서, 상기 화학식 1의 상기 L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, 상기 X와 F, 또는 F와 Y는 공유 화학결합, 비공유 화학결합 또는 이들의 조합으로 L1 및 L2에 의해 서로 결합되고, L1 및 L2가 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다. 펩타이드성 링커가 0개의 아미노산 일 경우는 공유 화학결합인 펩타이드 결합에 의해 결합된 것일 수 있다.
또 하나의 구체예로서, 상기 화학식 1의 L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, L1 및 L2는 0개의 아미노산으로 이루어진 것으로, (i) X와 F, 또는 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것이고; 또는 (ii) X와 F, 및 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 "펩타이드성 링커"는 두 개의 융합 파트너를 연결하는 펩타이드 결합 또는 아미노산의 중합체를 포함한다. 구체적으로, 상기 펩타이드성 링커는 0개 내지 1000개의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 0개 내지 900개, 0개 내지 800개, 0개 내지 700개, 0개 내지 600개, 0개 내지 500개, 0개 내지 400개, 0개 내지 300개, 0개 내지 250개, 0개 내지 200개, 0개 내지 150개, 0개 내지 100개, 0개 내지 90개, 0개 내지 80개, 0개 내지 70개, 0개 내지 60개, 0개 내지 50개, 0개 내지 40개, 0개 내지 30개, 0개 내지 25개, 0개 내지 20개, 0개 내지 15개, 또는 0개 내지 10개의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 펩타이드성 링커의 예로는, GGGGS (서열번호: 58) 모티프, GS 모티프, GGGS (서열번호: 59) 모티프, 또는 GGSG (서열번호: 60) 모티프가 반복되는 형태의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 들 수 있으며, 상기 모티프가 1 내지 10번 반복될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 L2가 펩타이드성 링커인 경우, L2는 (GS)m, (GGS)m, (GGGS)m, 또는 (GGGGS)m이며, m은 1 내지 10일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 구체예로서, 상기 화학식 1의 L1 및 L2 중 어느 하나는 펩타이드성 링커이고, 이 중 다른 하나는 비펩타이드성 링커일 때, 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 링커이며, 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 할 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 "비펩타이드성 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체적합성 링커를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
또 하나의 구체예로서, 상기 비펩타이드성 링커 및 X 및 Y는 각각의 반응기에 의해 연결되고, 이때 비펩타이드성 링커의 반응기가 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드 유도체(succinimide derivative)로 이루어진 군이 선택되는 것일 수 있다. 상기 L1은 양 말단 작용기를 가지는 비펩타이드성 중합체이고, 상기 양 말단 작용기는 각각 아민 반응기 (amine-reactive group) 또는 티올 반응기 (thiol-reactive group)이고, 상기 양 말단 작용기는 서로 같은 종류이거나, 다른 종류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용 가능한 비펩타이드성 링커인 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히알루론산, 올리고뉴클에오타이드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 그 예로 폴리에틸렌글리콜일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 링커는 생체 내 단백질 분해 효소에 저항성 있는 중합체이면 제한 없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 0 초과 약 100 kDa 범위, 그 예로 약 0.5 내지 약 100 kDa, 약 1 내지 약 100 kDa 범위, 또는 약 1 내지 약 20 kDa 범위이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 비펩타이드성 링커는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
한편, 본 발명에 사용되는 비펩타이드성 링커인 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 물질이 공유결합을 형성할 수 있도록, 결합체를 형성하기 전, 비펩타이드성 링커는 F 및 X 또는 Y의 작용기와 결합될 수 있는 작용기를 보유할 수 있다.
구체적으로, 상기 비펩타이드성 링커는 적어도 2개의 말단 작용기를 가질 수 있으며, 구체적으로는 2개 또는 3개의 말단 작용기를 가질 수 있고, 보다 더 구체적으로는 2개의 말단 작용기를 가질 수 있다.
상기 작용기는 알데히드기, 말레이미드기 및 석시니미드 유도체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 알데히드기로 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기를 예로서 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 발레르에이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피온에이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피오네이트, N-하이드록시석시니미드, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비펩타이드성 링커의 양 말단 작용기는 서로 같거나 다를 수 있다.
예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드기를, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 예컨대, 프로피온 알데히드기, 또는 부틸 알데히드기를 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 작용기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 결합체를 제조할 수 있다.
또한, 상기 비펩타이드성 링커의 양 말단 또는 세 말단이 모두 알데히드기인 동종 기능성 비펩타이드성 중합체일 수 있다.
예컨대, 상기 비펩타이드성 링커는 양 말단에 프로피온 알데하이드기를 가지는 비펩타이드성 중합체, 구체적으로 양 말단에 프로피온 알데하이드기를 가지는 PEG일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 비펩타이드성 링커가 양 말단에 반응 알데히드기의 작용기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리 활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 아민화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 작용기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 결합체는 2개의 사슬로 구성되는 면역글로불린 Fc 영역 (단량체 Fc 영역이 결합한 이량체 형태의 Fc 영역)을 가지며 각각에 결합하는 생리활성 물질은 1군데의 면역글로불린 영역 (단량체 Fc 영역)에만 결합되거나 2군데의 면역글로불린 영역 모두(이량체 형태의 Fc 영역 각각)에 결합될 수 있다.
상기 화학 결합은 공유결합일 수 있고, 보다 구체적으로 이황화 결합일 수 있고, 더욱 더 구체적으로는 두 면역글로불린 Fc 영역의 힌지 영역에서 형성되는 이황화 결합일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, (i) 상기한 펩타이드성 링커 (예, 펩타이드 결합)를 통하여 뇌 표적 펩타이드가 한 분자의 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단 부위에 연결된, 제1 면역글로불린 Fc 영역, 및 (ii) 상기한 펩타이드성 링커 (예, 펩타이드 결합)를 통하여 뇌 표적 펩타이드가 한 분자의 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단 부위에 연결된, 제2 면역글로불린 Fc 영역이 화학결합을 통하여 이량체를 형성하고, 이러한 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역 두 분자 중 한 분자의 N-말단 영역에 한 분자의 생리활성 물질이 연결되거나, 또는 두 분자 모두의 N-말단 영역 각각에 생리활성 물질이 하나씩 연결된 형태일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기한 제1 면역글로불린 Fc 영역 및 제2 면역글로불린 Fc 영역은 융합 단백질 형태로서, 면역글로불린 Fc 영역이 뇌 표적 펩타이드와 펩타이드 결합을 통하여 in-frame 융합된 것일 수 있으며, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 제1 면역글로불린 Fc 영역 및 제2 면역글로불린 Fc 영역 간의 화학 결합은 구체적으로 공유결합일 수 있으며, 보다 구체적으로 이황화 결합일 수 있고, 더욱 더 구체적으로는 두 면역글로불린 Fc 영역의 힌지 영역에서 형성되는 이황화 결합일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 결합체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
상기 결합체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 해당 서열과 75% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 본 발명의 범주에 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 핵산 구조물(construct)을 의미한다.
상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체를 수득할 수 있다.
본 발명에서 상기 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.
본 발명에 적합한 숙주는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 뇌 표적 지속형 결합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
하나의 구체예로서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 약제의 제조에 있어서 상기 뇌 표적 지속형 결합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 뇌 표적 지속형 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(a) 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 뇌 표적 지속형 결합체를 회수하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(i) (a) 생리 활성 물질인 X, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L1, 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 F가 결합된, X-L1-F, 및 (b) 뇌 표적 펩타이드인 Y, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L2가 결합된 L2-Y를 제조하는 단계; 및
(ii) 상기 (a) X-L1-F 및 (b) L2-Y를 연결하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
이 때, 또 하나의 구체예로서, 상기 (a)의 L1은 펩타이드성 링커이고, (b)의 L2는 비펩타이드성 링커인 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(i) (a) 생리 활성 물질인 X 및 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L1이 결합된, X-L1, 및 (b) 뇌 표적 펩타이드인 Y, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L2 및 F가 결합된 F-L2-Y를 제조하는 단계; 및
(ii) 상기 (a) X-L1 및 (b) F-L2-Y를 연결하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
이 때, 또 하나의 구체예로서, 상기 (a)의 L1은 비펩타이드성 링커이고, (b)의 L2는 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(a) 양 말단에 각각 같거나 서로 다른 반응성 작용기가 위치하는 비펩타이드성 중합체인 L1의 어느 한 반응성 작용기를 유리된 생리 활성 물질인 X와 반응시켜 상기 말단을 통하여 비펩타이드성 중합체가 생리 활성 물질에 공유결합으로 연결된 연결체인 X-L1를 얻는 단계; 및
(b) 상기 연결체의 반응하지 않은 말단의 반응성 작용기를 F-L2-Y에 연결시켜 X-L1-F-L2-Y를 얻는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 (b) 단계는 상기 연결체의 반응하지 않은 말단의 반응성 작용기를 하기 화학식 2의 Fa에 연결시키는 것일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000013
여기에서,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn '은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
상기 제조 방법에서, 상기 반응성 작용기는 알데히드기, 말레이미드기 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 알데히드기는 프로피온알데히드기 또는 부틸알데히드기일 수 있다.
상기 석신이미드 유도체는 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트일 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단의 반응성 작용기는 모두 알데히드기일 수 있다.
다른 한편으로, 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데하이드기와 말레이미드기를 반응성 작용기로 가질 수 있다.
다른 한편으로, 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데하이드기와 석신이미드기를 반응성 작용기로 가질 수 있다.
상기 제조 방법은 하기 화학식 3의 X - L1a - Fa - (L2a1-BTPa1) - ...... - (L2an - BTPan)를 코딩하는 발현 카세트 및 X - L1b - Fb - (L2b1-BTPb1) - ...... - (L2bn' - BTPbn ')를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 하기 화학식 3의 결합체를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2019003755-appb-I000014
여기에서,
X는 생리 활성 물질이고,
L1a 및 L1b는 펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
여기서, 상기 결합체는 X - L1a - Fa - (L2a1-BTPa1) - ...... - (L2an - BTPan) 및 X - L1b - Fb - (L2b1-BTPb1) - ...... - (L2bn ' - BTPbn ')이 융합 단백질 형태로 발현되고 재접힘 과정에서 Fa 및 Fb 간의 결합이 형성되어 상기 결합체를 형성하는 것일 수 있다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 뇌 표적 펩타이드, 상기 뇌표적 펩타이드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
한편, 상기 뇌 표적 펩타이드는 펩타이드 그 자체, 이의 염 (예컨대, 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함한다.
또한, 뇌 표적 펩타이드는 약학적으로 허용되는 임의의 형태일 수 있다.
상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산， 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.
상기 뇌표적 펩타이드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 해당 서열과 75% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 본 발명의 범주에 포함한다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 결합된 융합 단백질의 제조
면역글로불린 불변 영역을 포함하며, FcRn 결합부위를 갖는 생체 적합성 물질, 뇌 표적 펩타이드 및 생리활성물질이, 펩타이드성 링커로 연결된, 뇌 표적 펩타이드 및 생리활성 폴리펩타이드를 포함하는 지속성 결합체를 제조하기 위해, 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 결합된 융합 단백질을 제조하였다.
이에, 뇌 표적 펩타이드의 예로 5가지 펩타이드를 선택하였다(표 1).
Figure PCTKR2019003755-appb-T000001
결합된 생리활성 폴리펩타이드의 반감기를 증가시킬 수 있는, 생체 적합성 물질로 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역을 선택하였으며, 상기 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드를 유전자 수준에서 융합하여 발현 벡터에 각각 삽입하였다.
상기 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드는 펩타이드 링커로 연결하거나, 직접 융합하는 방식에 의해 구체적으로, 하기와 같은 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 포함된 융합 단백질을 합성하였다(Bioneer에서 합성) (표 2). 하기 표 2의 서열에서 알 수 있듯이, IgG4 Fc 영역의 C-말단에 뇌 표적 펩타이드의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결되거나, 직접 융합하는 방식에 의해 제조된 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 결합된 융합 단백질을 제조하였다.
Figure PCTKR2019003755-appb-T000002
Figure PCTKR2019003755-appb-I000015
Figure PCTKR2019003755-appb-I000016
Figure PCTKR2019003755-appb-I000017
Figure PCTKR2019003755-appb-I000018
Figure PCTKR2019003755-appb-I000019
Figure PCTKR2019003755-appb-I000020
Figure PCTKR2019003755-appb-I000021
Figure PCTKR2019003755-appb-I000022
Figure PCTKR2019003755-appb-I000023
합성된 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드를 코딩하는 유전자는 양쪽 말단에 NdeI과 BamHI를 포함하고 있어 NdeI과 BamHI로 절단한 pET22b 발현 벡터에 삽입하였다. 상기 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드를 코딩하는 유전자가 삽입된 발현벡터를 BL21(DE3)균주에 삽입하여 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결된 지속형 융합 단백질을 발현시켰다.
실시예 2: 뇌 표적 펩타이드 제조
면역 글로불린 Fc 영역에 융합하는 여러가지 뇌 표적 펩타이드를 탐색하기 위해 상기 BTP1 내지 BTP5를 포함하여, 추가적인 뇌 표적 펩타이드를 설계하여 합성하였다(표 3).
Figure PCTKR2019003755-appb-T000003
Figure PCTKR2019003755-appb-I000024
상기 뇌 표적 펩타이드들이 실제로 뇌 표적이 되는지 확인하기 위해 in vitro및 in vivo 시험을 진행 하였다.
실시예 3: 뇌 표적 펩타이드의 통과세포외배출 분석( Transcytosis assay)
뇌 표적 펩타이드들의 뇌 혈관 장벽 (blood brain barrier, BBB) 통과 정도를 확인하기 위해 통과세포외배출 (transcytosis) 실험을 진행 하였다. 인간 뇌 내피세포 (Human cerebral endothelial cells)인 hCMEC/D3 세포를 미소공성의 막 (microporous membrane)위에서 5 X 104 cells/cm2로 10일 동안 배양하였다. BBB 형성이 되었는지 확인하기 위해 FITC-Dextran (70kDa)으로 침투 실험 (penetration test)을 진행하여 밀착연접 (tight junction)이 형성되는 것을 확인한 뒤, 25mM의 FITC-BTP5, FITC-BTP11, FITC-BTP12, FITC-BTP16 그리고 FITC-Exendin4, FITC-P-8 (음성 대조구, P-8)을 hCMEC/D3위에 놓고 2시간, 24시간 후에 FITC의 형광 광도(fluorescence intensity)를 측정하였다(도 1).
그 결과, 모든 BTP들은 Exendin-4와 음성 대조구(P-8)보다 높은 통과를 보였다. 시간이 지남에 따라 BTP5, BTP11, BTP16등의 뇌 표적 펩타이들의 통과가 증가되는 것을 확인 할 수 있었다.
상기와 같은 결과는, 본 발명에서 확인한 뇌 표적 펩타이드들이 효과적으로 BBB를 통과할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 4: 뇌 표적 펩타이드의 뇌 분포 (brain distribution) 확인
뇌 표적 펩타이드들의 뇌 혈관 장벽 (blood brain barrier) 통과 정도를 확인하기 위해 마우스에서 뇌 분포 실험 (brain distribution test)을 진행 하였다. 마우스의 CCA (common carotid artery)를 통해 2 mg/head로 투여한 뒤 마우스의 뇌를 분리한 후 단편으로 잘라 FITC의 형광 (fluorescence)을 이용하여 현미경으로 뇌 표적 펩타이드의 뇌 혈관 장벽 통과 정도를 확인하였다 (도 2).
CCA를 통해 주입된 뇌 표적 펩타이드는 주입 특성상 한쪽의 뇌 영역으로 퍼져야 하는데, 시험 결과 뇌의 한쪽 지역으로 퍼지는 것을 12.5배율의 현미경으로 관찰 할 수가 있었다. 또한, 장기기억에 중요한 역할을 하는 해마체 (hippocampus)의 세포바디가 분포하는 지역에 FITC의 형광이 관찰되는 것을 200배율의 현미경으로 확인 할 수 있었다. 이를 통해 뇌 표적 펩타이드가 뇌 혈관 장벽을 통과하여 뇌 조직으로 들어가는 것을 확인하였다.
이와 같은 결과들은 본 발명의 뇌 표적 펩타이드들이 in vitro 뿐 만 아니라, 실제 생체 내에서도 뇌로의 표적화가 가능함을 시사하는 것으로, 뇌 표적 펩타이드들에 결합된 생리 활성 물질 역시 BBB를 통과하여 효과적으로 뇌로의 전달이 가능함을 시사하는 것이다. 더욱이, 지속형 결합체 형태인 본 발명의 결합체는 생체 내 지속성이 증가하며 이와 같은 지속성이 증가할수록 뇌로의 표적화가 더욱더 효율적으로 수행될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 5: 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드를 포함하는 융합단백질의 발현벡터 제조
추가적인 융합단백질을 발현하기 위해 발현벡터를 제조하였다. 결합된 생리활성 폴리펩타이드의 반감기를 증가시킬 수 있는, 생체 적합성 물질로 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역을 선택하였으며, 상기 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드를 유전자 수준에서 융합하여 발현 벡터에 각각 삽입하였다.
상기 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드는 펩타이드 링커로 연결하거나, 직접 융합하는 방식에 의해 구체적으로, 하기 표 4와 같은 서열을 지니는, 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 이 Fc CH3 영역의 C-말단 방향에 뇌 표적 펩타이드가 펩타이드 결합으로 연결된 융합 단백질들을 합성하였다(한국 바이오니어사에서 합성)(표 4). 하기 표 4의 서열에서 알 수 있듯이, IgG4 Fc 영역의 C-말단에 뇌 표적 펩타이드의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결되거나, 직접 융합하는 방식에 의해 제조된 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 결합된 융합 단백질을 제조하였다.
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합성된 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드를 코딩하는 유전자는 양쪽 말단에 NdeI과 BamHI를 포함하고 있어 NdeI과 BamHI로 절단한 pET22b 발현 벡터에 삽입하였다. 상기 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드를 코딩하는 유전자가 삽입된 발현벡터를 BL21(DE3)균주에 삽입하여 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드 지속형 융합 단백질을 발현시켰다.
실시예 6: 면역글로불린 Fc 영역과 두 개 이상의 뇌 표적 펩타이드가 연결되어 있는 융합단백질의 발현벡터 제조
수용체 결합력을 증가시키기 위한 추가적인 융합단백질을 발현하기 위해 발현벡터를 제조하였다. 결합된 생리활성 폴리펩타이드의 반감기를 증가시킬 수 있는, 생체 적합성 물질로 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역을 선택하였으며, 상기 구축된 발현벡터에 링커와 뇌표적 펩타이드를 유전자 수준에서 부위 특이적 변이 (site-directed mutagenesis) PCR 기법을 이용하여 삽입하였다. 구체적으로는, 표 5에 기재된 서열번호의 프라이머를 이용하여 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단과 뇌 표적 펩타이드의 N-말단 사이 또는 뇌표적 펩타이드의 C-말단과 벡터의 BamH I 이 포함된 부위 사이에 링커와 뇌 표적 펩타이드를 삽입하였다. 상기의 PCR 기법으로 두개 이상으로 복제된 뇌 표적 펩타이드를 포함하는 융합 단백질 (표 6)을 발현하는 발현벡터를 구축하였다. 이 융합 단백질들은 표 6에 나타낸 서열을 지니는데, 예를 들어 Fc-BTP22 결합체는 상기 표 2의 BTP5 펩타이드 두 단위가 링커를 개재하여 Fc 절편의 CH3 영역의 C-말단 방향에 펩타이드 결합하고 있다. 구체적으로 하기 표 6에서 확인할 수 있듯이, 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단과 뇌 표적 펩타이드의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결되거나, 직접 융합하는 방식에 의해 제조되었다. 이 경우 뇌 표적 펩타이드는 종렬(tandem)로 연결되는 2개 이상의 뇌 표적 펩타이드는 1 단위의 뇌 표적 펩타이드들이 링커로 연결되는 형태이다.
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실시예 7: 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질의 발현
pET22b 벡터 (노바젠사)의 T7 프로모터 조절하의 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질의 발현을 수행 하였다. 각각의 구축된 발현벡터로 E.coli BL21-DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λDE3); 노바젠)을 형질전환하였다. 형질 전환 방법은 노바젠사에서 추천하는 방법을 따랐다. 각 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 각각의 단일 콜로니를 취하여 암피실린(50㎍/ml)이 포함된 2X 루리아 브로스(Luria Broth, LB) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 배양하였다. 재조합 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 각 1ml씩 크라이오-튜브에 분주하고, -140℃에 보관하였다. 이를 재조합 융합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.
면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 결합체의 발현을 위하여, 각 세포 스톡(stock) 1 바이알(vial)을 녹여 500 ml의 2X 루리아 브로스(LB)에 접종하고 37℃에서 14~16시간 동안 진탕 배양하였다. OD600의 값이 4.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 5 L 발효기(Ependorf, 미국)를 이용하여 종 배양액을 1.6 L의 발효 배지에 접종하고 초기 배치(bacth) 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 37℃, 공기량 2 L/분(1 vvm), 교반 속도 650 rpm 그리고 20% 암모니아수를 사용하여 pH 6.70으로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가배지(feeding solution)를 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하며, OD 값이 120이상에서 최종 농도 0.5mM의 IPTG로 도입하였다. 배양은 도입 후 약 23~25시간까지 더 진행하며, 배양 종료 후, 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수획하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 8: 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질의 회수 및 재접힘 (refolding)
상기 실시예 7에서 발현시킨 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질들을 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 리폴딩하였다. 각 배양액 200 ml에 해당하는 세포 펠렛을 200 ml 용해 완충액(50 mM 트리스(pH 9.0), 1 mM EDTA(pH 8.0), 0.2 M 소디움 클로라이드 및 0.5% 트리톤 X-100)에 재부유하였다. 미세용액화(microfluidizer) 프로세서 M-110EH(AC Technology Corp. Model M1475C)를 이용하여 15,000 psi 압력으로 수행하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 용해물을 12,200 g으로 4℃에서 30분 원심분리하여 상층액을 버리고, 200 mL 세척완충액(0.5% 트리톤 X-100 및 20 mM 트리스(pH 8.0))에 재부유하였다. 12,200g으로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 펠렛을 200 mL 세척완충액 (20mM 트리스(pH 8.0))에 재부유한 후, 동일한 방법으로 원심분리하였다. 펠렛을 취하여 100 mL의 완충액(8 M Guanidine-HCl, 50mM 트리스(pH 8.0))에 재부유하여 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후 12,200g으로 23℃에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 취한 뒤 2.5 mM Dithiothreitol을 첨가한 후 37℃에서 30분동안 교반하였다. 가용화된 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질의 재접힘(refolding)을 위하여 여기에 3.5 L의 완충액(3 M 우레아, 1 mM 시스테인, 0.160 M 알지닌, 50mM 트리스 (pH 9.2), 20% 글리세롤)를 연동펌프(peristaltic pump)를 이용하여 1 ml/min의 유속으로 넣어주면서 4℃에서 36시간 교반하였다. 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질 내의 면역글로불린 Fc 영역은 이량체 (dimer)로 발현한다.
실시예 9: 친화성 결합 크로마토그래피 (affinity chromatography) 정제
재접힘이 끝난 시료를 12,200g으로 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 0.22㎛의 필터 (satorius)로 필터링한 후 시료의 pH를 50% HCl을 이용하여 pH7.5로 조정하였다. 10mM 트리스 (pH 7.0)을 완충액으로 평형화된 ProteinA-sepharose (GE healthcare사) 컬럼에 시료를 결합시킨 후, 100 mM 소디움 시트레이트 (pH 3.3)과 10% 글리세롤 완충액을 사용하여 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 결합체 단백질을 용출하였다.
실시예 10: 소수성 결합 크로마토그래피 정제
용출된 시료에 0.6M 암모늄 설페이트를 삽입한뒤, 10mM 트리스 (pH 7.5)과 0.6M 암모늄 설페이트을 완충액으로 평형화된 Phenyl HP (GE healthcare사) 컬럼에 0.6M 암모늄 설페이트를 삽입한 시료를 결합시킨 후, 10 mM 트리스 (pH 7.5) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 6 컬럼 용량의 선형 농도구배로 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질을 용출하였다.
실시예 11: 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결되어 있는 융합 단백질의 뇌 분포 (brain distribution) 확인
면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결되어있는 융합단백질들의 뇌 혈관 장벽 (blood brain barrier) 통과 정도를 확인하기 위해 마우스에서 뇌 분포 실험 (brain distribution test)을 진행 하였다. 마우스의 정맥내 주사 (intravenous)를 통해 10 mg/kg로 투여한 뒤 2시간 후 마우스의 뇌를 분리한 후 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결되어있는 융합단백질들의 농도를 측정하여 뇌 혈관 장벽 통과 정도를 확인하였다 (도 3).
그 결과, 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드들의 뇌 혈관 장벽 통과 정도는 면역글로불린 Fc 영역보다 혈청 대비 뇌에서 높은 농도로 측정되어 높은 통과 정도를 보였다. 면역글로불린 Fc 영역에 동일한 종류의 뇌 표적 펩타이드가 두 개 이상 연결되어있는 융합단백질의 경우 한 개만 연결되어 있을 때보다 뇌에서 높은 농도로 측정되었고, 높은 T/S ratio를 확인 할 수 있었다.
이와 같은 결과들은 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질들이 실제 생체 내에서도 효과적으로 BBB를 통과하여 뇌로의 전달이 가능함을 시사하는 것이다. 더욱이, 지속형 결합체 형태인 본 발명의 융합 단백질은 생체 내 지속성이 증가하며 이와 같은 지속성이 증가할수록 뇌로의 표적화가 더욱더 효율적으로 수행될 수 있음을 시사하는 것이다.
이하에서는, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 융합된 지속형 융합 단백질에 생리활성 물질들이 연결된 경우에도 효과적으로 BBB를 통과하여 뇌로 전달되고, 뇌에서 생리활성을 나타내는 지 확인하는 실험을 추가로 수행하였다.
실시예 12: 이두설파제 (Idursulfase) 와 PEG 결합체 제조
전형적 크기의 단백질을 생리활성 물질로 포함하는 뇌 표적 지속형 결합체의 예로서, 이두설파제(약 72kDa)를 포함하는 뇌 표적 지속형 결합체를 제조하였다. 이 뇌 표적 지속형 결합체의 전구체로서 먼저 이두설파제에 링커로서 폴리에틸렌글리콜이 연결된 모노페길화 결합체를 다음과 같이 제조하였다.
이두설파제(아일랜드 Shire사)를 적정 농도까지 농축시킨후, 10K butyl-ALD(2) PEG(양 말단의 수소가 각각 부틸 알데하이드기로 개질되어 있는 10 kDa 폴리에틸렌글리콜, 일본 NOF사)를 이두설파제 N-말단에 페길화시키기 위하여, 이두설파제:10K butyl-ALD(2) PEG의 몰 비를 1:10으로, 이두설파제 농도를 10 mg/mL 로 하여 4°C에서 약 2시간 반응시켰다. 이때 0.1 M 인산칼륨(pH 6.0) 완충용액에 20 mM 농도의 NaBH3CN (sodium cyanoborohydirde) 환원제를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 인산나트륨(pH 6.0)과 NaCl 농도 구배를 이용한 Source 15Q(GE, 미국) 컬럼을 사용하여 모노페길화 결합체인 이두설파제-10 K PEG를 정제하였다.
실시예 13: 뇌 표적 지속형 결합체인 이두설파제 -10 kDa PEG- Fc - BTP22 결합체의 제조
다음으로, 이두설파제-10 kDa PEG 결합체를 뇌 표적 펩타이드를 포함하는 Fc 절편에 연결시켜 뇌 표적 지속형 결합체를 제조하였다. 실시예 12에서 정제한 이두설파제-10 K PEG와 뇌 표적 융합 단백질의 대표예인 Fc-BTP22의 몰비가 1 : 10이 되도록 하고, 이두설파제 농도를 10 mg/mL로 하여 25°C에서 15시간 반응시켰다. 이때 반응액은 둘베코 인산 완충액(DPBS)과 환원제로서 10 mM NaBH3CN를 첨가한 용액을 사용하였다.
반응이 종결된 후 반응액을 인산나트륨 완충액(pH 6.0)과 NaCl 농도 구배를 이용하여 Source 15Q(GE, 미국) 컬럼에 적용하고, 황산암모늄과 인산나트륨(pH 6.0)의 농도 구배를 이용하여, Source 15ISO(GE, 미국)에 적용하여, 목적하는 뇌 표적 지속형 결합체인 이두설파제-10K PEG-Fc-BTP22를 정제하였다. 이는 이두설파제-Fc-BTP22와 혼용된다.
실시예 14: GIP 유도체와 PEG의 결합체 제조
전형적 크기의 펩타이드를 생리 활성 물질로 포함하는 뇌표적 지속형 결합체의 예로서 40개 아미노산 잔기로 이루어진, GIP(glucose-dependent insulinotropic polypeptide) 수용체 자극 활성이 있는 인공 GIP 유도체의 뇌표적 지속형 결합체를 제조하였다. 이 지속형 결합체의 전구체로서 먼저 이 인공 GIP 유도체에 링커로서 폴리에틸렌글리콜이 연결된 모노페길화 결합체를 다음과 같이 제조하였다.
10k MAL-PEG-ALD(한 말단의 수소 원자가 3-[N-(3-N- 말레이미도-1-옥소프로릴)아미노]프로필기, 반대편 말단의 수소 원자가 3-옥소프로필기(프로필알데하이드기)로 개질되어 있는 10 kDa 폴리에틸렌글리콜, 일본 NOF사)를 이 GIP 유도체의 C-말단 시스테인에 페길화시키기 위하여, GIP 유도체:PEG의 몰 비를 1:1.3으로, GIP 유도체 농도를 3 mg/mL 로 하여 4°C에서 약 1시간 반응시켰다. 이때 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) + 45% 이소프로판올 용매에서 반응시켰다. 반응액은 시트르산나트륨 완충액(pH 3.0) + 45% 에탄올과 KCl 농도 구배를 이용한 SP HP(GE,미국) 컬럼에 적용하여 모노페길화 결합체인 GIP 유도체-10K PEG를 정제하였다.
실시예 15: GIP 유도체-10K PEG-Fc-BTP22결합체 제조
다음으로, GIP 유도체-10K PEG 결합체를 뇌 표적 펩타이드를 포함하는 Fc 절편에 연결시켜 뇌 표적 지속형 결합체를 제조하였다. 실시예 14에서 정제한 GIP 유도체-10 K PEG 와 Fc-BTP22의 몰비가 1 : 2가 되도록 하고, 전체 반응 농도를 4.55 mg/mL로 하여 4°C에서 16시간 반응시켰다. 이때 반응액은 DPBS와 환원제로서 20 mM NaBH3CN를 첨가한 용액을 사용하였다.
반응이 종결된 후 반응액은 인산나트륨 완충액(pH 7.5)과 황산암모늄 농도 구배를 이용하여 Source 15ISO(GE, 미국) 컬럼에 적용하고, 동일한 완충액과 동일한 컬럼에 다시 한 번 적용하여, 목적하는 뇌 표적 지속형 결합체인 GIP 유도체-10K PEG-Fc-BTP22를 정제하였다. 이는 GIP 유도체-Fc BTP22와 혼용된다.
실시예 16: 뇌 표적 지속형 결합체의 통과세포외배출 분석
실시예에서 얻은 뇌 표적 지속형 결합체의 뇌 혈관 장벽 통과 정도를 확인하기 위해 통과세포외배출(transcytosis) 실험을 진행 하였다. 인간 뇌 내피세포 (Human cerebral endothelial cells)인 hCMEC/D3세포를 미세공성의 막 (microporous membrane)위에서 5 X 104 cells/cm2로 10일 동안 배양하였다. BBB 형성이 되었는지 확인하기 위해 FITC-덱스트란(70 kDa)으로 침투 실험(penetration test)을 진행하여 밀착연접(tight junction)이 형성되는 것을 확인한 뒤, 25 mM의 뇌 표적 지속형 결합체를 hCMEC/D3위에 놓고 2시간, 4시간 후에 ELISA kit를 이용하여 단백질의 농도를 측정하였다.
그 결과, 실시예 15의 GIP 유도체-10K PEG-Fc-BTP22는 대조군과 비교하여 뇌 혈관 장벽 통과 효과를 나타내었고, 시간이 지남에 따라 통과율도 높아지는 것을 확인 할 수 있었다(도 4). 실시예 13의 이두설파제-10K PEG-Fc-BTP22에 대해서도 유사한 뇌 혈관 장벽 투과성을 볼 수 있었다(미도시).
상기와 같은 결과는, 본 발명에서 확인한 뇌 표적 지속성 결합체가 효과적으로 BBB를 통과할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 17: 이두설파제-10 kDa PEG-Fc-BTP22 결합체의 활성 측정
이두설파제-10K PEG-Fc-BTP22 결합체 제조에 따른 이두설파제의 효소 활성 (specific activity) 변화가 있는지를 측정하고자 시험관 내 효소 활성 실험을 진행하였다. 이두설파제 의 효소 기질로 알려진 4MU-α-IdopyraA-2 (4-Methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic Acid-2-sulfate Sodium Salt) 를 이두설파제 베타 및 IDS-Fc-BTP22와 37℃에서 4시간 반응 후, 이차반응 효소인 α-이두로니다제 (α-Iduronidase)와 다시 37℃에서 24시간 반응하였다. 최종적으로 생성되는 4MU (4-Methylumbelliferone)에 대한 형광을 측정함으로써 해당물질에 대한 효소 활성을 측정하였다(도 5).
그 결과, 결합체를 형성하지 않은 유리 이두설파제와 이두설파제-10K PEG-Fc-BTP22의 효소 활성이 각각 23.4 ± 1.94, 10.8 ± 1.39 nmol/min/㎍로 나타났다. 여기서 효소 활성의 값은 이두설파제의 환산 중량(㎍) 당의 특이적 활성으로 계산하였는데, 즉 시간당 효소 반응의 수를 유리 이두설파제의 경우는 중량으로, 이두설파제-10K PEG-Fc-BTP22의 경우는 이 결합체 내에서 이두설파제 부분이 차지하는 환산 중량으로 나눈 값이다. 결론적으로 이두설파제 대비, 이두설파제-10K PEG-Fc-BTP22 의 효소 활성이 46.6% 로서, 일부가 감소하긴 하였지만 효소를 본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체로 제조하였을 때에도 그 결합체에서 유의미한 효소 활성이 나타남을 확인하였다.
실시예 18: 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결되어 있는 융합 단백질 발현벡터의 제작
추가적인 융합단백질을 발현하기 위해 다음과 같이 발현벡터를 제조하였다. 결합된 생리활성 폴리펩타이드의 반감기를 증가시킬 수 있는, 생체 적합성 물질로 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역을 선택하였으며, 상기 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드를 유전자 수준에서 융합하여 발현 벡터에 각각 삽입하였다.
상기 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드는 펩타이드 링커로 연결하거나, 직접 융합하는 방식에 의해 구체적으로, 하기 표 7과 같은 서열을 지니는, 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 이 Fc CH3 영역의 C-말단 방향에 뇌 표적 펩타이드가 펩타이드 결합으로 연결된 융합 단백질들을 합성하였다(한국 바이오니어사에서 합성) (표 7). 하기 표 7의 서열에서 알 수 있듯이, IgG4 Fc 영역의 C-말단에 뇌 표적 펩타이드의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결되거나, 직접 융합하는 방식에 의해 제조된 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 결합된 융합 단백질을 제조하였다.
Figure PCTKR2019003755-appb-T000007
합성된 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드를 코딩하는 유전자는 양쪽 말단에 NdeI과 BamHI를 포함하고 있어 NdeI과 BamHI로 절단한 pET22b 발현 벡터에 삽입하였다. 상기 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드를 코딩하는 유전자가 삽입된 발현벡터를 BL21(DE3)균주에 삽입하여 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결된 지속형 융합 단백질을 발현시켰다.
실시예 19: 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결되어 있는 융합 단백질의 뇌 분포 (brain distribution) 확인
면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결되어있는 융합단백질들의 뇌 혈관 장벽 (blood brain barrier) 통과 정도를 확인하기 위해 마우스에서 뇌 분포 실험 (brain distribution test)을 진행 하였다. 마우스의 정맥내 주사 (intravenous)를 통해 10 mg/kg로 투여한 뒤 2시간 후 마우스의 뇌를 분리한 후 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결되어있는 융합단백질들의 농도를 측정하여 뇌 혈관 장벽 통과 정도를 확인하였다 (도 6).
그 결과, 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드들의 뇌 혈관 장벽 통과 정도는 면역글로불린 Fc 영역보다 혈청 대비 뇌에서 높은 농도로 측정되어 높은 통과정도를 보였다.
실시예 20: 이두로네이트-2-설파타제-Fc-BTP 융합 단백질의 제조
(1) 이두로네이트-2-설파타제-Fc-BTP 융합 단백질 발현 벡터의 제조
효소 융합단백질을 생산하기 위해 천연형 이두로네이트-2-설파타제 (Iduronate-2-sulfatase, IDS, 서열번호 102)가 삽입되어 있는 발현 벡터 (IDS cDNA, Cat No. EX-C0003-M02, Gencopoeia)와 합성된 링커(linker, 서열번호 17)와 IgG4 Fc 영역(서열번호 11, 12, 및 13)을 오버래핑 (overlap) PCR을 이용하여 융합단백질 발현 벡터를 제작하였다. 오버래핑 PCR 기법은 각 효소와 링커-Fc를 각각 PCR 증폭 할 때, 프라이머에 서로 중첩되는 서열을 포함하므로, 생산되는 PCR 산물은 중첩되는 서열을 포함하게 된다. 상기 융합단백질 증폭을 위한 PCR 조건은 1차는 95℃ 1분, 57℃ 30초, 68℃ 3분으로 이 과정을 25회 반복하였으며, 2차는 95℃ 1분, 57℃ 30초, 68℃ 4분으로 25회 반복하여 증폭하였다.
구체적으로, IDS는 서열번호 86, 87의 프라이머를 이용하여 PCR을 하고, 링커-Fc는 서열번호 88, 89의 프라이머를 이용하여 PCR을 함으로써, IDS PCR산물은 3'쪽에 링커-Fc 서열을 포함하게 되고, 링커-Fc PCR 산물은 5'쪽에 IDS의 서열을 포함하게 된다.
상기 1차 PCR에서 수득된 두 개의 PCR 산물을 주형으로 하여 서열번호 86, 89의 프라이머를 사용하여 2차 PCR을 진행하여, IDS-Fc의 서열을 가진 PCR산물을 얻은 뒤 KpnI, XhoI 제한효소로 오버래핑 서열을 절단하고, 상기 수득된 PCR 산물을 X0GC 벡터에 삽입하여 IDS-Fc 융합단백질을 발현하는 벡터를 구축하였다 (pX0GC-효소-Fc).
Figure PCTKR2019003755-appb-T000008
구축된 융합단백질의 서열 중 Fc 영역에서 사슬 교환 (chain exchange)과 N-글리코실화 부위 (N-glycosylation site)를 제거하기 위하여 부위 특이적 변이 (site-directed mutagenesis) PCR기법을 이용하였다.구체적으로, 서열번호 90 및 91의 프라이머를 이용하여 사슬 교환에 관여하는 Fc 영역의 2번째 아미노산인 세린 (Serine)을 프롤린 (Proline)으로 대체하였고, 서열번호 92 및 93의 프라이머를 이용하여 N-글리코실화가 이 이루어지는 Fc 영역의 71번째 아미노산인 아스파라긴 (Asparagine)을 글루타민 (Glutamine)으로 치환하였다.
Figure PCTKR2019003755-appb-T000009
Fc 영역에서 사슬 교환 (chain exchange)과 N-글리코실화 부위 (N-glycosylation site)가 제거된 IDS-Fc 융합단백질에 BTP 서열을 삽입하기 위하여 부위 특이적 변이 (site-directed mutagenesis) PCR기법을 이용하였다.구체적으로, 서열번호 94, 95의 프라이머를 이용하여 Fc-BTP22의 BTP5 서열을 삽입하는 1차 PCR을 진행하여 BTP5 서열이 Fc 영역 C-말단에 삽입된 것을 확인 후, 서열번호 96 및 97의 프라이머를 이용하여 링커와 BTP5 서열을 삽입하는 2차 PCR을 진행 하였다.
상기 1차 PCR과 2차 PCR을 진행하여 X0GC 벡터에 IDS-Fc-BTP22 융합단백질을 발현하는 벡터를 구축하였다.
Figure PCTKR2019003755-appb-T000010
상기 실시예에서 제조된 효소 융합단백질 발현 벡터를 pX0GC-IDS-Fc-BTP22 벡터라 명명하였으며, 다음과 같은 서열을 가진다 (표 11).
Figure PCTKR2019003755-appb-T000011
Figure PCTKR2019003755-appb-I000040
(2) 이두로네이트 2- 설파타제 - Fc - BTP22 융합 단백질의 형질 전환 CHO 세포주 제작
상기에서 제조한 재조합 발현벡터 pX0GC-IDS-Fc-BTP22를 DHFR 유전자가 훼손되어 핵산 생합성 과정이 불완전한 DG44/CHO 세포주(CHO/dhfr-)(콜럼비아 대학의 Chasin 박사로부터 구입)에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체로부터 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합 단백질을 발현시켰다.
구체적으로, 상기 DG44/CHO 세포주를 배양 용기 바닥의 80 내지 90% 정도를 덮을 정도로 배양시킨 다음, 상기 세포를 Opti-MEM(Lifetechnology사, cat. No. 51985034)으로 3회 세척하였다.
한편, 3 ㎖의 Opti-MEM과 5㎍의 발현 벡터 pX0GC-IDS-Fc-BTP22의 혼합물과, 3㎖의 Opti-MEM과 20 ㎕의 리포펙타민(Lifetechnology사, cat. no. 18324-012)의 혼합물을 각각 상온에서 30분 동안 정치시켰다. 이어, 상기 각 혼합물을 혼합하고 상기 배양된 DG44/CHO 세포주에 가한 다음, 37 ℃ 및 5% CO2 조건으로 약 18시간 동안 배양함으로써, 상기 발현 벡터 pX0GC-IDS-Fc-BTP22를 DG44/CHO 세포주에 도입하였다. 이어, 상기 배양된 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM-F12(Lifetechnology사, cat. no. 11330) 배지로 3회 세척한 다음, 상기 배지를 가하고 48시간 동안 다시 배양하였다. 배양된 세포에 트립신을 가하여 배양된 세포들을 각각 분리하고, 이들을 선별배지(HT 보충제(Hypoxanthine-Thymidine)가 없고, 10% FBS 및 1㎎/㎖의 G418(Cellgro사, cat. no. 61-234 -RG)를 포함하는 MEM-α 배지(WELGENE사, cat. no. LM008-02))에 접종하였다. 형질전환된 세포들만이 생존하여 콜로니를 형성할 때까지, 상기 선별배지를 2일 또는 3일 간격으로 교환하며 배양함으로써, 상기 분리된 세포들로부터 형질전환된 세포를 선발하였다. 이때, 상기 선발된 형질전환된 세포에서 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 결합체의 발현수준을 향상시키기 위하여, 5 nM MTX(Sigma사, cat. no. M8407)를 선별배지에 가하여 점차로 농도를 증가시켜서, 2 내지 3주 후에는 20 nM까지 MTX의 함량을 증가시켰다.
아울러, 상기 형질전환된 세포의 이종성(heterogeneity)을 감소시키기 위하여 한계희석법(limiting dilution method)을 수행하여 단일 클론을 확보하였다. 구체적으로, 96 웰 플레이트에 각 웰 당 0.7 세포수의 비율이 되도록 희석한 상기 형질전환된 세포를 각각 분주하고, 2 내지 3주간 배양하여 단일클론이 나타나는지를 확인하였다. 단일클론이 클러스터를 형성하는 웰이 검색되면, 상기 단일클론을 24웰 플레이트로 옮기고, 각 클론의 세포성장율(cell growth rate)과 이두설파제 유도체의 발현량을 ELISA 방법으로 분석하여, 이두설파제 유도체의 발현량이 가장 우수한 클론을 선별하였다. 그리고 선별된 세포주는 무혈청 배지(EX-CELL CHO 배지, 미국 Sigma사, cat. no. 63289C)를 이용하여 부유배양에 적응시켰다.
(3) 형질전환 이두로네이트 2- 설파타제 - Fc - BTP22 / CHO를 이용한 재조합 단백질의 생산
상기 (2)에서 선별된 후 부유 배양에 적응되어 액체질소 탱크에 보관 중인 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 결합체의 발현 세포주 1 바이알(1Х107 세포/㎖)을 꺼내어 37℃ 항온수조에서 최대한 신속히 녹인 후, 종균배양배지(글루타민 0.45g/L가 첨가된 EX-CELL CHO 배지(Sigma사, cat. no. 63289C))로 1회 세척하고 90Хg에서 5분 동안 원심분리하여 종균배양배지 50 mL이 들어있는 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask; 미국 Corning사 cat. no. 431144)에 접종하였다. CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 세포 농도가 10Х105 세포/㎖가 될 때까지 1~2일간 배양한 다음, 위에서와 같은 방법으로 원심분리하여 신선한 종균배양배지 100 mL이 들어있는 새로운 삼각 플라스크로 계대 배양하였다. 같은 방법으로 충분한 수의 세포가 얻어질 때까지 2배씩 배양 부피를 늘려가며 계대 배양하였다. 충분한 수의 세포가 얻어지면 삼각 플라스크에서 자라던 생산 세포를 5 L 규격의 생물반응기(Sartorious사, model: biostat)로 옮겨 배양하였다. 목표로 한 세포 농도인 10Х106 세포/㎖의 농도가 되면, 배양배지에 소디움부틸레이트(시그마사, cat no. 58903C)를 첨가하였으며, 온도를 33도로 맞추어 10일 이상 배양하였다. 배양이 종료되면 배양액을 3,000Хg 에서 60분간 원심분리하여 세포와 상등액으로 분리하였고, 그 중 상등액을 여과하여 -20℃ 냉동 보관하였다.
(4) 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP 융합 단백질의 정제
상기 (3)에서 배양된 배양액 시료를 20mM 트리스 (tris) (pH 7.5)와 글리세롤 (glycerol) 완충액으로 평형화된 rProtein A sepharose fast flow (GE healthcare, 미국) 컬럼에 결합시킨 후, 0.1M 구연산 나트륨 (sodium citrate) (pH 3.0~4.0)와 염화 나트륨 (sodium chloride) 그리고 글리세롤로 이루어진 완충액을 사용하여 용출하였다. 용출된 시료는 황산암모늄 (ammonium sulfate)과 트리스 (pH 7.5)의 농도 구배를 이용하여, Source 15ISO (GE healthcare, 미국)에 적용하여, 재조합 단백질인 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 를 정제하였다.정제된 재조합 단백질 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22의 SDS-PAGE 확인 결과는 도 7과 같다.
실시예 21: 이두로네이트 2-설파타제-10kDa PEG-Fc-BTP28 결합체의 제조
10K propion-ALD(2) PEG (양 말단에 각각 프로피온 알데히드기를 하나씩 지니고 있는 10K PEG, NOF사, 일본)를 이두로네이트 2-설파타제의 N-말단 (Shire, Ireland)에 페길화시키기 위하여, 이두로네이트 2-설파타제 : PEG의 몰 비를 1:10~20, 이두로네이트 2-설파타제 농도를 10~20 mg/ml로 2~8°C에서 약 1~2시간 반응시켰다. 이때 반응은 0.1M 인산칼륨 (potassium phosphate)(pH 6.0) 완충용액에 20 mM 농도의 소디움 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)) 환원제를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 인산 나트륨 (sodium phosphate) (pH 6.0)과 염화 나트륨 농도 구배를 이용한 Source 15Q (GE healthcare, 미국) 컬럼을 사용하여 모노페길화된 (mono-PEGylated) 이두설파제-10K PEG를 정제하였다.
다음으로, 상기 정제된 모노 페길화된(mono-PEGylated) 이두설파제와 면역글로불린 Fc-BTP28의 몰비가 1:10~15이 되도록 하고, 전체 단백질 농도를 10~20 mg/ml로 하여 2~8°C에서 16시간 반응시켰다. 이때 반응액은 0.1 M 인산칼륨 (pH 6.0)과 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다.
반응이 종결된 후, 반응액을 인산 나트륨 (pH 5.6) 완충액과 염화 나트륨 농도 구배를 이용하여 Source 15Q (GE healthcare, 미국) 컬럼에 적용하고, 황산암모늄과 인산나트륨(pH 6.0)의 농도 구배를 이용하여 Source 15ISO (GE healthcare, 미국)에 적용하여, 이두로네이트 2-설파타제-10kDa PEG-Fc-BTP28 결합체(이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체와 혼용될 수 있다)를 제조하였다. SDS-PAGE 확인 결과는 도 8과 같다.
실시예 22: 이두로네이트 2- 설파타제 - Fc - BTP22 융합단백질 및 이두로네이트 2-설파타제-10kDa PEG-Fc-BTP28 결합체의 in vitro 효소 활성 확인
실시예 20에 따라 제조된 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 실시예 21에 따라 제조된 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체의 지속형 결합체 제조에 따른 효소활성 변화를 측정하고자 in vitro 시험관 효소활성 측정을 진행하였다. 이두로네이트 2-설파타제의 효소기질로 알려진 4MU-α-IdopyraA-2 (4-Methylumbelliferyl a-L-Idopyranosiduronic Acid-2-sulfate Sodium Salt )를 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질 및 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체와 37 ℃에서 4시간 반응 후, 이차반응 효소인 α-Iduronidase 와 다시 37 ℃에서 24시간 반응하였다. 최종적으로 생성되는 4-Methylumbelliferone (4MU) 에 대한 형광을 측정함으로써 해당물질에 대한 효소활성을 측정하였다 (도 9).
그 결과, 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체의 효소활성 (specific activity)이 각각 45.0 ± 11.4, 41.2 ± 1.2 nmol/min/㎍ 임을 확인하였다. 결론적으로 이두로네이트 2-설파타제 대비, 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체의 효소활성이 95.5, 87.4% 로 뇌 표적 지속형 결합체 및 융합단백질 제조 후에도 효소 활성이 유사한 수준임을 확인하였다.
실시예 23: 이두로네이트 2- 설파타제 - Fc - BTP22 융합단백질의 뇌 조직 분포 확인
실시예 20에 따라 제조된 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질의 뇌 혈관 장벽(blood brain barrier, BBB) 통과 정도를 확인하기 위해 정상 마우스에서 뇌 분포 실험(brain distribution)을 진행하였다. 정상 마우스의 정맥내 주사(intravenous)를 통해 6.58nmol/kg로 투여한 뒤 1시간 후 마우스의 뇌를 분리한 후 각 결합체 단백질의 농도를 측정하여 뇌 혈관 장벽(BBB) 통과 정도를 확인하였다 (도 10). 그 결과, 뇌 표적 지속형 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질의 뇌 혈관 장벽 통과 정도는 천연형 이두로네이트 2-설파타제보다 뇌에서 높은 농도로 측정되어 높은 통과 정도를 보였다.
실시예 24: 이두로네이트 2- 설파타제 넉아웃 마우스에서 이두로네이트 2- 설파타제 -Fc-BTP22 융합단백질 및 이두로네이트 2- 설파타제 - 10kDa PEG- Fc - BTP28 결합체의 투여에 따른 생체 내 ( in vivo ) 효능 시험
실시예 20에 따른 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 실시예 21에 따른 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체의 투여에 따른 효능을 확인하기 위하여 마우스를 7그룹으로 준비하였다.
첫 번째 그룹의 야생형 (WT) 마우스 (n=4)에는 뇌 표적 지속형 이두로네이트 2-설파타제 부형제를 투여하였고, 두 번째 그룹부터는 이두로네이트 2-설파타제 넉아웃마우스 (n=4) 시험군으로, 군 2: 뇌 표적 지속형 이두로네이트 2-설파타제 부형제 투여, 군 3: 이두로네이트 2-설파타제 0.5 mg/kg (주 1회, 정맥투여), 군 4: 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질 2 mg/kg (2주 1회, 정맥투여), 군 5: 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질 4 mg/kg (2주 1회, 피하투여), 군 6: 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28의 결합체 2 mg/kg (2주 1회, 정맥투여), 군 7: 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28의 결합체 4 mg/kg (2주 1회, 피하투여)이 있다. 실험이 진행되는 동안 투여 전과 투여 후 1주 간격으로 소변을 채취하여 각각 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan, GAG) 함량을 측정하고 크레아티닌 함량을 측정하여 GAG 함량을 보정하였다.GAG 측정을 위해, 소변 샘플 50μL를 96웰 플레이트에 넣고 디메틸메틸렌블루(dimethylmethylene blue) 용액을 250μL 첨가한 후 섞어주고 ELISA 리더에 의해 525nm에서 GAG를 정량 한 후, 상호 비교하였다. 통계 처리는 일원분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 부형제 군(대조군) 및 시험군 사이를 비교하였다.
GAG 함량을 측정한 결과, 도 11에서 보는 바와 같이, 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체 투여 군은 2주 후 소변의 GAG 감소량이 정상 마우스의 GAG 함량 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 상기 결과는 뇌 표적 지속형 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체가 GAG가 분해되지 않아 축적되는 헌터증후군에 치료효과를 가질 수 있음을 시사한다.
실시예 25: 면역글로불린 Fc 영역과 서로 다른 뇌 표적 펩타이드가 2개 이상 연결되어 있는 융합 단백질의 제조
(1) 면역글로불린 Fc 영역과 서로 다른 뇌 표적 펩타이드가 2개 이상 연결되어 있는 융합 단백질의 발현벡터의 제조
추가적인 융합단백질을 발현하기 위해 다음과 같이 발현벡터를 제조하였다. 결합된 생리활성 폴리펩타이드의 반감기를 증가시킬 수 있는, 생체 적합성 물질로 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역을 선택하였으며, 상기 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 서로 다른 2개 이상의 뇌 표적 펩타이드를 유전자 수준에서 융합하여 발현 벡터에 각각 삽입하였다.
상기 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 서로 다른 2개 이상의 뇌 표적 펩타이드는 펩타이드 링커로 연결하거나, 직접 융합하는 방식에 의해 구체적으로, 하기 표 13와 같은 서열을 지니는, 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 이 Fc CH3 영역의 C-말단 방향에 2개 이상의 뇌 표적 펩타이드가 펩타이드 결합으로 연결된 융합 단백질들을 하기의 Primer (표12)를 이용하여 제조하였다. 구체적으로는 Fc-BTP28 발현벡터에 BTP16 서열과 Linker를 삽입하기 위하여 서열번호 107, 108의 프라이머를 이용하여 Fc-BTP29를, 서열번호 109, 110번의 프라이머를 이용하여 Fc-BTP30을 Site-mutagenesis PCR 기법을 이용하여 제조하였다. 하기 표 13의 서열에서 알 수 있듯이, IgG4 Fc 영역의 C-말단에 두개 이상의 뇌 표적 펩타이드의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결되거나, 직접 융합하는 방식에 의해 제조된 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 결합된 융합 단백질을 제조하였다.
Figure PCTKR2019003755-appb-T000012
Figure PCTKR2019003755-appb-T000013
Figure PCTKR2019003755-appb-I000041
상기 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드를 코딩하는 유전자가 삽입된 발현벡터를 BL21(DE3)균주에 삽입하여 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결된 지속형 융합 단백질을 발현시켰다.
(2) 면역글로불린 Fc 영역과 서로 다른 뇌 표적 펩타이드가 2개 이상 연결되어 있는 융합 단백질의 정제
상기 (1)에서 발현시킨 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질들을 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 리폴딩하였다. 각 배양액 200 ml에 해당하는 세포 펠렛을 200 ml 용해 완충액(50 mM 트리스(pH 9.0), 1 mM EDTA(pH 8.0), 0.2 M 소디움 클로라이드 및 0.5% 트리톤 X-100)에 재부유하였다. 미세용액화(microfluidizer) 프로세서 M-110EH(AC Technology Corp. Model M1475C)를 이용하여 15,000 psi 압력으로 수행하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 용해물을 12,200 g으로 4℃에서 30분 원심분리하여 상층액을 버리고, 200 mL 세척완충액(0.5% 트리톤 X-100 및 20 mM 트리스(pH 7.0))에 재부유하였다. 12,200g으로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 펠렛을 200 mL 세척완충액 (20mM 트리스(pH 7.0))에 재부유한 후, 동일한 방법으로 원심분리하였다. 펠렛을 취하여 400 mL의 완충액(8 M Urea, 20 mM 트리스(pH 7.0), 1 mM EDTA)에 재부유하여 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 3시간 후 12,200g으로 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 취한 뒤 0.5 mM 시스테인을 첨가한 후 37℃에서 30분동안 교반하였다. 가용화된 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질의 재접힘(refolding)을 위하여 여기에 600 mL의 완충액(0.11 mM 시스테인, 0.5 M 알지닌, 50 mM 트리스 (pH 9.5))를 연동펌프(peristaltic pump)를 이용하여 천천히 넣어주면서 4℃에서 36시간 교반하였다. 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질 내의 면역글로불린 Fc 영역은 이량체 (dimer)로 발현한다.
재접힘이 끝난 시료를 12,200g으로 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 0.22㎛의 필터 (satorius)로 필터링한 후 시료의 pH를 50% HCl을 이용하여 pH7.5로 조정하였다. 10mM 트리스 (pH 7.0)을 완충액으로 평형화된 ProteinA-sepharose (GE healthcare사) 컬럼에 시료를 결합시킨 후, 100 mM 소디움 시트레이트 (pH 3.3)과 10% 글리세롤 완충액을 사용하여 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 결합체 단백질을 용출하였다.
용출된 시료에 0.6M 암모늄 설페이트를 삽입한뒤, 10mM 트리스 (pH 7.5)과 0.6M 암모늄 설페이트을 완충액으로 평형화된 Phenyl FF (GE healthcare사) 컬럼에 0.6M 암모늄 설페이트를 삽입한 시료를 결합시킨 후, 10 mM 트리스 (pH 7.5) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질을 용출하였다.
상기에서 제조된 지속성 결합체는 Fc 영역에 결합된 뇌 표적 펩타이드에 의해 뇌혈관 장벽의 통과가 가능하고, 결합된 생리활성 물질의 생리활성이 유지되어 지속성과 안정성이 향상된 지속성 결합체를 제공하여, 새로운 BBB 통과가 가능한 치료제의 개발 플랫폼을 제공할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (67)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 뇌 표적 지속형 결합체:
    [화학식 1]
    X-L1-F-L2-Y
    여기에서,
    X는 생리 활성 물질이며,
    Y는 뇌 표적 펩타이드 (BTP)이고,
    L1 및 L2는 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
    L1 및 L2가 펩타이드성 링커일 때, 상기 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하며,
    F는 FcRn 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 불변 영역임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지속형 결합체는 뇌 혈관 장벽을 통과하여, 뇌 조직 내로 생리 활성 물질이 전달되는 것을 특징으로 하는, 뇌 표적 지속형 결합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 뇌 표적 펩타이드는 뇌 혈관 장벽을 통과 가능한 아미노산 서열을 가지는, 펩타이드, 단백질 또는 항체를 포함하는 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌 표적 펩타이드는 수동전달(passive transport)에 의한 경로 또는 수용체 매개 전달(receptor-mediated transport)에 의한 경로를 통해 뇌 혈관 장벽을 통과하는 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생리 활성 물질은 톡신; 또는 GLP-1(Glucagon like peptide-1) 수용체 아고니스트; 글루카곤 수용체 아고니스트; GIP(Gastric inhibitory polypeptide) 수용체 아고니스트; FGF(Fibroblast growth factor) 수용체 아고니스트; 콜레키스토키닌 (Cholecystokinin) 수용체 아고니스트; 가스트린(gastrin) 수용체 아고니스트; 멜라노코르틴(melanocortin) 수용체 아고니스트; 인간 성장호르몬; 성장호르몬 방출 호르몬; 성장호르몬 방출 펩타이드; 인터페론; 인터페론 수용체; 콜로니 자극인자; 인터루킨; 인터루킨 수용체; 효소; 인터루킨 결합 단백질; 사이토카인 결합 단백질; 마크로파지 활성인자; 마크로파지 펩타이드; B 세포인자; T 세포인자; 단백질 A; 알러지 억제인자; 세포 괴사 당단백질; 면역독소; 림포독소; 종양 괴사인자; 종양 억제인자; 전이 성장인자; 알파-1 안티트립신; 알부민; 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin); 아포리포 단백질-E; 적혈구 생성 인자; 고 당쇄화 적혈구 생성인자; 안지오포이에틴(angiopoietin); 헤모글로빈; 트롬빈(thrombin); 트롬빈 수용체 활성 펩타이드; 트롬보모듈린(thrombomodulin); 혈액인자 VII; 혈액인자 VIIa; 혈액인자 VIII; 혈액인자 IX; 혈액인자 XIII; 플라즈미노겐 활성인자; 피브린-결합 펩타이드; 유로키나제; 스트렙토키나제; 히루딘(hirudin); 단백질 C; C-반응성 단백질; 레닌 억제제; 콜라게나제 억제제; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; 렙틴; 혈소판 유래 성장인자; 상피세포 성장인자; 표피세포 성장인자; 안지오스타틴(angiostatin); 안지오텐신(angiotensin); 골 형성 성장인자; 골 형성 촉진 단백질; 칼시토닌; 인슐린; 아트리오펩틴; 연골 유도인자; 엘카토닌(elcatonin); 결합조직 활성인자; 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor); 여포 자극 호르몬; 황체 형성 호르몬; 황체 형성 호르몬 방출 호르몬; 신경 성장인자류; 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1); 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide); 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor); 네트린(netrin); 중성구 억제인자(neurophil inhibitor factor); 신경영양인자; 뉴트린(neuturin); 부갑상선 호르몬; 릴랙신; 시크레틴; 소마토메딘; 인슐린 유사 성장인자; 부신피질 호르몬; 글루카곤; 콜레시스토키닌; 췌장 폴리펩타이드; 가스트린 방출 펩타이드; 코티코트로핀 방출인자; 갑상선 자극호르몬; 오토탁신(autotaxin); 락토페린(lactoferrin); 미오스타틴(myostatin); ADNP(activity-dependent neuroprotective protein), BACE1(beta-secretase1), APP(Amyloid Precursor Protein), NCAM(Neural cell adhesion molecule), 아밀로이드 베타(Amyloid beta), 타우(Tau), RAGE(receptor for advanced glycation endproducts), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), 또는 이들의 아고니스트 또는 안타고니스트; 수용체류, 수용체 아고니스트; 세포표면항원; 단일클론 항체; 다중클론 항체; 항체 단편; 바이러스 유래 백신 항원; 하나 이상의 수용체 아고니스트를 활성화 시키는 하이브리드 폴리펩타이드 또는 키메릭 (chimeric) 폴리펩타이드; 및 이들의 아날로그를 포함하는 군으로 이루어진 군에서 선택된 생리활성 물질인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 톡신은 메이탄신(Maytansine) 또는 이의 유도체, 오리스타틴 (Auristatin) 또는 이의 유도체, 듀오카마이신(Duocarmycin) 또는 이의 유도체, 및 PBD(Pyrrolobenzodiazepine) 또는 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택되고, GLP-1(Glucagon like peptide-1) 수용체 아고니스트는 천연형 엑센딘-3 또는 천연형 엑센딘-4, 및 이들의 아날로그로 이루어진 군에서 선택된 것이며, FGF 수용체 아고니스트는 FGF1 또는 이의 아날로그, FGF19 또는 이의 아날로그, FGF21 또는 이의 아날로그, 및 FGF23 또는 이의 아날로그로 이루어진 군에서 선택되고,
    인터페론은 인터페론-알파, 인터페론-베타 및 인터페론-감마로 이루어진 군에서 선택되고,
    인터페론 수용체는 인터페론-알파 수용체, 인터페론-베타 수용체, 인터페론-감마 수용체, 및 수용성 타입 I 인터페론 수용체로 이루어진 군에서 선택되고,
    인터루킨은 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-6, 인터루킨-7, 인터루킨-8, 인터루킨-9, 인터루킨-10, 인터루킨-11, 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-14, 인터루킨-15, 인터루킨-16, 인터루킨-17, 인터루킨-18, 인터루킨-19, 인터루킨-20, 인터루킨-21, 인터루킨-22, 인터루킨-23, 인터루킨-24, 인터루킨-25, 인터루킨-26, 인터루킨-27, 인터루킨-28, 인터루킨-29, 및 인터루킨-30으로 이루어진 군에서 선택되고,
    인터루킨 수용체는 인터루킨- 1 수용체 또는 인터루킨-4 수용체이고,
    효소는 베타글루코시다제(beta-glucosidase), 알파갈락토시다제(alpha-galactosidase), 베타갈락토시다제(beta-galactosidase), 이두로니다제(iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제(Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제(acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제(acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidsase), 아릴설파타제(arylsulfatase) A, 아릴설파타제 B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, 베타-헥소사미니다제 B, 헤파린-N-설파타제(heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제(alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제(lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제(alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파아제(lipase), 우리카제(Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제(Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), 알파-갈락토시다제-A, 아갈시다제 알파(agalsidase alpha), 아갈시다제 베타, 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase), 뷰티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 및 이미글루세라제(imiglucerase)로 이루어진 군에서 선택되고,
    인터루킨 결합 단백질은 IL-18bp이고,
    사이토카인 결합 단백질은 TNF (Tumor necrosis factor) 결합 단백질이고,
    신경 성장인자류는 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(cilliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neurophil inhibitor factor), 신경영양인자, 및 뉴트린(neuturin)으로 이루어진 군에서 선택되고,
    미오스타틴 수용체는 TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, 및 B 세포 활성인자 수용체로 이루어진 군에서 선택되고,
    미오스타틴 수용체 안타고니스트는 IL1-Ra이고,
    세포표면 항원은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45 및 CD69로 이루어진 군에서 선택되고,
    항체 단편류는 scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd로 이루어진 군에서 선택되는, 뇌 표적 지속형 결합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 GLP-1 수용체 아고니스트는 천연형 엑센딘-4, 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 제거된 엑센딘-4, 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹으로 치환된 엑센딘-4, 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 디메틸기로 수식된 엑센딘-4, 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 카르복실기로 치환된 엑센딘-4, 천연형 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산(히스티딘)의 알파 탄소가 제거된 엑센딘-4; 및 상기 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(라이신)이 세린으로 치환된 엑센딘-4 및 상기 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(라이신)이 알지닌으로 치환된 엑센딘-4로 이루어진 군에서 선택되는, 뇌 표적 지속형 결합체.
  8. 제4항에 있어서, 상기 수용체 매개 전달에 의한 경로는 인슐린 수용체(insulin receptor), 트랜스페린 수용체(transferrin receptor), 저밀도 지질단백질 수용체(low density lipoprotein receptor), 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질(Low density lipoprotein receptor-related protein), 렙틴 수용체(leptin receptor), 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor), 글루타티온 수송체(Glutathione transporter), 칼슘의존성 칼륨통로(calcium-activated potassium channel), 및 RAGE (receptor for advanced glycation endproducts), 및 상기 수용체들의 리간드 및 상기 수용체 또는 리간드에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 통하여 수용체 매개 전달 경로에 의해 뇌 혈관 장벽을 통과하는, 뇌 표적 지속형 결합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L1은 F의 N-말단 영역에 연결되고, L2는 F의 C-말단 영역에 연결된 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L1은 X의 N-말단 또는 C-말단에 연결되고, L2는 Y의 N-말단 또는 C-말단 영역에 연결된 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L1은 X의 N-말단 또는 C-말단에 연결되고, L2는 Y의 N-말단 영역에 연결된 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학식 1의 F-L2-Y는
    하기 화학식 2로 표시되는 구조인 것인, 뇌 표적 지속형 결합체:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019003755-appb-I000042
    여기에서,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn '은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
  13. 제12항에 있어서,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn '은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수인,
    뇌 표적 지속형 결합체.
  14. 제12항에 있어서, 상기 L1은 Fa의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조인,
    뇌 표적 지속형 결합체:
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019003755-appb-I000043
    여기에서,
    X는 생리활성 물질이고,
    L1a 및 L1b는 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn '은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
  16. 제15항에 있어서,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn '은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수인,
    뇌 표적 지속형 결합체.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    상기 L1a 및 L1b는 각각 Fa 및 Fb의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것인,
    뇌 표적 지속형 결합체.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 4로 표시되는 구조인,
    뇌 표적 지속형 결합체:
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2019003755-appb-I000044
    여기에서,
    X는 생리활성 물질이고,
    L1은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn '은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
  19. 제18항에 있어서,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn '은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수인,
    뇌 표적 지속형 결합체.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, L1은 Fa의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것인,
    뇌 표적 지속형 결합체.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 5로 표시되는 구조인,
    뇌 표적 지속형 결합체:
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2019003755-appb-I000045
    여기에서,
    상기 X는 생리 활성 물질이며,
    L1은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이고,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
    각각의 Ya 및 Yb는 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드고,
    각각의 L2a 및 L2b는 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
  22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 5로 표시되는 구조인,
    뇌 표적 지속형 결합체:
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2019003755-appb-I000046
    여기에서,
    상기 X는 생리 활성 물질이고,
    L1a 및 L1b는 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
    각각의 Ya 및 Yb는 서로 같거나 다른 뇌표적 펩타이드이고,
    각각의 L2a 및 L2b는 서로 같거나 서로 다른 펩타이드성 링커이며,
    이 때 n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
  23. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, n=n'이고, 각각 L2a1 = L2b1, ······, L2an = L2bn '과 BTPa1 = BTPb1, ······, BTPan = BTPbn '의 조건을 만족하는 뇌 표적 지속형 결합체.
  24. 제23항에 있어서,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn '은 펩타이드성 링커인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  25. 제23항에 있어서,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn '은 펩타이드성 링커인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  26. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    n=n'이고,
    BTPa1 ≠ BTPb1, ······, BTPan ≠ BTPbn ' 중 어느 하나의 요건을 만족하는
    뇌 표적 지속형 결합체.
  27. 제26항에 있어서,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn '은 펩타이드성 링커인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  28. 제26항에 있어서,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn '은 펩타이드성 링커인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  29. 제12항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 n 및 n'은 1 내지 5인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  30. 제12항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L1, L1a, 또는 L1b는 X의 N-말단 아민기, 라이신의 측쇄에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 측쇄에 위치한 -SH 기 (티올기)에 연결된 것인,
    뇌 표적 지속형 결합체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L1, L1a, 또는 L1b는 X의 N-말단 아민기, 라이신의 측쇄에 위치한 아민기, 또는 시스테인의
    측쇄에 위치한 -SH 기 (티올기)에 연결된 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 생리활성 물질인 X는 2개 내지 1000개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, L1, L1a, 또는 L1b는 각각 독립적으로 0.5 내지 100 kDa 크기의 비펩타이드성 링커인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  34. 제33항에 있어서, 상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌글리콜인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  35. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, L1, L1a, 또는 L1b는 0개 내지 1000개의 아미노산을 포함하는 펩타이드성 링커인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L2, L2a, 또는 L2b는 펩타이드성 링커인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 펩타이드성 링커는 (GS)m, (GGS)m, (GGGS)m, 또는 (GGGGS)m이며, m은 1 내지 10인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  38. 제1항에 있어서, 상기 L1 및 L2 중 하나는 펩타이드성 링커이고, 또 다른 하나는 비펩타이드성 링커인 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  39. 제1항에 있어서, 상기 L1 및 L2 모두 펩타이드성 링커인,
    뇌 표적 지속형 결합체.
  40. 제1항에 있어서, 상기 L1은 비펩타이드성 링커이고, L2는 펩타이드성 링커일 때, 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  41. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히알루론산, 지방산, 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  42. 제1항에 있어서, 상기 L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, 상기 X와 F, 또는 F와 Y는 공유 화학결합, 비공유 화학결합 또는 이들의 조합으로 L1 및 L2 에 의해 서로 결합되고, L1 및 L2 가 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  43. 제1항에 있어서, L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, L1 및 L2 는 0개의 아미노산으로 이루어진 것으로,
    (i) X와 F, 또는 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것이고; 또는
    (ii) X와 F, 및 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  44. 제1항에 있어서, L1 및 L2 중 어느 하나는 펩타이드성 링커이고, 이 중 다른 하나는 비펩타이드성 링커일 때,
    펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 링커이며,
    비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌 글리콜인 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, F는 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  46. 제45항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 도메인을 포함하는, 뇌 표적 지속형 결합체.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 힌지 영역을 추가로 포함하는 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG의 Fc 영역인 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  49. 제48항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  50. 제49항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 서열의 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  51. 제1항에 있어서, L1에 의해 X의 N-말단 및 F의 N-말단이 연결된 것이고, L2에 의해 Y의 N-말단 및 F의 C-말단이 연결된, 뇌 표적 지속형 결합체.
  52. 제1항에 있어서,
    L1의 일 말단은 X의 라이신 잔기 또는 시스테인 잔기에, L1의 다른 말단은 F의 N-말단에 연결된 것이고,
    L2에 의해 Y의 N-말단 및 F의 C-말단이 연결된, 뇌 표적 지속형 결합체.
  53. 제1항에 있어서, 상기 F는 천연형 면역글로불린의 Fc 영역의 서열을 포함하거나, 천연형 면역글로불린 Fc 영역에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  54. 제53항에 있어서, 상기 F는 IgG 유래의 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬 두 개가 서로 이황화 결합으로 연결된 이량체 형태로서,
    상기 힌지 영역은 서열번호: 14의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호: 14의 아미노산 서열에서 2 번째 아미노산인 세린(Ser, S)이 프롤린 (Pro, P)으로 변이된 서열을 포함하고;
    상기 CH2 도메인은 서열번호: 15의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호: 15의 아미노산 서열에서 67번째 아미노산인 아스파라긴 (Asn, N)이 글루타민 (Gln, Q)으로 변이된 서열을 포함하고;
    CH3 도메인이 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하고; 또는
    상기 F를 구성하는 면역글로불린 불변영역을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호: 105에서 2번째 아미노산이 프롤린으로 치환되거나; 71번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나; 또는 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌 표적 펩타이드 (BTP)는 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 및 85로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 뇌 표적 지속형 결합체.
  56. 아미노산 서열로 구성되는 융합 단백질 형태인, 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 뇌 표적 지속형 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  57. 제56항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  58. 제57항의 발현 벡터가 도입된, 숙주세포.
  59. (a) 제58항의 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 뇌 표적 지속형 결합체를 회수하는 단계를 포함하는,
    뇌 표적 지속형 결합체를 제조하는 방법.
  60. 하기 단계를 포함하는, 제1항의 뇌 표적 지속형 결합체를 제조하는 방법:
    (i) (a) 생리 활성 물질인 X, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L1, 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 F가 결합된, X-L1-F, 및 (b) 뇌 표적 펩타이드인 Y, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L2가 결합된 L2-Y를 제조하는 단계; 및
    (ii) 상기 (a) X-L1-F 및 (b) L2-Y를 연결하는 단계.
  61. 하기 단계를 포함하는, 제1항의 뇌 표적 지속형 결합체를 제조하는 방법:
    (i) (a) 생리 활성 물질인 X 및 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L1이 결합된, X-L1, 및 (b) 뇌 표적 펩타이드인 Y, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L2 및 F가 결합된 F-L2-Y를 제조하는 단계; 및
    (ii) 상기 (a) X-L1 및 (b) F-L2-Y를 연결하는 단계.
  62. (a) 양 말단에 각각 같거나 서로 다른 반응성 작용기가 위치하는 비펩타이드성 중합체인 L1의 어느 한 반응성 작용기를 유리된 X와 반응시켜 상기 말단을 통하여 비펩타이드성 중합체가 X에 공유결합으로 연결된 연결체인 X-L1를 얻는 단계; 및
    (b) 상기 연결체의 반응하지 않은 말단의 반응성 작용기를 F-L2-Y에 연결시켜 X-L1-F-L2-Y를 얻는 단계를 포함하는,
    제1항의 뇌 표적 지속형 결합체를 제조하는 방법.
  63. 제62항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 상기 연결체의 반응하지 않은 말단의 반응성 작용기를 하기 화학식 2의 Fa에 연결시키는 것인, 방법:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019003755-appb-I000047
    여기에서,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn '은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
  64. 제62항에 있어서,
    상기 반응성 작용기는 알데히드기, 말레이미드기 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택하는 것인, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 알데히드기는 프로피온알데히드기 또는 부틸알데히드기인, 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 석신이미드 유도체는 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트인 것인 방법.
  67. 하기 화학식 3의 X - L1a - Fa - (L2a1-BTPa1) - ...... - (L2an - BTPan)를 코딩하는 발현 카세트 및 X - L1b - Fb - (L2b1-BTPb1) - ...... - (L2bn ' - BTPbn ')를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 하기 화학식 3의 결합체를 수득하는 단계를 포함하는,
    제12항의 뇌 표적 지속형 결합체를 제조하는 방법:
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019003755-appb-I000048
    여기에서,
    X는 생리 활성 물질이고,
    L1a 및 L1b는 펩타이드성 링커이며,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn '은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn '은 펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
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