CN112760275B

CN112760275B - 一种生产卟啉类化合物的重组菌及生产卟啉类化合物的方法

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Publication number: CN112760275B
Application number: CN201910999107.4A
Authority: CN
Inventors: 张璐; 张立新; 谭高翼; 陈海红; 朱国良; 王科峰; 李川; 周立铭; 石桐; 刘乐诗
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2019-10-21
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2039-10-21
Also published as: CN112760275A

Abstract

本发明涉及一种生产卟啉类化合物的重组菌以及使用所述重组菌生产卟啉类化合物的方法。相比出发菌株，本发明的重组菌包含调控能力降低的调节子FnrL，并具有血红蛋白合成酶AhbD表达盒。本发明的重组菌不仅能够生产卟啉类化合物，并且可将所生产的卟啉类化合物外排至发酵液中，从而使得能够更方便地获得所述卟啉类化合物。

Description

一种生产卟啉类化合物的重组菌及生产卟啉类化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌，尤其涉及一种生产卟啉类化合物的重组菌及其应用。

背景技术

红细胞在维持人体机能方面有着不可或缺的作用。红细胞中的血红蛋白是红细胞内运输氧气的蛋白，其由血红素与球蛋白结合形成。血红素有四个亚基，每个亚基都能与一分子的氧进行结合，从而将氧气传输至全身。因此，血红素对人体来说也是不可缺少的一种物质。当人体缺乏血红素时，会导致一种疾病的产生-卟啉病。卟啉病是由血红素合成途径中各种特异性酶缺陷导致卟啉类物质产生及***异常而产生的。这种病一旦发作，反复无常，在急性发作期需要静脉注射血红素来缓解症状。预防性规律小剂量给予血红素也可以降低血浆中卟啉前体水平，从而改善急性发作频率及严重程度。

卟啉类化合物及血红素除了能够缓解卟啉病病症外也可以作为人体铁补充剂。可见，卟啉类化合物及血红素被广泛用于医疗保健，食品色素等方面，应用市场广泛。但是该类化合物的生产主要来源于动物的组织及血液，随之而来的问题就是原料供应有限、提取工艺繁杂、成本高昂及产能低下，而且现在非洲猪瘟疫情蔓延严重，化合物的生物安全性能也有待考察。

Soufian Ouchane等公开了对在胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)中的一个全局调控因子-FnrL的详细研究(Soufian Ouchane等，Global Regulation ofPhotosynthesis and Respiration by FnrL，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRYVOL.282,NO.10，第7690-7699页，2007年3月9日)。FnrL作为一个能够感应氧浓度的调节子控制着一系列的基因表达(即在厌氧或好氧两种条件下会选择表达不同的基因)，而这些基因的表达都与血红素、叶绿素、VB12的合成有关。fnrL基因存在于许多物种中，例如大肠杆菌(E.coli)，类鼻疽杆菌(Burkholderia pseudomallei)，及荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)等许多的光合细菌中。2018年，Sang Yup Lee课题组通过代谢途径优化及发酵工艺的优化，在大肠杆菌中成功生产了血红素(Xin Rui Zhao等，Metabolic engineeringof Escherichia coli for secretory production of free haem，Nature Catalysis，VOL 1，2018年9月，720–728)。

然而，本领域中仍需要能够生产卟啉类化合物的基因工程菌株，尤其是能够生产血红素的基因工程菌株，来提供更多的卟啉类化合物生产途径。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明人通过基因工程获得了能够生产卟啉类化合物的重组菌，该重组菌不仅可生产卟啉类化合物，还可将所生产的卟啉类化合物外排至发酵液中，从而使得能够更方便地获得这些卟啉类化合物。

在本发明的第一方面中，本发明提供了产卟啉类化合物的重组菌。在本发明中，相比出发菌株，所述产卟啉类化合物的重组菌包含调控能力降低的调节子FnrL，并具有导入的编码血红素合成酶(heme synthase)AhbD的表达盒。

在本发明中，所述重组菌选自光合细菌、脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、中美根瘤菌(Rhizobium mesoamericanum)、巴克利氏甲烷杆菌(Methanosarcina barkeri str.Fusaro)。优选地，所述光合细菌选自紫色非硫光合细菌。例如，所述光合细菌选自类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、固氮红杆菌(Rhodobacter azotoformans)、或胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)。

在所述重组菌为类球红细菌的情况中，所述重组菌具有编码FnrL(由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列)的基因(fnrL基因)的敲除。

在一些实施方式中，所述重组菌具有编码AhbD(例如，由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列)的表达盒。

在本发明的第二方面中，本发明提供了上述第一方面所述的重组菌的制备方法，所述方法包括：使出发菌株中的调节子FnrL的调控能力降低，并向所述出发菌株中导入编码血红素合成酶AhbD表达盒。

在本发明的第三方面中，本发明提供了生产卟啉类化合物的方法，所述方法包括发酵如前所述的重组菌，从而获得所述卟啉类化合物。

在本发明的第四方面中，如前所述的重组菌在制备卟啉类化合物中的用途。

在本发明的第五方面中，本发明提供了一种活菌制剂，其包含本发明的重组菌。

有益效果

本发明成功利用微生物生产了各种血红素的前体物质以及血红素，即各种卟啉类化合物，有效的避免了使用动物或植物来源的原料，提高了血红素及其它他卟啉类化合物生产的生物安全性能，并且有效的降低了生产成本。另外，本发明中涉及的重组菌能够主动外排所产生的卟啉类化合物。本发明的重组菌与其它报道的重组菌株中的卟啉类化合物合成及外排途径相比，具有更好的稳定性。

附图说明

图1示出了生物体内血红素的合成途径。

图2示出了结合子验证结果。共三组，空白对照均为不添加任何核酸模板；基因组对照均是以类球红细菌基因组为模板；质粒对照均是以pK18-fnrL重组质粒为模板；1-1、1-2、2、3为四个结合子。组1：引物均为fnrL基因左同源臂上游引物及右同源臂下游引物。组2：上游引物位于类球红细菌基因组上，下游引物位于***的抗性基因amp^R中间。组3：上游引物位于要敲除的目的基因fnrL上，下游引物位于类球红细菌基因组上。

图3示出了结合子验证结果。共两组中，空白对照均为不添加任何模板；基因组对照均是以类球红细菌基因组为模板；质粒对照均是以pK18-fnrL重组质粒为模板；1-1、1-2、2、3为四个结合子。组3：均以***质粒上sacB基因为模板设计的引物。组4：均以***质粒上kana^R基因为模板设计的引物。

图4示出了RSI-ΔfnrL发酵液上清全光谱扫描结果。其中，取发酵至48h的对照组和实验组各1mL发酵液，12000×，1min离心，取上清于96孔板中以酶标仪进行全光谱扫描，下方曲线代表对照株-野生型类球红细菌2.4.1，上方曲线代表RSI-ΔfnrL。

图5示出了RSI-ΔfnrL发酵液的低分辨LC-MS检测结果。将发酵液上清以0.22μm滤膜过滤，取滤液进行LC-MS检测，其中，Ind代表对照株-野生型类球红细菌2.4.1，Ind-ΔFnrL代表RSI-ΔfnrL。敲除株RSI-ΔfnrL产生两个明显差异峰。

图6为图5中峰1对应的质谱结果。根据质谱的正负离子源判断其质量分数为707，与卟啉途径中中间体进行比对，判断其为Fe-粪卟啉Ⅲ(C₃₆H₃₆FeN₄O₈)。

图7为图5中峰2对应的质谱结果。根据质谱的正负离子源峰判断其质量分数为654，与卟啉途径中中间体进行比对，判断其为粪卟啉Ⅲ(C₃₆H₃₈N₄O₈)。

图8为HR-MS检测结果。将RSI-ΔfnrL发酵液进行浓缩，取浓缩后样品进行HR-MS检测，在390nm处有两个明显的吸收峰，其中1是在388nm处的吸收峰，2是在389nm处的吸收峰。在MS 654.5-655.5及707.5-708.5之间分别提取离子色谱图。

图9为图8的HR-MS中峰2对应的质谱图。利用HR-MS分析软件对提取的离子色谱图进行比对，峰2的吸收强度达到2.37E9，分子量为655.26074，化学结构式比对为C₃₆H₃₉O₈N₄，与Coproporphyrin III(C₃₆H₃₈N₄O₈)一致。

图10为图8的HR-MS中峰1对应的质谱图。利用HR-MS分析软件对提取的离子色谱图进行比对，峰1的吸收强度达到2.99E8，分子量为708.17133，化学结构式比对为C₃₆H₃₆O₈N₄Fe，与Fe-Coproporphyrin III(C₃₆H₃₆FeN₄O₈)一致。

图11示出了血红素标准品与RSI-ahbD全细胞提取物的HPLC保留时间对比结果。

图12A和图12B分别示出了血红素标准品的离子提取峰和RSI-ahbD的离子提取峰。

具体实施方式

下文将详细阐述本发明。

在生物体内，血红素的合成途径是从5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)开始的(见图1)，其中，5-氨基乙酰丙酸以甘氨酸和琥珀酰COA为底物通过谷氨酰t-RNA合成酶(HemA，由hemA编码)催化获得。ALA是血红素合成途径的关键前体物质。ALA在ALA脱水酶(HemB，由基因hemB编码)的催化下生成胆色素原，然后胆色素原在羟甲基胆素合成酶(HemC，由基因hemC编码)的作用下生成羟甲基胆素，又被尿卟啉原III合成酶(HemD，由基因hemD编码)催化生成含有四吡咯环的尿卟啉原III，再经过尿卟啉原III脱羧酶(HemE，由基因hemE编码)和粪卟啉原III氧化酶(HemF，由基因hemF编码；无氧条件下为HemN，由基因hemN编码)的脱羧氧化作用生成原卟啉原IX，又在偶联呼吸链辅酶Q的原卟啉原氧化酶(HemG，由基因hemG编码)催化下生成原卟啉IX；原卟啉IX在亚铁螯合酶(HemH，由基因hemH编码)作用下将铁离子螯合进原卟啉环生成血红素。

可见，生物体中血红素合成途径调控机制复杂，而这条途径上所涉及的基因hemA、hemB、hemC、hemE、hemN、hemH和bchE(编码厌氧镁-原卟啉IX单甲酯环化酶，anaerobicmagnesium-protoporphyrin IX monomethyl ester cyclase，用于从原卟啉IX生成叶绿素)的转录表达均受到调节子FnrL(也可称为转录因子FnrL或全局调控因子FnrL)的全面调控，其中hemN和bchE是其中两个关键的调控点。

本发明人发现，当降低宿主细胞中调节子FnrL的调控能力，可使得卟啉类化合物在宿主细胞中累积；进一步引入血红素合成酶可使得宿主细胞直接生产血红素，从而获得能够直接生产卟啉类化合物(尤其是血红素)的重组菌。令人惊奇的是，本发明的重组菌将所产生的卟啉类化合物(例如，血红素)分泌至细胞外。

不受任何理论限制，本发明人发现全局调控因子FnrL表达下调导致HemN表达受限，原通路受阻，粪卟啉原Ⅲ经粪卟啉原氧化酶(HemY，由基因hemY编码)催化生成粪卟啉Ⅲ，粪卟啉Ⅲ在亚铁螯合酶(HemH，由基因hemH编码)作用下将铁离子螯合进粪卟啉Ⅲ生成Fe-粪卟啉Ⅲ；进一步，通过外源导入的血红素合成酶(AhbD)将Fe-粪卟啉Ⅲ脱羧生成血红素(图1)。

因此，本发明的一个方面提供了生产卟啉类化合物的重组菌，相比出发菌株，所述重组菌具有调控能力降低的调节子FnrL，并具有导入的编码血红素合成酶的表达盒。

在本发明中，所使用的术语“卟啉类化合物”是指一类由四个吡咯类亚基的α-碳原子通过次甲基桥(＝CH-)互联而形成的大分子杂环化合物。其母体化合物为卟吩，有取代基的卟吩称为卟啉。卟啉与金属离子配合的形式存在于自然界中，比如与铁配位就能产生血红素。在本发明的一些实施方式中，所述卟啉类化合物主要指生物体内的内源卟啉类化合物，例如，血红素合成途径中所涉及的卟啉类化合物(例如，尿卟啉原Ⅲ、粪卟啉原Ⅲ、原卟啉原Ⅸ、原卟啉Ⅸ、粪卟啉Ⅲ、Fe-粪卟啉Ⅲ、血红素)。例如，在紫色非硫细菌中，所述卟啉类化合物包括尿卟啉原Ⅲ、粪卟啉原Ⅲ、原卟啉原Ⅸ、原卟啉Ⅸ、粪卟啉Ⅲ、Fe-粪卟啉Ⅲ、血红素。在一些优选的实施方式中，所述卟啉类化合物为与血红素合成相关的卟啉化合物，包括血红素、粪卟啉Ⅲ和Fe-粪卟啉Ⅲ。

在本发明中，所述出发菌株选自具有四吡咯化合物合成途径并具有调节子FnrL或与FnrL具有类似功能的调节子的菌株(例如，细菌菌株)。在本发明的一些实施方式中，所述出发菌株可选自光合细菌、脱氮副球菌、枯草芽孢杆菌、根癌农杆菌、中美根瘤菌、巴克利氏甲烷杆菌。优选地，所述光合细菌选自紫色硫光合细菌和紫色非硫光合细菌。例如，所述紫色硫细菌可选自荚硫菌属(Thiocapsa)和着色菌属(Chromatinum)。例如，所述紫色非硫细菌可选自红螺菌属(Rhodospirillum)和红细菌属(Rhodobacter)。例如，所述光合细菌选自类球红细菌、荚膜红细菌、固氮红杆菌、或胶状红长命菌。在本发明的实施方式中，所述出发菌株可为野生型菌株，基因工程菌株和/或化学诱变菌株。

在本发明的一些实施方式中，所述出发菌株可为选自以下中的细菌的野生型菌株、基因工程菌株和/或化学诱变菌株：光合细菌、脱氮副球菌、枯草芽孢杆菌、根癌农杆菌、中美根瘤菌、巴克利氏甲烷杆菌。优选地，所述光合细菌选自紫色非硫光合细菌。例如，所述光合细菌选自类球红细菌、荚膜红细菌、固氮红杆菌、或胶状红长命菌。在一个优选的实施方式中，所述出发菌株选自紫色非硫细菌，例如类球红细菌。

在本发明中，调节子FnrL包括调节子FnrL本身；以及能够全面调控基因hemA、hemB、hemC、hemE、hemN、hemH和bchE(特别是hemN和bchE)或具有同等功能基因的调节子(例如，CrpK：Crp家族蛋白，参与调控光合作用和维持铁稳态；CrpK和FnrL具有相似的DNA结合决定因素；Saheed Imam等，Global Analysis of Photosynthesis TranscriptionalRegulatory Networks，2014年12月，第10卷，第12期，e1004837)。

在一些实施方式中，所述出发菌株为类球红细菌的野生型菌株、基因工程菌株和/或化学诱变菌株。在所述出发菌株为类球红细菌的情况中，所述调控子FnrL具有如SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列。

在具体的实施方式中，相比出发菌株，本发明的重组菌包含具有修饰的调节子FnrL，所述修饰包括调节子FnrL的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的置换、***和/或缺失，以使调节子FnrL的调控能力或表达水平降低。

在一些实施方式，相比出发菌株，所述重组菌具有部分或全部氨基酸残基缺失的调节子FnrL，例如，1％-100％氨基酸残基缺失，例如，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％以上或100％氨基酸残基(即，缺乏调节子FnrL的情况)的缺失；或者，1个以上氨基酸的缺失，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、100个、200个以上或全部氨基酸残基的缺失。在另外的实施方式中，相比初始菌株，所述重组菌具有使FnrL的调控能力降低的一个或多个氨基酸置换或***。

在具体的实施方式中，相比出发菌株，本发明的重组菌包含具有修饰的fnrL基因，所述修饰包括fnrL基因的核苷酸序列中的一个或多个碱基的置换、***和/或缺失，以使调节子FnrL的调控能力或表达水平降低。

在一些实施方式，相比出发菌株，所述重组菌具有部分或全部碱基缺失的fnrL基因，例如，1％-100％碱基的缺失，例如，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％以上或100％碱基(即，缺乏fnrL基因的情况)的缺失；或者，1个以上碱基的缺失，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个以上或全部碱基的缺失。在另外的实施方式中，相比初始菌株，所述重组菌具有使FnrL的调控能力降低的一个或多个碱基置换或***。

在具体的实施方式中，相比出发菌株，本发明的重组菌包含具有修饰的调控fnrL基因表达的元件，所述修饰包括fnrL基因表达的调控元件中的一个或多个碱基的置换、***和/或缺失，以使调节子FnrL的调控能力或表达水平降低。

在一些实施方式中，相比出发菌株，所述重组菌具有完全敲除的编码调节子FnrL的基因(fnrL基因)。在一个实施方式中，在重组菌为类球红细菌的情况中，所述重组菌具有编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的全长基因(例如，由SEQ ID NO：2所示的多核苷酸序列)的缺失。在本发明的一些实施方式中，相比出发菌株，所述重组菌可具有编码所述调节子FnrL的基因的一条等位基因的敲除。在本发明中，具有调节子FnrL的一条等位基因敲除的重组菌可被称为杂合子重组菌，相应地，具有调节子FnrL的两条等位基因敲除的重组菌可被称为纯合子重组菌。

在本发明的一些实施方式中，相比出发菌株，所述重组菌具有降低水平的调节子FnrL调控能力。在本发明中，相比出发菌株中的调节子FnrL调控能力，所述重组菌中调节子FnrL的调控能力降低。在一些实施方式中，相比出发菌株中调节子FnrL的调控能力，所述重组菌中调节子FnrL的调控能力降低至少10％，例如降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括降低100％(如，相对于出发菌株的缺乏水平)、或相对于出发菌株的水平降低在10％到100％之间的任意量。

在本发明的一些实施方式中，相比出发菌株，所述重组菌具有降低水平的调节子FnrL表达水平。在本发明中，相比出发菌株中的调节子FnrL表达水平，所述重组菌中调节子FnrL的表达水平降低。在一些实施方式中，相比出发菌株中调节子FnrL的表达水平，所述重组菌中调节子FnrL的表达水平降低至少10％，例如降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括降低100％(如，相对于出发菌株的缺乏水平)、或相对于出发菌株的水平降低在10％到100％之间的任意量。

血红素合成酶AhbD属于SAM自由基酶家族，包含两个[4Fe-4S]簇。在硫酸盐还原菌和古菌中发生的血红素生物合成途径中，AhbD催化Fe-粪卟啉Ⅲ上C3和C8位的两个丙酸侧链氧化脱羧生成血红素相应的乙烯基。

在一些实施方式中，所述编码AhbD的表达盒为能够在宿主细胞(即本发明中的重组菌或出发菌株)中表达目标蛋白AhbD的核酸元件。具体而言，所述编码AhbD的表达盒包含编码AhbD的多核苷酸序列。在一些实施方式中，所述AhbD可为天然表达的AhbD、合成的AhbD等。例如，所述AhbD可来自Methanosarcina barkeri Fusaro(NCBI号：Mbar-A1458，其具有由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，例如，可由SEQ ID NO：4所示的多核苷酸序列编码)。

根据本发明一个特别优选的实施方式，为提高在宿主细胞内的表达效率，可将野生型AhbD的编码序列替换为由宿主细胞偏爱密码子组成的多核苷酸序列。

根据本发明优选的实施方式，在所述重组菌为类球红细菌的情况中，将野生型AhbD的编码序列(SEQ ID NO：4)替换为由类球红细菌偏爱密码子组成的多核苷酸序列(SEQID NO：5)。

只要是编码具有AhbD酶活性的多肽的核苷酸序列，则并不限于这些多核苷酸序列。

根据本发明另一优选的实施方式，作为编码AhbD的多核苷酸序列，也可以是下述多核苷酸序列：与如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的多核苷酸序列的互补序列在严格条件下进行杂交并具有上述所希望的活性的血红素合成酶编码序列。其中，严格条件是指形成所谓的特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。尽管该条件因核苷酸序列或其长度而不同，其实例包括具有高同源性(例如，具有不低于75％的同源性、优选不低于90％的同源性、进一步优选不低于95％的同源性、最优选不低于98％的同源性)的核酸序列相互杂交，而同源性低于上述标准的核酸序列不杂交的条件；或Southern杂交中用于漂洗的常用条件的杂交条件(60℃和1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC和相当于0.1％SDS的盐浓度)。

AhbD的表达盒还包含启动子和终止子。所述启动子和终止子的选择不受限制，只要其能够在宿主细胞中起始和终止目标多核苷酸序列的转录即可。在优选的实施方式中，所述启动子和终止子为能够在类球红细菌中发挥作用的启动子和终止子。

在本发明的实施方式中，编码AhbD的多核苷酸可处于表达载体中。在一些实施方式中，所述表达载体可为商业上可获得的表达载体。关于表达载体的选择，本领域技术人员可根据宿主的类型容易地确定。

表达AhbD的表达盒可整合进宿主细胞的基因组中，或者处于游离型质粒中。在本发明中，编码AhbD的表达盒优选处于游离型质粒中。

在本发明中，相比出发菌株，所述重组菌具有提高的AhbD酶活性水平。在优选的实施方式中，所述出发菌株不具有血红素合成酶AhbD。

在本发明的第二方面中，本发明提供了制备上述所述的重组菌的方法，所述方法包括：使出发菌株中的调节子FnrL的调控能力降低，并向所述出发菌株中导入表达血红素合成酶AhbD表达盒，从而得到本发明所述的重组菌。

在本发明的方法中，上述步骤可以任意顺序实施，例如，上述两个步骤可同时进行。例如，本发明的方法可包括：向出发菌株中导入血红素合成酶AhbD表达盒；然后使其中的调节子FnrL的调控能力降低，从而得到本发明所述的重组菌。例如，本发明的方法可包括：在向出发菌株中导入血红素合成酶AhbD表达盒的同时，使出发菌株中的调节子FnrL的调控能力降低，从而得到本发明所述的重组菌。

在本发明所述的方法中，可使用本领域技术人员已知的任何方法来使调节子FnrL的调控能力降低或使调节子FnrL的表达水平降低(包括完全或部分敲除编码FnrL的fnrL基因)。此类方法包括但不限于：同源重组、CRISPR/Cas***、定点突变或RNA干扰(RNAi)。

在一个实施方式中，本发明的方法包括：将出发菌株中的fnrL基因完全敲除，并导入编码血红素合成酶AhbD表达盒，从而获得本发明的重组菌。所述出发菌株的种类如上所述。

在一些实施方式中，通过同源重组的方式将出发菌株中的fnrL基因敲除。

在所述重组菌为类球红细菌的情况中，作为同源重组的实例，可采用双菌结合转移的方法。其中，可使用大肠杆菌等作为供体菌。

编码AhbD的表达盒的导入技术是本领域技术人员已知。例如，可通过电转化的方法进行导入。在优选的实施方式中，可将编码血红素合成酶AhbD的多核苷酸可操作地连接至表达载体中，然后将所述表达载体导入所述出发菌株或已敲除fnrL基因的菌株中。所述表达载体可根据重组菌的类型来选择，例如，可选择可商购的表达载体。例如，对于类球红细菌而言，可使用PUC57载体、pBBR载体、pIND4载体。

在一些实施方式中，在各步骤中，可使用标记来筛选和/或选择阳性菌株。本文使用的术语“标记”是指报告基因、阳性选择标记和阴性选择标记。报告基因是指其在细胞中表达产生可检测信号(例如可检测信号、例如发光)的任何分子。示例性的标记在例如如下中公开：Sambrook，J.等，(2001)Molecular Cloning：A Lbaroratory Manual，第二版(2001)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；以及美国专利号5,464,764和5,625,048。用于选择和检测标记的多种程序为本领域所知晓，参见例如Joyner，A.L.(2000)Gene Targeting：A Practical Approach，第二版，Oxford UniversityPress，New York，N.Y。本文使用的术语“选择标记”和“阳性选择标记”是指其表达使得细胞能够包含待识别基因的基因，例如抗生素抗性基因和可检测(例如荧光)的分子。在本发明的一些实施方式中，编码产物的基因使得在一些条件下仅携带该基因的细胞能够存活和/或生长。例如，表达所引入的氨苄霉素抗性基因、新霉素抗性(Neor)基因的菌株对相应的化合物具有抗性。而不携带所述抗性基因标记的细胞被相应的化合物杀死。其它阳性选择标记为本领域技术人员所知晓，或在本领域技术人员的掌握范围之内。“阴性选择标记”是指其表达抑制包含待识别基因的细胞的基因。

在本发明的第三方面中，本发明提供了生产卟啉类化合物(特别是血红素)的方法，所述方法包括对本发明所述的重组菌进行发酵，从而获得所述卟啉类化合物。

在一个实施方式中，所述卟啉类化合物为尿卟啉原Ⅲ、粪卟啉原Ⅲ、原卟啉原Ⅸ、原卟啉Ⅸ、粪卟啉Ⅲ、Fe-粪卟啉Ⅲ或血红素中的一种或多种；优选粪卟啉Ⅲ、Fe-粪卟啉Ⅲ和血红素中的一种或多种。

关于重组菌的发酵，本领域技术人员可根据宿主菌的类型通过本领域常规的发酵方法进行发酵。

在一个实施方式中，对于出发菌株为类球红细菌的重组菌，发酵条件为：28-32℃，180rpm-220rpm；发酵时间为培养基中的碳源被耗尽。发酵培养基可为本领域中常用的发酵培养基。在一个实施方式中，所述发酵培养基可包含硫酸铵、味精、玉米浆粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰、氯化胆碱和碳酸钙。

作为种子液，可采用二级培养法，即，在一级种子平板上以28-32℃培养至6-8天，接种到二级种子液体培养基中以28-32℃，180rpm-220rpm培养18-48h，OD为5-10。一级种子培养基和二级种子培养基可为本领域中常用的种子培养基。

细胞生物学和分子生物学中常用术语的定义可在如下著作中找到：TheEncyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；Benjamin Lewin，Genes X，Jones&BartlettPublishing出版，2009(ISBN-10:0763766321)；Kendrew等(著)，MolecularBiology and Biotechnology:a ComprehensiveDesk Reference，VCHPublishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；以及CurrentProtocols in Protein Sciences 2009，Wiley Intersciences，Coligan等著。

实施例

通过下述实施例对本发明进行了进一步的说明，所述实施例不应被视为对本发明的进一步限定。

实施例中所用的试剂以及标准品均购自Sigma。

实施例1类球红细菌2.4.1fnrL^-突变株(RSI-ΔfnrL)的构建

1.重组质粒pK18mobsacB-fnrL的构建

以类球红细菌2.4.1(ATCC BAA-808)的基因组DNA为模板扩增fnrL基因(SEQ IDNO:2)的左右同源臂，其中，左游同源臂的序列为SEQ ID NO:6中所示的核酸序列，右游同源臂的序列为SEQ ID NO:7中所示的核酸序列；以pBBR-amp质粒(购自addgene)为模板，扩增amp^R抗性片段(SEQ ID NO:8)作为筛选标记。fnrL基因左右同源臂的扩增引物及抗性筛选标记基因的扩增引物如表1所示，PCR扩增条件如下所示。用EcoR I/BamH I对pK18mobsacB***质粒(购自addgene)进行双酶切，并回收线性化的载体片段。酶切体系如下所示。

将获得的左右同源臂、抗性筛选标记基因片段及线性化的载体片段，按照Ezmaxone-step无缝克隆试剂盒提供的步骤，在37℃下、30min进行四片段连接。将连接产物转入大肠杆菌DH10b感受态细胞中，并涂布于添加有50μg/mL氨苄抗生素的LB平板上进行筛选，并进一步通过菌落PCR和测序筛选出阳性克隆，从而获得重组质粒pK18mobsacB-fnrL。

其中，所有酶购于NEW ENGLAND BioLabs公司，Ezmax one-step无缝克隆试剂盒购于吐露港公司。

表1

引物	序列	编号
			Left-F	acagctatga catgattacg gcccgacgat ccggccctga	SEQ ID NO:9
Left-R	tgattaagca ttggaagctt ctgccggtct gaggcgaccc	SEQ ID NO:10
			Right-F	gaaaagatca aaggatcttc gtgcagcgtc atgccgtttt	SEQ ID NO:11
Right-R	cctgcaggtc gactctagag cgagaagtcc gtctcggcat	SEQ ID NO:12
			Amp-F	ccaatgctta atcagtgagg	SEQ ID NO:13
Amp-R	gaagatcctt tgatcttttc	SEQ ID NO:14

2.类球红细菌2.4.1fnrL^-突变株(RSI-ΔfnrL)的构建

将重组质粒pK18mobsacB-fnrL导入大肠杆菌S17-1(购自武汉淼灵生物科技有限公司，编号为P1454)中，涂布于氨苄抗性及卡纳抗性的LB平板上，获得含有pK18mobsacB-fnrL的大肠杆菌；挑取其中的单克隆于5mL氨苄抗性及卡纳抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养16h，按10％转接至5mL氨苄抗性LB培养基中，培养至OD700为0.3-1.0之间。在种子平板上培养类球红细菌2.4.1，挑取长至6-7天的类球红细菌2.4.1的单菌落，接种于无抗TSB培养基中，30℃、200rpm培养至OD为0.5-2.0之间。

分别取2mL的上述含有重组质粒的大肠杆菌S17-1培养液(以下也称为“供体菌”)和1mL的类球红细菌2.4.1培养液(以下也称为“受体菌”)，在6000rpm下离心3min，弃上清；分别用l mL TSB培养基重悬菌体，在6000rpm下离心3min，弃上清；再各用l mL TSB培养基重悬菌体；按照1：3体积比取供体菌和受体菌并混匀，使得总体积为400μL，并将混合后的菌液点在无抗种子平板上；30℃倒置培养24h，使其发生结合转移将重组质粒导入宿主菌中并发生同源重组；将菌苔刮下，分别用400μL TSB培养基重悬；将得到的菌液涂布至含有氨苄和萘啶酮酸抗生素的种子固体培养基上；30℃静置培养平板，直至长出结合子；将结合子挑出，以加有萘啶酮酸和氨苄抗生素的TSB液体培养基进行液体培养；取1μL菌液进行PCR验证结合子是单交换还是双交换。

如果为单交换克隆，则取200μL菌液涂布含有蔗糖和氨苄抗生素的种子固体培养基上进行筛选，直至获得双交换结合子，即以amp^R抗性标记替换了fnrL片段的结合子。

最终获得将fnrL基因完全敲除的双交换结合子RSI-ΔfnrL(参见图2和图3)，即类球红细菌2.4.1fnrL^-突变株。

其中，氨苄抗生素的终浓度为50μg/mL，萘啶酮酸的终浓度为7.5μg/mL。

种子平板培养基：酵母提取物(yeast extract)30g、磷酸二氢钾3g、氯化钠5g、七水合硫酸亚铁1g、七水合硫酸镁2g、硫酸锰(1％)3mL、氯化钴(1％)1mL、氯化胆碱(0.404g/L)1mL、琼脂粉20g，pH调至7.0，加入双蒸水至终总体积为1L。制好后于121℃湿热高温灭菌25min。

TSB培养基配方：胰蛋白胨大豆牛肉膏(tryptone soya broth)30g/L。制好后于115℃灭菌20min。

实施例2类球红细菌2.4.1fnrL^-突变株RSI-ΔfnrL的发酵结果

从种子平板培养基上挑取多个生长状况良好的类球红细菌2.4.1(作为对照菌株，以下可简称RSI)及类球红细菌fnrL^-突变株(生长6-8天，外观饱满、无白边、菌落大小均一)，分别接种到二级种子摇瓶培养基中，以30℃、200rpm培养24h，约OD值在5-10时，将发酵液按20％转接至三级发酵摇瓶培养基，以30℃、200rpm发酵至培养基中的碳源被耗尽。

发酵液OD值测定方法：取500μL发酵液于EP管，加入200μL 0.5mol/L HCl混匀，去除发酵培养基中的CaCO₃，加水定容至10mL，在波长600nm下测定OD值。

二级种子培养基配方：酵母提取物(yeast extract)8g，硫酸铵7g，味精3g，玉米浆粉4g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钠5g，硫酸亚铁0.5g，硫酸镁1g，硫酸锰(1％)2mL，氯化钴(1％)3mL，氯化胆碱(0.404g/L)3mL，碳酸钙16g。加入去离子水至终总体积为1L。制好后于121℃湿热高温灭菌30min。

三级发酵培养基配方：硫酸铵6g，味精6g，玉米浆粉15g，葡萄糖15g，磷酸二氢钾2g，氯化钠4g，硫酸亚铁1.16g，硫酸镁25g，氯化钙2g，硫酸锰0.15g，氯化胆碱(0.404g/L)3mL，碳酸钙20g，加入去离子水至终总体积为1L。制好后于121℃湿热高温灭菌30min。

分别采用全光谱扫描仪、低分辨LC-MS和高分辨LC-MS对发酵液进行检测。

取发酵至48h的对照组发酵液和实验组发酵液各1mL，以12000rpm离心1min，取上清于96孔板中以酶标仪进行全光谱扫描(其中，全光谱扫描仪为德国BGM CLARIOstar全功能多功能酶标仪)。结果示于图4中，其中，上方的线代表RSI-ΔfnrL菌株，下方的线代表对照RSI。可以看出，RSI-ΔfnrL菌株在380-390nm的广谱范围具有明显的吸收峰，这与卟啉类化合物的吸收峰相符。

分别取对照组发酵液和实验组发酵液50mL，以9000rpm离心10min，取上清液进行旋蒸浓缩；待上清液旋蒸干后加入少量去离子水，将粗提物从旋蒸瓶上洗脱并转移至10mL离心管，以4700rpm离心10min，取上清液以0.22μm滤膜进行过滤，对滤液进行低分辨LC-MS检测。柱子为Agilent YMC-PacK ODS-A，250×4.6mml.D.S-5μm，12nm。

LC条件：A相为H₂O+0.1％HCOOH；B相为Methanol

低分辨LC-MS检测的结果见图5。从图5中可以看出，RSI-ΔfnrL株发酵液中存在两个明显的差异峰，而RSI株的发酵液总未发现相应的峰。对应的质谱结果见图6和图7。图6的结果对应于图5中两个差异峰中的第一个峰，根据质谱的正负离子源判断其质量分数为707，与卟啉途径中中间体进行比对，判断其为Fe-粪卟啉III(Fe-Coproporphyrin III，C₃₆H₃₆FeN₄O₈)。图7的结果对应于图5中两个差异峰中的第二个峰，根据质谱的正负离子源峰判断其质量分数为654，与卟啉途径中中间体进行比对，判断其为粪卟啉III(Coproporphyrin III，C₃₆H₃₈N₄O₈)。

取用于低分辨液质联用检测的粗提物样品，用甲醇稀释10倍，进行高分辨LC-MS检测。

LC条件：A相为H₂O+0.1％HCOOH；B相为Methanol

/>

结果见图8。在图8中，在390nm处有两个明显的吸收峰，其中，1是在388nm处的吸收峰，2是在389nm处的吸收峰。在MS 654.5-655.5及707.5-708.5之间分别提取离子色谱图。利用HR-MS分析软件对提取的离子色谱图进行比对，峰2的吸收强度达到2.37E9，分子量为655.26074，化学结构式比对为C₃₆H₃₉O₈N₄，与粪卟啉III一致(见图9)。利用HR-MS分析软件对提取的离子色谱图进行比对，峰1的吸收强度达到2.99E8，分子量为708.17133，化学结构式比对为C₃₆H₃₆O₈N₄Fe，与Fe-粪卟啉III一致(见图10)。

实施例3生产血红素的菌株的构建

对AhbD基因Mbar-A1458(来自于Methanosarcina barkeri Fusaro)进行密码子优化，得到SEQ ID NO:5中所示的AhbD基因，并人工合成至PUC57载体上(由南京金斯瑞生物科技有限公司公司提供)。PCR扩增获得该目的片段(引物见表2)，以EZmax一步克隆试剂盒将该片段构建至pBBR载体(购自吐露港生物科技有限公司)上，获得重组质粒。通过电转化方法将测序验证正确的重组质粒导入类球红细菌菌株中得到菌株RSI-ahbD并进行摇瓶发酵。

表2

引物	序列	编号
			AhbD-F	gagctcatgatcgccatgac	SEQ ID NO:15
AhbD-R	cgggcaagaagtgaggatcc	SEQ ID NO:16

电转化方法的步骤如下所示：

1.向2mL无菌EP管中每管加2mL菌体(以TSB培养基培养菌体至OD为1-3)，9000rpm离心1min；2.去上清，加入1mL去离子水，吹打混匀；3.9000rpm离心1min，倒去上清，加1mL去离子水，枪头吹打混匀，重复水洗三遍；4.倒去上清，加入10％甘油100μL，重悬菌体并加入质粒(100ng)混匀；5.将混合液取出，全部注入2mm电转杯；6.电转条件：1500V-3000V，200Ω，2mm；7.电转完，加入600μL无抗TSB培养基，吹吸混匀后将液体全部取出，置于2mL EP管，30℃、200rpm孵育2h；8.12000g离心1min，倒去部分上清，将剩余菌液混匀，涂布于卡纳抗性平板，放于30℃培养箱培养。

摇瓶发酵培养条件：

从种子平板培养基上挑取多个生长状况良好的野生型类球红细菌(作为对照菌株，以下可简称RSI)及类球红细菌RSI-ahbD(生长6-8天，外观饱满、无白边、菌落大小均一)，分别接种到二级种子摇瓶培养基中，以30℃、200rpm培养24h，约OD值在5-10时，将发酵液按20％转接至三级发酵摇瓶培养基，以30℃、200rpm发酵至培养基中的碳源被耗尽。

培养基配方如实施例2所述。

取2mL发酵液，12000rpm，1min离心，去上清，以PBS缓冲液清洗菌体三次，将菌体于-80℃预冻后放于冷冻干燥机(LABCONCO冷冻干燥机购于北京照生仪器设备有限公司)中冻干。干燥菌粉中加入1mL DMSO及适量钢珠及磁珠后于全自动样品冷冻研磨机中进行菌体破碎(购于上海静信实业发展有限公司)。12000rpm，1min离心，取上清于新的EP管中，再加1mL DMSO于破碎菌体中，充分振荡混匀后12000rpm，1min离心，取上清，共用DMSO萃取三次。将萃取液以0.22μm滤膜过滤后进行LC-MS检测。检测条件如实施例2中所述。实验结果表明，由RSI-ahbD发酵生产获得血红素(请参见图11-图12)。

另外，以相同的检测方法，在RSI-ahbD的发酵液上清中也检测到血红素，即本发明的重组菌可外排生产血红素。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种生产卟啉类化合物的重组菌及生产卟啉类化合物的方法

<130> SHIC198037

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> 类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）

<400> 1

Met Thr Leu His Glu Val Pro Thr Ile Leu His Arg Cys Gly Asp Cys

1 5 10 15

Pro Ile Arg His Arg Ala Val Cys Ala Arg Cys Asp Ser Glu Glu Leu

20 25 30

Ala Thr Leu Glu Gln Ile Lys Tyr Tyr Arg Ser Tyr Gln Ala Gly Gln

35 40 45

Thr Val Ile Trp Ser Gly Asp Lys Met Asp Phe Val Ala Ser Val Val

50 55 60

Thr Gly Ile Ala Thr Leu Thr Gln Thr Met Glu Asp Gly Arg Arg Gln

65 70 75 80

Met Val Gly Leu Leu Leu Pro Ser Asp Phe Val Gly Arg Pro Gly Arg

85 90 95

Gln Thr Val Ala Tyr Asp Val Thr Ala Thr Thr Asp Leu Leu Met Cys

100 105 110

Cys Phe Arg Arg Lys Pro Phe Glu Glu Met Met Gln Lys Thr Pro His

115 120 125

Val Gly Gln Arg Leu Leu Glu Met Thr Leu Asp Glu Leu Asp Ala Ala

130 135 140

Arg Glu Trp Met Leu Leu Leu Gly Arg Lys Thr Ala Arg Glu Lys Ile

145 150 155 160

Ala Ser Leu Leu Ala Ile Ile Ala Arg Arg Asp Ala Ala Leu Lys Leu

165 170 175

Arg Glu Ser Asn Gly Pro Met Thr Phe Asp Leu Pro Leu Thr Arg Glu

180 185 190

Glu Met Ala Asp Tyr Leu Gly Leu Thr Leu Glu Thr Val Ser Arg Gln

195 200 205

Val Ser Ala Leu Lys Arg Asp Gly Val Ile Ala Leu Glu Gly Lys Arg

210 215 220

His Val Ile Val Thr Asp Phe Ala Arg Leu Leu Glu Glu Ala Gly Asp

225 230 235 240

Asp Ser Asp Gly Gly Leu Pro Val

245

<210> 2

<211> 747

<212> DNA

<213> 类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）

<400> 2

atgacgctgc acgaagtccc aaccatcctt caccgctgcg gcgactgccc gatccgtcat 60

cgtgccgtct gcgcacgctg tgactccgaa gaactcgcga cgctcgagca gatcaagtat 120

taccgcagct atcaggccgg tcagaccgtg atctggtcgg gcgacaagat ggatttcgtg 180

gcgtcggtcg tcaccggcat cgcgacgctg acccagacga tggaggacgg ccgccggcag 240

atggtgggcc ttctgctgcc ttcggatttc gtgggccgtc ccggccggca gaccgtggcc 300

tatgacgtga ccgccacgac cgacctgctg atgtgctgct tccggcgcaa gcccttcgag 360

gaaatgatgc agaagacgcc ccatgtgggg cagcgcctgc tggagatgac gctcgacgag 420

ctcgatgccg cgcgcgaatg gatgctgctc ctgggacgca agacggcgcg cgagaagatc 480

gcgagcctgc ttgcgatcat cgcccggcgc gacgcggcgc tgaagctgcg cgagtcgaac 540

ggacccatga ccttcgacct gccgctcacg cgcgaggaga tggcggatta cctcggcctg 600

acgctcgaga ccgtgagccg tcaggtctcg gcgctgaagc gggacggggt gatcgcgctc 660

gaaggcaagc ggcatgtgat cgtgacagac ttcgcccgtc tgctcgaaga ggccggcgac 720

gacagcgacg gcggtctgcc ggtctga 747

<210> 3

<211> 349

<212> PRT

<213> Methanosarcina barkeri Fusaro

<400> 3

Met Ile Ala Met Thr Asn Ala Pro Arg Leu Ile Ala Trp Glu Leu Thr

1 5 10 15

Ala Gly Cys Asn Leu Asn Cys Val His Cys Arg Gly Ala Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Val Pro Ala Gly Glu Leu Thr Thr Asp Glu Ala Lys His Phe Ile

35 40 45

Asp Glu Val Ala Ser Ile Gly Lys Pro Ile Leu Ile Leu Ser Gly Gly

50 55 60

Glu Pro Leu Thr Arg Pro Asp Val Phe Glu Ile Ala Arg Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Asp Ala Gly Leu Arg Val Val Leu Ala Thr Asn Gly Thr Leu Leu Thr

85 90 95

Pro Glu Ile Val Glu Lys Leu Arg Ala Ala Gly Val Gln Arg Leu Ser

100 105 110

Val Ser Ile Asp Gly Ala Asn Ala Glu Thr His Asp Asn Phe Arg Gly

115 120 125

Met Pro Gly Ala Phe Glu Arg Thr Leu Ala Gly Ile Glu Val Leu Arg

130 135 140

Lys Ala Asp Phe Pro Phe Gln Ile Asn Thr Thr Val Ser Lys Arg Asn

145 150 155 160

Leu Glu Glu Ile Thr Lys Thr Phe Glu Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ala

165 170 175

Val Ala Tyr His Val Phe Phe Leu Val Pro Thr Gly Arg Gly Asp Glu

180 185 190

Ser Asp Glu Val Ser Pro Ala Asp Tyr Glu Arg Ile Leu His Trp Phe

195 200 205

Tyr Glu Met Gln Lys Glu Ser Lys Ile Gln Leu Lys Ala Thr Cys Ala

210 215 220

Pro His Tyr Phe Arg Ile Met Arg Gln Gln Ala Lys Lys Glu Gly Ile

225 230 235 240

Glu Ile Ser Val Lys Thr His Gly Tyr Glu Ala Met Thr Lys Gly Cys

245 250 255

Leu Gly Gly Thr Gly Phe Cys Phe Val Ser Ser Val Gly Lys Val Phe

260 265 270

Pro Cys Gly Tyr Leu Pro Val Leu Ala Gly Asn Ile Arg Glu Gln Pro

275 280 285

Phe Arg Glu Ile Trp Glu Asn Ala Glu Val Phe Arg Lys Leu Arg Asp

290 295 300

Pro Glu Glu Leu Lys Gly Lys Cys Gly Ile Cys Glu Tyr Lys Lys Val

305 310 315 320

Cys Ala Gly Cys Arg Ala Arg Ala Tyr Ala Ala Thr Gly Asp Tyr Leu

325 330 335

Glu Glu Glu Pro Tyr Cys Ile Tyr Arg Pro Gly Lys Lys

340 345

<210> 4

<211> 1050

<212> DNA

<213> Methanosarcina barkeri Fusaro

<400> 4

atgatcgcca tgacaaatgc accaaggctt atcgcatggg aactgactgc aggatgcaac 60

ctgaactgcg tacactgtag gggagcttcc acttcatcgg ttccggcagg tgaacttaca 120

actgatgagg ctaaacactt cattgacgaa gttgcaagta ttggaaaacc cattcttata 180

ctgagcggag gcgagcctct gaccaggcct gacgtttttg aaatcgcacg ttacggtact 240

gatgctgggc ttcgagtcgt acttgcaaca aacgggactc ttcttacgcc tgaaattgtt 300

gagaaattaa gagctgctgg agtgcaaagg ctcagcgtta gtattgatgg agcaaacgca 360

gagacacacg acaatttcag aggcatgccc ggggcttttg aaagaacact tgcaggcatt 420

gaagtcctca ggaaagccga ttttcctttt cagatcaata ccacggtctc aaaacgcaac 480

cttgaggaaa tcactaagac ttttgagctt gcaaaagagc ttggtgcagt tgcatatcat 540

gtctttttcc ttgtgcccac aggcagggga gacgaatccg atgaggtttc ccctgcagac 600

tacgagcgca ttctacactg gttttatgaa atgcaaaaag aatcaaaaat ccagttgaaa 660

gcaacctgtg ctccccacta tttcaggata atgcgccagc aagcaaaaaa agaaggaatt 720

gagatatcgg ttaaaaccca cggctatgaa gcaatgacaa aaggctgcct cggaggtaca 780

ggcttctgtt ttgtatcaag tgtgggtaaa gtcttccctt gcggctacct tccagttctt 840

gccggaaaca taagggaaca gcctttcagg gagatctggg aaaacgccga ggtcttcagg 900

aaactgagag accccgaaga gcttaaagga aagtgcggga tatgtgaata caaaaaagtc 960

tgtgcaggct gcagggcaag agcctatgct gctacaggcg actatctcga agaagagcct 1020

tactgcatat acaggcccgg aaaaaagtga 1050

<210> 5

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

atgatcgcca tgaccaacgc cccgcgcctc atcgcctggg agctgaccgc gggctgcaac 60

ctgaactgcg tgcattgccg cggcgcctcg acctcgtcgg tgccggccgg cgagctgacg 120

accgacgagg ccaagcactt catcgacgag gtggcctcga tcggcaagcc gatcctgatc 180

ctctcgggcg gcgagccgct cacccgcccc gacgtgttcg agatcgcccg ctatggcacc 240

gacgccggcc tgcgcgtggt gctggccacc aacggcacgc tgctcacccc ggagatcgtg 300

gagaagctgc gcgccgcggg cgtgcagcgc ctgtcggtgt cgatcgacgg cgccaacgcg 360

gagacccatg acaacttccg cggcatgccg ggcgccttcg agcgcacgct ggccggcatc 420

gaggtgctcc gcaaggcgga cttcccgttc cagatcaaca ccacggtgtc gaagcgcaac 480

ctggaggaga tcaccaagac cttcgagctg gcgaaggagc tgggcgcggt ggcctatcat 540

gtgttcttcc tcgtgccgac cggccgcggc gacgagtcgg acgaggtgtc gccggccgac 600

tatgagcgca tcctgcattg gttctacgag atgcagaagg agtcgaagat ccagctgaag 660

gcgacctgcg ccccgcacta tttccgcatc atgcgccagc aggccaagaa ggagggcatc 720

gagatctcgg tgaagaccca tggctatgag gcgatgacga agggctgcct gggcggcacc 780

ggcttctgct tcgtgtcgtc ggtgggcaag gtgttcccgt gcggctatct cccggtgctg 840

gccggcaaca tccgcgagca gcccttccgc gagatctggg agaacgccga ggtgttccgc 900

aagctccgcg acccggagga gctgaagggc aagtgcggca tctgcgagta caagaaggtg 960

tgcgccggct gccgcgcgcg cgcctatgcg gccacgggcg actatctgga ggaggagccg 1020

tactgcatct atcgcccggg caagaagtga 1050

<210> 6

<211> 500

<212> DNA

<213> 类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）

<400> 6

gcccgacgat ccggccctga gcgagcggtt cggccaccgg atcgtcatcg cctgggacca 60

gagccgcgag gcgctgacgg cggtgcgcaa ggccatgccg ttccttctgc gcgccgacaa 120

tgtggacatc gtgatcgtcg atcccgcggc ccatggcgcc gaacggtcgg atccgggcgg 180

cgcgctctgc cagatgctcg tgcgccacgg ggtccgggcc gaggtttcgg tgctggccaa 240

gacgatgccg cgcatttccg acgtgatcgc gcgccatgtg cgcgatcagg atgccgatct 300

tctggtgatg ggtgcctacg gccattcccg cttccgcgag gcgatcctcg gcggggccac 360

gcgggacatg ctcgaactgg cggaagtacc cgtcctgatg gcgcactgac ggaagaaggg 420

gctgcctctg cccgcctcgc aaggggcggg ccttttcaag ccggccgggg cgggaccggc 480

gggtcgcctc agaccggcag 500

<210> 7

<211> 500

<212> DNA

<213> 类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）

<400> 7

gtgcagcgtc atgccgtttt ccccgcttga tctgaatcaa agcaatagac gactttcacg 60

cctagcgaaa gccgatggcg gccgtttctc atcttgcaaa actcgggcta tttgacgcgc 120

gggttccacg ctacacgagc tacccgacgg cgccgaactt cggtgtcggg gtaaccgaga 180

acctccatgc ggactggatc tcgtccattc ctgcgggagg ttcaatatca ttatacctcc 240

atgtcccttt ctgtcgcagg ctctgctggt tctgcgcctg ccgcactcag gggacgagtt 300

cggacgcccc cgtgcgcgct tatgccgcag ccctcaaatc cgagctcgcg ctcctgcggg 360

cgcggctcgc tccgggcgtg cgactggcgc ggatgcactg gggcgggggc acgcccacgc 420

tcctgccgcc cacgctgatc catgagctgg ctctggcgat ccgcgatgcg gtgccgtccg 480

atgccgagac ggacttctcg 500

<210> 8

<211> 985

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> ampR抗性片段

<400> 8

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 60

gggattttgg tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata aacagtaata caaggggtgt 120

taagcttatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg 180

ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt 240

gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 300

tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 360

attatcccgt gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 420

tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 480

agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 540

aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 600

tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 660

cacgatgcct gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 720

tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 780

tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 840

tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 900

tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 960

aggtgcctca ctgattaagc attgg 985

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Left-F

<400> 9

acagctatga catgattacg gcccgacgat ccggccctga 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Left-F

<400> 10

tgattaagca ttggaagctt ctgccggtct gaggcgaccc 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Right-F

<400> 11

gaaaagatca aaggatcttc gtgcagcgtc atgccgtttt 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Right-R

<400> 12

cctgcaggtc gactctagag cgagaagtcc gtctcggcat 40

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Amp-F

<400> 13

ccaatgctta atcagtgagg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Amp-R

<400> 14

gaagatcctt tgatcttttc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AhbD-F

<400> 15

gagctcatga tcgccatgac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AhbD-R

<400> 16

cgggcaagaa gtgaggatcc 20

Claims

1.一种重组菌，相比出发菌株，所述重组菌具有表达水平降低的调节子FnrL，并具有导入的编码血红素合成酶AhbD的表达盒，其中，所述出发菌株为类球红细菌，其中，所述调节子FnrL的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述AhbD的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.如权利要求1所述的重组菌，其中，所述出发菌株为野生型菌株、基因工程菌株和/或化学诱变菌株。

3.如权利要求1所述的重组菌，其中，所述重组菌包含具有修饰的调节子FnrL，所述修饰包括调节子FnrL的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的置换、***和/或缺失，以使相比出发菌株而言调节子FnrL的表达水平降低。

4.如权利要求3所述的重组菌，其中，所述重组菌具有部分或全部氨基酸残基缺失的调节子FnrL，以使相比出发菌株而言调节子FnrL的表达水平降低。

5.如权利要求3所述的重组菌，其中，相比出发菌株，所述重组菌具有使FnrL的表达水平降低的一个或多个氨基酸置换或***。

6.如权利要求1或2所述的重组菌，其中，所述重组菌包含具有修饰的fnrL基因，所述修饰包括fnrL基因的核苷酸序列中的一个或多个碱基的置换、***和/或缺失，以使相比出发菌株而言调节子FnrL的表达水平降低。

7.如权利要求6所述的重组菌，其中，所述重组菌具有部分或全部碱基缺失的fnrL基因，以使相比出发菌株而言调节子FnrL的表达水平降低。

8.如权利要求6所述的重组菌，其中，相比出发菌株，所述重组菌具有使FnrL的表达水平降低的一个或多个碱基置换或***。

9.如权利要求1或2所述的重组菌，其中，相比出发菌株，所述重组菌包含具有修饰的调控fnrL基因表达的元件，所述修饰包括fnrL基因表达的调控元件中的一个或多个碱基的置换、***和/或缺失，以使调节子FnrL的表达水平降低。

10.如权利要求1或2所述的重组菌，其中，所述重组菌为编码所述调节子FnrL的基因被敲除的重组菌。

11.如权利要求1或2所述的重组菌，其中，所述编码AhbD的多核苷酸序列为密码子优化的。

12.如权利要求1或2所述的重组菌，其中，所述编码血红素合成酶AhbD的表达盒整合进宿主细胞的基因组中，或者处于游离型质粒中。

13.一种如权利要求1-12中任一项所述的重组菌的制备方法，所述方法包括：使出发菌株中的调节子FnrL的表达水平降低，并向所述出发菌株中导入编码血红素合成酶AhbD的表达盒，其中，所述出发菌株为类球红细菌。

14.如权利要求13所述的方法，其中，将所述出发菌株中编码调节子FnrL的基因敲除，从而使所述出发菌株中的所述调节子FnrL的调控能力降低。

15.一种活菌制剂，其中，包含如权利要求1-12中任一项所述的重组菌。

16.如权利要求1-12中任一项所述的重组菌或如权利要求15所述的活菌制剂在制备卟啉类化合物中的用途，其中，所述卟啉类化合物选自粪卟啉Ⅲ、Fe-粪卟啉Ⅲ和血红素中的一种或多种。