CN116688234A - 一种复合干细胞的活性生物材料的制备及其人工皮肤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种复合干细胞的活性生物材料的制备及其人工皮肤中的应用，有效的解决了现有方法制作成本较高、制作过程复杂、未用于活性物质研究的问题，包括双层结构的复合材料，下层为由活性脂质体与干细胞组成呈水凝胶状的活性材料层，上层为抗菌层，本发明制备巯基化透明质酸/H活性因子复合水凝胶采用的制备方法比较温和，无需加入交联剂且含有大量活性成分，利用该机制环境可通过内皮细胞/脂肪干细胞联合活性因子与血小板裂解物诱导血管新生并在体外快速构建微组织，有利于该支架在体外大规模培育人工皮肤基底层满足患者需求。
Description
技术领域
本发明涉及仿生高分子材料技术领域，具体的是一种复合干细胞的活性生物材料的制备及其人工皮肤中的应用。
背景技术
理解：皮肤是人体面积最大的器官，具有重要的保护作用和生理功能。而烧伤、创伤及顽固性皮肤溃疡(如糖尿病足)等对皮肤造成的严重缺损是当今世界各国普遍面临的重大医疗及公众健康问题。临床实践中，针对难愈合创面和大面积创伤修复需在其表面移植天然皮肤或人工皮肤。
天然皮肤(包括自体皮、异体皮和异种皮)虽然有接近于受体皮肤的结构和功能，但存在皮源不足、免疫排异、病毒传播等问题，因此在大面积创伤修复时应用有限。
人工皮肤是指利用工程学和细胞生物学的原理和方法，在体外人工研制的皮肤代用品，用来修复、替代缺损的皮肤组织。人工皮肤高度近似人类皮肤，在治疗烧伤、烫伤方面具有减轻患者疼痛，愈后不留瘢痕的特效，并且对治疗糖尿病足等长期难愈性溃疡具有良好疗效。国际上已商业化的具有真皮替代功能的人工皮肤选用了与人体皮肤相近的动物源生物材料，但由于这些生物高分子的异种源性，仍会在移植后诱发一定程度的免疫排异反应(如炎症反应)，影响创面快速愈合，且在大面积移植时有诱发全身炎症反应综合症的风险。
一个真正意义上的人工皮肤应具备原生皮肤的三维结构，并实现天然皮肤组织的功能。此外，它还应支持血管形成，并为存在于局部环境中的细胞提供支持。在其植入体内后，它还必须能够以最小的疤痕与宿主结合，同时产生可控的炎症反应。在临床上大面积的全层皮肤缺损是全球伤口医疗中的一个棘手问题，一旦出现突发性的创伤、车祸等事故，将对人类的生命健康及生活品质产生极大的影响。干细胞与组织工程的发展，为人类的组织损伤及器官衰竭的治疗带来了革命性变革，引发在药物和手术之后的新一轮医学革命。目前自体皮移植已被广泛用作全层皮肤缺损的皮肤治疗的重要手段，最早的产品代表就是安体肤。然而，由于血管化成熟的程度不够或者皮肤移植失败等原因，会导致创伤愈合延迟产生感染风险，并且很少生成皮肤附属器官。此外，由微生物感染的伤口以及血管缺损造成的血运断送，是导致全层皮肤缺损并发症的主要因素之一。目前，市场上没有一种单一的皮肤替代品被证明可以完全恢复正常的皮肤结构和生理功能。没有与目前市场产品比较到位。
目前已经面市的各种类型人工皮肤产品品牌包括Dermagraft、Integra、AlloDerm、MatriStem、PriMatrix、PELNAC和PermeaDerm皮肤敷料；以及EpiSkin，EpiDerm，MatriDerm，和Apligraf和安体肤（ActivSkin）等组织工程复合皮肤（人工皮肤）。
检索：在专利库中对该相关领域进行检索，共检索到几十篇相关专利，其中与本申请解决的技术问题较为相似有以下几篇。
引证：
对于公告号为CN110960730B的发明专利，公开了一种3D打印的仿生抗排异人工皮肤及其制备方法。是将带氨基的多糖类物质和蛋白质溶于酸性溶液中得到前体溶液，亚精胺和小分子二醛或两端用醛基修饰的高分子材料溶于无水乙醇中得到亚精胺交联剂，采用3D生物打印方法，在培养皿中打印前体溶液并雾化亚精胺交联剂，依次进行，并通过控制各层的亚精胺交联剂的浓度从而控制各层的硬度，最终得到硬度具有梯度变化的仿生抗排异人工皮肤。
对于公告号为CN111228572B的发明专利，公开了一种人工皮肤及其制备方法与应用。其步骤包括：将液态硅橡胶均匀涂布于固相支持物表面，进行第一固化处理，形成未完全固化的硅橡胶层；将已成型的胶原膜直接放置于步骤S1中所述未完全固化的硅橡胶层的表面，进行第二固化处理，使所述硅橡胶层完全固化并与所述胶原膜紧密粘结；将步骤中粘结所述胶原膜的完全固化的所述硅橡胶层与所述固相支持物分离，获得所述人工皮肤。
对于公告号为CN111407929A的发明专利，提供一种新型人工皮肤及其制备方法。该新型人工皮肤制备方法具体如下：取新鲜动物离体皮肤，通过氢氧化钠、DNA酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠、过氧乙酸、PBS等一系列处理后获得脱细胞真皮基质，超声混合将氧化石墨烯与脱细胞真皮基质溶液混匀，再通过富集处理后得到一种新型人工皮肤。
对于公告号为CN111494713A的发明专利，公开了一种微纳仿生人工皮肤修复膜，包括基底膜、支架层、表皮膜和可分离表膜；基底膜、支架层、聚氨酯表皮膜和可分离表膜从内向外依次层叠设置；基底膜为由丝胶蛋白静电纺丝喷织而成的非织造膜；丝胶蛋白静电纺丝的直径为50-500nm；支架层为混纺静电纺丝喷织而成的非织造层；混纺静电纺丝为由PLA和PCL混纺形成的螺旋状纤维丝；混纺静电纺丝的直径为0 .2-5μm；表皮膜为生物可降解聚氨酯薄膜；可分离表膜由丙纶丝编织而成。
对于公告号为CN113174138A的发明专利，公开了一种含有层状液晶的人工皮肤膜及其制备方法和应用。该人工皮肤膜包括基底材料和溶致液晶组分，所述基底材料为聚二甲基硅氧烷和壳聚糖形成的网络结构，所述溶致液晶组分在人工皮肤膜中的质量百分比为3-8％。所述溶致液晶组分选自糖苷类液晶组分、蔗糖酯类液晶组分、卵磷脂类液晶组分、磷酸酯类液晶组分、硬脂酰类液晶组分、脂肪酸酯类液晶组分其中一种或多种。
对于公告号为CN113105711A的发明专利，提供了一种模拟排汗的人工皮肤，包括透水层和温敏聚氨酯水凝胶层。制备步骤包括：按照重量份称取所述碳纳米管、聚醚多元醇、异氰酸酯、扩链剂、N-乙基吗啉、五氧化二钽、季戊四醇、辛酸亚锡和乙二胺四乙酸二钠镁盐；乳化得到碳纳米管乳浊液；通入臭氧气体，得到亲水性碳纳米管；改性碳纳米管、聚醚多元醇、异氰酸酯、N-乙基吗啉和五氧化二钽放反应釜中，设定反应条件，制备聚氨酯半成品；反应釜中加入扩链剂、季戊四醇和辛酸亚锡投入到反应釜中，制备聚氨酯预聚体；聚氨酯预聚体和乙二胺四乙酸二钠镁盐进一步得到温敏聚氨酯水凝胶。
对于公告号为CN113577398A的发明专利，公开一种3D打印人工皮肤及其制备方法，其皮肤包括：表皮层和真皮层；表皮层覆设于真皮层的上表面，呈水凝胶状态，具有pH敏感性；表皮层的组分包括：第一明胶、单宁酸和铁盐，改善了表皮层的力学性能，具有长效稳定的抗菌和抗炎特性；解决了现有技术中表皮层的抗菌物质爆发性释放对正常细胞造成细胞毒性的问题。
对于公告号为CN114108177A的发明专利，公开了一种可光热触发生长因子阶段性释放的人工皮肤材料及其制法和应用。涉及可光热触发生长因子阶段性释放的人工皮肤材料及其制法。以可降解聚合物材料、可降解天然高分子及相变材料为主要原料并加入抗菌药物、多种生长因子，通过静电纺丝制备成具有多级修复效果的支架材料，材料中加入不同种类抗菌药物，以实现多重抗菌效果；在两层纤维层之间沉积含有不同种类种生长因子的相变材料颗粒，可光热触发多种生长因子的时空可控有序释放，提供伤口愈合不同阶段所需微环境。
对于公告号为CN113797388 A的发明专利，公开了一种甲壳素人工皮肤膜及制备方法，通过利用低温冻融法，以甲壳素粉末为原料，研究氢氧化钠浓度、甲壳素用量、尿素浓度等对膜材料形成的影响，研究复合材料种类、配比等对对复合材料膜力学性能的影响，优化制备条件，制备出具有适宜强度、降解率和力学性能的多功能膜材料。
对于公告号为CN114288474A的发明专利，公开了一种促毛囊再生用真皮层、人工皮肤及其制备方法。其真皮层的原料包括：胶原蛋白、YAP蛋白抑制剂和生长因子微球，通过采用YAP蛋白抑制剂有效阻断伤口中锯齿状蛋白基因激活，从而使次生皮肤成分(毛囊和腺体)的恢复、细胞外基质结构和拉伸强度与未受伤皮肤没有区别。
对于公告号为CN114470338A的发明专利，公开了一种真皮层、人工皮肤及其制备方法。其真皮层的原料包括：重组人源胶原蛋白、维替泊芬和酶，其原料中维替泊芬提供了有效的机械转导机制，调节伤口愈合过程中的En1的表达，诱导正常真皮超微结构的恢复，解决了皮肤愈合过程中疤痕产生，无法生成毛囊、皮脂腺和其他真皮附属物的问题。
对于公告号为CN214881593U的发明专利，公开了一种多功能的人工皮肤培养医疗器械，包括装置主体；将待培养的皮肤块放置在尼龙网上，然后转动第一转手，通过第一转手带动单向丝杆进行转动，单向丝杆的转动使得第一滑块可以在第一滑槽内向下移动，从而使得尼龙网的位置可以下降，进而使得放置在尼龙网上的皮肤块可以完全浸入到培养液内，使其漂浮在培养液中进行培养，当培养一段时间之后，反向转动第一转手，进而使得单向丝杆反向转动，从而使得第一滑块可以在第一滑槽内向上移动，从而使得尼龙网的位置可以上升，进而使得放置在尼龙网上的皮肤块的位置可以上升到气-液面位置进行继续培养，该方式操作简单，解决了传统技术中操作过程繁琐的缺点。
对于专利号为US20070181490A1的发明专利，公开了一种PAMPA模型的制备方法。
对于专利号为CN201510818671 .3的发明专利，公开了一种脂质体人工皮肤膜，其主要成分为卵磷脂，制备过程包括脂质体制备、多孔膜与嵌套底部密封、脂质体与多孔膜结合、冻融循环等步骤。
对于专利号为CN200980152302 .8的发明专利，公开了一种利用神经酰胺、棕榈酸和胆固醇制备的皮肤角质层细胞间脂质模拟基板，形成于基板上的脂质膜与角质层的脂质层状结构类似。
对于公告号为US10473574的发明专利，公开了一种脂质仿生屏障PermeapadTM的制备方法，该仿生屏障由2-4层磷脂和添加剂的混合物和水合纤维支撑层构成，模型药物经过该脂质仿生屏障模型的渗透系数与Caco-2模型以及PAMPA模型的渗透系数有较好的相关性。
总结：以上相关专利存在如下问题：
1.所采用的脂质等材料成本较高。
2.制备过程较为复杂。
3.未用于活性物质渗透预测研究。
4.脂质仿生屏障PermeapadTM更适宜模拟体内吸收的过程。
在此基础上，本发明提供一种复合干细胞的活性生物材料的制备及其人工皮肤中的应用来解决此问题。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明提供一种复合干细胞的活性生物材料的制备及其人工皮肤中的应用，有效的解决了现有方法制作成本较高、制作过程复杂、未用于活性物质研究的问题。
一种复合干细胞的活性生物材料，其特征在于，包括双层结构的复合材料，下层为由活性脂质体与干细胞组成呈水凝胶状的活性材料层，上层为抗菌层。
一种复合干细胞的活性生物材料的制备方法，其特征在于，所述活性脂质体的制备步骤为：
1）将大豆磷脂与胆固醇按照5：2的质量比溶解于无水乙醇当中，溶解物置于真空旋蒸仪中，45℃温度，在转速为200rpm的条件下旋干，成均一的磷脂膜；
2）加入pH为4的柠檬酸溶液，保持磷脂浓度为30mg/ml，水化上述磷脂膜，然后置于超声波中超声分散均匀，300W,30s开30s关，每6ml脂质体超声1分钟；
3）将上述液体转入浓度为100mM的磷酸钠溶液中，用截留分子量为3500Da的透析袋透析24h，即获得所需要的无内包封物的空白脂质体；
4） 包封活性因子的脂质体的制备：保持活性因子浓度为1mg/ml，总体系中磷脂浓度为30mg/ml条件下，用PBS溶解活性因子浓度为1mg/ml加入空白脂质体中，于55℃的水浴摇床中孵育1小时后，将其于截留分子量为3500Da透析袋中，在4℃温度下透析24h，即获得包封活性因子脂质体；
5）聚赖氨酸包覆活性因子脂质体的制备：配制浓度为10mg/ml的ε-聚赖氨酸溶液，取4ml，在1200rpm转速旋转搅拌条件下，逐滴加入包封活性肽脂质体，保持转速搅拌1小时，取出，在4℃离心机中，以15000rpm转速，离心15分钟，用相应溶剂溶解后置于4℃下保存，即获得为本活性脂质体。
优选的，所述活性因子来自海洋生物材料，或陆生生物材料，或利用基因工程技术制造的来自微生物的短肽活性物质，其分子量在2KD至100kD。
优选的，所述活性材料层的制备步骤为：
1）首先是巯基化透明质酸的制备：取4g透明质酸加入1L蒸馏水中，搅拌溶解，配制成均一溶液；再将0.8gL-半胱氨酸盐酸盐加入到透明质酸溶液中；紧接着加入EDC/NHS避光搅拌溶解，调节溶液pH至4.7，即获得接枝改性的巯基化透明质酸复合物；然后依次用pH为5的去离子水、浓度为1wt%的氯化钠溶液、pH为5的去离子水，分别透析3天，而后避光冷冻干燥得到巯基化透明质酸；
2）其次是复合水凝胶的制备：取适量包封活性脂质体溶液超声后，搅拌器加入质量浓度为4%的巯基化透明质酸，溶解完毕后，加入质量分数为0.02%的α-酮戊二酸与1%的N-羟基琥珀酰亚胺复合物；在1000rpm搅拌转速下，逐步滴加浓度为1M的氢氧化钠溶液，调整体系pH为7-8，取出放入37℃水浴锅中成胶，然后将凝胶密封置于4℃冰箱备用；
3）再次是负载干细胞的含活性肽脂质体水凝胶制备：取适量包封活性因子的脂质体溶液通过搅拌器加入质量分数为4%的巯基化透明质酸，溶解完毕后，加入质量分数为0.02%的α-酮戊二酸与1%的N-羟基琥珀酰亚胺复合物；将其置于超净台中，用0.22um的滤头过滤，经过紫外照射灭菌后，逐步滴加经过无菌的1M氢氧化钠溶液，调节体系至中性后，置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中10分钟，稳定成胶；取出后加入含0.1%三抗的PBS溶液冲洗凝胶体系，再置于温度为37℃的二氧化碳恒温箱中温育30min；取出再加入干细胞专用培养基将其净化5-7遍；取培养至第三代的干细胞，调整细胞个数为104个/毫升，吸取干细胞悬液1ml，加到凝胶表面，放入温度为37℃二氧化碳培养箱中，孵育24小时，即得到负载干细胞的含活性肽脂质体水凝胶。
优选的，所述抗菌层由抗菌材料聚六甲基双胍与丝素蛋白通过静电纺丝组成，所述抗菌层的制备步骤为：
1）丝素蛋白的提取：取削口蚕茧加入浓度为0.02M的碳酸钠水溶液中，煮沸，脱胶、直至无黄色胶质沉淀产生；用大量去离子水清洗脱胶蚕茧，洗净后烘干得到干态的丝素蛋白，取干态丝素蛋白于浓度为9.3M的溴化锂溶液中溶解4小时，透析并冻干得到冻干丝素蛋白；
2）丝素蛋白/聚六甲基双胍静电纺丝液的制备：将冻干丝素蛋白，用六氟异丙醇（HFIP）溶解为纺丝溶液，称取一定质量的聚六甲基双胍，在120rpm的转速下，溶解于纺丝溶液中，聚六甲基双胍在静电纺丝液中的质量体积比为0.3-1wt%；
3）丝素蛋白/聚六甲基双胍静电纺丝膜的制备：取上述纺丝液于18G针头配备的注射器中，置于静电纺丝机上，在电压为23KV，接收距离为10-12cm条件下电纺，纺丝完毕的样品，恒温真空干燥箱中干燥去除未挥发的溶剂，即获得抗菌材料层。
优选的，所述双层结构的复合材料制备方法为：采用迈克尔加成反应技术，将包含丝素蛋白/聚六甲基双胍的静电纺丝抗菌材料层与含巯基化透明质酸的包封活性因子的脂质体水凝胶在成胶时复合，静电纺丝膜作为双层复合材料的上层，活性脂质体水凝胶为下层，进一步在上、下层种植成纤维细胞与脂肪干细胞，通过气液共培养，获得复合干细胞的活性生物材料。
优选的，其特征在于，所述干细胞为脂肪干细胞、脐带干细胞、骨髓间充质干细胞的一种，或来自患者自体，或来自陆生动物。
一种复合干细胞的活性生物材料在人工皮肤中的应用，其特征在于，所述复合干细胞的活性生物材料应用于人工皮肤中。
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
（1）本发明制备巯基化透明质酸/H活性因子复合水凝胶采用的制备方法比较温和，无需加入交联剂且含有大量活性成分，利用该机制环境可通过内皮细胞/脂肪干细胞联合活性因子与血小板裂解物诱导血管新生并在体外快速构建微组织，有利于该支架在体外大规模培育人工皮肤基底层满足患者需求。
（2）本发明采用的原料成分纯天然低毒，生物相容性优良有利于细胞生长。
（3）本发明的基材方面选择了透明质酸、活性因子脂质体、丝素蛋白以及聚六甲基双胍起到促血管、可在体外快速构建微组织、可降解、抗菌以及抗张等作用，可作为一种双层仿生人工皮肤支架的生物材料应用于大面积皮肤缺损等，基材方面上不仅选择了透明质酸和活性因子脂质体起到渗透可吸收的作用，并且其负载的活性因子脂质体和脂肪干细胞有促血管化以及促进增殖的主功能。
（4）本发明所得丝素蛋白抗菌膜具有较好的强度、止血性、抗菌性和生物相容性能；上层抵御膜主支架材料为丝素蛋白，为该抗菌膜能够指导内皮细胞有序排列生长，并提供了一定的机械强度、生物相容性并能止血和抗菌等。
（5）本发明所制人工皮肤的上下层可根据创面大小及深度灵活组合使用，实现个性化治疗。其中人工皮肤的上下层的结合可以在水凝胶成胶过程中与上层抗菌膜通过迈克尔加成反应实现。
附图说明
图1为本发明构建的人工皮肤图。
图2为本发明人工皮肤微观结构图。
图3为本发明人工皮肤促血管生长效果图。
图4为本发明人工皮肤动物皮肤缺损治疗应用效果图。
图5为本发明抗菌层抗菌效果图。
图6为本发明抗菌层止血效果图。
具体实施方式
有关本发明的前述及其他技术内容、特点与功效，在以下配合参考附图1至图6对实施例的详细说明中，将可清楚的呈现。以下实施例中所提到的内容，均是以说明书附图为参考。
下面将参照附图描述本发明的各示例性的实施例。
本发明的目的是改善目前市场人工皮肤产品的不足，提供一种双层仿生人工皮肤支架及其作为大面积皮肤缺损修复材料的应用。
本发明技术方案构思：
（1）将水凝胶、活性因子、干细胞、抗菌膜有序组装，构建双层仿生人工皮肤，实现大面积缺损创面修复的技术创新。
采用静电作用和二硫键等反应，在温和条件下交联合成可高效负载生长因子天然复合多级结构支架，通过提供支架内部的孔隙结构以及降解的营养物质、力学性能、缓释生长因子等因素提高干细胞在水凝胶中的存活率，为大面积皮肤损伤的修复提供有益环境。
（2）利用仿生皮肤活性材料促进血管再生，重建再生微环境，实现大面积缺损创面修复的应用创新。
（3）采用活性因子缓释***的构建加入水凝胶中，以期能利用其自身的功能进而促进水凝胶中血管新生环境，从而达到改善宿区微环境，提高水凝胶中种子细胞的存活和与机体组织适应性。
首次通过水凝胶将活性因子与干细胞有序组装，一方面利用活性脂质体水凝胶加强干细胞的功能，提高其存活及对移植局部微环境的耐受能力，另一方面应用活性因子靶向宿主细胞，促进血管新生并重建再生微环境，通过双管齐下的方式，提高创面修复的治疗效果，不但具有广阔的临床应用前景和开发转化潜力，也为其他复杂组织的修复再生提供技术支持。
本发明具体实现的技术手段为：
一种双层仿生人工皮肤支架，由包括下层-巯基化透明质酸/活性因子/脂肪干细胞复合水凝胶和上层抗菌膜-丝素蛋白/聚六甲基双胍静电纺丝膜。
其中，下层支架的制备，其步骤如下：
（1）活性因子脂质体的制备：将大豆软磷脂（PC）与胆固醇（CHOL）按照一定比例溶解后制备合成脂质体，用于包封小分子活性物质。将溶解好的磷脂与胆固醇的溶解物置于真空旋蒸仪上以45℃、200rpm的条件旋干。加入一定体积的柠檬酸溶液（pH=4）水化上述磷脂膜后，将其置于细胞超声中超声分散均匀再转入适当浓度的磷酸钠溶液（PBS）中用3500Da分子量的透析袋透析24h。透析结束后留取少量样品为空白脂质体（K-lip），用PBS溶解的一定浓度的活性因子H与活性因子FITC-H加入空白脂质体溶液中于55℃的水浴摇床中孵育1小时，（保持各组药物浓度为1mg/ml、总体系磷脂浓度为30mg/ml），最后得到总体积为15ml的脂质体。取出后将各组放入标记好的透析袋中于4℃下透析24h。（透析膜截留分子量为3500Da。）；
（2）聚赖氨酸包覆活性因子脂质体（H-Lip-ε-PL）的制备：在平底玻璃瓶中溶解ε-聚赖氨酸（ε- PL）浓度为10mg/ml，分装为4ml/瓶,向三组瓶子中加入磁力搅拌子后置于普通多通道磁力搅拌器上以1200rpm转速旋转搅拌，将上述（1）制备的空白脂质体（K-lip）、包封了活性短肽脂质体（H-lip）以及活性短肽脂质体（Fitc-H-lip）分别吸入10ml注射器中，在上述搅拌的三组瓶子中分别逐滴加入各组脂质体，保持转速搅拌1小时后分别吸出于干净EP管中于4℃离心机中以15000rpm，4℃的条件离心15分钟，取各组吸弃上清液后重悬即为本发明所制脂质体；
（3）巯基化透明质酸/ 活性因子脂质体/脂肪干细胞复合水凝胶的制备：
①巯基化透明质酸的改性：取透明质酸加入蒸馏水中，搅拌溶解，待固体完全溶解可得到透明质酸溶液；再将L-半胱氨酸盐酸盐加入到透明质酸溶液中，紧接着加入EDC/NHS避光搅拌溶解，调节溶液pH至4.7，让L-半胱氨酸盐酸盐接枝可得到巯基化透明质酸复合物；然后依次用pH为5的去离子水、含1wt%的NaCl的pH为5的去离子水、pH为5的去离子水，分别透析3天，而后避光冷冻干燥得到巯基化透明质酸；
②复合水凝胶的制备：将其用于活性因子脂质体溶液中置于磁力搅拌器下搅拌以用于溶解一定比例的巯基化透明质酸，溶解完毕以后在加入特定体系体积的α-酮戊二酸与N-羟基琥珀酰亚胺作为凝胶前驱液，用1M的氢氧化钠(NaOH)在1000rpm搅拌转速下逐步滴加如前驱液中调节体系酸碱度PH为7-8后立刻取出分装入模板中放入37℃水浴锅中，待体系成胶后密封置于4℃冰箱备用。
③制备负载脂肪干细胞含有活性肽脂质体的水凝胶（ADSCs/H-lip/ε- PL/HASH）：如上述步骤制备含活性肽脂质体（DDS）的单纯的凝胶前驱液，将其置于超净台中过滤经过0.22um的滤头过滤，经过紫外照射灭菌后,在前驱液中逐步滴加经过无菌过滤的1M的氢氧化钠(NaOH)调节至中性后置于37℃二氧化碳培养箱中10分钟，取出后向样品中加入含0.1%的三抗PBS轻柔反复浸泡凝胶体系，置于37℃二氧化碳恒温箱中温育30min后取出再加入干细胞专用培养基将其净化5-7遍，置于超净台中备用，将脂肪干细胞培养至第三代的脂肪干细胞消化下来调整细胞个数为10^4个每毫升，吸取脂肪干细胞悬液各1ml加入凝胶表面放入37℃二氧化碳培养箱中孵育1天后即可使用。
支架上层丝素蛋白/聚六甲基双胍静电纺丝膜的制备，其步骤如下：
（1）丝素蛋白的提取：取削口蚕茧加入0.02M的碳酸钠水溶液中，煮沸，脱胶、直至无黄色胶质沉淀产生；而后用大量去离子水清洗脱胶蚕茧，洗净后烘干得到干态的丝素蛋白，取干态丝素蛋白于饱和的9.3M溴化锂溶液中溶解4小时结束后，透析并冻干得到丝素蛋白。
（2）丝素蛋白/聚六甲基双胍静电纺丝液的制备：将所得冻干的丝素蛋白（SF）用六氟异丙醇（HFIP）溶解为纺丝溶液，称取一定质量的（PHMB），在120rpm的转速下溶解于丝素蛋白纺丝溶液中，聚六甲基双胍在静电纺丝液中的质量体积比为0.3wt%和1wt%，命名为SF/PH0.3与SF/PH1。
（3）丝素蛋白/聚六甲基双胍静电纺丝膜的制备：取上述事先准备的搅拌均匀的纺丝液转移至18G针头配备的注射器中，置于静电纺丝机上，施加23KV的高压给注射泵配备适宜的推速配合高压电场，调整接收距离为10-12cm，在接收转轴表面固定一层锡箔纸接收纺丝，纺丝完毕的样品，连带锡箔纸一起揭下置于恒温真空干燥箱中干燥去除未挥发的溶剂保存样品备用。
双层仿生人工皮肤支架的合成：
将丝素蛋白/聚六甲基双胍静电纺丝膜通过迈克尔加成反应与巯基化透明质酸/H活性因子复合水凝胶在成胶时复合，丝素蛋白/聚六甲基双胍静电纺丝膜作为双层仿生人工皮肤支架的上层，巯基化透明质酸/ H活性因子复合水凝胶的下层，分别在上下层种植成纤维细胞与脂肪干细胞通过气液共培养将双层支架结合，该双层支架也可分层培养用于不同深度及损伤面积的创面。
具体实施例为：
人工皮肤上层-抗菌膜的制备方法：
（1）纺丝液的制备：取削口蚕茧加入浓度为0.02M的碳酸钠水溶液中，煮沸，脱胶、直至无黄色胶质沉淀产生；用大量去离子水清洗脱胶蚕茧，洗净后烘干得到干态的丝素蛋白，取干态丝素蛋白于浓度为9.3M的溴化锂溶液中溶解4小时，透析并冻干得到冻干丝素蛋白。将冻干丝素蛋白，用六氟异丙醇（HFIP）溶解为纺丝溶液，称取一定质量的聚六甲基双胍，在120rpm的转速下，溶解于纺丝溶液中。聚六甲基双胍在静电纺丝液中的质量体积比为0.3-1wt%。
（2）抗菌膜的制备：丝素蛋白/聚六甲基双胍静电纺丝膜的制备：取（1）所制纺丝液于18G针头配备的注射器中，置于静电纺丝机上，在电压为23KV，接收距离为10-12cm条件下电纺，纺丝完毕的样品，恒温真空干燥箱中干燥去除未挥发的溶剂，即获得抗菌材料层。
性能表征：
抗菌膜的主要直径分布于1um左右，可供细胞生长，具备优良的微观结构，见图2。此外该抗菌膜具有优良的抗菌性能与止血性能，且具有良好的机械性能。在大鼠皮表大出血以及肝脏出血的模型中表现出优异的止血效果，可作为烧伤以及急性创伤的急救处理材料。此外，该材料在全层皮肤感染伤口中表现出优良的组织愈合能力并产生较多的胶原沉积、且能够促进伤口闭合速率。
活性因子脂质体的制备方法
（1）将大豆磷脂与胆固醇按照5：2的质量比溶解于无水乙醇当中，溶解物置于真空旋蒸仪中，45℃温度，在转速为200rpm的条件下旋干，成均一的磷脂膜；
（2）加入一定体积的pH为4的柠檬酸溶液，保持磷脂浓度为30mg/ml，水化上述磷脂膜，然后置于超声波中超声分散均匀，300W,30s开30s关，每6ml脂质体超声1分钟；
（3）将上述液体转入浓度为100mM的磷酸钠溶液中，用截留分子量为3500Da的透析袋透析24h，即获得所需要的无内包封物的空白脂质体；
（4）制备包封活性肽的脂质体的制备：保持活性因子浓度为1mg/ml，总体系中磷脂浓度为30mg/ml条件下，用PBS溶解活性因子浓度为1mg/ml加入空白脂质体中，于55℃的水浴摇床中孵育1小时后，将其于截留分子量为3500Da透析袋中，在4℃温度下透析24h，即获得包封活性脂质体。
（5）聚赖氨酸包覆活性因子脂质体的制备：配制浓度为10mg/ml的ε-聚赖氨酸溶液，取4ml，在1200rpm转速旋转搅拌条件下，逐滴加入包封活性肽脂质体，保持转速搅拌1小时。取出，在4℃离心机中，以15000rpm转速，离心15分钟，用相应溶剂溶解后置于4℃下保存，即获得为本发明的脂质体。
性能表征：
从附图3可看出：H-LIP-ε- PL脂质体组具有优越的促血管形成的效果，能在24小时内促进小管形成并生成大量的新生毛细血管，该活性因子能促进血管形成，且缓释活性因子并保持生长因子的活力。
人工皮肤下层-生物活性水凝胶的制备方法
（1）改性透明质酸的制备：
取4g透明质酸加入1L蒸馏水中，搅拌溶解，配制成均一溶液；再将0.8gL-半胱氨酸盐酸盐加入到透明质酸溶液中；紧接着加入EDC/NHS避光搅拌溶解，调节溶液pH至4.7，即获得接枝改性的巯基化透明质酸复合物；然后依次用pH为5的去离子水、浓度为1wt%的氯化钠溶液、pH为5的去离子水，分别透析3天，而后避光冷冻干燥得到巯基化透明质酸；
（2）其次是复合水凝胶的制备：取适量包封活性因子的脂质体溶液超声后，搅拌器加入质量浓度为4%的巯基化透明质酸，溶解完毕后，加入质量分数为0.02%的α-酮戊二酸与1%的N-羟基琥珀酰亚胺复合物；在1000rpm搅拌转速下，逐步滴加浓度为1M的氢氧化钠溶液，调整体系PH为7-8，取出放入37℃水浴锅中成胶。然后将凝胶密封置于4℃冰箱备用。
（3）再次是负载干细胞的含活性肽脂质体水凝胶制备：取适量包封活性因子的脂质体溶液通过搅拌器加入质量分数为4%的巯基化透明质酸，溶解完毕后，加入质量分数为0.02%的α-酮戊二酸与1%的N-羟基琥珀酰亚胺复合物；将其置于超净台中，用0.22um的滤头过滤，经过紫外照射灭菌后，逐步滴加经过无菌的1M氢氧化钠溶液，调节体系至中性后，置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中10分钟，稳定成胶；取出后加入含0.1%三抗的PBS溶液冲洗凝胶体系，再置于温度为37℃的二氧化碳恒温箱中温育30min；取出再加入干细胞专用培养基将其净化5-7遍；取培养至第三代的干细胞，调整细胞个数为104个/毫升，吸取干细胞悬液1ml，加到凝胶表面，放入温度为37℃二氧化碳培养箱中，孵育24小时，即得到负载干细胞的含活性肽脂质体水凝胶。
性能表征：
从附图2中水凝胶孔径为100μm左右且ε-聚赖氨酸包覆的活性因子脂质体由于静电作用均匀分布在凝胶支架内壁上缓慢释放活性因子；
从附图4对比各组发现，联合治疗组的HE与Masson、CD31的荧光染色结果来看联合治疗组-负载干细胞的复合水凝胶组（ADSCs/CH02-lip/ε- PL/HASH）的组织愈合能力最强，产生大量新生血管在缺损部位，且胶原沉积情况最佳、能够促进伤口闭合速率。故负载干细胞的复合水凝胶组（ADSCs/CH02-lip/ε- PL/HASH）的治疗效果优于其他实验组。该生物活性水凝胶具有免疫源性低以及生物相容性高的特点。
双层人工皮肤支架的制备方法：
（1）将充分干燥后的抗菌膜用复合水凝胶前驱液在37℃下润湿孵育一个小时，将事先准备好的复合水凝胶置于润湿抗菌膜的表面，整个材料浸泡于含有前驱液的培养皿中，用1M的氢氧化钠调节至前驱液为中性后将培养皿置于37℃温孵1小时即形成双层人工皮肤支架-抗菌膜/生物活性水凝胶。
（2）该支架可通过气液共培养等分层培养环境大规模培育出仿生真皮层表皮层含细胞支架，用于细胞培养环境的活性因子均来自于自主提取的温和活性因子以及血小板裂解物，真皮层细胞来源于患者自身的脂肪干细胞与内皮细胞的共培养物，具有免疫源性低以及生物相容性高的特点。
性能表征：
将材料冻干后通过扫描电镜观察发现其支架上层是直径为1μm左右的纳米纤维静电纺丝支架，下层水凝胶孔径为100μm左右且ε-聚赖氨酸包覆的活性因子脂质体由于静电作用均匀分布在凝胶支架内壁上缓慢释放活性因子；两层材料界面间发生交联，见图2。该双层材料可根据患者实际情况调配，实现个性化治疗，有望成为极具潜力的人工皮肤支架材料。
本发明制备方法温和、天然无毒，有利于细胞生长，还可在体外快速构建微组织、可降解、抗菌以及抗张等作用，并且具有较好的强度、止血性、抗菌性和生物相容性能。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制，在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (8)
1.一种复合干细胞的活性生物材料，其特征在于，包括双层结构的复合材料，下层为由活性脂质体与干细胞组成呈水凝胶状的活性材料层，上层为抗菌层。
2.根据权利要求1所述的一种复合干细胞的活性生物材料的制备方法，其特征在于，所述活性脂质体的制备步骤为：
1）将大豆磷脂与胆固醇按照5：2的质量比溶解于无水乙醇当中，溶解物置于真空旋蒸仪中，45℃温度，在转速为200rpm的条件下旋干，成均一的磷脂膜；
2）加入pH为4的柠檬酸溶液，保持磷脂浓度为30mg/ml，水化上述磷脂膜，然后置于超声波中超声分散均匀，300W,30s开30s关，每6ml脂质体超声1分钟；
3）将上述液体转入浓度为100mM的磷酸钠溶液中，用截留分子量为3500Da的透析袋透析24h，即获得所需要的无内包封物的空白脂质体；
4） 包封活性因子的脂质体的制备：保持活性因子浓度为1mg/ml，总体系中磷脂浓度为30mg/ml条件下，用PBS溶解活性因子浓度为1mg/ml加入空白脂质体中，于55℃的水浴摇床中孵育1小时后，将其于截留分子量为3500Da透析袋中，在4℃温度下透析24h，即获得包封活性因子脂质体；
5）聚赖氨酸包覆活性因子脂质体的制备：配制浓度为10mg/ml的ε-聚赖氨酸溶液，取4ml，在1200rpm转速旋转搅拌条件下，逐滴加入包封活性肽脂质体，保持转速搅拌1小时，取出，在4℃离心机中，以15000rpm转速，离心15分钟，用相应溶剂溶解后置于4℃下保存，即获得为本活性脂质体。
3.根据权利要求2所述的一种复合干细胞的活性生物材料的制备方法，其特征在于，所述活性因子来自海洋生物材料，或陆生生物材料，或利用基因工程技术制造的来自微生物的短肽活性物质，其分子量在2KD至100kD。
4.根据权利要求2所述的一种复合干细胞的活性生物材料的制备方法，其特征在于，所述活性材料层的制备步骤为：
1）首先是巯基化透明质酸的制备：取4g透明质酸加入1L蒸馏水中，搅拌溶解，配制成均一溶液；再将0.8gL-半胱氨酸盐酸盐加入到透明质酸溶液中；紧接着加入EDC/NHS避光搅拌溶解，调节溶液pH至4.7，即获得接枝改性的巯基化透明质酸复合物；然后依次用pH为5的去离子水、浓度为1wt%的氯化钠溶液、pH为5的去离子水，分别透析3天，而后避光冷冻干燥得到巯基化透明质酸；
2）其次是复合水凝胶的制备：取适量包封活性脂质体溶液超声后，搅拌器加入质量浓度为4%的巯基化透明质酸，溶解完毕后，加入质量分数为0.02%的α-酮戊二酸与1%的N-羟基琥珀酰亚胺复合物；在1000rpm搅拌转速下，逐步滴加浓度为1M的氢氧化钠溶液，调整体系pH为7-8，取出放入37℃水浴锅中成胶，然后将凝胶密封置于4℃冰箱备用；
3）再次是负载干细胞的含活性肽脂质体水凝胶制备：取适量包封活性因子的脂质体溶液通过搅拌器加入质量分数为4%的巯基化透明质酸，溶解完毕后，加入质量分数为0.02%的α-酮戊二酸与1%的N-羟基琥珀酰亚胺复合物；将其置于超净台中，用0.22um的滤头过滤，经过紫外照射灭菌后，逐步滴加经过无菌的1M氢氧化钠溶液，调节体系至中性后，置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中10分钟，稳定成胶；取出后加入含0.1%三抗的PBS溶液冲洗凝胶体系，再置于温度为37℃的二氧化碳恒温箱中温育30min；取出再加入干细胞专用培养基将其净化5-7遍；取培养至第三代的干细胞，调整细胞个数为104个/毫升，吸取干细胞悬液1ml，加到凝胶表面，放入温度为37℃二氧化碳培养箱中，孵育24小时，即得到负载干细胞的含活性肽脂质体水凝胶。
5.根据权利要求4所述的一种复合干细胞的活性生物材料的制备方法，其特征在于，所述抗菌层由抗菌材料聚六甲基双胍与丝素蛋白通过静电纺丝组成，所述抗菌层的制备步骤为：
1）丝素蛋白的提取：取削口蚕茧加入浓度为0.02M的碳酸钠水溶液中，煮沸，脱胶、直至无黄色胶质沉淀产生；用大量去离子水清洗脱胶蚕茧，洗净后烘干得到干态的丝素蛋白，取干态丝素蛋白于浓度为9.3M的溴化锂溶液中溶解4小时，透析并冻干得到冻干丝素蛋白；
2）丝素蛋白/聚六甲基双胍静电纺丝液的制备：将冻干丝素蛋白，用六氟异丙醇（HFIP）溶解为纺丝溶液，称取一定质量的聚六甲基双胍，在120rpm的转速下，溶解于纺丝溶液中，聚六甲基双胍在静电纺丝液中的质量体积比为0.3-1wt%；
3）丝素蛋白/聚六甲基双胍静电纺丝膜的制备：取上述纺丝液于18G针头配备的注射器中，置于静电纺丝机上，在电压为23KV，接收距离为10-12cm条件下电纺，纺丝完毕的样品，恒温真空干燥箱中干燥去除未挥发的溶剂，即获得抗菌材料层。
6.根据权利要求5所述的一种复合干细胞的活性生物材料的制备方法，其特征在于，所述双层结构的复合材料制备方法为：采用迈克尔加成反应技术，将包含丝素蛋白/聚六甲基双胍的静电纺丝抗菌材料层与含巯基化透明质酸的包封活性因子的脂质体水凝胶在成胶时复合，静电纺丝膜作为双层复合材料的上层，活性脂质体水凝胶为下层，进一步在上、下层种植成纤维细胞与脂肪干细胞，通过气液共培养，获得复合干细胞的活性生物材料。
7.根据权利要求4所述的一种复合干细胞的活性生物材料的制备方法，其特征在于，所述干细胞为脂肪干细胞、脐带干细胞、骨髓间充质干 细胞的一种，或来自患者自体，或来自陆生动物。
8.根据权利要求1-7任一所述一种复合干细胞的活性生物材料在人工皮肤中的应用，其特征在于，所述复合干细胞的活性生物材料应用于人工皮肤中。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202310055382.7A CN116688234A (zh) | 2023-01-16 | 2023-01-16 | 一种复合干细胞的活性生物材料的制备及其人工皮肤中的应用 |
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| CN202310055382.7A CN116688234A (zh) | 2023-01-16 | 2023-01-16 | 一种复合干细胞的活性生物材料的制备及其人工皮肤中的应用 |
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| CN116688234A true CN116688234A (zh) | 2023-09-05 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN117205366A (zh) * | 2023-11-07 | 2023-12-12 | 南京东万生物技术有限公司 | 面部填充用胶原蛋白-透明质酸复合水凝胶及其制备方法 |
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2023
- 2023-01-16 CN CN202310055382.7A patent/CN116688234A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117205366A (zh) * | 2023-11-07 | 2023-12-12 | 南京东万生物技术有限公司 | 面部填充用胶原蛋白-透明质酸复合水凝胶及其制备方法 |
| CN117205366B (zh) * | 2023-11-07 | 2024-01-02 | 南京东万生物技术有限公司 | 面部填充用胶原蛋白-透明质酸复合水凝胶及其制备方法 |
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