WO2019131720A1 - 角膜保護用の組成物 - Google Patents

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WO2019131720A1
WO2019131720A1 PCT/JP2018/047749 JP2018047749W WO2019131720A1 WO 2019131720 A1 WO2019131720 A1 WO 2019131720A1 JP 2018047749 W JP2018047749 W JP 2018047749W WO 2019131720 A1 WO2019131720 A1 WO 2019131720A1
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corneal
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naphthalene
pyridin
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華子 池田
彰 垣塚
木下　茂
中村　隆宏
真帆 永田
範子 小泉
直毅 奥村
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国立大学法人京都大学
京都府公立大学法人
学校法人同志社
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Definitions

  • the cornea is one of the tissues that make up the eye.
  • the corneal endothelial cells which are the innermost of the cornea, have a pump function and are essential for maintaining the transparency of the cornea.
  • the corneal endothelium is not mitotic and does not regenerate once it is damaged. Endothelial cells in the surrounding area compensate for the damaged area by enlarging the area, but when the number of cells is too small, the transparency of the cornea can not be maintained and visual acuity is extremely deteriorated.
  • the corneal endothelium can be impaired by surgical insults such as cataracts and glaucoma, diseases such as acute intraocular pressure increase, inflammation, trauma, Fux corneal dystrophy and the like. As the disease progresses, it is necessary to compensate for corneal endothelial cells that have been reduced by corneal transplantation (such as penetrating keratoplasty and corneal endothelial transplantation). There is no effective treatment for regenerating corneal endothelial cells or suppressing the reduction of corneal endothelial cells.
  • the corneal epithelial cells have their stem cells in the corneal limbus (the interface between the cornea and the conjunctiva) and are turnovered daily.
  • stem cells are exhausted due to trauma or conjunctival inflammatory disease, etc.
  • sufficient supply of corneal epithelial cells is not made, and corneal epithelial defect is prolonged.
  • corneal epithelial disorders are often accompanied by intense eye pain.
  • anti-inflammatory agents and the like are used to suppress the reduction of corneal epithelial cells and corneal epithelial stem cells, their effects are limited.
  • corneal preservation solutions such as Optisol-GS are usually used for preservation of donor corneas for corneal transplantation, the preservation can be performed only for about 2 weeks at the longest.
  • Certain 4-amino-naphthalene-1-sulfonic acid derivatives having VCP (valosin-containing protein) ATPase inhibitory activity include glaucoma, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, ischemic eye disease, etc. Are known to be effective in the treatment or prevention of ocular diseases of the following (Patent Documents 2 to 4, Non-patent Documents 1 and 2). In these diseases, retinal tissues and optic nerves present in the posterior segment are damaged. The effects of these agents on the cornea are not known.
  • the object of the present application is to provide a composition for corneal protection.
  • VCP inhibitors have a protective effect on corneal endothelial cells and corneal epithelial cells.
  • the present application is directed to a compound of formula (I):
  • Ra is halo, hydroxy, alkyl, halo substituted alkyl, aryl, halo or alkyl substituted aryl, alkoxy, hydroxy or carboxy substituted alkoxy, aryloxy, halo or alkyl substituted aryloxy, CHO, C (O) -alkyl, C (O Selected from the group consisting of) -aryl, C (O) -alkyl-carboxyl, C (O) -alkylene-carboxyester and cyano; m is an integer selected from 0 to 4]
  • a composition for corneal protection comprising the compound of the formula or an ester, oxide, prodrug, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • the present application provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of corneal diseases, which comprises a compound of formula (I) or an ester, oxide, prodrug, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof: Do.
  • the present application provides a composition for ocular perfusion comprising a compound of formula (I) or an ester, oxide, prodrug, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • the present application provides a composition for preservation of transplanted cornea, comprising a compound of formula (I) or an ester, oxide, prodrug, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • the present application provides a composition having a corneal protective effect.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing corneal disease, or a composition for ocular perfusion with improved corneal protective effect or a composition for preserving transplanted cornea is provided.
  • FIG. 17 shows the results of Western blot of cleaved caspase 3 and PARP in immortalized human corneal endothelial cells cultured in the presence of thapsigargin, showing that apoptosis is suppressed in the presence of KUS121.
  • FIG. 10 is an HE stained image of a section of a rabbit cornea tissue section stored for 1-4 weeks in Optisol-GS, showing that changes in corneal tissue morphology are suppressed in the presence of KUS121 or KUS187.
  • FIG. 10 is a TUNEL stained image of a rabbit corneal tissue section stored for 1-4 weeks in Optisol-GS, showing that apoptosis is suppressed in the presence of KUS121 or KUS187. Images of three fields of view are shown for each section. The propidium iodide (PI) stained image of the same visual field of FIG. 8 is shown. The percentage of TUNEL stained positive cells in tissue sections of rabbit cornea stored in Optisol-GS for 1-4 weeks is shown.
  • PI propidium iodide
  • FIG. 1 is a transmission electron micrograph of a rabbit cornea stored for 1 week in Optisol-GS. In controls, vacuolation of the corneal epithelial cells and disappearance of the microvilli and swelling of the corneal stroma and corneal endothelial cells are observed, but none are seen in the presence of KUS121.
  • Alkyl means a monovalent saturated aliphatic hydrocarbyl group having from 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms. Alkyl means, for example, straight and branched chain hydrocarbyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, t-butyl, n-pentyl and neopentyl It is not limited.
  • substituted of a group means that one or more hydrogen atoms of the group are substituted by the same or different designated substituents.
  • Alkylene means a divalent saturated aliphatic hydrocarbyl group having from 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms. Alkylene groups include branched and straight chain hydrocarbyl groups.
  • Alkoxy means a group of -O-alkyl, wherein alkyl is as defined herein. Alkoxy means, for example but not limited to, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, t-butoxy, sec-butoxy and n-pentoxy.
  • Aryl means a monovalent aromatic carbocyclic group of 6 to 14 carbon atoms having one ring (eg, phenyl) or multiple condensed rings (eg, naphthyl or anthryl). Aryl groups typically include phenyl and naphthyl.
  • Aryloxy refers to the group -O-aryl, wherein aryl is defined herein, including, for example, phenoxy and naphthoxy.
  • Cyano refers to the group -CN.
  • Carboxyl or “carboxy” means -COOH or salts thereof.
  • Carboxyl ester refers to the group -C (O) O-alkyl, wherein alkyl is as defined herein.
  • Halo means halogen, in particular fluoro, chloro, bromo and iodo.
  • Hydroxy means an -OH group.
  • substituents not explicitly defined herein is performed by naming the terminal portion of the functional group and then naming the adjacent functional group towards the point of attachment.
  • substituent "arylalkyloxycarbonyl” refers to (aryl)-(alkyl) -OC (O)-.
  • the compounds of formula (I) may exist as enantiomers or diastereomers.
  • the compounds of formula (I) may be racemic or may be separated into stereoisomerically pure components in a known manner. Certain compounds may be tautomers.
  • Ester means an ester that can be hydrolyzed in vivo, including those that are easily degraded in the human body to release the parent compound or a salt thereof.
  • Suitable ester groups are, for example, those derived from pharmaceutically acceptable aliphatic carboxylic acids, in particular those derived from alkane acids, alkeno acids, cycloalkanoic acids and alkane diacids (wherein each alkyl or alkenyl group is, for example, 6 Containing no more than one carbon atom).
  • specific esters include formic acid ester, acetic acid ester, propionic acid ester, butyric acid ester, acrylic acid ester and ethyl succinic acid ester.
  • Oxide means that the nitrogen ring atom of the heteroaryl group is oxidized to form an N-oxide.
  • Prodrugs are a reasonable benefit / suitable for use in contact with human or animal tissue without undue toxicity, irritation, allergic response, etc., within the scope of reasonable medical judgment.
  • prodrug is meant a prodrug of a compound that is balanced at the risk ratio and that is effective for the intended use.
  • Prodrugs are compounds that are rapidly transformed in vivo, for example by hydrolysis in blood, to provide the parent compound of the above formula. A general description can be found in T. Higuchi and V. Stella, Pro drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the ACS Symposium Series and Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press , 1987, each of which is incorporated herein by reference.
  • a “pharmaceutically acceptable salt” may be a salt of a compound of formula (I) with an inorganic or organic acid.
  • Preferred salts are salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid or sulfuric acid, or organic carboxylic acids or sulfonic acids such as acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, maleic acid, fumaric acid, It is a salt with malic acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid, benzoic acid or methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid or naphthalenedisulfonic acid.
  • salts are salts with conventional bases, such as alkali metal salts (eg sodium or potassium salts), alkaline earth metal salts (eg calcium or magnesium salts), or ammonia or organic amines (eg For example, diethylamine, triethylamine, ethyldiisopropylamine, procaine, dibenzylamine, N-methylmorpholine, dihydroaviethylamine, methylpiperidine, L-arginine, creatine, choline, L-lysine, ethylenediamine, benzathine, ethanolamine, meglumine or tromethamine Ammonium salts, in particular sodium salts, derived from
  • Solidvate means a compound of formula (I) that forms a complex in the solid or liquid state by coordination with solvent molecules.
  • the preferred solvate is a hydrate.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of halo, hydroxy, alkyl, halosubstituted alkyl and alkoxy.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of halo and alkyl.
  • two Ra are present, one is halo and the other is alkyl.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of hydroxy, alkyl and alkoxy.
  • three Ra are present, one is hydroxy, one is alkyl, and one is alkoxy.
  • the compounds of Formula (I) are selected from the compounds of Table 1 below:
  • the compounds of formula (I) protect corneal endothelial cells and corneal epithelial cells, have the effect of suppressing cell death, and thus can protect the cornea.
  • “protecting the cornea” or “corneal protection” refers to cell death of corneal endothelial cells and corneal epithelial cells in corneas that are in the eye of the subject or resected for transplantation.
  • corneal abnormalities eg, edema, swelling, opacification
  • the subject suffers from corneal disease It may or may not be affected.
  • a composition for corneal protection comprising a compound of formula (I).
  • a method of protecting the cornea comprising administering a compound of formula (I) to a subject in need of corneal protection.
  • a method of protecting a cornea comprising contacting the cornea with a compound of formula (I).
  • compounds of formula (I) for corneal protection are provided.
  • the use of a compound of formula (I) to protect the cornea is provided in the manufacture of a composition for corneal protection.
  • the compound of formula (I) is useful as a component such as, for example, a pharmaceutical composition for treating or preventing corneal disease, a composition for ocular perfusion, and a composition for preserving transplanted cornea is there.
  • corneal disease means a disease associated with a lesion, disorder or damage in the cornea.
  • the corneal disease may be corneal endothelial disease or corneal epithelial disease.
  • diseases that target corneal endothelial cells for example, corneal endothelium, such as drip cornea, Fux corneal dystrophy, posterior polymorphic corneal dystrophy, iris corneal endothelial syndrome or congenital corneal endothelial dystrophy, etc.
  • Viral diseases such as cytomegalovirus corneal endothelitis or herpes simplex virus corneal endothelitis, exfoliation syndrome or rejection after corneal endothelium transplantation, etc., or inflammation or physical damage associated with external factors such as corneal uveitis, Keratitis, Keratitis, Keratoplasty, Keratoplasty, Intraocular surgery (eg cataract surgery, vitrectomy, glaucoma surgery etc.), Keratoplasty, Glaucoma attack, Corneal injury with long-term contact lens wear It includes diseases such as corneal trauma or bullous keratopathy. Corneal epithelial diseases include diseases such as punctate superficial keratitis, corneal erosion, corneal ulcer, dry eye, dry keratoconjunctivitis, peripheral corneal ulcer, and corneal trauma.
  • treat or “treatment” reduces or eliminates the cause of corneal disease, delays or arrests its progression, and in subjects suffering from corneal disease, and And / or to reduce, alleviate, ameliorate or eliminate the condition.
  • preventing prevents the onset of corneal disease in a subject, particularly in a subject that is likely to suffer from corneal disease but is not yet affected Or to reduce the possibility of suffering from corneal disease.
  • Subjects who may suffer from corneal disease but are not yet affected include, for example, subjects with a genetic predisposition to corneal disease such as Fux corneal dystrophy or posterior polymorphic corneal dystrophy, subjects with causes of corneal disease Is included.
  • causes of corneal disease include internal eye surgery (for example, cataract surgery, vitreous surgery, glaucoma surgery, etc.), corneal transplantation, laser treatment, rapid intraocular pressure increase, inflammation, trauma, conjunctival inflammation and the like.
  • Subjects for treatment or prevention of corneal diseases include animals, typically mammals (eg, humans, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys, etc.), particularly humans.
  • mammals eg, humans, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys, etc.
  • the administration method of the pharmaceutical composition is not particularly limited, but general administration routes such as oral administration, parenteral administration, injection, infusion, infusion, instillation, in the anterior chamber, intravitreal administration and the like can be used, and the composition And may be suitable dosage forms for each administration route.
  • Dosage forms for oral administration include granules, fine granules, powders, coated tablets, tablets, suppositories, powders, capsules, microcapsules, chewables, solutions, suspensions, emulsions, etc. .
  • a dosage form for administration by injection a general dosage form of pharmaceutical preparation such as intravenous injection, drip infusion, intraocular injection, a preparation for prolonging the release of the active substance and the like can be adopted.
  • Dosage forms for eye drops include solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • dosage forms are manufactured by formulating in a conventional manner.
  • various pharmaceutically acceptable substances for formulation can be formulated according to the need for formulation.
  • the substance for formulation can be appropriately selected depending on the dosage form of the preparation, but for example, buffer, surfactant, stabilizer, preservative, excipient, excipient, diluent, additive, disintegrant, binder, A coating agent, a lubricant, a lubricant, a flavor agent, a sweetening agent, a solubilizer, etc. are mentioned.
  • the pharmaceutical composition is an eye drop.
  • Eye drops are typically isotonicity agents such as sodium chloride, concentrated glycerin etc .; buffering agents such as sodium phosphate, sodium acetate etc .; polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyl stearate 40, polyoxyethylene hardened castor Surfactants such as oil; Stabilizers such as sodium citrate and sodium edetate; Preservatives such as benzalkonium chloride and paraben etc. can be used, but the ingredients of eye drops are not limited to these .
  • the pH may be within the range acceptable for the ophthalmic preparation, for example, within the range of pH 4-8.
  • the pharmaceutical composition may be ocular perfusate or may be in the form of a composition for addition to ocular perfusate.
  • the pharmaceutical composition may be a preservation solution for transplanting cornea, or may be in the form of a composition for addition to the preservation solution for transplanting cornea. The details of these dosage forms are as described later.
  • the dosage and frequency of administration of the pharmaceutical composition is such that the species of animal to be administered, the health condition of the subject, age, weight, route of administration, and administration mode such that an effective amount of the compound of formula (I) is administered to the subject.
  • the effective amount in certain circumstances can be readily determined by routine experimentation and is within the skill and judgment of the ordinary clinician.
  • about 0.001 to about 1000 mg / kg body weight / day, about 0.01 to about 300 mg / kg body weight / day, about 0.1 to about 100 mg / kg body weight / day, or about 1. From 0 to about 30 mg / kg body weight / day of a compound of formula (I) may be administered.
  • the formula (I) of about 0.01 to about 100 ⁇ g / kg body weight / day, about 0.1 to about 10 ⁇ g / kg body weight / day, or about 0.3 to about 3 ⁇ g / kg body weight / day can be administered.
  • the compounds of formula (I) can be administered one or more times daily, for example twice, three times or four times daily.
  • the compounds of the formula (I) can be used alone or in combination with one or more further active ingredients, in particular for the treatment or prophylaxis of corneal diseases.
  • the pharmaceutical composition may comprise, in addition to the compound of formula (I), one or more further active ingredients.
  • “Combining” the components not only uses the dosage form containing all the components and the combination of dosage forms containing each component separately, but also uses them for the prevention and / or treatment of corneal diseases As far as possible, it also means that each component is administered simultaneously or with delayed administration of either component. It is also possible to use two or more further active ingredients in combination. Active ingredients suitable for use in combination include, for example, anti-inflammatory agents, antibacterial agents, antifungal agents, immunosuppressive agents, antiviral agents.
  • treatments for ocular diseases other than drug therapy may also be practiced. Suitable treatments include, for example, surgery, photodynamic therapy, gene therapy, regenerative medicine, corneal transplantation, laser therapy.
  • a method of treating or preventing corneal disease comprising administering a compound of formula (I) to a subject in need of treating or preventing corneal disease.
  • a compound of formula (I) for the treatment or prophylaxis of corneal disease.
  • a compound of Formula (I) for the treatment or prevention of a corneal disease.
  • a compound of Formula (I) in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of corneal disease.
  • an eye perfusion solution is usually used for the purpose of eye perfusion and cleansing.
  • corneal disorders such as corneal edema and corneal opacification may occur.
  • the addition of the compound of formula (I) to the eye perfusion solution can protect the cornea and prevent corneal diseases.
  • the composition for ocular perfusion may be a solid, semi-solid or liquid dosage form, and may be provided as an ready-to-use ocular perfusion solution, provided as a composition for addition to other ocular perfusion solutions It is also good.
  • the other components contained in the composition may be equivalent to the existing eye perfusion solution, preferably a component close to aqueous humor, glutathiones such as oxyglutathione, antibiotics You may contain components, such as a substance.
  • existing eye perfusion solutions for example, physiological saline, lactated Ringer's solution, BSS PLUS (trade name), Opguard (trade name), oxyglutathione eye reflux (trade name), etc. are known, but are limited thereto I will not.
  • the composition may contain any component as long as the function and safety of the ocular perfusion solution are not impaired.
  • the composition for ocular perfusion may contain the compound of formula (I) at an effective concentration when used as an ocular perfusion solution.
  • the effective concentration of the compound of formula (I) at the time of use may be, for example, 0.1 ⁇ M to 10 mM, 1 ⁇ M to 1 mM, 2 ⁇ M to 200 ⁇ M, 5 ⁇ M to 100 ⁇ M or 10 ⁇ M to 100 ⁇ M.
  • a method of performing ocular perfusion of a subject undergoing ocular surgery comprising using an ocular perfusion solution comprising an effective amount of a compound of formula (I).
  • a method of protecting a cornea of a subject comprising eye perfusion using an eye perfusion solution comprising an effective amount of a compound of Formula (I) in a subject undergoing eye surgery.
  • a compound of Formula (I) for use in ocular perfusion comprising a compound of formula (I) for protecting the cornea during ocular perfusion.
  • provided is the use of a compound of Formula (I) for ocular perfusion.
  • composition for preservation of transplanted cornea In the case of corneal transplant, it is necessary to preserve the cornea (transplanted cornea) provided by the cornea donor (donor) until the time of transplant surgery to a patient.
  • the cornea By adding the compound of formula (I) to the corneal preservation solution, the cornea can be protected and preserved in a better condition.
  • the composition for transplanted corneal preservation may be a solid, semi-solid or liquid dosage form and may be provided as a ready-to-use corneal preservation solution, provided as a composition for addition to other corneal preservation solutions May be When provided as a corneal preservation solution, other components contained in the composition may be equivalent to existing corneal preservation solution, for example, basic medium, buffer, chondroitin sulfate, dextran, vitamins, ATP precursor You may contain components, such as a body and an antibiotic.
  • corneal preservation solutions examples include M199 medium, MEM ⁇ medium, MK medium, CSM medium, CSMD medium, DMEM / F-12 medium, Optisol-GS (trade name), K-Sol (trade name), EP2 (trade name)
  • trade names are known, the present invention is not limited thereto.
  • the composition may contain any component as long as the function and safety of the corneal preservation solution are not impaired.
  • the composition for transplanted cornea preservation may contain the compound of the formula (I) at an effective concentration when used as a cornea preservation solution.
  • the effective concentration of the compound of formula (I) at the time of use may be, for example, 0.1 ⁇ M to 10 mM, 1 ⁇ M to 1 mM, 2 ⁇ M to 200 ⁇ M, 5 ⁇ M to 100 ⁇ M or 10 ⁇ M to 100 ⁇ M.
  • a method of preserving a transplanted cornea comprising preserving the transplanted cornea in a corneal preservation solution comprising an effective amount of a compound of formula (I).
  • a method of protecting a transplanted cornea comprising preserving the transplanted cornea in a corneal preservation solution comprising an effective amount of a compound of formula (I).
  • a compound of Formula (I) for preserving a transplanted cornea is provided for protecting the cornea upon storage of the transplanted cornea.
  • a compound of Formula (I) for transplanted corneal preservation.
  • Ra is halo, hydroxy, alkyl, halo substituted alkyl, aryl, halo or alkyl substituted aryl, alkoxy, hydroxy or carboxy substituted alkoxy, aryloxy, halo or alkyl substituted aryloxy, CHO, C (O) -alkyl, C (O Selected from the group consisting of) -aryl, C (O) -alkyl-carboxyl, C (O) -alkylene-carboxyester and cyano; m is an integer selected from 0 to 4]
  • a composition for protecting the cornea comprising: a compound of the following: or an ester, oxide, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of halo, hydroxy, alkyl, halo-substituted alkyl and alkoxy.
  • the composition according to item 1 or 2 wherein Ra is each independently selected from the group consisting of halo and alkyl.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of hydroxy, alkyl and alkoxy.
  • composition according to item 1 wherein the compound of formula (I) is selected from the compounds listed in Table 1.
  • the compound of the formula (I) is 4-amino-3- [6- (4-fluoro-2-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid or 4-amino-3
  • the composition according to paragraphs 1, 2 or 7 which is-[6- (3-formyl-2-butoxy-5-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid.
  • the compound of the formula (I) is 4-amino-3- [6- (4-fluoro-2-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid, A composition according to any of paragraphs 4, 7 and 8.
  • Items 1 to 4 and 7 including [10] 4-amino-3- [6- (4-fluoro-2-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid sodium salt A composition according to any of the preceding items.
  • composition according to any one of Items 1 to 12, for the treatment or prevention of a corneal disease for the treatment or prevention of a corneal disease.
  • the corneal disease is a corneal endothelial disease.
  • Corneal endothelium diseases include: Dwarf cornea, Fuchs corneal dystrophy, posterior polymorphic corneal dystrophy, iris corneal endothelial syndrome, congenital hereditary corneal endothelial dystrophy, cytomegalovirus corneal endothelitis, herpes simplex virus corneal endothelitis, Exfoliation syndrome, rejection after corneal endothelium transplantation, corneal uveitis, keratitis, corneal endothelitis, corneal injury after corneal transplantation, corneal surgery after intraocular surgery, glaucoma attack, corneal injury by contact lens long-term wearing, corneal trauma, The composition according to claim 14, which is at delivery corneal trauma or bullous keratopathy.
  • composition according to item 14 or 15 wherein the corneal endothelial disease is Fux corneal dystrophy or blister keratopathy.
  • the corneal disease is a corneal epithelial disease.
  • the corneal epithelial disease is punctate superficial keratitis, corneal erosion, corneal ulcer, dry eye, dry keratoconjunctivitis, peripheral corneal ulcer or corneal trauma.
  • Corneal disease may include dripping cornea, Fuchs corneal dystrophy, posterior polymorphic corneal dystrophy, iris corneal endothelial syndrome, congenital hereditary corneal endothelial dystrophy, cytomegalovirus corneal endothelitis, herpes simplex virus corneal endothelitis, desquamation Syndrome, rejection after corneal endothelium transplantation, corneal uveitis, keratitis, corneal endothelitis, corneal injury after corneal transplantation, corneal injury after intraocular surgery, glaucoma attack, corneal injury by contact lens long-term wearing, corneal injury, parturition
  • composition according to Item 13 or 19, wherein the corneal disease is Fuchs corneal dystrophy, blister keratopathy, corneal erosion, dry eye or corneal trauma.
  • Ra is halo, hydroxy, alkyl, halo substituted alkyl, aryl, halo or alkyl substituted aryl, alkoxy, hydroxy or carboxy substituted alkoxy, aryloxy, halo or alkyl substituted aryloxy, CHO, C (O) -alkyl, C (O Selected from the group consisting of) -aryl, C (O) -alkyl-carboxyl, C (O) -alkylene-carboxyester and cyano; m is an integer selected from 0 to 4] Or a pharmaceutical composition for treating or preventing corneal disease, which comprises an ester, oxide, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of halo, hydroxy, alkyl, halo-substituted alkyl and alkoxy.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of hydroxy, alkyl and alkoxy.
  • the compound of the formula (I) is 4-amino-3- [6- (4-fluoro-2-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid or 4-amino-3
  • the compound of formula (I) is 4-amino-3- [6- (4-fluoro-2-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid, according to item 24.
  • the compound of formula (I) is 4-amino-3- [6- (3-formyl-2-butoxy-5-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid, 24. A composition according to any of paragraphs 24, 25 and 28-31. [35] Item 24, 25 containing [35] 4-amino-3- [6- (3-formyl-2-butoxy-5-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid sodium salt , A composition according to any of items 28 to 31 and 34.
  • Corneal endothelium diseases include: Dwarf cornea, Fuchs corneal dystrophy, posterior polymorphic corneal dystrophy, iris corneal endothelial syndrome, congenital hereditary corneal endothelial dystrophy, cytomegalovirus corneal endothelitis, herpes simplex virus corneal endothelitis, Exfoliation syndrome, rejection after corneal endothelium transplantation, corneal uveitis, keratitis, corneal injury after cataract surgery, corneal injury after corneal transplantation, corneal injury after retinal surgery, corneal injury after retinal surgery, corneal injury after vitrectomy, corneal injury after glaucoma surgery, 37.
  • composition according to item 36 which is a glaucomatous attack, corneal damage by contact lens long-term wearing, corneal injury, corneal injury at delivery or bullous keratopathy.
  • the composition according to paragraph 36 or 37 wherein the corneal endothelial disease is Fux corneal dystrophy or blister keratopathy.
  • the corneal epithelial disease is corneal erosion, dry eye or corneal trauma.
  • Corneal disease may include dripping cornea, Fuchs corneal dystrophy, posterior polymorphic corneal dystrophy, iris corneal endothelial syndrome, congenital hereditary corneal endothelial dystrophy, cytomegalovirus corneal endothelitis, herpes simplex virus corneal endothelitis, desquamation Syndrome, rejection after corneal endothelium transplantation, corneal uveitis, keratitis, corneal injury after cataract surgery, corneal injury after corneal transplantation, corneal injury after retinal surgery, corneal injury after vitrectomy, corneal injury after vitrectomy, corneal injury after glaucoma surgery, glaucoma surgery.
  • the composition according to any one of the items 24 to 35, which is seizure, corneal damage by contact lens long-term wearing, corneal trauma, corneal trauma during delivery, bullous keratopathy, corneal erosion, or dry eye.
  • composition according to any one of the items 24 to 35 and 41, wherein the corneal disease is Fuchs corneal dystrophy, blister keratopathy, corneal erosion, dry eye or corneal trauma.
  • the composition according to any one of the items 24 to 42 which is an eye drop.
  • the composition according to any one of items 24 to 42 which is a composition for addition to an eye perfusion solution or an eye perfusion solution.
  • the composition according to any one of the items 24 to 42 which is a composition for addition to a transplanting corneal preservation solution or a transplanting corneal preservation solution.
  • Ra is halo, hydroxy, alkyl, halo substituted alkyl, aryl, halo or alkyl substituted aryl, alkoxy, hydroxy or carboxy substituted alkoxy, aryloxy, halo or alkyl substituted aryloxy, CHO, C (O) -alkyl, C (O Selected from the group consisting of) -aryl, C (O) -alkyl-carboxyl, C (O) -alkylene-carboxyester and cyano; m is an integer selected from 0 to 4] Or a composition for ocular perfusion, comprising an ester, oxide, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of halo, hydroxy, alkyl, halo substituted alkyl and alkoxy.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of halo and alkyl.
  • two Ras are present, one is halo and the other is alkyl.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of hydroxy, alkyl and alkoxy.
  • there are 3 Ras one is hydroxy, one is alkyl and one is alkoxy.
  • composition according to paragraph 46 wherein the compound of formula (I) is selected from the compounds listed in Table 1.
  • the compound of the formula (I) is 4-amino-3- [6- (4-fluoro-2-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid or 4-amino-3
  • the composition according to paragraph 46, 47 or 52 which is-[6- (3-formyl-2-butoxy-5-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid.
  • Ra is halo, hydroxy, alkyl, halo substituted alkyl, aryl, halo or alkyl substituted aryl, alkoxy, hydroxy or carboxy substituted alkoxy, aryloxy, halo or alkyl substituted aryloxy, CHO, C (O) -alkyl, C (O Selected from the group consisting of) -aryl, C (O) -alkyl-carboxyl, C (O) -alkylene-carboxyester and cyano; m is an integer selected from 0 to 4] Or a composition for preserving a transplanted cornea, comprising an ester, oxide, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • composition according to item 60 wherein R a is each independently selected from the group consisting of halo, hydroxy, alkyl, halo substituted alkyl and alkoxy.
  • R a is each independently selected from the group consisting of halo, hydroxy, alkyl, halo substituted alkyl and alkoxy.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of halo and alkyl.
  • there are two Ras, one is halo and the other is alkyl.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of hydroxy, alkyl and alkoxy.
  • the compound of the formula (I) is 4-amino-3- [6- (4-fluoro-2-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid or 4-amino-3
  • the compounds of formula 60, wherein the compound of the formula (I) is 4-amino-3- [6- (4-fluoro-2-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid 63.
  • a composition according to any of paragraphs 63, 66 and 67 [69] Sections 60 to 63 and 66, including 4-amino-3- [6- (4-fluoro-2-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid sodium salt 68. A composition according to any of the preceding clauses. [70] a compound of formula (I), which is 4-amino-3- [6- (3-formyl-2-butoxy-5-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid, A composition according to any of paragraphs 60, 61 and 64-67.
  • Articles 60, 61 including 4-amino-3- [6- (3-formyl-2-butoxy-5-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid sodium salt , A composition according to any of paragraphs 64 to 67 and 70.
  • the composition according to any one of paragraphs 60 to 71 which is a preservation solution for transplanted cornea.
  • the composition according to any one of paragraphs 60 to 71 which is a composition for addition to a stock solution for transplantation cornea.
  • KUS 121 4-amino-3- [6- (4-fluoro-2-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid sodium salt
  • KUS 187 4-amino-3- [6- (3-formyl -2-Butoxy-5-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid sodium salt
  • KUS121 and KUS187 were prepared according to the method described in WO 2012/014994.
  • Test 1 Effect on rabbit cultured corneal endothelial cells Endothelial cells are scraped and collected mechanically using a crescent knife from a cornea which is excised and cut off from the whole eye (funakoshi) of a Japanese white rabbit with a scissors. Primary cultures were performed in DMEM containing 10% fetal bovine serum and 2 ng / ml bFGF. When subconfluent, cells were harvested using trypsin, an equal volume (4 ⁇ 10 4 cells / well) was passaged to a 12-well plate, and cultured in the above medium for 24 hours.
  • control (the above medium + DMSO), (2) above medium + KUS121 (50 ⁇ M), (3) above medium + antimycin (20 ⁇ M), (4) above medium + antimycin (20 ⁇ M) + KUS121 (50 ⁇ M), (5) the above medium + oligomycin (10 ⁇ M), (6) the above medium + oligomycin (10 ⁇ M) + KUS121 (50 ⁇ M), (7) DMEM containing 2 ng / ml bFGF (glucose free), (8) DMEM containing 2 ng / ml bFGF The medium was changed to a glucose-free) + KUS121 (50 ⁇ M) medium, and culture was continued.
  • FIG. 1 is a phase contrast microscopic image of cells 28 hours after drug addition. Treatment with antimycin or oligomycin induces cell death of corneal endothelial cells, but the cell death is suppressed in the presence of KUS121 (50 ⁇ M).
  • FIG. 2 is a phase contrast microscopic image of cells cultured in the absence of glucose and 96 hours after drug addition. Culturing in the absence of glucose induced cell death of corneal endothelial cells, but suppressed the cell death in the presence of KUS121 (50 ⁇ M).
  • FIG. 3 shows the results of measurement of intracellular ATP concentration. Intracellular ATP concentration decreased in cells treated with antimycin or oligomycin for 27 hours and cells cultured in the absence of glucose for 96 hours, but in the presence of KUS121, the decrease in intracellular ATP concentration was suppressed.
  • Test 2 Effect on human normal donor cornea-derived corneal endothelial cells Corneal endothelial cells were detached from the research corneas imported from Seattle Eye Bank together with Descemet's membrane which is a basement membrane, to become Optisol-GS (Bosh Lomb), a corneal preservation solution. Soaked. Thereafter, collagenase treatment was carried out to enzymatically recover corneal endothelial cells and culture.
  • the culture medium used was 10 ⁇ M SB203580 (Funakoshi, 13067) and 1 ⁇ M SB431542 (Wako, 192-) after adding 10% fetal bovine serum (FBS) to OptiMEM (Gibco, 31985070) and acclimating in 3T3 cells for 24 hours. 16541) is added.
  • the corneal endothelial cells were immortalized by the following procedure.
  • the SV40 large T antigen and the hTERT gene were amplified by PCR and introduced into a lentiviral vector (pLenti6.3_V5-TOPO; Life Technologies Inc.).
  • the lentiviral vector is then transfected with 293T cells (RCB 2202; Riken using transfection reagents (Fugene HD; Promega Corp., Madison, WI) with three helper plasmids (pLP1, pLP2, pLP / VSVG; Life Technologies Inc.). Infected with Bioresource Center, Ibaraki, Japan).
  • the virus-containing culture supernatant was recovered and added to the culture solution of the above-mentioned cultured corneal endothelial cells using 5 ⁇ g / ml polybrene to introduce the SV40 large T antigen and hTERT gene.
  • the phase contrast microscopic image of the immortalized cell line (iHCEC) of normal corneal endothelial cells thus obtained was confirmed, it had one more polygonal morphology like normal corneal endothelial cells.
  • iHCEC was subjected to maintenance culture with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) + 10% fetal bovine serum (FBS).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the culture medium was removed from the culture dishes in which immortalized human corneal endothelial cells were cultured, and 1 ⁇ PBS ( ⁇ ) prewarmed to 37 ° C. was added and washing was performed. This work was repeated twice. Again 1 ⁇ PBS ( ⁇ ) was added and incubated for 3 minutes at 37 ° C. (5% CO 2 ). After PBS ( ⁇ ) removal, 0.05% Trypsin-EDTA (Nacalai Tesque, 322778-34) was added and incubated for 5 minutes at 37 ° C. (5% CO 2 ). Then, the cells were collected by suspending in a medium and centrifuging at 1500 rpm for 3 minutes. Medium: DMEM (Nacalai Tesque, 08456-36) + 10% FBS (Biowest, S1820-500) + 1% P / S (Nacalai Tesque, 26252-94)
  • Immortalized human corneal endothelial cells (lot: iHCEC1-1) were seeded at 7 ⁇ 10 4 cells / well in a 12-well plate, and cultured at 37 ° C. (5% CO 2 ) for 24 hours.
  • DMEM + 2% FBS + 1% P / S After 24 hours, the medium was removed, a medium containing 10 ⁇ M thapsigargin (Wako, 209-17281) and KUS121 (10 ⁇ M, 25 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M) was added, and culture was carried out for 8 hours.
  • DMEM + 2% FBS + 1% P / S After 24 hours, the medium was removed, a medium containing 10 ⁇ M thapsigargin (Wako, 209-17281) and KUS121 (10 ⁇ M, 25 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M) was added, and culture was carried out for 8 hours.
  • DMEM + 2% FBS + 1% P / S After 24 hours, the medium was removed, a medium containing 10 ⁇ M thapsigargin (Wako, 209-17281) and KUS121 (10 ⁇ M, 25 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M) was added, and culture was carried
  • the collected solution was triturated three times for 30 seconds in cold water using an ultrasonic device (BIORUPTOR, manufactured by TOSHO DENKI), and centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to recover a protein supernatant.
  • BIOUPTOR manufactured by TOSHO DENKI
  • the primary antibody used was rabbit anti-caspase 3 antibody (Cell Signaling, 9662), rabbit anti-PARP antibody (Cell Signaling, 9542), and mouse anti-GAPDH antibody (MBL, M171-3).
  • an anti-rabbit antibody labeled with peroxidase and an anti-mouse antibody (GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V) were used.
  • the primary antibody was a rabbit anti-caspase 3 antibody: diluted 1: 1000, the rabbit anti-PARP antibody: diluted 1: 1000, the mouse anti-GAPDH antibody: diluted 3000 times, and the secondary antibody was diluted 5000 times.
  • Chemi Lumi ONE Ultra (Nacalai Tesque, 11644-40) was used for detection.
  • the intensity of the detected band was analyzed by lumina image analyzer LAS-4000 mini (Fuji Film Co., Ltd.) and ImageQuantTM software (GE Healthcare).
  • Test 3 Effect on rabbit cornea The Japanese white rabbit was euthanized, the whole eye was removed, and a scleral piece was made using a scissors. Using 4 (1) Optisol-GS (control), (2) Optisol-GS + KUS121 (50 ⁇ M) or (3) Optisol-GS + KUS 187 (20 ⁇ M) as storage solution, 4 sclera pieces at 4 ° C for each condition. I saved it for a week. The tissues were embedded and sliced over time.
  • KUS121 and KUS187 are suggested to have a protective effect on corneal epithelial cells and corneal endothelial cells.
  • FIG. 8 shows propidium iodide (PI) -stained images in the same field of view.
  • Total corneal epithelial cells stained with PI and TUNEL stained positive cells were counted, the percentage of TUNEL stained positive cells was calculated, and changes over time were compared (FIG. 10).
  • the number of TUNEL positive apoptotic cells increased in the corneal epithelial cells after 1 week, but the apoptosis was suppressed in the KUS121 or KUS187 addition group.
  • the KUS121 or KUS187 group there were less TUNEL staining of corneal epithelial cells throughout the period as compared to the control group. It is suggested that KUS121 and KUS187 have an apoptosis-suppressing effect on corneal epithelial cells.
  • FIG. 11 shows a PI-stained image of the same field of view.
  • KUS121 or 187 group there was less change in corneal endothelial cells from one week as compared to the control group. It is suggested that KUS121 and KUS187 have a protective effect on corneal endothelial cells from an early stage.
  • the cornea stored for 1 week was immersed in 4% of 2% glutaraldehyde (0.1 M phosphate buffer) as pre-fix. As a wash, it was immersed in 0.1 M phosphate buffer overnight at 4 ° C. As post-fixing, it was immersed in 2% osmium aqueous solution for 3 hours at 4 ° C. As dehydration, it was sequentially changed to high concentration ethanol (50, 70, 90, 100, 100, 100%) at 4 ° C. (only 50%) and room temperature for 15 minutes each. As a substitution, it was changed to propylene oxide at room temperature for 45 minutes, and then changed to a mixture of propylene oxide + epoxy resin for 1.5 hours at room temperature.
  • high concentration ethanol 50, 70, 90, 100, 100, 100%
  • an epoxy resin was put in a capsule together with a sample for 48 hours at 60 ° C. and cured. Thereafter, 80-90 nm sections were prepared with an ultramicrotome and loaded on 200 mesh. The sections were stained with 2% uranyl acetate, a lead stain, and reinforced with carbon deposition (reinforcement of sections to electron beam). The samples were observed with a transmission electron microscope and photographed (FIG. 13).
  • KUS121 and KUS187 have a protective effect on the corneal endothelial cells and corneal epithelial cells, and a cell death suppressive effect, and the corneal endothelial cells in which the cell death is suppressed have normal pump function and the cornea It was found to suppress the edema of the
  • composition of the present application is expected to be widely used in the ophthalmologic area.

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Abstract

本願発明者らは、ある種のＶＣＰ阻害剤が、角膜内皮細胞および角膜上皮細胞の保護効果を有することを見出した。従って、本開示は、式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、角膜保護用の組成物を提供する。別の態様として、前記化合物を含む角膜疾患の処置および／または予防用の医薬組成物を提供する。さらなる態様として、前記化合物を含む眼灌流用の組成物を提供する。またさらなる態様として、前記化合物を含む移植角膜保存用の組成物を提供する。

Description

角膜保護用の組成物
　本特許出願は、日本国特許出願第２０１７－２５１８３９について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本願は、角膜保護用の組成物に関する。
　角膜は、眼を構成する組織の一つである。角膜の最も内側にある角膜内皮細胞は、ポンプ機能を持ち、角膜の透明性を維持するために必須である。角膜内皮には***能がなく、一度障害を受けると再生しない。障害を受けた部分は周りの内皮細胞が面積を拡大して補うが、細胞数が少なくなりすぎると角膜の透明性が保てなくなり、視力が極端に悪化する。
　角膜内皮は、白内障や緑内障などの手術侵襲、急激な眼圧上昇、炎症、外傷、フックス角膜ジストロフィーなどの疾患によって障害され得る。病状が進行すれば、角膜移植（全層角膜移植や角膜内皮移植など）により減少した角膜内皮細胞を補うことが必要となる。角膜内皮細胞を再生させたり、角膜内皮細胞の減少を抑制したりする有効な治療法はない。
　角膜上皮細胞は、角膜輪部（角膜と結膜の境界部分）にその幹細胞が存在し、日々ターンオーバーをしている。しかしながら、外傷や結膜炎症疾患などによって幹細胞が疲弊すると、角膜上皮細胞の十分な供給がなされず、角膜上皮欠損が遷延する。その結果、角膜透明性の維持が困難となり、角膜上皮の結膜化をきたし、視力が低下する。また、角膜上皮障害は、しばしば強い眼痛を伴う。角膜上皮細胞および角膜上皮幹細胞の減少を抑制するために抗炎症剤などが使用されるが、その効果は限定的である。
　眼手術や角膜移植の際には、角膜の保護が必要とされる。現在、眼手術時に使用される眼灌流液として、角膜内皮細胞および網膜細胞を保護するために、グルタチオンが添加されている製品がある。一方、角膜移植用のドナー角膜の保存には、通常、Optisol-GS等の角膜保存液を使用するが、最長でも２週間程度しか保存ができない。
　このように、角膜を保護し、角膜疾患を処置または予防することに対して、多面的な要望がある。
　ＶＣＰ（valosin-containing protein）ＡＴＰａｓｅ阻害活性を有するある種の４－アミノ－ナフタレン－１－スルホン酸誘導体（特許文献１）は、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、虚血性眼疾患などの眼疾患の処置または予防に有効であることが知られている（特許文献２～４、非特許文献１および２）。これらの疾患では、後眼部に存在する網膜組織や視神経が損傷を受ける。角膜に対するこれらの薬剤の効果は知られていない。
国際公開第２０１２／０１４９９４号パンフレット 国際公開第２０１２／０４３８９１号パンフレット 国際公開第２０１４／１２９４９５号パンフレット 国際公開第２０１５／１２９８０９号パンフレット
池田華子 他著、Sci Rep 4, 5970, 2014 中野紀子 他著、Heliyon 2, e00096, 2016
　本願の目的は、角膜保護用の組成物を提供することである。
　本発明者らは、ＶＣＰ阻害剤が、角膜内皮細胞および角膜上皮細胞の保護効果を有することを見出した。
　従って、ある態様では、本願は、式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０～４から選択される整数である〕
の化合物またはそのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、角膜保護用の組成物を提供する。
　別の態様では、本願は、式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、角膜疾患の処置または予防用の医薬組成物を提供する。
　別の態様では、本願は、式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、眼灌流用の組成物を提供する。
　別の態様では、本願は、式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、移植角膜保存用の組成物を提供する。
　本願により、角膜保護効果を有する組成物が提供される。具体的には、例えば、角膜疾患の処置または予防用の医薬組成物、あるいは、角膜保護効果が改善された眼灌流用の組成物または移植角膜保存用の組成物が提供される。
アンチマイシンまたはオリゴマイシン存在下で培養したウサギ角膜内皮細胞の位相差顕微鏡像であり、ＫＵＳ１２１の細胞保護効果を示す。 無グルコース下で培養したウサギ角膜内皮細胞の位相差顕微鏡像であり、ＫＵＳ１２１の細胞保護効果を示す。 アンチマイシンまたはオリゴマイシン存在下または無グルコース下で培養したウサギ角膜内皮細胞の細胞内ＡＴＰ濃度の測定結果であり、ＫＵＳ１２１の存在下では細胞内ＡＴＰ濃度の減少が抑制されることを示す。 タプシガルジン存在下で培養した不死化ヒト角膜内皮細胞の細胞形態およびアポトーシスを示す位相差顕微鏡像であり、ＫＵＳ１２１の細胞障害抑制効果を示す。 タプシガルジン存在下で培養した不死化ヒト角膜内皮細胞における、切断カスパーゼ３およびＰＡＲＰのウェスタンブロットの結果であり、ＫＵＳ１２１の存在下ではアポトーシスが抑制されることを示す。 Optisol-GS中で１～４週間にわたり保存したウサギ角膜の組織切片のＨＥ染色像であり、ＫＵＳ１２１またはＫＵＳ１８７の存在下では、角膜組織形態の変化が抑制されることを示す。 Optisol-GS中で１～４週間にわたり保存したウサギ角膜の中央部の角膜厚を計測した結果であり、ＫＵＳ１２１またはＫＵＳ１８７の存在下では、角膜の膨化が抑制されることを示す。 Optisol-GS中で１～４週間にわたり保存したウサギ角膜の組織切片のＴＵＮＥＬ染色像であり、ＫＵＳ１２１またはＫＵＳ１８７の存在下ではアポトーシスが抑制されることを示す。各切片につき、３視野の画像を示す。 図８と同視野のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色像を示す。 Optisol-GS中で１～４週間にわたり保存したウサギ角膜の組織切片におけるＴＵＮＥＬ染色陽性細胞率を示す。ＫＵＳ１２１またはＫＵＳ１８７の存在下では、全期間を通して、コントロール群と比べてＴＵＮＥＬ染色陽性細胞率が低い。 Optisol-GS中で１～４週間にわたり保存したウサギ角膜の組織切片のＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ染色像であり、ＫＵＳ１２１または１８７の存在下では、コントロール群に比べて１週から角膜内皮細胞の変化が少ないことを示す。 図１１と同視野のＰＩ染色像を示す。 Optisol-GS中で１週間にわたり保存したウサギ角膜の透過型電子顕微鏡写真である。コントロールでは、角膜上皮細胞の空胞化および微絨毛（microvilli）の消失、並びに、角膜実質および角膜内皮細胞の膨潤化が見られるが、ＫＵＳ１２１の存在下ではいずれも見られない。
　本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　「アルキル」は、１～１０個の炭素原子、好ましくは１～６個の炭素原子を有する、１価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。アルキルは、例えば直鎖および分枝鎖ヒドロカルビル基、例えばメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチルおよびネオペンチルを意味するが、これらに限定されない。
　基の接頭語「置換」は、当該基の１個以上の水素原子が、同一または異なる指定する置換基によって置換されていることを意味する。
　「アルキレン」は、１～１０個の炭素原子、好ましくは１～６個の炭素原子を有する、２価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。アルキレン基は、分枝鎖および直鎖ヒドロカルビル基を含む。
　「アルコキシ」は、－Ｏ－アルキル（ここで、アルキルは本明細書に定義されている）の基を意味する。アルコキシは、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシおよびｎ－ペントキシを意味するが、これらに限定されない。
　「アリール」は１個の環（例えばフェニル）または複数の縮合環（例えばナフチルまたはアントリル）を有する６～１４個の炭素原子の１価芳香族性炭素環式基を意味する。アリール基は典型的には、フェニルおよびナフチルを含む。
　「アリールオキシ」は、－Ｏ－アリール（ここで、アリールは本明細書に定義されている）の基を意味し、例えばフェノキシおよびナフトキシを含む。
　「シアノ」は、－ＣＮの基を意味する。
　「カルボキシル」または「カルボキシ」は－ＣＯＯＨまたはその塩を意味する。
　「カルボキシエステル」は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキル（ここで、アルキルは本明細書に定義されている）の基を意味する。
　「ハロ」は、ハロゲン、特に、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。
　「ヒドロキシ」は－ＯＨの基を意味する。
　特に定めのない限り、本明細書において明示的に定義されていない置換基の命名法は、官能基の末端部分を命名し、次いで結合点に向かって隣接する官能基を命名して行う。例えば、置換基「アリールアルキルオキシカルボニル」は、（アリール）－（アルキル）－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－を意味する。
　式（Ｉ）の化合物には、置換パターンによっては、エナンチオマーまたはジアステレオマーが存在し得る。式（Ｉ）の化合物は、ラセミ体であってもよく、既知方法で立体異性的に純粋な成分に分離したものであってもよい。ある種の化合物は、互変異性体であり得る。
　「エステル」は、インビボで加水分解され得るエステルを意味し、人体で容易に分解されて親化合物またはその塩を放出するものを含む。好適なエステル基は、例えば、薬学的に許容し得る脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカン二酸に由来するもの（ここで、各アルキルまたはアルケニル基は、例えば６個以下の炭素原子を有する）を含む。具体的なエステルの例には、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、ブチル酸エステル、アクリル酸エステルおよびエチルコハク酸エステルが含まれる。
　「オキシド」は、ヘテロアリール基の窒素環原子が酸化され、Ｎ－オキシドを形成しているものを意味する。
　「プロドラッグ」は、合理的な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー性応答等なくヒトまたは動物の組織と接触させて使用するのに適した、合理的な利益／危険比で釣り合った、そして意図した使用に有効な化合物のプロドラッグを意味する。プロドラッグは、インビボで速やかに、例えば血中で加水分解によって変換されて、上記式の親化合物をもたらす化合物である。一般的な説明は、T. Higuchi and V. Stella, Pro drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S. Symposium SeriesおよびEdward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987 に記載されている（いずれも参照により本明細書に引用する）。
　「薬学的に許容し得る塩」は、式（Ｉ）の化合物の無機または有機酸との塩であり得る。好ましい塩は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸または硫酸との塩、または、有機カルボン酸またはスルホン酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸またはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸またはナフタレンジスルホン酸との塩である。
　また、薬学的に許容し得る塩は、常套の塩基との塩、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）、または、アンモニアまたは有機アミン（例えば、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ジヒドロアビエチルアミン、メチルピペリジン、Ｌ－アルギニン、クレアチン、コリン、Ｌ－リジン、エチレンジアミン、ベンザチン、エタノールアミン、メグルミンまたはトロメタミン）から誘導されるアンモニウム塩、特にナトリウム塩であり得る。
　「溶媒和物」は、固体または液体状態で溶媒分子との配位により錯体を形成している式（Ｉ）の化合物を意味する。好適な溶媒和物は水和物である。
　本明細書において「式（Ｉ）の化合物」に言及する場合、文脈中で不適切でない限り、そのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩および溶媒和物も包含することを意図する。
　ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される。
　ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは、それぞれ独立して、ハロおよびアルキルから成る群から選択される。
　ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは２個存在し、一方がハロであり、他方がアルキルである。
　ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは、それぞれ独立して、ヒドロキシ、アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される。
　ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは３個存在し、１つがヒドロキシであり、１つがアルキルであり、１つがアルコキシである。
　ある実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、下記の表１の化合物から選択される：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　ある実施態様では、下記式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 で表される４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸、または、そのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、特にナトリウム塩が好ましい。
　ある実施態様では、下記式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 で表される４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸、または、そのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、特にナトリウム塩が好ましい。
　式（Ｉ）の化合物、特に、上記の化合物の特性および合成方法は、国際公開第２０１２／０１４９９４号、国際公開第２０１２／０４３８９１号、国際公開第２０１４／１２９４９５号パンフレット、国際公開第２０１５／１２９８０９号パンフレット（特許文献１～４）に詳細に記載されている。これらの文献の全体を出典明示により本明細書の一部とする。
　後述する実施例により立証される通り、式（Ｉ）の化合物は、角膜内皮細胞および角膜上皮細胞を保護し、細胞死を抑制する作用を有し、従って、角膜を保護し得る。本明細書で使用されるとき、「角膜を保護する」または「角膜保護」は、対象の眼内にあるか、または移植用に切除された角膜において、角膜内皮細胞および角膜上皮細胞の細胞死を抑制すること、角膜の異常（例えば、浮腫、膨潤、混濁）を抑制すること、および／または、角膜の異常の進行を抑制することを意味し、ここで、対象は、角膜疾患に罹患していても、罹患していなくてもよい。
　従って、ある態様では、式（Ｉ）の化合物を含む、角膜保護用の組成物が提供される。
　ある態様では、角膜の保護を必要としている対象に式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、角膜の保護方法が提供される。
　ある態様では、角膜を式（Ｉ）の化合物と接触させることを含む、角膜の保護方法が提供される。
　ある態様では、角膜保護用の式（Ｉ）の化合物が提供される。
　ある態様では、角膜を保護するための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
　ある態様では、角膜保護用の組成物の製造における、式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
　式（Ｉ）の化合物は、その角膜保護効果により、例えば、角膜疾患の処置または予防用の医薬組成物、眼灌流用の組成物、および、移植角膜保存用の組成物などの成分として有用である。
（１）角膜疾患の処置または予防用の医薬組成物
　「角膜疾患」は、角膜における病変、障害または損傷を伴う疾患を意味する。角膜疾患は、角膜内皮疾患または角膜上皮疾患であり得る。角膜内皮疾患には、角膜内皮細胞を標的とする疾患、例えば、滴状角膜、フックス角膜ジストロフィー、後部多形性角膜ジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群もしくは先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィーなどの角膜内皮変性、サイトメガロウイルス角膜内皮炎もしくは単純ヘルペスウイルス角膜内皮炎などのウイルス性疾患、落屑症候群または角膜内皮移植後拒絶反応など、あるいは、外的要因に伴う炎症または物理的損傷、例えば、角膜ぶどう膜炎、角膜実質炎、角膜内皮炎、角膜移植後角膜損傷、内眼手術（例えば白内障手術、硝子体手術、緑内障手術など）後角膜損傷、緑内障発作、コンタクトレンズ長期装着による角膜損傷、角膜外傷、分娩時角膜外傷、または、水疱性角膜症などの疾患が含まれる。角膜上皮疾患には、点状表層角膜炎、角膜びらん、角膜潰瘍、ドライアイ、乾性角結膜炎、周辺部角膜潰瘍、角膜外傷などの疾患が含まれる。
　本明細書で使用されるとき、「処置する」または「処置」は、角膜疾患に罹患している対象において、角膜疾患の原因を軽減または除去すること、その進行を遅延または停止させること、および／または、その症状を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。
　本明細書で使用されるとき、「予防する」または「予防」は、対象において、特に、角膜疾患に罹る可能性が高いが、未だ罹患していない対象において、角膜疾患への罹患を防止すること、または、角膜疾患に罹る可能性を低減することを意味する。角膜疾患に罹る可能性があるが、未だ罹患していない対象には、例えば、フックス角膜ジストロフィーまたは後部多形性角膜ジストロフィーなどの角膜疾患の遺伝的素因を有する対象、角膜疾患の原因を有する対象が含まれる。角膜疾患の原因としては、内眼手術（例えば白内障手術、硝子体手術、緑内障手術など）、角膜移植、レーザー治療、急激な眼圧上昇、炎症、外傷、結膜炎症などが挙げられる。
　角膜疾患の処置または予防の対象としては、動物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）、特にヒトが挙げられる。
　医薬組成物の投与方法は特に限定されないが、経口投与、非経腸投与、注射、輸液、点眼、前眼房内、硝子体内投与等の一般的な投与経路を経ることができ、組成物は、各投与経路に適する剤形であり得る。
　経口投与の剤形としては、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、坐剤、散剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、チュアブル剤、液剤、懸濁剤、乳濁液などが挙げられる。また注射による投与の剤形としては、静脈注射用、点滴投与用、眼内注射用、活性物質の放出を延長する製剤等などの医薬製剤一般の剤形を採用することができる。点眼用の剤形としては、液剤、懸濁剤、乳濁液などが挙げられる。
　これらの剤形は、常法により製剤化することによって製造される。さらに製剤上の必要に応じて、医薬的に許容し得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択することができるが、例えば、緩衝化剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等が挙げられる。
　ある実施態様では、医薬組成物は点眼剤である。点眼剤は、典型的には、塩化ナトリウム、濃グリセリンなどの等張化剤；リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤；クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等の安定化剤；塩化ベンザルコニウム、パラベン等の防腐剤等を用いて調製することができるが、点眼剤の成分はこれらに限定されない。ｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよく、例えば、ｐＨ４～８の範囲内である。
　医薬組成物は、眼灌流液であってもよく、眼灌流液に添加するための組成物の形態であってもよい。医薬組成物は、移植用角膜の保存液であってもよく、移植用角膜の保存液に添加するための組成物の形態であってもよい。これらの剤形の詳細は、後述する通りである。
　医薬組成物の投与量および投与回数は、有効量の式（Ｉ）の化合物が対象に投与されるように、投与対象の動物種、投与対象の健康状態、年齢、体重、投与経路、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できる。ある状況での有効量は、日常的な実験によって容易に決定することができ、通常の臨床医の技術および判断の範囲内である。例えば、全身投与には、約０.００１～約１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約０.０１～約３００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約０.１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、あるいは約１.０～約３０ｍｇ／ｋｇ体重／日の式（Ｉ）の化合物を投与し得る。例えば、局所投与により、約０.０１～約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約０.１～約１０μｇ／ｋｇ体重／日、あるいは約０.３～約３μｇ／ｋｇ体重／日の式（Ｉ）の化合物を投与し得る。式（Ｉ）の化合物は１日１回以上、例えば、１日２回、３回または４回投与することができる。
　式（Ｉ）の化合物は、単独で、または、１種またはそれ以上のさらなる有効成分、特に、角膜疾患の処置または予防のための有効成分と併用できる。例えば、医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物に加えて、１種またはそれ以上のさらなる有効成分を含み得る。
　成分を「併用する」ことは、全成分を含有する投与剤形の使用および各成分を別個に含有する投与剤形の組合せの使用のみならず、それらが角膜疾患の予防および／または処置に使用される限り、各成分を同時に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。２種またはそれ以上のさらなる有効成分を併用することも可能である。併用に適する有効成分には、例えば、抗炎症剤、抗菌剤、抗真菌剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤が含まれる。
　式（Ｉ）の化合物による角膜疾患の処置または予防に加えて、薬物療法以外の眼疾患の治療法を実施することもできる。適する治療法には、例えば、外科手術、光線力学療法、遺伝子治療、再生医療、角膜移植、レーザー治療が含まれる。
　ある態様では、角膜疾患の処置または予防を必要としている対象に式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、角膜疾患の処置または予防方法が提供される。
　ある態様では、角膜疾患の処置または予防用の式（Ｉ）の化合物が提供される。
　ある態様では、角膜疾患の処置または予防のための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
　ある態様では、角膜疾患の処置または予防用の医薬組成物の製造における、式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
（２）眼灌流用の組成物
　白内障手術、硝子体手術、緑内障手術等の眼手術時には、眼灌流および洗浄を目的として、通常、眼灌流液が使用される。このような手術時には、角膜浮腫や角膜混濁等の角膜障害が生じる場合があるが、式（Ｉ）の化合物を眼灌流液に添加することにより、角膜を保護し、角膜疾患を予防し得る。
　眼灌流用の組成物は、固体、半固体または液体の剤形であり得、即時使用できる眼灌流液として提供されてもよく、他の眼灌流液に添加するための組成物として提供されてもよい。眼灌流液として提供される場合、組成物に含まれるその他の成分は、既存の眼灌流液と同等のものであり得、好ましくは房水に近い成分であり、オキシグルタチオン等のグルタチオン類、抗生物質等の成分を含有してもよい。既存の眼灌流液としては、例えば、生理食塩液、乳酸リンゲル液、BSS PLUS（商品名）、オペガード（商品名）、オキシグルタチオン眼還流液（商品名）などが知られているが、これらに限定されない。他の眼灌流液に添加するための組成物として提供される場合、組成物は、眼灌流液の機能および安全性を損なわない限り、いかなる成分を含有してもよい。
　眼灌流用の組成物は、眼灌流液として使用する際に、式（Ｉ）の化合物を有効な濃度で含有していればよい。式（Ｉ）の化合物の使用時の有効濃度は、例えば、０.１μＭ～１０ｍＭ、１μＭ～１ｍＭ、２μＭ～２００μＭ、５μＭ～１００μＭまたは１０μＭ～１００μＭであり得る。
　ある態様では、眼手術を受けている対象の眼灌流を行う方法であって、有効量の式（Ｉ）の化合物を含む眼灌流液を用いることを含む方法が提供される。
　ある態様では、眼手術を受けている対象において有効量の式（Ｉ）の化合物を含む眼灌流液を用いて眼灌流することを含む、対象の角膜の保護方法が提供される。
　ある態様では、眼灌流において使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
　ある態様では、眼灌流時に角膜を保護するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
　ある態様では、眼灌流のための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
　ある態様では、眼灌流時に角膜を保護するための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
　ある態様では、眼灌流用の組成物を製造するための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
　ある態様では、眼灌流時に角膜を保護するための組成物を製造するための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
（３）移植角膜保存用の組成物
　角膜移植の際には、角膜提供者（ドナー）から提供された角膜（移植角膜）を、患者への移植手術時まで保存する必要がある。式（Ｉ）の化合物を角膜保存液に添加することにより、角膜を保護し、より良好な状態で保存し得る。
　移植角膜保存用の組成物は、固体、半固体または液体の剤形であり得、即時使用できる角膜保存液として提供されてもよく、他の角膜保存液に添加するための組成物として提供されてもよい。角膜保存液として提供される場合、組成物に含まれるその他の成分は、既存の角膜保存液と同等のものであり得、例えば、基本媒体、緩衝剤、コンドロイチン硫酸、デキストラン、ビタミン類、ＡＴＰ前駆体、抗生物質等の成分を含有してもよい。既存の角膜保存液としては、例えば、Ｍ１９９培地、ＭＥＭα培地、ＭＫ培地、ＣＳＭ培地、ＣＳＭＤ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地、Optisol-GS（商品名）、K-Sol（商品名）、EP2（商品名）などが知られているが、これらに限定されない。他の角膜保存液に添加するための組成物として提供される場合、組成物は、角膜保存液の機能および安全性を損なわない限り、いかなる成分を含有してもよい。
　移植角膜保存用の組成物は、角膜保存液として使用する際に、式（Ｉ）の化合物を有効な濃度で含有していればよい。式（Ｉ）の化合物の使用時の有効濃度は、例えば、０.１μＭ～１０ｍＭ、１μＭ～１ｍＭ、２μＭ～２００μＭ、５μＭ～１００μＭまたは１０μＭ～１００μＭであり得る。
　ある態様では、移植角膜の保存方法であって、有効量の式（Ｉ）の化合物を含む角膜保存液中で移植角膜を保存することを含む方法が提供される。
　ある態様では、有効量の式（Ｉ）の化合物を含む角膜保存液中で移植角膜を保存することを含む、移植角膜の保護方法が提供される。
　ある態様では、移植角膜を保存するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
　ある態様では、移植角膜の保存時に角膜を保護するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
　ある態様では、移植角膜保存のための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
　ある態様では、移植角膜保存時に角膜を保護するための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
　ある態様では、移植角膜保存用の組成物を製造するための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
　ある態様では、移植角膜保存時に角膜を保護するための組成物を製造するための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
　例えば、下記の実施態様が提供される。
［１］式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０～４から選択される整数である〕
の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、角膜保護用の組成物。
［２］Ｒａが、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、第１項に記載の組成物。
［３］Ｒａが、それぞれ独立して、ハロおよびアルキルから成る群から選択される、第１項または第２項に記載の組成物。
［４］Ｒａが２個存在し、一方がハロであり、他方がアルキルである、第１項～第３項のいずれかに記載の組成物。
［５］Ｒａが、それぞれ独立して、ヒドロキシ、アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、第１項または第２項に記載の組成物。
［６］Ｒａが３個存在し、１つがヒドロキシであり、１つがアルキルであり、１つがアルコキシである、第１項、第２項または第５項に記載の組成物。
［７］式（Ｉ）の化合物が表１に記載の化合物から選択される、第１項に記載の組成物。
［８］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸、または、４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第１項、第２項または第７項に記載の組成物。
［９］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第１項～第４項、第７項および第８項のいずれかに記載の組成物。
［１０］４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩を含む、第１項～第４項および第７項～第９項のいずれかに記載の組成物。
［１１］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第１項、第２項および第５項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［１２］４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩を含む、第１項、第２項、第５項～第８項および第１１項のいずれかに記載の組成物。
［１３］角膜疾患の処置または予防用の、第１項～第１２項のいずれかに記載の組成物。
［１４］角膜疾患が角膜内皮疾患である、第１３項に記載の組成物。
［１５］角膜内皮疾患が、滴状角膜、フックス角膜ジストロフィー、後部多形性角膜ジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィー、サイトメガロウイルス角膜内皮炎、単純ヘルペスウイルス角膜内皮炎、落屑症候群、角膜内皮移植後拒絶反応、角膜ぶどう膜炎、角膜実質炎、角膜内皮炎、角膜移植後角膜損傷、内眼手術後角膜損傷、緑内障発作、コンタクトレンズ長期装着による角膜損傷、角膜外傷、分娩時角膜外傷または水疱性角膜症である、第１４項に記載の組成物。
［１６］角膜内皮疾患が、フックス角膜ジストロフィーまたは水泡性角膜症である、第１４項または第１５項に記載の組成物。
［１７］角膜疾患が角膜上皮疾患である、第１３項に記載の組成物。
［１８］角膜上皮疾患が、点状表層角膜炎、角膜びらん、角膜潰瘍、ドライアイ、乾性角結膜炎、周辺部角膜潰瘍または角膜外傷である、第１７項に記載の組成物。
［１９］角膜疾患が、滴状角膜、フックス角膜ジストロフィー、後部多形性角膜ジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィー、サイトメガロウイルス角膜内皮炎、単純ヘルペスウイルス角膜内皮炎、落屑症候群、角膜内皮移植後拒絶反応、角膜ぶどう膜炎、角膜実質炎、角膜内皮炎、角膜移植後角膜損傷、内眼手術後角膜損傷、緑内障発作、コンタクトレンズ長期装着による角膜損傷、角膜外傷、分娩時角膜外傷、水疱性角膜症、点状表層角膜炎、角膜びらん、ドライアイ、乾性角結膜炎または周辺部角膜潰瘍である、第１３項に記載の組成物。
［２０］角膜疾患が、フックス角膜ジストロフィー、水泡性角膜症、角膜びらん、ドライアイまたは角膜外傷である、第１３項または第１９項に記載の組成物。
［２１］点眼剤である、第１項～第２０項のいずれかに記載の組成物。
［２２］眼灌流液または眼灌流液に添加するための組成物である、第１項～第２０項のいずれかに記載の組成物。
［２３］移植用角膜の保存液または移植用角膜の保存液に添加するための組成物である、第１項～第２０項のいずれかに記載の組成物。
［２４］式（Ｉ）の化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０～４から選択される整数である〕
またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、角膜疾患の処置または予防用の医薬組成物。
［２５］Ｒａが、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、第２４項に記載の組成物。
［２６］Ｒａが、それぞれ独立して、ハロおよびアルキルから成る群から選択される、第２４項または第２５項に記載の組成物。
［２７］Ｒａが２個存在し、一方がハロであり、他方がアルキルである、第２４項～第２６項のいずれかに記載の組成物。
［２８］Ｒａが、それぞれ独立して、ヒドロキシ、アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、第２４項または第２５項に記載の組成物。
［２９］Ｒａが３個存在し、１つがヒドロキシであり、１つがアルキルであり、１つがアルコキシである、第２４項、第２５項または第２８項に記載の組成物。
［３０］式（Ｉ）の化合物が表１に記載の化合物から選択される、第２４項に記載の組成物。
［３１］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸、または、４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第２４項、第２５項または第３０項に記載の組成物。
［３２］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第２４項～第２７項、第３０項および第３１項のいずれかに記載の組成物。
［３３］４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩を含む、第２４項～第２７項および第３０項～第３２項のいずれかに記載の組成物。
［３４］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第２４項、第２５項および第２８項～第３１項のいずれかに記載の組成物。
［３５］４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩を含む、第２４項、第２５項、第２８項～第３１項および第３４項のいずれかに記載の組成物。
［３６］角膜疾患が角膜内皮疾患である、第２４項～第３５項のいずれかに記載の組成物。
［３７］角膜内皮疾患が、滴状角膜、フックス角膜ジストロフィー、後部多形性角膜ジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィー、サイトメガロウイルス角膜内皮炎、単純ヘルペスウイルス角膜内皮炎、落屑症候群、角膜内皮移植後拒絶反応、角膜ぶどう膜炎、角膜実質炎、白内障手術後角膜損傷、角膜移植後角膜損傷、網膜手術後角膜損傷、硝子体手術後角膜損傷、緑内障手術後角膜損傷、緑内障発作、コンタクトレンズ長期装着による角膜損傷、角膜外傷、分娩時角膜外傷または水疱性角膜症である、第３６項に記載の組成物。
［３８］角膜内皮疾患が、フックス角膜ジストロフィーまたは水泡性角膜症である、第３６項または第３７項に記載の組成物。
［３９］角膜疾患が角膜上皮疾患である、第２４項～第３５項のいずれかに記載の組成物。
［４０］角膜上皮疾患が、角膜びらん、ドライアイまたは角膜外傷である、第３９項に記載の組成物。
［４１］角膜疾患が、滴状角膜、フックス角膜ジストロフィー、後部多形性角膜ジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィー、サイトメガロウイルス角膜内皮炎、単純ヘルペスウイルス角膜内皮炎、落屑症候群、角膜内皮移植後拒絶反応、角膜ぶどう膜炎、角膜実質炎、白内障手術後角膜損傷、角膜移植後角膜損傷、網膜手術後角膜損傷、硝子体手術後角膜損傷、緑内障手術後角膜損傷、緑内障発作、コンタクトレンズ長期装着による角膜損傷、角膜外傷、分娩時角膜外傷、水疱性角膜症、角膜びらんまたはドライアイである、第２４項～第３５項のいずれかに記載の組成物。
［４２］角膜疾患が、フックス角膜ジストロフィー、水泡性角膜症、角膜びらん、ドライアイまたは角膜外傷である、第２４項～第３５項および第４１項のいずれかに記載の組成物。
［４３］点眼剤である、第２４項～第４２項のいずれかに記載の組成物。
［４４］眼灌流液または眼灌流液に添加するための組成物である、第２４項～第４２項のいずれかに記載の組成物。
［４５］移植用角膜の保存液または移植用角膜の保存液に添加するための組成物である、第２４項～第４２項のいずれかに記載の組成物。
［４６］式（Ｉ）の化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０～４から選択される整数である〕
またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、眼灌流用の組成物。
［４７］Ｒａが、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、第４６項に記載の組成物。
［４８］Ｒａが、それぞれ独立して、ハロおよびアルキルから成る群から選択される、第４６項または第４７項に記載の組成物。
［４９］Ｒａが２個存在し、一方がハロであり、他方がアルキルである、第４６項～第４８項のいずれかに記載の組成物。
［５０］Ｒａが、それぞれ独立して、ヒドロキシ、アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、第４６項または第４７項に記載の組成物。
［５１］Ｒａが３個存在し、１つがヒドロキシであり、１つがアルキルであり、１つがアルコキシである、第４６項、第４７項または第５０項に記載の組成物。
［５２］式（Ｉ）の化合物が表１に記載の化合物から選択される、第４６項に記載の組成物。
［５３］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸、または、４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第４６項、第４７項または第５２項に記載の組成物。
［５４］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第４６項～第４９項、第５２項および第５３項のいずれかに記載の組成物。
［５５］４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩を含む、第４６項～第４９項、第５２項～第５４項のいずれかに記載の組成物。
［５６］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第４６項、第４７項および第５０項～第５３項のいずれかに記載の組成物。
［５７］４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩を含む、第４６項、第４７項、第５０項～第５３項および第５６項のいずれかに記載の組成物。
［５８］眼灌流液である、第４６項～第５７項のいずれかに記載の組成物。
［５９］眼灌流液に添加するための組成物である、第４６項～第５７項のいずれかに記載の組成物。
［６０］式（Ｉ）の化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０～４から選択される整数である〕
またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、移植角膜保存用の組成物。
［６１］Ｒａが、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、第６０項に記載の組成物。
［６２］Ｒａが、それぞれ独立して、ハロおよびアルキルから成る群から選択される、第６０項または第６１項に記載の組成物。
［６３］Ｒａが２個存在し、一方がハロであり、他方がアルキルである、第６０項～第６２項のいずれかに記載の組成物。
［６４］Ｒａが、それぞれ独立して、ヒドロキシ、アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、第６０項または第６１項に記載の組成物。
［６５］Ｒａが３個存在し、１つがヒドロキシであり、１つがアルキルであり、１つがアルコキシである、第６０項、第６１項または第６４項に記載の組成物。
［６６］式（Ｉ）の化合物が表１に記載の化合物から選択される、第６０項に記載の組成物。
［６７］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸、または、４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第６０項、第６１項または第６６項に記載の組成物。
［６８］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第６０項～第６３項、第６６項および第６７項のいずれかに記載の組成物。
［６９］４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩を含む、第６０項～第６３項および第６６項～第６８項のいずれかに記載の組成物。
［７０］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第６０項、第６１項および第６４項～第６７項のいずれかに記載の組成物。
［７１］４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩を含む、第６０項、第６１項、第６４項～第６７項および第７０項のいずれかに記載の組成物。
［７２］移植用角膜の保存液である、第６０項～第７１項のいずれかに記載の組成物。
［７３］移植用角膜の保存液に添加するための組成物である、第６０項～第７１項のいずれかに記載の組成物。
　本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
　以下、実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されない。また、上記の説明は、すべて非限定的なものであり、本発明は添付の特許請求の範囲において定義され、その技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
　実施例において、以下の化合物を使用した。
ＫＵＳ１２１：４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩
ＫＵＳ１８７：４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩
　ＫＵＳ１２１およびＫＵＳ１８７は、国際公開第２０１２／０１４９９４号に記載の方法により製造した。
試験１：ウサギ培養角膜内皮細胞における効果
　日本白色家兎の全眼球（フナコシ）より剪刀により輪部で切開し摘出した角膜から、クレセントナイフを用いて機械的に内皮細胞を掻把、採取し、１０％ウシ胎児血清およびｂＦＧＦ２ｎｇ／ｍｌ含有ＤＭＥＭ中で初代培養を行った。サブコンフルエントになった時点でトリプシンを用いて細胞を採取し、等量（４×１０４個／ウェル）を１２ウェルプレートに継代し、上記培地で２４時間培養した。その後、（１）コントロール（上記培地＋ＤＭＳＯ）、（２）上記培地＋ＫＵＳ１２１（５０μＭ）、（３）上記培地＋アンチマイシン（２０μＭ）、（４）上記培地＋アンチマイシン（２０μＭ）＋ＫＵＳ１２１（５０μＭ）、（５）上記培地＋オリゴマイシン（１０μＭ）、（６）上記培地＋オリゴマイシン（１０μＭ）＋ＫＵＳ１２１（５０μＭ）、（７）ｂＦＧＦ２ｎｇ／ｍｌ含有ＤＭＥＭ（無グルコース）、（８）ｂＦＧＦ２ｎｇ／ｍｌ含有ＤＭＥＭ（無グルコース）＋ＫＵＳ１２１（５０μＭ）の８条件の培地に交換し、培養を継続した。
（１）細胞形態の観察
　薬剤添加後、位相差顕微鏡で経時的に培養角膜内皮細胞の写真撮影を行った。
　図１は、薬剤添加の２８時間後の細胞の位相差顕微鏡像である。アンチマイシンまたはオリゴマイシンで処理すると角膜内皮細胞の細胞死が惹起されたが、ＫＵＳ１２１（５０μＭ）の存在下では細胞死が抑制された。図２は、無グルコース下で培養した、薬剤添加の９６時間後の細胞の位相差顕微鏡像である。無グルコース下で培養すると、角膜内皮細胞の細胞死が惹起されたが、ＫＵＳ１２１（５０μＭ）の存在下では細胞死が抑制された。
（２）細胞内ＡＴＰ濃度の測定
　薬剤添加後の培養角膜内皮細胞（Ｐ＝１）の培地を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄し、トリプシン処理により上記培地（１０％ウシ胎児血清およびｂＦＧＦ２ｎｇ／ｍｌ含有ＤＭＥＭ）で懸濁し、細胞数を計測した。一定数（２.５×１０４個）の細胞を遠心し、ＰＢＳ（－）で懸濁し、９６ウェルプレートに５×１０３個ずつ５ウェルにわけて分注した。ルシフェラーゼ発光法（「細胞の」ＡＴＰ測定試薬、東洋ビーネット）により反応させ、ルミノメーターを用いて蛍光強度を測定し、細胞内ＡＴＰ濃度の相対値とした。
　図３は、細胞内ＡＴＰ濃度の測定結果を示す。アンチマイシンまたはオリゴマイシンで２７時間処理した細胞および無グルコース下で９６時間培養した細胞では細胞内ＡＴＰ濃度が低下したが、ＫＵＳ１２１の存在下では、細胞内ＡＴＰ濃度の低下が抑制された。
試験２：ヒト正常ドナー角膜由来角膜内皮細胞における効果
　シアトルアイバンクから輸入した研究用角膜から角膜内皮細胞を基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるOptisol-GS（ボシュロム社）に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して培養した。用いた培地は、OptiMEM（Gibco, 31985070）に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加し、３Ｔ３細胞で２４時間馴化した後に、１０μＭのＳＢ２０３５８０（Funakoshi, 13067）および１μＭのＳＢ４３１５４２（Wako, 192-16541）を添加したものである。
　以下の手順により、角膜内皮細胞を不死化した。ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、レンチウイルスベクター（pLenti6.3_V5-TOPO; Life Technologies Inc.）に導入した。その後、レンチウイルスベクターを３種類のヘルパープラスミド（pLP1, pLP2, pLP/VSVG; Life Technologies Inc.）とともにトランスフェクション試薬（Fugene HD; Promega Corp., Madison, WI）を用いて２９３Ｔ細胞（RCB2202; Riken Bioresource Center, Ibaraki, Japan）に感染させた。４８時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、５μｇ／ｍｌのポリブレンを用いて、上記の培養した角膜内皮細胞の培養液に添加して、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した。かくして得られた正常角膜内皮細胞の不死化細胞株（ｉＨＣＥＣ）の位相差顕微鏡像を確認したところ、正常角膜内皮細胞と同様に、一層の多角形の形態を有した。ｉＨＣＥＣはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）により維持培養を行った。
　不死化ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（－）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（－）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で３分間インキュベートした。ＰＢＳ（－）除去後、０.０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（ナカライテスク、322778-34）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で５分間インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。
培地：ＤＭＥＭ（ナカライテスク、08456-36）＋１０％ＦＢＳ（Biowest, S1820-500）＋１％Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、26252-94）
　１２ウェルプレートに不死化ヒト角膜内皮細胞（ロット：ｉＨＣＥＣ１－１）を１ウェル当たり７×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％ＣＯ２）で２４時間培養した。
培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ
　２４時間後、培地を除去し、ＫＵＳ１２１（１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ）を含む培地を添加し、２４時間培養した。
培地：ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ
　２４時間後、培地を除去し、１０μＭのタプシガルジン（和光、209-17281）およびＫＵＳ１２１（１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ）を含む培地を添加し、８時間培養を行った。
培地：ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ
　タプシガルジン添加の８時間後に、位相差顕微鏡下で細胞形態およびアポトーシスを観察した。図４に結果を示す。ＫＵＳ１２１非存在下で不死化ヒト角膜内皮細胞をタプシガルジンにより刺激すると（ＴＧ）、細胞障害を示す細胞の変形が観察された。ＫＵＳ１２１添加群においては、変形は抑制された。ＫＵＳ１２１はタプシガルジンにより誘導される細胞障害を抑制することが示唆される。
　上記の観察後、以下の手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。
　氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、洗浄溶液を回収した。浮遊細胞および死細胞を回収するために、回収した培地および洗浄溶液を、４℃、８００ｇ、１２分間遠心し、上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞に、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１％ＳＤＳ、０.５％ＤＯＣ、１％ＮＰ－４０）を加えた。その後、上記の浮遊細胞および死細胞の沈殿物も加え、一緒に懸濁した。回収した液を超音波装置（BIORUPTOR, TOSHO DENKI製）にて冷水中で３０秒間、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、タンパク質の上清を回収した。
　上記抽出したタンパク質７μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗カスパーゼ３抗体（Cell Signaling, 9662）、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Cell Signaling, 9542）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（MBL社, M171-3）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V）を用いた。１次抗体はウサギ抗カスパーゼ３抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体：１０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：３０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出には Chemi Lumi ONE Ultra（ナカライテスク、11644-40）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ－４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）および ImageQuantTM software（GE Healthcare社）により解析した。
　図５に結果を示す。不死化ヒト角膜内皮細胞にＫＵＳ１２１非存在下で、タプシガルジンにより刺激した場合、活性型である約１７ｋＤａの切断カスパーゼ３（約１７ｋＤａ）が認められた。他方で、ＫＵＳ１２１添加群においては、活性型の切断カスパーゼ３はほとんど確認されなかった。従って、ウェスタンブロットによる解析より、ＫＵＳ１２１はタプシガルジンにより誘導されるカスパーゼの活性化を抑制することが認められた。ＫＵＳ１２１はタプシガルジンにより誘導されるＥＲストレスによる細胞障害を抑制することが示唆される。
試験３：ウサギ角膜における効果
　日本白色家兎を安楽死させ、全眼球を摘出し、剪刀を用いて強角膜片を作成した。保存液として（１）Optisol-GS（コントロール）、（２）Optisol-GS＋ＫＵＳ１２１（５０μＭ）または（３）Optisol-GS＋ＫＵＳ１８７（２０μＭ）を用いて、各条件につき強角膜片４眼を、４℃で４週間保存した。経時的に組織を包埋、薄切した。
（１）組織所見および角膜中央部の角膜厚の評価
　組織切片をＨＥ染色し、顕微鏡にて観察し経時的変化を比較した（図６）。また、角膜中央部を通る切片を顕微鏡下で撮影し、角膜中央部の角膜厚を計測し経時的変化を比較した（図７）。Optisol-GS中で保存した角膜（コントロール）では、１週で角膜内皮細胞が膨化し、３週以降、角膜実質が膨化したが、ＫＵＳ１２１またはＫＵＳ１８７添加群では、細胞膨化が２週まで抑制され、角膜実質膨化は４週まで軽度にとどまった。ＫＵＳ１２１またはＫＵＳ１８７群では、コントロール群に比べて、特に３週以降で角膜上皮、角膜厚の変化が少なかった。ＫＵＳ１２１およびＫＵＳ１８７には、角膜上皮細胞および角膜内皮細胞の保護効果があることが示唆される。
（２）ＴＵＮＥＬ法による角膜上皮細胞アポトーシスの評価
　組織切片をＴＵＮＥＬ法にて蛍光染色し、共焦点顕微鏡で観察、角膜中央部付近上皮層３視野を撮影した（図８）。図９は同視野のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色像を示す。ＰＩにて染色された全角膜上皮細胞およびＴＵＮＥＬ染色陽性細胞を計数し、ＴＵＮＥＬ染色陽性細胞率を算出し、経時的変化を比較した（図１０）。コントロールでは１週以降、角膜上皮細胞においてＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス細胞が増加したが、ＫＵＳ１２１またはＫＵＳ１８７添加群ではアポトーシスは抑制された。ＫＵＳ１２１またはＫＵＳ１８７群では、コントロール群に比べて、全期間を通して角膜上皮細胞のＴＵＮＥＬ染色が少なかった。ＫＵＳ１２１およびＫＵＳ１８７には、角膜上皮細胞のアポトーシス抑制効果があることが示唆される。
（３）Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ免疫蛍光染色による角膜内皮機能の評価
　組織切片を、抗Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ抗体を用いて間接蛍光法にて免疫蛍光染色し、中央部付近の角膜内皮を観察し、経時的変化を比較した（図１１）。図１２は同視野のＰＩ染色像を示す。ＫＵＳ１２１または１８７群では、コントロール群に比べて１週から角膜内皮細胞の変化が少なかった。ＫＵＳ１２１およびＫＵＳ１８７には、早期から角膜内皮細胞の保護効果があることが示唆される。
（４）電子顕微鏡による観察
　１週間にわたり保存した角膜を、前固定として２％グルタールアルデヒド（０.１Ｍリン酸緩衝液）４℃に浸漬した。洗浄として、４℃、一晩０.１Ｍリン酸緩衝液に浸漬した。後固定として、４℃、３時間、２％オスミウム水溶液に浸漬した。脱水として、４℃（５０％のみ）、室温、各１５分間、順次高濃度エタノールに液換した（５０、７０、９０、１００、１００、１００％）。置換として、室温、４５分間、プロピレンオキサイドに液換し、その後、室温、１.５時間プロピレンオキサイド＋エポキシ樹脂の混合液に液換した。包埋目的に、６０℃、４８時間、カプセル内に試料とともにエポキシ樹脂を入れ硬化させた。その後、ウルトラミクロトームにて８０－９０ｎｍ切片を作製し、２００メッシュに積載した。２％酢酸ウラニル、鉛染色液にて切片を染色し、カーボン蒸着（電子線に対する切片の補強）で補強した。サンプルを透過型電子顕微鏡で観察し、写真撮影した（図１３）。
　コントロールでは角膜上皮細胞の空胞化および微絨毛の消失が見られたが、ＫＵＳ１２１を添加して保存した角膜では、空胞化は見られず、微絨毛が観察された。また、コントロールでは角膜実質および角膜内皮細胞の膨潤化が見られたが、ＫＵＳ１２１を添加して保存した角膜では見られなかった。これらの結果は、ＫＵＳ１２１は早期から角膜上皮細胞、角膜実質および角膜内皮細胞の保護効果を発揮することを示唆する。
　試験１～３の結果から、ＫＵＳ１２１およびＫＵＳ１８７には、角膜内皮細胞および角膜上皮細胞の保護作用、細胞死抑制作用があり、細胞死抑制された角膜内皮細胞は、正常なポンプ機能を持ち、角膜の浮腫を抑制することが明らかになった。
　本願の組成物は、眼科領域で幅広く用いられることが期待される。

Claims (15)

  1. 　式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式中、
    Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
    ｍは０～４から選択される整数である〕
    の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、角膜保護用の組成物。
  2. 　Ｒａが、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  3. 　式（Ｉ）の化合物が、
    ４－アミノ－３－（６－フェニルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－（６－ｐ－トルイルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－（６－ｍ－トルイルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－（６－ｏ－トルイルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－（６－ビフェニル－２－イルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
    ３－［６－（２－アセチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］－４－アミノナフタレン－１－スルホン酸；
    ３－［６－（３－アセチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］－４－アミノナフタレン－１－スルホン酸；
    ３－［６－（４－アセチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］－４－アミノナフタレンスルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２,４－ジクロロフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２－トリフルオロメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（４－トリフルオロメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２－クロロフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（３－クロロフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（４－クロロフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２－メトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（４－メトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２－イソプロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（４－イソプロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２－フェノキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（３－メトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２,３－ジメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２,５－ジメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（３,５－ジメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（３－トリフルオロメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－｛４－［５－（１－アミノ－４－スルホナフタレン－２－イルアゾ）ピリジン－２－イル］フェニル｝－４－オキソブチル酸；
    ４－アミノ－３－（６－ビフェニル－３－イルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（３－シアノフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（４－シアノフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（３,５－ビストリフルオロメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレンスルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（４－ベンゾイルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２－プロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（５－フルオロ－２－プロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２－フルオロ－６－プロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－プロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（５－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２－フルオロ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２－ブトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２－ヘキシルオキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（４－ブチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２－ヒドロキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－｛６－［２－（６－ヒドロキシヘキシルオキシ）フェニル］ピリジン－３－イルアゾ｝ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－｛２－［５－（１－アミノ－４－スルホナフタレン－２－イルアゾ）ピリジン－２－イル］フェノキシ｝ブチル酸；
    ４－アミノ－３－｛６－［２－（３－ヒドロキシプロポキシ）フェニル］ピリジン－３－イルアゾ｝ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２－イソブトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（５－クロロ－２－ヒドロキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（４－メチルビフェニル－２－イル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（４’－クロロ－４－メチルビフェニル－２－イル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（４,３’,５’－トリメチルビフェニル－２－イル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（３’－クロロ－４－メチルビフェニル－２－イル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（２,６－ジメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    ４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－イソプロポキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；および、
    ４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
    からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  4. 　式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸または４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、請求項１に記載の組成物。
  5. 　角膜疾患の処置または予防用の医薬組成物である、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
  6. 　角膜疾患が角膜内皮疾患である、請求項５に記載の組成物。
  7. 　角膜疾患が角膜上皮疾患である、請求項５に記載の組成物。
  8. 　角膜疾患が、滴状角膜、フックス角膜ジストロフィー、後部多形性角膜ジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィー、サイトメガロウイルス角膜内皮炎、単純ヘルペスウイルス角膜内皮炎、落屑症候群、角膜内皮移植後拒絶反応、角膜ぶどう膜炎、角膜実質炎、角膜内皮炎、角膜移植後角膜損傷、内眼手術後角膜損傷、緑内障発作、コンタクトレンズ長期装着による角膜損傷、角膜外傷、分娩時角膜外傷、水疱性角膜症、点状表層角膜炎、角膜びらん、角膜潰瘍、ドライアイ、乾性角結膜炎または周辺部角膜潰瘍である、請求項５に記載の組成物。
  9. 　角膜疾患が、フックス角膜ジストロフィー、水泡性角膜症、角膜びらん、ドライアイまたは角膜外傷である、請求項５に記載の組成物。
  10. 　点眼剤である、請求項１～９のいずれかに記載の組成物。
  11. 　眼灌流液または眼灌流液に添加するための組成物である、請求項１～９のいずれかに記載の組成物。
  12. 　移植用角膜の保存液または移植用角膜の保存液に添加するための組成物である、請求項１～９のいずれかに記載の組成物。
  13. 　式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     〔式中、
    Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
    ｍは０～４から選択される整数である〕
    の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、角膜疾患の処置または予防用の医薬組成物。
  14. 　式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     〔式中、
    Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
    ｍは０～４から選択される整数である〕
    の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、眼灌流用の組成物。
  15. 　式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     〔式中、
    Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
    ｍは０～４から選択される整数である〕
    の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、移植角膜保存用の組成物。
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