WO2018211877A1 - 糸及びその製造方法 - Google Patents

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WO2018211877A1
WO2018211877A1 PCT/JP2018/015488 JP2018015488W WO2018211877A1 WO 2018211877 A1 WO2018211877 A1 WO 2018211877A1 JP 2018015488 W JP2018015488 W JP 2018015488W WO 2018211877 A1 WO2018211877 A1 WO 2018211877A1
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vitrigel
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filamentous
atelocollagen
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俊明 竹澤
茂久 青木
寛 江内田
歩 宮崎
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国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
国立大学法人佐賀大学
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea

Definitions

  • the present invention relates to a yarn and a manufacturing method thereof.
  • the present inventors have so far developed atelocollagen vitrigel membrane and demonstrated that damaged tissues such as skin, cornea, trachea, articular cartilage, tympanic membrane and esophagus can be regenerated.
  • the atelocollagen vitrigel membrane is a biocompatible material having an epithelialization promoting effect and a scar formation inhibiting effect in the wound part.
  • atelocollagen vitrigel membranes useful for skin tissue regeneration have already been researched and developed as medical devices by pharmaceutical companies and the like.
  • artificial dermis made from atelocollagen that can be used in Japan includes Integra (registered trademark) (manufactured by Integra Life Science), Teldermis (registered trademark) (manufactured by Terumo) and Pernac (registered trademark) (manufactured by Gunze).
  • Integra registered trademark
  • Teldermis registered trademark
  • Pernac registered trademark
  • the present inventors have developed a technique for processing a native collagen vitrigel into an arbitrary shape such as a membrane, a thread, or a tube (for example, see Patent Document 1).
  • telocollagen gel has less strength than native collagen gel
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method for producing a yarn that can use a hydrogel having a lower strength than a native collagen gel as a raw material. Further, the present invention provides a yarn obtained by the above production method and having excellent strength.
  • a columnar hydrogel can be irradiated with ultraviolet rays, vitrified, and rehydrated to produce a filamentous atelocollagen vitrigel.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the method for producing a yarn according to the first aspect of the present invention includes: A step A of irradiating the columnar hydrogel with ultraviolet rays; Step B obtained by vitrifying the columnar hydrogel after the ultraviolet irradiation to obtain a dried filamentous hydrogel, Rehydrating the dried filamentous hydrogel to obtain a filamentous vitrigel; and In this order.
  • the yarn-shaped vitrigel may be re-glassed to obtain a dried filamentous vitrigel.
  • a step E of reirradiating the dried filamentous vitrigel with ultraviolet rays may be provided.
  • the yarn manufacturing method according to the first aspect may further include, after the step E, a step F of attaching or impregnating a hydrophobic solvent to the dried filamentous vitrigel re-irradiated with ultraviolet rays.
  • the hydrogel may be atelocollagen gel.
  • the yarn may be a tissue regeneration yarn that can be used as a suture.
  • the yarn may be a cell transplant carrier.
  • the yarn may be a conjunctival fistula filling material.
  • the yarn may be a peritonitis inhibitor or a peritoneal fibrosis inhibitor.
  • the yarn according to the second aspect of the present invention is made of a dried vitrigel, and is attached or impregnated with a hydrophobic solvent.
  • the breaking strength of the yarn may be 0.1 kgf or more.
  • the breaking strength of the yarn may be 0.2 kgf or more.
  • the dried vitrigel may be a dried atelocollagen vitrigel.
  • the hydrophobic solvent may be silicone oil.
  • the thread may be a tissue regeneration thread that can be used as a suture.
  • the yarn may be a cell transplant carrier.
  • the yarn may be a filling material for the conjunctival fistula.
  • the thread may be a peritonitis inhibitor or a peritoneal fibrosis inhibitor.
  • yarn which can use the hydrogel which is not stronger than native collagen gel as a raw material can be provided. Moreover, the thread
  • FIG. 2 is a graph showing the breaking strength of the dried filamentous atelocollagen gel 1 of each condition in Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the breaking strength of the dried filamentous atelocollagen vitrigel 2 under various conditions in Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the breaking strength of Polyglactin suture bicyclyl (registered trademark) under various conditions in Example 1.
  • FIG. It is the image which sutured the mouse incision part using the filamentous atelocollagen vitrigel dry body 1 infiltrated with the silicone oil in Example 2.
  • FIG. 6 is an image showing the results of staining a hematoxylin-eosin (HE) tissue section of a mouse suture part using dried filamentous atelocollagen 1 (infiltrate 1) infiltrated with silicone oil on day 7 of suture in Example 2; is there. It is an image which shows the result of carrying out HE dyeing
  • HE hematoxylin-eosin
  • Example 2 a tissue section of a mouse suture part using dried atelocollagen vitrigel 1 (infiltrate 1) infiltrated with silicone oil on the 7th day of suture was subjected to anti- ⁇ smooth muscle actin ( ⁇ -smooth muscle actin: ⁇ ).
  • -SMA An image showing the result of immunostaining with an antibody. It is an image which shows the result of carrying out the immuno-staining by the anti- (alpha) SMA antibody the tissue section
  • FIG. It is an image of the rehydrated filamentous atelocollagen vitrigel 1 (rehydrated 1) cultured with endothelial cells in Example 4. It is an image of the rehydrated filamentous atelocollagen vitrigel 1 (rehydrated 1) cultured with fibroblasts in Example 4.
  • Example 4 is an image of a rehydrated polyglactin suture bicyclyl (registered trademark) (rehydrated body 3) cultured with fibroblasts in Example 4.
  • 6 is an image of dried filamentous atelocollagen vitrigel (CXM1 and CXM5) used in Example 5. It is a figure which shows the insertion method in the mouse
  • FIG. It is an image which shows a mode that the filamentous atelocollagen vitrigel dry body in Example 5 is inserted in the mouse
  • the upper figure is an image showing the entire abdomen of the opened mouse, and the lower figure is an enlarged image of the peritoneum.
  • the scale bar indicates 1 cm. 6 is an HE-stained image of a tissue section of each group of mice 40 days after the induction of peritonitis in Example 5.
  • FIG. The upper figure is a HE-stained image of the wall-side peritoneum, and the lower figure is a HE-stained image of the visceral peritoneum.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 6 is an Azan-stained image of a tissue section of the wall-side peritoneum of each group of mice 40 days after induction of peritonitis in Example 5.
  • FIG. The scale bar indicates 200 ⁇ m.
  • FIG. 6 is a graph showing the thickness of the subcutaneous connective tissue of the fibrotic peritoneum of each group of mice 40 days after induction of peritonitis in Example 5. It is an image which shows the mode of the peritoneum of each group of mice opened on day 56 after peritonitis induction in Example 5. The upper figure is an image showing the entire abdomen of the opened mouse, and the lower figure is an enlarged image of the peritoneum. The scale bar indicates 1 cm.
  • FIG. 6 is a HE-stained image of a tissue section of each group of mice 56 days after induction of peritonitis in Example 5.
  • FIG. 6 is a HE-stained image of a tissue section of each group of mice 56 days after induction of peritonitis in Example 5.
  • the upper figure is a HE-stained image of the wall-side peritoneum
  • the lower figure is a HE-stained image of the visceral peritoneum.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m. 6 is an Azan-stained image of a tissue section of the wall-side peritoneum of each group of mice 56 days after induction of peritonitis in Example 5.
  • FIG. The scale bar indicates 200 ⁇ m.
  • FIG. 6 is a graph showing the thickness of the subcutaneous connective tissue of fibrotic peritoneum in each group of mice on day 56 after induction of peritonitis in Example 5.
  • FIG. 9 is an immunostained image of various antibodies on tissue sections of the peritoneum of each group of mice 40 days after induction of peritonitis in Example 5.
  • FIG. The scale bar of the immunostained image with anti-cytokeratin AE1 / AE3 (CK AE1 / AE3) antibody, anti-vimentin antibody and anti-N-cadherin antibody indicates 50 ⁇ m.
  • the scale bar of the immunostained image with an anti-connective tissue growth factor (CTGF) antibody and anti- ⁇ -SMA antibody indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 9 is an immunostained image of various antibodies on tissue sections of the peritoneum of each group of mice 40 days after induction of peritonitis in Example 5.
  • FIG. The scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • SMIL mesothelial stroma layer
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • the yarn manufacturing method according to the first embodiment of the present invention includes: A step A of irradiating the columnar hydrogel with ultraviolet rays; Step B obtained by vitrifying the columnar hydrogel after the ultraviolet irradiation to obtain a dried filamentous hydrogel, Rehydrating the dried filamentous hydrogel to obtain a filamentous vitrigel; and In this order.
  • a yarn can be manufactured using a hydrogel having a strength lower than that of the native collagen gel as a raw material.
  • the details of each step of the yarn manufacturing method of the present embodiment will be described.
  • the columnar hydrogel is irradiated with ultraviolet rays to increase the strength of the columnar hydrogel.
  • the columnar hydrogel used in the step A may be any one obtained by, for example, using a cylindrical mold or the like so that the sol has a desired diameter.
  • the temperature which heat-retains sol at the time of gelatinizing according to the kind of sol to be used is just to adjust suitably the temperature which heat-retains sol at the time of gelatinizing according to the kind of sol to be used.
  • the heat retention during gelation may be lower than the collagen denaturation temperature depending on the animal species of the collagen used, and is generally 20 ° C. or higher and 37 ° C. or lower.
  • the gelation can be performed in a few minutes to a few hours by keeping the temperature at.
  • sol means that dispersoid colloidal particles (size: about 1 to several hundred nm) using a liquid as a dispersion medium are particularly composed of a polymer compound. More specifically, the sol is an aqueous solution of a natural product polymer compound or a synthetic polymer compound. Therefore, when a crosslink is introduced by a chemical bond of these polymer compounds to form a network structure, the polymer compound is transferred to a “hydrogel” that is a semi-solid substance having a large amount of water in the network. That is, “hydrogel” means a gelled sol. “Vitrigel” refers to a gel in a stable state obtained by rehydrating a conventional hydrogel after vitrification.
  • Vitrigel (registered) Trademark) ”. Further, in the present specification, in describing the production process of the present embodiment in detail, the hydrogel dried body that has just undergone the vitrification process and has not undergone the rehydration process is simply referred to as “hydro. Gel dried body ". And the gel obtained through the rehydration process after the said vitrification process was distinguished and represented as "Vitrigel", and the dried body obtained by vitrifying the Vitrigel was referred to as "Vitrigel dried body”. Moreover, what was obtained by performing the step of irradiating the dried vitrigel with ultraviolet rays was referred to as “dried vitrigel dried with ultraviolet rays”. Therefore, “vitrigel” is a hydrate.
  • the sol used as a raw material for the columnar hydrogel may be any material having biocompatibility, for example, an extracellular matrix-derived component that gels, natural polymer compounds such as fibrin, agar, agarose, and cellulose, and Synthetic polymer compounds such as polyacrylamide, polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, poly (II-hydroxyethyl methacrylate) / polycaprolactone, and the like can be mentioned.
  • extracellular matrix-derived component examples include collagen (type I, type II, type III, type V, type XI, etc.), mouse EHS tumor extract (type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, etc.) (Including, but not limited to) base membrane components (trade name: Matrigel), glycosaminoglycan, hyaluronic acid, proteoglycan, gelatin and the like. It is possible to produce a desired vitrigel by selecting components such as salt, concentration, pH and the like that are optimal for each gelation. Moreover, the vitrigel which imitated various in-vivo tissues can be obtained by combining raw materials.
  • collagen type I, type II, type III, type V, type XI, etc.
  • mouse EHS tumor extract type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, etc.
  • base membrane components trade name: Matrigel
  • glycosaminoglycan hyaluronic acid
  • an extracellular matrix-derived component that gels is preferable, and collagen is more preferable.
  • a more preferable raw material in collagen native collagen or atelocollagen can be illustrated, and atelocollagen is more preferable.
  • atelocollagen gel is particularly preferable because it is a biocompatible material having an epithelialization promoting effect and a scar formation suppressing effect in a wound part.
  • the hydrogel obtained from the sol exemplified above becomes a gel having a strength equivalent to that of the native collagen gel or a gel having a strength lower than that of the native collagen gel depending on the composition and content thereof. Further, the gel may be stronger than the native collagen gel. Even if it is hydrogel of any intensity
  • the “epithelialization promoting effect” means that the formation of regenerative epithelium is promoted by suppressing the formation of granulation tissue and further promoting the proliferation of epidermal cells in the healing process of the wound part. Means. By using a thread made of dried atelocollagen vitrigel as a suture, epithelialization is promoted, so that the wound can be healed in a shorter period of time than before. Moreover, the “scar formation inhibitory effect” means an effect of suppressing the formation of a so-called scar (a scar) remaining after the wound has healed. By using a thread made of dried atelocollagen vitrigel as a suture, the wound can be treated without leaving a scar.
  • the irradiation energy of the ultraviolet rays to the columnar hydrogel in this step is sufficient if the vitrification is performed in the state where the hydrogel is continued, for example, when vitrification is performed in a state where the columnar hydrogel is suspended. What is necessary is just to adjust suitably according to a composition and content of a gel.
  • Columnar irradiation energy of the ultraviolet into the hydrogel may be, for example, if 0.1 mJ / cm 2 or more 6000 mJ / cm 2 or less, as long e.g. 10 mJ / cm 2 or more 4000 mJ / cm 2 or less, for example 100 mJ / cm 2 It is sufficient if it is 3000 mJ / cm 2 or more.
  • the irradiation of the columnar hydrogel with ultraviolet rays is performed so that the ultraviolet irradiation region is divided into one surface and the other surface of the columnar hydrogel (for example, “upper surface”) so that the entire surface of the columnar hydrogel is irradiated with ultraviolet rays.
  • the total irradiation amount may be set as the total irradiation amount of ultraviolet rays per unit area to the columnar hydrogel.
  • Step B the dried columnar hydrogel is dried and vitrified to obtain a dried filamentous hydrogel.
  • free water in the columnar hydrogel can be completely removed, and further partial removal of the bound water can proceed.
  • the longer the period of this vitrification process the process of proceeding with the partial removal of bound water after completely removing the free water in the columnar hydrogel, the more excellent the transparency and strength when rehydrated. Vitrigel can be obtained. If necessary, the filamentous vitrigel obtained by rehydration after vitrification for a short period of time can be washed with PBS or the like to be vitrified again.
  • a drying method for example, various methods such as air drying, drying in a sealed container (circulating air in the container and always supplying dry air), drying in an environment where silica gel is placed, and the like can be used.
  • the air drying method include a method of drying in an incubator kept sterile at 10 ° C. and 40% humidity for 2 days, or drying at room temperature all day and night in a clean clean bench. it can.
  • the columnar hydrogel since the columnar hydrogel has an appropriate strength by being irradiated with the ultraviolet rays in the above-mentioned step A, it can be efficiently dried in a state of being hung on a clothesline or the like during drying. it can.
  • Step C Subsequently, the obtained dried filamentous hydrogel is rehydrated to obtain a filamentous vitrigel.
  • rehydration may be performed using physiological saline, PBS (Phosphate Buffered Saline), or the like.
  • yarn which concerns on 2nd Embodiment of this invention is a method provided with the process D which re-glass-forms the said filamentous vitrigel further after the said process C, and obtains a filamentous vitrigel dried body.
  • a yarn can be produced using a hydrogel having a lower strength than a native collagen gel as a raw material. Steps A to C are as described in the first embodiment. Details of step D in the present embodiment will be described below.
  • the obtained filamentous vitrigel is dried and vitrified again.
  • the drying method include the same methods as those exemplified in Step B above. Further, in this step, since the filamentous vitrigel has an appropriate strength, it can be efficiently dried while being hung on a clothesline or the like.
  • yarn which concerns on 3rd Embodiment of this invention is a method provided with the process E which reirradiates an ultraviolet-ray to the said filamentous vitrigel dried body after the said process D further.
  • a yarn can be produced using a hydrogel having a lower strength than a native collagen gel as a raw material. Moreover, the yarn obtained by the production method of the present embodiment has excellent strength. Steps A to D are as described in the first and second embodiments described above. Details of step E in the present embodiment will be described below.
  • the dried filamentous vitrigel product is further irradiated with ultraviolet rays to further increase the strength of the dried filamentous vitrigel product.
  • the irradiation energy of the ultraviolet ray to the dried filamentous vitrigel in this step is not limited as long as the dried filamentous vitrigel is used as a suture or the like, depending on the composition and content of the dried filamentous vitrigel. What is necessary is just to adjust suitably.
  • Filamentous UV irradiation energy to Bitorigeru dried body may, for example, if 0.1 mJ / cm 2 or more 6000 mJ / cm 2 or less, as long e.g. 10 mJ / cm 2 or more 4000 mJ / cm 2 or less, for example 100 mJ / cm as long as two or more 3000mJ / cm 2 or less.
  • the total irradiation amount may be set as the total irradiation amount of ultraviolet rays per unit area to the dried filamentous vitrigel body, for example, “upper surface and lower surface” or “front surface and back surface”.
  • the yarn manufacturing method according to the fourth embodiment of the present invention is a method including, after the step E, the step F of attaching or impregnating a hydrophobic solvent to the dried filamentous vitrigel that has been re-irradiated with ultraviolet rays. .
  • a yarn can be produced using a hydrogel having a lower strength than the native collagen gel as a raw material. Further, the yarn obtained by the production method of the present embodiment has increased flexibility due to the hydrophobic solvent acting as a lubricant, and includes the hydrophobic solvent, so that even in the presence of an aqueous solvent. Strength can be maintained. Steps A to E are as described in the first embodiment, the second embodiment, and the third embodiment described above. Details of step F in the present embodiment will be described below.
  • Step F the dried filamentous vitrigel after ultraviolet irradiation is attached or impregnated with a hydrophobic solvent.
  • the flexibility of the dried filamentous vitrigel is increased, and when used in applications such as sutures, the hydrophobic solvent acts as a lubricant and can be smoothly sutured without catching the laceration.
  • the hydrophobic solvent acts as a lubricant and can be smoothly sutured without catching the laceration.
  • a hydrophobic solvent on the surface of the dried filamentous vitrigel or impregnating from directly under the surface to the inside, a decrease in strength due to rehydration by body fluid or the like is prevented at the sutured portion, and the yarn Strength is maintained.
  • attachment means that a hydrophobic solvent is attached to the surface of the dried filamentous vitrigel
  • impregnate means that the hydrophobic solvent is directly from the surface of the dried filamentous vitrigel to the inside. It means to be soaked.
  • hydrophobic solvent used in this step is not particularly limited as long as it has biocompatibility, and examples thereof include hydrophobic solvents used in known medical applications.
  • hydrophobic solvents include, for example, medical paraffin; liquid oils from plant, seafood, or animal sources (eg, olive oil, corn oil, soybean oil, canola oil, cottonseed oil, coconut oil, sesame oil, sunflower oil Borage seed oil, clove oil, hemp seed oil, herring oil, cod liver oil, salmon oil, flaxseed oil, malt oil, evening primrose oil, and mixtures thereof in any proportion); linole and linolenic acid, ⁇ -linoleic acid ( Polyunsaturated oils containing omega-3 and omega-6 fatty acids such as GLA), eicosapentaenoic acid (EPA), and docosahexaenoic acid (DHA); roses, chanoki, burdock, camphor, cardamom, carrots, kousaigaya Clary), s
  • hydrophobic solvents may be used alone or in combination.
  • the hydrophobic solvent is preferably silicone oil.
  • Silicone oil may be unmodified or modified. More specific examples of the silicone oil include, but are not limited to, polydimethylsiloxane, polymethylphenylsiloxane, polydiphenylsiloxane, polymethylhydrogensiloxane, and the like.
  • the temperature for attaching or impregnating the hydrophobic solvent is not particularly limited, and may be, for example, 10 ° C. or more and 40 ° C. or less.
  • the time for attaching or impregnating the hydrophobic solvent is not particularly limited, and may be, for example, 30 minutes to 48 hours.
  • Examples of the method for adhering or impregnating the hydrophobic solvent include a method of immersing the dried filamentous vitrigel in a hydrophobic solvent, a method of applying a hydrophobic solvent to the dried filamentous vitrigel, and spraying the hydrophobic solvent on the dried filamentous vitrigel. However, it is not limited to these.
  • the yarn obtained by the production method of the present embodiment can be used as, for example, a tissue regeneration yarn, a cell transplant carrier, and the like, as shown in Examples described later.
  • the yarn obtained by the production method of the present embodiment is used as a conjunctival fistula filling material to be used for inserting a treatment device into the vitreous body during a vitreous surgery, as shown in the following examples. Can do.
  • yarn obtained by the manufacturing method of this embodiment can be used as an indwelling material which inserts in the abdominal cavity and suppresses peritonitis and peritoneal fibrosis as shown in the below-mentioned Example.
  • yarn which concerns on one Embodiment of this invention consists of a vitrigel dry body, and the hydrophobic solvent adheres or is impregnated.
  • the yarn of this embodiment is composed of a dried vitrigel, it has excellent strength and can be used as a suture or the like.
  • the yarn of the present embodiment has increased flexibility due to the hydrophobic solvent acting as a lubricant, and can maintain strength even in the presence of the aqueous solvent by including the hydrophobic solvent. it can. Therefore, in the case where the thread of this embodiment is used as a suture, the suture part is maintained without being released after the operation.
  • the shape of the cross section of the yarn of this embodiment is not particularly limited.
  • a polygon such as a triangle, a quadrangle (including a square, a rectangle, a trapezoid), a pentagon, a hexagon, a heptagon, an octagon;
  • Examples include, but are not limited to, a shape, a substantially circular shape, an elliptical shape, a substantially elliptical shape, a semicircular shape, and a sector shape.
  • yarn is circular.
  • the average diameter of the yarn may be, for example, from 1 ⁇ m to 1 mm, for example, from 3 ⁇ m to 900 ⁇ m.
  • the breaking strength of the yarn of this embodiment may be a strength that does not cut when used in applications such as sutures.
  • the breaking strength of the yarn may be, for example, 0.1 kgf or more, for example, 0.2 kgf or more.
  • the yarn can have a strength that does not cut when used in applications such as sutures.
  • the method for measuring the breaking strength of the yarn is as follows. Using a digital force gauge (manufactured by Nidec Simpo), cut the yarn to a total length of 5 cm, fix 1 cm at both ends, and measure the breaking strength (kgf) when pulled at 9 mm per minute . Next, the components of the yarn of this embodiment will be described in detail below.
  • the yarn of this embodiment is made of a dried vitrigel.
  • the sol that is a raw material for the dried vitrigel include the same materials as those exemplified in the above-described yarn production method.
  • the dried vitrigel constituting the yarn of this embodiment is preferably a dried atelocollagen vitrigel because it is a biocompatible material having an epithelialization promoting effect and a scar formation suppressing effect in a wound part.
  • the yarn of this embodiment is attached or impregnated with a hydrophobic solvent.
  • the hydrophobic solvent include the same solvents as those exemplified in the above-described yarn production method.
  • the hydrophobic solvent contained in the yarn of this embodiment is preferably silicone oil.
  • the thread of the present embodiment is useful as a suture because it has excellent strength and the strength is maintained even in the presence of bodily fluids, etc., as shown in the examples described later. Furthermore, when the thread of this embodiment is used as a suture, tissue regeneration is promoted in the wound and no scar is formed. That is, the yarn of this embodiment is useful as a tissue regeneration yarn that can be used as a suture.
  • the thread of the present embodiment is composed of a dried atelocollagen vitrigel, it has an effect of promoting epithelialization and suppressing scar formation in a wound part, and thus is suitable as a tissue regeneration thread.
  • tissue regenerated yarn means a yarn that promotes tissue regeneration at the sutured portion.
  • promotion of tissue regeneration specifically refers to promotion of wound contraction in the healing process of the wound, suppression of formation of granulation tissue, promotion of formation of regenerative epithelium by proliferation of epidermal cells, and the like.
  • the yarn of this embodiment has excellent cell adhesion and cell proliferation as shown in the examples described later.
  • desired cells can be cultured using the yarn of this embodiment, and the yarn with the cells adhered thereto can be transplanted into the living body of the subject. That is, the yarn of this embodiment is useful as a cell transplant carrier.
  • the thread of this embodiment is useful as a material for conjunctival fistula preparation in order to insert a treatment device into the vitreous body during a vitreous surgery, as shown in the examples described later.
  • the yarn of this embodiment when the yarn of this embodiment is composed of a dried atelocollagen vitrigel, it has an inhibitory action on inflammation and fibrosis of the wall-side peritoneum and visceral peritoneum, as shown in Examples below. Furthermore, it has an inhibitory action on the adhesion between the visceral peritoneum (intestinal tracts).
  • the yarn of this embodiment is safe even when placed in a living body, and similarly has an inflammation-inhibiting action or a fibrosis-inhibiting action in tissues other than the peritoneum. That is, the yarn of this embodiment is useful as an inflammation inhibitor or a fibrosis inhibitor (particularly a peritonitis inhibitor or a peritoneal fibrosis inhibitor).
  • yarn of this embodiment is useful as an intestinal adhesion inhibitor.
  • filamentous atelocollagen vitrigel dried 1 a product manufactured using a 1 mL pipette (hereinafter sometimes referred to as “filamentous atelocollagen vitrigel dried 1”) is 148 ⁇ What was manufactured using a 5 mL pipette (hereinafter may be referred to as “filamentous atelocollagen vitrigel 2”) was 444 ⁇ 30 ⁇ m.
  • Example 1 Test for confirming breaking strength of dried filamentous atelocollagen vitrigel The breaking strength of the dried filamentous atelocollagen 1 and the dried filamentous atelocollagen 2 produced in Production Example 1 was measured.
  • a filamentous atelocollagen vitrigel dried body 1 hereinafter sometimes referred to as “dried body 1”
  • rehydrated body 1 a filamentous atelocollagen vitrigel obtained by rehydrating the dried body 1
  • infiltrate 1 dried filamentous atelocollagen vitrigel 1 infiltrated with silicone oil
  • dried body 2 dried filamentous atelocollagen vitrigel 2
  • rehydrated body 2 dried atelocollagen vitrigel rehydrated dry body 2
  • rehydrated body 2 dried atelocollagen vitrigel 2 infiltrated with silicone oil
  • polyglactin suture bicyclyl (7-0, average diameter of suture standard: about 50 to 69 ⁇ m) (hereinafter sometimes referred to as “dry body 3”), dry body 3 Rehydrated bicyclyl (registered trademark) (hereinafter sometimes referred to as “rehydrated body 3”) and bicyclyl (registered trademark) infiltrated with silicone oil (hereinafter sometimes referred to as “infiltrated body 3”). ) Also prepared.
  • FIGS. 1A, 1B and 1C show the breaking strength.
  • the dried body 1 and the infiltrating body 1 have almost the same breaking strength as that of the dry body 3, the rehydrated body 3 and the infiltrating body 3 of Bicuryl (registered trademark) as controls. It was. On the other hand, the rehydrated body 1 and the rehydrated body 2 had a breaking strength smaller than 0.1 kgf. Further, it was confirmed that the dried body 2 and the infiltrating body 2 had a breaking strength larger than 1 kgf and superior to the bicyclyl (registered trademark) dried body 3, the rehydrated body 3 and the infiltrating body 3 as controls. It was. This was presumed to originate from the size of the average diameter.
  • Example 2 Suture test of mouse incision using dried filamentous atelocollagen vitrigel The dried filamentous atelocollagen 1 obtained in Production Example 1 was infiltrated with silicone oil (infiltrate 1) for surgery. In order to confirm that the strength was able to withstand, a suture test of the mouse epidermis incision was performed.
  • FIG. 2 shows an image of the mouse on the day of suture.
  • the infiltrating body 1 has sufficient strength as a suture and does not cause the wound to be separated after the operation.
  • a tissue section of the sutured part on the 7th day of suture was prepared, and immunostaining was performed using hematoxylin-eosin (HE) staining and anti- ⁇ smooth muscle actin ( ⁇ -SMA) antibody.
  • HE staining is shown in FIG. 3A
  • ⁇ -SMA antibody is shown in FIG. 3C.
  • a suture test of the mouse epidermis incision was performed using a polyglactin suture bicyclyl (registered trademark) (7-0, average diameter of suture standard: about 50 to 69 ⁇ m) (dry body 3) as a control.
  • a tissue section of the sutured part on the seventh day of suture was prepared, and HE staining and immunostaining using an anti- ⁇ -SMA antibody were performed.
  • the result of HE staining is shown in FIG. 3B, and the result of immunostaining with anti- ⁇ -SMA antibody is shown in FIG. 3D.
  • Example 3 Filling test of porcine conjunctival fistula using dried filamentous atelocollagen vitrigel To confirm that dried filamentous atelocollagen gel 2 obtained in Production Example 1 (dried product 2) has excellent strength. In addition, it was used as a filling material in the conjunctival defect part (fistula part) of pigs.
  • FIG. 4A shows an image of the conjunctival fistula of the pig on the day embedded as a filling material.
  • the arrow indicates the embedded dry body 2.
  • a plastic port that is usually used as a filling material for the conjunctival fistula was embedded. The result is shown in FIG. 4B.
  • the arrows indicate embedded plastic ports.
  • the dry body 2 has excellent strength and can be used as a filling material for closing the conjunctival fistula.
  • Example 4 Cell Adhesion and Proliferation Confirmation Test Using Dry Filament Atelocollagen Vitrigel Dry Cellular Atelocollagen Vitrigel 1 in Production Example 1 (Rehydrated 1) is a good cell.
  • a cell culture test using endothelial cells and fibroblasts was performed. Specifically, endothelial cells (MS-1, ATCC (American Type Culture Collection)) and fibroblasts (Wistar rat-derived primary cultured dermal fibroblasts) were each resected together with rehydrated body 1 cut to 5 cm. Cultured for 10 days.
  • FIG. 5A is an image showing rehydrate 1 cultured with endothelial cells
  • FIG. 5B is an image showing rehydrate 1 cultured with fibroblasts.
  • the arrows indicate the endothelial cells adhered to the rehydrated body 1.
  • FIG. 5C is an image showing rehydrated body 3 cultured with fibroblasts.
  • Example 5 Peritoneitis suppression effect and peritoneal fibrosis suppression effect confirmation test using dried filamentous atelocollagen vitrigel Dry filamentous atelocollagen vitrigel 1 and dried filamentous atelocollagen vitrigel 2 produced in Production Example 1 were used as peritoneal fibers. We investigated the effect of indwelling in a model mouse.
  • FIG. 6A is an image showing dried filamentous atelocollagen vitrigel 1 and dried filamentous atelocollagen vitrigel 2 produced in Production Example 1.
  • FIG. 6A “CXM1” represents the dried filamentous atelocollagen vitrigel 1 and “CXM5” represents the dried filamentous atelocollagen vitrigel 2.
  • FIG. 6B is a diagram showing a method for inserting a dried filamentous atelocollagen vitrigel into the abdominal cavity of a mouse.
  • the dried filamentous atelocollagen vitrigel 1 and the dried filamentous atelocollagen vitrigel 2 were respectively inserted into the abdominal cavity of a female ICR mouse having a body weight of 40 g (see FIG. 6C).
  • Sham group needle puncture only, chlorhexidine not intraperitoneal injection CG group: chlorhexidine intraperitoneal injection only Gel group: atelocollagen gel intraperitoneal injection, chlorhexidine intraperitoneal injection CXM group: filamentous atelocollagen vitrigel dry body intraperitoneal insertion, chlorhexidine intraperitoneal Injection
  • FIG. 7A the results are shown in FIG. 7A (40 days after induction of peritonitis) and FIG. 8A (56 days after induction of peritonitis).
  • FIG. 7A the arrowheads described in the CG group and the Gel group indicate adhesion between the peritoneum and the intestinal tract
  • the arrow described in the Gel group indicates a collagen gel placed in the peritoneum
  • the arrow described in the CXM group indicates the peritoneum.
  • the indwelling filamentous atelocollagen vitrigel is shown.
  • FIG. 8A the arrow head described in the CG group indicates adhesion between the peritoneum and the intestinal tract
  • the arrow described in the CXM group indicates a filamentous atelocollagen vitrigel placed in the peritoneum.
  • FIG. 7B HE-stained image
  • FIG. 7C Azan-stained image
  • FIG. 8B HE dyeing
  • FIG. 8C Azan dyeing
  • the upper figure is a HE-stained image of the wall-side peritoneum
  • the lower figure is a HE-stained image of the visceral peritoneum.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • a scale bar shows 200 micrometers. Further, from the Azan stained images shown in FIG. 7C and FIG. 8C, the thickness ( ⁇ m) of the mid-subcutaneous connective tissue of each group of mice was measured, and the average value was graphed (see FIG. 7D and FIG. 8D).
  • the fibrosis of the wall side peritoneum was significantly suppressed in the Gel group and the CMX group as compared with the CG group.
  • the CMX group had a particularly remarkable effect of suppressing fibrosis of the wall side peritoneum than the Gel group.
  • the fibrosis of the wall-side peritoneum was significantly suppressed in the CMX group as compared with the CG group at the 56th day after the induction of peritonitis. From this point on, the weight loss of the CG group was significant and the test could not be continued.
  • Anti-cytokeratin AE1 / AE3 (CK AE1 / AE3) antibody CK AE1 / AE3 is a general-purpose epithelial marker.
  • Anti-Vimentin antibody Vimentin is an intermediate filament characteristic of mesenchymal cells. Marker of mesenchymal cells.
  • Anti-N-cadherin antibody A process in which epithelial cells differentiate into mesenchymal cells and expresses N-cadherin.
  • CTGF connective tissue growth factor
  • Anti- ⁇ -SMA antibody The process of differentiation of epithelial cells into mesenchymal cells and expressing ⁇ -SMA. Marker of epithelial-mesenchymal transition.
  • the results of immunostaining are shown in FIG. In FIG. 9, the scale bar of the immunostained image with anti-CK AE1 / AE3 antibody, anti-vimentin antibody and anti-N-cadherin antibody indicates 50 ⁇ m.
  • the scale bar of the immunostained image with anti-CTGF antibody and anti- ⁇ -SMA indicates 100 ⁇ m. Further, in the immunostained image with the anti- ⁇ -SMA antibody in FIG.
  • FIG. 9 shows that at the 40th day after the induction of peritonitis, the CXM group had suppressed the appearance of vimentin positive cells, N-cadherin positive cells and ⁇ -SMA positive cells compared to the CG group. This means that the epithelial-mesenchymal transition of mesothelial cells and the appearance of myofibroblasts, which cause peritoneal fibrosis, were suppressed.
  • FIGS. 10B to 10D the number of CD45 positive cells, the number of F4 / 80 positive cells, and the ratio of PCNA positive cells in the mouse subepithelial interstitial layer (SMIL) were calculated. Were graphed (see FIGS. 10B to 10D). In FIG. 10B and FIG. 10C, the number of each positive cell is represented by area (mm 2 ), and in FIG. 10D, the ratio of the area of PCNA positive cell to the total area of SMIL (%) is represented.
  • the CXM group showed the appearance of CD45 positive leukocytes, F4 / 80 positive macrophages and PCNA positive mesenchymal cells compared to the CG group. It was significantly suppressed. From these results, it was suggested that peritoneal fibrosis was suppressed by suppressing peritonitis in the CMX group.
  • the dried filamentous atelocollagen vitrigel suppressed peritoneal inflammation and fibrosis caused by chlorhexidine.
  • gel-like collagen similar peritoneal inflammation-suppressing effect and fibrosis-suppressing effect were observed, but a significant difference was observed in the effect between dried filamentous atelocollagen vitrigel and gel-like collagen. That is, the dried filamentous atelocollagen vitrigel had significantly superior peritoneal inflammation suppression effect and fibrosis suppression effect than the gel collagen.
  • no significant change was observed in the properties of the dried filamentous atelocollagen vitrigel (see FIGS. 8A to 8C). From this, it was guessed that the peritoneal fibrosis inhibitory effect continues after this.
  • a yarn having excellent strength can be manufactured.
  • yarn obtained by the said manufacturing method consists of an atelocollagen vitrigel dried body, it is the structure where the atelocollagen vitrigel dried body converged with high density, and has the epithelialization promotion effect and scar formation suppression effect. Therefore, the yarn is useful as a tissue regeneration yarn.
  • the yarn obtained by the production method has good cell adhesion and proliferation. Therefore, it is useful as a carrier for cell transplantation.
  • the yarn obtained by the production method has an inhibitory action on inflammation and fibrosis of the wall side peritoneum and visceral peritoneum. In addition, it has an inhibitory action on the adhesion of the visceral peritoneum (intestinal tract). Therefore, it is useful as a peritonitis inhibitor, a peritoneal fibrosis inhibitor, or an intestinal adhesion inhibitor.

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Abstract

ネイティブコラーゲンゲルよりも強度がないハイドロゲルを原料として使用できる糸の製造方法を提供する。前記製造方法により得られ、優れた強度を有する糸を提供する。糸の製造方法は、柱状ハイドロゲルに紫外線を照射する工程Ａと、前記紫外線照射後の柱状ハイドロゲルをガラス化して、糸状ハイドロゲル乾燥体を得る工程Ｂと、前記糸状ハイドロゲル乾燥体を再水和して、糸状ビトリゲルを得る工程Ｃと、をこの順に備える方法である。糸は、ビトリゲル乾燥体からなり、疎水性溶媒が付着又は含浸されている。

Description

糸及びその製造方法
　本発明は、糸及びその製造方法に関する。
本願は、２０１７年５月１８日に、日本に出願された特願２０１７－０９８９３１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　本発明者らは、これまで、アテロコラーゲンビトリゲル膜を開発し、皮膚、角膜、気管、関節軟骨、鼓膜及び食道等の損傷組織を再生できることを実証してきた。この過程で、アテロコラーゲンビトリゲル膜は、創傷部における上皮化促進効果及び瘢痕形成抑制効果を有する生体適合性素材であることが明らかとなった。
　このような背景のもと、皮膚の組織再生に有用なアテロコラーゲンビトリゲル膜は、既に製薬企業等にて医療機器としての研究開発が進められている。一方、日本において使用可能なアテロコラーゲンを原料とする人工真皮としては、インテグラ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、テルダーミス（登録商標）（テルモ社製）及びペルナック（登録商標）（グンゼ社製）の３製品が存在する。これらの人工真皮は、アテロコラーゲンスポンジとシリコン膜とから構成された真皮再建用のテンプレートである。これらのことから、アテロコラーゲンビトリゲルは再生医療分野での適用拡大を見込めることから、膜状のみならず、糸状についても開発が求められていた。
一方、本発明者らは、これまで、ネイティブコラーゲンビトリゲルを、膜状、糸状、管状等の任意の形状に加工する技術を開発してきた（例えば、特許文献１参照）。
特開２００７－２０４８８１号公報
　しかしながら、アテロコラーゲンゲルはネイティブコラーゲンゲルよりも強度がないため、特許文献１に記載の方法では、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度がないアテロコラーゲン等のハイドロゲルを用いて、糸状のビトリゲルを製造することが困難であった。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度がないハイドロゲルを原料として使用できる糸の製造方法を提供する。また、前記製造方法により得られ、優れた強度を有する糸を提供する。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、柱状のハイドロゲルに紫外照射を施して、ガラス化し、再水和することで糸状のアテロコラーゲンビトリゲルが製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
　本発明の第１態様に係る糸の製造方法は、
柱状ハイドロゲルに紫外線を照射する工程Ａと、
前記紫外線照射後の柱状ハイドロゲルをガラス化して、糸状ハイドロゲル乾燥体を得る工程Ｂと、
　前記糸状ハイドロゲル乾燥体を再水和して、糸状ビトリゲルを得る工程Ｃと、
をこの順に備える方法である。
　上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記工程Ｃの後、さらに、前記糸状ビトリゲルを再ガラス化して、糸状ビトリゲル乾燥体を得る工程Ｄを備えてもよい。
　上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記工程Ｄの後、前記糸状ビトリゲル乾燥体に紫外線を再照射する工程Ｅを備えてもよい。
　上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記工程Ｅの後、さらに、紫外線を再照射された前記糸状ビトリゲル乾燥体に疎水性溶媒を付着又は含浸させる工程Ｆを備えてもよい。
　上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記ハイドロゲルが、アテロコラーゲンゲルであってもよい。
　上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記糸は、縫合糸として使用可能な組織再生糸であってもよい。
　上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記糸は、細胞移植用担体であってもよい。
　上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記糸は、結膜瘻孔部の補填材であってもよい。
　上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記糸は、腹膜炎抑制剤又は腹膜線維化抑制剤であってもよい。
　本発明の第２態様に係る糸は、ビトリゲル乾燥体からなり、疎水性溶媒が付着又は含浸されている。
　前記糸の破断強度が０．１ｋｇｆ以上であってもよい。
　前記糸の破断強度が０．２ｋｇｆ以上であってもよい。
　前記ビトリゲル乾燥体がアテロコラーゲンビトリゲル乾燥体であってもよい。
　前記疎水性溶媒がシリコンオイルであってもよい。
　前記糸は、縫合糸として使用可能な組織再生糸であってもよい。
　前記糸は、細胞移植用担体であってもよい。
　前記糸は、結膜瘻孔部の補填材であってもよい。
　前記糸は、腹膜炎抑制剤又は腹膜線維化抑制剤であってもよい。
上記態様によれば、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度がないハイドロゲルを原料として使用できる糸の製造方法を提供することができる。また、前記製造方法により得られ、優れた強度を有する糸を提供することができる。
実施例１における各条件の糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１における破断強度を示すグラフである。 実施例１における各条件の糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２における破断強度を示すグラフである。 実施例１における各条件のポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）における破断強度を示すグラフである。 実施例２におけるシリコンオイルを浸潤させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１を用いてマウス切開部を縫合した画像である。 実施例２における縫合７日目のシリコンオイルを浸潤させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１（浸潤体１）を用いたマウス縫合部の組織切片をヘマトキシリン－エオジン（ＨＥ）染色した結果を示す画像である。 実施例２における縫合７日目のポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）（乾燥体３）を用いたマウス縫合部の組織切片をＨＥ染色した結果を示す画像である。 実施例２における縫合７日目のシリコンオイルを浸潤させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１（浸潤体１）を用いたマウス縫合部の組織切片を抗α平滑筋アクチン（α－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ：α－ＳＭＡ）抗体による免疫染色した結果を示す画像である。 実施例２における縫合７日目のポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）（乾燥体３）を用いたマウス縫合部の組織切片を抗αＳＭＡ抗体による免疫染色した結果を示す画像である。 実施例３における糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２を補填材として用いてブタの結膜瘻孔部を塞いだ画像である。 実施例３における従来の補填材であるプラスチックポートを用いてブタの結膜瘻孔部を塞いだ画像である。 実施例４における内皮細胞と共に培養した再水和させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１（再水和体１）の画像である。 実施例４における線維芽細胞と共に培養した再水和させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１（再水和体１）の画像である。 実施例４における線維芽細胞と共に培養した再水和させたポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）（再水和体３）の画像である。 実施例５で用いられた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体（ＣＸＭ１及びＣＸＭ５）の画像である。 実施例５における糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体のマウス腹腔内への挿入方法を示す図である。 実施例５における糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体をマウス腹腔内へ挿入している様子を示す画像である。 実施例５における腹膜炎誘導後４０日目に開腹した各群のマウスの腹膜の様子を示す画像である。上図は開腹したマウスの腹部全体を示す画像であり、下図は腹膜を拡大した画像である。スケールバーは１ｃｍを示す。 実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの組織切片のＨＥ染色像である。上図は壁側腹膜のＨＥ染色像であり、下図は臓側腹膜のＨＥ染色像である。スケールバーは１００μｍを示す。 実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの壁側腹膜の組織切片のアザン染色像である。スケールバーは２００μｍを示す。 実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの線維化した腹膜の中皮下結合織の厚さを示すグラフである。 実施例５における腹膜炎誘導後５６日目に開腹した各群のマウスの腹膜の様子を示す画像である。上図は開腹したマウスの腹部全体を示す画像であり、下図は腹膜を拡大した画像である。スケールバーは１ｃｍを示す。 実施例５における腹膜炎誘導後５６日目の各群のマウスの組織切片のＨＥ染色像である。上図は壁側腹膜のＨＥ染色像であり、下図は臓側腹膜のＨＥ染色像である。スケールバーは１００μｍを示す。 実施例５における腹膜炎誘導後５６日目の各群のマウスの壁側腹膜の組織切片のアザン染色像である。スケールバーは２００μｍを示す。 実施例５における腹膜炎誘導後５６日目の各群のマウスの線維化した腹膜の中皮下結合織の厚さを示すグラフである。 実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの腹膜の組織切片の各種抗体による免疫染色像である。抗サイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３（ＣＫ　ＡＥ１／ＡＥ３）抗体、抗ビメンチン抗体及び抗Ｎ－カドヘリン抗体による免疫染色像のスケールバーは５０μｍを示す。抗結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＣＴＧＦ）抗体及び抗α－ＳＭＡ抗体による免疫染色像のスケールバーは１００μｍを示す。 実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの腹膜の組織切片の各種抗体による免疫染色像である。スケールバーは５０μｍを示す。 実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの中皮下間質層（ｓｕｂｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ　ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　ｌａｙｅｒ：ＳＭＩＬ）中のＣＤ４５陽性細胞の数を示すグラフである。 実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスのＳＭＩＬ中のＦ４／８０陽性細胞の数を示すグラフである。 実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスのＳＭＩＬ中の増殖細胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＣＮＡ）陽性細胞の割合を示すグラフである。
≪糸の製造方法≫
＜第１実施形態＞
　本発明の第１実施形態に係る糸の製造方法は、
柱状ハイドロゲルに紫外線を照射する工程Ａと、
前記紫外線照射後の柱状ハイドロゲルをガラス化して、糸状ハイドロゲル乾燥体を得る工程Ｂと、
　前記糸状ハイドロゲル乾燥体を再水和して、糸状ビトリゲルを得る工程Ｃと、
をこの順に備える方法である。
　従来の製造方法では、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のないハイドロゲルを用いて糸を製造することができなかった。
　これに対し、本実施形態の製造方法によれば、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のないハイドロゲルを原料としても、糸を製造することができる。
　以下、本実施形態の糸の製造方法の各工程について、詳細を説明する。
［工程Ａ］
　まず、柱状ハイドロゲルに紫外線を照射し、柱状ハイドロゲルの強度を上げる。
　工程Ａで用いられる柱状ハイドロゲルは、例えば、ゾルを所望の径となるように筒状の型等を用いて、ゲル化させて得られたものであればよい。また、ゲル化する際にゾルを保温する温度は、用いるゾルの種類に応じて適宜調整すればよい。例えば、ゾルがコラーゲンゾルである場合、ゲル化する際の保温は、用いるコラーゲンの動物種に依存したコラーゲンの変性温度より低い温度とすればよく、一般的には２０℃以上３７℃以下の温度で保温することで数分から数時間でゲル化を行うことができる。
　なお、本明細書において、「ゾル」とは、液体を分散媒とする分散質のコロイド粒子（サイズ：約１～数百ｎｍ程度）が、特に高分子化合物で構成されるものを意味する。ゾルとしてより具体的には、天然物高分子化合物や合成高分子化合物の水溶液である。そのため、これら高分子化合物の化学結合により架橋が導入されて網目構造をとった場合は、その網目に多量の水を保有した半固形状態の物質である、「ハイドロゲル」に転移する。すなわち、「ハイドロゲル」とは、ゾルをゲル化させたものを意味する。
また、「ビトリゲル」とは、従来のハイドロゲルをガラス化（ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後に再水和して得られる安定した状態にあるゲルのことを指し、本発明者によって、「ビトリゲル（ｖｉｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）」と命名されている。
　また、本明細書においては、本実施形態の製造工程を詳細に説明するにあたり、当該ガラス化工程の直後であり再水和の工程を経ていないハイドロゲルの乾燥体に対しては、単に「ハイドロゲル乾燥体」とした。そして、当該ガラス化工程の後に再水和の工程を経て得られたゲルを「ビトリゲル」として区別して表し、そのビトリゲルをガラス化させて得られた乾燥体を「ビトリゲル乾燥体」とした。また、ビトリゲル乾燥体に紫外線照射する工程を施して得られるものを「紫外線を再照射された糸状ビトリゲル乾燥体」とした。従って、「ビトリゲル」は水和体である。
　また、柱状ハイドロゲルの原料となるゾルとしては、生体適合性を有する材料であればよく、例えば、ゲル化する細胞外マトリックス由来成分、フィブリン、寒天、アガロース、セルロース等の天然高分子化合物、及びポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（ＩＩ－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ等の合成高分子化合物が挙げられる。
前記ゲル化する細胞外マトリックス由来成分としては、例えば、コラーゲン（I型、II型、III型、V型、XI型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ゼラチン等が挙げられ、これらに限定されない。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨ等を選択し所望のビトリゲルを製造することが可能である。また、原料を組み合わせることで、様々な生体内組織を模倣したビトリゲルを得ることができる。
中でも、ゾルとしては、ゲル化する細胞外マトリックス由来成分が好ましく、コラーゲンがより好ましい。また、コラーゲンの中でもより好ましい原料としては、ネイティブコラーゲン又はアテロコラーゲンを例示でき、アテロコラーゲンがさらに好ましい。すなわち、本工程において用いられるハイドロゲルとしては、創傷部における上皮化促進効果及び瘢痕形成抑制効果を有する生体適合性素材であることから、アテロコラーゲンゲルが特に好ましい。
　また、上記例示されたゾルから得られるハイドロゲルは、その組成及び含有量によっては、ネイティブコラーゲンゲルと同等の強度を有するゲル、又は、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のないゲルとなる。また、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のあるゲルとなってもよい。いずれの強度のハイドロゲルであっても、本実施形態の製造方法によれば、上記例示されたゾルから得られるハイドロゲルを原料として、糸を製造することができる。
　なお、本明細書において「上皮化促進効果」とは、創傷部の治癒過程において、肉芽組織の形成を抑制し、さらに表皮細胞の増殖を促進することで、再生上皮の形成が促進されることを意味する。アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体からなる糸を縫合糸として使用することで、上皮化が促進されるため、従来よりも短期間での創傷部の治癒を期待できる。
また、「瘢痕形成抑制効果」とは、創傷部が治癒した後に残る痕（瘢痕）、いわゆる傷痕が形成されることを抑制する効果を意味する。アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体からなる糸を縫合糸として使用することで、傷痕を残さずに創傷部を治療することができる。
　本工程における柱状ハイドロゲルへの紫外線の照射エネルギーは、ハイドロゲルが続く工程Ｂにおいて、例えば柱状ハイドロゲルを吊るした状態でガラス化を行った場合に、切断されない程度の強度となればよく、ハイドロゲルの組成及び含有量に応じて適宜調整すればよい。柱状ハイドロゲルへの紫外線の照射エネルギーは、例えば０．１ｍＪ／ｃｍ２以上６０００ｍＪ／ｃｍ２以下であればよく、例えば１０ｍＪ／ｃｍ２以上４０００ｍＪ／ｃｍ２以下であればよく、例えば１００ｍＪ／ｃｍ２以上３０００ｍＪ／ｃｍ２以下であればよい。
　また、柱状ハイドロゲルへの紫外線の照射は、柱状ハイドロゲルの全面に紫外線が照射されるように、紫外線の照射部位を、柱状ハイドロゲルの一方の面と他方の面と（例えば、「上面と下面と」、又は、「表面と裏面と」等）に分けて照射して、その総照射量を、柱状ハイドロゲルへの単位面積あたりの紫外線総照射量としてもよい。
［工程Ｂ］
　次いで、紫外線照射後の柱状ハイドロゲルを乾燥し、ガラス化させることで、糸状ハイドロゲル乾燥体を得る。
　柱状ハイドロゲルを乾燥させることにより、柱状ハイドロゲル内の自由水を完全に除去し、さらに結合水の部分除去を進行させることができる。
　このガラス化工程（柱状ハイドロゲル内の自由水を完全に除去した後に、結合水の部分除去を進行させる工程）の期間を長くするほど、再水和した際には透明度、強度に優れた糸状ビトリゲルを得ることができる。なお、必要に応じて短期間のガラス化後に再水和して得た糸状ビトリゲルをＰＢＳ等で洗浄し、再度ガラス化することもできる。
　乾燥方法としては、例えば、風乾、密閉容器内で乾燥（容器内の空気を循環させ、常に乾燥空気を供給する）、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用いることができる。例えば、風乾の方法としては、１０℃、４０％湿度で無菌に保たれたインキュベーターで２日間乾燥させる、又は、無菌状態のクリーンベンチ内で一昼夜、室温で乾燥する等の方法を例示することができる。
　また、本工程において、上述の工程Ａで紫外線を照射させたことで、柱状ハイドロゲルは適度な強度を有するため、乾燥の際に、物干し等に吊り下げた状態で効率的に乾燥させることができる。
［工程Ｃ］
　次いで、得られた糸状ハイドロゲル乾燥体を再水和して糸状ビトリゲルを得る。
　このとき、生理食塩水、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）等を用いて、再水和させればよい。
＜第２実施形態＞
　本発明の第２実施形態に係る糸の製造方法は、前記工程Ｃの後、さらに、前記糸状ビトリゲルを再ガラス化して、糸状ビトリゲル乾燥体を得る工程Ｄを備える方法である。
　本実施形態の製造方法によれば、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のないハイドロゲルを原料としても、糸を製造することができる。
　工程Ａ～工程Ｃについては、上述の第１実施形態に記載のとおりである。本実施形態における工程Ｄについて、以下に詳細を説明する。
［工程Ｄ］
　次いで、得られた糸状ビトリゲルを乾燥し、再度ガラス化する。
　乾燥方法としては、上記工程Ｂで例示された方法と同様の方法が挙げられる。
　また、本工程において、糸状ビトリゲルは適度な強度を有するため、乾燥の際に、物干し等に吊り下げた状態で効率的に乾燥させることができる。
＜第３実施形態＞
　本発明の第３実施形態に係る糸の製造方法は、前記工程Ｄの後、さらに、前記糸状ビトリゲル乾燥体に紫外線を再照射する工程Ｅを備える方法である。
　本実施形態の製造方法によれば、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のないハイドロゲルを原料としても、糸を製造することができる。また、本実施形態の製造方法により得られる糸は、優れた強度を有する。
　工程Ａ～工程Ｄについては、上述の第１実施形態及び第２実施形態に記載のとおりである。本実施形態における工程Ｅについて、以下に詳細を説明する。
［工程Ｅ］
　次いで、得られた糸状ビトリゲル乾燥体に紫外線を再照射して、糸状ビトリゲル乾燥体の強度をさらに上げる。
本工程における糸状ビトリゲル乾燥体への紫外線の照射エネルギーは、糸状ビトリゲル乾燥体が縫合糸等で使用した場合に切断されない程度の強度となればよく、糸状ビトリゲル乾燥体の組成及び含有量に応じて適宜調整すればよい。糸状ビトリゲル乾燥体への紫外線の照射エネルギーは、例えば０．１ｍＪ／ｃｍ２以上６０００ｍＪ／ｃｍ２以下であればよく、例えば１０ｍＪ／ｃｍ２以上４０００ｍＪ／ｃｍ２以下であればよく、例えば１００ｍＪ／ｃｍ２以上３０００ｍＪ／ｃｍ２以下であればよい。
また、糸状ビトリゲル乾燥体への紫外線の照射は、糸状ビトリゲル乾燥体の全面に紫外線が照射されるように、紫外線の照射部位を、糸状ビトリゲル乾燥体の一方の面と他方の面と（例えば、「上面と下面と」、又は、「表面と裏面と」等）に分けて照射して、その総照射量を、糸状ビトリゲル乾燥体への単位面積あたりの紫外線総照射量としてもよい。
＜第４実施形態＞
　本発明の第４実施形態に係る糸の製造方法は、前記工程Ｅの後、さらに、紫外線が再照射された前記糸状ビトリゲル乾燥体に疎水性溶媒を付着又は含浸させる工程Ｆを備える方法である。
　本実施形態の製造方法によれば、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のないハイドロゲルを原料として糸を製造することができる。また、本実施形態の製造方法により得られる糸は、疎水性溶媒が潤滑剤として作用することで、しなやかさが増しており、且つ、疎水性溶媒を含むことで、水系溶媒の存在下においても強度を保つことができる。
　工程Ａ～工程Ｅについては、上述の第１実施形態、第２実施形態及び第３実施形態に記載のとおりである。本実施形態における工程Ｆについて、以下に詳細を説明する。
［工程Ｆ］
　次いで、紫外線再照射後の糸状ビトリゲル乾燥体に疎水性溶媒を付着又は含浸させる。これにより、糸状ビトリゲル乾燥体のしなやかさが増して、縫合糸等の用途で用いる際に、疎水性溶媒が潤滑剤として働き、裂傷部をひっかかりなく、なめらかに縫合することができる。また、疎水性溶媒を糸状ビトリゲル乾燥体の表面上に付着させる、又は、表面直下から内部へと含侵させることで、縫合部において体液等による再水和による強度の低下が防止され、糸の強度が維持される。
　なお、ここでいう「付着させる」とは、疎水性溶媒を糸状ビトリゲル乾燥体の表面にくっつかせることを意味し、「含浸させる」とは疎水性溶媒を糸状ビトリゲル乾燥体の表面直下から内部へと染み込ませることを意味する。
　本工程において用いられる疎水性溶媒としては、生体適合性を有するものであればよく、公知の医療用途で用いられる疎水性溶媒が例示される。疎水性溶媒として具体的には、例えば、医療用パラフィン；植物、海産物、又は動物源からの液状油（例えば、オリーブオイル、コーン油、大豆油、キャノーラ油、綿実油、ヤシ油、胡麻油、ヒマワリ油、ルリヂサ種子油、チョウジ油、麻実油、ニシン油、タラ肝油、サケ油、アマニ油、麦芽油、マツヨイグサ油、及びそれらの任意の割合の混合物等）；リノール及びリノレン酸、γ -リノール酸（ＧＬＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、並びにドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等のω－３及びω－６脂肪酸を含む多価不飽和油；バラ、チャノキ、メボウキ、カンファー、カルダモン、ニンジン、コウスイガヤ、オニサルビア（クラリー）、セージ、チョウジ、イトスギ、乳香、ショウガ、グレープフルーツ、ヒソップ、ジャスミン、ラベンダー、レモン、マンダリン、マヨラナ、没薬、ネロリ油、ナツメグ、プチグレン、セージ、タンジェリン、バニラ、及びバーベナ等由来の精油；トリグリセリドオイル、シリコンオイル等が挙げられ、これらに限定されない。これら疎水性溶媒を単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
中でも、疎水性溶媒としては、シリコンオイルであることが好ましい。シリコンオイルは変性されていないものであってもよく、変性されたものであってもよい。シリコンオイルとしてより具体的には、例えば、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリジフェニルシロキサン、ポリメチルハイドロジェンシロキサン等が挙げられ、これらに限定されない。
　疎水性溶媒を付着又は含浸させる温度は、特別な限定はなく、例えば１０℃以上４０℃以下であればよい。
　疎水性溶媒を付着又は含浸させる時間は、特別な限定はなく、例えば３０分以上４８時間以下であればよい。
　疎水性溶媒を付着又は含浸させる方法としては、例えば、疎水性溶媒に糸状ビトリゲル乾燥体を浸漬させる方法、糸状ビトリゲル乾燥体に疎水性溶媒を塗布する方法、糸状ビトリゲル乾燥体に疎水性溶媒を噴霧する方法等が挙げられ、これらに限定されない。
＜用途＞
　本実施形態の製造方法により得られた糸は、後述の実施例に示すとおり、例えば、組織再生糸、細胞移植用担体等として用いることができる。又は、本実施形態の製造方法により得られた糸は、後述の実施例に示すとおり、硝子体手術の際に治療機器を硝子体内に挿入するために作製する結膜瘻孔部の補填材として用いることができる。又は、本実施形態の製造方法により得られた糸は、後述の実施例に示すとおり、腹腔内へ挿入して腹膜炎及び腹膜線維化を抑制する留置材として用いることができる。
≪糸≫
　本発明の一実施形態に係る糸は、ビトリゲル乾燥体からなり、疎水性溶媒が付着又は含浸されている。
本実施形態の糸は、ビトリゲル乾燥体から構成されながらも、優れた強度を有するため、縫合糸等として利用することができる。また、本実施形態の糸は、疎水性溶媒が潤滑剤として作用することで、しなやかさが増しており、且つ、疎水性溶媒を含むことで、水系溶媒の存在下においても強度を保つことができる。そのため、本実施形態の糸を縫合糸として用いた場合において、手術後に縫合部が離開することなく、維持される。
＜物性＞
　本実施形態の糸の横断面の形状は、特別な限定はなく、例えば、三角形、四角形（正方形、長方形、台形含む）、五角形、六角形、七角形、八角形等の多角形；円形、楕円形、略円形、楕円形、略楕円形、半円形、扇形等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、糸の横断面の形状は、円形であることが好ましい。
　また、本実施形態の糸の横断面の形状が円形である場合、その平均直径は、用途に応じて適宜選択すればよい。糸の平均直径としては、例えば１μｍ以上１ｍｍ以下であればよく、例えば３μｍ以上９００μｍ以下であればよい。
　本実施形態の糸の破断強度は、縫合糸等の用途で用いた場合に切断しない程度の強度であればよい。糸の破断強度として具体的には、例えば０．１ｋｇｆ以上であればよく、例えば０．２ｋｇｆ以上であればよい。糸の破断強度の下限値が上記範囲以上であることにより、縫合糸等の用途で用いた場合に切断しない程度の強度を有することができる。
　なお、糸の破断強度の測定方法は、以下のとおりである。
　デジタルフォースゲージ（日本電産シンポ社製）を使用して、糸を全長５ｃｍに切断した後に両端の１ｃｍを固定して、毎分９ｍｍで引っ張った時の破断強度（ｋｇｆ）を測定すればよい。
　次いで、本実施形態の糸の構成成分について、以下に詳細を説明する。
＜ビトリゲル乾燥体＞
　本実施形態の糸は、ビトリゲル乾燥体からなる。
　ビトリゲル乾燥体の原料となるゾルとしては、上述の糸の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の糸を構成するビトリゲル乾燥体としては、創傷部における上皮化促進効果及び瘢痕形成抑制効果を有する生体適合性素材であることから、アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体であることが好ましい。
＜疎水性溶媒＞
　本実施形態の糸は、疎水性溶媒が付着又は含浸されている。
　疎水性溶媒としては、上述の糸の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の糸に含まれる疎水性溶媒としては、シリコンオイルであることが好ましい。
＜用途＞
　本実施形態の糸は、後述の実施例において示すとおり、優れた強度を有し、且つ、体液等が存在してもその強度が維持されることから縫合糸として有用である。さらに、本実施形態の糸を縫合糸として使用した場合に、創傷部において組織の再生が促進され、且つ、瘢痕が形成されない。すなわち、本実施形態の糸は、縫合糸として使用可能な組織再生糸として有用である。
　特に、本実施形態の糸が、アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体で構成される場合、創傷部における上皮化促進効果及び瘢痕形成抑制効果を有することから、組織再生糸として好適である。
　なお、本明細書において、「組織再生糸」とは、縫合部における組織の再生を促進する糸を意味する。ここで、「組織の再生の促進」とは、具体的には、創傷部の治癒過程における創収縮の促進、肉芽組織の形成抑制、表皮細胞の増殖による再生上皮の形成促進等を示す。
　また、本実施形態の糸は、後述の実施例において示すとおり、優れた細胞接着性及び細胞増殖性を有する。このことから、本実施形態の糸を用いて所望の細胞を培養し、当該細胞が接着された状態の糸を被検体の生体に移植することができる。すなわち、本実施形態の糸は、細胞移植用担体として有用である。
　また、本実施形態の糸は、後述の実施例において示すとおり、硝子体手術の際に治療機器を硝子体内に挿入するために作製する結膜瘻孔部の補填材として有用である。
　また、本実施形態の糸が、アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体で構成される場合、後述の実施例に示すとおり、壁側腹膜及び臓側腹膜の炎症及び線維化に対して抑制作用を有する。さらに、臓側腹膜（腸管同士）の癒着に対して抑制作用を有する。また、本実施形態の糸は、生体内に留置しても安全であり、腹膜以外の組織においても同様に炎症抑制作用又は線維化抑制作用を有すると考えられる。すなわち、本実施形態の糸は、炎症抑制剤又は線維化抑制剤（特に、腹膜炎抑制剤又は腹膜線維化抑制剤）として有用である。また、本実施形態の糸は、腸管癒着抑制剤として有用である。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［製造例１］糸の製造
（１）柱状アテロコラーゲンゲルの調製
　まず、１．０％ブタアテロコラーゲン溶液（関東化学社製）と無血清培養液とを等量混和した０．５％のブタ由来アテロコラーゲン溶液を調製した。次いで、調製したアテロコラーゲン溶液を１ｍＬピペット内に１．４ｍＬ、５ｍＬピペット内に７ｍＬ、それぞれ吸い込ませた。次いで、各ピペットの両端をパラフィルムで密閉し、細胞培養用インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置し、ゲル化させて、柱状アテロコラーゲンゲルを調製した。
（２）柱状アテロコラーゲンゲルへの紫外線照射
　次いで、各ピペットの両端からパラフィルムを除去した。ピペット内から柱状アテロコラーゲンゲルを取り出し、ビニールシートが敷かれた平面状のトレイの上に直線的に張った状態で静置した。次いで、紫外線を照射し（照射エネルギー：８００ｍＪ／ｃｍ２）、柱状アテロコラーゲンゲルを反転させて、再度紫外線を照射した（照射エネルギー：８００ｍＪ／ｃｍ２）。合計の紫外線照射エネルギーは、１６００ｍＪ／ｃｍ２であった。
（３）糸状アテロコラーゲンゲル乾燥体の調製
　次いで、紫外線が照射された柱状アテロコラーゲンゲルの一端をポリプロピレン樹脂製の物干しの縁に固定して吊るした。次いで、温度１０℃、湿度４０％の条件の恒温恒湿機を備えた簡易クリーンベンチ内で、充分に風乾して、吊るされた状態の柱状アテロコラーゲンゲルをガラス化させて、糸状アテロコラーゲンゲル乾燥体を調製した。
（４）糸状アテロコラーゲンビトリゲルの調製
　次いで、得られた糸状アテロコラーゲンゲル乾燥体をＰＢＳで再水和し、糸状アテロコラーゲンビトリゲルを調製した。
（５）糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体の調製
　次いで、得られた糸状アテロコラーゲンビトリゲルの一端をポリプロピレン樹脂製の物干しの縁に固定して吊るした。次いで、温度１０℃、湿度４０％の条件の恒温恒湿機を備えた簡易クリーンベンチ内で、充分に風乾して、吊るされた状態の糸状アテロコラーゲンゲルを再ガラス化させて、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を調製した。
（６）糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体への紫外線照射
　次いで、得られた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を平面状のトレイの上に直線的に張った状態で静置した。次いで、紫外線を照射し（照射エネルギー：４００ｍＪ／ｃｍ２）、糸状アテロコラーゲンゲルを反転させて、再度紫外線を照射した（照射エネルギー：４００ｍＪ／ｃｍ２）。合計の紫外線照射エネルギーは、８００ｍＪ／ｃｍ２であった。
　得られた紫外線照射後の糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体の平均直径について、１ｍＬのピペットを用いて製造されたもの（以下、「糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１」と称する場合がある）は、１４８±４２μｍであり、５ｍＬのピペットを用いて製造されたもの（以下、「糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２」と称する場合がある）は、４４４±３０μｍであった。
［実施例１］糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体の破断強度確認試験
　製造例１で製造された糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１及び糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２の破断強度を測定した。
　測定対象として、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１（以下、「乾燥体１」と称する場合がある）、乾燥体１を再水和した糸状アテロコラーゲンビトリゲル（以下、「再水和体１」と称する場合がある）、シリコンオイルを浸潤させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１（以下、「浸潤体１」と称する場合がある）、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２（以下、「乾燥体２」と称する場合がある）、乾燥体２を再水和した糸状アテロコラーゲンビトリゲル（以下、「再水和体２」と称する場合がある）及びシリコンオイルを浸潤させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２（以下、「浸潤体２」と称する場合がある）を準備した。
また、対照として、ポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）（７－０、縫合糸の規格の平均直径：５０～６９μｍ程度）（以下、「乾燥体３」と称する場合がある）、乾燥体３を再水和したバイクリル（登録商標）（以下、「再水和体３」と称する場合がある）及びシリコンオイルを浸潤させたバイクリル（登録商標）（以下、「浸潤体３」と称する場合がある）も準備した。
　また、破断強度の具体的な測定方法としては、デジタルフォースゲージ（日本電産シンポ社製）を使用して、全長５ｃｍに切断した後に両端の１ｃｍを固定して、毎分９ｍｍで引っ張った時の破断強度（ｋｇｆ）を計測した。結果を図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃに示す。
　図１Ａは、各条件の糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１における破断強度、図１Ｂは各条件の糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２における破断強度、及び、図１Ｃは各条件のポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）における破断強度を示したものである。
　図１Ａ～図１Ｃから、乾燥体１及び浸潤体１は、対照であるバイクリル（登録商標）の乾燥体３、再水和体３及び浸潤体３とほぼ同等の破断強度であることが確かめられた。一方、再水和体１及び再水和体２は、破断強度が０．１ｋｇｆよりも小さかった。
　また、乾燥体２及び浸潤体２は破断強度が１ｋｇｆよりも大きく、対照であるバイクリル（登録商標）の乾燥体３、再水和体３及び浸潤体３よりも優れた強度を有することが確かめられた。これは、平均直径の大きさに由来するものであると推察された。
［実施例２］糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を用いたマウス切開部の縫合試験
　製造例１で得られた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１をシリコンオイルで浸潤させたもの（浸潤体１）が手術用に耐えうる強度であることを確かめるために、マウス表皮切開部の縫合試験を行った。縫合を行った当日のマウスの画像を図２に示す。
　図２から、浸潤体１は縫合糸としての強度を充分に有し、手術後に創部離開を来さないことが確かめられた。
　また、縫合７日目の縫合部の組織切片を作製し、ヘマトキシリン－エオジン（ＨＥ）染色及び抗α平滑筋アクチン（α－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ：α－ＳＭＡ）抗体を用いた免疫染色を行った。ＨＥ染色の結果を図３Ａに、抗α－ＳＭＡ抗体による免疫染色による結果を図３Ｃに示す。
　さらに、対照としてポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）（７－０、縫合糸の規格の平均直径：５０～６９μｍ程度）（乾燥体３）を用いてマウス表皮切開部の縫合試験を行った。浸潤体１を用いた場合と同様に、縫合７日目の縫合部の組織切片を作製し、ＨＥ染色及び抗α－ＳＭＡ抗体を用いた免疫染色を行った。ＨＥ染色の結果を図３Ｂに、抗α－ＳＭＡ抗体による免疫染色による結果を図３Ｄに示す。
　図３Ａ及び図３Ｂから、浸潤体１を用いた縫合部では、乾燥体３と同様に、良好に結紮され、組織同士の結合が確認された。
　さらに、図３Ｃ及び図３Ｄから、乾燥体３を用いた場合と比較して、浸潤体１を用いた場合では、瘢痕形成の主体となるαＳＭＡ陽性の筋線維芽細胞数が、縫合部周囲で圧倒的に少ないことが明らかとなった。
［実施例３］糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を用いたブタ結膜瘻孔部の補填試験
　製造例１で得られた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２（乾燥体２）が優れた強度を有することを確かめるために、ブタの結膜欠損部（瘻孔部）に補填材として使用した。補填材として埋め込んだ当日のブタの結膜瘻孔部の画像を図４Ａに示す。図４Ａにおいて、矢印は、埋め込まれた乾燥体２を示す。
また、対照として、通常、結膜瘻孔部の補填材として用いられるプラスチックポートを埋め込んだ。その結果を図４Ｂに示す。図４Ｂにおいて、矢印は、埋め込まれたプラスチックポートを示す。
　図４Ａ及び図４Ｂから、乾燥体２は優れた強度を有し、結膜瘻孔部を塞ぐ補填材として利用可能であることが確かめられた。
［実施例４］糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を用いた細胞接着性及び増殖性確認試験
　製造例１で糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１を再水和したもの（再水和体１）が良好な細胞接着性及び増殖性を有することを確かめるために、内皮細胞及び線維芽細胞を用いた細胞培養試験を行った。
　具体的には、内皮細胞（ＭＳ－１、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））及び線維芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ　ｒａｔ由来初代培養真皮線維芽細胞）をそれぞれ、５ｃｍに切断した再水和体１とともにシャーレで１０日間培養した。培養後、再水和体１を取り出し、ＨＥ染色を行い、光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製、ＢＸ５３）を用いて観察した。図５Ａは、内皮細胞と共に培養した再水和体１を示す画像であり、図５Ｂは線維芽細胞と共に培養した再水和体１を示す画像である。図５Ａにおいて、矢印は、再水和体１に接着した内皮細胞を示す。
　さらに、対照として製造例１でポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）を再水和したもの（再水和体３）についても同様に、５ｃｍに切断し、線維芽細胞とともにシャーレで１０日間培養した。培養後、再水和体３を取り出し、ＨＥ染色を行い、光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製、ＢＸ５３）を用いて観察した。図５Ｃは、線維芽細胞と共に培養した再水和体３を示す画像である。
　図５Ｃから、再水和させたポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）を用いた場合では、非常に少数の細胞のみが接着し増殖も低かった。一方、図５Ｂから、再水和させた糸状アテロコラーゲンビトリゲルを用いた場合では、多数の細胞が接着し増殖していた。
　また、図５Ａ及び図５Ｂから、再水和させた糸状アテロコラーゲンビトリゲルは、内皮細胞及び線維芽細胞共に良好な接着性及び増殖性を示すことが確認された。
［実施例５］糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を用いた腹膜炎抑制効果及び腹膜線維化抑制効果確認試験
　製造例１で製造された糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１及び糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２を腹膜線維化モデルマウスに留置することによる影響を調べた。
（１）糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体のマウス腹腔内への挿入及び留置
　図６Ａは、製造例１で製造された糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１及び糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２を示す画像である。図６Ａにおいて、「ＣＸＭ１」は糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１を示し、「ＣＸＭ５」は糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２を示す。また、図６Ｂは、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体のマウス腹腔内への挿入方法を示す図である。
　体重４０ｇの雌のＩＣＲマウスの腹腔内に、留置針及びピンセットを用いて、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１及び糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２をそれぞれ挿入し、留置した（図６Ｃ参照）。
（２）クロルヘキシジンの腹腔内注入による腹膜線維化モデルマウスの誘導
　糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を留置させた翌日に、当該マウスの腹腔内に０．１％のクロルヘキシジン溶液（１５％エタノール含有生理食塩水溶液を用いて予め調製）を体重１ｋｇ当たり１０ｍＬの投与量で、１日おきに投与した。
　なお、対照試験群も含め、以下の４群を準備した。
　Ｓｈａｍ群：針穿刺のみ、クロルヘキシジン腹腔内注射なし
　ＣＧ群：クロルヘキシジン腹腔内注射のみ
　Ｇｅｌ群：アテロコラーゲンゲル腹腔内注入、クロルヘキシジン腹腔内注射あり
　ＣＸＭ群：糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体腹腔内挿入、クロルヘキシジン腹腔内注射あり
（３）腹膜の観察
　腹膜炎誘導後４０日目及び５６日目に、各群のマウス１匹ずつを開腹し、目視により観察した。結果を図７Ａ（腹膜炎誘導後４０日目）及び図８Ａ（腹膜炎誘導後５６日目）に示す。図７Ａにおいて、ＣＧ群及びＧｅｌ群に記載の矢頭は、腹膜と腸管との癒着を示し、Ｇｅｌ群に記載の矢印は腹膜に留置されたコラーゲンゲルを示し、ＣＸＭ群に記載の矢印は腹膜に留置された糸状アテロコラーゲンビトリゲルを示す。また、図８Ａにおいて、ＣＧ群に記載の矢頭は、腹膜と腸管との癒着を示し、ＣＸＭ群に記載の矢印は腹膜に留置された糸状アテロコラーゲンビトリゲルを示す。
（４）ＨＥ染色及びアザン染色
　次いで、腹膜炎誘導後４０日目及び５６日目の各群のマウスの腹膜の組織切片を作製し、ＨＥ染色及びアザン染色を行った。腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスにおける結果を図７Ｂ（ＨＥ染色像）及び図７Ｃ（アザン染色像）に示す。また、腹膜炎誘導後５６日目の各群のマウスにおける結果を図８Ｂ（ＨＥ染色像）及び図８Ｃ（アザン染色像）に示す。
図７Ｂ及び図８Ｂにおいて、上図は壁側腹膜のＨＥ染色像であり、下図は臓側腹膜のＨＥ染色像である。スケールバーは１００μｍを示す。また、図７Ｃ及び図８Ｃにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
　さらに、図７Ｃ及び図８Ｃそれぞれに示すアザン染色像から、各群のマウスの中皮下結合織の厚さ（μｍ）を測定し、その平均値をグラフ化した（図７Ｄ及び図８Ｄ参照）。
　図７Ａ～図７Ｄから、腹膜炎誘導後４０日目の時点で、Ｇｅｌ群及びＣＭＸ群は、ＣＧ群と比較して、壁側腹膜の線維化が有意に抑制されていた。また、ＣＭＸ群は、Ｇｅｌ群よりも、壁側腹膜の線維化抑制効果が特に顕著であった。
　また、図８Ａ～図８Ｄから、腹膜炎誘導後５６日目の時点で、ＣＭＸ群は、ＣＧ群と比較して、壁側腹膜の線維化が有意に抑制されていた。また、これ以降は、ＣＧ群の体重減少が著しく、試験の継続が不能であった。
（５）線維化マーカーに対する抗体を用いた免疫染色
　次いで、腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの腹膜の組織切片を作製し、各種抗体を用いて免疫染色を行った。用いた抗体を以下に示す。
　抗サイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３（ＣＫ　ＡＥ１／ＡＥ３）抗体：ＣＫ　ＡＥ１／ＡＥ３は、汎用の上皮性マーカーである。
　抗ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）抗体：ビメンチンは、間葉系細胞に特有の中間径フィラメントである。間葉系細胞のマーカー。
　抗Ｎ－カドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）抗体：上皮細胞が間葉系細胞へと分化するプロセスで、Ｎ－カドヘリンを発現する。上皮－間葉分化転換のマーカー。
　抗結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＣＴＧＦ）抗体：ＣＴＧＦは、線維芽細胞の増殖とコラーゲンの産生を冗進させる因子である。線維化マーカー。
　抗α－ＳＭＡ抗体：上皮細胞が間葉系細胞へと分化するプロセスで、α－ＳＭＡを発現する。上皮－間葉分化転換のマーカー。
　また、免疫染色の結果を図９に示す。図９において、抗ＣＫ　ＡＥ１／ＡＥ３抗体、抗ビメンチン抗体及び抗Ｎ－カドヘリン抗体による免疫染色像のスケールバーは５０μｍを示す。抗ＣＴＧＦ抗体及び抗α－ＳＭＡによる免疫染色像のスケールバーは１００μｍを示す。また、図９の抗α－ＳＭＡ抗体による免疫染色像において、矢頭は、陽性コントロールとなる血管壁を示す。
　図９から、腹膜炎誘導後４０日目の時点で、ＣＸＭ群は、ＣＧ群と比較して、ビメンチン陽性細胞、Ｎ－カドヘリン陽性細胞及びα－ＳＭＡ陽性細胞の出現が抑制されていた。これは腹膜の線維化の原因となる中皮細胞の上皮－間葉分化転換と筋線維芽細胞の出現とが抑制されたことを意味する。
（６）炎症マーカーに対する抗体を用いた免疫染色
　次いで、腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの腹膜の組織切片を作製し、各種抗体を用いて免疫染色を行った。用いた抗体を以下に示す。
　抗ＣＤ４５抗体：ＣＤ４５は、白血球のマーカーである。
　抗Ｆ４／８０抗体：Ｆ４／８０は、マウスの成熟マクロファージのマーカーである。
　抗増殖細胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＣＮＡ）抗体：ＰＣＮＡは、細胞周期関連核タンパク質である。細胞増殖と細胞周期とのマーカー（Ｇ１～Ｓ期）。
　また、免疫染色の結果を図１０Ａに示す。図１０Ａにおいて、スケールバーは５０μｍを示す。
　さらに、図１０Ａの各免疫染色像から、マウスの中皮下間質層（ｓｕｂｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ　ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　ｌａｙｅｒ：ＳＭＩＬ）中のＣＤ４５陽性細胞の数、Ｆ４／８０陽性細胞の数及びＰＣＮＡ陽性細胞の割合を算出して、グラフ化した（図１０Ｂ～図１０Ｄ参照）。なお、図１０Ｂ及び図１０Ｃでは、各陽性細胞の数を面積（ｍｍ２）で表し、図１０Ｄでは、ＳＭＩＬ全体の面積に対するＰＣＮＡ陽性細胞の面積の割合（％）で表した。
　図１０Ａ～図１０Ｄから、腹膜炎誘導後４０日目の時点で、ＣＸＭ群は、ＣＧ群と比較して、ＣＤ４５陽性の白血球、Ｆ４／８０陽性のマクロファージ及びＰＣＮＡ陽性の間葉系細胞の出現が有意に抑制されていた。この結果から、ＣＭＸ群では、腹膜炎が抑制されたことで、腹膜線維化が抑制されたことが示唆された。
　以上のことから、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体は、クロルヘキシジンによる腹膜の炎症及び線維化を抑制することが明らかとなった。ゲル状のコラーゲンにおいても同様の腹膜の炎症抑制効果及び線維化抑制効果が認められたが、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体とゲル状のコラーゲンとの間ではその効果に有意差が見られた。すなわち、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体は、ゲル状のコラーゲンよりも、顕著に優れた腹膜の炎症抑制効果及び線維化抑制効果を有していた。
　また、腹膜炎誘導後５６日目でも、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体の性状に大きな変化が見られなかった（図８Ａ～図８Ｃ参照）。このことから、これ以降も腹膜線維化抑制効果は継続するものと推察された。
本実施形態の糸の製造方法によれば、優れた強度を有する糸を製造することができる。また、前記製造方法により得られた糸がアテロコラーゲンビトリゲル乾燥体からなる場合、アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体が高密度に収束した構造であり、上皮化促進効果及び瘢痕形成抑制効果を有する。そのため、前記糸は、組織再生糸として有用である。さらに、前記製造方法により得られた糸は、良好な細胞接着性及び増殖性を有する。そのため、細胞移植用担体として有用である。さらに、前記製造方法により得られた糸は、壁側腹膜及び臓側腹膜の炎症及び線維化に対して抑制作用を有する。また、臓側腹膜（腸管同士）の癒着に対して抑制作用を有する。そのため、腹膜炎抑制剤、腹膜線維化抑制剤又は腸管癒着抑制剤として有用である。

Claims (18)

  1. 　柱状ハイドロゲルに紫外線を照射する工程Ａと、
    前記紫外線照射後の柱状ハイドロゲルをガラス化して、糸状ハイドロゲル乾燥体を得る工程Ｂと、
    　前記糸状ハイドロゲル乾燥体を再水和して、糸状ビトリゲルを得る工程Ｃと、
    をこの順に備える糸の製造方法。
  2. 　前記工程Ｃの後、さらに、前記糸状ビトリゲルを再ガラス化して、糸状ビトリゲル乾燥体を得る工程Ｄを備える請求項１に記載の糸の製造方法。
  3. 　前記工程Ｄの後、さらに、前記糸状ビトリゲル乾燥体に紫外線を再照射する工程Ｅを備える請求項１又は２に記載の糸の製造方法。
  4. 　前記工程Ｅの後、さらに、紫外線を再照射された前記糸状ビトリゲル乾燥体に疎水性溶媒を付着又は含浸させる工程Ｆを備える請求項１～３のいずれか一項に記載の糸の製造方法。
  5. 　前記ハイドロゲルが、アテロコラーゲンゲルである請求項１～４のいずれか一項に記載の糸の製造方法。
  6. 　前記糸は、縫合糸として使用可能な組織再生糸である請求項１～５のいずれか一項に記載の糸の製造方法。
  7. 　前記糸は、細胞移植用担体である請求項１～５のいずれか一項に記載の糸の製造方法。
  8. 　前記糸は、結膜瘻孔部の補填材である請求項１～７のいずれか一項に記載の糸の製造方法。
  9. 　前記糸は、腹膜炎抑制剤又は腹膜線維化抑制剤である請求項１～５のいずれか一項に記載の糸の製造方法。
  10. 　ビトリゲル乾燥体からなり、疎水性溶媒が付着又は含浸された糸。
  11. 　前記糸の破断強度が０．１ｋｇｆ以上である請求項１０に記載の糸。
  12. 　前記糸の破断強度が０．２ｋｇｆ以上である請求項１０又は１１に記載の糸。
  13. 　前記ビトリゲル乾燥体がアテロコラーゲンビトリゲル乾燥体である請求項１０～１２のいずれか一項に記載の糸。
  14. 　前記疎水性溶媒がシリコンオイルである請求項１０～１３のいずれか一項に記載の糸。
  15. 　前記糸は、縫合糸として使用可能な組織再生糸である請求項１０～１４のいずれか一項に記載の糸。
  16. 　前記糸は、細胞移植用担体である請求項１０～１４のいずれか一項に記載の糸。
  17. 　前記糸は、結膜瘻孔部の補填材である請求項１０～１６のいずれか一項に記載の糸。
  18. 　前記糸は、腹膜炎抑制剤又は腹膜線維化抑制剤である請求項１０～１４のいずれか一項に記載の糸。
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