WO2017116207A1 - Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도 - Google Patents

Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도 Download PDF

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analog
mature
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허용호
최승호
정성엽
권세창
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한미약품 주식회사
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    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to FGF21 analogs, FGF21 conjugates, and uses thereof.
  • Fibroblast growth factor 21 is a secretory polypeptide belonging to a subfamily of fibroblast growth factor (FGF), including FGF19, FGF21 and FGF23.
  • FGF21 is known to play an important role in several physiological functions including angiogenesis, mitosis, pattern formation, cell differentiation, metabolic regulation and tissue damage repair.
  • FGF21 has been reported to be expressed primarily in the liver and has been described as a therapeutic for ischemic vascular disease, wound healing, diseases associated with impairment of lung, bronchial or alveolar cell function, and numerous other disorders.
  • FGF21 stimulated glucose uptake in these cells when treated with mouse 3T3-L1 adipocytes in the presence and absence of insulin (72 hours), in ob / ob and db / db mice and 8 week old ZDF rats.
  • FGF21 stimulated glucose uptake in these cells when treated with mouse 3T3-L1 adipocytes in the presence and absence of insulin (72 hours), in ob / ob and db / db mice and 8 week old ZDF rats.
  • Fasting and postprandial blood glucose, triglycerides, and glucagon have been found to decrease in a dose-dependent manner.
  • the efficacy of the use of FGF21 as a therapy for the treatment of diabetes and obesity has been demonstrated (WO2003 / 011213).
  • human FGF21 is known to have a short half-life in vivo.
  • the half-life of human FGF21 in mice is only 1 to 2 hours, and the half-life of Cynomogus monkeys is 2.5 to 3 hours. Accordingly, in order to use FGF21 protein as a therapeutic agent in the treatment of type 2 diabetes, there is a need for an increase in half-life of FGF21 protein in vivo. Developing an improved half-life FGF21 protein can reduce the frequency of patients receiving protein injections and increase convenience.
  • FGF19 targets both adipocytes and hepatocytes and has an effect on them.
  • mice treated with recombinant human FGF19 show increased metabolic rate, increased lipid oxidation, lower respiratory index and weight loss despite being on a high fat diet.
  • such mice showed lower serum levels of leptin, insulin, cholesterol and triglycerides, and normal levels of blood sugar despite a high fat diet without appetite loss.
  • FGF19 showed weight loss, lowered cholesterol and triglycerides, and diabetes was not developed.
  • rhFGF19 was injected in db / db mice, its metabolic properties were reversed in the form of weight loss and decreased blood glucose.
  • FGF19 and FGF21 are achieved through their binding to the FGFR1c, FGFR2c and FGFR3c receptors, of which the binding to FGFR1c and FGFR2c is the most significant.
  • binding of FGF19 and FGF21 to these receptors requires co-receptor beta-klotho.
  • the metabolic effects of FGF19 and FGF21 are adipocyte specific due to the tissue-specific localized beta-cloto co-receptors.
  • FGF19 is known to regulate bile production by the liver through a liver-specific effect, distinct from FGF21. Specifically, in response to bile-production after meals, it inhibits the transcription of the cholesterol 7-alpha-hydroxylase gene (CYP7A1), a rate limiting enzyme in bile acid synthesis, whereby FGF19 negatively regulates bile production. In addition, FGF19 appears to have a hepatic scavenger effect not observed for FGF21. For example, hepatic adenocarcinoma develops due to increased proliferation and dysplasia of hepatocytes in FGF19 transgenic mice, and mice treated with rhFGF19 have shown hepatocyte proliferation of hepatocytes (Nicholes, K. et al., Am J). Pathol 160, 2295-2307 (2000).
  • CYP7A1 cholesterol 7-alpha-hydroxylase gene
  • FGF21 retains the activity of FGF19, it may be possible to retain useful activity of FGF19, such as bile control function in the liver.
  • Exendin-4 is also a 39 amino acid peptide produced by the salivary glands of Gila monster (Hloderma suspectum). Exendin-4 is an activator of glucagonlike peptide-1 (GLP-1) receptors, but does not significantly activate glucagon receptors.
  • GLP-1 glucagonlike peptide-1
  • Exendin-4 shares most of the glycemic action observed in GLP-1. Clinical and nonclinical studies show that exendin-4 enhances glucose-dependent insulin synthesis and secretion, inhibits glucose-dependent glucagon secretion, slows gastric emptying, food intake and weight loss, and increases beta cell mass and beta cell function. It has been shown to exhibit several beneficial antidiabetic properties, including an increase in markers.
  • Obese patients are at higher risk for diabetes, hypertension, hyperlipidemia, cardiovascular disease and musculoskeletal disease.
  • Exendin-4 exhibits resistance to cleavage by dipeptidyl peptidase (DPP4) compared to GLP-1, resulting in longer half-lives and duration of action in vivo.
  • DPP4 dipeptidyl peptidase
  • One object of the present invention is to provide an FGF21 analog, in which one or more amino acids in native fibroblast growth factor 21 (mutated) are removed, added, substituted, modified, or a combination thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the FGF21 analog.
  • Another object of the present invention is to provide a vector comprising the polynucleotide.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant containing the polynucleotide or a vector comprising the polynucleotide.
  • Another object of the present invention is (i) a native FGF21 or the FGF21 analog; And (ii) an FGF21 conjugate to which a carrier selected from the group consisting of an FcRn binder, a fatty acid, polyethylene glycol, an amino acid fragment, and albumin is bound.
  • a carrier selected from the group consisting of an FcRn binder, a fatty acid, polyethylene glycol, an amino acid fragment, and albumin is bound.
  • Another object of the present invention is the FGF21 analog; Or FGF21 analog or natural FGF21 to the carrier selected from the group consisting of FcRn binding material, fatty acid, polyethylene glycol, amino acid fragment, and albumin, FGF21 conjugate comprising an FGF21 conjugate as an active ingredient, for the prevention or treatment of metabolic syndrome It is to provide a pharmaceutical composition.
  • Another object of the present invention is to culture the transformant to express the FGF21 analog; And recovering the expressed FGF21 analog from a transformant or a culture thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a FGF21 conjugate, comprising binding a native FGF21 or the FGF21 analog with a carrier selected from the group consisting of FcRn binders, fatty acids, polyethylene glycols, amino acid fragments, and albumin. will be.
  • One embodiment embodying the present invention is an FGF21 analog, wherein one or more amino acids in native fibroblast growth factor 21 (mutated) are removed, added, substituted, modified, or a combination thereof.
  • the FGF21 analog is characterized in that the FGF21 analog, having one or more of the following (i) to (iii).
  • the FGF21 analog is further characterized as being an FGF21 analog, having a variation of (iv), (v) or both:
  • the FGF21 analog is characterized in that the FGF21 analog, having the mutation of the following (a) and (b):
  • the FGF21 analog further comprises substitution of glutamic acid, glycine, amino acid 170 of naturally-occurring mature FGF21; Substitution of the serine of amino acid 172 for leucine; Or FGF21 analog, including both.
  • the FGF21 analog is characterized in that the FGF21 analog having an amino acid sequence, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26, and 86.
  • the other amino acid is alanine, characterized in that the FGF21 analog.
  • the amino acid sequence from No. 16 to No. 20 from the N-terminus of the native mature FGF19 is characterized in that the FGF21 analog, WGDPI (SEQ ID NO: 122).
  • the amino acid sequence comprising the amino acid sequence of 16 to 20 amino acids from the N-terminal end of the native mature FGF19 is characterized in that the FGF21 analog, consisting of 5 to 20 amino acids.
  • the amino acid sequence comprising the amino acid sequence 16 to 20 from the N-terminus of the native mature FGF19 is an amino acid sequence of 14 to 20 from the N-terminus of the native mature FGF19 or 15 to 20 It is characterized by being an FGF21 analog which is an amino acid sequence up to.
  • An FGF21 analog with an amino acid sequence comprising an amino acid sequence 16 to 20 from the N-terminus of a native mature FGF19 adds an amino acid sequence 16 to 20 from the N-terminus of a native mature FGF19. It is characterized in that the amino acid sequence is an FGF21 analog, added to the full length sequence of mature FGF21 or an active fragment thereof.
  • the amino acid sequence comprising the amino acid sequence 16 to 20 from the N-terminus of the native mature FGF19 is a form in which the C-terminus thereof is added to the full-length sequence of the mature FGF21 or the N-terminus of its active fragment, It is characterized by being an FGF21 analog.
  • amino acid sequence comprising the amino acid sequence 16 to 20 from the N-terminus of the native mature FGF19 is an FGF21 analog, directly or via a linker, to the full length sequence of the mature FGF21 or active fragment thereof do.
  • the FGF21 analog is a group consisting of SEQ ID NOs: 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 119, and 121 It is characterized in that the FGF21 analog having an amino acid sequence selected from.
  • the FGF21 analog is the N-terminal amino acid sequence of the mature FGF21,
  • N-terminals 1 to 4 amino acids in the amino acid sequence of the mature FGF21 is characterized in that the analogue is the N-terminal amino acid sequence of FGF21 is excluded.
  • N-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 is a contiguous amino acid sequence from the N-terminal to the amino acid sequence of the mature FGF21 from the fifth, sixth or ninth amino acid to any amino acid located in the C-terminal direction.
  • the contiguous amino acid sequence has 2 to 30 amino acids
  • the C-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 is characterized in that the analog is a continuous amino acid sequence from any amino acid of the mature FGF21 up to the first, fourth, or eleventh amino acid from the C- terminal.
  • the contiguous amino acid sequence has 2 to 30 amino acids
  • C-terminal amino acid sequence of FGF19 is a contiguous amino acid sequence from any amino acid of FGF19 to C-terminal to the first amino acid
  • the contiguous amino acid sequence has 2 to 30 amino acids
  • N-terminal amino acid sequence of mature FGF21 and the C-terminal amino acid sequence of mature FGF21 or FGF19 are linked to each other via a linker
  • N-terminal amino acid sequence of mature FGF21 and C-terminal amino acid sequence of mature FGF21 or FGF19 are sequentially arranged in the N-terminal to C-terminal direction, or
  • the N-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 123 to 130,
  • the C-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 131 to 136,
  • the C-terminal amino acid sequence of the FGF19 is characterized in that the analog of SEQ ID NO: 137 or 138.
  • the FGF21 analog is characterized in that the FGF21 analog, having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 90 to 101.
  • exendin-4 sequence is a sequence in which the alpha carbon of histidine, the first amino acid, is removed from the native exendin-4 sequence, and the 32nd to 39th amino acid sequence is excluded.
  • the N-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 is characterized in that the FGF21 analog, which is the N-terminal amino acid sequence of FGF21, except for N-terminal 1 to 4 amino acids in the amino acid sequence of the mature FGF21.
  • the N-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 is a contiguous amino acid sequence from the N-terminal to the fifth amino acid to any amino acid located in the C-terminal direction in the amino acid sequence of the mature FGF21, and the C-terminal of the mature FGF21.
  • the amino acid sequence is a contiguous amino acid sequence from any amino acid of mature FGF21 to the first or fourth amino acid from the C-terminus
  • the C-terminal amino acid sequence of FGF19 is the first amino acid from C-terminus to any amino acid of FGF19. It is characterized in that the FGF21 analog, which is a sequence of amino acids up to.
  • the contiguous amino acid sequence is FGF21 analogue having 2 to 30 amino acids.
  • the FGF21 analogue is an exendin-4 sequence, an N-terminal amino acid sequence of mature FGF21, and an amino acid sequence of C-terminal sequence of mature FGF21 or FGF19, which are sequentially connected from the N-terminal to the C-terminal direction. It is characterized in that the FGF21 analog.
  • the N-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 139 to 142, and the C-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 143 to 147, and the mature FGF19 C-terminal amino acid sequence of, is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 148 to 150,
  • the FGF21 analog is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 103 to 113, characterized in that the FGF21 analog.
  • Another embodiment embodying the present invention is a polynucleotide encoding said FGF21 analog.
  • Another embodiment of the invention is a vector comprising said polynucleotide.
  • Another embodiment of the invention is a transformant containing the polynucleotide or a vector comprising the polynucleotide.
  • the FcRn binding agent is an FGF21 conjugate, which is an immunoglobulin Fc region.
  • the carrier comprises (iii) a peptide linker or polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaka It is characterized in that it is connected via a non-peptidyl linker selected from the group consisting of a ride, dextran, polyvinylethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid and combinations thereof.
  • the FGF21 analog Or an FGF21 conjugate comprising an FGF21 conjugate, a carrier selected from the group consisting of an FcRn binding substance, a fatty acid, polyethylene glycol, an amino acid fragment, and albumin, bound to the FGF21 analog or natural FGF21,
  • compositions for the prevention or treatment of metabolic syndrome are provided.
  • the metabolic syndrome includes disorders of glucose tolerance, hypercholesterolemia, dyslipidemia, obesity, diabetes, hypertension, nonalcoholic steatohepatitis (NAS), atherosclerosis caused by dyslipidemia, atherosclerosis, arteriosclerosis, and coronary heart disease ( Coronary heart disease), or liver metabolic disorders, characterized in that the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic syndrome.
  • NAS nonalcoholic steatohepatitis
  • atherosclerosis caused by dyslipidemia
  • atherosclerosis atherosclerosis
  • arteriosclerosis arteriosclerosis
  • Coronary heart disease coronary heart disease
  • liver metabolic disorders characterized in that the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic syndrome.
  • Another embodiment of the present invention comprises the steps of culturing the transformant to express the FGF21 analog; And recovering the expressed FGF21 analog from a transformant or a culture thereof.
  • Another embodiment embodying the present invention is a method for preparing a FGF21 conjugate, comprising binding a native FGF21 or FGF21 analog with a carrier selected from the group consisting of FcRn binders, fatty acids, polyethylene glycols, amino acid fragments, and albumin .
  • FGF21 analogue according to the present invention can be applied therapeutically useful in FGF21-related diseases.
  • Lane 1 shows the results of analysis of recombinant FGF21 purity by protein electrophoresis; Lane 1: size marker, lanes 2 and 3: purified FGF21, lanes 4 and 5: FGF21 containing impurities.
  • Figure 3 shows the results of confirming the binding capacity and in vitro glucose uptake activity of the FGF21 analog protein to beta-klotho (beta-klotho).
  • 4A to 4C are diagrams showing the results of reversal phase chromatography (RPC), ion exchange chromatography (EIX), and size exclusion chromatography (SEC) using HPLC to confirm purity after FGF21 analog purification, respectively.
  • 6A and 6B show the results of confirming the binding capacity and in vitro glucose uptake activity of beta-klotho of FGF19-FGF21 protein.
  • amino acids mentioned herein are abbreviated as follows according to the IUPAC-IUB nomenclature.
  • One embodiment embodying the present invention provides an FGF21 analog, wherein one or more amino acids in native fibroblast growth factor 21 (mutated) are removed, added, substituted, modified, or a combination thereof.
  • FGF21 analog refers to a modification of one or more amino acids in the amino acid sequence of native FGF21.
  • the FGF21 analog may be non-naturally occurring.
  • Naturally mature FGF21 can promote glucose uptake specifically for adipocytes.
  • Information about the native FGF21 protein can be easily obtained from known databases such as NCBI GenBank or UnitProt.
  • native FGF21 can be expressed in an immanture form with a total of 209 amino acids.
  • amino acids 1 to 28 from the N-terminus of the protein correspond to the signal sequence
  • amino acids 29 to 209 correspond to the sequence of mature FGF21 protein.
  • amino acid sequences of these immature forms of FGF21 are described in SEQ ID NOs: 87 and 88 (types L and P, respectively), but are not limited thereto.
  • amino acid sequence of this naturally occurring mature FGF21 examples include, but are not limited to, proteins represented by SEQ ID NOs: 4 (type L) and 151 (type P).
  • the FGF21 analog according to the present invention may have one or more of the following characteristics:
  • Modification of one or more amino acids in the native sequence means a modification selected from the group consisting of substitution, addition, removal, modification, and combinations thereof, of at least one amino acid in native FGF21. Can be.
  • the number of amino acids modified in the native FGF21 sequence is not particularly limited, but at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, 20 or more, 21 or more, 22 or more, 23 or more, 24 or more, 25 or more, 26 or more, 27 or more, 28 or more , 29 or more, 30 or more, 31 or more, 32 or more, 33 or more, 34 or more, 35 or more, 36 or more, 37 or more, 38 or more, 39 or more, 40 or more, 41 or more, 42 or more, 43 or more, 44 or more, 45 At least 46, at least 47, at least 48, at least 49, at least 50, at least 51, at least 52, at least 53, at least 54, at least 55, at least 56, at least 57, at least 58, at least 59, at least 60, at least 61,
  • amino acids commonly observed in human proteins can be used.
  • commercial sources of atypical amino acids include Sigma-Aldrich, ChemPep, Genzyme Pharmaceuticals, and the like.
  • Peptides containing these amino acids and formal peptide sequences can be synthesized and purchased through commercial peptide synthesis companies such as American Peptide Company or Bachem in the United States, or Anygen in Korea.
  • Amino acid derivatives can be obtained in the same manner, for example, desamino-histidine, beta-hydroxyimidazopropionic acid and 4-imidazoacetic acid. ), Beta-carboxyimidazopropionic acid and the like can be used.
  • the addition of the amino acid may be an addition of amino acid sequences derived from other peptides, such as FGF19 and / or insulin secreting peptides (eg exendin-3, exendin-4) other than FGF21.
  • the addition of such amino acids encompasses the addition of a large number of amino acids such as polypeptides or proteins.
  • the FGF21 analog may be a peptide having the same type of in vivo metabolic regulation as the native FGF21.
  • the FGF21 used in the examples of the present invention is an FGF21 analog made by genetic recombination technology, but the present invention is not limited to this, but encompasses various FGF21 analogs possessing the above-described characteristic activities.
  • the FGF21 analog may be prepared by a genetic recombination method according to its form, or may be prepared by a solid phase method, but is not limited thereto.
  • FGF21 analogs of the present invention include derivatives of native FGF21, fragments of native FGF21, and the like.
  • the term “derived from natural FGF21” refers to a peptide having one or more differences in amino acid sequence compared to a native FGF21, a peptide modified by modifying a native FGF21 sequence through modification, and the same kind as a native FGF21. Natural mimics of FGF21 that retain the physiological activity of
  • FGF21 may be homologous to a native FGF21 at least 80% amino acid sequence and / or some groups of one residue of FGF21 are chemically substituted (eg, alpha-methylation, alpha-hydroxylation), removed (eg; deamination) or modified form (eg, N-methylation), but is not limited thereto.
  • Combinations of the various methods for the preparation of derivatives can be used to prepare derivatives of the native FGF21 applied to the present invention.
  • modifications for the preparation of derivatives of native FGF21 include modifications with L- or D-type amino acids, and / or non-natural amino acids; And / or modifying by native or post-translational modification (eg, methylation, acylation, ubiquitination, intramolecular covalent bonds, etc.).
  • the substituted or added amino acids may use at least 20 amino acids commonly found in human proteins, as well as atypical or non-naturally occurring amino acids.
  • Commercial sources of atypical amino acids include Sigma-Aldrich, ChemPep and Genzyme pharmaceuticals. Peptides and formal peptide sequences containing these amino acids can be synthesized and purchased through commercial peptide synthesis companies, for example, American peptide company or Bachem in the United States, or Anygen in Korea.
  • fragment of natural FGF21 or derivative of natural FGF21 refers to a form in which one or more amino acids are removed at the amino or carboxy terminus of a native FGF21 or a derivative of native FGF21. Such fragments may possess the same type of physiological activity as native FGF21.
  • the preparation methods used in the FGF21 derivatives and fragments of the present invention may be used independently and may be combined.
  • peptides having a glycemic control function in a body having one or more amino acid sequences different from each other and deaminated to amino residues at the N-terminus are included.
  • the FGF21 analog may have one or more or two or more of three of the following (i) to (iii):
  • glycine amino acid 170 of naturally-occurring mature FGF21, is substituted with an amino acid other than glycine
  • serine amino acid 172 of naturally occurring mature FGF21, is substituted with an amino acid other than serine
  • the removal of one or more amino acids of amino acid sequences 1 to 4 of the native mature FGF21 may include removal of amino acid 1 and amino acid 2 from the N-terminus of native mature FGF21.
  • removal of amino acids 1, 1 and 2, or amino acids 1 to 4 of the native mature FGF21 may be removed, but is not limited thereto.
  • the corresponding variation may be one in which 167th amino acid serine and / or 168th amino acid methionine is substituted with threonine, alanine, phenylalanine, or isoleucine, and more specifically, each in its natural form. It may correspond to, but is not limited to, substitution of threonine of amino acid 167 with threonine of mature FGF21 and substitution of alanine, phenylalanine, or isoleucine of 168 amino acid with methionine.
  • an FGF21 analogue ( ⁇ H, M168A) with removal of histidine, amino acid 1 of native mature FGF21, and substitution of alanine for 168 amino acid methionine;
  • an FGF21 analogue ( ⁇ HP, S167T) having removal of histidine amino acid 1 and proline amino acid 2 of native-type mature FGF21 and substitution of threonine of amino acid 167;
  • an FGF21 analogue ( ⁇ HP, M168A) having the elimination of histidine, amino acid 1 and proline, amino acid 2 of the native mature FGF21, and substitution of alanine for methionine, amino acid 168;
  • FGF21 analogs ( ⁇ HP, M168F) having removal of histidine amino acid 1 and proline amino acid 2 of native-type mature FGF21 and substitution of 168 amino acid methionine with phenylalanine;
  • FGF21 analogs ( ⁇ HP, M168I) with removal of histidine amino acid 1 and proline amino acid 2 of native-type mature FGF21, and substitution of isoleucine with 168 amino acid methionine;
  • the FGF21 analog having the above-described mutations may include 1) a site cleaved upon expression of the analog and / or 2) a site cleaved in vivo, such as a site cleaved by DPPIV (Dipeptidyl peptidase-4) and And / or the site cleaved by the fibroblast activating protein (FAP) may have been removed, and / or 3) the binding to the receptor and / or co-receptor may be reduced compared to native mature FGF21, but is not limited thereto. .
  • DPPIV Dipeptidyl peptidase-4
  • FAP fibroblast activating protein
  • amino acids 1 to 4 eg HPIP
  • the amino acid located may be substituted with another amino acid, but is not limited thereto.
  • the FGF21 analogue according to the present invention has a long half-life compared to the native mature FGF21 due to the removal of the site cleaved at the time of expression and / or in vivo, while the removal by the receptor is significantly reduced by increasing the dissociation constant. It is characterized by an increased half-life.
  • the FGF21 analog may be an FGF21 analog having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18, 20, 22, 24, 26, and 86, but is not particularly limited thereto.
  • the FGF21 analog according to the present invention may include the following mutations together with or independently of the above-described mutations.
  • the FGF21 analogue according to the present invention is the fifth, sixth, seventh, eighth, ninth, 168, 172, 176, 177, and 178 amino acids of native FGF21.
  • One or more amino acids selected from the group consisting of the first amino acid are substituted with another amino acid, and / or
  • It may be an analog comprising a feature added with an amino acid sequence comprising the amino acid sequence 16 to 20 from the N-terminus of the native mature FGF19.
  • the other amino acid may be alanine, but is not particularly limited thereto.
  • any amino acid that can reduce the binding capacity to the FGF21 receptor and / or co-receptor compared to the unsubstituted FGF21 is included in the category of other amino acids without limitation.
  • FGF21 analogue ( ⁇ H, D5A, M168A) with removal of histidine, amino acid 1 of amino acid FGF21, substitution of apartin of aspartic acid, amino acid 5, with alanine, amino acid 168, ;
  • an FGF21 analogue ( ⁇ H, S6A, M168A) with the removal of histidine, amino acid 1 of amino acid FGF21, substitution of arineine for serine 6 amino acid, and alanine for amino acid 168;
  • FGF21 analogues ( ⁇ H, S7A, M168A) with removal of histidine, amino acid 1 of amino acid FGF21, substitution of arine for a serine of amino acid 7, and alanine for amino acid 168;
  • FGF21 analogs ( ⁇ H, P8A, M168A) with removal of histidine, amino acid 1 of amino acid FGF21, substitution of alanine for proline amino acid 8, and alanine for amino acid 168;
  • FGF21 analogs ( ⁇ H, L9A, M168A) with removal of histidine, amino acid 1 of amino acid FGF21, substitution of leucine of amino acid 9 with alanine, and substitution of alanine with methionine amino acid 168;
  • FGF21 analogs ( ⁇ H, S172A, M168A) with removal of histidine, amino acid 1 of amino acid FGF21, substitution of arineine for serine, amino acid 172, and alanine for amino acid 168;
  • FGF21 analogs ( ⁇ H, S176A, M168A) with removal of histidine, amino acid 1 of amino acid FGF21, substitution of arineine for serine, amino acid 176, and alanine for amino acid 168;
  • FGF21 analogs ( ⁇ H, P177A, M168A) with removal of histidine, amino acid 1 of amino acid of natural type FGF21, substitution of alanine for proline, amino acid 177, and alanine for amino acid 168;
  • FGF21 analogs ( ⁇ H, S178A, M168A) with removal of histidine, amino acid 1 of amino acid FGF21, substitution of arineine for serine, amino acid 178, and alanine for amino acid 168;
  • FGF21 analogue with removal of histidine amino acid 1 and proline amino acid 2 of amino acid FGF21, substitution of aspartic acid amino acid 5 with alanine, and substitution of 168 amino acid methionine with alanine ⁇ HP, D5A, M168A);
  • FGF21 analogue ( ⁇ HP) with the removal of histidine amino acid 1 and proline amino acid 2 of the native mature FGF21, substitution of a serine of serine 6 amino acid with alanine, and substitution of alanine with methionine amino acid 168 , S6A, M168A);
  • FGF21 analogue ( ⁇ HP) with removal of histidine amino acid 1 and proline amino acid 2 of amino acid FGF21, substitution of a serine of serine 7 amino acid, and alanine of amino acid 168 , S7A, M168A);
  • FGF21 analogue ( ⁇ HP) with the removal of histidine amino acid 1 and proline amino acid 2 of prophylactic mature FGF21, substitution of alanine for amino acid proline 8 with alanine, and substitution of alanine for amino acid 168 with alanine , P8A, M168A);
  • FGF21 analogue with the removal of histidine amino acid 1 and proline amino acid 2 of amino acid FGF21, substitution of leucine amino acid 9 with alanine, and substitution of alanine with methionine amino acid 168 , L9A, M168A);
  • FGF21 analogue ( ⁇ HP) with removal of histidine amino acid 1 and proline amino acid 2 of amino acid FGF21, substitution of arineine for serine amino acid 172, and alanine for amino acid 168 , S172A, M168A);
  • FGF21 analogue ( ⁇ HP) with the removal of histidine amino acid 1 and proline amino acid 2 of the native type FGF21, substitution of arineine for amino acid 176 with alanine, and alanine for amino acid 168 with alanine , S176A, M168A);
  • FGF21 analogues ( ⁇ HP) with removal of histidine amino acid 1 and proline amino acid 2 of the native mature FGF21, substitution of alanine for proline amino acid 177, and alanine for amino acid 168 with alanine , P177A, M168A);
  • FGF21 analogue ( ⁇ HP) with removal of histidine amino acid 1 and proline amino acid 2 of amino acid FGF21, substitution of arineine for serine amino acid 178, and alanine for amino acid 168 , S178A, M168A).
  • the above-described FGF21 analog has a cleavage site and / or has a reduced binding capacity with FGF21 receptors and / or co-receptors (beta-klotho) relative to native FGF21 and / or reduced receptor mediated rejection compared to native FGF21. -mediated clearance (RMC).
  • the FGF21 analog is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, and 80 , May be an FGF21 analog having an amino acid sequence, but is not particularly limited thereto.
  • the FGF21 analogue according to the present invention may be a natural FGF21-derived amino acid sequence of FGF19 or a fragment thereof; Or is added to a derivative of native FGF21 or a fragment thereof.
  • an amino acid sequence comprising an amino acid sequence 16 to 20 from the N-terminus of native mature FGF19 may be added may be included independently or with the mutation (s) described above.
  • the "FGF19" described in the present invention includes a substance capable of expressing metabolic activity by targeting both adipocytes and hepatocytes.
  • the FGF19 may bind to FGFR4 and exhibit its metabolic activity, particularly metabolic activity to the liver.
  • An example is the ability to regulate bile acids.
  • the FGF19 is a concept including not only a naturally occurring mature FGF19 protein but also derivatives and fragments of native FGF19, and the detailed description of the derivatives and fragments also applies to the contents described above in FGF21.
  • the native mature FGF19 may exhibit metabolic activity against adipocytes and / or liver cells.
  • Information about the native FGF19 protein can be easily obtained from known databases such as NCBI GenBank or UnitProt.
  • the native FGF19 may have an amino acid sequence corresponding to NCBI Accession Number NP — 005108. That is, native FGF19 can be expressed as a protein of 216 amino acids in total. In this case, amino acids 1 to 22 from the N-terminus of the protein correspond to the signal sequence, and amino acids 23 to 216 correspond to the sequence of the mature FGF19 protein.
  • amino acid sequence of the native type FGF19 in this immature form examples include, but are not limited to, the protein represented by SEQ ID NO: 89, and amino acid sequences 23-216 in the sequence are mature FGF19 sequences. Corresponds to
  • amino acid sequence 16 to 20 from the N-terminus of the native mature FGF19 may be WGDPI (SEQ ID NO: 122).
  • amino acid sequence including the amino acid sequence of 16 to 20 amino acids from the N-terminal end of the native mature FGF19 may be composed of 5 to 20 amino acids.
  • amino acid sequence comprising the amino acid sequence 16 to 20 from the N- terminal of the native mature FGF19, the amino acid sequence of 14 to 20 from the N- terminal of the mature FGF19 of the native type ( SEQ ID NO: 152) or amino acid sequence 15 to 20 (SEQ ID NO: 153).
  • the FGF21 analog to which the amino acid sequence was added containing the amino acid sequence 16-16 of the N-terminus of a native mature FGF19 added the amino acid sequence 16-20 from the N-terminal of a native mature FGF19
  • the amino acid sequence, including the sequence may be added to the full length sequence of mature FGF21 or an active fragment thereof.
  • amino acid sequence comprising the amino acid sequence 16 to 20 from the N-terminus of the native mature FGF19, the C-terminus thereof is added to the full-length sequence of the mature FGF21 or the N-terminus of the active fragment thereof Form, FGF21 analog.
  • amino acid sequence comprising the amino acid sequence from 16 to 20 from the N-terminus of the native mature FGF19 may be linked directly or via a linker to the full length sequence of the mature FGF21 or an active fragment thereof.
  • the linker may be a flexible linker, and specifically, may be a peptide linker or a non-peptide linker.
  • non-peptide linker refers to a biocompatible linker in which two or more repeating units are linked, and the repeating units are connected to each other through any covalent bonds, not peptide bonds.
  • Non-limiting examples of such non-peptide linkers include polyethylene glycol (PEG) homopolymers, polypropylene glycol homopolymers, ethylene glycol-propylene glycol copolymers, polyoxy ethylated polyols, polyvinyl alcohols, polysaccharides, Dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymers, lipid polymers, chitin, hyaluronic acid or combinations thereof, but is not limited thereto.
  • PEG polyethylene glycol
  • the conjugate may be in the form of a fusion protein including FGF19 and FGF21.
  • fusion protein examples include, but are not limited to, a fusion protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 119 or 121. It is apparent to those skilled in the art that in the preparation of the fusion protein, there may be additional amino acid sequences for fusion as well as the original amino acid sequence of the fusion partner for recombinant linkage of each fusion partner. In this case, the scope of the fusion protein should not be construed as limited to the sequence numbers described.
  • the FGF21 analog according to the present invention may include the following mutations together with or independently of the above-described mutations, but is not particularly limited thereto.
  • amino acid sequence of (i) the N-terminal end of mature FGF21 may be added to (ii) the C-terminal amino acid sequence of mature FGF21 or FGF19.
  • it may comprise (i) the N-terminal amino acid sequence of mature FGF21 and (ii) the C-terminal amino acid sequence of mature FGF21 or FGF19, wherein (i) and (ii) may be directly or Indirectly linked, in the form of a FGF21 mock peptide derivative.
  • Such an FGF21 analog of the present invention may have a structure in which up to 30 amino acid sequences located at the N-terminal portion of the naturally occurring mature FGF21 and 30 or less amino acid sequences located at the C-terminal portion are combined.
  • some groups of amino acid residues here may be chemically substituted (e.g., alpha-methylation, alpha-hydroxylation), removed (e.g., deamination) or modified (e.g., N-methylated), and metabolized in the body. It can have the ability to adjust.
  • the FGF21 analog has a portion of the N-terminus important for binding of the FGF21 receptor and a portion of the C-terminus of the FGF21 or FGF19 which directly binds to the FGF21 co-receptor beta-closo in the mature FGF21 sequence excluding the signal sequence. It may be combined.
  • the FGF21 analog may have a decreased binding capacity to the FGF21 receptor than the native FGF21, and may have an increase in blood half-life due to a significant decrease in receptor-mediated clearance caused by an increase in dissociation constant. have.
  • the FGF21 analog may include an N-terminal amino acid sequence of FGF21, in which all N-terminals 1 to 4 amino acids are excluded from an amino acid sequence of mature FGF21 that does not include a signal sequence. .
  • the N-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 included in the FGF21 analog of the present invention is in the C-terminal direction from the fifth, sixth or ninth amino acid from the N-terminus in the amino acid sequence of the mature FGF21. It can be a contiguous amino acid sequence up to any amino acid located.
  • the consecutive amino acids are 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, May have 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 amino acids, but is not limited thereto It doesn't work.
  • the N-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 may be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 123 to 130, but is not limited thereto.
  • the FGF21 imitation peptide derivative exhibiting a lower titer than the natural FGF21 according to the present invention it is not limited to the sequence, 70% or more, specifically 80% or more, 81% or more with the sequence.
  • Amino acid sequences that exhibit at least%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of similarity are also included within the scope of the present invention.
  • sequence having such similarity it is obvious that the case where some sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added is also included within the scope of the present invention. The same applies to the description of the C-terminal amino acid sequence of FGF21, the C-terminal amino acid sequence of FGF19, and the specific sequence of the FGF21 mock peptide derivative which will be described later.
  • similarity is intended to represent a similar degree to a wild type amino acid sequence or nucleic acid sequence, and the comparison of the homology may be performed by using a comparison program known in the art, which is easy to be seen with the naked eye.
  • Commercially available computer programs can calculate the similarity between two or more sequences as a percentage. In addition,% similarity can be calculated for adjacent sequences.
  • the C-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 included in the FGF21 mock peptide derivative of the present invention is from any amino acid of mature FGF21 to the 1st, 4th, or 11th amino acid from the C-terminus. It may be a contiguous amino acid sequence.
  • the consecutive amino acids are 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, May have 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 amino acids, but is not limited thereto It doesn't work.
  • the C-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 may be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 131 to 136, but is not limited thereto.
  • the C-terminal amino acid sequence of FGF19 included in the FGF21 analog of the present invention may be a contiguous amino acid sequence from any amino acid of FGF19 to C-terminal to the first amino acid.
  • the consecutive amino acids are 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, May have 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 amino acids, but is not limited thereto It doesn't work.
  • amino acid sequence of FGF19 is shown in SEQ ID NO: 89.
  • 1 to 24 is a signal sequence and 25 to 216 correspond to a mature FGF19 amino acid sequence.
  • the C-terminal amino acid sequence of the mature FGF19 may be SEQ ID NO: 137 or 138, but is not limited thereto.
  • the FGF21 mock peptide derivative is composed of several combinations of sequences starting from the N-terminal fourth, fifth and ninth amino acids of the native mature FGF21 and sequences starting from the first, fourth and eleventh amino acids of the C-terminal. Can be configured.
  • the present invention is not limited thereto, and all FGF21 analogs having reduced binding to the FGF21 receptor fall within the scope of the present invention.
  • the N-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 123 to 130
  • the C-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 131 to 136
  • the FGF19 The amino acid sequence of the C-terminus of may be an FGF21 analog, SEQ ID NO: 137 or 138. Various combinations thereof are included in the scope of the present invention.
  • the FGF21 analog may include an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 90 to 101. However, it is not limited thereto.
  • the FGF21 analog is not particularly limited in length as long as it can activate the FGF21 receptor and / or co-receptor (ie, beta-closo), but for example, may have 4 to 100 amino acids. However, it is not limited to what was described above.
  • amino acid sequence of the N- terminal of the mature FGF21 and (ii) the amino acid sequence of the C-terminal of the mature FGF21 or FGF19 may be linked to each other through a linker.
  • the linker is not particularly limited as long as the linker connects (i) and (ii) and brings the FGF21 imitation peptide derivative to the FGF21 receptor.
  • the linker may be a flexible linker.
  • the flexible linker may increase flexibility in binding the N-terminal amino acid sequence of FGF21 to the FGF21 receptor and the C-terminal amino acid sequence of FGF21 or FGF19 to the FGF21 co-receptor.
  • the linker may be a peptidic linker or a non-peptidyl linker, but is not limited thereto.
  • the linker is as described above.
  • the amino acid sequence of (i) the N-terminus of the mature FGF21 and (ii) the C-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 or FGF19 are sequentially arranged from the N-terminal to the C-terminal direction, although not limited thereto. Can be.
  • the present invention is not limited thereto, and (ii) the amino acid sequence of the C-terminus of mature FGF21 or FGF19 and (i) the amino acid sequence of the N-terminus of mature FGF21 are sequentially arranged from the N-terminus to the C-terminal direction. Can be.
  • the FGF21 analog according to the present invention may include the following mutations together with or independently of the above-described mutations, but is not particularly limited thereto.
  • the N-terminal amino acid sequence of mature FGF21 is added to (ii) the C-terminal amino acid sequence of mature FGF21 or FGF19, and (iii) the exendin-4 sequence is added.
  • it may be FGF21 analog.
  • FGF21 analog which is a dual GLP-1 / FGF21 agonist, including an Excendin-4 sequence, a mature FGF21 N-terminal region and a mature FGF21 or FGF19 C-terminal region.
  • the FGF21 analog may be a reduced GLP-1 or FGF21 titer as compared to native GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) or FGF21.
  • This double GLP-1 / FGF21 agonist, the FGF21 analog has a decreased binding capacity to the GLP-1 receptor, the FGF21 receptor, and / or the FGF21 co-receptor than the native GLP-1 and FGF21. This may be due to a significant decrease in clearance, resulting in increased blood half-life.
  • the "dual GLP-1 / FGF21 agonist” may comprise an exendin-4 peptide derived sequence, a mature FGF21 N-terminal sequence, and a C-terminal sequence of mature FGF21 or FGF19.
  • such structural properties may result in reduced GLP-1 and / or FGF21 titers, and any GLP-1 / FGF21 agonist possessing these properties may be included in the scope of the present invention without limitation.
  • exendin-4 peptide-derived sequence included in the double GLP-1 / FGF21 agonist is exendin-4, ie, imidazoacetyl-Exendin, from which the alpha carbon of histidine, the first amino acid, is removed from the exendin-4 sequence.
  • exendin-4 imidazoacetyl-exendin-4, CA-exendin-4 derived sequence.
  • the alpha carbon of the first amino acid histidine is removed from the native exendin-4 sequence, and may be a sequence from which the 32nd to 39th amino acid sequences are excluded.
  • the present invention is not limited thereto, and the exendin-4 sequence includes all CA-exedin-4 sequences having reduced GLP-1 titers.
  • the FGF21 sequence applied to the double GLP-1 / FGF21 agonist is directly linked to betacloso, an FGF21 co-receptor, and a portion of the N-terminus important for the binding of the FGF21 receptor in the mature FGF21 sequence except for the signal sequence.
  • -Part of the terminal may be a sequence consisting of a combination.
  • N-terminus or “C-terminus” may refer to the N-terminal region or C-terminal region of FGF21 or FGF19 which may constitute the dual GLP-1 / FGF21 agonist.
  • the dual GLP-1 / FGF21 agonists of the present invention are dual agents comprising an exendin-4 peptide, an N-terminal sequence of mature FGF21 amino acid sequence, and a C-terminal of mature FGF21 or FGF19 amino acid sequence, but the present invention is limited thereto. Rather, it includes all dual GLP-1 / FGF21 agonists with reduced in - vitro titers.
  • FGF19 binds to the FGF receptor like FGF21
  • FGF19 is preceded by betacloso, an FGF co-receptor, and it is known that the C-terminus of FGF19 binds to betacloso and its binding force is stronger than that of FGF21.
  • sequences consisting of the binding of the mature FGF21 N-terminus to the FGF19 C-terminus.
  • FGF21 N-terminal amino acid sequence used in the present invention is N-terminal except N-terminal 1st amino acid (Histidine) to 4th amino acid (Proline) does not affect activity in the mature FGF21 amino acid sequence that does not include a signal sequence
  • the amino acid sequence of the site can be used and specifically, in the amino acid sequence of mature FGF21, a contiguous amino acid sequence from the N-terminus to the fifth amino acid to any amino acid located in the C-terminus direction can be used.
  • the C-terminal amino acid sequence of mature FGF21 is a contiguous amino acid sequence from any amino acid of mature FGF21 to the first or fourth amino acid from the C-terminus
  • the C-terminal amino acid sequence of FGF19 is any of FGF19 Contiguous amino acid sequence from amino acid to C-terminus to first amino acid.
  • the contiguous amino acid sequence may be composed of 2 to 30 amino acid sequences.
  • exendin-4 sequence (ii) FGF21 N-terminal amino acid sequence, and (iii) FGF21 C-terminal amino acid sequence or FGF19 C-terminal amino acid sequence may be FGF21 analogs linked to each other.
  • N-terminal amino acid sequence of mature FGF21 and the C-terminal amino acid sequence of mature FGF21 or FGF19, or the N-terminal amino acid sequence and exendin-4 sequence of mature FGF21 are directly It may be connected or connected via a linker, the linker as described above.
  • the linker may increase flexibility in binding exendin-4, a GLP-1 analog, to the GLP-1 receptor.
  • the N-terminus of FGF21 binds to the FGF21 receptor and FGF21 or the C-terminus of FGF19 can increase flexibility in binding to the FGF21 co-receptor.
  • the FGF21 analog may be one in which the exendin-4 sequence, the amino acid sequence of the N-terminus of mature FGF21, and the amino acid sequence of the C-terminus of mature FGF21 or FGF19 are sequentially connected from the N-terminal to the C-terminal direction. .
  • the N-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 139 to 142
  • the C-terminal amino acid sequence of the mature FGF21 is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 143 to 147
  • the amino acid sequence of the C-terminus of mature FGF19 may be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 148 to 150, but is not limited thereto.
  • the FGF21 analog may be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 103 to 113.
  • the FGF21 analog of the present invention can be produced by standard synthetic methods, recombinant expression systems, or any other method of the art.
  • FGF21 analogs according to the invention can be synthesized in a number of ways, including for example, including:
  • Another embodiment embodying the present invention provides a transformant comprising a polynucleotide encoding the FGF21 analog, a vector comprising the polynucleotide, or a vector comprising the polynucleotide or the polynucleotide.
  • the FGF21 analog is as described above.
  • vector refers to a DNA preparation containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding said FGF21 analog operably linked to a suitable regulatory sequence such that the target protein, such as said FGF21 analog, can be expressed in a suitable host. do.
  • the regulatory sequence includes a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the recombinant vector can be transformed into a suitable host cell and then replicated or functioned independently of the host genome and integrated into the genome itself.
  • the recombinant vector to be used in the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host cell, and may be produced using any vector known in the art.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages. For example, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc.
  • the vector usable in the present invention is not particularly limited and known expression vectors can be used.
  • the recombinant vector can be used to transform host cells to produce the FGF21 analog of the present invention.
  • Such transformed cells which are also part of the present invention, may be cultured cells or cell lines used for propagation of the nucleic acid fragments and vectors of the invention or used for recombinant production of the conjugates of the invention.
  • transformation in the present invention means introducing a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding a target protein into a host cell to allow the protein encoded by the polynucleotide to be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide it includes all of them regardless of whether they are inserted into or located outside the chromosome of the host cell.
  • the polynucleotide also includes DNA and RNA encoding the target protein.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be expressed by being introduced into a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette may include a promoter, a transcription termination signal, a ribosomal binding site, and a translation termination signal, which are typically operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form, and may be operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that the gene sequence is functionally linked with a promoter sequence for initiating and mediating the transcription of a polynucleotide encoding the FGF21 analog of the present invention.
  • Suitable hosts for the present invention are not particularly limited as long as they allow expression of the polynucleotide of the present invention.
  • Specific examples of hosts that can be used in the present invention include bacteria of the genus Escherichia , such as E. coli ; Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) and Bacillus (Bacillus), such as bacteria belonging to the genus; Bacteria of the genus Pseudomonas , such as Pseudomonas putida ; Pichia pastoris , Saccharomyces cerevisiae ), Schizosaccharomyces yeast such as pombe ); Insect cells such as Spodoptera luciferda (Sf9); And animal cells such as CHO, COS, BSC and the like.
  • FGF21 native FGF21 or said FGF21 analog
  • FGF21 conjugate to which a carrier selected from the group consisting of FcRn binder, fatty acid, polyethylene glycol, amino acid fragment, and albumin is bound.
  • the FGF21 and the FGF21 analog are as described above.
  • the FcRn binding agent may be an immunoglobulin Fc region.
  • the FGF21 conjugate may include (i) a native FGF21 or the FGF21 analog and (ii) a carrier (iii) a peptide linker, or polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, Polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, and combinations thereof.
  • each end of the non-peptidyl polymer may be bound to an immunoglobulin Fc region and an amine group or thiol group of FGF21, respectively.
  • the immunoglobulin Fc region, or immunoglobulin constant region, of the present invention is a biodegradable polypeptide that is metabolized in vivo, it is safe to use as a carrier for drugs.
  • the immunoglobulin Fc region is advantageous in terms of the manufacture, purification and yield of the conjugate because of its relatively low molecular weight compared to the whole immunoglobulin molecule, as well as the removal of Fab moieties that exhibit high heterogeneity because the amino acid sequence varies from antibody to antibody. It is also expected that the homogeneity will be greatly increased and the likelihood of inducing blood antigens will be lowered.
  • an "immunoglobulin Fc region” or an “immunoglobulin constant region” is a site including a heavy chain constant region 2 (CH2) and / or a heavy chain constant region 3 (CH3) moiety except for the heavy and light chain variable regions of an immunoglobulin. Means.
  • the immunoglobulin Fc region may be one component of a moiety of the FGF21 conjugate of the present invention.
  • the immunoglobulin Fc region may include a hinge portion in the heavy chain constant region, but is not limited thereto.
  • some or all heavy chain constant region 1 (CH1) and / or light chain constant region It may be an extended Fc region including 1 (CL1). It may also be a region from which some fairly long amino acid sequences corresponding to CH2 and / or CH3 have been removed.
  • the immunoglobulin Fc regions of the present invention may comprise 1) CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain and CH4 domain, 2) CH1 domain and CH2 domain, 3) CH1 domain and CH3 domain, 4) CH2 domain and CH3 domain, 5) Combination of one or two or more of the CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain and CH4 domain with an immunoglobulin hinge region (or a portion of the hinge region), 6) heavy chain constant region may be a dimer of each domain and light chain constant region .
  • an immunoglobulin hinge region or a portion of the hinge region
  • the immunoglobulin Fc region may be in a dimeric form, and one molecule of FGF21 or an analog thereof may be covalently linked to one Fc region in a dimeric form, wherein the immune Globulin Fc and FGF21 or analogs thereof may be linked to each other by non-peptidyl polymers.
  • the immunoglobulin Fc and FGF21 or an analog thereof may be connected to each other by a non-peptidyl polymer.
  • immunoglobulin Fc regions of the present invention include naturally occurring amino acid sequences as well as sequence derivatives thereof.
  • Amino acid sequence derivatives mean that one or more amino acid residues in a natural amino acid sequence have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • IgG Fc amino acid residues 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322 or 327 to 331 which are known to be important for binding can be used as suitable sites for modification.
  • various kinds of derivatives are possible, such as a site capable of forming disulfide bonds, a few amino acids at the N-terminus in the native Fc, or a methionine residue may be added at the N-terminus of the native Fc.
  • the complement binding site such as C1q binding site may be removed, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) site may be removed in order to eliminate the effector function.
  • ADCC antibody dependent cell mediated cytotoxicity
  • Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art (H. Neurode, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly.
  • it may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation and amidation. may be modified.
  • Fc derivatives may exhibit biological activities equivalent to those of the Fc region of the present invention and may increase structural stability to heat, pH, etc. of the Fc region.
  • the Fc region may be obtained from a natural type separated in vivo from animals such as humans, cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats or guinea pigs, or obtained from transformed animal cells or microorganisms. It may be recombinant or a derivative thereof.
  • the method of obtaining from the natural form may be a method of separating the whole immunoglobulin from a human or animal living body, and then processing the protease. When treated with papain, it is cleaved into Fab and Fc, and when treated with pepsin, it is cleaved into pF'c and F (ab) 2 . Fc or pF'c may be separated by size-exclusion chromatography or the like.
  • the human-derived Fc region is a recombinant immunoglobulin Fc region obtained from a microorganism.
  • the immunoglobulin Fc region may be in a natural sugar chain, an increased sugar chain compared to the natural form, a reduced sugar chain or a sugar chain removed from the natural form.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms can be used to increase or decrease such immunoglobulin Fc sugar chains.
  • the immunoglobulin Fc region in which the sugar chain is removed from the Fc is significantly reduced in binding strength with the complement (c1q), and antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity is reduced or eliminated, thereby not causing an unnecessary immune response in vivo. Do not.
  • a form more consistent with the original purpose as a carrier of the drug would be the immunoglobulin Fc region from which the sugar chains have been removed or unglycosylated.
  • “Deglycosylation” refers to an Fc region in which sugar is removed by an enzyme
  • Aglycosylation refers to an Fc region which is not produced and glycosylated in prokaryotes, and more specifically, in Escherichia coli. .
  • the immunoglobulin Fc region may be of human origin or animal origin such as cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, etc., and in more specific embodiments is human origin.
  • the immunoglobulin Fc region may be an Fc region by IgG, IgA, IgD, IgE, IgM derived or combinations thereof or hybrids thereof. In more specific embodiments it is derived from IgG or IgM, which is most abundant in human blood, and in more specific embodiments it is of IgG known to enhance the half-life of ligand binding proteins. In even more specific embodiments the immunoglobulin Fc region is an IgG4 Fc region, and in the most specific embodiment the immunoglobulin Fc region is a non-glycosylated Fc region derived from human IgG4, but is not limited thereto.
  • “combination” in the present invention means that, when forming a dimer or multimer, a polypeptide encoding a single-chain immunoglobulin Fc region of the same origin forms a bond with a single-chain polypeptide of different origin. That is, it is possible to prepare dimers or multimers from two or more fragments selected from the group consisting of Fc fragments of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc and IgE.
  • non-peptidyl polymer refers to a biocompatible polymer having two or more repeating units bonded thereto, and may be one component forming a moiety of the FGF21 conjugate of the present invention.
  • the repeating units are linked to each other through any covalent bond, not a peptide bond.
  • the non-peptidyl polymer may be used in combination with the non-peptidyl linker.
  • Non-peptidyl polymers usable in the present invention include polyethylene glycol, polypropylene glycol, copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, polyoxy ethylated polyols, polyvinyl alcohol, polysaccharides, dextran, polyvinyl ethyl ether, PLA ( Biodegradable polymers such as polylactic acid, polylactic acid) and PLGA (polylactic-glycolic acid), lipid polymers, chitins, hyaluronic acid, and combinations thereof. Glycol (PEG). Analogs thereof known in the art and analogs which can be easily manufactured at the technical level in the art are included in the scope of the present invention.
  • the non-peptidyl polymer of the present invention may have a reactor capable of binding to the carrier of the present invention, for example, an immunoglobulin Fc region and FGF21. That is, it can be linked to a carrier such as an immunoglobulin Fc region and FGF21 or these analogues through the reactor of the non-peptidyl polymer.
  • Both terminal reactors of the non-peptidyl polymer are preferably selected from the group consisting of reaction aldehyde groups, propion aldehyde groups, butyl aldehyde groups, maleimide groups and succinimide analogs.
  • the functional group containing the aldehyde group may be an alkyl aldehyde such as propion aldehyde, butyl aldehyde. Therefore, specifically, the non-peptidyl polymer may be PEG in which a propion aldehyde group is substituted at the sock end.
  • succinimid analog succinimidyl propionate, hydroxy succinimidyl, succinimidyl carboxymethyl or succinimidyl carbonate can be used.
  • the non-peptidyl polymer has a reactor of reactive aldehyde groups at both ends, it is effective to minimize nonspecific reactions and to bind FGF21 and immunoglobulins at both ends of the non-peptidyl polymer, respectively.
  • the final product, resulting from reductive alkylation by aldehyde bonds, is much more stable than linked by amide bonds.
  • the aldehyde reactor selectively reacts to the N-terminus at low pH and can form covalent bonds with lysine residues at high pH, for example pH9.0 conditions.
  • Both terminal reactors of the linker which is the non-peptidyl polymer may be the same or different from each other.
  • one end may have a maleimide group and the other end may have an aldehyde group, a propion aldehyde group, or a butyl aldehyde group.
  • the hydroxy group may be activated into the various reactors by a known chemical reaction, or a polyethylene glycol having a commercially available modified reactor may be used. Sustained conjugates of the invention can be prepared.
  • the non-peptidyl polymer of the present invention may each have a reactor selected from the group consisting of aldehyde, maleimide, vinylsulfone, thiol, disulfide orthopyridine, iodide acetamide, succinimide and their derivatives each independently And, it may be covalently linked to each of the FGF21 and the carrier, for example immunoglobulin Fc region through the reactor of the both ends.
  • the conjugates of the present invention are those wherein the reactors at both ends of the non-peptidyl polymer are bound to the carrier and the amine group or thiol group of FGF21, respectively, or the reactors at both ends of the non-peptide polymer are respectively FGF21 and It may be bound to the N-terminal amine group of the carrier or the amine group of the Lys residue side chain.
  • the non-peptidic polymer includes a reactor capable of binding to a carrier, for example, an immunoglobulin Fc region and FGF21 at both ends, and the reactor is not particularly limited thereto, but is not particularly limited to an aldehyde group, propionaldehyde.
  • a carrier for example, an immunoglobulin Fc region and FGF21 at both ends
  • the reactor is not particularly limited thereto, but is not particularly limited to an aldehyde group, propionaldehyde.
  • a succinimide analog succinimidyl propionate, hydroxy succinimidyl, succinimidyl carboxymethyl or succinimidyl carbonate
  • non-peptidyl polymer that can be used in the present invention can be used without limitation so long as it is a polymer resistant to proteolytic enzymes in vivo.
  • Non-peptidyl polymers preferably have a molecular weight in the range of 1 to 100 kDa, specifically 1 to 20 kDa.
  • the non-peptidyl polymer of the present invention which is combined with FGF21 or a carrier, may be used not only with one kind of polymer but also with a combination of different kinds of polymers.
  • the non-peptidyl polymer used in the present invention may have a two- or three-terminal reactor that can be combined with FGF21 and a carrier. Specifically, the reactor may be an aldehyde group.
  • the present invention provides a composition comprising the FGF21 analog or FGF21 conjugate.
  • the FGF21 conjugate is as described above.
  • a persistent formulation for FGF21 comprising an FGF21 analog or FGF21 conjugate.
  • the long-acting formulation may be an FGF21 conjugated persistent formulation or an FGF21 analog persistent formulation having increased in vivo persistence and stability compared to native FGF21.
  • the long-acting formulation may be a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic syndrome to be described later.
  • long-acting formulations or pharmaceutical compositions of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” refers to a carrier or diluent that does not irritate an organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • the carrier may include a kind of non-naturally occuring carrier.
  • excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments and flavorings can be used.
  • buffers, preservatives, analgesics, solubilizers, isotonic and stabilizing agents can be used in combination.
  • bases, excipients, lubricants and preservatives may be used.
  • the formulations of the long-acting formulations or pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared in a variety of mixtures with the pharmaceutically acceptable carriers described above.
  • FGF21 analog or FGF21 analog or natural FGF21 to the carrier selected from the group consisting of FcRn binding material, fatty acid, polyethylene glycol, amino acid fragment, and albumin, FGF21 conjugate comprising an FGF21 conjugate as an active ingredient, for the prevention or treatment of metabolic syndrome It provides a pharmaceutical composition.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of metabolic syndrome disease by administration of the FGF21 analog, FGF21 conjugate, or a composition comprising the same
  • treatment refers to the FGF21 analog, FGF21 conjugate, Or it refers to any action that improves or benefits the symptoms of metabolic syndrome disease by administration of a composition comprising the same.
  • the metabolic syndrome includes disorders of glucose tolerance, hypercholesterolemia, dyslipidemia, obesity, diabetes, hypertension, nonalcoholic steatohepatitis (NAS), atherosclerosis caused by dyslipidemia, atherosclerosis, arteriosclerosis, and coronary heart disease (Coronary heart disease) may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • NAS nonalcoholic steatohepatitis
  • atherosclerosis caused by dyslipidemia atherosclerosis
  • arteriosclerosis arteriosclerosis
  • coronary heart disease Coronary heart disease
  • the term "administration" means introducing a predetermined substance into a patient in any suitable manner, and the route of administration of the composition is not particularly limited, but any general route by which the composition can reach a target in vivo.
  • Can be administered for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, rectal administration, and the like. have.
  • intraperitoneal administration intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, rectal administration, and the like. have.
  • the oral composition since the peptide is digested, it is desirable to formulate the oral composition to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach. It may preferably be administered in the form of an injection.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include excipients or diluents as well as pharmaceutically acceptable carriers.
  • pharmaceutically acceptable means a sufficient amount and side effects that do not cause a therapeutic effect, the type of disease, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug It can be easily determined by those skilled in the art according to well-known factors in the medical field, such as the route of administration, the method of administration, the frequency of administration, the duration of treatment, the combination or the drug used simultaneously.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used as oral administration binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments and flavors, etc.
  • buffers, preservatives, analgesic A topical agent, a solubilizer, an isotonicity agent, a stabilizer, etc. can be mixed and used, and in case of topical administration, a base, an excipient, a lubricant, a preservative, etc. can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with the pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups and wafers, and in the case of injections, they may be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. Others may be formulated into solutions, suspensions, tablets, pills, capsules and sustained release preparations.
  • suitable carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers may be further included.
  • the invention comprises administering to a subject in need thereof a selected from the group consisting of the FGF21 analogs, FGF21 conjugates thereof, persistent agents thereof, pharmaceutical compositions thereof, and combinations thereof.
  • a selected from the group consisting of the FGF21 analogs, FGF21 conjugates thereof, persistent agents thereof, pharmaceutical compositions thereof, and combinations thereof are provided.
  • FGF21 analogs FGF21 conjugates, their sustained preparations, and pharmaceutical compositions thereof are as described above.
  • the FGF21-related diseases may be metabolic syndrome, as described above.
  • the dosage of the FGF21 analog, FGF21 conjugate, and the like of the present invention depends on the type of active ingredient, FGF21 analog, FGF21 conjugate, etc., along with various related factors such as the route of administration, the age, sex and weight of the patient, and the severity of the disease. Is determined. Since the FGF21 analogs, FGF21 conjugates, and the like of the present invention have excellent in vivo persistence and titer, the frequency and frequency of administration of the FGF21 analogs, FGF21 conjugates, their sustained preparations, or pharmaceutical compositions thereof of the present invention can be significantly reduced. have.
  • Another embodiment of the present invention comprises the steps of culturing the transformant to express the FGF21 analog; And recovering the expressed FGF21 analog from a transformant or a culture thereof.
  • the FGF21 analog and transformant are as described above.
  • it may be a method for producing an FGF21 analog including the following steps:
  • step (c) obtaining a supernatant containing FGF21 analog from the precipitate of step (b), applying it to anion binding chromatography, and obtaining an eluate comprising FGF21 analog;
  • Another embodiment embodying the present invention provides a method of making a FGF21 conjugate comprising binding a native FGF21 or the FGF21 analog with a carrier selected from the group consisting of FcRn binding agents, fatty acids, polyethylene glycols, amino acid fragments, and albumin to provide.
  • a carrier selected from the group consisting of FcRn binding agents, fatty acids, polyethylene glycols, amino acid fragments, and albumin to provide.
  • the FGF21, its analog, FGF21 conjugate, and transformants are as described above.
  • the present invention provides a method for increasing the half-life in vivo using the FGF21 and analog or FGF21 analog conjugate, combined with FGF21, analog and carrier.
  • the FGF21, its analog, FGF21 conjugate, and carrier are as described above.
  • the FGF21 gene was amplified from FGF21 cDNA (OriGene, RC204538) to construct FGF21 expression vector.
  • FGF21 cDNA OriGene, RC204538
  • the following primers SEQ ID NO: 1, 2 was prepared and PCR was performed.
  • FGF21 amplification primer order SEQ ID NO: FGF21 5'-GTCAAGCTCACCCCATCCCTGACTCCAGTC-3 '
  • FGF-21 expression vector was constructed. The correct sequence was confirmed by sequence analysis. Nucleotide and protein sequences are as follows. The following FGF21 sequence corresponds to the mature FGF21 sequence.
  • the backbone vector of the FGF21 analog was produced to prepare the FGF21 analog using the native FGF21 expression vector as a template.
  • Naturally mature FGF21 is found in about 20% of histidine's first amino acid histidine (Histidine) in the protein expression process, and cut between amino acids 167 and 168 near the C terminus. To prevent this, the first histidine or the second proline at the N-terminus is removed, and serine, the 167th amino acid, threonine, and alanine, the 168th amino acid, Methionine.
  • FGF21 muteins substituted with Alanine, Phenylalanine and Isoleucine were prepared and used as backbone vectors for the FGF21 analog fabrication described above.
  • the histidine removal form was first prepared using SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and then the FGF21 M168A substituted FGF21 analog backbone vector was completed.
  • FGF21 analog backbone vector DNA protein sequence order SEQ ID NO: ⁇ H, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCTCCT GAGGACGGAT ACAATG
  • FGF21 analogs in which the N- and C-terminal amino acids of FGF21 were modified one by one were prepared.
  • forward and reverse oligonucleotides were synthesized (Table 5), followed by PCR to amplify each analog gene.
  • amino acid numbers indicated in the analog names below are numbered based on the sequence of the native mature FGF21, ⁇ H is the deletion of the first amino acid histidine in the native mature FGF21 sequence, ⁇ HP in the native mature FGF21 sequence The first and second amino acids histidine and proline are deleted.
  • FGF21 analog backbone vector DNA protein sequence analog order SEQ ID NO: ⁇ H, D5A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGCATCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCTCCCCCCCCC
  • E. coli BL21 E. coli B F-dcm ompT hsdS (rB-mB-) gal, Agilent
  • E. coli B F-dcm ompT hsdS (rB-mB-) gal, Agilent was transformed using the recombinant FGF21 expression vector.
  • Fermentation proceeded when the nutrients in the culture was limited, feeding medium was added to the fed value culture.
  • the growth of the strains was monitored by OD values and introduced IPTG with a final concentration of 0.5 mM at OD values above 80. After the introduction, the culture was further carried out until about 23 to 25 hours, and after the incubation, the recombinant strain was harvested using a centrifuge and stored at -80 ° C until use.
  • Histidine is added to the supernatant obtained in the above example to 15 mM. Then, 60% HCl was added slowly to pH 5.2, centrifuged at 7,000 rpm to remove the pellet, and the supernatant containing the recombinant FGF21 analog was collected.
  • 1M Tris pH 8.0 buffer was added to the supernatant obtained in the above example so that the pH was 6 or more, and then diluted with 10 mM Tris 8.0 buffer so that the conductivity was 5 or less.
  • the protein was conjugated to a DEAE (GE, USA) column equilibrated with 10 mM Tris pH 8.0 buffer, followed by concentration using a 10 mM Tris pH 8.0 buffer containing 0.5 M sodium chloride.
  • the recombinant FGF21 analog was eluted with a linear concentration gradient of 10 column volumes from% to 100%.
  • the eluate obtained in the above example was diluted 10-fold with 10 mM Tris pH 8.0 buffer, and then slowly added 3 M ammonium sulfate (1.2 M) buffer to 1.2 M.
  • Bound to Source Iso (GE, USA) column equilibrated with 10 mM Tris pH 8.0 buffer containing 1.2 M Ammonium Sulfate and then concentrated using 10 mM Tris pH 8.0 buffer.
  • the recombinant FGF21 protein was eluted with a linear gradient of 10 column volumes from 0% to 100%.
  • the present inventors confirmed that about 50% of the cleavage form of FGF21 was expressed in the course of expressing native FGF21 in E. coli, and the cleaved FGF21 in the full sequencing result was serine at position 167. It was confirmed that the cleavage between (167S) and methionine (168M) located at 168 by an unknown route.
  • the FGF21 analog was produced using the native FGF21 expression vector as a template.
  • the native FGF21 forms a truncated form between amino acids 167 and 168 near the C-terminus during protein expression.
  • FGF21 was replaced with Ser, the 167th amino acid, and Thr, with Met, the 168th amino acid.
  • amino acids 1-4 were removed at the gene level.
  • the 170th amino acid Gly was replaced with Glu and the 172th amino acid Ser was replaced with Leu to prevent the formation of the cleaved form between the 171th and 172th amino acids by the fibroblast activating protein (FAP) in vivo.
  • FAP fibroblast activating protein
  • Oligonucleotides used to prepare the FGF21 analog were synthesized as shown in Table 8, followed by site-directed mutagenesis PCR to amplify the FGF21 analog gene.
  • the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 81 and 82 were first prepared to form a form in which 1-4 amino acids (HPIP) were removed, and then 167, 168, 170, and 172 using oligonucleotides of SEQ ID NOs: 83 and 84. Th amino acid was substituted to complete the FGF21 analog vector.
  • FGF21 Analog Fabrication Primer order SEQ ID NO: HPIP 5'-CGCTACCGTTGCGCAAGCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCA-3 ' 81 5'-TGCAGGAGAGGACTGGAGTCAGCTTGCGCAACGGTAGCGA-3 ' 82 S167T, M168I, G170ES172L 5'-GGCTCCTCGGACCCTCTGACCATCGTGGAACCTCTCCAGGG-3 ' 83 5'-CCCTGGAGAGGTTCCACGATGGTCAGAGGGTCCGAGGAGCC-3 ' 84
  • FGF21 analog backbone vector DNA protein sequence order SEQ ID NO: FGF21 (del-HPIP, S167T, M168I, G170E, S172L) DNA
  • E. coli BL21 E. coli BF - dcm ompT hsdS (r B -m B- ) gal, Agilent
  • E. coli BL21 E. coli BF - dcm ompT hsdS (r B -m B- ) gal, Agilent
  • the transformation method was recommended by Agilent.
  • Single colonies transformed with the recombinant FGF-21 analog expression vector were taken and inoculated in 1X Luria Broth (LB) medium containing ampicillin (50 ⁇ g / ml) and incubated at 37 ° C. for 15 hours.
  • LB 1X Luria Broth
  • Recombinant FGF21 strain cultures and 1X LB medium containing 30% glycerol were mixed at a ratio of 1: 1 (v / v), and each 1 ml was dispensed into cryo-tubes and stored at -140 ° C. This was used as a cell stock for the production of recombinant fusion proteins.
  • Fermentation proceeded when the nutrients in the culture was limited, supplemented with additional feeding (feeding solution) to proceed with the oil value culture.
  • the growth of the strain was monitored by OD values, and introduced with an IPTG of 0.5 mM final concentration at an OD value of 80 or higher. After the introduction, the culture was further performed until about 23 to 25 hours, and after the incubation, the recombinant strain was harvested using a centrifuge and stored at -80 ° C until use.
  • Example 2 (2) 200 g of the E. coli cells obtained in Example 2 (2) were dissolved in 3 L of a buffer solution (20% sucrose, 1 mM EDTA, 30 mM Tris pH 7.5) at room temperature, stirred for 2 hours, and centrifuged at 7,000 rpm. Collected. The pellet was again dissolved in 3 L of distilled water at 4 ° C., stirred at 4 ° C. for 2 hours, centrifuged at 7,000 rpm to remove the pellet, and the supernatant containing the surrounding cytoplasmic protein was collected.
  • a buffer solution 20% sucrose, 1 mM EDTA, 30 mM Tris pH 7.5
  • Example 2 To the supernatant obtained in Example 2 (3) was added histidine to a final concentration of 15 Mm. Then, 60% HCl was added slowly to pH 5.2, centrifuged at 7,000 rpm to remove the pellet, and the supernatant containing the recombinant FGF21 analog protein was collected.
  • 1M Tris pH 8.0 buffer was added to the supernatant obtained in Example 2 (4) to have a pH of 6 or more, and then diluted with 10 mM Tris 8.0 buffer to have a conductivity of 5 or less. Conjugate the protein to a DEAE (GE, USA) column equilibrated with 10 mM Tris pH 8.0 buffer, then use a 10 mM Tris pH 8.0 buffer containing 0.5 M sodium chloride to give a concentration of 0 to 100%. The recombinant FGF21 analog protein was eluted with a linear concentration gradient of.
  • Example 2 (5) The eluate obtained in Example 2 (5) was diluted 10-fold with 10 mM Tris pH 8.0 buffer, and then slowly added 3M ammonium sulfate buffer solution to 1.2M.
  • the protein was bound to a Source Iso (GE, USA) column equilibrated with 10 mM Tris pH 8.0 buffer containing 1.2 M Ammonium Sulfate, followed by zero concentration using 10 mM Tris pH 8.0 buffer.
  • Recombinant FGF21 analog was eluted with a linear gradient of 10 column volumes from% to 100%.
  • FIGS. 4A-4C Purity of the purified FGF21 analog protein was analyzed using electrophoresis (SDS-PAGE) and high pressure chromatography (HPLC) and the results are shown in FIGS. 4A-4C (FIGS. 4A-4C).
  • FGF21 analog FGF21 mock peptide, having the following sequence was synthesized (Table 10).
  • the FGF21 analog may have a high production efficiency when mass-produced compared to the natural FGF21, and may have a reduced titer compared to the natural FGF21.
  • the FGF21 analog a dual GLP-1 / FGF21 agonist, capable of simultaneously acting on the GLP-1 receptor and the FGF21 receptor, was prepared and its sequence is shown in Table 11 below.
  • the first amino acid (Xaa) in the table means that the alpha carbon is removed from histidine, ie imidazoacetyl.
  • the novel dual GLP-1 / FGF21 agonist prepared above has a binding capacity to the GLP-1 receptor, FGF21 receptor, FGF21 co-receptor, its binding capacity is reduced compared to the natural type has a reduced titer, diabetes, It can be used as a therapeutic substance in obese or nonalcoholic steatohepatitis patients.
  • the amino acids 15-20 of FGF19 refer to amino acids 15-20, based on the mature FGF19 sequence excluding amino acids 1-22, which are signal sequences in the native immature FGF19 sequence.
  • FGF19 (15 ⁇ 20) Insertion Primer order SEQ ID NO: FGF-19 (15-20) 5'-GAAGGAGATATACATATGGGCTGGGGTGATCCGATTCACCCCATCCCTGACTCCAG-3 ' 114 5'-CTGGAGTCAGGGATGGGGTGAATCGGATCACCCCAGCCCATATGTATATCTCCTTC-3 ' 115
  • the site-directed mutagenesis method was used to insert the FGF19 (15-20) sequence, which is the FGFR4 binding site, between the start codon of the pET22b vector and the FGF21 N-terminus.
  • PCR amplification conditions were repeated 18 times at 95 °C 30 seconds, 55 °C 30 seconds, 68 °C 6 minutes and confirmed the exact sequence through the sequence analysis.
  • FGF19 (15-20) -FGF21 sequence present in pET22b in the surrounding cytoplasm of the host cell, it was intended to be inserted into the pFlage-CTS vector.
  • the following primers SEQ ID NOs: 116 and 117
  • PCR was performed. It was.
  • FGF19 (14 ⁇ 20) Insertion Primer order SEQ ID NO: FGF-19 (14-20) 5'-GTAAGCTTATGGCTGGGGTGATCCGATTC-3 ' 116 5'-CACTCGAGTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTC-3 ' 117
  • PCR amplification conditions were repeated 25 times at 95 ° C., 30 sec, 55 ° C., 30 sec, and 68 ° C. at 40 sec.
  • the amplified gene and vector were digested with Hind III and Xho I restriction enzymes, followed by pFlag- with T4 ligase.
  • An expression vector was prepared by inserting into a CTS vector. Sequence analysis confirmed the correct sequence.
  • FGF21, FGF19 (15-20) -FGF21 recombinant fusion protein, and FGF19 (14-20) -FGF21 recombinant fusion protein are as follows.
  • E. coli BL21 E. coli BF - dcm ompT hsdS (r B -m B- ) gal, Agilent
  • E. coli BL21 E. coli BF - dcm ompT hsdS (r B -m B- ) gal, Agilent
  • the transformation was followed by the method recommended by Agilent.
  • Single colonies transformed with the recombinant FGF19-FGF21 expression vector were taken and inoculated in 1X Luria Broth (LB) medium containing ampicillin (50 ⁇ g / ml) and incubated at 37 ° C. for 15 hours.
  • LB 1X Luria Broth
  • Recombinant FGF19-FGF21 strain cultures and 1X LB medium containing 30% glycerol were mixed at a ratio of 1: 1 (v / v), and each 1 ml was dispensed into cryo-tubes and stored at -140 ° C. This was used as a cell stock for the production of recombinant fusion proteins.
  • FGF19-FGF21 For expression of recombinant FGF19-FGF21, 1 vial of each cell stock was dissolved, inoculated into 1 L of 1 ⁇ Luria broth, and cultured at 37 ° C. for 14-15 hours. When the value of the OD600 was 1.0 or more, the culture was terminated, and this was used as the seed culture solution. Seed cultures were inoculated into 9.2 L of fermentation medium using a 30 L fermenter (BIOSTAT C-plsu 30L, Sartorius, Germany) and initial bath fermentation was started. Culture conditions were maintained at pH 6.70 using a temperature of 30 °C, air volume 13 L / min (1 vvm), agitation speed 500 rpm and 30% ammonia water.
  • a 30 L fermenter BIOSTAT C-plsu 30L, Sartorius, Germany
  • Fermentation proceeded when the nutrients in the culture was limited, supplemented with additional feeding (feeding solution) to proceed with the oil value culture.
  • the growth of the strains was monitored by OD values and introduced with IPTG with a final concentration of 0.5 mM at an OD value of 80 or higher.
  • the culture proceeds further to about 23-25 hours after introduction, and after the incubation, the recombinant strain is harvested using a centrifuge and stored at -80 ° C until use.
  • Histidine was added to the supernatant obtained in the above (3) to 15 mM. Then, 60% HCL was slowly added to pH 5.2, centrifuged at 7,000 rpm to remove the pellet, and the supernatant containing the recombinant FGF19-FGF21 protein was collected.
  • 1M Tris pH 8.0 buffer was added to the supernatant obtained in (4) so that the pH was 6 or more, and then diluted with 10 mM Tris 8.0 buffer so that the conductivity was 5 or less. Conjugate the protein to a DEAE (GE, USA) column equilibrated with 10 mM Tris pH 8.0 buffer, then use a 10 mM Tris pH 8.0 buffer containing 0.5 M sodium chloride to provide a linear concentration of 10 column volumes so that the concentration is from 0% to 100%. The gradient eluted the recombinant FGF19-FGF21 protein.
  • the eluate obtained in (5) was diluted 10-fold with 10 mM Tris pH 8.0 buffer, and then slowly added 3M ammonium sulfate buffer to 1.2M.
  • the protein was bound to a Source Iso (GE, USA) column equilibrated with 10 mM Tris pH 8.0 buffer containing 1.2 M ammonium sulfate, and then the concentration was 0% to 100% using 10 mM Tris pH 8.0 buffer.
  • Recombinant FGF19-FGF21 protein was eluted at a linear concentration gradient of 10 columns.
  • reaction solution was mono-pegylated by application to Source15Q (GE, USA) using a buffer containing 10 mM Tris pH 7.0 and a 0.25 M Sodium Chloride gradient. Monopegylated) native FGF21 was purified.
  • the molar ratio of the purified mono-pegylated natural FGF21 and immunoglobulin Fc was 1: 3 and the protein concentration was 50 mg / mL, and the reaction was carried out at 4 ° C. for 16 hours.
  • the reaction solution was performed in an environment in which 20 mM sodium cyanoborohydride (NaCHBH 3 ) as a reducing agent was added to 100 mM potassium phosphate pH 6.0 buffer. After the reaction was completed, the reaction solution was applied to Source15Q (GE, USA) using a 20 mM Bis Tris pH 6.0 and 0.25 M sodium chloride concentration gradient, and 1.2 M ammonium sulfate (Ammonium Sulfate). ) And a concentration gradient of 20 mM Tris pH 7.5 was applied to Source ISO (GE, USA) to purify the conjugate covalently linked with PEG by native FGF21 to immunoglobulin Fc.
  • Source15Q GE, USA
  • Ammonium Sulfate ammonium Sulf
  • the binding force of the representative FGF21 analogs of the present invention with the receptor and the co-receptor is measured.
  • the FGF21 analog of the present invention confirms that the binding force between the FGF21 receptor and the co-receptor (beta-klotho) is reduced compared to the native type FGF21.
  • Receptor-mediated clearance (RMC) of the FGF21 analog is measured.
  • the FGF21 analog of the present invention confirms that the receptor-mediated elimination is reduced than that of the native FGF21.
  • the SPR test was conducted to confirm whether the recombinant FGF19-FGF21 protein, which is the FGF21 analog obtained in Example 5, has a binding capacity to FGFR4. As a result, it was confirmed that the FGF19-FGF21 protein had a binding capacity of about 1.7% of FGFR4 compared to the native type FGF19 (FIG. 7).
  • FGF19-FGF21 protein has the activity of FGF19.
  • the concentration of FGF21-immunoglobulin Fc conjugate was increased (1.2, 2.4, 4.8 nmol / kg / Q2D) in diabetic model mice (db / db mouse). Blood glucose was measured for 4 weeks after subcutaneous administration once. As a result, it was confirmed that the blood glucose of the diabetic model mice was significantly reduced (FIG. 9).

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Abstract

본 발명은 FGF21 아날로그, FGF21 결합체, 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

FGF21 아날로그, FGF21 결합체, 및 이의 용도
본 발명은 FGF21 아날로그, FGF21 결합체, 및 이의 용도에 관한 것이다.
FGF21(Fibroblast growth factor 21)은 FGF19, FGF21 및 FGF23을 포함하는 섬유아세포 성장 인자(FGF)의 서브 패밀리에 속하는 분비형 폴리펩티드이다. FGF21은 혈관신생, 유사분열생식, 패턴 형성, 세포 분화, 대사 조절 및 조직 손상 복구를 비롯한 여러 생리학적 기능에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, FGF21은 주로 간에서 발현되는 것으로 보고되어 왔으며, 허혈성 혈관 질환, 상처 치유, 폐, 기관지 또는 폐포 세포 기능의 손상과 관련된 질환, 및 수많은 다른 장애들에 대한 치료제로서 기술되어 왔다. 또한, FGF21은 인슐린의 존재 및 부재 하에 마우스 3T3-L1 지방세포에 장시간 처리하는 경우(72 시간), 상기 세포에서 글루코스 수용을 자극하였으며, ob/ob 및 db/db 마우스 및 8 주령의 ZDF 랫트에서 공복 및 식후 혈중 글루코스, 트리글리세리드, 및 글루카곤 수준을 투여량 의존적인(dose-dependent) 방식으로 감소시키는 것으로 밝혀진 바 있다. 이와 같이 당뇨 및 비만의 치료를 위한 요법으로서 FGF21의 사용에 대한 효력은 증명되었다(WO2003/011213).
한편, 인간 FGF21은 생체 내 반감기가 짧은 것으로 알려져 있다. 마우스 생체 내에서 인간 FGF21의 반감기는 1시간 내지 2시간에 불과하고, 필리핀 원숭이 (Cynomogus monkey)에서의 반감기는 2.5시간 내지 3시간 정도이다. 이에 따라, 2형 당뇨병의 치료에서 FGF21 단백질을 치료제로써 사용하기 위해, FGF21 단백질의 생체 내 반감기 증가가 필요한 실정이다. 반감기가 향상된 FGF21 단백질을 개발하는 것을 통해 환자의 단백질 주사제 투여 빈도를 낮추어 편의성을 증대시킬 수 있다.
한편, FGF19는 지방세포 및 간세포 양쪽을 표적으로 하여 이들에 대해 효과를 갖는다. 예를 들어, 재조합 인간 FGF19 (rhFGF19)로 처리된 마우스는, 고지방 식이 중임에도 불구하고, 증가된 대사율, 증가된 지질 산화, 더 낮은 호흡 지수 및 체중 감소를 나타낸다. 또한, 이 같은 마우스는 식욕 감소 없이 고지방 식이에도 불구하고 더 낮은 혈청 수준의 렙틴, 인슐린, 콜레스테롤 및 트리글리세리드, 및 정상 수준의 혈당을 나타냈다. 또한, 렙틴이 없지만 FGF19 트랜스진(transgene)을 포함한 비만 마우스에서 FGF19는 체중 감소, 저하된 콜레스테롤 및 트리글리세리드를 나타냈고, 당뇨병이 발달되지 않았다. db/db 마우스에서는 rhFGF19가 주사되었을 때, 체중 감소 및 저하된 혈당의 형태로 이의 대사 특성의 반전을 나타낸 바 있다.
이와 같은 FGF19 및 FGF21의 대사 효과는 FGFR1c, FGFR2c 및 FGFR3c 수용체에 대한 이들의 결합을 통해 달성되고, 이 중에서 FGFR1c 및 FGFR2c에 대한 결합이 가장 유의하다. 또한, 이러한 수용체들에 대한 FGF19 및 FGF21의 결합은 공동-수용체 베타-클로토(beta-klotho)를 요구한다. 또한, 이러한 FGFR 수용체들이 만연함에도 불구하고, 조직-특이적으로 국소화되어 있는 베타-클로토 공동 수용체로 인하여 FGF19 및 FGF21의 대사 효과는 지방세포 특이적이다.
FGF19는 FGF21과 구별되게 간-특이적 효과를 통해 간에 의한 담즙 생산을 조절하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 식후 담즙-생산에 반응하여, 담즙산 합성에서의 속도 제한 효소인 콜레스테롤 7-알파-히드록실라제 유전자 (CYP7A1)의 전사를 억제하고, 이로써 FGF19는 담즙 생산을 음성적으로 조절한다. 또한, FGF19는 FGF21에 대해서는 관찰되지 않는 간 분열촉진 효과가 있는 것으로 보인다. 예를 들어, FGF19 트랜스제닉 마우스에서 간세포의 증가된 증식 및 형성이상으로 인해 간 선암종이 발달되고, rhFGF19로 처리된 마우스는 간세포들의 간세포 증식을 나타낸 바 있다(Nicholes, K. et al., Am J Pathol 160, 2295-2307 (2000)).
따라서, FGF21에 FGF19의 활성을 보유하도록 하는 경우, FGF19의 유용한 활성, 예컨대 간에서의 담즙 조절 기능을 보유하도록 할 수 있다.
또한, 엑센딘-4는 힐라 몬스터(Gila monster, Heloderma suspectum)의 침샘에 의해 생성되는 39개 아미노산 펩타이드이다. 엑센딘-4는 글루카곤 유사 펩타이드-1(glucagonlike peptide-1, GLP-1) 수용체의 활성화 인자이나, 글루카곤 수용체를 의미있게 활성화하지는 않는다.
엑센딘-4는 GLP-1에서 관찰되는 혈당조절 작용의 대부분을 공유한다. 임상연구와 비임상연구는 엑센딘-4가 글루코오스 의존성 인슐린 합성 및 분비의 증진, 글루코오스 의존성 글루카곤 분비의 억제, 위 배출의 둔화, 식품섭취 및 체중 감량 및 베타 세포 질량의 증가 및 베타 세포 기능을 나타내는 마커들의 증가를 포함하는 여러 가지 유익한 항당뇨 성질을 나타낸다는 점을 보여준 바 있다.
이러한 효과는 당뇨뿐만 아니라 비만으로 고통 받는 환자들에게도 유익하다. 비만 환자들은 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심혈관 질환 및 근골격 질환에 걸릴 위험이 더 높다.
한편, GLP-1에 비해 엑센딘-4는 디펩티딜 펩티다아제(DPP4)에 의한 분할에 대해 저항성을 나타내, 생체 내에서 더 긴 반감기와 작용시간을 나타낸다.
엑센딘-4의 N-말단의 아민 그룹을 제거한 데스-아미노-히스티딜 엑센딘-4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹을 하이드록실 그룹으로 치환한 베타- 히드록시-이미다조-프로피오닐 엑센딘-4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹을 두 개의 메틸 그룹으로 수식한 디메틸-히스티딜 엑센딘-4, 및 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거한 이미다조-아세틸-엑센딘-4등의 결합체의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가되는 것으로 보고되었다(대한민국 공개특허 제10-2011-0092253호).
이러한 배경 하에 본 발명자들은 천연형 FGF21에 비해 반감기가 증대되거나, FGF21의 활성을 보유하면서도 새로운 활성을 보유하는 FGF21 아날로그를 개발하고자 하였고, 새로운 수 종의 FGF21 아날로그로서, FGF21 관련 질환에 있어 치료적 유용성을 가지는 펩타이드를 새롭게 개발하였다.
본 발명의 하나의 목적은 천연형 FGF21 (fibroblast growth factor 21)에서 하나 이상의 아미노산이 제거, 부가, 치환, 수식, 또는 이들의 조합으로 변이된, FGF21 아날로그를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 FGF21 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 함유하는, 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (i) 천연형 FGF21 또는 상기 FGF21 아날로그; 및 (ii) FcRn 결합물질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 단편, 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택된 캐리어가 결합된, FGF21 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 FGF21 아날로그; 또는 상기 FGF21 아날로그 또는 천연형 FGF21에 FcRn 결합물질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 단편, 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택된 캐리어가 결합된, FGF21 결합체를 유효성분으로 포함하는, 대사증후군의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 FGF21 아날로그를 발현하는 단계; 및 형질전환체 혹은 이의 배양물로부터 상기 발현된 FGF21 아날로그를 회수하는 단계를 포함하는, FGF21 아날로그의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 천연형 FGF21 또는 상기 FGF21 아날로그를 FcRn 결합물질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 단편, 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택된 캐리어와 결합시키는 단계를 포함하는, FGF21 결합체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 천연형 FGF21 (fibroblast growth factor 21)에서 하나 이상의 아미노산이 제거, 부가, 치환, 수식, 또는 이들의 조합으로 변이된, FGF21 아날로그이다.
하나의 구체예로서,
상기 FGF21 아날로그는 하기 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상의 변이를 가지는, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
(i) 천연형 성숙 FGF21의 1번부터 4번까지의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산이 제거됨;
(ii) 천연형 성숙 FGF21의 167번 아미노산인 세린이 세린 외 다른 아미노산으로 치환됨; 및
(iii) 천연형 성숙 FGF21의 168번 아미노산인 메티오닌이 메티오닌 외 다른 아미노산으로 치환됨.
다른 구체예로서,
상기 FGF21 아날로그는 추가로 하기 (iv), (v) 또는 둘 다의 변이를 가지는, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다:
(iv) 천연형 성숙 FGF21의 170번 아미노산인 글리신이 글리신 외 다른 아미노산으로 치환됨; 및
(v) 천연형 성숙 FGF21의 172번 아미노산인 세린이 세린 외 다른 아미노산으로 치환됨.
다른 구체예로서,
상기 FGF21 아날로그는 하기 (a) 및 (b)의 변이를 가지는, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다:
(a) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산, 1번 및 2번 아미노산, 또는 1번부터 4번까지의 아미노산이 제거됨; 및
(b) 천연형 성숙 FGF21의 167번 아미노산인 세린의 트레오닌으로의 치환, 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌, 페닐알라닌, 또는 이소류신으로의 치환, 또는 167번 아미노산인 세린의 트레오닌으로의 치환 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌, 페닐알라닌, 또는 이소류신으로의 치환.
다른 구체예로서,
상기 FGF21 아날로그는 추가로 천연형 성숙 FGF21의 170번 아미노산인 글리신의 글루탐산으로의 치환; 172번 아미노산인 세린의 류신으로의 치환; 또는 둘 다를 포함하는, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 FGF21 아날로그는 서열번호: 18, 20, 22, 24, 26, 및 86으로 이루어진 군에서 선택된, 아미노산 서열을 가지는 FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 FGF21 아날로그는
천연형 성숙 FGF21의 5번째 아미노산, 6번째 아미노산, 7번째 아미노산, 8번째 아미노산, 9번째 아미노산, 172번째 아미노산, 176번째 아미노산, 177번째 아미노산, 및 178번째 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환;
천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열의 부가; 또는
상기 두 가지 변이를 모두 포함하는 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 다른 아미노산은 알라닌인, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열은 WGDPI (서열번호: 122)인, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번 아미노산부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열은 5개 내지 20개의 아미노산으로 이루어진, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열은, 천연형의 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 14번부터 20번까지의 아미노산 서열 혹은 15번부터 20번까지의 아미노산 서열인, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열이 부가된 FGF21 아날로그는, 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열이 성숙 FGF21의 전장 서열 혹은 이의 활성 단편에 부가된, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열은 이의 C-말단이 성숙 FGF21의 전장 서열 혹은 이의 활성 단편의 N-말단에 부가된 형태인, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 전장 서열 혹은 이의 활성 단편에 직접적으로 또는 링커를 통하여 연결된, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 FGF21 아날로그는 서열번호: 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 119, 및 121로 이루어진 군에서 선택된, 아미노산 서열을 가지는 FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 FGF21 아날로그는
(i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열에 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열이 부가된, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 FGF21 아날로그는 상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은,
성숙 FGF21의 아미노산 서열에서 N-말단 1번 내지 4번 아미노산은 모두 제외된 FGF21의 N-말단 아미노산 서열인 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 5번째, 6번째 또는 9번째 아미노산으로부터 C-말단 방향에 위치하는 임의의 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열인,
FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 연속되는 아미노산 서열은 2개 내지 30개의 아미노산을 가지는,
FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 성숙 FGF21의 C-말단 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 임의의 아미노산으로부터 C-말단으로부터 1번째, 4번째, 또는 11번째 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열인 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 연속되는 아미노산 서열은 2개 내지 30개의 아미노산을 가지는,
FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 FGF19의 C-말단 아미노산 서열은 FGF19의 임의의 아미노산으로부터 C-말단으로부터 1번째 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열인,
FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 연속되는 아미노산 서열은 2개 내지 30개의 아미노산을 가지는,
FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열과 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열은 서로 링커를 통해 연결된,
FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 (i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열 및 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열이 N-말단에서 C-말단 방향으로 순차적으로 배열되거나,
상기 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열 및 (i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열이 N-말단에서 C-말단 방향으로 순차적으로 배열된 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은 서열번호 123 내지 130으로 이루어진 군에서 선택되고,
상기 성숙 FGF21의 C-말단의 아미노산 서열은 서열번호 131 내지 136으로 이루어진 군에서 선택되고,
상기 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열은 서열번호 137 또는 138인 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 FGF21 아날로그는 서열번호: 90 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된, 아미노산 서열을 가지는, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
(i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열에 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열이 부가되고, 추가로 (iii) 엑센딘-4(exendin-4) 서열이 부가된, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 엑센딘-4 서열은 천연형 엑센딘-4 서열에서 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 카본이 제거되고, 32번째부터 39번째 아미노산 서열이 제외된 서열이고,
상기 성숙 FGF21의 N-말단 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 아미노산 서열에서 N-말단 1번 내지 4번 아미노산은 모두 제외된 FGF21의 N-말단 아미노산 서열인, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 5번째 아미노산으로부터 C-말단 방향에 위치하는 임의의 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열이고, 상기 성숙 FGF21의 C-말단 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 임의의 아미노산으로부터 C-말단으로부터 1번째 또는 4번째 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열이고, 상기 FGF19의 C-말단 아미노산 서열은 FGF19의 임의의 아미노산으로부터 C-말단으로부터 1번째 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열인, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 연속되는 아미노산 서열은 2개 내지 30개의 아미노산을 가지는, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열과 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열 사이, 또는 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열과 엑센딘-4(exendin-4) 서열은 직접적으로 연결되거나, 링커를 통해 연결된, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 FGF21 아날로그는 엑센딘-4(exendin-4) 서열, 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열, 및 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열이 N-말단에서 C-말단 방향으로 순차적으로 연결된 것인, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은 서열번호: 139 내지 142로 이루어진 군에서 선택되고, 성숙 FGF21의 C-말단의 아미노산 서열은, 서열번호: 143 내지 147로 이루어진 군에서 선택되고, 성숙 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열은, 서열번호: 148 내지 150으로 이루어진 군에서 선택되는,
FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 FGF21 아날로그는 서열번호: 103 내지 113으로 이루어진 군에서 선택되는, FGF21 아날로그인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 FGF21 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 구현하는 다른 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터이다.
본 발명의 구현하는 다른 양태는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 함유하는, 형질전환체이다.
본 발명의 구현하는 다른 양태는
(i) 천연형 FGF21 또는 상기 FGF21 아날로그; 및 (ii) FcRn 결합물질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 단편, 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택된 캐리어가 결합된, FGF21 결합체이다.
하나의 구체예로서,
상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역인, FGF21 결합체인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
(i) 천연형 FGF21 또는 상기 FGF21 아날로그와 (ii) 캐리어가 (iii) 펩타이드 링커, 또는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구현하는 다른 양태는
상기 FGF21 아날로그; 또는 상기 FGF21 아날로그 또는 천연형 FGF21에 FcRn 결합물질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 단편, 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택된 캐리어가 결합된, FGF21 결합체를 유효성분으로 포함하는,
대사증후군의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물이다.
하나의 구체예로서,
상기 대사증후군은 내당증 장애, 고콜레스테롤혈증, 이상지혈증, 비만, 당뇨, 고혈압, 비알코올지방간염 (nonalcoholic steatohepatitis, NASH), 이상지혈증에 의한 동맥경화, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 관상동맥 심질환(관동맥성 심장병), 혹은 간 대사 질환을 포함하는, 대사증후군의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구현하는 다른 양태는 상기 형질전환체를 배양하여 FGF21 아날로그를 발현하는 단계; 및 형질전환체 혹은 이의 배양물로부터 상기 발현된 FGF21 아날로그를 회수하는 단계를 포함하는, FGF21 아날로그의 제조방법인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구현하는 다른 양태는 천연형 FGF21 또는 상기 FGF21 아날로그를 FcRn 결합물질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 단편, 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택된 캐리어와 결합시키는 단계를 포함하는, FGF21 결합체의 제조 방법이다.
본 발명에 따른 FGF21 아날로그는 FGF21 관련 질환에 있어 치료적으로 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은, 재조합 FGF21 순도를 단백질 전기영동으로 분석한 결과이다; 1번 레인: size marker, 2, 3번 레인: 정제된 FGF21, 4, 5번 레인: 불순물이 포함된 FGF21.
도 2는, FGF21 순도를 고압 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 3는, FGF21 아날로그 단백질의 베타-클로토(beta-klotho)에 대한 결합력 및 in vitro 글루코스 수용 활성을 확인한 결과이다.
도 4a 내지 4c는 각각 FGF21 아날로그 정제 후 순도를 확인하기 위해 HPLC를 사용하여 RPC(Reverse phase chromatography), IEX(Ion exchange chromatography), 그리고 SEC(size exclusion chromatography)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는, FGF19-FGF21 단백질 순도를 고압 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 6a 및 6b는 FGF19-FGF21 단백질의 베타-클로토(beta-klotho)에 대한 결합력 및 in vitro 글루코스 수용 활성을 확인한 결과이다.
도 7은, FGF19-FGF21 단백질의 FGFR4와의 결합력을 확인한 결과이다.
도 8은, FGF21-면역글로불린 Fc 결합체 (LAPS-FGF21로 표기)의 농도별 체중 감소 및 음식 섭취에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 9은, FGF21-면역글로불린 Fc 결합체 (LAPS-FGF21로 표기)의 농도별 혈당 강하 효과를 확인한 결과이다.
도 10는, FGF21-면역글로불린 Fc 결합체 (LAPS-FGF21로 표기)의 농도별 콜레스테롤 및 지방산(Triglyceride) 감소 효과를 확인한 결과이다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 본 명세서 전반을 통하여, 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다.
또한 본 명세서에서 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
알라닌 A 아르기닌 R
아스파라긴 N 아스파르트산 D
시스테인 C 글루탐산 E
글루타민 Q 글리신 G
히스티딘 H 이소류신 I
류신 L 리신 K
메티오닌 M 페닐알라닌 F
프롤린 P 세린 S
트레오닌 T 트립토판 W
티로신 Y 발린 V
이러한 내용을 바탕으로 하기에서 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 천연형 FGF21 (fibroblast growth factor 21)에서 하나 이상의 아미노산이 제거, 부가, 치환, 수식, 또는 이들의 조합으로 변이된, FGF21 아날로그를 제공한다.
본 발명에서 용어, "FGF21 아날로그"란 천연형 FGF21의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변형된 것을 말한다.
상기 FGF21 아날로그는 비자연적으로 발생된 (non-naturally occurring) 것일 수 있다.
천연형 성숙 FGF21은 지방세포 특이적으로 글루코스 수용을 촉진할 수 있다. 상기 천연형 FGF21 단백질에 대한 정보는 NCBI GenBank 혹은 UnitProt과 같은 공지의 데이터베이스로부터 용이하게 얻을 수 있다.
예컨대, 천연형 FGF21은 총 209개의 아미노산의 단백질로 미성숙한 형태(immanture form)로 발현될 수 있다. 여기서, 상기 단백질의 N-말단으로부터 1 내지 28번 아미노산은 신호 서열에 해당하고, 29번 내지 209번의 아미노산이 성숙 FGF21 단백질의 서열에 해당한다.
상기 209개의 아미노산을 가지는 천연형 FGF21에서 174번 위치에 류신(L)을 갖는 "FGF-21의 209 아미노산 L형" 및 프롤린(P)을 갖는 "FGF-21의 209 아미노산 P형"이 존재한다. 그러나, 상기 종류에 제한되는 것은 아니다.
이러한 미성숙 형태의 FGF21의 아미노산 서열을 서열번호 87 및 88 (각각 L형 및 P형)에 각각 기술하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 천연형 성숙 FGF21의 아미노산 서열의 예로, 서열번호 4 (L형) 및 151 (P형)로 표시되는 단백질을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 FGF21 아날로그는 다음 중 어느 하나 이상의 특성을 가지는 것일 수 있다:
1) 천연형 FGF21에 비해 FGF21 수용체 및/또는 보조 수용체에 대한 결합력이 감소됨;
2) 천연형 FGF21에 비해 생체 내 지속성 및/또는 안정성이 증대됨;
3) 천연형 GLP-1 또는 FGF21에 비해 역가가 감소되고, GLP-1과 FGF21의 이중 작용제로서 작용함;
4) FGF19 및 FGF19의 활성을 모두 보유함;
5) 생체 내 및 발현 시의 절단 부위가 제거됨.
상기 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변형된 것이란 천연형 FGF21에서 적어도 하나 이상의 아미노산이 치환(substitution), 부가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형일 수 있다.
상기 천연형 FGF21 서열에서 변형되는 아미노산 수는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 25 이상, 26 이상, 27 이상, 28 이상, 29 이상, 30 이상, 31 이상, 32 이상, 33 이상, 34 이상, 35 이상, 36 이상, 37 이상, 38 이상, 39 이상, 40 이상, 41 이상, 42 이상, 43 이상, 44 이상, 45 이상, 46 이상, 47 이상, 48 이상, 49 이상, 50 이상, 51 이상, 52 이상, 53 이상, 54 이상, 55 이상, 56 이상, 57 이상, 58 이상, 59 이상, 60 이상, 61 이상, 62 이상, 63 이상, 64 이상, 65 이상, 66 이상, 67 이상, 68 이상, 69 이상, 70 이상, 71 이상, 72 이상, 73 이상, 74 이상, 75 이상, 76 이상, 77 이상, 78 이상, 79 이상, 80 이상, 81 이상, 82 이상, 83 이상, 84 이상, 85 이상, 86 이상, 87 이상, 88 이상, 89 이상, 90 이상, 91 이상, 92 이상, 93 이상, 94 이상, 95 이상, 96 이상, 97 이상, 98 이상, 99 이상, 100 이상의 아미노산이 변형된 것일 수 있다.
상기 아미노산의 치환 또는 부가 시에는 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비자연적 발생 아미노산 및 아미노산 유도체를 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep, Genzyme Pharmaceuticals 등이 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American Peptide Company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하다.
아미노산 유도체도 마찬가지 방식으로 입수할 수 있는데, 그 예를 일부만 들자면 데스아미노-히스티딘(desamino-histidine), 베타-히드록시 이미다조프로피온산(beta-hydroxyimidazopropionic acid), 4-이미다조아세트산(4-imidazoacetic acid), 베타-카르복시 이미다조프로피온산(beta-carboxyimidazopropionic acid) 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 아미노산의 부가는 FGF21이 아닌 다른 펩타이드, 예컨대 FGF19 및/또는 인슐린 분비 펩타이드 (예, 엑센딘-3, 엑센딘-4)로부터 유래한 아미노산 서열이 부가된 것일 수 있다. 또한, 이러한 아미노산의 부가는 폴리펩타이드 또는 단백질 등과 같이 많은 수의 아미노산이 부가된 것을 포괄한다.
한편, FGF21 아날로그는 천연형 FGF21과 동일한 종류의 생체 내의 대사 조절기능을 보유한 펩타이드일 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에서 사용된 FGF21은 유전자 재조합 기술로 만든 FGF21 아날로그이지만, 본 발명은 이것에만 국한되는 것이 아니라 상술한 특징적인 활성을 보유하는 다양한 FGF21 아날로그를 포괄한다.
또한, 상기 FGF21 아날로그는 그 형태에 따라 유전자 재조합 방법으로 제조할 수도 있고, 고체상(solid phase) 방법으로도 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 FGF21 아날로그는 천연형 FGF21의 유도체, 천연형 FGF21의 단편 등을 포함한다.
본 발명에서 용어, "천연형 FGF21의 유도체"는 천연형 FGF21과 비교하여 아미노산 서열에 하나 이상의 차이가 있는 펩타이드, 천연형 FGF21 서열을 개질(modification)을 통하여 변형시킨 펩타이드, 천연형 FGF21와 동일한 종류의 생리활성을 보유하는 천연형 FGF21의 모방체를 포함한다.
구체적으로, 천연형 FGF21과 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이는 것일 수 있고/있거나 FGF21의 아미노산 한 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation) 된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유도체 제조를 위한 여러 방법들의 조합으로 본 발명에 적용되는 천연형 FGF21의 유도체를 제조할 수 있다.
또한, 천연형 FGF21의 유도체의 제조를 위한 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질 혹은 번역 후 변형 (예, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 분자 내 공유결합 등) 함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다.
또한, 천연형 FGF21의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하다.
본 발명에서 용어, "천연형 FGF21 혹은 천연형 FGF21의 유도체의 단편"은 천연형 FGF21 혹은 천연형 FGF21의 유도체의 아미노 말단 혹은 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 제거된 형태를 말한다. 이러한 단편은 천연형 FGF21와 동일한 종류의 생리활성을 보유할 수 있다.
본 발명의 FGF21 유도체 및 단편에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 N 말단의 아미노 잔기에 탈아미노화(deamination)된 체내에서 혈당 조절 기능을 보유한 펩타이드도 포함된다.
구체적으로, FGF21 아날로그는 하기 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상 또는 둘 이상, 또는 세 가지의 변이를 가질 수 있다:
(i) 천연형 성숙 FGF21의 1번부터 4번까지의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산이 제거됨;
(ii) 천연형 성숙 FGF21의 167번 아미노산인 세린이 세린 외 다른 아미노산으로 치환됨; 및
(iii) 천연형 성숙 FGF21의 168번 아미노산인 메티오닌이 메티오닌 외 다른 아미노산으로 치환됨.
또한, 상기 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상의 변이와 함께, 또는 독립적으로 하기 (iv), (v) 또는 둘 다의 변이를 가질 수 있다:
(iv) 천연형 성숙 FGF21의 170번 아미노산인 글리신이 글리신 외 다른 아미노산으로 치환됨; 및 (v) 천연형 성숙 FGF21의 172번 아미노산인 세린이 세린 외 다른 아미노산으로 치환됨.
구체적으로, 상기 (i)에서 천연형 성숙 FGF21의 1번부터 4번까지의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산의 제거는, 천연형 성숙 FGF21의 N-말단으로부터 1번 아미노산의 제거, 2번 아미노산의 제거, 3번 아미노산의 제거, 또는 4번 아미노산의 제거, 혹은 이들의 조합을 의미할 수 있으며, 보다 더 구체적으로 천연형 성숙 FGF21의 N-말단으로부터 순차적으로 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 제거를 의미할 수 있다. 구체적으로, 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산의 제거, 1번 및 2번 아미노산의 제거, 또는 1번부터 4번까지의 아미노산이 제거일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 (ii) 및 (iii)에서 해당 변이는, 167번째 아미노산인 세린 및/또는 168번째 아미노산인 메티오닌이 트레오닌, 알라닌, 페닐알라닌, 또는 이소류신으로 치환된 것일 수 있고, 보다 구체적으로 각각 천연형 성숙 FGF21의 167번 아미노산인 세린의 트레오닌으로의 치환 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌, 페닐알라닌, 또는 이소류신으로의 치환에 해당할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (iv) 및 (v)에서 기술된 해당 변이는 각각 천연형 성숙 FGF21의 170번 아미노산인 글리신의 글루탐산으로의 치환; 및 172번 아미노산인 세린의 류신으로의 치환에 해당할 수 있다.
상술한 변이를 포함하는 FGF21 아날로그의 보다 구체적인 예는 다음과 같다:
(1) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘의 제거, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔH, M168A);
(2) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 및 167번 아미노산인 세린의 트레오닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, S167T);
(3) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, M168A);
(4) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 페닐알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, M168F);
(5) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 이소류신으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, M168I);
(6) 천연형 성숙 FGF21의 1번부터 4번까지의 아미노산 서열의 제거, 167번 아미노산인 세린의 트레오닌으로의 치환, 168번 아미노산인 메티오닌의 이소류신으로의 치환, 170번 아미노산인 글리신의 글루탐산으로의 치환, 및 172번 아미노산인 세린의 류신으로의 치환 [FGF21 (del-HPIP, S167T, M168I, G170E, S172L)].
상술한 변이를 가지는 FGF21 아날로그는 1) 상기 아날로그의 발현 시 절단되는 부위가 제거된 것일 수 있고/있거나, 2) 생체 내에서 절단되는 부위, 예컨대 DPPIV(Dipeptidyl peptidase-4)에 의해 절단되는 부위 및/또는 FAP(fibroblast activating protein)에 의해 절단되는 부위가 제거된 것일 수 있고/있거나, 3) 천연형 성숙 FGF21에 비해 수용체 및/또는 보조 수용체에 대한 결합력이 감소된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 2)와 관련하여, DPPIV에 의해 제거되는 천연형 성숙 FGF21의 N-말단에 위치한 1번부터 4번까지의 아미노산 (예, HPIP)가 제거되고/되거나 FAP에 의해 절단되는 부위 혹은 그 주변에 위치한 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 FGF21 아날로그는 발현 시 및/또는 생체 내에서 절단되는 부위가 제거되어 천연형 성숙 FGF21에 비해 긴 반감기를 가지면서, 해리상수 증가에 의해 수용체에 의해 매거되는 제거가 현저하게 감소하여 혈중 반감기가 증가된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 FGF21 아날로그는 서열번호: 18, 20, 22, 24, 26, 및 86으로 이루어진 군에서 선택된, 아미노산 서열을 가지는 FGF21 아날로그일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 FGF21 아날로그는 상술한 변이와 함께, 또는 독립적으로 하기와 같은 변이를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 FGF21 아날로그는 천연형 성숙 FGF21의 5번째 아미노산, 6번째 아미노산, 7번째 아미노산, 8번째 아미노산, 9번째 아미노산, 168번째 아미노산, 172번째 아미노산, 176번째 아미노산, 177번째 아미노산, 및 178번째 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고/되거나,
천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열이 부가된 특징을 포함하는 아날로그일 수 있다.
여기서, 상기 다른 아미노산은 알라닌일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 또한, 비치환된 FGF21에 비해 FGF21 수용체 및/또는 보조 수용체에 대한 결합력을 감소시킬 수 있는 아미노산이라면 상기 다른 아미노산의 범주에 제한 없이 포함된다.
상술한 변이를 포함하는 FGF21 아날로그의 보다 구체적인 예는 다음과 같다:
(1) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘의 제거, 5번 아미노산인 아스파르트산의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔH,D5A, M168A);
(2) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘의 제거, 6번 아미노산인 세린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔH,S6A, M168A);
(3) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘의 제거, 7번 아미노산인 세린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔH, S7A, M168A);
(4) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘의 제거, 8번 아미노산인 프롤린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔH, P8A, M168A);
(5) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘의 제거, 9번 아미노산인 류신의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔH, L9A, M168A);
(6) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘의 제거, 172번 아미노산인 세린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔH, S172A, M168A);
(7) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘의 제거, 176번 아미노산인 세린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔH, S176A, M168A);
(8) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘의 제거, 177번 아미노산인 프롤린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔH, P177A, M168A);
(9) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘의 제거, 178번 아미노산인 세린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔH, S178A, M168A);
(10) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 5번 아미노산인 아스파르트산의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, D5A, M168A);
(11) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 6번 아미노산인 세린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, S6A, M168A);
(12) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 7번 아미노산인 세린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, S7A, M168A);
(13) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 8번 아미노산인 프롤린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, P8A, M168A);
(14) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 9번 아미노산인 류신의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, L9A, M168A);
(15) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 172번 아미노산인 세린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, S172A, M168A);
(16) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 176번 아미노산인 세린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, S176A, M168A);
(17) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 177번 아미노산인 프롤린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, P177A, M168A);
(18) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산인 히스티딘 및 2번 아미노산인 프롤린의 제거, 178번 아미노산인 세린의 알라닌으로의 치환, 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌으로의 치환을 가지는 FGF21 아날로그 (ΔHP, S178A, M168A).
상술한 FGF21 아날로그는 절단 부위가 제거되고/되거나, FGF21 수용체 및/또는 보조 수용체 (beta-klotho)와의 결합력이 천연형 FGF21에 비하여 감소되고/되거나, 천연형 FGF21에 비해 감소된 수용체 매개 제거(receptor-mediated clearance, RMC)를 나타내는 것일 수 있다.
또한, 상기 FGF21 아날로그는 서열번호: 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 및 80으로 이루어진 군에서 선택된, 아미노산 서열을 가지는 FGF21 아날로그일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명에 따른 FGF21 아날로그는 FGF19 유래 아미노산 서열이 천연형 FGF21 또는 이의 단편; 또는 천연형 FGF21의 유도체 또는 이의 단편에 부가된 것을 포함한다.
구체적으로, 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열이 부가된 특징을 독립적으로 혹은 상술한 변이(들)과 함께 포함할 수 있다.
본 발명에서 기술되는 상기 "FGF19"는 지방세포 및 간세포 모두를 표적으로 하여 대사적 활성을 나타낼 수 있는 물질을 포함한다. 특히 상기 FGF19는 FGFR4에 결합하여 이의 대사 활성, 특히 간에 대한 대사 활성을 나타내는 것일 수 있다. 그 예로, 담즙산 조절 능력을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 FGF19은 천연형 성숙 FGF19 단백질뿐만 아니라, 천연형 FGF19의 유도체, 및 단편을 모두 포함하는 개념으로, 유도체 및 단편에 대한 구체적인 설명은 상기한 FGF21에 기술된 내용이 여기에도 적용된다.
상기 천연형 성숙 FGF19은 지방세포 및/또는 간 세포에 대해 대사 활성을 나타낼 수 있다. 상기 천연형 FGF19 단백질에 대한 정보는 NCBI GenBank 혹은 UnitProt과 같은 공지의 데이터베이스로부터 용이하게 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 천연형 FGF19는 NCBI 접근번호 NP_005108에 해당하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 즉, 천연형 FGF19는 총 216개의 아미노산의 단백질로 발현될 수 있다. 이때, 상기 단백질의 N-말단으로부터 1 내지 22번 아미노산은 신호 서열에 해당하고, 23번 내지 216번의 아미노산이 성숙 FGF19 단백질의 서열에 해당한다.
이러한 미성숙 형태(immature form)의 천연형 FGF19의 아미노산 서열의 예로, 서열번호: 89로 표시되는 단백질을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 해당 서열에서 23번 내지 216번 아미노산 서열이 성숙 FGF19의 서열에 해당된다.
구체적으로, 상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열은 WGDPI (서열번호: 122)일 수 있다.
구체적으로, 상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번 아미노산부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열은 5개 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열은, 천연형의 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 14번부터 20번까지의 아미노산 서열 (서열번호: 152) 혹은 15번부터 20번까지의 아미노산 서열 (서열번호: 153)일 수 있다.
또한, 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열이 부가된 FGF21 아날로그는, 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열이 성숙 FGF21의 전장 서열 혹은 이의 활성 단편에 부가된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열은 이의 C-말단이 성숙 FGF21의 전장 서열 혹은 이의 활성 단편의 N-말단에 부가된 형태인, FGF21 아날로그일 수 있다.
또한, 상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 전장 서열 혹은 이의 활성 단편에 직접적으로 또는 링커를 통하여 연결된 것일 수 있다.
상기 링커는 유연 링커(flexible linker)일 수 있고, 구체적으로 펩타이드 링커 또는 비펩타이드 링커일 수 있다.
여기서, "비펩타이드 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체적합성 링커를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
이러한 비펩타이드 링커의 비제한적인 예로는, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG) 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 또는 이들의 조합을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 구체적으로 상기 결합체는 FGF19 및 FGF21을 포함하는 융합 단백질의 형태일 수 있다.
상기 융합 단백질의 예로, 서열번호 119 또는 121의 아미노산 서열로 표시되는 융합 단백질을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 융합 단백질의 제조에 있어서 각각의 융합 파트너의 재조합적 연결을 위하여 해당 융합 파트너의 본래의 아미노산 서열뿐만 아니라, 융합을 위한 부가적인 아미노산 서열이 존재할 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 이러한 경우에 있어서까지 기술된 서열번호에 한정되어 융합 단백질의 범위가 해석되어서는 안된다.
본 발명에 따른 FGF21 아날로그는 상술한 변이와 함께, 또는 독립적으로 하기와 같은 변이를 포함하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, (i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열에 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열이 부가된 것일 수 있다.
보다 구체적으로, (i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열 및 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 (i) 및 (ii)가 직접적으로 또는 간접적으로 연결된, FGF21 모조 펩타이드 유도체 형태일 수 있다.
이러한 본 발명의 FGF21 아날로그는 천연형 성숙 FGF21의 N-말단 부위에 위치한 30개 이하의 아미노산 서열과 C-말단 부위에 위치한 30개 이하의 아미노산 서열이 결합된 구조를 가질 수 있다. 또한, 여기서 아미노산 한 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예;deamination) 또는 수식(예; N-methylation) 된 형태일 수 있고, 체내에서 대사를 조절하는 기능을 보유할 수 있다.
또한, 상기 FGF21 아날로그는 신호서열이 제외된 성숙 FGF21 서열에서 FGF21 수용체의 결합에 중요한 N-말단의 일부분과 FGF21 공동수용체인 베타-클로소와 직접적으로 결합하는 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 일부분이 결합된 것일 수 있다.
또한, 이러한 FGF21 아날로그는 FGF21 수용체에 대한 결합력이 천연형 FGF21 보다 감소한 것일 수 있으며, 해리 상수 증가에 의해 수용체에 의해 매개되는 제거(receptor-mediated clearance)가 현저하게 감소하여 혈중 반감기가 증가된 것일 수 있다.
특별히 이에 제한되지는 않으나, 상기 FGF21 아날로그는 신호서열을 포함하지 않는 성숙 FGF21의 아미노산 서열에서 N-말단 1번 내지 4번 아미노산은 모두 제외된, FGF21의 N-말단 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
특별히 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 FGF21 아날로그에 포함되는 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 5번째, 6번째 또는 9번째 아미노산으로부터 C-말단 방향에 위치하는 임의의 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열일 수 있다.
상기 연속되는 아미노산은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개의 아미노산을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은 서열번호 123 내지 130으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 따른 천연형 FGF21에 비하여 낮은 역가를 나타내는 FGF21 모조 펩타이드 유도체에 포함되어 작용할 수 있다면 상기 서열에 제한되는 것은 아니며, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열도 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 이러한 유사성을 가지는 서열로서, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 이러한 내용은 이하 후술될 FGF21의 C-말단 아미노산 서열 및 FGF19의 C-말단 아미노산 서열, FGF21 모조 펩타이드 유도체의 구체적인 서열에 대한 설명에도 동일하게 적용된다.
여기서 "유사성"이란 야생형(wild type) 아미노산 서열 혹은 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 당업계에 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 유사성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 또한, 유사성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
특별히 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 FGF21 모조 펩타이드 유도체에 포함되는 상기 성숙 FGF21의 C-말단 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 임의의 아미노산으로부터 C-말단으로부터 1번째, 4번째, 또는 11번째 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열일 수 있다.
상기 연속되는 아미노산은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개의 아미노산을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 성숙 FGF21의 C-말단의 아미노산 서열은 서열번호: 131 내지 136으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
특별히 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 FGF21 아날로그에 포함되는 상기 FGF19의 C-말단 아미노산 서열은 FGF19의 임의의 아미노산으로부터 C-말단으로부터 1번째 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열일 수 있다.
상기 연속되는 아미노산은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개의 아미노산을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
FGF19의 아미노산 서열의 예를 서열번호: 89에 나타내었다. 여기서, 1번부터 24번까지는 신호서열이고 25번부터 216번까지는 성숙 FGF19 아미노산 서열에 해당된다.
보다 구체적으로, 상기 성숙 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열은 서열번호: 137 또는 138일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
앞서 기술한 바와 같이, 상술한 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열과 성숙 FGF21의 C-말단 아미노산 서열, 또는 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열과 성숙 FGF19의 C-말단 아미노산 서열의 다양한 조합이 본 발명의 범주에 포함된다. 구체적으로, 천연형 성숙 FGF21의 N-말단 4번째, 5번째, 9번째 아미노산부터 시작되는 서열과 C-말단 1번째, 4번째, 11번째 아미노산부터 시작되는 서열의 여러 조합으로 FGF21 모조 펩타이드 유도체가 구성될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, FGF21 수용체에 대한 결합력이 감소된 FGF21 아날로그는 모두 본 발명의 범주에 속한다.
예시적으로 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은 서열번호 123 내지 130으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 성숙 FGF21의 C-말단의 아미노산 서열은 서열번호 131 내지 136으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열은 서열번호 137 또는 138인, FGF21 아날로그일 수 있다. 이들의 다양한 조합이 본 발명의 범주에 포함된다.
보다 구체적으로, 상기 FGF21 아날로그는 서열번호: 90 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 FGF21 아날로그는 FGF21 수용체 및/또는 공동 수용체 (즉, 베타-클로소)를 활성화시킬 수 있기만 하면 그 길이는 특별히 제한되지 않으나, 그 예로 4개 내지 100개의 아미노산을 가질 수 있다. 그러나, 상기 기술한 바에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 (i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열 및 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열은 서로 링커를 통해 연결된 것일 수 있다.
여기서, 상기 링커는 상기 (i)과 (ii)를 연결하고, 해당 FGF21 모조 펩타이드 유도체의 FGF21 수용체에 대한 결합을 가지고 온다면 그 종류는 특별히 제한되지 않는다.
특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 링커는 유연 링커(flexible linker)일 수 있다.
특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 유연 링커는 FGF21의 N-말단 아미노산 서열이 FGF21 수용체와 결합하고 FGF21 또는 FGF19의 C-말단 아미노산 서열이 FGF21 공동수용체와 결합하는 것에 있어 유연성을 증대시킬 수 있다.
상기 링커는 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 링커에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 (i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열 및 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로 순차적으로 배열된 것일 수 있다. 또한, 이에 제한되는 것은 아니며, (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열 및 (i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열이 N-말단에서 C-말단 방향으로 순차적으로 배열된 것일 수 있다.
이때 앞서 설명한 바와 같이 (i)과 (ii)는 링커를 매개로 하여 배열된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 FGF21 아날로그는 상술한 변이와 함께, 또는 독립적으로 하기와 같은 변이를 포함하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, (i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열에 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열이 부가되고, 추가로 (iii) 엑센딘-4(exendin-4) 서열이 부가된, FGF21 아날로그일 수 있다.
보다 구체적으로, 엑센딘-4 (Excendin-4) 서열, 성숙 FGF21 N-말단 영역과 성숙 FGF21 또는 FGF19 C-말단 영역이 포함되어 결합된, 이중 GLP-1/FGF21 작용제인 FGF21 아날로그일 수 있다.
상기 FGF21 아날로그는 천연형 GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) 또는 FGF21에 비해 GLP-1 또는 FGF21 역가가 감소된 것일 수 있다.
이와 같은 이중 GLP-1/FGF21 작용제인 FGF21 아날로그는 GLP-1 수용체, FGF21 수용체, 및/또는 FGF21 공동수용체에 대한 결합력이 천연형 GLP-1과 FGF21 보다 감소한 것으로 해리 상수 증가에 의해 수용체에 의해 매개되는 제거 가 현저하게 감소하여 혈중 반감기가 증가된 것일 수 있다.
상기 "이중 GLP-1/FGF21 작용제"는 엑센딘-4 펩타이드 유래 서열, 성숙 FGF21 N-말단 서열과, 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 이와 같은 구조적 특성으로 GLP-1 및/또는 FGF21 역가가 감소된 것일 수 있으며, 이러한 특성을 보유하는 이중 GLP-1/FGF21 작용제라면 제한없이 본 발명의 범주에 포함된다.
구체적으로, 상기 이중 GLP-1/FGF21 작용제에 포함되는 엑센딘-4 펩타이드 유래 서열은, 엑센딘-4 서열에서 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 탄소이 제거된 엑센딘-4, 즉 이미다조아세틸-Exendin-4 (imidazoacetyl-exendin-4, CA-엑센딘-4) 유래 서열일 수 있다.
구체적으로, 천연형 엑센딘-4 서열에서 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 카본이 제거되고, 32번째부터 39번째 아미노산 서열이 제외된 서열일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않으며, 상기 엑센딘-4 서열은 GLP-1 역가가 감소된 모든 CA-엑세딘-4 서열을 포함한다.
또한, 상기 이중 GLP-1/FGF21 작용제에 적용되는 상기 FGF21 서열은 신호서열을 제외한 성숙 FGF21 서열에서 FGF21 수용체의 결합에 중요한 N-말단의 일부분과 FGF21 공동수용체인 베타클로소와 직접적으로 결합하는 C-말단의 일부분이 결합되어 구성된 서열일 수 있다.
본 발명에서 용어 "N-말단" 또는 "C-말단"은 상기 이중 GLP-1/FGF21 작용제를 구성할 수 있는 FGF21 또는 FGF19의 N-말단 영역 또는 C-말단 영역을 의미할 수 있다.
본 발명의 이중 GLP-1/FGF21 작용제는 엑센딘-4 펩타이드와 성숙 FGF21 아미노산 서열의 N-말단 서열, 그리고 성숙 FGF21 또는 FGF19 아미노산 서열의 C-말단이 포함된 이중 작용제이지만 본 발명은 이것에만 국한되는 것이 아니라 in - vitro 역가가 감소된 모든 이중 GLP-1/FGF21 작용제를 포함한다.
한편, FGF19는 FGF21과 같이 FGF 수용체에 결합할 때 FGF 공동수용체인 베타클로소와의 결합이 선행되는데 FGF19의 C-말단이 베타클로소와 결합하고 그 결합력이 FGF21의 C-말단보다 강한 것으로 알려져 있다. 이러한 이중 GLP-1/FGF21 작용제에서 성숙 FGF21 N-말단과 FGF19 C-말단의 결합으로 이루어진 서열도 포함한다.
본 발명에 사용되는 FGF21 N-말단 아미노산 서열은 신호서열을 포함하지 않는 성숙 FGF21 아미노산 서열에서 활성에 영향을 미치지 않는 N-말단 1번째 아미노산(Histidine)부터 4번째 아미노산(Proline)까지 제외한 N-말단 부위의 아미노산 서열을 사용할 수 있고, 구체적으로 성숙 FGF21의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 5번째 아미노산으로부터 C-말단 방향에 위치하는 임의의 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열을 사용할 수 있다.
또한, 상기 성숙 FGF21의 C-말단 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 임의의 아미노산으로부터 C-말단으로부터 1번째 또는 4번째 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열이고, 상기 FGF19의 C-말단 아미노산 서열은 FGF19의 임의의 아미노산으로부터 C-말단으로부터 1번째 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열일 수 있다.
상기 연속되는 아미노산 서열은 2개 내지 30개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
이러한 (i) 엑센딘-4 서열, (ii) FGF21 N-말단 아미노산 서열, 및 (iii) FGF21 C-말단 아미노산 서열 또는 FGF19 C-말단 아미노산 서열이 서로 결합된, FGF21 아날로그일 수 있다.
또한, 상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열과 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열 사이, 또는 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열과 엑센딘-4(exendin-4) 서열은 직접적으로 연결되거나, 링커를 통해 연결된 것일 수 있으며, 상기 링커에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 링커는 GLP-1 아날로그인 엑센딘-4가 GLP-1 수용체에 결합하는 것에 있어 유연성을 증대시킬 수 있다. 또한 FGF21의 N-말단이 FGF21 수용체와 결합하고 FGF21 또는 FGF19의 C-말단이 FGF21 공동수용체와 결합하는데 유연성을 증대시킬 수 있다.
또한, 상기 FGF21 아날로그는 엑센딘-4 서열, 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열, 및 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열이 N-말단에서 C-말단 방향으로 순차적으로 연결된 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은 서열번호: 139 내지 142로 이루어진 군에서 선택되고, 성숙 FGF21의 C-말단의 아미노산 서열은, 서열번호: 143 내지 147로 이루어진 군에서 선택되고, 성숙 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열은, 서열번호: 148 내지 150으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적인 예로서, 상기 FGF21 아날로그는 서열번호: 103 내지 113으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 FGF21 아날로그는 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템, 또는 임의의 다른 당해 분야의 방법에 의해 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 FGF21 아날로그는, 예를 들어 하기를 포함하는 방법을 포함하는 다수의 방법으로 합성될 수 있다:
(a) 펩타이드를 고체상 또는 액체상 방법의 수단으로 단계적으로 또는 단편 조립에 의해 합성하고, 최종 펩타이드 생성물을 분리 및 정제하는 방법; 또는
(b) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물을 숙주세포 내에서 발현시키고, 발현 생성물을 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 방법; 또는
(c) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물의 무세포 시험관 내 발현을 수행하고, 발현 생성물을 회수하는 방법; 또는
(d) (a), (b) 및 (c)의 임의의 조합으로 펩타이드의 단편을 수득하고, 이어서 단편을 연결시켜 펩타이드를 수득하고, 당해 펩타이드를 회수하는 방법.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 FGF21 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 함유하는, 형질전환체를 제공한다.
상기 FGF21 아날로그에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질, 예컨대 상기 FGF21 아날로그를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 FGF21 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.
상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 재조합 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 재조합 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 제작될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 OmpA계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 본 발명의 FGF21 아날로그를 생산하기 위해 숙주세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 일부인, 이러한 형질전환 세포는 본 발명의 핵산 단편 및 벡터의 증식에 사용되거나, 본 발명의 결합체의 재조합 생산에 사용된 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 FGF21 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(Sf9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있다.
본 발명의 구현하는 다른 양태는
(i) 천연형 FGF21 또는 상기 FGF21 아날로그; 및 (ii) FcRn 결합물질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 단편, 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택된 캐리어가 결합된, FGF21 결합체를 제공한다.
상기 FGF21 및 FGF21 아날로그에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역일 수 있다.
또한, 상기 FGF21 결합체는 (i) 천연형 FGF21 또는 상기 FGF21 아날로그와 (ii) 캐리어가 (iii) 펩타이드 링커, 또는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 한다.
예컨대, 상기 비펩타이드성 중합체의 각 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역과 FGF21의 아민 그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합된 형태일 수 있다.
본 발명의 면역글로불린 Fc 영역, 다른 용어로 면역글로불린 불변영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서 "면역글로불린 Fc 영역" 또는 "면역글로불린 불변영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하는 부위를 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 본 발명의 FGF21 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다.
이러한 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
예컨대, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 하나의 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 이합체 형태(dimeric form)일 수 있으며, 이합체 형태의 하나의 Fc 영역에 FGF21 또는 이의 아날로그 한 분자가 공유결합적으로 연결될 수 있으며, 이때 상기 면역글로불린 Fc와 FGF21 또는 이의 아날로그는 비펩타이드성 중합체에 의해 서로 연결될 수 있다. 한편, 이합체 형태의 하나의 Fc 영역에 FGF21 또는 이의 아날로그 두 분자가 대칭적으로 결합하는 것 역시 가능하다. 이때 상기 면역글로불린 Fc와 FGF21 또는 이의 아날로그는 비펩타이드성 중합체에 의해 서로 연결될 수 있다. 그러나, 상기 기술된 예에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다.
예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인으로 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신으로 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 더 구체적인 실시 형태에서는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 보다 더 구체적인 실시 형태에서는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 더욱 더 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이며, 가장 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 중합체"는, 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하는 것으로, 본 발명의 FGF21 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다. 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 상기 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 링커와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 구체적으로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 당해 분야에 알려진 이들의 아날로그 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 아날로그들도 본 발명의 범위에 포함된다.
한편, 상기한 바와 같이 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 본 발명의 캐리어, 예를 들어 면역글로불린 Fc 영역과 FGF21에 결합될 수 있는 반응기를 가질 수 있다. 즉, 상기 비펩타이드성 중합체의 반응기를 통해 캐리어, 예컨대 면역글로불린 Fc 영역과 FGF21 또는 이들 아날로그에 연결될 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알데하이드 그룹, 부틸 알데하이드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 아날로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 알데하이드기를 포함하는 작용기는 프로피온 알데하이드, 부틸 알데하이드 등의 알킬알데하이드일 수 있다. 따라서, 구체적으로 상기 비펩타이드성 중합체는 양말단에 프로피온 알데하이드기가 치환된 PEG일 수 있다. 석시니미드 아날로그로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다.
특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 FGF21 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물인 결합체는 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체인 링커의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 지속형 결합체를 제조할 수 있다.
본 발명의 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 독립적으로 알데하이드, 말레이미드, 비닐술폰, 티올, 이황화 오르토피리딘, 요오드화 아세트아미드, 석시니미드 및 각각의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응기를 갖는 것일 수 있으며, 상기 양 말단의 반응기를 통해 FGF21 및 캐리어, 예를 들어 면역글로불린 Fc 영역과 각각 공유결합으로 연결되는 것일 수 있다.
특히, 본 발명의 결합체는 비펩타이드성 중합체의 양 말단의 반응기가 각각 캐리어와 FGF21의 아민그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합하는 것, 또는 비펩타이드성 중합체의 양 말단의 반응기가 각각 FGF21 및 캐리어의 N-말단 아민기 또는 Lys 잔기 측쇄의 아민기에 결합되는 것 등이 될 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 비펩티드성 중합체는 양쪽 말단에 캐리어, 예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역과 FGF21에 결합될 수 있는 반응기를 포함하고, 상기 반응기는 특별히 이에 제한되지 않으나, 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹, 비닐술폰(vinlysulfone) 그룹, 티올(thiol) 그룹, 이황화 오르토피리딘(orthopyridyl disulfide) 그룹, 요오드화아세트아미드(iodoacetamide) 그룹, 석시니미드 그룹, 석시니미드(succinimide) 아날로그(석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트) 그룹 및 각각의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 생체 내 단백질분해 효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체는 분자량이 1 내지 100 kDa 범위, 구체적으로는 1 내지 20 kDa 범위인 것이 바람직하다. 또한, FGF21 또는 캐리어와 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다. 또한, 본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 FGF21 및 캐리어와 결합될 수 있는 양 말단 또는 세 말단의 반응기를 가질 수 있다. 구체적으로 상기 반응기는 알데하이드기(reactive aldehyde group)일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 FGF21 아날로그 또는 FGF21 결합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 FGF21 결합체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
하나의 양태로서, FGF21 아날로그 또는 FGF21 결합체를 포함하는, FGF21에 대한 지속성 제제를 제공한다.
상기 지속성 제제는 천연형 FGF21에 비해 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 FGF21 결합체 지속성 제제 또는 FGF21 아날로그 지속성 제제일 수 있다. 상기 지속성 제제는 후술할 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
또한 본 발명의 지속성 제제 또는 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)의 종류를 포함할 수 있다. 경구투여 시에는 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 지속성 제제 또는 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다.
다른 양태는 상기 FGF21 아날로그; 또는 상기 FGF21 아날로그 또는 천연형 FGF21에 FcRn 결합물질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 단편, 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택된 캐리어가 결합된, FGF21 결합체를 유효성분으로 포함하는, 대사증후군의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "예방"은 상기 FGF21 아날로그, FGF21 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 대사 증후군 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 FGF21 아날로그, FGF21 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 대사 증후군 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
상기 대사증후군은 내당증 장애, 고콜레스테롤혈증, 이상지혈증, 비만, 당뇨, 고혈압, 비알코올지방간염 (nonalcoholic steatohepatitis, NASH), 이상지혈증에 의한 동맥경화, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 및 관상동맥 심질환(관동맥성 심장병)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 조성물이 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 뿐 아니라, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다.
또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 FGF21 아날로그, FGF21 결합체, 이들의 지속성 제제, 이들의 약학적 조성물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 FGF21 관련 질환 치료 방법을 제공한다.
상기 FGF21 아날로그, FGF21 결합체, 이들의 지속성 제제, 이들의 약학적 조성물에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
또한, 상기 FGF21 관련 질환은 대사증후군일 수 있으며, 이에 대해서는 상술한 바와 같다.
또한, 본 발명의 FGF21 아날로그, FGF21 결합체 등의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 FGF21 아날로그, FGF21 결합체 등의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 FGF21 아날로그, FGF21 결합체 등은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 FGF21 아날로그, FGF21 결합체, 이들의 지속성 제제, 또는 이들의 약학적 조성물의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
본 발명의 구현하는 다른 양태는 상기 형질전환체를 배양하여 FGF21 아날로그를 발현하는 단계; 및 형질전환체 혹은 이의 배양물로부터 상기 발현된 FGF21 아날로그를 회수하는 단계를 포함하는, FGF21 아날로그의 제조방법을 제공한다.
상기 FGF21 아날로그, 형질전환체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
하나의 일례로서, 다음과 같은 단계를 포함하는 FGF21 아날로그의 제조방법일 수 있다:
(a) FGF21 아날로그를 대장균의 페리플라즘에 발현시키는 단계;
(b) 페리플라즘으로부터 FGF21 아날로그를 추출하여 침전시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 침전물로부터 FGF21 아날로그가 포함된 상등액을 수득하고, 이를 음이온 결합 크로마토그래피에 적용하고, FGF21 아날로그를 포함하는 용출액을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 용출액을 소수성 결합 크로마토그래피에 적용하여 FGF21 아날로그를 포함하는 용출액을 수득하는 단계.
본 발명의 구현하는 다른 양태는 천연형 FGF21 또는 상기 FGF21 아날로그를 FcRn 결합물질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 단편, 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택된 캐리어와 결합시키는 단계를 포함하는, FGF21 결합체의 제조 방법을 제공한다.
상기 FGF21, 이의 아날로그, FGF21 결합체, 형질전환체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 FGF21 및 아날로그 또는 FGF21, 아날로그 및 캐리어가 결합된, FGF21 아날로그 결합체를 이용하여 생체 내 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 FGF21, 이의 아날로그, FGF21 결합체, 캐리어에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: FGF21 아날로그의 제작 (1)
(1) FGF21 및 아날로그 발현 벡터의 제작
FGF21 발현 벡터를 제작하기 위해 FGF21 cDNA (OriGene, RC204538)로부터 FGF21 유전자를 증폭하였다. E. coli 페리플라즘(periplasm)으로 발현시키기 위하여 OmpA signal 서열이 포함되어 있는 pFlag-CTS 벡터에 삽입하기 위하여 하기 프라이머(서열번호 1, 2)를 제작하여 PCR을 진행하였다.
FGF21 증폭 프라이머
서열 서열번호
FGF21 5'-GTCAAGCTCACCCCATCCCTGACTCCAGTC-3' 1
5'-GACTCGAGTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTC-3' 2
PCR 증폭 조건은 95 ℃ 30초, 55 ℃에서 30초, 68 ℃에서 45초로 이 과정을 30회 반복하였으며 증폭된 유전자와 벡터를 HindⅢ, XhoⅠ 제한효소로 절단한 후 T4 리가아제로 접합하여 FGF-21 발현 벡터를 제작하였다. 서열 분석을 통하여 정확한 서열을 확인하였으며 뉴클레오타이드 및 단백질 서열은 다음과 같다. 하기 FGF21 서열은 성숙 FGF21 서열에 해당한다.
서열 서열번호
FGF21 DNA CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACTCCCGGAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTACGCTTCCTGA 3
단백질 HPIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPGNKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLSMVG PSQGRSPSYA S 4
보유 중인 천연형 FGF21 발현 벡터를 주형으로 하여 FGF21 아날로그를 제작하고자 FGF21 아날로그의 백본 벡터를 제작하였다. 천연형 성숙 FGF21은 단백질 발현 과정 중 N 말단의 첫 번째 아미노산인 히스티딘 (Histidine)이 자연적으로 제거되는 형태가 약 20% 정도 발견되고, C 말단 부근에 167번 아미노산과 168번 아미노산 사이가 잘린 형태가 형성되는데 이를 방지하기 위하여 N 말단 첫 번째 히스티딘 (Histidine) 또는 두 번째 프롤린 (Proline)을 제거하고 167번째 아미노산인 세린(Serine)을 트레오닌(Threonine), 그리고 168번째 아미노산인 메티오닌(Methionine)을 알라닌(Alanine), 페닐알라닌(Phenylalanine), 아이소류신(Isoleucine)으로 치환한 FGF21 뮤테인을 제작해 이를 상기에서 서술한 FGF21 아날로그 제작에 백본 벡터로 사용하였다.
백본 벡터를 제작하기 위해 사용한 올리고 뉴클레오타이드를 합성한 후(표 3), 위치선택적 돌연변이(site-directed mutagenesis) PCR을 진행하여 백본 벡터의 FGF21 유전자를 증폭하였다.
서열번호 5 및 서열번호 6를 이용하여 히스티딘 제거 형태를 먼저 제작한 후, FGF21 M168A 치환 FGF21 아날로그 백본 벡터를 완성하였다.
FGF21 아날로그 백본 벡터 제작 프라이머
서열 서열번호
ΔHis 5'-GTTGCGCAAGCTCCCATCCCTG-3' 5
5'-CAGGGATGGGAGCTTGCGCAAC-3' 6
ΔPro 5'-GTTGCGCAAGCTATCCCTGACT-3 7
5'-AGTCAGGGATAGCTTGCGCAAC-3' 8
S167T 5'-GGCTCCTCGGACCCTCTGACCATGGTGGGACCTTCCCAG-3 9
5'-CTGGGAAGGTCCCACCATGGTCAGAGGGTCCGAGGAGCC-3' 10
M168A 5'-CCTCGGACCCTCTGAGCGCGGTGGGACCTTCCC-3' 11
5'-GGGAAGGTCCCACCGCGCTCAGAGGGTCCGAGG-3' 12
M168F 5'-CTCCTCGGACCCTCTGAGCTTCGTGGGACCTTCCCAGGGC-3' 13
5'-GCCCTGGGAAGGTCCCACGAAGCTCAGAGGGTCCGAGGAG-3' 14
M168I 5'-CTCCTCGGACCCTCTGAGCATCGTGGGACCTTCCCAGGGC-3' 15
5'-GCCCTGGGAAGGTCCCACGATGCTCAGAGGGTCCGAGGAG-3' 16
FGF21 아날로그 증폭을 위한 PCR 조건은 95 ℃ 30초, 55 ℃에서 60초, 68 ℃에서 6분으로 이 과정을 18회 반복하였다. 하기 표 4에 FGF21 아날로그 백본 벡터의 FGF21 아날로그 DNA 서열 및 단백질 서열을 나타냈다.
FGF21 아날로그 백본 벡터 DNA, 단백질 서열
서열 서열번호
ΔH,M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 17
단백질 PIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSPSYA S 18
ΔHP,S167T DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAC CATGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 19
단백질 IPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPL T MVG PSQGRSPSYA S 20
ΔHP,M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 21
단백질 IPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSPSYA S 22
ΔHP,M168F DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CTTCGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 23
단백질 IPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS F VG PSQGRSPSYA S 24
ΔHP,M168I DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CATCGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 25
단백질 IPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS I VG PSQGRSPSYA S 26
(2) 저 친화성 (Low affinity) FGF21 아날로그 발현 벡터 제작
상기 실시예 1 (1)에서 제작된 백본 벡터를 주형으로 하여 FGF21의 N 말단과 C 말단의 아미노산을 하나씩 변형시킨 FGF21 아날로그들을 제작하였다. 이들 FGF21 아날로그들을 제작하기 위해 순방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드를 합성한 후 (표 5), PCR을 진행하여 각각의 아날로그 유전자를 증폭하였다.
FGF21 아날로그 증폭을 위한 프라이머
돌연변이 정보 서열 서열번호
D5A 5'-CAAGCTCCCATCCCTGCATCCAGTCCTCTCCTG-3' 27
5'-CAGGAGAGGACTGGATGCAGGGATGGGAGCTTG-3' 28
S6A 5'-AAGCTCCCATCCCTGACGCCAGTCCTCTCCTGC-3' 29
5'-GCAGGAGAGGACTGGCGTCAGGGATGGGAGCTT-3' 30
S7A 5'-TCCCATCCCTGACTCCGCTCCTCTCCTGCAATTC-3' 31
5'-GAATTGCAGGAGAGGAGCGGAGTCAGGGATGGGA-3' 32
P8A 5'-CCATCCCTGACTCCAGTGCTCTCCTGCAATTCG-3' 33
5'-CGAATTGCAGGAGAGCACTGGAGTCAGGGATGG-3' 34
L9A 5'-CCCTGACTCCAGTCCTGCTCTGCAATTCGGGGG-3' 35
5'-CCCCCGAATTGCAGAGCAGGACTGGAGTCAGGG-3' 36
S172A 5'-GAGCGCGGTGGGACCTGCCCAGGGCCGAAGCCC-3' 37
5'-GGGCTTCGGCCCTGGGCAGGTCCCACCGCGCTC-3' 38
S176A 5'-ACCTTCCCAGGGCCGAGCACCCAGCTACGCTTCCT-3' 39
5'-AGGAAGCGTAGCTGGGTGCTCGGCCCTGGGAAGGT-3' 40
P177A 5'-CTTCCCAGGGCCGAAGCGCCAGCTACGCTTCCTG-3' 41
5'-CAGGAAGCGTAGCTGGCGCTTCGGCCCTGGGAAG-3' 42
S178A 5'-CCAGGGCCGAAGCCCCGCATACGCTTCCTGAGGATC-3' 43
5'-GATCCTCAGGAAGCGTATGCGGGGCTTCGGCCCTGG-3' 44
FGF21 아날로그 증폭을 위한 PCR 조건은 95 ℃에서 30초, 55 ℃에서 60초, 68 ℃에서 6분으로 이 과정을 18회 반복하였다. 이와 같은 조건에서 얻어진 돌연변이(mutagenesis) 산물은 원하는 부위의 아미노산이 정상적으로 바뀌어 있는지 서열 분석을 통해 확인하였고, 이렇게 얻어진 발현 벡터를 OmpA-FGF21 아날로그라 명명하였다.
상기 과정을 통해 제조한 FGF21 아날로그의 DNA 서열 및 단백질 서열을 하기 표 6 및 7에 정리하였다.
하기 아날로그 명칭에 표시된 아미노산 번호는 천연형 성숙 FGF21의 서열을 기준으로 번호를 매긴 것에 해당하고, ΔH는 천연형 성숙 FGF21 서열에서 첫 번째 아미노산인 히스티딘이 결실된 것을, ΔHP는 천연형 성숙 FGF21 서열에서 첫 번째 및 두 번째 아미노산인 히스티딘과 프롤린이 결실된 것을 나타낸다.
아날로그 변화 서열
아날로그 1 ΔH,D5A, M168A
아날로그 2 ΔH,S6A, M168A
아날로그 3 ΔH, S7A, M168A
아날로그 4 ΔH, P8A, M168A
아날로그 5 ΔH, L9A, M168A
아날로그 6 ΔH, S172A, M168A
아날로그 7 ΔH, S176A, M168A
아날로그 8 ΔH, P177A, M168A
아날로그 9 ΔH, S178A, M168A
아날로그 10 ΔHP, D5A, M168A
아날로그 11 ΔHP, S6A, M168A
아날로그 12 ΔHP, S7A, M168A
아날로그 13 ΔHP, P8A, M168A
아날로그 14 ΔHP, L9A, M168A
아날로그 15 ΔHP, S172A, M168A
아날로그 16 ΔHP, S176A, M168A
아날로그 17 ΔHP, P177A, M168A
아날로그 18 ΔHP, S178A, M168A
FGF21 아날로그 백본 벡터 DNA, 단백질 서열
아날로그 서열 서열번호
ΔH,D5A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGCATCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 45
단백질 PIP A SSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSPSYA S 46
ΔH,S6A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACGCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 47
단백질 PIPD A SPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSPSYA S 48
ΔH,S7A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCGC TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 49
단백질 PIPDS A PLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSPSYA S 50
ΔH,P8A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TGCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 51
단백질 PIPDSS A LL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSPSYA S 52
ΔH,L9A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TCCTGCTCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 53
단백질 PIPDSSP A L QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSPSYA S 54
ΔH,S172A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTGCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 55
단백질 PIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG P A QGRSPSYA S 56
ΔH,S176A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAGCACC CAGCTACGCT TCCTGA 57
단백질 PIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGR A PSYA S 58
ΔH,P177A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCGC CAGCTACGCT TCCTGA 59
단백질 PIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRS A SYA S 60
ΔH,S178A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CGCATACGCT TCCTGA 61
단백질 PIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSP A YA S 62
ΔHP,D5A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGCATCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 63
단백질 IP A SSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSPSYA S 64
ΔHP,S6A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGACGCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 65
단백질 IPD A SPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSPSYA S 66
ΔHP,S7A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGACTCCGC TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 67
단백질 IPDS A PLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSPSYA S 68
ΔHP,P8A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGACTCCAG TGCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 69
단백질 IPDSS A LL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSPSYA S 70
ΔHP,L9A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGACTCCAG TCCTGCTCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 71
단백질 IPDSSP A L QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSPSYA S 72
ΔHP,S172A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTGCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA 73
단백질 IPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG P A QGRSPSYA S 74
ΔHP,S176A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAGCACC CAGCTACGCT TCCTGA 75
단백질 IPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGR A PSYA S 76
ΔHP,P177A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCGC CAGCTACGCT TCCTGA 77
단백질 IPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRS A SYA S 78
ΔHP,S178A, M168A DNA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CGCATACGCT TCCTGA 79
단백질 IPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLS A VG PSQGRSP A YA S 80
상기 표 7의 아미노산 서열의 볼드체 및 밑줄로 표시된 부분은 천연형 성숙 FGF21의 서열에서 다른 아미노산 서열로 치환된 부분을 표시한 것이다.
(3) 재조합 FGF21 아날로그의 발현
OmpA 신호 (signal) 서열의 유도 하에 E. coli의 페리플라즘으로 재조합 FGF21 아날로그의 발현을 수행하였다. 재조합 FGF21 발현 벡터를 이용하여 E. coli BL21 (E.coli B F- dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal, Agilent)을 형질 전환하였다.
형질 전환 방법은 Agilent사에서 권고하는 방법을 따랐다. 재조합 FGF-21 발현 벡터가 형질 전환된 단일 콜로니를 취하여 암피실린 (50 ㎍/mL)이 포함된 1X 루리아 브로스(Luria Broth, LB) 배지에 접종하고, 37 ℃에서 15시간 배양하였다. 재조합 FGF21 균주 배양액과 30 % 글리세롤이 포함된 1X LB 배지를 1:1 (v/v)의 비율로 혼합하여 각 1 mL씩 크라이오-튜브 (cyro-tube)에 분주하고, -140 ℃에 보관하였다. 이를 재조합 융합 단백질의 생산을 위한 세포 스탁 (cell stock)으로 사용하였다.
재조합 FGF21 아날로그의 발현을 위하여, 각 세포 스탁 1 바이알을 녹여 1L의 1X 루리아 브로스에 접종하고 37 ℃에서 14 내지 15시간 동안 진탕 배양하였다. OD600의 값이 1.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 30 L 발효기 (BIOSTAT C-plus 30 L, Sartorius, 독일)를 이용하여 종 배양액을 9.2 L의 발효 배지에 접종하고 초기 배스 (bath) 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 30 ℃, 공기량 13 L/분 (1 vvm), 교반 속도 500 rpm 그리고 30 % 암모니아수를 사용하여 pH 6.7로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가배지 (feeding solution)를 첨가하여 유가 배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하며, OD 값이 80 이상에서 최종 농도 0.5 mM의 IPTG를 도입하였다. 도입 후 약 23~25 시간까지 배양을 더 진행하며, 배양 종료 후, 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수획하여 사용 시까지 -80 ℃에 보관하였다.
(4) 페리플라즘 재조합 FGF21 아날로그의 추출
상기 실시예에서 얻은 대장균 균체 200 g을 상온의 완충용액 (20 % 수크로즈, 1 mM EDTA, 30 mM Tris pH 7.5) 3 L에 용해시킨 후 2 시간 동안 교반한 후 7,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛을 수거하였다. 이 펠렛을 다시 4 ℃의 증류수 3 L에 용해시켜 4 ℃에서 2시간 동안 교반한 후 7,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛을 제거하고 페리플라즘 단백질이 포함된 상등액을 수거하였다.
(5) 재조합 FGF21 아날로그의 침전
상기 실시예에서 얻은 상등액에 15 mM이 되도록 Histidine을 첨가한다. 그리고 60 % HCl을 pH를 5.2가 되도록 서서히 첨가시킨 후 7,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛을 제거하고 재조합 FGF21 아날로그가 포함된 상등액을 수거하였다.
(6) 음이온 결합 크로마토그래피 정제
상기 실시예에서 얻은 상등액에 1M 트리스 (Tris) pH 8.0 완충액을 pH가 6 이상이 되도록 넣어준 후 전도도(conductivity)가 5 이하가 되도록 10 mM 트리스 (Tris) 8.0 완충액으로 희석시켜 주었다. 10 mM 트리스 (Tris) pH 8.0 완충액으로 평형화된 DEAE (GE, 미국) 컬럼에 단백질을 접합시킨 후 염화나트륨 (Sodium Chloride) 0.5 M이 포함된 10 mM 트리스 (Tris) pH 8.0 완충액을 사용하여 농도가 0 % 에서 100 %가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도 구배로 재조합 FGF21 아날로그를 용출하였다.
(7) 소수성 결합 크로마토그래피 정제
상기 실시예에서 얻은 용출액을 10 mM 트리스 (Tris) pH 8.0 완충액으로 10 배 희석시켜준 후 3 M 황산암모늄 (Ammonium Sulfate) 완충액을 1.2 M이 되도록 서서히 넣어주었다. 1.2 M 황산암모늄 (Ammonium Sulfate)가 포함된 10 mM 트리스 (Tris) pH 8.0 완충액으로 평형이 잡힌 Source Iso (GE, 미국) 컬럼에 결합시킨 후 10 mM 트리스 (Tris) pH 8.0 완충액을 사용하여 농도가 0 %에서 100 %가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 재조합 FGF21 단백질을 용출하였다.
정제된 FGF21 아날로그의 순도는 전기영동 (SDS-PAGE, 도 1) 및 고압크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 분석하였다 (도 2).
(8) FGF21 아날로그 단백질의 수용체 결합력 및 활성 확인
상기 실시예에서 얻은 FGF21 아날로그의 FGF21의 보조 수용체인 베타-클로토와의 결합력 및 활성을 확인하기 위하여 SPR(surface plasmon resonance) 및 in vitro 글루코스 수용(glucose uptake) 시험을 진행하였다. 베타-클로토와의 SPR 시험 결과, 본 발명에 따른 FGF21 아날로그 단백질은 천연형 FGF21과 비교하여 현저하게 낮은 결합력과 in vitro 활성을 보이는 것을 확인하였다 (도 3). 이와 같은 결과는 FGF21의 N 말단 및 C 말단 부위가 수용체와의 결합 및 활성에 중요한 부위라는 것을 시사하는 것이다..
실시예 2: FGF21 아날로그의 제작 (2)
(1) FGF21 아날로그 백본 벡터의 제작
본 발명자들은 천연형 FGF21을 대장균에 발현시키는 과정에서 FGF21의 약 50%의 절단 형태 (cleavage form)가 발현되는 것을 확인하였고, 전체 서열분석 (full sequencing) 결과에서 절단된 FGF21은 167번에 위치한 세린 (167S)과 168번에 위치한 메티오닌 (168M) 사이가 알 수 없는 경로에 의해 절단되는 것을 확인하였다.
이에, 보유 중인 천연형 FGF21 발현 벡터를 주형으로 하여 FGF21 아날로그를 제작하였다. 천연형 FGF21은 단백질 발현 중에 C-말단 부근에 167, 168번 아미노산 사이가 잘린 형태가 형성되는데 이를 방지하기 위하여 167번째 아미노산인 Ser을 Thr으로, 168번째 아미노산인 Met을 Ile으로 치환하였다. 또한 생체 내에서 DPPIV (Dipeptidyl peptidase-4)에 의해 N-말단 1~4번의 아미노산이 잘린 형태가 형성되는 것을 방지하기 위해 1~4번 아미노산이 유전자 수준에서 제거되도록 하였다. 또한 생체 내에서 FAP (fibroblast activating protein)에 의해 171번째 아미노산과 172번째 아미노산 사이가 절단되는 형태로 형성되는 것을 방지하기 위해 170번째 아미노산인 Gly을 Glu으로, 172번째 아미노산인 Ser를 Leu으로 치환하였다.
상기의 FGF21 아날로그를 제작하기 위해 사용한 올리고 뉴클레오티드를 하기 표 8과 같이 합성한 후, 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis) PCR을 진행하여 FGF21 아날로그 유전자를 증폭하였다.
구체적으로, 서열번호 81 및 82의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 1~4번의 아미노산 (HPIP)이 제거된 형태를 먼저 제작한 후, 서열번호 83 및 84의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 167, 168, 170 그리고 172번째 아미노산을 치환하여 FGF21 아날로그 벡터를 완성하였다.
FGF21 아날로그 제작 프라이머
서열 서열번호
HPIP 5'-CGCTACCGTTGCGCAAGCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCA-3' 81
5'-TGCAGGAGAGGACTGGAGTCAGCTTGCGCAACGGTAGCGA-3' 82
S167T, M168I, G170ES172L 5'-GGCTCCTCGGACCCTCTGACCATCGTGGAACCTCTCCAGGG-3' 83
5'-CCCTGGAGAGGTTCCACGATGGTCAGAGGGTCCGAGGAGCC-3' 84
FGF21 아날로그 증폭을 위한 PCR 조건은 95℃ 30초, 55℃에서 60초, 68℃에서 6분으로 이 과정을 18회 반복하였다. 하기 표 9에 FGF21 아날로그 백본 벡터의 DNA 서열 및 단백질 서열을 나타냈다.
FGF21 아날로그 백본 벡터 DNA, 단백질 서열
서열 서열번호
FGF21(del-HPIP, S167T, M168I, G170E, S172L) DNA GACTCCAGTC CTCTCCTGCA ATTCGGGGGC CAAGTCCGGC AGCGGTACCT CTACACAGATGATGCCCAGC AGACAGAAGC CCACCTGGAGATCAGGGAGG ATGGGACGGT GGGGGGCGCTGCTGACCAGA GCCCCGAAAG TCTCCTGCAGCTGAAAGCCT TGAAGCCGGG AGTTATTCAAATCTTGGGAG TCAAGACATC CAGGTTCCTG TGCCAGCGGC CAGATGGGGC CCTGTATGGATCGCTCCACT TTGACCCTGA GGCCTGCAGCTTCCGGGAGC TGCTTCTTGA GGACGGATACAATGTTTACC AGTCCGAAGC CCACGGCCTCCCGCTGCACC TGCCAGGGAA CAAGTCCCCACACCGGGACC CTGCACCCCG AGGACCAGCTCGCTTCCTGC CACTACCAGG CCTGCCCCCCGCACTCCCGG AGCCACCCGG AATCCTGGCCCCCCAGCCCC CCGATGTGGG CTCCTCGGAC CCTCTGACCA TCGTGGAACC TCTCCAGGGCCGAAGCCCCA GCTACGCTTC CTGA 85
단백질 DSSPLLQFGG QVRQRYLYTD DAQQTEAHLEIREDGTVGGA ADQSPESLLQ LKALKPGVIQILGVKTSRFL CQRPDGALYG SLHFDPEACSFRELLLEDGY NVYQSEAHGL PLHLPGNKSPHRDPAPRGPA RFLPLPGLPP ALPEPPGILAPQPPDVGSSD PLTIVEPLQG RSPSYAS 86
(2) 재조합 FGF21 아날로그의 발현
OmpA 신호 서열의 유도 하에 E. coli의 주변 세포질(periplasm)로의 발현을 수행하였다. 재조합 FGF21 아날로그 발현 벡터를 이용하여 E. coli BL21 (E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal, Agilent)을 형질전환 하였다. 형질전환 방법은 Agilent사에서 추천하는 방법을 따랐다. 재조합 FGF-21 아날로그 발현 벡터가 형질 전환된 단일 콜로니를 취하여 암피실린(50 ㎍/ml)이 포함된 1X 루리아 브로스(Luria Broth, LB) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 배양하였다. 재조합 FGF21 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 1X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 각 1 ml씩 크라이오-튜브에 분주하고, -140℃에 보관하였다. 이를 재조합 융합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.
재조합 FGF21 아날로그의 발현을 위하여, 각 세포 스톡 1 바이알을 녹여 1L의 1X 루리아 브로스에 접종하고 37℃에서 14~15시간 동안 진탕 배양하였다. OD600의 값이 1.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 5 L 발효기(B.E Marubishi, MDL-501, 일본)를 이용하여 종 배양액을 1.7 L의 발효 배지에 접종하고 초기 배스(bath) 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 30℃, 공기량 2 L/분(1 vvm), 교반 속도 500 rpm 그리고 18% 암모니아수를 사용하여 pH 6.70으로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가배지(feeding solution)를 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하며, OD 값이 80이상에서 최종 농도 0.5mM의 IPTG를 도입하였다. 도입 후 약 23~25시간까지 배양을 더 진행하며, 배양 종료 후, 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수획하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
(3) 주변 세포질에 존재하는 재조합 FGF21 아날로그의 추출
상기 실시예 2 (2)에서 얻은 대장균 균체 200g을 상온의 완충용액(20 % 수크로스, 1mM EDTA, 30mM Tris pH 7.5) 3L에 용해 시킨 후 2 시간 동안 교반한 후 7,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛을 수거하였다. 이 펠렛을 다시 4℃의 증류수 3L에 용해시켜 4℃에서 2시간 동안 교반한 후 7,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛을 제거하고 주변 세포질 단백질이 포함된 상등액을 수거하였다.
(4) 재조합 FGF21 단백질의 침전
상기 실시예 2 (3)에서 얻은 상등액에 15Mm의 최종 농도가 되도록 히스티딘을 첨가하였다. 그리고 pH가 5.2가 되도록 60% HCl을 서서히 첨가시킨 후 7,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛을 제거하고 재조합 FGF21 아날로그 단백질이 포함된 상등액을 수거하였다.
(5) 음이온 결합 크로마토그래피 정제
상기 실시예 2 (4)에서 얻은 상등액에 1M 트리스 pH 8.0 완충액을 pH가 6 이상이 되도록 넣어준 후 전도도가 5이하가 되도록 10mM 트리스 8.0 완충액으로 희석시켰다. 10mM 트리스 pH 8.0 완충액으로 평형화된 DEAE (GE, 미국) 컬럼에 단백질을 접합 시킨 후 염화나트륨 0.5 M이 포함된 10mM 트리스 (Tris) pH 8.0 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 재조합 FGF21 아날로그 단백질을 용출하였다.
(6) 소수성 결합 크로마토그래피 정제
상기 실시예 2 (5)에서 얻은 용출액을 10mM 트리스 (Tris) pH 8.0 완충액으로 10배 희석시켜준 후 3M 황산암모늄 (Ammonium Sulfate) 완충액을 1.2M이 되도록 서서히 넣어주었다. 1.2M 황산암모늄 (Ammonium Sulfate)가 포함된 10mM 트리스 (Tris) pH 8.0 완충액으로 평형화된 Source Iso (GE, 미국) 컬럼에 단백질을 결합시킨 후 10mM 트리스 (Tris) pH 8.0 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 재조합 FGF21 아날로그를 용출하였다.
정제된 FGF21 아날로그 단백질의 순도는 전기영동(SDS-PAGE) 및 고압크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였고, 그 결과를 도 4a 내지 4c에 나타내었다 (도 4a 내지 4c).
실시예 3: FGF21 아날로그의 제작 (3)
다음과 같은 서열을 가지는, FGF21 모조펩타이드인 FGF21 아날로그를 합성하였다 (표 10).
설명 서열 서열번호
천연형 FGF21 L형 (Immature) Met-Asp-Ser-Asp-Glu-Thr-Gly-Phe-Glu-His-Ser-Gly-Leu-Trp-Val-Ser-Val-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Leu-Gly-Ala-Cys-Gln-Ala-His-Pro-Ile-Pro-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Leu-Tyr-Thr-Asp-Asp-Ala-Gln-Gln-Thr-Glu-Ala-His-Leu-Glu-Ile-Arg-Glu-Asp-Gly-Thr-Val-Gly-Gly-Ala-Ala-Asp-Gln-Ser-Pro-Glu-Ser-Leu-Leu-Gln-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Pro-Gly-Val-Ile-Gln-Ile-Leu-Gly-Val-Lys-Thr-Ser-Arg-Phe-Leu-Cys-Gln-Arg-Pro-Asp-Gly-Ala-Leu-Tyr-Gly-Ser-Leu-His-Phe-Asp-Pro-Glu-Ala-Cys-Ser-Phe-Arg-Glu-Leu-Leu-Leu-Glu-Asp-Gly-Tyr-Asn-Val-Tyr-Gln-Ser-Glu-Ala-His-Gly-Leu-Pro-Leu-His-Leu-Pro-Gly-Asn-Lys-Ser-Pro-His-Arg-Asp-Pro-Ala-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Arg-Phe-Leu-Pro-Leu-Pro-Gly-Leu-Pro-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Pro-Pro-Gly-Ile-Leu-Ala-Pro-Gln-Pro-Pro-Asp-Val-Gly-Ser-Ser-Asp-Pro-Leu-Ser-Met-Val-Gly-Pro-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ala-Ser 87
천연형 FGF21 P형 (Immature) Met-Asp-Ser-Asp-Glu-Thr-Gly-Phe-Glu-His-Ser-Gly-Leu-Trp-Val-Ser-Val-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Leu-Gly-Ala-Cys-Gln-Ala-His-Pro-Ile-Pro-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Leu-Tyr-Thr-Asp-Asp-Ala-Gln-Gln-Thr-Glu-Ala-His-Leu-Glu-Ile-Arg-Glu-Asp-Gly-Thr-Val-Gly-Gly-Ala-Ala-Asp-Gln-Ser-Pro-Glu-Ser-Leu-Leu-Gln-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Pro-Gly-Val-Ile-Gln-Ile-Leu-Gly-Val-Lys-Thr-Ser-Arg-Phe-Leu-Cys-Gln-Arg-Pro-Asp-Gly-Ala-Leu-Tyr-Gly-Ser-Leu-His-Phe-Asp-Pro-Glu-Ala-Cys-Ser-Phe-Arg-Glu-Leu-Leu-Leu-Glu-Asp-Gly-Tyr-Asn-Val-Tyr-Gln-Ser-Glu-Ala-His-Gly-Leu-Pro-Leu-His-Leu-Pro-Gly-Asn-Lys-Ser-Pro-His-Arg-Asp-Pro-Ala-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala-Arg-Phe-Leu-Pro-Leu-Pro-Gly-Leu-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Glu-Pro-Pro-Gly-Ile-Leu-Ala-Pro-Gln-Pro-Pro-Asp-Val-Gly-Ser-Ser-Asp-Pro-Leu-Ser-Met-Val-Gly-Pro-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ala-Ser 88
천연형 FGF19 (Immature) Met-Arg-Ser-Gly-Cys-Val-Val-Val-His-Val-Trp-Ile-Leu-Ala-Gly-Leu-Trp-Leu-Ala-Val-Ala-Gly-Arg-Pro-Leu-Ala-Phe-Ser-Asp-Ala-Gly-Pro-His-Val-His-Tyr-Gly-Trp-Gly-Asp-Pro-Ile-Arg-Leu-Arg-His-Leu-Tyr-Thr-Ser-Gly-Pro-His-Gly-Leu-Ser-Ser-Cys-Phe-Leu-Arg-Ile-Arg-Ala-Asp-Gly-Val-Val-Asp-Cys-Ala-Arg-Gly-Gln-Ser-Ala-His-Ser-Leu-Leu-Glu-Ile-Lys-Ala-Val-Ala-Leu-Arg-Thr-Val-Ala-Ile-Lys-Gly-Val-His-Ser-Val-Arg-Tyr-Leu-Cys-Met-Gly-Ala-Asp-Gly-Lys-Met-Gln-Gly-Leu-Leu-Gln-Tyr-Ser-Glu-Glu-Asp-Cys-Ala-Phe-Glu-Glu-Glu-Ile-Arg-Pro-Asp-Gly-Tyr-Asn-Val-Tyr-Arg-Ser-Glu-Lys-His-Arg-Leu-Pro-Val-Ser-Leu-Ser-Ser-Ala-Lys-Gln-Arg-Gln-Leu-Tyr-Lys-Asn-Arg-Gly-Phe-Leu-Pro-Leu-Ser-His-Phe-Leu-Pro-Met-Leu-Pro-Met-Val-Pro-Glu-Glu-Pro-Glu-Asp-Leu-Arg-Gly-His-Leu-Glu-Ser-Asp-Met-Phe-Ser-Ser-Pro-Leu-Glu-Thr-Asp-Ser-Met-Asp-Pro-Phe-Gly-Leu-Val-Thr-Gly-Leu-Glu-Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ser-Phe-Glu-Lys 89
FGF21 모조펩타이드 1 Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Leu-Tyr-Thr-Cys-Ser-Ser-Asp-Pro-Leu-Ser-Met-Val-Gly-Pro-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ala-Ser 90
FGF21 모조펩타이드 2 Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Leu-Tyr-Thr-Cys-Met-Val-Gly-Pro-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ala-Ser 91
FGF21 모조펩타이드 3 Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Leu-Tyr-Thr-Asp-Asp-Ala-Gln-Gln-Thr-Cys-Met-Val-Gly-Pro-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ala-Ser 92
FGF21 모조펩타이드 4 Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Leu-Tyr-Thr-Asp-Cys-Asp-Val-Gly-Ser-Ser-Asp-Pro-Leu-Ser-Met-Val-Gly-Pro-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser 93
FGF21 모조펩타이드 5 Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Leu-Tyr-Thr-Cys-Pro-Asp-Val-Gly-Ser-Ser-Asp-Pro-Leu-Ser-Met-Val-Gly-Pro 94
FGF21 모조펩타이드 6 Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Leu-Tyr-Thr-Asp-Cys-Asp-Pro-Phe-Gly-Leu-Val-Thr-Gly-Leu-Glu-Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ser-Phe-Glu-Lys 95
FGF21 모조펩타이드 7 Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Leu-Tyr-Thr-Asp-Cys-Gly-Ser-Gly-Met-Val-Gly-Pro-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ala-Ser 96
FGF21 모조펩타이드 8 Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Cys-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Met-Val-Gly-Pro-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ala-Ser 97
FGF21 모조펩타이드 9 Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Gly-Gly-Ser-Gly-Cys-Gly-Ser-Gly-Asp-Pro-Leu-Ser-Met-Val-Gly-Pro-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser 98
FGF21 모조펩타이드 10 Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Leu-Tyr-Thr-Gly-Gly-Ser-Gly-Cys-Gly-Ser-Gly-Pro-Pro-Asp-Val-Gly-Ser-Ser-Asp-Pro-Leu-Ser-Met-Val-Gly-Pro 99
FGF21 모조펩타이드 11 Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Leu-Tyr-Thr-Asp-Cys-Gly-Ser-Gly-Gly-Leu-Val-Thr-Gly-Leu-Glu-Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ser-Phe-Glu-Lys 100
FGF21 모조펩타이드 12 Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Gln-Val-Arg-Gln-Arg-Tyr-Gly-Gly-Ser-Gly-Cys-Gly-Ser-Gly-Gly-Leu-Val-Thr-Gly-Leu-Glu-Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ser-Phe-Glu-Lys 101
상기의 FGF21 아날로그는 천연형 FGF21과 비교하여 대량 생산 시 생산 효율이 높을 수 있으며, 천연형 FGF21에 비하여 역가가 감소된 것일 수 있다.
실시예 4: FGF21 아날로그의 합성 (4)
GLP-1 수용체 및 FGF21 수용체에 동시에 작용할 수 있는, 이중 GLP-1/FGF21 작용제인 FGF21 아날로그를 제조하여, 하기 표 11에 이의 서열을 나타냈다.
명칭 서열 서열번호
엑센딘-4 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser 102
이중 GLP-1/FGF21 작용제1 Xaa-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Val-Gly-Pro-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser 103
이중 GLP-1/FGF21 작용제2 Xaa-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Pro-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser 104
이중 GLP-1/FGF21 작용제3 Xaa-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Gly-Gly-Ser-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser 105
이중 GLP-1/FGF21 작용제4 Xaa-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser 106
이중 GLP-1/FGF21 작용제5 Xaa-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ala-Ser 107
이중 GLP-1/FGF21 작용제6 Xaa-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Gly-Gly-Ser-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ala-Ser 108
이중 GLP-1/FGF21 작용제7 Xaa-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Ser-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ala-Ser 109
이중 GLP-1/FGF21 작용제8 Xaa-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Glu-Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ser-Phe-Glu-Lys 110
이중 GLP-1/FGF21 작용제9 Xaa-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Val-Arg-Ser-Pro-Ser-Phe-Glu-Lys 111
이중 GLP-1/FGF21 작용제10 Xaa-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Gly-Gly-Ser-Arg-Ser-Pro-Ser-Phe-Glu-Lys 112
이중 GLP-1/FGF21 작용제11 Xaa-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Asp-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-Phe-Gly-Gly-Ser-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser-Phe-Glu-Lys 113
상기 표에서 첫 번째 아미노산 (Xaa)는 히스티딘에서 알파 탄소가 제거된 것, 즉 이미다조아세틸을 의미한다.
상기에서 제조한 신규한 이중 GLP-1/FGF21 작용제는 GLP-1 수용체, FGF21 수용체, FGF21 공동 수용체에 결합력을 가지며, 이의 결합력은 천연형에 비해 감소되어 역가가 감소된 기능을 가지는 바, 당뇨병, 비만 또는 비알콜성 지방간염 환자의 치료제 물질로 이용될 수 있다.
실시예 5: FGF21 아날로그의 제작 (5)
(1) FGF19(14~20)-FGF21 발현 벡터의 제작
천연형 FGF21가 삽입되어 있는 pET22b벡터에 FGF19(15~20)를 삽입하기 위해 하기의 프라이머 (서열번호 1 및 2)를 제작하여 상기 벡터를 주형으로 하여 PCR을 진행하였다.
FGF19의 15번 내지 20번 아미노산은 천연형 미성숙 FGF19 서열에서 신호서열인 1번 내지 22번 아미노산을 제외한 성숙 FGF19 서열을 기준으로 15번 내지 20번에 위치하는 아미노산을 말한다.
FGF19(15~20)삽입 프라이머
서열 서열번호
FGF-19(15~20) 5'-GAAGGAGATATACATATGGGCTGGGGTGATCCGATTCACCCCATCCCTGACTCCAG-3' 114
5'-CTGGAGTCAGGGATGGGGTGAATCGGATCACCCCAGCCCATATGTATATCTCCTTC-3' 115
FGFR4 결합 위치인 FGF19(15~20) 서열을 pET22b 벡터의 시작코돈과 FGF21 N-말단 사이에 삽입하기 위하여 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis) 방법을 이용하였다. PCR 증폭 조건은 95℃ 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 6분으로 이 과정을 18회 반복하였으며 서열 분석을 통하여 정확한 서열을 확인하였다.
pET22b에 존재하는 FGF19(15~20)-FGF21 서열을 숙주 세포의 주변 세포질에서 발현시키기 위해 pFlage-CTS 벡터에 삽입하고자 하였고, 이를 위하여 하기의 프라이머(서열번호 116 및 117)를 제작하여 PCR을 진행하였다.
FGF19(14~20) 삽입 프라이머
서열 서열번호
FGF-19(14~20) 5'-GTAAGCTTATGGCTGGGGTGATCCGATTC-3' 116
5'-CACTCGAGTCAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTC-3' 117
PCR 증폭 조건은 95℃ 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 40초로 이 과정을 25회 반복하였으며 증폭된 유전자와 벡터를 HindIII, XhoI 제한효소로 절단한 후 T4 리가아제로 pFlag-CTS벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다. 서열 분석을 통하여 정확한 서열을 확인하였다.
이러한 FGF21, FGF19(15~20)-FGF21 재조합 융합 단백질, 및 FGF19(14~20)-FGF21 재조합 융합 단백질의 뉴클레오타이드 및 단백질 서열은 다음과 같다.
서열 서열번호
NativeFGF21 DNA CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACTCCCGGAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTACGCTTCCTGA 3
단백질 HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGS SDPLSMVGPSQGRSPSYAS 4
FGF19(15~20)-FGF21 DNA ATGggctggggcgaccccatcCACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACTCCC GGAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTACGCTTCCTGA 118
단백질 MGWGDPIHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRG PARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS 119
FGF19(14~20)-FGF21 DNA TATGGCTGGGGTGATCCGATTCACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACTCCC GGAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTACGCT TCCTGA 120
단백질 YGWGDPIHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRG PARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS 121
(2) 재조합 FGF19(14~20)-FGF21 단백질의 발현
OmpA 신호 서열의 유도 하에 E. coli의 주변 세포질로의 발현을 수행하였다. 재조합 FGF21 발현 벡터를 이용하여 E. coli BL21 (E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)gal, Agilent)을 형질전환 하였다. 형질 전환 방법은 Agilent사에서 추천하는 방법을 따랐다. 재조합 FGF19-FGF21 발현 벡터가 형질 전환된 단일 콜로니를 취하여 암피실린(50 ㎍/ml)이 포함된 1X 루리아 브로스(Luria Broth, LB) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 배양하였다. 재조합 FGF19-FGF21 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 1X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 각 1 ml씩 크라이오-튜브에 분주하고, -140℃에 보관하였다. 이를 재조합 융합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.
재조합 FGF19-FGF21의 발현을 위하여, 각 세포 스톡 1 바이알을 녹여 1L의 1X 루리아 브로스에 접종하고 37℃에서 14~15시간 동안 진탕 배양하였다. OD600의 값이 1.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 30 L 발효기(BIOSTAT C-plsu 30L, Sartorius, 독일)를 이용하여 종 배양액을 9.2 L의 발효 배지에 접종하고 초기 배스(bath) 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 30℃, 공기량 13 L/분(1 vvm), 교반 속도 500 rpm 그리고 30% 암모니아수를 사용하여 pH 6.70으로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가배지(feeding solution)를 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하며, OD 값이 80이상에서 최종 농도 0.5mM의 IPTG로 도입하였다. 배양은 도입 후 약 23~25시간까지 더 진행하며, 배양 종료 후, 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수확하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
(3) 주변 세포질에 존재하는 재조합 FGF19(14~20)-FGF21 단백질의 추출
상기 (2)에서 얻은 대장균 균체 200g을 상온의 완충용액(20 % sucrose, 1mM EDTA, 30mM Tris pH 7.5) 3L에 용해 시킨 후 2 시간 동안 교반하고, 7,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛을 수거하였다. 이 펠렛을 다시 4℃의 증류수 3L에 용해시켜 4℃에서 2시간 동안 교반한 후 7,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛을 제거하고 주변 세포질 단백질이 포함된 상등액을 수거하였다.
(4) 재조합 FGF19(14~20)-FGF21 단백질의 침전
상기 (3)에서 얻은 상등액에 15mM이 되도록 히스티딘을 첨가하였다. 그리고 60% HCL을 pH가 5.2가 되도록 서서히 첨가시킨 후 7,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛을 제거하고 재조합 FGF19-FGF21 단백질이 포함된 상등액을 수거하였다.
(5) 음이온 결합 크로마토그래피 정제
상기 (4)에서 얻은 상등액에 1M 트리스 pH 8.0 완충액을 pH가 6 이상이 되도록 넣어준 후 전도도가 5이하가 되도록 10mM 트리스 8.0 완충액으로 희석시켰다. 10mM 트리스 pH 8.0 완충액으로 평형화된 DEAE (GE, 미국) 컬럼에 단백질을 접합 시킨 후 염화나트륨 0.5 M이 포함된 10mM 트리스 pH 8.0 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 재조합 FGF19-FGF21 단백질을 용출하였다.
(6) 소수성 결합 크로마토그래피 정제
상기 (5)에서 얻은 용출액을 10mM 트리스 pH 8.0 완충액으로 10배 희석 시켜준 후 3M 황산암모늄 완충액을 1.2M이 되도록 서서히 넣어주었다. 1.2M 황산암모늄 이 포함된 10mM 트리스 (Tris) pH 8.0 완충액으로 평형화된 Source Iso (GE, 미국) 컬럼에 단백질을 결합시킨 후 10mM 트리스 (Tris) pH 8.0 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 재조합 FGF19-FGF21 단백질을 용출하였다.
정제된 FGF19-FGF21 단백질의 순도는 전기영동 및 고압크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였고, 도 5에 나타내었다.
실시예 6: 천연형 FGF21과 면역글로불린 Fc를 비펩타이드성 중합체에 의해 연결된 결합체의 제조
3.4 K PropionALD(2) PEG (프로피온 알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG, NOF, 일본)를 천연형 FGF21의 B 쇄의 N 말단에 페길화시키기 위하여, 천연형 FGF21과 3.4 K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:3, 단백질의 농도를 5 mg/mL로 하여 4 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이때, 반응은 100 mM 인산 칼륨 (Potassium phosphate) pH 6.0 완충액에 환원제인 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드 (Sodium Cyanoborohydride; NaCHBH3)가 첨가된 환경 하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액은 10 mM 트리스 (Tris) pH 7.0이 포함된 완충액과 0.25 M 염화나트륨 (Sorium Chloride) 농도 구배를 이용하여 Source15Q (GE, 미국)에 적용하여 모노-페길화된 (Monopegylated) 천연형 FGF21을 정제하였다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 천연형 FGF21과 면역글로불린 Fc 의 몰비가 1:3, 단백질의 농도를 50 mg/mL로 하여 4 ℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100 mM 인산 칼륨 (Potassium Phosphate) pH 6.0 완충액에 환원제인 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드 (Sodium Cyanoborohydride; NaCHBH3)가 첨가된 환경 하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액은 20 mM 비스 트리스(Bis Tris) pH 6.0과 0.25 M 염화나트륨 (Sodium Chloride) 농도 구배를 이용하여 Source15Q (GE, 미국)에 적용하고, 1.2 M 황산암모늄 (Ammonium Sulfate)과 20 mM 트리스 (Tris) pH 7.5의 농도 구배를 이용하여 Source ISO (GE, 미국)에 적용하여 면역글로불린 Fc에 천연형 FGF21이 PEG에 의해 공유결합으로 연결된 결합체를 정제하였다.
정제된 결합체는 2 % D-만니톨 (D-mannitol), 100 mM 염화나트륨 (Sodium Chloride), 0.02 % 폴리솔베이트 20 (polysorbate 20), 10 mM 소디움 아세테이트 (Sodium Acetated) pH 6.0 완충액으로 버퍼 교환하였다.
실험예 1: 천연형 FGF21 및 FGF21 아날로그의 수용체 결합력 비교
본 발명의 대표적인 FGF21 아날로그들의 수용체 및 보조 수용체와의 결합력을 측정한다.
그 결과 본 발명의 FGF21 아날로그는 FGF21 수용체 및 보조 수용체(beta-klotho)와의 결합력이 천연형 FGF21에 비하여 감소하는 것을 확인한다.
실험예 2: 천연형 FGF21 및 FGF21 아날로그의 수용체 매개 제거 ( Receptor -mediated clearance) 비교
FGF21 아날로그의 수용체 매개 제거(receptor-mediated clearance, RMC)를 측정한다.
그 결과 본 발명의 FGF21 아날로그는 천연형 FGF21 보다 수용체 매개 제거가 감소하는 것을 확인한다.
실험예 3: FGF19(14~20)-FGF21 단백질의 수용체 결합력 및 활성 확인
상기 실시예 5에서 얻은 FGF21 아날로그의 FGF21의 보조 수용체인 베타-클로토와의 결합력 및 FGF21의 활성을 확인하기 위하여 SPR(surface plasmon resonance) 및 in vitro 글루코스 수용(glucose uptake) 시험을 진행하였다. 베타-클로토와의 SPR 시험 결과, 본 발명에 따른 FGF21 아날로그인, FGF19-FGF21 단백질은 천연형 FGF21과 비교하여 동일한 결합력과 in vitro 활성을 보이는 것을 확인하였다 (도 6a 및 6b). 이와 같은 결과는 FGF19-FGF21 단백질이 FGF21의 활성을 그대로 유지하고 있음을 시사하는 것이다.
실험예 4: FGF19(14~20)-FGF21 단백질의 FGFR4 결합력 확인
상기 실시예 5에서 얻은 FGF21 아날로그인 재조합 FGF19-FGF21 단백질이 FGFR4에 대한 결합력을 가지는 지 여부를 확인하기 위하여 SPR 시험을 진행하였다. 확인 결과 FGF19-FGF21 단백질은 천연형 FGF19에 비해 약 1.7%의 FGFR4에 대한 결합력을 가지는 것이 확인되었다 (도 7).
이와 같은 결과는 FGF19-FGF21 단백질이 FGF19의 활성을 가지고 있음을 시사하는 것이다.
실험예 5: FGF21 -면역글로불린 Fc 결합체의 체중 감소 및 음식 섭취 효과 확 인
상기 실시예 6에서 얻은 재조합 FGF21-면역글로불린 Fc 결합체의 체중감소 및 음식 섭취에 미치는 영향을 확인하기 위하여 식이 요법으로 비만을 유도한 마우스 (DIO mouse)에서 FGF21-면역글로불린 Fc 결합체를 농도 증가적으로 (0.9, 1.7, 3.4, 7.1, 14.3 nmol/kg/Q2D) 2일에 한번 피하 투여한 후 체중 변화량과 음식 섭취량을 2주 동안 측정하였다. 확인 결과 농도 의존적으로 비만 마우스의 체중이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였고, 음식 섭취량은 유의적 변화가 없는 것으로 확인되었다 (도 8).
이와 같은 결과는 음식 섭취량을 줄이지 않고도 FGF21-면역글로불린 Fc 결합체가 체중 감소시킴으로써 비만 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
실험예 6: FGF21-면역글로불린 Fc 결합체의 혈당 감소 효과 확인
재조합 FGF21-면역글로불린 Fc 결합체의 혈당 감소 효과를 확인하기 위하여 당뇨병 모델 마우스 (db/db mouse)에서 FGF21-면역글로불린 Fc 결합체를 농도 증가적으로 (1.2, 2.4, 4.8 nmol/kg/Q2D) 2일에 한번 피하 투여한 후 혈당을 4주동안 측정하였다. 확인 결과 농도 의존적으로 당뇨병 모델 마우스의 혈당이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 9).
이와 같은 결과는 FGF21-면역글로불린 Fc 결합체가 효과적으로 혈당을 감소시킴으로써 당뇨병 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
실험예 7: FGF21-면역글로불린 Fc 결합체의 지방 대사 개선 효과 확인
재조합 FGF21-면역글로불린 Fc 결합체의 지방 대사 개선 효과를 확인하기 위하여 식이 요법으로 비만을 유도한 마우스 (DIO mouse)에서 FGF21-면역글로불린 Fc 결합체를 농도 증가적으로 (0.9, 1.7, 3.4, 7.1, 14.3 nmol/kg/Q2D) 2일에 한번 피하 투여한 후 체중 변화량과 음식 섭취량을 2주 동안 측정하였다. 확인 결과 농도 의존적으로 비만 마우스의 콜레스테롤과 지방산 (Triglyceride)이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 10). 이와 같은 결과는 FGF21-면역글로불린 Fc 결합체가 지방 대사 질환 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (45)

  1. 천연형 FGF21 (fibroblast growth factor 21)에서 하나 이상의 아미노산이 제거, 부가, 치환, 수식, 또는 이들의 조합으로 변이된, FGF21 아날로그.
  2. 제1항에 있어서, 상기 FGF21 아날로그는 하기 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상의 변이를 가지는, FGF21 아날로그:
    (i) 천연형 성숙 FGF21의 1번부터 4번까지의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산이 제거됨;
    (ii) 천연형 성숙 FGF21의 167번 아미노산인 세린이 세린 외 다른 아미노산으로 치환됨; 및
    (iii) 천연형 성숙 FGF21의 168번 아미노산인 메티오닌이 메티오닌 외 다른 아미노산으로 치환됨.
  3. 제2항에 있어서, 상기 FGF21 아날로그는 추가로 하기 (iv), (v) 또는 둘 다의 변이를 가지는, FGF21 아날로그:
    (iv) 천연형 성숙 FGF21의 170번 아미노산인 글리신이 글리신 외 다른 아미노산으로 치환됨; 및
    (v) 천연형 성숙 FGF21의 172번 아미노산인 세린이 세린 외 다른 아미노산으로 치환됨.
  4. 제2항에 있어서, 상기 FGF21 아날로그는 하기 (a) 및 (b)의 변이를 가지는, FGF21 아날로그:
    (a) 천연형 성숙 FGF21의 1번 아미노산, 1번 및 2번 아미노산, 또는 1번부터 4번까지의 아미노산이 제거됨; 및
    (b) 천연형 성숙 FGF21의 167번 아미노산인 세린의 트레오닌으로의 치환, 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌, 페닐알라닌, 또는 이소류신으로의 치환, 또는 167번 아미노산인 세린의 트레오닌으로의 치환 및 168번 아미노산인 메티오닌의 알라닌, 페닐알라닌, 또는 이소류신으로의 치환.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 FGF21 아날로그는 추가로 천연형 성숙 FGF21의 170번 아미노산인 글리신의 글루탐산으로의 치환; 172번 아미노산인 세린의 류신으로의 치환; 또는 둘 다를 포함하는, FGF21 아날로그.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 FGF21 아날로그는 서열번호: 18, 20, 22, 24, 26, 및 86으로 이루어진 군에서 선택된, 아미노산 서열을 가지는 FGF21 아날로그.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FGF21 아날로그는
    천연형 성숙 FGF21의 5번째 아미노산, 6번째 아미노산, 7번째 아미노산, 8번째 아미노산, 9번째 아미노산, 172번째 아미노산, 176번째 아미노산, 177번째 아미노산, 및 178번째 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환;
    천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열의 부가;
    또는 상기 두 가지 변이를 모두 포함하는,
    FGF21 아날로그.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 알라닌인, FGF21 아날로그.
  9. 제7항에 있어서, 상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열은 WGDPI (서열번호: 122)인, FGF21 아날로그.
  10. 제7항에 있어서, 상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번 아미노산부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열은 5개 내지 20개의 아미노산으로 이루어진, FGF21 아날로그.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열은, 천연형의 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 14번부터 20번까지의 아미노산 서열 혹은 15번부터 20번까지의 아미노산 서열인, FGF21 아날로그.
  12. 제7항에 있어서, 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열이 부가된 FGF21 아날로그는, 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열이 성숙 FGF21의 전장 서열 혹은 이의 활성 단편에 부가된, FGF21 아날로그.
  13. 제12항에 있어서, 상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열은 이의 C-말단이 성숙 FGF21의 전장 서열 혹은 이의 활성 단편의 N-말단에 부가된 형태인, FGF21 아날로그.
  14. 제12항에 있어서, 상기 천연형 성숙 FGF19의 N-말단으로부터 16번부터 20번까지의 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 전장 서열 혹은 이의 활성 단편에 직접적으로 또는 링커를 통하여 연결된, FGF21 아날로그.
  15. 제7항에 있어서,
    상기 FGF21 아날로그는 서열번호: 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 119, 및 121로 이루어진 군에서 선택된, 아미노산 서열을 가지는 FGF21 아날로그.
  16. 제1항에 있어서, 상기 FGF21 아날로그는
    (i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열에 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열이 부가된, FGF21 아날로그.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 FGF21 아날로그는 상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은,
    성숙 FGF21의 아미노산 서열에서 N-말단 1번 내지 4번 아미노산은 모두 제외된 FGF21의 N-말단 아미노산 서열인,
    FGF21 아날로그.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 5번째, 6번째 또는 9번째 아미노산으로부터 C-말단 방향에 위치하는 임의의 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열인,
    FGF21 아날로그.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 연속되는 아미노산 서열은 2개 내지 30개의 아미노산을 가지는,
    FGF21 아날로그.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 성숙 FGF21의 C-말단 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 임의의 아미노산으로부터 C-말단으로부터 1번째, 4번째, 또는 11번째 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열인,
    FGF21 아날로그.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 연속되는 아미노산 서열은 2개 내지 30개의 아미노산을 가지는,
    FGF21 아날로그.
  22. 제16항에 있어서,
    상기 FGF19의 C-말단 아미노산 서열은 FGF19의 임의의 아미노산으로부터 C-말단으로부터 1번째 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열인,
    FGF21 아날로그.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 연속되는 아미노산 서열은 2개 내지 30개의 아미노산을 가지는,
    FGF21 아날로그.
  24. 제16항에 있어서,
    성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열과 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열은 서로 링커를 통해 연결된,
    FGF21 아날로그.
  25. 제16항에 있어서,
    상기 (i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열 및 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열이 N-말단에서 C-말단 방향으로 순차적으로 배열되거나,
    상기 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열 및 (i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열이 N-말단에서 C-말단 방향으로 순차적으로 배열된,
    FGF21 아날로그.
  26. 제16항에 있어서,
    상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은 서열번호 123 내지 130으로 이루어진 군에서 선택되고,
    상기 성숙 FGF21의 C-말단의 아미노산 서열은 서열번호 131 내지 136으로 이루어진 군에서 선택되고,
    상기 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열은 서열번호 137 또는 138인,
    FGF21 아날로그.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 FGF21 아날로그는 서열번호: 90 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된, 아미노산 서열을 가지는,
    FGF21 아날로그.
  28. 제16항에 있어서,
    (i) 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열에 (ii) 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열이 부가되고, 추가로 (iii) 엑센딘-4(exendin-4) 서열이 부가된,
    FGF21 아날로그.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 엑센딘-4 서열은 천연형 엑센딘-4 서열에서 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 카본이 제거되고, 32번째부터 39번째 아미노산 서열이 제외된 서열이고,
    상기 성숙 FGF21의 N-말단 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 아미노산 서열에서 N-말단 1번 내지 4번 아미노산은 모두 제외된 FGF21의 N-말단 아미노산 서열인,
    FGF21 아날로그.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 5번째 아미노산으로부터 C-말단 방향에 위치하는 임의의 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열이고,
    상기 성숙 FGF21의 C-말단 아미노산 서열은 성숙 FGF21의 임의의 아미노산으로부터 C-말단으로부터 1번째 또는 4번째 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열이고,
    상기 FGF19의 C-말단 아미노산 서열은 FGF19의 임의의 아미노산으로부터 C-말단으로부터 1번째 아미노산까지의 연속되는 아미노산 서열인,
    FGF21 아날로그.
  31. 제30항에 있어서, 상기 연속되는 아미노산 서열은 2개 내지 30개의 아미노산을 가지는, FGF21 아날로그.
  32. 제28항에 있어서,
    상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열과 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열 사이, 또는 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열과 엑센딘-4(exendin-4) 서열은 직접적으로 연결되거나, 링커를 통해 연결된,
    FGF21 아날로그.
  33. 제28항에 있어서,
    상기 FGF21 아날로그는 엑센딘-4(exendin-4) 서열, 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열, 및 성숙 FGF21 또는 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열이 N-말단에서 C-말단 방향으로 순차적으로 연결된 것인,
    FGF21 아날로그.
  34. 제28항에 있어서,
    상기 성숙 FGF21의 N-말단의 아미노산 서열은 서열번호: 139 내지 142로 이루어진 군에서 선택되고,
    성숙 FGF21의 C-말단의 아미노산 서열은, 서열번호: 143 내지 147로 이루어진 군에서 선택되고,
    성숙 FGF19의 C-말단의 아미노산 서열은, 서열번호: 148 내지 150으로 이루어진 군에서 선택되는,
    FGF21 아날로그.
  35. 제28항에 있어서,
    상기 FGF21 아날로그는 서열번호: 103 내지 113으로 이루어진 군에서 선택되는, FGF21 아날로그.
  36. 제1항 내지 제6항, 제16항 내지 제29항, 및 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 FGF21 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  37. 제36항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  38. 제36항의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 함유하는, 형질전환체.
  39. (i) 천연형 FGF21 또는 제1항 내지 제6항, 제16항 내지 제29항, 및 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 FGF21 아날로그; 및 (ii) FcRn 결합물질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 단편, 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택된 캐리어가 결합된,
    FGF21 결합체.
  40. 제39항에 있어서, 상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역인, FGF21 결합체.
  41. 제39항에 있어서,
    (i) 천연형 FGF21 또는 상기 FGF21 아날로그와 (ii) 캐리어가 (iii) 펩타이드 링커, 또는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 연결되는 것인, FGF21 결합체.
  42. 제1항 내지 제6항, 제16항 내지 제29항, 및 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항의 FGF21 아날로그; 또는 상기 FGF21 아날로그 또는 천연형 FGF21에 FcRn 결합물질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 단편, 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택된 캐리어가 결합된, FGF21 결합체를 유효성분으로 포함하는,
    대사증후군의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 대사증후군은 내당증 장애, 고콜레스테롤혈증, 이상지혈증, 비만, 당뇨, 고혈압, 비알코올지방간염 (nonalcoholic steatohepatitis, NASH), 이상지혈증에 의한 동맥경화, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 관상동맥 심질환(관동맥성 심장병), 혹은 간 대사 질환을 포함하는,
    대사증후군의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  44. 제38항의 형질전환체를 배양하여 FGF21 아날로그를 발현하는 단계; 및
    형질전환체 혹은 이의 배양물로부터 상기 발현된 FGF21 아날로그를 회수하는 단계를 포함하는,
    FGF21 아날로그의 제조방법.
  45. 천연형 FGF21 또는 제1항 내지 제6항, 제16항 내지 제29항, 및 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 FGF21 아날로그를 FcRn 결합물질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 단편, 및 알부민으로 이루어진 군에서 선택된 캐리어와 결합시키는 단계를 포함하는,
    FGF21 결합체의 제조 방법.
PCT/KR2016/015561 2015-12-31 2016-12-30 Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도 WO2017116207A1 (ko)

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