WO2013025042A2 - 줄기세포 유래 미세소포를 포함하는 신경 생성 촉진용 조성물 - Google Patents

줄기세포 유래 미세소포를 포함하는 신경 생성 촉진용 조성물 Download PDF

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    • C12N2502/1358—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Definitions

  • the present invention relates to a composition for promoting neuronal growth comprising a stem cell-derived microvesicles and a method for promoting neuronal production.
  • stem cells are likely to cause arterial infarction due to their large size, leading to cerebral infarction.
  • stem cells are easily moved into the brain in the open state of the brain-vessel barrier, such as in the acute phase, but in the chronic phase, the movement is limited due to their large size.
  • cell therapy products there is a limit to inducing the propensity to cells specialized for the desired propensity.
  • microvesicles are small vesicles with a diameter of 0.1 to 1 ⁇ m or less, which means that a part of cell membranes such as endothelial cells and platelets are released into the blood by stimulation.
  • Microvesicles derived from stem cells are used to detect nuclear components as well as receptors and proteins. It is known to play an intercellular communication role.
  • the microvesicles may also exclude the risk of zoonosis due to animal serum infection. Considering the characteristics of these microvesicles, cell therapy using microvesicles is expected to become a new paradigm (paradiam) that can overcome the limitations of the existing stem cell therapy.
  • WO 10/070141 discloses a method for producing adipose stem cells-derived microvesicles, an immune disease, an allergic reaction, an inflammatory disease, and the like of the resulting microvesicles.
  • -122087 discloses particles secreted by mesenchymal stem cells and comprising the biological properties of one or more mesenchymal stem cells and techniques of using the particles as therapeutic agents for cardiac protection.
  • stem cell-derived microvesicles there is not much research on stem cell-derived microvesicles, and thus, stem cells that can be used for the treatment of various diseases cannot be replaced by the microvesicles, and in particular, microvesicles and neuronal cell growth promotion. No correlation with effect has been reported.
  • stem cell-derived microvesicles can be used to promote the production of nerve cells, there is an advantage that can be used in the treatment of diseases related to nerve damage, the study of the correlation between stem cell-derived microvesicles and nerve cells Is urgent needed.
  • the present inventors studied stem cell-derived microvesicles and the relationship between neurons, and confirmed that the stem cell-derived microvesicles have an excellent effect of promoting the production and migration of nerve cells and angiogenesis in vascular endothelial cells.
  • the present invention was completed.
  • the present invention provides a composition for promoting neuronal growth comprising a stem cell-derived microvesicles as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for promoting nerve production, including; adding stem cells-derived microvesicles to neural stem cells.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases, including stem cells-derived microvesicles as an active ingredient.
  • the present invention comprises the steps of treating the stem cell-derived microvesicles in individuals other than humans, the nerve damage is induced; It provides a nerve damage treatment method comprising a.
  • Stem cell-derived microvesicles according to the present invention can promote the production of nerves and the movement of nerves, and can promote angiogenesis in vascular endothelial cells has an excellent effect of treating nerve damage.
  • CD105 positive / annexin V negative compares blood levels of CD105 positive / annexin V negative, CXCR4 positive / annexin V negative microvesicles in patients with small brain lesions (A), patients with large brain lesions (B), and CD105 positive and Figure (C) shows a relationship with CD90 positive.
  • Figure 2 shows CD105 positive / Annexin V negative stem cell-derived microvesicles (A), CD105 positive / CXCR4 positive / Annexin V negative microvesicles (B), SDP-1 ⁇ (C) and the size of brain lesions (DWI) , NIHSS, and correlation with elapsed time after onset of cerebral infarction.
  • Figure 3 is bone marrow-derived mesenchymal stem cells treated with Kn DEME (knockout DEME), STS 100 nM (Staurosporin A treated group), 20% ischemic brain extract (BE (whole)) and 20% ischemic serum (serum) Figure showing the result of confirming the number of stem cell-derived microvesicles in the flow cytometer using CD105 and Annexin V.
  • FIG. 5 is a microvesicle (A) obtained without giving ischemic stimulation or after stem cell-derived microvesicles (B) obtained through ischemic stimulation to the neural stem cells, the neuronal capacity was confirmed by optical and confocal microscopy results The figure shown.
  • FIG. 6 is a view showing the results of confirming the vascular endothelial ability of vascular endothelial cells by fluorescence microscopy after the treatment (1, 3, 10, 30ug / ml) obtained through the ischemic stimulation.
  • Figure 7 shows the results obtained by injecting microvesicles obtained through ischemic stimulation into the ventricles of mice induced with ischemic stroke, and the distance of neural progenitor cells by fluorescence staining (A) and the numerical results (B) (Contra: contralateral, ipsi: ipsilateral).
  • FIG. 8 shows the results obtained by injecting the stem cell-derived microvesicles obtained through ischemic stimulation into the ventricles of mice induced with ischemic stroke, and confirming microvascular production of vascular endothelial cells through fluorescent staining (A) and quantifying the results ( B) (Contra: contralateral, ipsi: ipsilateral, sham: normal control).
  • the present invention provides a composition for promoting neuronal growth comprising stem cell-derived microvesicles as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for promoting neuronal production, comprising: adding a stem cell-derived microvesicles to neural stem cells.
  • Stem cell-derived microvesicles refers to small vesicles derived from stem cells, containing receptors and proteins, and having a size of 0.1 to 1 ⁇ m or less in diameter.
  • the stem cell-derived microvesicles may be microvesicles induced through ischemic stimulation, and the ischemic stimulus may be preferably obtained by treating the stem cells with brain tissue extracts of an ischemic individual.
  • the stem cell-derived microvesicles are not particularly limited thereto, but may include CD105 positive microvesicles, annexin V-negative microvesicles, etc., which show specificity to mesenchymal stem cells.
  • the type of stem cells that are the source of the microvesicles is not particularly limited, but induced pluripotent stem cells (iPS, adult stem cells, embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, adipose stem cells, Hematopoietic stem cells, umbilical cord blood stem cells, dedifferentiated stem cells, and the like, and preferably mesenchymal stem cells.
  • iPS induced pluripotent stem cells
  • adult stem cells embryonic stem cells
  • mesenchymal stem cells adipose stem cells
  • Hematopoietic stem cells Hematopoietic stem cells
  • umbilical cord blood stem cells dedifferentiated stem cells, and the like
  • mesenchymal stem cells preferably mesenchymal stem cells.
  • stem cell-derived microvesicles can promote the production and migration of nerve cells and can promote angiogenesis in vascular endothelial cells.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases, including stem cells-derived microvesicles as an active ingredient.
  • Stem cell-derived microvesicles according to the present invention can promote the production of nerves and the movement of nerves, and can promote angiogenesis in vascular endothelial cells has an excellent effect of treating nerve damage. Therefore, the stem cell-derived microvesicles according to the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases.
  • the degenerative neurological diseases may include without limitation various diseases caused by nerve damage, such as ischemic stroke, cerebral infarction, nerve trauma, Parkinson's disease, Alzheimer's, Lou Gehrig's disease and epilepsy.
  • nerve damage such as ischemic stroke, cerebral infarction, nerve trauma, Parkinson's disease, Alzheimer's, Lou Gehrig's disease and epilepsy.
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases comprising the stem cell-derived microvesicles of the present invention as an active ingredient is preferably within the range that does not impair the main effect of the present invention in addition to the stem cell-derived microvesicles. It may contain other ingredients such as synergistic effect on the main effect.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient and diluent in addition to the active ingredient described above for administration.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, textose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil.
  • compositions of the present invention may be prepared in various parenteral or oral administration forms according to known methods.
  • isotonic aqueous solutions or suspensions are preferred for injectable formulations.
  • injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents.
  • each component may be formulated for injection by dissolving in saline or buffer.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient in the active ingredient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like. It is prepared by mixing. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, and the like, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, may be included. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository utopsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the effective dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age and gender of the patient, but may be administered at 100 ⁇ g / kg to 1 mg / kg, and preferably at 200 ⁇ g / kg to 500 ⁇ g / kg. .
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, chemotherapy, radiotherapy, hormone therapy, drug therapy and biological response modifiers for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases.
  • the present invention provides a method for treating nerve damage comprising the step of treating the stem cell-derived microvesicles in an individual except a human, the nerve damage is induced.
  • the stem cell-derived microvesicles By the treatment of the stem cell-derived microvesicles, the production and migration of nerve cells are promoted, angiogenesis is promoted in vascular endothelial cells, and nerve damage can be effectively treated.
  • nerve damage refers to a condition in which nerves are damaged by physical factors or degenerative neurological diseases, but the nerve damage caused by the physical factors is not particularly limited thereto, but is a brain trauma, spinal cord injury, cerebral infarction, cerebral hemorrhage , Nerve injury due to the degenerative neurological disease is not particularly limited, but nerve damage due to degenerative neurological diseases such as ischemic stroke, cerebral infarction, nerve trauma, Parkinson's disease, Alzheimer's, Lou Gehrig's disease and epilepsy Can be.
  • Subjects other than humans may be, but are not limited to, rats, red foxes, skunks, raccoons, badgers, dogs, wolves, mongoose, coyote, ferrets, dogs and cats.
  • Citrate serum was obtained from a cerebral infarction patient and centrifuged for 10 minutes at 19,800 g and 10 ° C. to obtain stem cell-derived microvesicles. After resuspending the obtained stem cell-derived microvesicles in 20 ⁇ l of PBS, using stem cell flow (flow cytometric analysis), stem cell-derived microvesicles (CD105 positive / Annexin V negative) and SX-1 receptor CXCR4 Blood levels of expressing microvesicles (CXCR4 positive / annexin V negative) were compared between patients with small brain lesions (less than DWI volume 10 cc) and larger patients (DWI volume 10 cc or higher). It was confirmed whether the CD90 positive or double positive.
  • CD105 positive cells and CXCR4 positive cells were found to be greater in patients with large brain lesions after brain infarction (B) than in patients with small brain lesions (A).
  • B brain infarction
  • A small brain lesions
  • CD105 positive cells it was confirmed that most of CD90 double positive (C), through which it was verified that the CD105 positive microvesicles are stem cell-derived microvesicles.
  • DWI diffusion weighted image
  • NIHSS National Institutes of Health Stroke Scal
  • CD105 positive / Annexin V negative stem cell-derived microvesicles tend to increase as the size of the brain lesions (DWI), NIHSS values higher (A), CD105 positive / CXCR4 positive Microvesicles with annexin V-negative tended to increase with higher NIHSS levels and decreased with longer elapsed time after onset of cerebral infarction (B).
  • microvesicles were verified to increase blood levels of highly motile stem cells as cerebral infarct severity increased, suggesting that the incidence of intrinsic stem cells may decrease with time after onset.
  • the blood concentration of SDF-1 ⁇ decreased as the brain lesions increased and increased as the time elapsed after onset (C).
  • Bone marrow was collected from the rat femur and bone marrow-derived mesenchymal stem cells were obtained through culture.
  • the obtained mesenchymal stem cells were cultured in a T75 flask at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml at 5% CO 2 and 37 ° C., and subcultured when grown to 80% or more of the total area.
  • the subculture is gently washed one or more times with PBS after removing the medium, and then added tripples (Tryple, Invitrogen), incubated for about 1 minute in a 37 ° C. incubator, and then in a medium containing 10% FBS (Fetal bovine serum). After neutralizing the cells were collected by centrifugation for 1,300g, 5 minutes.
  • FBS Fetal bovine serum
  • the cell precipitate was resuspended in a medium containing FBS and the cells were counted and cultured. 4-6 generation cells were used for the experiment. Medium was used low glucose DMEM containing 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin.
  • ischemic brain extract After inducing cerebral artery infarction in rats, damaged brain hemisphere tissues were pulverized with DMEM medium at 150 mg / ml and centrifuged at 10,000 g for 10 minutes to obtain supernatant to obtain ischemic brain extract. . The obtained ischemia-brain tissue extract was divided into equal amounts and stored at -70 ° C.
  • ischemic stimulation samples containing 20% ischemic brain tissue extract or 20% ischemic serum were prepared by suspending DMEM to include 20% ischemia-brain tissue extract.
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells prepared in 2.1 were cultured in a 60 mm culture dish containing DMEM medium containing 10% FBS. After adding the ischemic stimulus (20% ischemic brain extract or 20% ischemia serum) prepared in 2.2 to the culture dish, the culture supernatant was obtained from the culture. Centrifuge the culture supernatant at low speed (2,500g, 10 °C, 10 minutes) to remove impurities from the culture supernatant, then centrifuged again at high speed (14,500g, 10 °C, 45 minutes) derived from stem cells Microvesicles were obtained. The number of the obtained microvesicles was calculated by applying the following formula, and the degree of CD105 and annexin V expression in each of the microvesicles was analyzed by flow cytometry.
  • Number of microvesicles (n / L) N x (amount of total microvesicle suspension / amount of microvesicles used for antibody reaction) x (total amount of microvesicle dilution for flow cytometry / amount used for flow cytometry) x (10 6 / amount of total serum)
  • the expression levels of CD105 and Annexin V were used as markers to confirm whether microvesicles were derived from mesenchymal stem cells. Bone marrow treated with knockout DMEM or staurosporin A was used as a control. Microvesicles obtained from the derived mesenchymal stem cells were used.
  • the control group Kn DEME knockout DEME
  • STS 100 nM Staurosporin A
  • 20% ischemic serum treated group (20% Serum) was obtained from the bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • the treated group (20% BE (Whole)) treated with ischemic brain tissue extract was confirmed that the amount of microvesicles significantly increased. Therefore, in order to increase the secretion amount of microvesicles, it was confirmed that it is preferable to use ischemic brain tissue extract.
  • microvesicles obtained through ischemia pretreatment were treated to neurons in culture, it was confirmed whether this caused cell death.
  • Microvesicles (1, 3, 10, 30 ⁇ g / ml) or 30 ⁇ M NMDA (positive control) obtained through the ischemic pretreatment was treated in neuronal cell culture, and then neuronal necrosis occurred by LDH analysis 24 hours later.
  • the microvesicles obtained through ischemic pretreatment did not cause neural cell necrosis, but in the group treated with NMDA it was confirmed that more than 70% neural cell necrosis occurs. Therefore, it can be seen that the microvesicles obtained through the ischemic pretreatment do not cause necrosis of neural stem cells and are a material whose safety is recognized.
  • Brain tissues obtained from embryonic rats at 14 days of gestation were carefully physically pulverized using a narrow-mouthed glass pipette or separated to a single cell level using a cell separation solution such as Accutase, followed by centrifugation (500g, 5 Min) precipitated cells were obtained.
  • the resulting cells were cultured in DMEM / F12 medium with 1 ⁇ N2 supplement, 25 ng / ml bFGF, 25 ng / ml EGF, and induced to form neural stem cells.
  • the induced neural stem cells were passaged to maintain the diameter of neuronal cells within 100 nm.
  • the neural stem cells derived from 3.1 were treated with stem cell-derived microvesicles obtained through the ischemic stimulation obtained in 2.3, and then compared with the neurogenesis capacity of the treated neural stem cells.
  • microvesicles obtained from mesenchymal stem cells without ischemic stimulation were used.
  • Each experimental group was identified by light and confocal microscopy.
  • nestin which is a marker of neural stem cells
  • DCX Doublecortin
  • GFAP gliafilament acid protein
  • vascular endothelial cells were treated with microvesicles obtained through the ischemic stimulation obtained in Example 2.2 (1, 3, 10, 30 ⁇ g / ml) and the vascular endothelial ability was compared.
  • microvesicles obtained from mesenchymal stem cells without ischemic stimulation were used.
  • Living cells were fluorescein stained using calcein AM, which was used as a marker capable of measuring blood vessel generation capacity, and observed by fluorescence microscopy.
  • the increase in fluorescence was not observed in the control group (ctrl), but when the stem cell-derived microvesicles were treated, fluorescence was increased in a concentration-dependent manner as blood vessels were formed in vascular endothelial cells. there was. Therefore, it can be seen that the stem cell-derived microvesicles are substances capable of promoting blood vessel production in vascular endothelial cells.
  • microvesicles obtained through the ischemic stimulation obtained in Example 2.3 were injected into the ventricles of mice induced with ischemic stroke, and the degree of migration of neural progenitor cells was compared.
  • PBS containing no microvesicles was injected into the ventricles as a control group, and fluorescent staining was performed using an antibody against DCX, which is a marker of neural precursor cells.
  • both ipsilateral (ipsi) and contralateral (contra) of the ventricle are compared with the control group (Veh) injected with PBS. It can be seen that the distance of neural progenitor cells increased significantly. Therefore, it was confirmed that the stem cell-derived microvesicles can stimulate migration of neural progenitor cells.
  • Example 2.3 After injecting the stem cell-derived microvesicles obtained through the ischemic stimulation obtained in Example 2.3 into the ventricles of mice induced with ischemic stroke, the degree of microvascular formation of vascular endothelial cells was compared. PBS containing no microvesicles was injected into the ventricles as a control, and fluorescent staining was performed using an antibody against vWF (Von Willebrand factor), a marker of vascular endothelial cells.
  • vWF Volon Willebrand factor

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Abstract

본 발명은 줄기세포 유래 미세소포를 유효성분으로 포함하는 신경생성 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 줄기세포 유래 미세소포는, 신경의 생성 및 신경의 이동을 촉진하고, 혈관내피세포에서 혈관신생을 촉진할 수 있어 신경의 손상 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 유래 미세소포를 포함하는 신경 생성 촉진용 조성물
본 발명은 줄기세포 유래 미세소포를 포함하는 신경생성 촉진용 조성물 및 신경생성 촉진 방법에 관한 것이다.
최근 줄기세포 치료에 대하여 뇌경색, 외상성 신경손상, 근골격계 질환 등 다양한 질환에서 다양한 전임상, 임상 연구가 시도되고 있다. 그러나 현재 기술적인 수준은 단순한 줄기세포의 추출 및 배양/증식과 이를 주입하는 정도에 관한 연구까지만 미치고 있으며, 최근까지의 임상연구 결과 이러한 줄기세포 치료는 아직 뚜렷한 효과를 보이지 못하고 있는 것으로 알려졌다. 효과를 증진하기 위한 다양한 유전자 조작 줄기세포에 대한 연구가 진행되고 있으나, 유전자를 이용한 세포 치료는 윤리적인 문제 때문에 인체에서 적용하기 불가능한 한계점이 있다.
또한, 줄기세포를 이용하는 방법을 임상에 적용하는데 몇 가지 문제점이 있다. 첫째, 세포치료제의 경우 줄기세포가 조직에 생착한 다음 종괴 형성의 위험성이 있다. 둘째, 줄기세포의 경우 큰 크기로 인해 동맥패색을 유발하여 뇌경색을 초래할 가능성이 있다. 셋째, 줄기세포의 경우 급성기와 같이 뇌-혈관장벽이 열린 상태에서는 뇌 내로 이동이 용이하나 만성기에서는 큰 크기로 인해 이동에 제한이 있다. 끝으로, 세포치료제의 경우 원하는 성향으로 특화된 세포로 그 성향을 유도하는데 한계가 있다.
이에 반해 미세소포를 이용한 치료법은 줄기세포 자체를 이용하는 세포치료법과 차별화되는 방법으로 최근 주목을 받고 있다. 통상적으로 미세소포란 직경 0.1~1μm 이하의 작은 소포로서 자극에 의해 내피세포, 혈소판 등의 세포막 일부가 혈중으로 떨어져 나온 것을 의미하는데, 줄기세포에서 유래된 미세소포는 수용체 및 단백질뿐 아니라 핵 성분을 함유하고 있어 세포간 커뮤니케이션 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 미세소포는 줄기세포에 비해 동물혈청을 상대적으로 적게 함유하고 있어 동물 혈청 감염에 의한 증상(zoonosis)의 위험성 역시 배재할 수 있다. 이러한 미세소포의 특성을 고려할 때 미세소포를 이용한 세포치료방법은 기존의 줄기세포치료법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 패러다임(paradiam)이 될 것으로 기대된다.
따라서, 이러한 줄기세포로부터 유래된 미세소포를 줄기세포를 대신하여 사용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 국제특허공개 WO 10/070141호에는 지방줄기세포 유래 미세소포의 생성방법, 상기 생성된 미세소포의 면역질환, 알러지 반응, 염증성 질환의 치료효과 등에 대하여 개시되어 있고, 특허공개 제2010-122087호에는 중간엽 줄기세포에 의해 분비되고, 하나 이상의 중간엽 줄기세포의 생물학적 특성을 포함하는 입자 및 상기 입자를 심장보호용 치료제로서 사용하는 기술이 개시되어있다.
그러나, 아직까지 줄기세포 유래 미세소포에 대한 연구성과가 많지 않아, 각종 질환의 치료용도로서 사용될 수 있는 줄기세포를 상기 미세소포로 대체할 수 있다고 볼 수는 없고, 특히 미세소포와 신경세포 생성촉진 효과와의 상관관계에 대하여도 보고된 바 없다.
따라서, 줄기세포 유래 미세소포를 이용하여 신경 세포 생성을 촉진할 수 있다면, 이를 신경 손상과 관련된 질환의 치료에 사용할 수 있는 장점이 있으므로, 줄기세포 유래 미세소포와 신경 세포와의 상관관계에 대한 연구가 절실히 필요하다.
본 발명자들은 줄기세포 유래 미세소포와 신경 세포와의 상관관계에 관하여 연구하던 중, 줄기세포 유래 미세소포가 신경세포의 생성 및 이동을 촉진하고 혈관내피세포에서 혈관 신생을 촉진하는 효과가 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 줄기세포 유래 미세소포를 유효성분으로 포함하는 신경생성 촉진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 줄기세포 유래 미세소포를 신경줄기세포에 가하는 단계;를 포함하는, 신경 생성 촉진방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 줄기세포 유래 미세소포를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 신경손상이 유발된, 인간을 제외한 개체에 줄기세포 유래 미세소포를 처리하는 단계; 를 포함하는 신경 손상 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 줄기세포 유래 미세소포는, 신경의 생성 및 신경의 이동을 촉진하고, 혈관내피세포에서 혈관신생을 촉진할 수 있어 신경의 손상을 치료하는 우수한 효과가 있다.
도 1은 CD105 양성/아넥신 V 음성, CXCR4 양성/ 아넥신 V 음성 미세소포의 혈중 수준을 뇌병변이 작은 환자(A), 뇌병변이 큰 환자(B)에서 비교한 결과, 및 CD105 양성과 CD90 양성과의 관계(C)를 나타낸 도이다.
도 2는 CD105 양성/아넥신 V 음성인 줄기세포 유래 미세소포(A), CD105양성/CXCR4 양성/ 아넥신 V 음성 미세소포(B), SDP-1α(C)와 뇌병변의 크기(DWI), NIHSS, 뇌경색 발병 후 경과시간과의 상관 관계를 나타낸 도이다.
도 3은 Kn DEME(넉아웃 DEME), STS 100nM(스타우로스포린 A 처리군), 20% 허혈뇌 추출물(BE(whole)) 및 20% 허혈혈청(serum)으로 처리한 골수유래 중간엽 줄기세포에서의 줄기세포 유래 미세소포의 수를 CD105와 아넥신 V를 이용한 유세포 분석기로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 허혈 자극을 통해 얻어진 줄기세포 유래 미세소포를 신경세포에 처리(1, 3, 10, 30μg/ml)하거나, 대조군으로 30μM NMDA를 처리하여, 신경 세포의 괴사 여부를 LDH 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 허혈 자극을 주지 않고 얻어진 미세소포(A) 또는 허혈 자극을 통하여 얻어진 줄기세포 유래 미세소포(B)를 신경줄기세포에 처리한 후, 신경생성 능력을 광학 현미경 및 공초점 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 허혈 자극을 통하여 얻어진 미세소포를 처리(1, 3, 10, 30ug/ml)한 후, 혈관내피세포의 혈관생성능력을 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 허혈 자극을 통하여 얻어진 미세소포를 허혈성 뇌졸중을 유도한 쥐의 뇌실에 주입한 후, 신경 전구세포의 이동 거리를 형광염색을 통해 확인한 결과(A) 및 이를 수치화한 결과(B)를 나타낸 도이다(Contra: contralateral, ipsi: ipsilateral).
도 8은 허혈 자극을 통하여 얻어진 줄기세포 유래 미세소포를 허혈성 뇌졸중을 유도한 쥐의 뇌실에 주입한 후, 혈관내피세포의 미세혈관 생성을 형광 염색을 통해 확인한 결과(A) 및 이를 수치화한 결과(B)를 나타낸 도이다(Contra: contralateral, ipsi: ipsilateral, sham: 정상 대조군).
본 발명은 줄기세포 유래 미세소포를 유효성분으로 포함하는 신경생성 촉진용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 줄기세포 유래 미세소포를 신경줄기세포에 가하는 단계;를 포함하는, 신경 생성 촉진방법을 제공한다.
본 발명의 “줄기세포 유래 미세소포”란 줄기세포로부터 유래되고, 수용체, 단백질을 함유하며, 직경 0.1~1μm 이하의 크기를 가지는 작은 소포를 의미한다.
상기 줄기세포 유래 미세소포는 허혈 자극을 통해 유도된 미세소포일 수 있으며, 상기 허혈자극은 바람직하게는 허혈 개체의 뇌조직 추출물을 줄기세포에 처리하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 미세소포는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 중간엽 줄기세포에 특이성을 보이는 CD105 양성 미세소포, 아넥신 V(annexin V) 음성 미세소포 등을 포함할 수 있다.
이때, 상기 미세소포의 근원이 되는 줄기세포의 종류는 특별히 이에 제한되지 않으나, 유도만능줄기세포(iPS, induced pluripotent stem cell), 성체줄기세포, 배아줄기세포, 중간엽 줄기세포, 지방줄기세포, 조혈모세포, 제대혈 줄기세포, 역분화 줄기세포 등이 될 수 있고, 바람직하게는 중간엽 줄기세포가 될 수 있다.
본 발명에 따른, 줄기세포 유래 미세소포는 신경 세포의 생성 및 이동을 촉진시킬 수 있으며, 혈관내피세포에서의 혈관 신생을 촉진시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 줄기세포 유래 미세소포를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 줄기세포 유래 미세소포는, 신경의 생성 및 신경의 이동을 촉진하고, 혈관내피세포에서 혈관신생을 촉진할 수 있어 신경의 손상을 치료하는 우수한 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 줄기세포 유래 미세소포는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 퇴행성 신경 질환은 허혈성 뇌졸중, 뇌경색, 신경 외상, 파킨슨 병, 알츠하이머, 루게릭 병 및 간질 등 신경 손상으로 인하여 유발되는 다양한 질환을 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 줄기세포 유래 미세소포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 줄기세포 유래 미세소포 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 예를 들어 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 텍스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 체중에 따라 달라질 수 있으나 100μg/kg내지 1mg/kg으로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 200μg/kg내지 500μg/kg으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 화학적 치료, 방사성 치료, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 신경손상이 유발된, 인간을 제외한 개체에 줄기세포 유래 미세소포를 처리하는 단계;를 포함하는 신경 손상 치료 방법을 제공한다.
상기 줄기세포 유래 미세소포의 처리에 의하여, 신경 세포의 생성 및 이동이 촉진되고, 혈관 내피세포에서의 혈관신생이 촉진되어, 신경 손상을 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 용어 "신경손상"이란, 물리적 요인 또는 퇴행성 신경 질환에 의하여 신경이 손상되는 증상을 의미하는데, 상기 물리적 요인에 의한 신경손상은 특별히 이에 제한되지 않으나, 뇌외상, 척수손상, 뇌경색, 뇌출혈, 신경외상 등이 될 수 있고, 상기 퇴행성 신경 질환에 의한 신경손상은 특별히 이에 제한되지 않으나, 허혈성 뇌졸중, 뇌경색, 신경 외상, 파킨슨 병, 알츠하이머, 루게릭 병 및 간질 등의 퇴행성 신경 질환에 의한 신경 손상일 수 있다.
상기 인간을 제외한 개체는 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 쥐, 붉은 여우, 스컹크, 너구리, 오소리, 개, 늑대, 몽구스, 코요테, 흰족제비, 개 및 고양이일 수 있다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 줄기세포 유래 미세소포의 혈청 내 수준 비교
뇌경색 환자로부터 시트르산(citrate) 혈청을 얻어 19,800g, 10℃의 조건에서 10분 동안 원심분리하여 줄기세포 유래 미세소포를 수득하였다. 상기 수득한 줄기세포 유래 미세소포를 20μl의 PBS에 재현탁한 후, 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 이용하여, 줄기세포 유래 미세소포(CD105 양성/아넥신 V 음성)와 SDF-1 수용체인 CXCR4를 발현하는 미세소포(CXCR4 양성/아넥신 V 음성)의 혈중 수준을 뇌병변이 작은 환자들 (DWI volume 10cc 미만)과 큰 환자들 (DWI volume 10cc 이상)사이에서 비교하였으며, CD105 양성 세포의 경우, CD90 양성이 나타나는 이중 양성인지 여부를 확인하였다.
결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 뇌경색 후 뇌병변이 큰 환자들(B)에서 CD105 양성 세포 및 CXCR4 양성 세포가 뇌병변이 작은 환자들(A) 보다 더 많은 것을 확인하였다. 이를 통해, 뇌경색 후 뇌병변이 큰 환자들에서는 줄기세포 유래 미세소포와 SDF-1 주화성에 의해 이동할 수 있는 미세소포의 수가 증가함을 알 수 있다. 또한 CD105 양성 세포의 경우, 대부분 CD90 이중 양성임을 확인(C)하였으며, 이를 통해 CD105 양성 미세소포가 줄기세포 유래 미세소포임을 검증하였다.
한편, 뇌경색 환자의 임상기록을 바탕으로, 뇌병변 크기를 나타내는 확산강조영상(DWI; diffusion weighted image), NIHSS(National Institutes of Health Stroke Scal)와 뇌경색 발병 후 경과 시간에 따른 줄기세포 유래 미세소포(CD105 양성/ 아넥신 V 음성 미세소포), SDF-1 수용체인 CXCR4를 발현하는 미세소포(CXCR4 양성 /아넥신 V 음성 미세소포) 및 SDP-1α와의 관계를 분석하였다.
결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, CD105 양성/아넥신 V 음성인 줄기세포 유래 미세소포는 뇌병변의 크기(DWI)가 크고, NIHSS 수치가 높을수록 증가하는 경향을 나타내고(A), CD105양성/CXCR4 양성/아넥신 V 음성인 미세소포는 NIHSS 수치가 높을수록 증가하고 뇌경색 발병 후 경과시간이 길어짐에 따라 감소되는 경향을 나타내었다(B). 이를 통해, 뇌경색 중증도가 심할수록 운동성이 높은 줄기세포의 혈중 수치가 증가함을 미세소포를 통해 검증하였으며, 이는 발병 후 시간이 경과하면 내재적 줄기세포의 발생이 감소할 수 있음을 시사하는 것으로 생각되었다. 한편, SDF-1α의 혈중 농도는 뇌병변이 클수록 감소하였으며, 발병 후 경과시간이 길수록 증가(C)하였다.
실시예 2. 골수유래 줄기세포로부터 미세 소포의 분리
2.1 중간엽 줄기세포의 채취 및 배양
쥐의 대퇴골에서 골수를 채취하여 배양을 통해 골수유래 중간엽 줄기세포를 수득하였다. 상기 수득한 중간엽 줄기세포를 T75 플라스크에 1×105 cell/ml의 농도로 5% CO2 및 37℃에서 배양하고, 전체 면적의 80% 이상 자랐을 때 계대배양하였다. 상기 계대배양은 배지를 제거 후 PBS로 1회 이상 부드럽게 세척 후 트립플(Tryple, Invitrogen)을 넣고, 37℃ 배양기에서 약 1분 배양하고, 10% FBS(Fetal bovine serum)를 포함한 배지에 넣어 반응을 중화한 후 세포를 모아 1,300g, 5분간 원심분리하여 수행하였다. 세포침천물을 FBS를 포함하는 배지에 재현탁하고 세포 수를 계산하여 배양하였다. 4~6세대 세포를 실험에 사용하였다. 배지는 10% FBS, 1% 페니실린 /스트렙토마이신을 포함한 저농도 글루코스 DMEM을 사용하였다.
2.2 허혈 자극 시료 준비
흰쥐에 중뇌동맥 경색을 유발시킨 후 손상된 뇌반구 조직을 150mg/ml의 농도로 DMEM 배지와 함께 분쇄 후 10,000g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하여 허혈-뇌조직 추출물(ischemic brain extract)을 수득하였다. 상기 수득한 허혈-뇌조직 추출물을 동량으로 분주하여 -70℃에서 보관하였다. 줄기세포에 가할 허혈 자극을 위하여, DMEM에 20% 허혈-뇌조직 추출물이 포함되도록 현탁하여, 20% 허혈 뇌 조직 추출물 또는 20% 허혈 혈청을 포함하는 허혈 자극 시료를 준비하였다.
2.3 줄기세포 유래 미세소포의 분리 및 분석
상기 2.1에서 준비한 골수유래 중간엽 줄기세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지가 담긴 60 mm 배양접시에서 배양하였다. 배양 접시에 상기 2.2에서 준비된 허혈 자극(20% 허혈뇌 추출물 또는 20% 허혈 혈청)을 가한 후, 배양물로부터 배양 상층액을 수득하였다. 배양 상층액을 저속으로 원심분리(2,500g, 10℃, 10분)하여 상기 배양 상층액으로부터 불순물을 제거한 다음, 이를 다시 고속으로 원심분리(14,500g, 10℃, 45분)하여 줄기세포로부터 유래된 미세소포를 수득하였다. 상기 수득한 각 미세소포의 수를 하기의 수식에 적용하여 산출하고, 상기 각 미세소포에서 나타나는 CD105와 아넥신 V 발현 정도를 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여 분석하였다.
미세소포의 수(n/L)= N x (전체 미세소포 현탁액의 양/항체 반응에 사용한 미세소포의 양) x (유세포기 분석용 미세소포 희석액의 전체 양/유세포기 분석에 사용된 양) x (106/전체 혈청의 양)
CD105 와 아넥신 V 발현 정도는 미세소포가 중간엽 줄기세포로부터 유래되었는지를 확인하기 위한 표지자로서 사용되였으며, 대조군으로는 넉아웃(knockout) DMEM 또는 스타우로스포린 A(staurosporin A)를 처리한 골수 유래 중간엽 줄기세포로부터 수득한 미세소포를 사용하였다.
결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군인 Kn DEME(넉아웃 DEME), STS 100nM(스타우로스포린 A) 처리군 및 20% 허혈 혈청 처리군(20% Serum)은 골수 유래 중간엽 줄기세포로부터 수득한 미세소포의 양이 증가하지 않았으나, 허혈 뇌 조직 추출물을 처리한 처리군(20% BE(Whole))은 미세소포의 양이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 미세소포의 분비량을 증가시키기 위해서는 허혈 뇌 조직 추출물을 사용함이 바람직함을 확인하였다.
2.4 줄기세포 유래 미세소포의 안전성 검사
허혈 전처리를 통해 얻은 미세소포를 배양 중인 신경세포에 처리하는 경우, 이로 인하여 세포 사멸이 유발되는지 여부를 확인하였다. 허혈 전처리를 통해 얻은 미세소포(1, 3, 10, 30μg/ml) 혹은 30μM NMDA(양성 대조군)를 신경세포 배양에 처리 후, 24시간 후에 LDH 분석을 통해 신경세포 괴사가 일어났는지 확인하였다.
결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 허혈 전처리를 통해 얻은 미세소포는 신경세포 괴사를 일으키지는 않았지만, NMDA를 처리한 군에서는 70% 이상 신경세포 괴사가 일어남을 확인하였다. 따라서, 허혈 전처리를 통해 얻은 미세소포는 신경 줄기세포의 괴사를 유발하지 않아 안전성이 인정되는 물질임을 알 수 있다.
실시예 3. 줄기세포 유래 미세소포를 이용한 신경 줄기세포 자극
3.1 신경줄기세포의 분리 배양
임신 14일의 배아 쥐에서 수득한 뇌조직을 입구가 좁은 유리피펫을 이용해 조심스럽게 물리적으로 분쇄하거나 또는 Accutase와 같은 세포분리용액을 사용하여 단세포 수준으로 분리시킨 후, 이를 원심분리하여(500g, 5분) 침전된 세포를 수득하였다. 수득한세포를 1XN2 보충물, 25ng/ml bFGF, 25ng/ml EGF을 첨가한 DMEM/F12 배지에서 배양하고, 신경줄기세포를 형성하도록 유도하였다. 상기 유도된 신경줄기세포는 신경세포구의 지름을 100 nm 이내로 유지하도록 계대배양하였다.
3.2 줄기세포 유래 미세소포에 의한 신경줄기세포의 신경 생성 능력 증가
상기 3.1에서 유도된 신경줄기세포구에 상기 2.3에서 수득한 허혈자극을 통하여 얻어진 줄기세포 유래 미세소포를 처리한 다음, 처리된 신경줄기세포의 신생 신경생성능력을 비교하였다. 대조군으로는 허혈자극을 주지 않은 중간엽 줄기세포로부터 얻은 미세소포를 이용하였다. 각각의 실험군을 광학 현미경 및 공초점 현미경으로 확인하였으며, 표지자로써 신경줄기세포의 표지자인 네스틴(Nestin)과 신경전구세포를 확인하기 위한 DCX(Doublecortin)를 이용하였고, GFAP(글리아필라멘트산성단백질)를 이용하여 성상아교세포로의 분화를 확인하였다.
결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 허혈 자극을 주지 않고 얻어진 미세소포를 신경줄기세포구에 처리한 경우에는 신생 신경생성 능력의 증가를 뚜렷하게 확인할 수 없었으나(A),골수 줄기세포에 허혈자극을 가하여 얻은 미세소포를 신경줄기세포에 처리한 결과, 마커인 네스틴(Nestin)과 DCX 발현이 뚜렷하게 증가되어 신생 신경생성 능력이 증가됨을 확인할 수 있었다(B). 따라서, 허혈자극을 통해 유도된 줄기세포 유래 미세소포는 신경줄기세포에서 신경생성 능력을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
3.3 줄기세포 유래 미세소포에 의한 혈관내피세포의 혈관 생성 능력 증가
혈관내피세포에 실시예 2.2에서 수득한 허혈자극을 통하여 얻어진 미세소포를 처리(1, 3, 10, 30μg/ml)하고 혈관내피세포의 혈관생성능력을 비교하였다. 대조군으로는 허혈자극을 주지 않은 중간엽 줄기세포로부터 얻은 미세소포를 이용하였다. 칼세인 AM(Calcein AM)을 이용하여 살아있는 세포를 형광 염색하여, 혈관 생성 능력을 측정할 수 있는 표지자로 삼고, 형광 현미경으로 관찰하였다.
결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군(ctrl)에서는 형광의 증가를 관찰할 수 없었으나, 줄기세포 유래 미세소포를 처리할 경우, 혈관내피세포에서 혈관이 생성됨에 따라 농도 의존적으로 형광이 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 줄기세포 유래 미세소포는 혈관내피세포에서 혈관 생성을 촉진할 수 있는 물질임을 알 수 있다.
3.4 허혈 뇌졸중 동물에서 줄기세포 유래 미세소포의 신경줄기세포 자극(in vivo)
상기 실시예 2.3에서 수득한 허혈 자극을 통하여 얻어진 미세소포를 허혈성 뇌졸중을 유도한 쥐의 뇌실에 주입한 후, 신경전구세포의 이동 정도를 비교하였다. 미세소포를 포함하지 않는 PBS를 뇌실에 주입하여 대조군으로 삼았으며, 신경전구세포의 표지자인 DCX에 대한 항체를 이용하여 형광 염색하였다.
결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 줄기세포 유래 미세소포를 허혈뇌손상 쥐의 뇌실에 처리하면 PBS를 주입한 대조군(Veh)과 비교하여, 뇌실의 동측(ipsilateral; ipsi) 및 타측(contralateral; contra) 모두에서 신경전구세포의 이동거리가 뚜렷하게 증가하였음을 확인할 수 있다. 따라서, 줄기세포 유래 미세소포는 신경전구세포를 자극하여 이동을 촉진할 수 있음을 확인하였다.
3.5 허혈 뇌졸중 동물에서 줄기세포 유래 미세소포의 신생혈관생성 촉진(in vivo)
상기 실시예 2.3에서 수득한 허혈 자극을 통하여 얻어진 줄기세포 유래 미세소포를 허혈성 뇌졸중을 유도한 쥐의 뇌실에 주입한 후, 혈관내피세포의 미세혈관 생성 정도를 비교하였다. 미세소포를 포함하지 않은 PBS를 뇌실에 주입하여 대조군으로 삼았으며, 혈관내피세포의 표지자인 vWF(Von Willebrand factor)에 대한 항체를 이용하여 형광염색하였다.
결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군 및 PBS 처리 대조군(sham)과 비교하여 줄기세포 유래 미세소포를 처리한 실험군에서 뇌실의 동측(ipsilateral; ipsi) 및 타측(contralateral; contra) 모두에서 미세혈관 생성이 증가하며, 특히 타측 뇌실에서 혈관내피세포의 미세혈관생성이 뚜렷하게 증가함을 확인할 수 있다. 따라서, 줄기세포 유래 미세소포는 신경전구세포의 이동을 촉진할 뿐만 아니라, 혈관내피세포에서 미세혈관의 생성도 촉진할 수 있음을 확인하였다.

Claims (19)

  1. 줄기세포 유래 미세소포를 유효성분으로 포함하는 신경생성 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포 유래 미세소포는 허혈자극에 의하여 유도된 미세소포임을 특징으로 하는, 신경생성 촉진용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 허혈자극은 허혈 개체의 뇌조직 추출물에 의한 것임을 특징으로 하는, 신경생성 촉진용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포 유래 미세소포는 CD105 양성 및 아넥신 V 음성 미세소포인 것을 특징으로 하는, 신경생성 촉진용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(iPS, induced pluripotent stem cell), 성체줄기세포, 배아줄기세포, 중간엽 줄기세포, 지방줄기세포, 조혈모세포, 제대혈줄기세포 및 역분화줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신경생성 촉진용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포 유래 미세소포는 신경 세포의 생성 및 이동을 촉진시키는 것을 특징으로 하는, 신경생성 촉진용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포 유래 미세소포는 혈관내피세포의 혈관 신생을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 신경생성 촉진용 조성물.
  8. 줄기세포 유래 미세소포를 신경줄기세포에 가하는 단계;를 포함하는, 신경 생성 촉진방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 줄기세포 유래 미세소포는 줄기세포에 허혈자극을 가하여 얻어지는 것을 특징으로 하는, 신경 생성 촉진 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 허혈자극은 허혈 개체의 뇌조직 추출물 처리에 의한 것임을 특징으로 하는, 신경 생성 촉진 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(iPS, induced pluripotent stem cell), 성체줄기세포, 배아줄기세포, 중간엽 줄기세포, 지방줄기세포, 조혈모세포, 제대혈줄기세포 및 역분화줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신경 생성 촉진 방법.
  12. 줄기세포 유래 미세소포를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항이 있어서, 상기 퇴행성 신경 질환은 허혈성 뇌졸중, 뇌경색, 신경 외상, 파킨슨 병, 알츠하이머, 루게릭 병 및 간질로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 신경손상이 유발된, 인간을 제외한 개체에 줄기세포 유래 미세소포를 처리하는 단계; 를 포함하는 신경 손상 치료 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 신경손상은 물리적 손상 또는 퇴행성 신경 질환에 의한 신경손상인 것을 특징으로 하는, 신경 손상 치료 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 물리적 손상은 뇌외상, 척수손상, 뇌경색, 뇌출혈 및 신경외상으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신경 손상 치료 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 퇴행성 신경 질환은 허혈성 뇌졸중, 뇌경색, 신경 외상, 파킨슨 병, 알츠하이머, 루게릭 병 및 간질로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신경 손상 치료 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 인간의 제외한 개체는 쥐, 붉은 여우, 스컹크, 너구리, 오소리, 개, 늑대, 몽구스, 코요테, 흰족제비, 개 및 고양이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신경 손상 치료방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 줄기세포 유래 미세소포는 신경세포의 생성 또는 이동을 촉진시키는 것을 특징으로 하는, 신경 손상 치료 방법.
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