WO2019168364A1

WO2019168364A1 - 줄기세포의 티오레독신 발현을 증진시키는 방법

Info

Publication number: WO2019168364A1
Application number: PCT/KR2019/002408
Authority: WO
Inventors: 박원순; 장윤실; 성동경
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2018-03-02
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2019-09-06

Abstract

본 발명은 줄기세포의 티오레독신(Thioredoxin; TRX) 발현을 증진시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 줄기세포를 저산소 환경에서 배양시키는 단계를 포함하는 줄기세포의 티오레독신 발현을 증진시키는 방법, 상기 방법에 의해 티오레독신 발현이 증진된 줄기세포, 및 상기 줄기세포의 허혈성 뇌질환 치료용도에 관한 것이다. 저산소 환경에서 줄기세포를 배양함으로써 티오레독신의 발현을 증가시킬 수 있고 상기 방법을 통해 허혈성 뇌질환에 대한 우수한 치료효능이 있는 티오레독신 발현이 증진된 줄기세포를 획득할 수 있는바, 상기 줄기세포는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

줄기세포의 티오레독신 발현을 증진시키는 방법

본 발명은 줄기세포의 티오레독신(Thioredoxin; TRX) 발현을 증진시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 줄기세포를 저산소 환경에서 배양시키는 단계를 포함하는 줄기세포의 티오레독신 발현을 증진시키는 방법, 상기 방법에 의해 티오레독신 발현이 증진된 줄기세포, 및 상기 줄기세포의 허혈성 뇌질환 치료용도에 관한 것이다.

티오레독신(Thioredoxin; TRX)은 분자량이 10,000~13,000인 저분자 단백질로, 대장균의 DNA 합성에 필수적 효소인 리보뉴클레오티드 환원 효소에 수소 이온을 공여하는 조효소로써 발견되었다. 티오레독신은 -Cys-Gly-Pro-Cys-라고 하는 활성 부위를 갖고 있어 2개의 시스테인 잔기의 사이에서 이황화(S-S) 결합을 만드는 산화형과 디티올(-SH-SH)을 만드는 환원형이 존재하는 세포 내의 산화환원 제어 인자이다.

티오레독신은 많은 생물학적 활성을 가진다고 보고되어 있는데, 예컨대 생장인자로 작용하며 세포 내에서 독성을 유발하는 과산화수소를 제거하고, 진핵세포에서 NF-κB 신호전달 활성에 영향을 미쳐 상기 신호전달과 관련된 세포사멸 및 종양에 영향을 미친다고 보고되어 있다. 이러한 활성 때문에 최근 티오레독신은 항암제 개발 및 세포의 손상을 보호하는 항산화 단백질 개발 분야에서 주목 받고 있다.

한편, 허혈성 뇌질환은 뇌혈관 질환의 한 종류로써 혈전증(thrombosis), 색전증(embolism), 일과성 허혈성 발작(transient ischemic attack) 및 소경색(lacune) 등으로 세분화될 수 있는데, 주로 혈전과 색전 등에 의해 뇌에 혈류를 공급하는 혈관에 병리학적 이상이 생긴 질환을 의미한다. 대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포에서 ATP 감소 및 부종(edema)이 발생하며 결국 뇌에 광범위한 손상이 유발된다. 신경세포의 사멸은 뇌허혈이 있은 후 상당한 시간 경과 후에 나타나는데, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다.

뇌허혈에 의한 신경세포사는 크게 2가지 기전으로 발생하는데, 하나는 뇌허혈에 의해 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되고 이러한 글루타메이트가 세포 내로 유입되어 결국 과도한 세포 내 칼슘 축적으로 신경세포 사멸이 유발되는 흥분성 신경세포사 기전이고, 또 하나는 허혈-재관류 시 갑작스러운 산소 공급으로 인해 생체 내 라디칼의 증가로 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발되는 산화성 신경세포사 기전이다.

현재 허혈성 뇌질환 치료에 이용 가능한 약물은 항혈전제인데, 티크로피딘(ticlopidine), 시로스타졸(cilostazole) 및 프로스타시크린(prostacycline) 등의 항혈소판제나 항응고제는 종종 두통, 심계항진 및 간에 부담을 주는 부작용이 있어 사용에 제한이 따른다고 보고되어 있다. 또한, FDA 공인 시판중인 조직 플라즈미노겐 활성화제(tissue plasminogen activator)는 뇌허혈을 유발시키는 혈전을 녹여 빠른 산소 및 포도당의 공급을 유도하나, 직접적으로 신경세포를 보호하는 것이 아니기 때문에 조기 사용이 필요하며, 혈전용해제라는 특징 때문에 과량 사용하거나 자주 사용시에는 혈관벽이 얇아져 결국 출혈성 뇌혈관질환을 유발하게 된다(Int J Stroke. 2014 Apr;9(3):349-55).

현재까지 상기 약물들 이외에 허혈성 뇌질환의 발병 기전을 바탕으로 새로운 치료약물의 개발연구가 다양하게 수행되어오고 있으나, 아직까지 뇌허혈에 의한 신경세포 사멸을 억제하는 물질은 거의 없는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명자들은 허혈성 저산소 조건에서 줄기세포를 배양하였을 때 정상 조건에서와는 달리 특이적으로 티오레독신의 발현이 유의하게 증가하는 것을 관찰하였고, 이에 의한 신경세포의 사멸 억제효과를 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 줄기세포의 티오레독신(Thioredoxin; TRX) 발현을 증진시키는 방법 및 상기 방법에 의해 티오레독신의 발현이 증진된 줄기세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 티오레독신 발현이 증진된 줄기세포를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 티오레독신(Thioredoxin; TRX) 및 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS) 나노입자를 포함하는, 티오레독신 전달용 복합체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포를 저산소 환경에서 배양시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 티오레독신(Thioredoxin; TRX) 발현을 증진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 티오레독신 발현이 증진된, 줄기세포를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 저산소 환경은 0.5 내지 10%의 산소가 공급되는 환경일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반, 양수 또는 편도에서 유래된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 티오레독신 발현이 증진된 줄기세포를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 허혈성 뇌질환은 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 혈전증(thrombosis), 색전증(embolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 소경색(lacune), 뇌일혈, 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수, 외상성 뇌 손상 및 저산소성 뇌 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 티오레독신 발현이 증진된 줄기세포를 포함하는 허혈성 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 허혈성 뇌질환 치료용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 티오레독신(Thioredoxin; TRX) 및 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS) 나노입자를 포함하는, 티오레독신 전달용 복합체를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 나노입자는 테트라에틸 규산염 광물(Tetraethyl orthosilicate; TEOS)과 디메틸디에톡시실란(Dimethyldiethoxysilane; DMDES)을 혼합한 다음, 염기 촉매 하에 축합반응을 통해 제조된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는 약학적 조성물의, 허혈성 뇌질환 치료용도를 제공한다.

본 발명자들은 줄기세포를 저산소 조건에서 배양한 경우 정상 조건에서와 달리 저산소 조건에서만 특이적으로 티오레독신의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인하였고, 허혈성 저산소 환경하에 상해가 유도된 신경세포에서 티오레독신에 의한 세포사멸이 억제되며, 신생아 저산소성 허혈성 뇌병증 in vivo 모델에서 전달체를 통한 티오레독신의 뇌실내 투여 시 치료효과를 확인하였다. 이에, 저산소 환경에서 줄기세포를 배양함으로써 티오레독신의 발현을 증가시킬 수 있고, 상기 방법을 통해 허혈성 뇌질환에 대한 우수한 치료효능이 있는 티오레독신 발현이 증진된 줄기세포를 획득할 수 있는바, 상기 줄기세포는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1a는 저산소 조건에서 배양한 줄기세포(OGD)의 배양액으로부터 대조군 줄기세포(NC)와 비교하여 발현이 증가된 61종 단백질(OGD abundance) 및 이들의 세포 내 위치를 확인한 결과이다.

도 1b는 대조군(NC)에 비해 저산소 조건에서 배양한 줄기세포(OGD)에서 티오레독신(Thioredoxin)의 발현이 유의하게 증가됨을 보여주는 결과이다.

도 2a는 백서 태아의 대뇌피질 유래 신경세포를 1% 산소농도에 1시간 동안 노출시켜 세포상해를 유발한 다음 티오레독신을 처리(OGD thioredoxin)한 결과 티오레독신 미처리군(OGD control)과 비교하여 세포사멸이 유의하게 억제되었음을 보여주는 결과이다.

도 2b는 도 2a와 동일한 조건으로 배양한 신경세포에 티오레독신을 농도(1, 10, 100, 500, 1000 ng)별로 처리하거나 중간엽줄기세포(MSC)를 처리한 후 세포생존능(cell survival) 및 활성산소종(ROS) 수준을 측정한 결과이다.

도 3a는 신경세포 내 티오레독신의 전달을 위한 전달체 합성 과정을 도시한 것이다.

도 3b는 상기 전달체의 세포 내 흡수를 보여주는 in vitro 결과이다.

도 3c는 상기 전달체의 신경세포 내 흡수를 보여주는 ex vivo 결과 및 랫트의 뇌실 내 투여 시 뇌세포로의 흡수를 보여주는 결과이다.

도 4는 신생아 저산소성 허혈성 뇌병증 in vivo 모델에서 상기 전달체를 통한 티오레독신의 뇌실 내 투여 시 손상된 뇌조직이 개선된 치료효과를 보여주는 결과이다.

본 발명자들은 허혈성 저산소 조건에서 줄기세포를 배양하였을 때 정상 조건에서와는 달리 특이적으로 티오레독신의 발현이 유의하게 증가하는 것을 관찰하였고, 이에 의한 신경세포의 사멸 억제효과를 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 줄기세포를 저산소 환경에서 배양시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 티오레독신(Thioredoxin; TRX) 발현을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 실시예를 통해 저산소 환경에서 줄기세포를 배양한 결과 티오레독신의 발현이 유의하게 증진되는 것을 확인하였다. 보다 구체적으로, 저산소 조건(5% 산소농도에서 1시간 배양 후 정상 조건에서 6시간 배양) 또는 정상 조건(정상 조건에서 7시간 배양)에서 배양한 줄기세포의 배양액을 수집하여 저산소 조건에서 배양한 경우 특이적으로 발현이 증가된 단백질들을 조사한 결과 61종의 단백질이 확인되었으며, 이중 티오레독신 단백질의 발현수준이 현저히 증가된 것을 확인하였다(실시예 1 참조).

본 발명에 있어서, 상기 저산소 환경은 0.5 내지 10%의 산소가 공급되는 환경일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1 내지 5%의 산소가 공급되는 환경일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “줄기세포(stem cell)”란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있고, 보다 바람직하게 본 발명의 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반, 양수 또는 편도에서 유래된 것일 수 있으나, 인간 생체 내 조직에서 유래된 것이라면 그 유래가 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 티오레독신 발현이 증진된 줄기세포를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는, 저산소 환경에서 줄기세포로부터 발현이 증가된 티오레독신이 신경세포에 미치는 영향을 검증하였다. 보다 구체적으로 백서 태아의 대뇌피질에서 분리한 신경세포를 1% 산소 농도에 1시간 동안 노출시켜 상해를 유발한 다음 티오레독신을 처리하고 세포 생존능을 분석하였다. 그 결과, 티오레독신을 처리하지 않은 신경세포와 비교할 때 신경세포의 사멸이 유의하게 억제된 것을 확인하였고, 또한 이러한 효과는 티오레독신의 처리농도에 비례하여 나타났으며 활성산소종의 농도는 감소하는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 티오레독신을 세포 내로 전달할 수 있는 전달체를 합성하였고, 상기 전달체가 신경세포 내로 흡수되는 것을 확인하였으며, 나아가 신생아 저산소성 허혈성 뇌병증 in vivo 모델에서 티오레독신을 포함하는 전달체를 뇌실 내로 투여한 결과 손상된 뇌조직이 유의하게 개선되는 치료효과를 확인하였다.

상기 결과들은 티오레독신의 허혈성 뇌질환에 대한 치료효과를 보여주며, 또한 허혈성 저산소 환경에서 배양하여 티오레독신 발현이 증진된 줄기세포를 허혈성 뇌질환 치료에 효과적으로 이용할 수 있음을 입증하는 것이다.

상기 허혈성 뇌질환은 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 혈전증(thrombosis), 색전증(embolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 소경색(lacune), 뇌일혈, 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수, 외상성 뇌손상 및 저산소성 뇌손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 티오레독신(Thioredoxin; TRX) 및 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS) 나노입자를 포함하는, 티오레독신 전달용 복합체를 제공한다.

상기 나노입자는 테트라에틸 규산염 광물(Tetraethyl orthosilicate; TEOS)과 디메틸디에톡시실란(Dimethyldiethoxysilane; DMDES)을 혼합한 다음, 염기 촉매 하에 축합반응을 통해 제조된 것일 수 있으나, 제조방법이 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 티오레독신 발현이 증진된 줄기세포 또는 상기 복합체와 함께 허혈성 뇌질환의 치료 효과를 갖는 공지의 보조성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 허혈성 뇌질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 티오레독신 발현이 증진된 줄기세포를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 허혈성 뇌질환 치료용도를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 저산소 조건에서 줄기세포의 분비 단백질 조사 및 thioredoxin 발굴

본 발명자들은 허혈성 저산소 환경인 허혈성 뇌질환에 대한 줄기세포 치료제 개발을 위해 본 실험을 진행하였다.

이를 위해, 먼저 저산소 조건에 노출된 줄기세포에서 분비되는 단백질에 대해 조사하고자 하였다. 보다 구체적으로, 줄기세포를 5%의 산소 농도에서 1시간 동안 배양한 다음 정상적인 조건(normal condition)에서 6시간 동안 배양한 후 세포의 배양액을 수집하였으며, 대조군의 경우에는 동일한 종류의 줄기세포를 정상적인 조건에서만 7시간 동안 배양한 후 세포의 배양액을 수집하였다. 다음으로, 수집한 각 배양액을 3000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 배양액 내 잔해를 제거한 후 단백질 분석을 위해 배지를 농축하는 단계를 실시하였다. 이어서 트립신 분해(trypsin digestion) 후 분획화하고, Mass 분석을 실시하여 대조군 줄기세포 대비 저산소 조건에 노출시킨 줄기세포에서 발현이 증가하는 단백질을 분석하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 저산소 조건에서 총 61종 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 이들 단백질의 세포 내 위치를 조사한 결과 세포질(Cytoplasm) 55.7%, 세포외(Extracellular) 21.6%, 세포막(Plasma membrane) 12.3%, 핵(Nucleus) 8.5%, 및 기타(Other) 1.9%인 것으로 나타났다. 본 발명자들은 상기 61종의 단백질들 중에서, i) 허혈성 저산소 뇌질환에 대한 치료 표적으로 연구되고 있는 항산화(antioxidant) 단백질이면서, ii) 재조합 단백질에 비해 합성 단백질의 가격이 현저히 저렴한 것, 및 iii) 다양한 형태의 전달체 개발에 용이한 것의 조건을 모두 만족하는 단백질로써 최종적으로 티오레독신(thioredoxin)을 선택한 후 추가 분석을 실시하였다. 저산소 환경에서 상기 티오레독신의 발현수준 변화 결과는 도 1b에 나타내었다.

실시예 2. 허혈성 저산소 환경에서 thioredoxin의 신경세포 사멸 억제효과 검증

본 발명자들은 상기 실시예 1의 결과를 바탕으로, 상기 티오레독신이 허혈성 저산소 환경에서 신경세포에 미치는 영향을 검증하고자 하였다. 이를 위해, 저산소로 유도한 신경세포 사멸 체외 모델에서 티오레독신의 신경세포 사멸 억제효과를 검증하였다.

보다 구체적으로, 임신주령 18.5일이 된 백서에서 태아를 꺼내 대뇌피질을 분리하여 신경세포를 배양하였고, 이때 배지는 신경세포 전용 배양배지를 사용하였으며 7일간의 신경세포 부착 및 안정기를 거치도록 하였다. 이후 상기 신경세포를 1% 산소 조건에 60분 동안 노출시켜 세포 상해를 유발한 다음, 세포 사멸이 유발된 신경세포에 티오레독신을 처리하여 세포사멸 억제효과를 관찰하였으며, 세포생존능은 cell count kit(dojindo, korea)를 이용해 분석하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 저산소 조건에만 노출시키고 티오레독신을 처리하지 않은 신경세포(OGD control)의 경우 정상적인 조건에서 배양한 대조군(NC)에 비해 신경세포 사멸이 현저하게 유도된 반면, 티오레독신을 처리한 신경세포(OGD thioredoxin)에서는 세포 사멸이 유의한 수준으로 억제된 것을 확인하였다.

이에 더하여, 상기와 동일한 조건에서 배양한 신경세포에 대하여 티오레독신을 다양한 농도(1, 10, 100, 500, 1000 ng)로 처리하거나 중간엽줄기세포(MSC)를 처리한 다음 상기와 동일한 방법으로 세포생존능(cell survival)을 측정하였다. 또한, reactive oxygen species assay kit를 이용해 활성산소 변화량을 측정해 치료 효능의 평가 툴로 사용하였다.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 티오레독신의 처리 농도가 증가할수록 세포 사멸이 억제되며 활성산소종(ROS)이 감소하는 양상이 나타났고, 특히 처리 농도가 500 이상일 때 중간엽줄기세포 자체를 처리한 경우와 동일한 세포생존율 및 ROS 감소 효과가 나타나는 것을 확인하였다.

상기 결과들은 저산소 허혈성 환경에서 줄기세포에 의해 분비된 티오레독신의 신경세포 사멸 억제 효과를 입증하는 것이다.

실시예 3. 전달체를 통한 thioredoxin의 신경세포 전달 및 허혈성 뇌질환에 대한 in vivo 치료효과 검증

3-1. 티오레독신 전달체 합성

본 발명자들은 하기와 같은 방법에 따라 티오레독신을 세포 내로 전달할 수 있는 전달체를 합성하였다. 보다 구체적으로, 도 3a에 도시된 바와 같이 테트라에틸 규산염 광물(Tetraethyl orthosilicate; TEOS)과 디메틸디에톡시실란(Dimethyldiethoxysilane; DMDES)을 혼합하고 가수분해(hydrolysis) 되도록 한 다음, 염기 촉매 하에 축합반응(condensation)을 통해 실록산 기반 PDMS 나노입자(siloxane-based PDMS nanoparticle) 전달체를 제조하였다. 이후 상기 방법으로 제조된 전달체의 세포 내 흡수 여부를 검증하고자 하였다.

3-2. 전달체의 세포 내 흡수 확인

상기 실시예 3-1의 방법에 따라 제조된 전달체의 세포 내 흡수를 검증하기 위하여, 하기와 같은 실험을 진행하였다. 보다 구체적으로, 37℃ 항온수조를 데우고 동결세포 튜브를 상기 항온수조에서 2~3분간 빠르게 녹인 다음, 세포가 완전히 녹으면 300 x g의 속도로 실온에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 DMEM 배양배지에 넣고 다시 한 번 동일한 조건에서 원심분리한 다음, 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 배양배지에 넣어 재현탁시켰다. 다음으로 LUNA-FL™ 이중형광 세포카운터를 사용하여 세포 수를 측정한 후 4000 cells/cm²의 밀도가 되도록 세포를 씨딩하여 인큐베이터에서 배양하였다. 세포가 50% 정도 자라면 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine; TRITC)이 포함된 전달체 1 ㎕를 상기 배양된 세포의 배양액에 넣고 24시간 배양하였으며, 이후 형광 현미경으로 전달체가 세포 내부로 전달되었는지 관찰하였다.

그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 전달체를 2가지 농도로 처리한 경우 모두 세포질에서 붉은색 형광이 관찰된 것을 통해 상기 전달체가 세포 내로 효율적으로 흡수된 것을 확인하였다.

3-3. 전달체의 신경세포 및 뇌내 전달 확인

상기 실시예 3-2의 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 나아가 전달체가 신경세포 및 뇌내로 전달되는지 여부를 검증하였다.

먼저 신경세포로의 전달 여부를 확인하기 위해, 임신한지 18일이 지난 백서에서 태아를 꺼내어 대뇌피질을 분리한 다음, 트립신을 처리하고 피펫팅(pipetting)하여 단일세포로 분리하였다. 이어서 세포 수를 카운트하여 20,000 cells/cm²의 밀도가 되도록 세포를 씨딩하고 인큐베이터에서 배양하였다. 세포가 50% 정도 자라면 테트라메틸로다민이 포함된 전달체 1 ㎕를 상기 배양된 세포의 배양액에 넣고 24시간 배양하였으며, 이후 형광 현미경으로 전달체가 세포 내부로 전달되었는지 관찰하였다.

그 결과, 도 3c의 상단 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이 전달체가 신경세포 내로 흡수된 것을 확인하였다.

나아가 상기 전달체를 뇌실내 투여한 경우에도 신경세포 내로 흡수되는지 여부를 검증하기 위하여, 테트라메틸로다민이 포함된 전달체 10 ㎕를 생후 7일된 랫트의 뇌실 내로 투여하였다. 24시간 후 상기 랫트로부터 뇌를 적출하고 광학상(optical image) 분석을 통해 형광을 관찰하였다. 또한, 다른 한편으로는 상기 방법으로 적출한 뇌 조직 주변에 OCT compound를 뿌린 후 동결시키고, 동결박절기를 이용해 뇌 조직을 10 ㎛로 박절한 다음, 뇌 조직 절편을 슬라이드 글라스에 붙인 후 형광 현미경으로 뇌 조직 내 형광을 관찰하였다.

그 결과, 도 3c의 하단 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이 전달체를 뇌실 내로 투여한 경우 투여 부위에서 형광이 관찰되었으며, 뇌 조직을 형광현미경으로 관찰한 결과 붉은 색 형광이 관찰되었으며 이를 통해 뇌 세포 내로 상기 전달체가 흡수된 것을 알 수 있었다.

3-4. 티오레독신 전달체 투여에 의한 허혈성 뇌질환 치료효과 확인

본 발명자들은 상기 실시예 3-2 및 3-3의 결과를 바탕으로, 티오레독신을 상기 전달체와 함께 뇌실 내로 투여할 경우 실질적인 허혈성 뇌질환에 대한 치료효과가 나타나는지 여부를 검증하였다.

이를 위해, 생후 7일된 수컷 SD 랫트의 오른쪽 경동맥을 묶은 후 2시간 10분 동안 8% 농도의 저산소 환경에 노출시켜 체내 저산소성 허혈성 뇌병증(hypoxic ischemic encephalopathy; HIE) 모델을 제작하였다. 이후 오른쪽 뇌실 내로 티오레독신이 포함된 전달체 10 ㎕를 투여하였으며, 72시간 후 뇌를 적출하고 뇌조직의 손상 정도를 확인하기 위해 트리페닐 테트라졸리움 클로라이드(Triphenyl tetrazolium chloride; TTC) 염색을 실시하였다. 상기 TTC 염색은 미토콘드리아의 탈수소효소를 염색하는 시약으로, 신경세포가 사멸하게 되면 미토콘드리아에서 탈수소효소를 분비할 수 없어 흰색으로 보이며, 정상세포에서는 붉은색으로 보이게 된다. 염색은 TTC 파우더를 37℃ 생리식염수에 녹여 2% w/v TTC 용액을 만든 다음 상기 뇌 조직을 상기 용액에 담그고 15분~30분 동안 37℃에서 배양하는 방법으로 실시하였다.

실험결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 티오레독신이 포함된 전달체를 투여하지 않은 대조군(control)에 비해 티오레독신이 포함된 전달체를 투여한 경우(20% DMDES thioredoxin) 손상된 뇌 조직이 개선된 유의한 치료효과가 나타난 것을 확인하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

본 발명에 따른 방법에 의하면 줄기세포에서 티오레독신의 발현을 유의하게 증진시킬 수 있고, 상기 티오레독신에 의한 신경세포 사멸 억제 효과와 더불어 신생아 저산소성 허혈성 뇌병증 in vivo 모델에서 전달체를 통한 티오레독신의 뇌실내 투여 시 치료효과를 실험적으로 확인하였는바, 본 발명에 따른 방법에 의해 저산소 환경에서 배양된 티오레독신 발현이 증진된 줄기세포는 허혈성 뇌질환의 치료 분야에서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Claims

줄기세포를 저산소 환경에서 배양시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 티오레독신(Thioredoxin; TRX) 발현을 증진시키는 방법.
제1항에 있어서,

상기 저산소 환경은 0.5 내지 10%의 산소가 공급되는 환경인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,

상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
제3항에 있어서,

상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 태반, 양수 또는 편도에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 방법.
제1항의 방법에 의해 티오레독신(Thioredoxin; TRX) 발현이 증진된, 줄기세포.
제5항에 있어서,

상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
제6항에 있어서,

상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반, 양수 또는 편도에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 줄기세포.
제5항의 줄기세포를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서,

상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제9항에 있어서,

상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반, 양수 또는 편도에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제8항에 있어서,

상기 허혈성 뇌질환은 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 혈전증(thrombosis), 색전증(embolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 소경색(lacune), 뇌일혈, 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수, 외상성 뇌손상 및 저산소성 뇌손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
티오레독신(Thioredoxin; TRX) 및 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS) 나노입자를 포함하는, 티오레독신 전달용 복합체.
제12항에 있어서,

상기 나노입자는 테트라에틸 규산염 광물(Tetraethyl orthosilicate; TEOS)과 디메틸디에톡시실란(Dimethyldiethoxysilane; DMDES)을 혼합한 다음, 염기 촉매 하에 축합반응을 통해 제조된 것을 특징으로 하는, 복합체.
제12항의 복합체를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료용 약학적 조성물.
제5항의 줄기세포를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료방법.
제5항의 줄기세포를 포함하는 약학적 조성물의, 허혈성 뇌질환 치료용도.
제12항의 복합체를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌질환 치료방법.
제12항의 복합체를 포함하는 약학적 조성물의, 허혈성 뇌질환 치료용도.