WO2019096453A1 - Vorrichtung und verfahren zur immobilisierung von biomolekülen mittels makroskopischer partikel - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur immobilisierung von biomolekülen mittels makroskopischer partikel Download PDF

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WO2019096453A1
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biomolecules
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liquid
discharge valve
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Kai Hassler
Harald Quintel
Konstantin Lutze
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Hombrechtikon Systems Engineering Ag
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Definitions

  • the invention relates to a device for the reversible immobilization of biomolecules according to the preamble of independent claim 1.
  • the invention further relates to a method for the reversible immobilization of biomolecules according to the preamble of independent claim 11.
  • the invention further relates to an apparatus for the automated processing of biomolecules according to the The preamble of claim 14, comprising a device for the reversible immobilization of biomolecules according to the preamble of independent claim 1, for carrying out a
  • DNA extraction which precipitates DNA in a nonpolar environment.
  • DNA can be removed by centrifugation, e.g. after cell disruption or by electrophoretic methods.
  • Biomolecules can also be synthesized and purified by immobilization on an insoluble support.
  • Common substrates for immobilizing biomolecules are glass as well as other, less common substrates such as gold, platinum, oxides, semiconductors and various polymer substrates.
  • Magnetic bead-based clean-up and “magnetic bead-based normalization” are widespread methods for immobilization, purification and
  • Sequencing or DNA detection e.g., by PCR, English polymerase chain reaction, German Polymerase Chain Reaction.
  • the magnetic particles are typically held in the container by ring magnets which enclose a container.
  • a solution containing impurities can be pipetted off, while the magnetic particles with the bound biomolecules remain in the container.
  • the magnetic beads were developed at the Whitehead Institute in 1995 for the purification of PCR products.
  • the magnetic particles are mostly paramagnetic and may, for example, consist of polystyrene, which is coated with iron. On the iron then various molecules can be attached with carboxyl groups. These carboxyl groups can reversibly bind the DNA molecules. This immobilizes the DNA molecules.
  • magnetic particles are on the order of about 1 pm.
  • Magnetic particle methods usually include the following steps. First, the PCR products are bound to the magnetic particles. Subsequently, the magnetic particles with the attached PCR Products separated from impurities (this step is realized, for example, by pipetting off the solution of the solid). Then the following steps. First, the PCR products are bound to the magnetic particles. Subsequently, the magnetic particles with the attached PCR Products separated from impurities (this step is realized, for example, by pipetting off the solution of the solid). Then the following steps. First, the PCR products are bound to the magnetic particles. Subsequently, the magnetic
  • the plate may be embodied inter alia as a microtiter plate or microplate.
  • the magnetic particle-bound nucleic acids are collected at the bottom and at the edge of the cavities and, depending on the routine, brought into solution again by optimized pipetting up and down. Final the DNS or the RNA for a direct storage or further
  • the most important methods for the synthesis, normalization and purification of biomolecules are the methods with magnetic particles.
  • the biomolecules are bound to the surface of the magnetic particles.
  • the magnetic particles are then fixed by means of a magnet and the solution in which by-products and impurities are located can be easily separated.
  • the biomolecules can be easily and quickly cleaned and isolated. Due to the small size of the magnetic beads can move freely in the experimental approach. If one now wants to In a washing step, remove the liquid from the vessel, a magnet is positioned on the container and then the
  • Liquid can be dissipated without the magnetic particles.
  • the magnetic particles are small para- or ferromagnetic beads, which with
  • Solid phase methods are synthesized. One can use DNA strands, just like polypeptides, by sequentially attaching activated monomers to a growing chain that binds to an insoluble matrix
  • Magnetic particle separation can take place fully automatically in the cavities of extraction vessels used.
  • the object of the invention is therefore a device for the immobilization of biomolecules, a method for the reversible immobilization of
  • the object is achieved by a device for the reversible immobilization of biomolecules with the features of independent claim 1, by a method for the reversible immobilization of biomolecules with the
  • the device comprises a container which can be filled with a liquid with biomolecules, a depression for receiving a liquid with biomolecules and particles.
  • the container of the device comprises a feed opening for supplying a liquid with biomolecules into the depression and
  • arranged in the recess of the container particles have a
  • the particles at least one particle can be understood, since, depending on the size ratio between the particle and the container, a particle may be present.
  • a relevant size of the particle which prevents the particles from passing through the discharge valve, and may in particular a relevant edge length, relevant diagonal, relevant cross-sectional contour, relevant cross section, relevant cross section of an imaginary outer contour
  • the opening dimension of the purge valve can be understood to be a relevant size of the purge valve (or its opening), which prevents that the particles can pass through the discharge valve, and in particular can be a diameter, a diagonal, a height of the opening base or the edge length of an opening of the discharge valve, through which the liquid can be discharged from the wells of the container.
  • the opening dimension is thus in principle the maximum relevant
  • the opening area of the discharge valve is the area through which the liquid exits the container into the discharge valve. This is
  • a transition point between the discharge valve and the container which is typically the narrowest portion of the container (e.g., also the end of a taper).
  • the transition point between the discharge valve and the container may also be the place in which the
  • Valve effect acts on the liquid, ie where such a force or resistance is exerted on or against the liquid that the liquid can be dissipated only after overcoming this force or resistance (i.e., after opening the purge valve).
  • a relevant quantity is therefore relevant to the flow process of the liquid and the particles from the container, since the relevant size prevents the particles from leaving the container through the discharge valve.
  • Relevant surfaces (among others
  • Opening area of the purge valve, relevant cross-sectional area of the particles) are thus areas that prevent their expansion that the particles leave the container through the discharge valve.
  • the expansion of the particle is greater than the opening size of the discharge valve
  • the particles can not pass the purge valve and thus can not be discharged through the discharge valve, in any possible orientation, with the liquid.
  • the opening dimension of the purge valve must be smaller than the expansion of the particles.
  • a relevant cross-sectional contour of the particle may therefore not include an expansion measure (that is, no relevant variable) which is smaller than the opening dimension of the discharge valve, since otherwise the particle may pass through the discharge valve in a specific orientation, even if it may only be a single orientation.
  • the extent of expansion of the particle can correspond to a broadest relevant extent of a relevant cross-sectional area of the particle.
  • every widest relevant extent of each possible relevant cross-sectional area (but not of the non-relevant cross-sectional areas) of the particle, in particular of every possible relevant imaginary cross-sectional area, must be greater than the opening dimension of the discharge valve.
  • Cross-sectional area here is an imaginary circular area, which runs along the outer points and thus along the relevant maximum extent of the cross-sectional area.
  • the expansion of the particle then corresponds to the diameter of this imaginary circular area.
  • the expansion measure according to the claims relates in particular to the minimum relevant extent of expansion of the particle, in particular to the minimum relevant extent of expansion of the smallest particle.
  • an imaginary relevant cross-sectional area 3d is shown in FIG. 3A.
  • the imaginary relevant cross-sectional area 3d of the particle 3 is hereby of an imaginary one
  • This relevant diameter of the imaginary circular area 3b is in this case the expansion mass b of the particle.
  • This expansion mass b of the particle must be greater than the opening dimension of the purge valve and that for each possible imaginary cross-sectional area 3d. By such geometry ratios, it is not possible in the inventive device that the particles 3 can pass through the discharge valve.
  • FIG. 3B shows a similar particle 3 and is intended to illustrate which quantities can not be understood as an extent of expansion (that is, not as a relevant variable) of the particles 3 in the context of the invention.
  • the particle 3 of FIG. 3B has a different outer contour.
  • the particle 3 a shows a similar particle 3 and is intended to illustrate which quantities can not be understood as an extent of expansion (that is, not as a relevant variable) of the particles 3 in the context of the invention.
  • the particle 3 of FIG. 3B has a different outer contour.
  • Expansion dimension b as the particle 3 of Fig. 3a, but the particle 3 also has a dimension q which is significantly smaller than that
  • Expansion measure b The extent q may be smaller than that
  • the discharge valve can simply consist of an opening from which the liquid can be drained from the wells of the container.
  • purge valve is intended to clarify that there is a mechanism which can hold the fluid with biomolecules in the container and which device can manipulate that the liquid can be removed with biomolecules by opening the purge valve from the wells of the container.
  • Essential for the invention is that the expansion of the particle is greater than the opening size of the purge valve.
  • Geometry conditions namely ensures that the carrier for the biomolecules (ie the particles) not in addition to a magnet in the
  • Container must be fixed. Since the macroscopic particles can not be eluted through the purge valve, they remain in the well of the container as the liquid is removed, while the liquid can drain between the particles. Particularly advantageously, the shape of the particles may favor the outflow of a liquid.
  • Geometry relationships between the particles and the discharge valve need not be used in pipette procedures, or a corresponding device (in particular an automated device) must not include a pipette or pipetting device.
  • no pipette is needed to remove liquid solutions or the liquid or contaminants from the well of the container.
  • no holding device is needed which fixes the particles in the container, e.g. a magnet.
  • the particles may, in principle, simply function as carriers of solid phase extraction, but in biochemical processes they may also fulfill various other functions known in the art, e.g. as carrier for the start sequence for a polymerase chain reaction.
  • the ability of particles to adsorb or bind to biomolecules may be due to different interactions, depending on the material.
  • the interaction between particles and Biomolecule based on polar / nonpolar and / or ionic and / or covalent and / or multiple interactions.
  • the interaction can also be based on hydrogen bonds or dipole interactions.
  • immobilisable means one or a combination of the above-described interactions between the particles and biomolecules according to the invention.
  • the device and method for the immobilization of biomolecules can be understood in the context of the invention not only the immobilization of the biomolecules on the surface of the particles but also a
  • Liquids in washing, reaction and elution steps wherein these steps can be carried out in particular in the context of a purification of the biomolecules.
  • the particles may be macroscopic particles. That Not only that the expansion of the particles is greater than the opening dimension of the discharge valve, but the particles may in particular be significantly larger than the known in the prior art magnetic particles which are usually large by 1 pm. Thus, particles according to the invention may be larger by about a factor of 50-100, in particular 90-5000, in particular 100-5000, particularly preferably 100-1000.
  • Macroscopic particles may in particular also be nanobind
  • biomolecule includes, inter alia, DNA, RNA, nucleic acids, proteins, start sequences for biomolecules,
  • a washing step is generally a process step in which the liquid is discharged from the containers by actuation of the valve and in which way the impurities of magnetic particles are separated with the attached biomolecules. Washing may also include washing with a wash solution (water or others, such as low polarity liquids, such as, in particular, ethanol or an ethanol-water mixture).
  • a wash solution water or others, such as low polarity liquids, such as, in particular, ethanol or an ethanol-water mixture.
  • a reaction step is generally a process step in which the biomolecules bound to the macroscopic particles are reacted, bound to the particles, or extended (chain extension, e.g., PCR "polymerase chain reaction”).
  • the reaction step and the washing step relate in particular to the necessary steps of the solid phase extraction, wherein the fixing and dissolving of the molecules on the carrier (particle according to the invention) on the reaction step and rinsing or washing (eg, with a wash buffer) between the various steps the
  • Washing step refers. Between different steps is usually an elution step (especially with an elution buffer)
  • inventive device is removed.
  • a wash buffer is a solution for removing unbound
  • An elution buffer is a solution for dissolving and removing biomolecules bound to the surface of the particles.
  • a contaminant is generally a substance which is not fully reacted or is not bound to the magnetic particles, the solvent, by-products and contaminants, as well as a mixture of two or more of those described above.
  • a liquid may be a solution within the scope of the invention,
  • reaction mixture of biomolecules and / or reagents and / or impurities.
  • a particle according to the invention can generally be a particle with relevant diameter, relevant diagonal or relevant edge length of 50-5000 pm, in particular with relevant diameter, relevant diagonal or relevant edge length of 100-5000 pm, in particular with relevant diameter, relevant diagonal or relevant edge length of 90 to 500 pm, particularly preferably with relevant diameter, relevant diagonal or relevant edge length of 100 to 1000 pm or 1 -5 mm.
  • a particle of any suitable materials can be used to bind biomolecules. Among these, among others
  • Multilayer systems of functional layers for binding biomolecules and other layers e.g., magnetic layers.
  • the particle can also be made of a mixture or a composite.
  • the particle may consist of silica (S1O2), or the particle may also be a coated one
  • the particle may consist inter alia of matrix polymers such as polyvinyl butyral (PVB) and / or polymethymethacrylate (PMMA), functional components such as magnetite (magnetic
  • Nanoionenleyer can be embedded in the polymer matrix.
  • a particle may also consist of silica, glass or gold, or any other material known in the art suitable for the immobilization of biomolecules.
  • a biomolecule may hereinafter generally be understood as meaning thiol groups and / or amino groups and / or hydroxy groups and / or
  • the advantages of the device according to the invention and of the method according to the invention include: low process times due to faster draining.
  • the apparatus and method can be used for post-ligation purification.
  • the particles may have a density which is greater than or equal to the density of the liquid with biomolecules.
  • sinking or suspended in the liquid particles can be achieved.
  • in the liquid floating particles may be advantageous, as it facilitates the drainage of the liquid from the discharge valve.
  • the particles may have a convex outer shape. That The particles have no negative surfaces or cavities in which the liquid can remain, or in which larger
  • Biomolecules can remain.
  • cavities or porosity may have a positive effect on the yield due to the surface enlargement.
  • the size ratio between biomolecules and cavities plays a major role. If the cavities are larger by about a factor of 5 than the biomolecules, the probability of retention of biomolecules in the particles is significantly lower, so that a higher yield can be achieved.
  • the opening size of the purge valve should be at most 95% to 90% of the expansion of the particles.
  • the extent of expansion of the particles could be 90 pm and that
  • Opening dimension of the purge valve should be less than 90 pm.
  • the particles according to the invention have a density which is greater than that of the liquid present in the depressions, the particles sink to the bottom of the container. Usually, at this point, the discharge valve is arranged, resulting in reduced
  • Effluent efficacy may result in the discharge of the liquid from the wells, since the discharge valve acts as a kind of bottleneck because of the smaller size compared to the particles.
  • the container may have a taper towards the container bottom (direction discharge valve). This taper is particularly advantageous in the case of a large difference in size (approximately a factor of 10) between the particles and the discharge valve, since such a clogging of the discharge valve can be prevented.
  • the taper is constantly narrower in the direction of the purge valve, so that fewer and fewer particles are arranged in the direction of the purge valve in the recess of the container.
  • the ratio of the expansion of the particles to the opening dimension of the purge valve depends, inter alia, on the type of purge valve, on the shape, in particular internal shape of the purge valve (or its opening), on the shape of the particles, the material of the particles Porosity of the particles and the liquid or biomolecules used.
  • the particles according to the invention may also have at least one surface from the group consisting of round, quadrangular, dirty and n-shaped surfaces. Depending on the internal shape of the discharge valve (or its opening), the particle shape can be selected. It can be selected. It can be selected.
  • the particles may have a circular or annular or elliptical or cuboid, in particular platelet-shaped or cylindrical or pyramidal or polyhedral, in particular platonic form.
  • the shapes can also be present in distorted structures.
  • the shape should be selected to match the shape of the purge valve.
  • the mixing of the molds can be particularly advantageous, if angular particles and a round discharge valve (and vice versa) are present, the liquid can drain off particularly well. Also at
  • the liquid can flow out of the container particularly well.
  • particle shapes can be used mixed.
  • the discharge valve can be configured, inter alia, in various ways.
  • the discharge valve may in this case be arranged at the lower end of the container (opposite to the feed opening).
  • the discharge valve may be or comprise an opening and / or be designed as a capillary.
  • the opening of the discharge valve a have any inner shape, which may be, for example, round, square, oval, triangular or n-shaped.
  • capillaries typically have an inside diameter (for round capillaries, square edge length or capillary opening surface area) of 1-1 ohms, more preferably 1-5pm, especially 4-5pm.
  • the expansion of the inventive particles should then be greater than the inner diameter (ie the
  • the discharge valve can also be designed as a diaphragm valve or as a mechanical valve.
  • a mechanical valve are, inter alia, a through valve, an angle valve and an oblique seat valve, which e.g. can be opened and closed via a rotating mechanism or spring mechanism.
  • the device may be an opening mechanism of the
  • the opening mechanism of the purge valve may be in particular compressed air, a mechanical mechanism, a movement of a diaphragm or another suitable opening mechanism.
  • the discharge valve and the opening mechanism of the discharge valve can be used in conjunction for the controlled drainage of the liquid
  • the opening mechanism may be a pressing device, which is arranged on the container such that in the container, a pressure on the
  • Liquid with biomolecules can be generated, through which the liquid with the biomolecules from the container is removable. Opening the
  • Leakage valve pressure valve, which may also be a capillary
  • the pressure device can be arranged either at the feed opening and an overpressure (in comparison to the atmospheric pressure) on the
  • the pressure device can interact with the discharge valve in such a way that the pressure device is responsible for opening and closing the discharge valve.
  • a mechanical mechanism may be arranged on the discharge valve, if this is designed as a mechanical valve and be responsible for the opening and closing of the mechanical valve.
  • an opening mechanism is not mandatory because the purge valve can also be manipulated by a user.
  • the container can be formed in any way.
  • the container may be a multiwell plate, wherein the
  • Multiwell plate has a plurality of wells.
  • a multiwell plate may in particular also be a microtitration plate.
  • the discharge valve of the container can also be designed as a capillary, through which the liquid with the particles is held by capillary forces and / or the liquid is removed by pressure.
  • a plurality of recesses may each comprise a supply port and a discharge valve.
  • the container can also be designed as a perforated plate.
  • a method for the reversible immobilization of biomolecules comprises the following steps, which can be carried out successively, but need not.
  • Particles according to the invention and a liquid with biomolecules are arranged in a container, in particular in its recess. Binding of biomolecules, in particular reversible bind, the biomolecules to the
  • Contaminants removed by a discharge valve, wherein the particles remain in the recess of the container. Detachment of biomolecules from the particles.
  • the removal of the liquid from the recess of the container takes place by opening the purge valve. It is also possible that the biomolecules are removed with the discharge valve and in particular be transferred to another container.
  • the proposed method is preferably in a
  • Laxative be removed and transferred in particular in another container.
  • the process according to the invention can therefore additionally comprise the addition of a liquid without biomolecules, in particular a washing buffer, preferably before the dissolution of the biomolecules from the particles, or of an elution buffer, preferably after addition of a washing buffer.
  • a washing buffer preferably before the dissolution of the biomolecules from the particles
  • an elution buffer preferably after addition of a washing buffer.
  • the particles with the immobilized biomolecules are fixed in the container by the size difference between the expansion of the particles and the opening size of the discharge valve, so that the particles remain in the container while the liquid can be removed from the discharge valve.
  • the liquid can with the opening mechanism from the
  • Be discharged discharge valve wherein the liquid flows between the particles, so that no or only a few liquid residues remain in the container and on the particles.
  • the biomolecules bound to the particles can be detached from the surface and subsequently reused.
  • steps such as adding the particles, supplying and discharging the liquid and using the opening mechanism (opening / closing of the valve) are automatically executed.
  • the removal of the liquid advantageously takes place via the discharge valve and not via a pipette, since less liquid remains on the particles and in the depressions of the container, in particular if it is "blown out” under pressure.
  • Fig. 1 is a schematic representation of a device for reversible
  • Fig. 2 is a schematic representation of a device for reversible
  • Fig. 3A is a schematic representation of an imaginary
  • Fig. 3B is a further schematic representation of an imaginary
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a device 1 for the reversible immobilization of biomolecules with a multiwell plate 20 and particles 3 according to the invention.
  • the container 2 is in the present embodiment as a
  • the Multiwell plate 20 configured.
  • the multiwell plate 20 in this case comprises a plurality of wells 22.
  • the wells 22 of the multiwell plate 20 each comprise a feed opening (not shown) and a discharge valve. 4
  • the inventive particles 3 are in the wells 22 of the
  • Multiwell plate 20 is arranged.
  • Feed opening (not shown) may be added.
  • the liquid can be removed via the discharge valve 4 from the wells 22. Subsequently, the biomolecules by supplying and removing a liquid
  • Solvent be detached from the surface of the particles 3 or further processed with (several) successive reaction steps and washes.
  • the particles 3 are designed platelet or parallelepiped and the expansion mass b of the particles 3 is greater than the opening dimension d of the discharge valve 4.
  • the discharge valve 3 may have a round inner shape in this embodiment, wherein the edge length b of the particles 3 must be greater
  • a capillary could be used whose inner diameter d is smaller than the expansion mass b of the particles.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of a device 1 for the reversible immobilization of biomolecules with a multiwell plate 20 and a printing device 6.
  • the container 2 is in the present embodiment as a
  • the Multiwell plate 20 configured.
  • the multiwell plate 20 in this case comprises a plurality of wells 22.
  • the wells 22 of the multiwell plate 20 in this case each comprise a feed opening (not shown) and a discharge valve 4.
  • a printing device 6 is in this case at the feed openings (not shown) arranged that a pressure P on the Recesses 22 can be exercised.
  • the inventive particles 3 are in the wells 22 of the
  • Multiwell plate 20 is arranged.
  • Feed opening (not shown) may be added. After the biomolecules in the liquid have bound to the surface of the particles 3, the liquid can be removed from the recesses 22 via the discharge valve 4. For this purpose, the printing device 6 exerts a pressure P on the liquid contained in the recesses 22, so that it is ejected through the discharge valve 3.
  • the particles 3 are designed in the shape of platelets or cuboids, and the expansion dimension b of the particles 3 is greater than the opening dimension d of the discharge valve 4. It is thus achieved that the particles 3 remain in the depressions 22 when the liquid is removed by a pressure P. without having to be additionally fixed.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Vorrichtung (1) zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen mittels Partikel (3). Hierbei umfasst die Vorrichtung (1) einen mit einer Flüssigkeit mit Biomolekülen befüllbaren Behälter (2), eine oder mehrer Vertiefungen (22) zum Aufnehmen von Flüssigkeiten und Biomolekülen und von den Partikeln (3). Der Behälter (2) der Vorrichtung (1) umfasst eine Zuführöffnung zum Zuführen von Flüssigkeiten und Biomolekülen in die Vertiefung (22) und ein Abführventil (4) mit einem Öffnungsmass (d) zum Abführen einer Flüssigkeit mit Biomolekülen aus der Vertiefung (22). Die in der Vertiefung (22) des Behälters (2) angeordneten Partikel (3) besitzen ein Ausdehnungsmass (b). Hierbei ist das Ausdehnungsmass (b) der Partikel (3), an welchen die Biomoleküle immobilisierbar sind, insbesondere reversibel immobilisierbar sind, grösser als das Öffnungsmass (d) des Abführventils (4) des Behälters (2).

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen mittels makroskopischer Partikel
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 1. Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 11. Die Erfindung betrifft weiter einen Apparat zur automatisierten Verarbeitung von Biomolekülen gemäss dem Oberbegriff des Anspruchs 14, umfassend eine Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 1 , zur Durchführung eines
Verfahrens zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 11.
Im Stand der Technik sind viele Methoden zur Aufreinigung von DNS und anderen Biomolekülen bekannt. Eine Art der Aufreinigung ist die DNS- Extraktion, bei welcher die DNS in unpolarer Umgebung ausgefällt wird. Auch kann DNS über Zentrifugation, z.B. nach einem Zellaufschluss gereinigt werden oder über elektrophoretische Methoden.
Biomoleküle können auch durch Immobilisierung auf einem unlöslichen Träger synthetisiert und gereinigt werden. Übliche Substrate um Biomoleküle zu immobilisieren sind Glas sowie anderen, weniger verbreitete Substrate wie Gold, Platin, Oxide, Halbleiter und diverse Polymersubstrate. Da eine manuelle Aufreinigung und Verarbeitung bei zahlreichen
Arbeitsgängen zu viel Zeit erfordert erfolgen die Prozesse heutzutage meist vollautomatisiert, können jedoch auch heute noch manuell erfolgen. So spielen für die Automatisierung von Labormethoden sogenannte„magnetic beads“ (magnetische Partikel) eine grosse Rolle.
“Magnetic bead-based clean-up” und“magnetic bead-based normalization” sind weit verbreitete Verfahren zur Immobilisierung, Aufreinigung und
Konzentrationsanpassung von Nukleinsäuren. Typische Anwendungsgebiete dieser Verfahren sind die Probenvorbereitung im Kontext von DNS
Sequenzierung oder DNS Detektion (z.B. mittels PCR, englisch polymerase Chain reaction, deutsch Polymerase-Kettenreaktion).
Im Stand der Technik werden die magnetischen Partikel typischerweise durch Ringmagnete, welche einen Behälter umschliessen, im Behälter gehalten. Dadurch kann eine Lösung mit Verunreinigungen abpipettiert werden, während die magnetischen Partikel mit den gebundenen Biomolekülen im Behälter verbleiben.
Die magnetischen Partikel (magnetic beads) wurden 1995 am Whitehead Institute zu Aufreinigung von PCR Produkten entwickelt. Die magnetischen Partikel sind meist paramagnetisch und können z.B. aus Polystyrol bestehen, welches mit Eisen beschichtet ist. Auf dem Eisen können dann verschiedene Moleküle mit Carboxylgruppen angebracht sein. Diese Carboxylgruppen können die DNS-Moleküle reversibel binden. Dadurch werden die DNS- Moleküle immobilisiert. Typischerweise befinden sich magnetische Partikel in einer Grössenordnung von ungefähr 1 pm. Verfahren mit magnetischen Partikeln umfassen meist folgende Schritte. Zuerst werden die PCR-Produkte an die magnetischen Partikel gebunden. Anschliessend werden die magnetischen Partikel mit den angehefteten PCR- Produkten von Verunreinigungen getrennt (dieser Schritt wird z.B. durch abpipettieren der Lösung vom Feststoff realisiert). Dann werden die
magnetischen Partikel mit den angehefteten PCR-Produkten gewaschen. Nach dem Waschen werden die PCR-Produkte von den magnetischen Partikeln eluiert und auf eine neue Platte transferiert. Hierbei kann die Platte unter anderem als Mikrotitrierplatte oder Microplate ausgeführt sein.
Bei vollautomatisierten Prozessen werden nach dem Einbringen des
Ausgangsmaterials in einem Isolationsprozess die notwendigen Reagenzien automatisch zur Probe pipettiert und mittels Pipettenspitze wieder entfernt.
Die Magnetpartikel-gebundenen Nukleinsäuren werden am Boden und am Rand der Kavitäten gesammelt und in Abhängigkeit der Routine durch optimiertes Auf- und Abpipettieren wiederum in Lösung gebracht. Final werden die DNS oder die RNS für eine direkte Lagerung oder weitere
Anwendungen in separate Gefäße mit Deckel eluiert.
So sind die wichtigsten Verfahren zur Synthese, Normalisierung und zum Reinigen von Biomolekülen die Verfahren mit magnetischen Partikeln. Hierbei werden die Biomoleküle an die Oberfläche von den magnetischen Partikeln gebunden. Die magnetischen Partikel werden dann mittels eines Magneten fixiert und die Lösung, in welcher sich Nebenprodukte und Verunreinigungen befinden, können einfach abgetrennt werden. So können die Biomoleküle einfach und schnell gereinigt und isoliert werden. Durch die geringe Grösse können sich die magnetischen Kügelchen frei im Versuchsansatz bewegen. Will man nun z.B. in einem Waschschritt die Flüssigkeit aus dem Gefäss entfernen, wird ein Magnet am Behälter positioniert und dann kann die
Flüssigkeit ohne die magnetischen Partikel abgeführt werden.
Bei den magnetischen Partikeln (auch magnetic beads genannt) handelt es sich um kleine para- oder ferromagnetische Kügelchen, welche mit
verschiedenen Materialien beschichtet werden, welche die benötigten Eigenschaften vermitteln. Oft werden Nickelpartikel verwendet, welche mit einem Kunststoff beschichtet sind.
So können z.B. auch DNS-Sonden und Gene in automatisierten
Festphasenmethoden synthetisiert werden. DNS-Stränge kann man, genau wie Polypeptide durch das aufeinanderfolgende Anhängen aktivierter Monomere an eine wachsende Kette, die an eine unlösliche Matrix
(magnetische Partikel) gebunden ist, synthetisieren. Als aktivierte Monomere können hier geschützte Phosphoramidite dienen.
Dieses Vorgehen erlaubt die Isolierung hochreiner Biomoleküle mit exzellenten Ausbeuten. Das zugrundeliegende Verfahren der
Magnetpartikelseparation kann dabei vollautomatisiert in den Kavitäten von verwendeten Extraktionsbehältern erfolgen.
Auch sind im Stand der Technik Adsorptionsmethoden bekannt, bei welchen die DNS z.B. in leicht saurer Umgebung an Silica-Gel gebunden wird. In diesem Zusammenhang beschreibt die US 2018/0001325 sogenannte magnetische Silica-Nanomembranen. Diese magnetische Silica- Nanomembranen werden zur Festphasenextraktion von Biomolekülen verwendet. Auch hier wird wie bei Verfahren mit den„magnetic beads“, die magnetischen Silica-Nanomembranen mit einem Magneten manipuliert. Bei beiden Verfahren, also sowohl bei den Silica-Nanomembranen, als auch bei den magnetischen Partikeln werden die Verfahrensschritte in einem Behälter mit einer Öffnung durchgeführt. Dabei erfolgt Zufuhr und Abfuhr der von Flüssigkeiten aus dem Behälter über die Öffnung mittels einer
Pipettiervorrichtung. Hierbei kann durch die festen Träger (Silica- Nanomembranen und magnetischen Partikel) eine Festphasenextraktion von Biomolekülen (oder andere biochemische Verfahren) durchgeführt werden.
Wie auch die„magnetic beads“ weisen diese magnetischen Silica- Nanomembranen jedoch den wesentlichen Nachteil auf. Für die Verfahren werden Magnete benötigt, um die Träger (Silica-Nanomembranen
beziehungsweise magnetische Partikel) für die Biomoleküle zu fixieren. Dies führt nicht nur zu einer deutlich komplizierteren Vorrichtungsgeometrie, sondern auch zu einer sehr komplizierten und aufwendigen
Verfahrensführung. Ausserdem weisen die im Stand der Technik bekannten Verfahren und Vorrichtungen den wesentlichen Nachteil auf, dass eine grosse Menge an Pipettenspitzen benötigt werden, da bei jedem einzelnen Pipettierschritt, zum vermeiden eventueller Kontaminationen, die Pipettenspitzen ausgetauscht werden müssen. Aufgabe der Erfindung ist es daher eine Vorrichtung zur Immobilisierung von Biomolekülen, ein Verfahren zur reversiblen Immobilisierung von
Biomolekülen und einen Apparat zur automatisierten Verarbeitung von Biomolekülen mit einer Vorrichtung zur Immobilisierung von Biomolekülen bereitzustellen, welche die aus dem Stand der Technik bekannten
nachteiligen Wirkungen vermeiden.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 1 , durch ein Verfahren zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen mit den
Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 11 und durch einen Apparat zur automatisierten Verarbeitung von Biomolekülen umfassend eine Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 14 gelöst. Erfindungsgemäss wird eine Vorrichtung zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen mittels Partikel vorgeschlagen. Hierbei umfasst die Vorrichtung einen mit einer Flüssigkeit mit Biomolekülen befüllbaren Behälter, eine Vertiefung zum Aufnehmen einer Flüssigkeit mit Biomolekülen und von den Partikeln. Der Behälter der Vorrichtung umfasst eine Zuführöffnung zum Zuführen einer Flüssigkeit mit Biomolekülen in die Vertiefung und
gegebenenfalls zum Zuführen von anderen Flüssigkeiten ohne Biomoleküle wie zum Beispiel Elutionspuffer und Waschpuffer und ein Abführventil mit einem Öffnungsmass zum Abführen einer Flüssigkeit mit Biomolekülen (oder einer Flüssigkeit mit Verunreinigungen) aus der Vertiefung. Die in der Vertiefung des Behälters angeordneten Partikel besitzen ein
Ausdehnungsmass. Hierbei ist das Ausdehnungsmass der Partikel, an welchen die Biomoleküle immobilisierbar sind, insbesondere reversibel immobilisierbar sind, grösser als das Öffnungsmass des Abführventils des Behälters.
Unter„den Partikeln“ gemäss der vorliegenden Anmeldung kann mindestens ein Partikel verstanden werden, da je nach Grössenverhältnis zwischen Partikel und Behälter ein Partikel aussreichen kann.
Im Rahmen der Erfindung kann unter dem Ausdehnungsmass der Partikel, eine relevante Grösse der Partikels, welche verhindert, dass die Partikel das Abführventil passieren können, und kann insbesondere eine relevante Kantenlänge, relevante Diagonale, relevante Querschnittskontur, relevanter Querschnitt, relevanter Querschnitt einer gedachten Aussenkontur
(Querschnittskontur), relevante Höhe oder ein relevanter Durchmesser und insbesondere irgendeine relevante minimale Ausdehnung der Partikel sein. Unter dem Öffnungsmass des Abführventils kann eine relevante Grösse des Abführventils (bzw. dessen Öffnung) verstanden werden, welche verhindert, dass die Partikel das Abführventil passieren können, und kann insbesondere ein Durchmesser, eine Diagonale, eine Höhe der Öffnungsgrundfläche oder die Kantenlänge einer Öffnung des Abführventils sein, durch welche die Flüssigkeit aus den Vertiefungen des Behälters abgeführt werden kann. Das Öffnungsmass ist also prinzipiell die maximale relevante
Öffnungsausdehnung der Öffnungsfläche des Abführventils. Die
Öffnungsfläche des Abführventils ist hierbei die Fläche, durch welche die Flüssigkeit aus dem Behälter in das Abführventil austritt. Dies ist
insbesondere eine Übergangsstelle zwischen dem Abführventil und dem Behälter, welche in der Regel der schmälste Bereich des Behälters ist (z.B. auch das Ende einer Verjüngung). Die Übergangsstelle zwischen dem Abführventil und dem Behälter kann auch die Stelle sein, in der die
Ventilwirkung auf die Flüssigkeit einwirkt, also dort wo derart eine Kraft oder ein Widerstand auf oder gegen die Flüssigkeit ausgeübt wird, dass die Flüssigkeit erst nach Überwinden dieser Kraft oder dieses Widerstandes abgeführt werden kann (i.e. nach Öffnen des Abführventils).
Relevant soll hierbei bedeuten, dass diese Grösse durch ihre Ausmasse verhindert, dass das Partikel durch die Öffnung des Abführventils
hindurchgeführt werden kann. Eine relevante Grösse ist also relevant für den Durchflussprozess der Flüssigkeit und der Partikel aus dem Behälter, da durch die relevante Grösse verhindert wird, dass die Partikel den Behälter durch das Abführventil verlassen. Relevante Flächen (unter anderem
Öffnungsfläche des Abführventils, relevante Querschnittsfläche der Partikel) sind also Flächen, welche durch Ihre Ausdehnung verhindern, dass die Partikel den Behälter durch das Abführventil verlassen.
Dass„das Ausdehnungsmass des Partikel grösser ist als das Öffnungsmass des Abführventils“ hat folgendes zu bedeuten, beziehungsweise folgenden technischen Effekt. Die Partikel können das Abführventil nicht passieren und können somit nicht durch das Abführventil, und zwar in keiner möglichen Orientierung, mit der Flüssigkeit abgeführt werden.
Damit das der Fall ist muss das Öffnungsmass des Abführventils kleiner sein als das Ausdehnugsmass der Partikel. Eine relevante Querschnittskontur des Partikel darf also kein Ausdehnungsmass (also keine relevante Grösse) umfassen, welches kleiner ist als das Öffnungsmass des Abführventils, da sonst das Partikel in einer bestimmten Orientierung, auch wenn es nur eine einzige Orientierung sein kann, das Abführventil passieren kann.
Daraus folgt, dass das Ausdehnungsmass des Partikels einer breitesten relevanten Ausdehnung einer relevanten Querschnittsfläche des Partikels entsprechen kann. H ierbei muss dann jede breiteste relevante Ausdehnung jeder möglichen relevanten Querschnittsfläche (aber nicht der nicht- relevanten Querschnittsflächen) des Partikels, insbesondere jeder möglichen relevante gedachten Querschnittsfläche grösser sein als das Öffnungsmass des Abführventils.
Unter jeder möglichen relevanten Querschnittsfläche sind also die möglichen relevanten Querschnittsflächen in jeder Orientierung und Dimension des Partikels zu verstehen, welche für das Passieren des Partikels durch die Öffnung des Abführventils relevant sind. Die gedachte relevante
Querschnittsfläche ist hierbei eine gedachte Kreisfläche, welche entlang der Aussenpunkte und somit entlang der relevanten maximalen Ausdehnung der Querschnittsfläche verläuft. Hier entspricht das Ausdehnungsmass des Partikels dann dem Durchmesser dieser gedachten Kreisfläche.
Das Ausdehnungsmass gemäss der Ansprüche bezieht sich insbesondere auf das minimale relevante Ausdehnungsmass des Partikels, insbesondere auf das minimale relevante Ausdehnungsmass des kleinsten Partikels. Um diesen Sachverhalt genauer zu erläutern, ist in Fig. 3A eine derartige gedachte relevante Querschnittsfläche 3d dargestellt. Die gedachte relevante Querschnittsfläche 3d des Partikels 3 ist hierbei von einer gedachten
Kreisfläche 3b umgeben. Die gedachte relevante Querschnittsfläche 3d ist also vollkommen von der gedachten Kreisfläche 3b umgeben. Folglich entspricht die maximale relevante Ausdehnung der gedachten relevanten Querschnittsfläche 3d dem relevanten Durchmesser der gedachten
Kreisfläche 3b. Dieser relevante Durchmesser der gedachten Kreisfläche 3b ist hierbei das Ausdehnungsmass b des Partikels. Dieses Ausdehnungsmass b des Partikels muss grösser sein als Öffnungsmass des Abführventils und das für jede mögliche gedachte Querschnittsfläche 3d. Durch derartige Geometrieverhältnisse, ist es in der erfindungsgemässen Vorrichtung nicht möglich, dass die Partikel 3 das Abführventil passieren können.
Fig. 3B zeigt ein ähnliches Partikel 3 und soll verdeutlichen welche Grössen nicht als Ausdehnungsmass (also nicht als relevante Grösse) der Partikel 3 im Rahmen der Erfindung verstanden werden können. Das Partikel 3 der Fig. 3B hat jedoch eine andere Aussenkontur. Zwar weist das Partikel 3 ein
Ausdehnungsmass b wie das Partikel 3 der Fig. 3a auf, jedoch besitzt das Partikel 3 auch eine Ausdehnung q welche deutlich kleiner ist als das
Ausdehnungsmass b. Die Ausdehnung q kann kleiner sein als das
Öffnungsmass des Abführventils und ist somit keine relevante Grösse, welche verhindert, dass das Partikel das Abführventil (bzw. dessen Öffnung) passieren können und ist somit nicht unter dem Ausdehnungsmass des erfindungsgemässen Partikels zu verstehen. Das Abführventil kann selbstverständlich einfach nur aus einer Öffnung bestehen, aus welcher die Flüssigkeit aus den Vertiefungen des Behälters abgelassen werden kann. Die Verwendung des Begriffs Abführventil soll jedoch klarstellen, dass ein Mechanismus vorliegt, welcher die Flüssigkeit mit Biomolekülen im Behälter halten kann und welcher die Vorrichtung so manipulieren kann, dass die Flüssigkeit mit Biomolekülen durch Öffnen des Abführventils aus den Vertiefungen des Behälters entfernt werden kann.
Wesentlich für die Erfindung ist, dass das Ausdehnungsmass des Partikels grösser ist, als das Öffnungsmass des Abführventils. Durch diese
Geometrieverhältnisse wird nämlich gewährleistet, dass die Träger für die Biomoleküle (also die Partikel) nicht zusätzlich mit einem Magneten im
Behälter fixiert werden müssen. Da die makroskopischen Partikel nicht durch das Abführventil eluiert werden können, verbleiben sie beim Entfernen der Flüssigkeit in der Vertiefung des Behälters, während die Flüssigkeit zwischen den Partikeln abfliessen kann. Besonders vorteilhaft kann die Form der Partikel das Abfliessen einer Flüssigkeit begünstigen. Durch diese
Geometrieverhältnisse zwischen den Partikeln und des Abführventils muss in Verfahren keine Pipette verwendet werden, beziehungsweise muss eine entsprechende Vorrichtung (insbesondere eine automatisierte Vorrichtung) keine Pipette beziehungsweise Pipettiervorrichtung umfassen. Insbesondere wird keine Pipette zum Abführen von flüssigen Lösungen oder der Flüssigkeit oder Verunreinigungen aus der Vertiefung des Behälters benötigt. Ausserdem ist keine Haltevorrichtung notwendig, welche die Partikel im Behälter fixiert, wie z.B. ein Magnet. Die Partikel können prinzipiell einfach als Träger einer Festphasenextraktion fungieren, können jedoch in biochemischen Verfahren auch diverse andere aus dem Stand der Technik bekannte Funktionen erfüllen, wie z.B. als Träger für die Startsequenz für eine Polymerase-Kettenreaktion.
Die Fähigkeit der Partikel Biomoleküle zu Adsorbieren, beziehungsweise an sich zu binden, kann je nach Material, auf verschiedene Wechselwirkungen zurückzuführen sein. Hierbei kann die Wechselwirkung zwischen Partikel und Biomolekül auf polar/unpolaren und/oder ionischen und/oder kovalenten und/oder multiplen Wechselwirkungen beruhen. Selbstverständlich kann die Wechselwirkung auch auf Wasserstoffbrücken oder Dipol-Wechselwirkungen beruhen. Unter Immobilisierbar ist im Rahmen dieser Erfindung eine oder eine Kombination der vorangehend beschriebenen Wechselwirkungen zwischen den erfindungsgemässen Partikeln und Biomolekülen zu verstehen.
Unter Vorrichtung und Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen kann im Rahmen der Erfindung nicht nur das immobilisieren der Biomoleküle auf der Oberfläche der Partikel verstanden werden sondern auch eine
Vorrichtung beziehungsweise ein Verfahren für die Entnahme von
Flüssigkeiten in Wasch-, Reaktions- und Elutionsschritten, wobei diese Schritte insbesondere im Rahmen einer Aufreinigung der Biomoleküle durchgeführt werden können.
Dabei können die Partikel makroskopische Partikel sein. D.h. nicht nur dass das Ausdehnungsmass der Partikel grösser ist als das Öffnungsmass des Abführventils, sondern die Partikel können insbesondere auch deutlich grösser sein als die im Stand der Technik bekannten magnetischen Partikel welche in der Regel um 1 pm gross sind. Also können erfindungsgemässe Partikel ungefähr um einen Faktor 50-100, insbesondere 90-5000, im speziellen 100-5000, besonders bevorzugt 100-1000 grösser sein.
Makroskopische Partikel können hierbei insbesondere auch Nanobind
Substrate (Magnetische Disks mit Silica-Nanotechnologie ) von Circulomics in einer Grössenordnung von ungefähr 0,5 bis 1 mm sein.
Im Rahmen dieser Erfindung ist unter dem Begriff Biomolekül unter anderem, DNS, RNS, Nukleinsäuren, Proteine, Startsequenzen für Biomoleküle,
Monomere oder andere biologisch aktive Moleküle zu verstehen. Ausserdem können Biomoleküle alle möglichen aus Zellen, Bakterien, Gewebe, Viren, Blut, Serum, Plasma und Pflanzen isolierbaren Moleküle sein. Ein Waschschritt ist im Folgenden im Allgemeinen ein Verfahrensschritt, bei welchem die Flüssigkeit aus den Behältern durch Betätigung des Ventils abgelassen wird und bei welchem so die Verunreinigungen von magnetischen Partikeln mit den angehafteten Biomolekülen abgetrennt werden. Zu einem Waschschritt kann auch Waschen mit einer Waschlösung gehören (Wasser oder andere, wie schwach polare Flüssigkeiten, wie insbesondere Ethanol oder ein Ethanol-Wassergemisch).
Ein Reaktionsschritt ist im Folgenden im Allgemeinen ein Verfahrensschritt, bei welchem die an die makroskopische Partikel gebundenen Biomoleküle umgesetzt, an die Partikel gebunden, oder verlängert (Kettenverlängerung, z.B. PCR„Polymerase-Kettenreaktion“) werden.
Der Reaktionsschritt und der Waschschritt beziehen sich insbesondere auch auf die notwendigen Schritte der Festphasenextraktion, wobei sich das fixieren und lösen der Moleküle am Träger (erfindungsgemässes Partikel) auf den Reaktionsschritt und das Spülen beziehungsweise Waschen (z.B, mit einem Waschpuffer) zwischen den verschiedenen Schritten auf den
Waschschritt bezieht. Zwischen verschiedenene Schritten wird hierbei meist ein Elutionsschritt (insbesondere auch mit einem Elutionspuffer)
durchgeführt, bei welchem die Flüssigkeit mit Verunreinigungen
beziehungsweise irgendeine andere Flüssigkeit (insbesondere der
Elutionspuffer mit den Biomolekülen) aus dem Abführventil der
erfindungsgemässen Vorrichtung abgeführt wird.
Ein Waschpuffer ist eine Lösung zum Entfernen nicht gebundener
Reagenzien. Ein Elutionspuffer ist eine Lösung zum Lösen und Entfernen, an die Oberfläche der Partikel gebundener Biomoleküle. Eine Verunreinigung ist im Folgenden im Allgemeinen ein Stoff, welcher nicht vollständig reagiert ist beziehungsweise nicht an die magnetischen Partikel gebunden ist, das Lösungsmittel, Nebenprodukte und Kontaminationen, sowie ein Gemisch von zwei oder mehrerer der vorrangehend beschriebenen. Eine Flüssigkeit kann im Rahmen der Erfindung eine Lösung sein,
insbesondere ein Reaktionsgemisch aus Biomolekülen und/oder Reagenzien und/oder Verunreinigungen sein.
Ein erfindungsgemässes Partikel kann im Folgenden im Allgemeinen ein Partikel mit relevantem Durchmesser, relevanter Diagonale beziehungsweise relevanter Kantenlänge von 50-5000 pm sein, insbesondere mit relevantem Durchmesser, relevanter Diagonale beziehungsweise relevanter Kantenlänge von 100-5000 pm, im speziellen mit relevantem Durchmesser, relevanter Diagonale beziehungsweise relevanter Kantenlänge von 90 bis 500 pm, besonders bevorzugt mit relevantem Durchmesser, relevanter Diagonale beziehungsweise relevanter Kantenlänge von 100 bis 1000 pm oder 1 -5 mm. Weiter kann ein Partikel aus allen passenden Materialien zum Binden von Biomolekülen bestehen. Hierunter können unter anderem
Mehrschichtsysteme aus funktionalen Lagen zum Binden von Biomolekülen und anderen Schichte verstanden werden (z.B. magnetische Schichten).
Ausserdem kann das Partikel auch aus einem Gemische beziehungsweise einem Komposit hergestellt sein. Das Partikel kann unter anderem aus Silica (S1O2) bestehen, oder das Partikel kann ausserdem ein beschichteter
Nickelpartikel sein oder irgendein anderer ferro- oder paramagnetisches Partikel. Das Partikel kann unter anderem aus Matrixpolymeren wie zum Beispiel Polyvinylbutyral (PVB) und/oder Polymethymethacrylat (PMMA) bestehen, wobei funktionelle Komponenten wie Magnetit (magnetische
Eigenschaften) und/oder lonentauscher zur Adsorption wie z.B.
Nanoionentauscher in die Polymermatrix eingebettet sein können. Ein Partikel kann im Rahmen der Erfindung auch aus Silica, Glas oder Gold bestehen, oder aus irgendeinem anderen in Stand der Technik bekannten Material, welches zur Immobilisierung von Biomolekülen geeignet ist.
Ein Biomolekül kann im Folgenden im Allgemeinen über Thiolgruppen und/oder Aminogruppen und/oder Hydroxygruppen und/oder
Carboxylgruppen und/oder Carbonylgruppen und/oder Estergruppen und/oder Nitrilgruppen und/oder Amingruppen und/oder irgendwelchen anderen funktionellen Gruppen an die Oberfläche der Partikel gebunden sein.
Die Vorteile der erfindungsgemässen Vorrichtung und des erfindungsgeässen Verfahrens sind unter anderem: - geringe Prozesszeiten durch schnelleres Ablaufen.
- Hohe Ausbeuten
- effizient und kostengünstig
- leicht automatisierbar
- vereinfacht Verfahrensführung und Vorrichtungsgeometrie - erlaubt einfache Modifizierung vorhandener Maschinen
- keine Pipette benötigt somit Verringerung des Verbrauchs an
Pipettenspitzen kein Magnet benötigt ln der Praxis können die Vorrichtung und das Verfahren für Post-Ligation- Aufreinigung verwendet werden.
In Ausführung der Erfindung können die Partikel eine Dichte besitzen, welche grösser oder gleich der Dichte der Flüssigkeit mit Biomolekülen ist. Dadurch können sinkende oder in der Flüssigkeit schwebendes Partikel erreicht werden. Insbesondere in der Flüssigkeit schwebendes Partikel können vorteilhaft sein, da durch diese das Abfliessen der Flüssigkeit aus dem Abführventil erleichtert wird.
Auch können die Partikel eine konvexe Aussenform aufweisen. D.h. die Partikel haben keine negativen Oberflächen oder Kavitäten in welchen die Flüssigkeit verbleiben kann, beziehungsweise in welchen grössere
Biomoleküle verbleiben können.
Ein gewisses Mass an Kavitäten beziehungsweise Porosität kann jedoch aufgrund der Oberflächenvergrösserung eine positive Auswirkung auf die Ausbeute haben. Hierbei spielt jedoch das Grössenverhältnis zwischen Biomolekülen und Kavitäten einer grosse Rolle. Wenn die Kavitäten ungefähr um einen Faktor 5 grösser sind als die Biomoleküle ist die Wahrscheinlichkeit der Retention von Biomolekülen in den Partikel deutlich geringer, sodass eine höhere Ausbeute erzielt werden kann. Eine derartige
Oberflächenvergrösserung der Partikel kann auch schon durch eine
(mehrfache) leichte Einwölbung der Oberfläche erreicht werden.
Wie bereits vorrangehend angemerkt ist es wesentlich, dass das
Ausdehnungsmass der Partikel grösser ist als das Öffnungsmass des
Abführventils (beziehungsweise dessen Öffnung), wobei dias
Ausdehnungsmass der Partikel in einem Grössenbereich von 50 pm bis 10mm, insbesondere von 100pm bis 5 mm, im speziellen von 100m bis 1 mm, besonders bevorzugt von 100pm bis 500pm liegt. In einem ähnlichen Grössenbereich befindet sich dann auch das Öffnungsmass des
Abführventils. Jedoch sollte das Öffnungsmass des Abführventils maximal 95% bis 90% des Ausdehnungsmasses der Partikel betragen. Zum Beispiel könnte das Ausdehnungsmass der Partikel 90 pm betragen und das
Öffnungsmass des Abführventils kleiner als 90 pm sein.
Selbst verständlich ist es unwahrscheinlich, dass mehrere Partikel genau dieselbe Grösse aufweisen. Das Ausdehnungsmass der Partikel kann in einem Schwankungsbereich von 0-10%, insbesondere von 1-5% liegen. Deswegen sollte das Ausdehnungsmass des kleinsten Partikels immer (gemäss oben aufgeführter Anmerkungen) grösser sein als das
Öffnungsmass des Abführventils.
Eine weitere wichtige Ausführungsart sollte in diesem Zusammenhang erläutert werden. Besitzen die erfindungsgemässen Partikel eine Dichte, welche grösser ist als die der in den Vertiefungen befindlichen Flüssigkeit sinken die Partikel auf den Boden des Behälters. Gewöhnlicherweise ist an dieser Stelle das Abführventil angeordnet, was zu verminderter
Abflusseffektivität beim Abführen der Flüssigkeit aus den Vertiefungen führen kann, da das Abführventil wegen der im Vergleich zu den Partikeln geringeren Grösse als eine Art Nadelöhr fungiert. Um bei gewissen Ausführungen der Erfindung also ein Verstopfen des Abführventils zu vermeiden, kann der Behälter eine Verjüngung Richtung Behälterboden (Richtung Abführventil) aufweisen. Diese Verjüngung ist bei einem grossen Grössenunterschied (ungefähr Faktor 10) zwischen Partikeln und Abführventil besonders vorteilhaft, da so ein Verstopfen des Abführventils verhindert werden kann. Insbesondere wenn die Verjüngung konstant in Richtung des Abführventils enger wird, sodass in Richtung des Abführventils in der Vertiefung des Behälters immer weniger Partikel angeordnet sind. Wie das Verhältnis des Ausdehnungsmasses der Partikel zum Öffnungsmass des Abführventils ausgeführt wird ist unter anderem abhängig von der Art des Abführventils, von der Form, insbesondere inneren Form des Abführventils (beziehungsweise dessen Öffnung), von der Form der Partikel, dem Material der Partikel, der Porosität der Partikel und der verwendeten Flüssigkeit beziehungsweise Biomoleküle.
Die erfindungsgemässen Partikel können auch mindestens eine Fläche aus der Gruppe bestehend aus rund, viereckig, dreckig und n-eckig Fläche aufweisen. Je nach innerer Form des Abführventils (beziehungsweise dessen Öffnung) kann die Partikelform ausgewählt werden. Es können
selbstverständlich auch verzerrte Formen vorliegen.
Die Partikel können eine kreisförmige oder ringförmige oder elliptische oder quaderförmige, insbesondere plättchenförmig oder zylindrische oder pyramidale oder polyedrische, insbesondere platonische Form haben. Die Formen können selbstverständlich auch in verzerrten Strukturen vorliegen. Die Form sollte in Anpassung an die Form des Abführventils ausgewählt werden. Ausserdem können das Mischen der Formen besonders vorteilhaft sein, wenn eckige Partikel und ein rundes Abführventil (und umgekehrt) vorliegen kann die Flüssigkeit besonders gut abfliessen. Auch bei
ringförmigen Partikeln kann die Flüssigkeit besonders gut aus dem Behälter abfliessen. Selbstverständlich können auch verschiedene Partikelformen gemischt verwendet werden.
Das Abführventil kann unter anderem auf verschiedene Art und Weisen ausgestaltet sein. Das Abführventil kann hierbei am unteren Ende des Behälters (gegenüber der Zuführöffnung) angeordnet sein. Das Abführventil kann eine Öffnung sein beziehungsweise umfassen und/oder als eine Kapillare ausgeführt sein. Hierbei kann die Öffnung des Abführventil eine beliebige innere Form aufweisen, welche z.B. rund, viereckig, oval, dreieckig oder n-eckig sein kann.
Typischerweise haben Kapillaren einen Innendurchmesser (bei runden Kapillaren, bei eckigen respektiv Kantenlänge oder Höhe einer Grundfläche der Kapillaröffnung) von 1 -1 Omiti, insbesondere von 1 -5pm, im speziellen von 4-5pm. Hierbei sollte das Ausdehnungsmass der erfindungsgemässen Partikel dann grösser sein als der Innendurchmesser (also das
Öffnungsmass) der Kapillare. So könnte bei einer Kapillare mit 5pm
Innendurchmesser, Partikel mit einem Ausdehnungsmass von 100pm verwendet werden .
Das Abführventil kann auch als Membranventil oder als ein mechanisches Ventil ausgeführt sein. Unter einem mechanischen Ventil sind unter anderem ein Durchgangsventil, ein Eckventil und ein Schrägsitzventil, welche z.B. über einen Drehmechanismus oder Federmechanismus geöffnet und geschlossen werden können.
In der Praxis kann die Vorrichtung ein Öffnungsmechanismus des
Abführventils umfassen, sodass die Flüssigkeit nach dem Immobilisieren der Biomoleküle an der Oberfläche der Partikel aus dem Behälter entfernt werden kann. Der Öffnungsmechanismus des Abführventils kann insbesondere Druckluft, ein mechanischer Mechanismus, eine Bewegung einer Membran oder ein anderer geeigneter Öffnungsmechanismus sein. Das Abführventil und der Öffnungsmechanismus des Abführventils können im Zusammenspiel für das kontrollierbare Abfliessen der Flüssigkeit
verantwortlich sein. Hierbei kann der Öffnungsmechanismus eine Drückvorrichtung sein, welche derart am Behälter angeordnet ist, dass im Behälter ein Druck auf die
Flüssigkeit mit Biomolekülen erzeugbar ist, durch welchen die Flüssigkeit mit den Biomolekülen aus dem Behälter entfernbar ist. Dem Öffnen des
Abführventils (Druckventil, welches auch eine Kapillare sein kann), würde dann das Ausüben eines Drucks auf die Flüssigkeit entsprechen. Hierbei kann die Druckvorrichtung entweder an der Zuführöffnung angeordnet sein und einen Überdruck (im Vergleich zum Atmosphärendruck) auf die
Flüssigkeit erzeugen und so die Flüssigkeit aus der Vertiefung des Behälters herausrücken oder am Abführventil angeordnet sein und dort einen
Unterdrück (im Vergleich zum Atmosphärendruck) auf die Flüssigkeit erzeugen und so die Flüssigkeit aus der Vertiefung des Behälters
heraussaugen. Insbesondere kann die Druckvorrichtung derart mit dem Abführventil Zusammenwirken, dass die Druckvorrichtung für das Öffnen und Schliessen des Abführventils verantwortlich ist.
Auch kann ein mechanischer Mechanismus am Abführventil angeordnet sein, wenn dieses als mechanisches Ventil ausgestaltet ist und für das Öffnen und Schliessen des mechanischen Ventils verantwortlich sein.
Selbstverständlich ist ein Öffnungsmechanismus nicht zwingend notwendig, da das Abführventil auch durch einen Verwender manipuliert werden kann.
Der Behälter kann auf beliebige Art ausgeformt sein. In Ausgestaltung der Erfindung kann der Behälter eine Multiwellplatte sein, wobei die
Multiwellplatte mehrere Vertiefungen aufweist. Eine Multiwellplatte kann insbesondere auch eine Mikrotitrierplatte sein. Besonders vorteilhaft kann das Abführventil des Behälters auch als eine Kapillare ausgestaltet sein, durch welche die Flüssigkeit mit den Partikeln durch Kapillarkräfte gehalten wird und/oder die Flüssigkeit durch Druck entfernt wird. Wenn der Behälter der erfindungsgemässen Vorrichtungais eine Multiwellplatte mit mehreren Vertiefungen ausgestaltet ist, können mehrere Vertiefungen jeweils eine Zuführöffnung und ein Abführventil umfassen. Der Behälter kann auch als Lochplatte ausgestaltet sein.
Erfindungsgemäss wird weiter ein Verfahren zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst dabei die folgenden Schritte, welche nacheinander ausgeführt werden können, aber nicht müssen. Erfindungsgemässe Partikel und eine Flüssigkeit mit Biomolekülen werden in einem Behälter, insbesondere in dessen Vertiefung angeordnet. Binden der Biomoleküle, insbesondere reversibles binden, der Biomoleküle an die
Partikel. Dann wird die Flüssigkeit, insbesondere die Flüssigkeit mit
Verunreinigungen, durch ein Abführventil entfernt, wobei die Partikel in der Vertiefung des Behälters verbleiben. Ablösen der Biomoleküle von den Partikeln.
Das Entfernen der Flüssigkeit aus der Vertiefung des Behälters erfolgt durch das Öffnen des Abführventils. Auch ist es möglich, dass die Biomoleküle mit aus dem Abführventil entfernt werden und insbesondere in einen anderen Behälter transferiert werden.
Das vorgeschlagene Verfahren wird vorzugsweise in einer
erfindungsgemässen Vorrichtung durchgeführt. Dadurch bleiben dem
Verfahren Schritte wie die Verwendung eines Magneten und das
abpipettieren der Flüssigkeit erspart.
Prinzipiell kann das erfindungsgemässe Verfahren Waschschritte,
Reaktionsschritte und Elutuionsschritte in beliebiger Abfolge beziehungsweise Anzahl umfassen, um ein gewünschtes biochemisches Verfahren,
insbesondere Verfahren zur Festphasenextraktion durchzuführen.
Waschschritte, Reaktionsschritte und Elutuionsschritte können zwischen den einzelnen Schritten des Verfahrens, welches vorrangehend beschrieben wurde, durchgeführt werden. Auch können die Biomoleküle nach dem Ablösen von den Partikeln mit einer geeigneten Flüssigkeit über das
Abführventil abgeführt und insbesondere in einen weiteren Behälter transferiert werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann also zusätzlich die Zugabe einer Flüssigkeit ohne Biomoleküle, insbesondere eines Waschpuffers, bevorzugt vor dem Lösen der Biomoleküle von den Partikeln umfassen oder eines Elutionspuffers, bevorzugt nach Zugabe eines Waschpuffers, umfassen. Hierbei können die Verfahrensschritte a)-c) des Verfahrens mehrfach hintereinander durchgeführt werden, insbesondere kann nach jedem
Durchführen der Schritte a)-c) des erfindungsgemässen Verfahrens die Zugabe des Waschpuffers erfolgen, bevor letztendlich der Schritt d) des Verfahrens durchgeführt wird (die Bezeichnungen a)-d) beziehen sich auf die Verfahrensschritte des unabhängigen Anspruchs 11 ).
Genauer beschrieben könnte ein erfindungsgemässes Verfahren unter Verwendung einer erfindungsgemässen Vorrichtung wie folgt durchgeführt werden.
Die Partikel mit den immobilisierten Biomolekülen werden im Behälter durch den Grössenunterschied zwischen Ausdehnungsmass der Partikel und Öffnungsmass des Abführventils fixiert, sodass die Partikel im Behälter verbleiben, während die Flüssigkeit aus dem Abführventil entfernt werden kann. Die Flüssigkeit kann mit dem Öffnungsmechanismus aus dem
Abführventil abgeführt werden, wobei die Flüssigkeit zwischen den Partikeln abfliesst, sodass keine beziehungsweise nur wenige Flüssigkeitsreste im Behälter und auf den Partikeln verbleiben. Die an den Partikeln gebundenen Biomoleküle können von der Oberfläche abgelöst werden und anschliessend weiterverwendet werden. In einem Apparat zur automatisierten Verarbeitung können hierbei Schritte wie Zugabe der Partikel, Zuführen und Abführen der Flüssigkeit und Verwenden des Öffnungsmechanismus (Öffnen/Schliessen des Ventils) automatisch ausgeführt werden. Hierbei kann die Flüssigkeit mit Biomolekülen, ein Waschpuffer oder Elutionspuffer über eine aus dem Stand der Technik bekannte Dispensingvorrichtung beziehungsweise
Pipettiervorrichtung zugeführt werden.
Das Abführen der Flüssigkeit erfolgt vorteilhaft über das Abführventil und nicht über eine Pipette, da so weniger Flüssigkeit auf den Partikeln und in den Vertiefungen des Behälters verbleibt, insbesondere wenn diese mit Druck „herausgeblasen“ wird.
Im Folgenden werden die Erfindung und der Stand der Technik anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert.
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur reversiblen
Immobilisierung von Biomolekülen mit einer Multiwellplatte und erfindungsgemässen Partikeln
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur reversiblen
Immobilisierung von Biomolekülen mit einer Multiwellplatte und einer Druckvorrichtung
Fig. 3A eine schematische Darstellung einer gedachten
Querschnittsfläche
Fig. 3B eine weitere schematische Darstellung einer gedachten
Querschnittsfläche Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung 1 zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen mit einer Multiwellplatte 20 und erfindungsgemässen Partikeln 3.
Der Behälter 2 ist im vorliegenden Ausführungsbeispiel als eine
Multiwellplatte 20 ausgestaltet. Die Multiwellplatte 20 umfasst hierbei mehrere Vertiefungen 22. Die Vertiefungen 22 der Multiwell platte 20 umfassen hierbei jeweils eine Zuführöffnung (nicht dargestellt) und ein Abführventil 4.
Die erfindungsgemässen Partikel 3 sind in den Vertiefungen 22 der
Multiwellplatte 20 angeordnet. In einem erfindungsgemässen Verfahren kann die Flüssigkeit mit
Biomolekülen in die Vertiefungen 22 zu den Partikeln 3 über die
Zuführöffnung (nicht dargestellt) zugegeben werden.
Nachdem sich die in der Flüssigkeit befindlichen Biomoleküle an die
Oberfläche der Partikel 3 gebunden haben, kann die Flüssigkeit über das Abführventil 4 aus den Vertiefungen 22 entfernt werden. Anschliessend können die Biomoleküle durch Zu- und Abführen eines flüssigen
Lösungsmittels von der Oberfläche der Partikel 3 abgelöst werden oder mit (mehreren) aufeinander folgenden Reaktionsschritten und Waschschritten weiterverarbeitet werden. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel sind die Partikel 3 plättchen- beziehungsweise quaderförmig ausgestaltet und das Ausdehnungsmass b der Partikel 3 ist grösser als das Öffnungsmass d des Abführventils 4. Somit wird erreicht, dass beim Abführen der Flüssigkeit die Partikel 3 im Behälter 2 verbleiben, ohne dass sie zusätzlich fixiert werden müssen. Das Abführventil 3 kann in diesem Ausführungsbeispiel eine runde innere Form aufweisen, wobei die Kantenlänge b der Partikel 3 grösser sein muss als der Durchmesser d des Abführventils 4. Insbesondere könnte eine Kapillare verwendet werden, deren Innendurchmesser d kleiner ist als das Ausdehnungsmass b der Partikel.
Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung 1 zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen mit einer Multiwellplatte 20 und einer Druckvorrichtung 6.
Der Behälter 2 ist im vorliegenden Ausführungsbeispiel als eine
Multiwellplatte 20 ausgestaltet. Die Multiwellplatte 20 umfasst hierbei mehrere Vertiefungen 22. Die Vertiefungen 22 der Multiwellplatte 20 umfassen hierbei jeweils eine Zuführöffnung (nicht dargestellt) und ein Abführventil 4. Eine Druckvorrichtung 6 ist hierbei derart an den Zuführöffnungen (nicht dargestellt) angeordnet, dass ein Druck P auf die Vertiefungen 22 ausgeübt werden kann.
Die erfindungsgemässen Partikel 3 sind in den Vertiefungen 22 der
Multiwellplatte 20 angeordnet.
In einem erfindungsgemässen Verfahren kann die Flüssigkeit mit
Biomolekülen in die Vertiefungen 22 zu den Partikeln 3 über die
Zuführöffnung (nicht dargestellt) zugegeben werden. Nachdem sich die in der Flüssigkeit befindlichen Biomoleküle an die Oberfläche der Partikel 3 gebunden haben, kann die Flüssigkeit über das Abführventil 4 aus den Vertiefungen 22 entfernt werden. Hierfür übt die Druckvorrichtung 6 einen Druck P auf die in den Vertiefungen 22 befindliche Flüssigkeit aus, sodass diese durch das Abführventil 3 ausgestossen wird.
Anschliessend können weitere Verfahrensschritte durchgeführt werden. lm vorliegenden Ausführungsbeispiel sind die Partikel 3 plättchen- beziehungsweise quaderförmig ausgestaltet und das Ausdehnungsmass b der Partikel 3 ist grösser als das Öffnungsmass d des Abführventils 4. Somit wird erreicht, dass beim Abführen der Flüssigkeit durch einen Druck P die Partikel 3 in den Vertiefungen 22 verbleiben, ohne dass sie zusätzlich fixiert werden müssen.

Claims

Patentansprüche
Vorrichtung (1 ) zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen mittels Partikel (3),
wobei die Vorrichtung (1 ) einen mit einer Flüssigkeit mit Biomolekülen befüllbaren Behälter (2, 20) umfasst,
wobei der Behälter (2, 20) eine Vertiefung (22) zum Aufnehmen der Flüssigkeit mit Biomolekülen und den Partikeln (3), eine Zuführöffnung zum Zuführen der Flüssigkeit mit Biomolekülen in die Vertiefung (22), und ein Abführventil (4) mit einem Öffnungsmass (d) zum Abführen der Flüssigkeit aus der Vertiefung (22) umfasst,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Partikel (3) mit einem Ausdehnungsmass (b), an welchen die Biomoleküle immobilisierbar sind, insbesondere reversibel
immobilisierbar sind, in der Vertiefung (22) des Behälters (2, 20) angeordnet sind, wobei das Ausdehnungsmass (b) der Partikel (3) grösser ist als das Öffnungsmass (d) des Abführventils (4).
Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 1 , wobei die Partikel (3) eine Dichte besitzen, welche grösser oder gleich der Dichte der Flüssigkeit mit Biomolekülen ist.
Vorrichtung (1 ) nach einem der vorrangehenden Ansprüche, wobei die Partikel (3) eine konvexe Aussenform aufweisen.
Vorrichtung (1 ) nach einem der vorrangehenden Ansprüche, wobei das Ausdehnungsmass (b) der Partikel (3) grösser gleich 90 pm ist und/oder der Öffnungsmass (d) des Abführventils (4) kleiner 90 pm.
5. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Partikel (3) mindestens eine Fläche aus der Gruppe bestehend aus rund, viereckig, dreckig und n-eckig Fläche aufweisen.
6. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Partikel (3) eine kreisförmige oder ringförmige oder elliptische oder quaderförmige oder zylindrische oder pyramidale oder polyedrische Form haben beziehungsweise die Partikel (3) als Scheibe, Torus, Ellipsoid, Kugel, Quader, Pyramide oder als Polyeder ausgeformt ist.
7. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Abführventil (4) eine Öffnung umfasst und/oder als eine Kapillare ausgeführt ist.
8. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Behälter (2, 20) ein Multiwellplatte (20) ist und die Multiwellplatte (20) mehrere Vertiefungen (22) aufweist. 9. Vorrichtung (1 ) nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die
Vorrichtung (1 ) ein Instrument (6) zum Öffnen des Abführventils (4) umfasst, insbesondere ein Instrument (6) zum automatischen Öffnen des Abführventils (4) umfasst.
10. Vorrichtung (1 ) nach Anspruch 9, wobei der Behälter (2, 20) eine
Druckvorrichtung umfasst, welche derart an der Vorrichtung
angeordnet ist, dass im Behälter (2, 20) ein Druck (P) auf die
Flüssigkeit mit Biomolekülen erzeugbar ist, durch welchen die
Flüssigkeit mit den Biomolekülen aus dem Behälter entfernbar ist.
1 1 . Verfahren zur reversiblen Immobilisierung von Biomolekülen,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Verfahren folgende Schritte umfasst:
a) Anordnen von Partikeln (3) und einer Flüssigkeit mit
Biomolekülen in einem Behälter (2, 20)
b) Binden, insbesondere reversibles Binden, der Biomoleküle an die Partikel (3)
c) Entfernen der Flüssigkeit aus dem Behälter (2, 20) durch ein Abführventil, wobei die Partikel (3) in einer Vertiefung (22) des Behälters verbleiben.
d) Lösen der Biomoleküle von den Partikeln (3)
12. Verfahren nach Anspruch 11 , wobei eine Vorrichtung (1 ) nach einem der Ansprüche 1-10 verwendet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Verfahren zusätzlich die Zugabe einer Flüssigkeit ohne Biomoleküle, insbesondere eines Waschpuffers, bevorzugt vor einem Schritt d) oder Elutionspuffers, bevorzugt nach Zugabe eines Waschpuffers, umfasst.
14. Apparat zur automatisierten Verarbeitung von Biomolekülen umfassend eine Vorrichtung (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur
Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 11 bis 13.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004092403A1 (en) * 2003-04-03 2004-10-28 University Of Washington Microwell arrays with nanoholes
US20070025883A1 (en) * 2005-04-21 2007-02-01 California Institute Of Technology Uses of parylene membrane filters
WO2010075199A2 (en) * 2008-12-22 2010-07-01 Abbott Laboratories Apparatus and method for handling fluids for analysis
US20130259772A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-03 National Applied Research Laboratories Miniature sieve apparatus and manufacturing method thereof
US20180001325A1 (en) 2015-01-27 2018-01-04 Circulomics Inc. Hierarchical silica lamella for magnetic nucleic acid extraction

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4086060A (en) * 1976-10-22 1978-04-25 Jocelyn Dickson Disposable manipulative laboratory device for transferring biological fluids
US4111754A (en) * 1976-11-29 1978-09-05 Hydow Park Immunological testing devices and methods
DE4423878A1 (de) * 1994-07-07 1996-01-11 Boehringer Mannheim Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Abscheiden von magnetischen Mikropartikeln
CN1114831C (zh) * 1995-03-20 2003-07-16 准确***科学株式会社 利用吸移管装置处理液体的方法以及用于该法的仪器
DE69939622D1 (de) * 1998-03-19 2008-11-06 Prec System Science Co Ltd Apparat zur integration von magnetteilchen - verarbeitung und steuerungsverfahren
DE10142960C2 (de) * 2001-09-01 2003-12-04 Eppendorf Ag Verwendung einer Platte aus elastisch verformbaren Kunststoff oder Gummi zur Abdeckung einer zum Teil befüllten Mikrofiltrationsplatte während der Filtration
US7718442B2 (en) * 2002-11-22 2010-05-18 Genvault Corporation Sealed sample storage element system and method
US8409528B2 (en) * 2003-06-19 2013-04-02 Abbott Laboratories Apparatus and method for handling fluids for analysis
EP1621890A1 (de) * 2004-07-26 2006-02-01 bioMerieux B.V. Gerät und Methode zur Separation, Mischung und Konzentrierung magnetischer Partikel mit Flüssigkeiten und deren Verwendungen in Reinigungsmethoden
WO2008053751A1 (fr) * 2006-11-01 2008-05-08 Shimadzu Corporation Plaque de conteneur de réaction et son équipement de traitement de réaction
DE102008057291B4 (de) 2008-11-14 2012-10-04 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Vorrichtung und Verfahren zum Erzeugen eines Tropfens einer Flüssigkeit
US9857332B2 (en) * 2011-07-22 2018-01-02 Tecan Trading Ag System for manipulating samples in liquid droplets
JP6026432B2 (ja) * 2012-01-12 2016-11-16 パナソニックヘルスケアホールディングス株式会社 検体濃縮容器とそれを用いた検体濃縮方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004092403A1 (en) * 2003-04-03 2004-10-28 University Of Washington Microwell arrays with nanoholes
US20070025883A1 (en) * 2005-04-21 2007-02-01 California Institute Of Technology Uses of parylene membrane filters
WO2010075199A2 (en) * 2008-12-22 2010-07-01 Abbott Laboratories Apparatus and method for handling fluids for analysis
US20130259772A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-03 National Applied Research Laboratories Miniature sieve apparatus and manufacturing method thereof
US20180001325A1 (en) 2015-01-27 2018-01-04 Circulomics Inc. Hierarchical silica lamella for magnetic nucleic acid extraction

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WO2019096407A1 (de) 2019-05-23

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