WO2018189274A1 - Liquid cell for the microscopic imaging and raman spectroscopic material analysis of particles suspensions - Google Patents

Abstract

The invention relates to a liquid cell (1) for the microscopic image capture and Raman spectroscopic material analysis of a particle suspension in a reflected light microscope, having at least the following components: - a measuring chamber (2) which has a base (3), a measuring window (5) opposite the base (3), and a seal (6), wherein - the base (3) has a planar design at least in one region of the support of the seal (6), and the base (3) has a reflective surface (4) which is provided such that Raman excitation light incident through the measuring window (5) is reflected on the reflective surface (4) in a directed manner such that the background signal in a Raman measurement is reduced and the Raman signal of a particle in a suspension is increased. The invention further relates to a microscope which has such a liquid cell.

Description

Flüssigkeitszelle zur mikroskopischen Bildgebung und ramanspektroskopischen Materialanalyse von Partikelsuspensionen Fluid cell for microscopic imaging and Ramspectroscopic material analysis of particle suspensions

Beschreibung description

Die Erfindung betrifft eine Flüssigkeitszelle gemäß Anspruch 1 , ein System gemäß Anspruch 8 sowie ein Mikroskop gemäß Anspruch 9. The invention relates to a fluid cell according to claim 1, a system according to claim 8 and a microscope according to claim 9.

Viele Pharm azeutika werden standardmäßig auf Fremdpartikel und/oder Many pharmaceuticals are standard on foreign particles and / or

Proteinaggregate untersucht. Oftmals ist dies sogar durch behördliche Vorschriften wie durch die US FDA vorgeschrieben. Solche Vorschriften betreffen beispielsweise die maximalen Partikelzahlen, gegliedert nach verschiedenen Größenklassen. Um zu gewährleisten, dass Grenzwerte nicht überschritten werden, müssen Partikel identifiziert und quantifiziert werden. Dazu gehört, dass Aggregate in Examined protein aggregates. Often this is even required by regulatory requirements such as the US FDA. Such regulations relate, for example, to the maximum particle numbers, broken down into different size classes. In order to ensure that limit values are not exceeded, particles must be identified and quantified. This includes aggregates in

Proteinlösungen, Fremdpartikel und Luftblasen detektiert und unterschieden werden. Dies geschieht durch eine Vorrichtung die dazu eingerichtet ist, die Detektion von Partikeln sowie die Bestimmung deren Größe und Form zu ermöglichen. Die Protein solutions, foreign particles and air bubbles are detected and distinguished. This is done by a device which is adapted to allow the detection of particles and the determination of their size and shape. The

Detektion von Partikeln kann auf verschiedene Arten erfolgen. Üblich sind jedoch bildgebende Verfahren, wie beispielsweise Lichtmikroskopie. Detection of particles can be done in several ways. However, imaging techniques such as light microscopy are common.

Bildgebung von Partikeln in Flüssigkeitszellen und Durchflusszellen ist bereits aus dem Stand der Technik bekannt (US 5,471 ,294, EP 1329706, US7605919). Mit der FlowCam können zum Beispiel Bilder von Partikeln beim Durchfließen der Zelle aufgenommen und analysiert werden (US7605919). Über Formparameter der Partikel und Auswertealgorithmen können die Partikel verschiedenen Klassen (Beispielsweise Proteinaggregate, Luftblasen oder Silikontropfen) zugeordnet werden. Die genaue Bestimmung des Stoffes, aus dem das Partikel besteht, ist allerdings nicht möglich. Dabei wäre es bei derartigen Verfahren vorteilhaft, wenn die Bildgebung von Partikeln in einer Flüssigkeit mit der Bestimmung des Imaging of particles in fluid cells and flow cells is already known from the prior art (US 5,471, 294, EP 1329706, US7605919). With the FlowCam, for example, images of particles as they flow through the cell can be recorded and analyzed (US7605919). Using particle shape parameters and evaluation algorithms, the particles can be assigned to different classes (for example, protein aggregates, air bubbles or silicone droplets). The exact determination of the substance of which the particle is made, however, is not possible. It would be advantageous in such methods, when the imaging of particles in a liquid with the determination of

Partikelmaterials durch Ramanspektroskopie in der gleichen Messzelle durchgeführt werden könnte. Dies würde es beispielsweise erlauben, verschiedene Proteine oder Polymere zu identifizieren bzw. differenzieren.  Particle material could be carried out by Raman spectroscopy in the same measuring cell. This would allow, for example, different proteins or polymers to be identified or differentiated.

Für eine kombinierte, bildgebende und zielgerichtete, d.h. basierend auf den aufgenommen Bildern, Raman-spektroskopische Messung müsste ein derartig eingerichtetes Mikroskop umfassende optische und mechanische Einrichtungen aufweisen. Dies liegt unter anderem daran, dass ramanspektroskopische Messungen üblicherweise Punktmessungen sind und sichergestellt werden muss, dass die ramanspektroskopische Messung am richtigen Ort durchgeführt wird. Nur so können die beiden Messmethoden zu einer korrelierten Gesamtmessaussage kombiniert werden. For a combined, imaging and targeting, ie based on the images taken, Raman spectroscopic measurement would have such a set-up microscope comprehensive optical and mechanical devices exhibit. Among other things, this is because Raman spectroscopic measurements are usually point measurements and it must be ensured that the Raman spectroscopic measurement is carried out at the correct location. Only then can the two measuring methods be combined into a correlated overall measurement statement.

Es sind Verfahren bekannt, bei denen das Anfahren der Partikel in sogenannten„wet cells" zur Ramanspektroskopie automatisiert durchgeführt wird. Die automatische Erkennung der Größe und Form sowie des Ortes von Mikropartikeln in einer Methods are known in which the particle start-up in so-called "wet cells" for Raman spectroscopy is automated, and the automatic detection of the size and shape as well as the location of microparticles in one

Suspension mit dem Ziel Schwingungsspektroskopie durchzuführen, wurde bereits von Malvern (Malvern Application Note„„Characterization of protein aggregates in Suspension and on a filter membrane by Morphologically-Directed Raman Suspension with the aim to perform vibrational spectroscopy has already been performed by Malvern (Malvern Application Note "Characterization of protein aggregates in suspension and on a filter membrane by Morphologically-Directed Raman

Spectroscopy") beschrieben. Hier sind Ergebnisse veröffentlicht, die zeigen, dass mit kombinierter, automatisierter Erkennung von Partikeln und Ramanspektroskopie in der„thin-path wet cell" verschiedene Partikelspezies in einer Proteinlösung unterschieden werden können. Die Bildgebung der Probe erfolgt im Durchlicht, weshalb sowohl für die obere als auch die untere Seite der Messzelle ein Here, results are published which show that with combined, automated detection of particles and Raman spectroscopy in the thin-path wet cell different particle species can be distinguished in one protein solution. The imaging of the sample takes place in transmitted light, which is why both for the upper and the lower side of the measuring cell

transparentes Messfenster aus Quarz verwendet wird. transparent measuring window made of quartz is used.

Eine weitere Flüssigkeitszelle, die auch für die Ramanspektroskopie an Partikeln genutzt werden kann, ist in DE 102013015033 beschrieben. Die Abbildung in dieser Durchflusszelle erfolgt in Auflichtgeometrie. Another liquid cell which can also be used for Raman spectroscopy on particles is described in DE 102013015033. The image in this flow cell is in incident light geometry.

Problematisch an beiden vorgenannten Messzellen ist der hohe Untergrund des Substrates. Das üblicherweise verwendete Glas oder Quarzglas erzeugt bei der Messung ebenfalls ein Ramansignal, welches das zu messende Signal der Probe so überlagern kann, dass dessen Qualität deutlich schlechter und damit die The problem with both aforementioned measuring cells is the high background of the substrate. The commonly used glass or quartz glass also generates a Raman signal during the measurement, which can superimpose the signal to be measured on the sample so that its quality is significantly worse and thus the

Identifizierung der Partikelsubstanz schwieriger wird. Dies wird insbesondere bei der Messung von Mikropartikeln relevant, da hier der durch das Anregungslicht belichtete Fleck deutlich größer als das zu analysierende Partikel und somit der Anteil des Hintergrundsignals sehr groß sein kann. Identification of the particulate matter is difficult. This becomes particularly relevant in the measurement of microparticles, since here the spot exposed by the excitation light can be significantly larger than the particle to be analyzed and thus the proportion of the background signal can be very large.

Neben dem hohen Untergrund der Messungen, sind auch folgende Probleme bei derartigen Messungen zu lösen. Luftblasen, die sich beim Befüllen der Messkammer bilden können, müssen vermieden werden, da sie zu Messartefakten führen können. Die Bildung von Luftblasen ist besonders bei hochviskosen Suspensionen problematisch. In addition to the high background of the measurements, the following problems in such measurements are to be solved. Air bubbles that may form when filling the measuring chamber must be avoided as they can lead to measuring artifacts. The formation of air bubbles is particularly problematic in high viscosity suspensions.

Um eine möglichst vielseitigen Einsatzmöglichkeit der Flüssigkeitszelle zu gewährleisten, muss die Zelle aus inerten Materialien gefertigt sein und muss insbesondere einfach zu reinigen sein, damit eine Kontamination von folgenden Proben ausgeschlossen werden kann. In order to ensure the most versatile possible use of the liquid cell, the cell must be made of inert materials and in particular must be easy to clean, so that contamination of subsequent samples can be excluded.

Weiterhin ist die Schichtdicke der zu untersuchenden Suspension kritisch, da bei einer zu dicken Schicht eine optimale Fokussierung auf die Partikel nicht möglich ist. Umgekehrt besteht bei einer sehr dünnen Flüssigkeitsschicht die Gefahr, dass ein sehr hohes Hintergrundsignal durch das sich nahe dem Fokus befindende Furthermore, the layer thickness of the suspension to be examined is critical, since in the case of too thick a layer optimum focusing on the particles is not possible. Conversely, with a very thin layer of liquid, there is a risk that a very high background signal will be due to the near-focus

Fenstermaterial erzeugt wird. Dieses Hintergrundsignal überlagert das Ramansignal und erschwert die spektroskopische Bestimmung des Partikelmaterials. Window material is generated. This background signal superimposes the Raman signal and makes the spectroscopic determination of the particulate material more difficult.

Daneben sollte das untersuchbare Probenvolumen von variabler Größe sein, damit einerseits Proben mit niedriger Partikelzahl untersucht werden können (erfordert ein eher großes Volumen), andererseits aber Proben untersucht werden können, die nur ein in kleinen Mengen vorliegen (kleines Probenvolumen). In addition, the sample volume to be examined should be of variable size, so that on the one hand samples with a low particle number can be examined (requires a rather large volume), but on the other hand samples can be examined which are only one in small amounts (small sample volume).

Häufig ist der Bildkontrast, also der Kontrast zwischen Partikel und Hintergrund bei den bekannten Verfahren nicht ausreichend hoch. Dies führt zu Fehlern sowohl bei der Messung als auch bei der Auswertung der Messdaten. Frequently the image contrast, ie the contrast between particle and background, is not sufficiently high in the known methods. This leads to errors both in the measurement and in the evaluation of the measured data.

Eine weitere Schwierigkeit bei der Bestimmung des Partikelmaterials durch Another difficulty in determining the particulate material

Ramanspektroskopie besteht darin, eine ausreichend hohe Signalqualität zu erreichen. Oft müssen zum Beispiel Protein-Aggregate in einer hochkonzentrierten Proteinlösung untersucht werden, deren Ramansignal sich nur wenig von dem der umgebenden Flüssigkeit unterscheidet. Raman spectroscopy is to achieve a sufficiently high signal quality. Often, for example, protein aggregates must be examined in a highly concentrated protein solution whose Raman signal differs only slightly from that of the surrounding fluid.

Die Aufgabe der Erfindung besteht somit darin, eine Flüssigkeitszelle bereitzustellen, mit der die Vielzahl der oben genannten Probleme in vorteilhafter Weise gelöst werden, insbesondere soll das Signal-zu-Rauschverhältnis bei Messungen in einer erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle hinsichtlich bildgestützter, The object of the invention is therefore to provide a liquid cell with which the plurality of the above-mentioned problems are solved in an advantageous manner, in particular, the signal-to-noise ratio in measurements in a liquid cell according to the invention in terms of image-based,

ramanspektroskopischer Messungen verbessert werden. Weiterhin besteht die Aufgabe der Erfindung darin, ein Mikroskop bereitzustellen, mit dem die oben genannten Aufgaben vorteilhaft bewirkt werden können. Das erfindungsgemäße Problem wird durch eine Flüssigkeitszelle gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben und werden nachfolgend beschrieben. ramanspektroskopischer measurements can be improved. Furthermore, the object of the invention is to provide a microscope, with which the above-mentioned objects can be advantageously effected. The problem of the invention is solved by a liquid cell according to claim 1. Advantageous embodiments of the invention are specified in the subclaims and are described below.

Danach weist eine Flüssigkeitszelle zur mikroskopischen Bilderfassung und bildgestützten, ramanspektroskopischen Materialanalyse einer Partikelsuspension in einem Auflicht-Mikroskop, zumindest die folgenden Komponenten auf: eine Messkammer, aufweisend einen Boden, ein dem Boden gegenüberliegendes insbesondere parallel zum Boden verlaufendesThereafter, a liquid cell for microscopic image acquisition and image-based, ramanspektroskopischen material analysis of a particle suspension in an incident light microscope, at least the following components: a measuring chamber, having a bottom, a bottom opposite, in particular parallel to the ground running

Messfenster und eine Dichtung, wobei Measuring window and a seal, where

- der Boden zumindest in einem Bereich der Auflagefläche der Dichtung eben ausgeführt ist,  the base is designed to be flat, at least in a region of the bearing surface of the seal,

wobei der Boden eine insbesondere glatte, insbesondere bereichsweise glatte und reflektierende Oberfläche aufweist, die so beschaffen ist, dass durch das Messfenster einfallendes Licht, insbesondere Raman- Anregungslicht, an der reflektierenden Oberfläche gerichtet reflektiert wird, so dass das Untergrundsignal bei einer Ramanmessung reduziert wird und das Ramansignal eines in einer Suspension enthaltenen Partikels erhöht wird.  wherein the bottom has a particularly smooth, in particular partially smooth and reflective surface which is such that light incident through the measuring window, in particular Raman excitation light, is reflected at the reflecting surface, so that the background signal is reduced in a Raman measurement and the Raman signal of a particle contained in a suspension is increased.

Die reflektierende Oberfläche weist dabei einen Reflexionsgrad von insbesondere mehr als 70% in zumindest einem breiten Bereich des elektromagnetischen The reflective surface in this case has a reflectance of in particular more than 70% in at least a broad range of the electromagnetic

Spektrums auf - insbesondere im ultra-violetten, sichtbaren sowie im nahen infraroten Spektralbereich. Die Oberfläche ist so beschaffen, dass auftreffende Lichtstrahlen gerichtet reflektiert werden und zwar weitgehend unabhängig vom Einfallswinkel, d.h. die Reflexion ist insbesondere nicht nur auf Grenzwinkel für Totalreflexion beschränkt. Die reflektierende Oberfläche bewirkt in vorteilhafterweise, dass das Signal-zu-Rauschverhältnis bei ramanspektroskopischen Messungen verbessert wird, insbesondere dadurch, dass der Anregungslaser aufgrund der Reflexion die oder den Partikel zweimal anregt, und zwar beim Weg vom einem Objektiv zur Probe und auf dem Weg nach der Reflexion an der reflektierenden Oberfläche. Zudem wird ein Hintergrundsignal des Bodens unterdrückt, wodurch das Probensignal besser erfassbar wird. Der Boden sollte, um eine ausreichend gerichtete Reflexion ausreichende Güte zu bewirken und auch um vorteilhaft für eine Dunkelfeldbeleuchtung verwendbar zu sein, eine in ausreichendem Maße glatte und ebene Oberfläche aufweisen. Zur Charakterisierung der Glattheit bzw. Rauheit kann auch die sogenannte RZ-Zahl der Oberfläche herangezogen werden. Die RZ-Zahl charakterisiert die insbesondere gemittelte Rauheit einer Fläche. Die Ermittlung der RZ-Zahl ist dem Fachmann geläufig. Die RZ-Zahl sollte insbesondere kleiner als 0,1 , bevorzugt kleiner als 0,01 sein. Die Erhöhung des Ramansignals ist also Spectrum on - especially in the ultra-violet, visible and in the near infrared spectral range. The surface is designed so that incident light rays are reflected in a directionally independent and largely independent of the angle of incidence, ie the reflection is in particular not limited only to critical angles for total reflection. The reflective surface advantageously effects that the signal-to-noise ratio is improved in Raman spectroscopic measurements, in particular in that the excitation laser excites the particle or particles twice as a result of the reflection on the way from a lens to the sample and on the way to the reflection on the reflective surface. In addition, a background signal of the ground is suppressed, whereby the sample signal is better detectable. The floor should have a sufficiently smooth and level surface to effect sufficient directional reflection of sufficient quality, and also to be useful for dark field illumination. To characterize the smoothness or roughness can also the so-called RZ number of the surface can be used. The RZ number characterizes the particular averaged roughness of a surface. The determination of the RZ number is familiar to the person skilled in the art. The RZ number should in particular be less than 0.1, preferably less than 0.01. The increase of the Raman signal is so

insbesondere nicht die Folge eines Proben-Oberflächeneffekts wie er beispielsweise in der„surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) verwendet wird. in particular, not the result of a sample surface effect as used in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS), for example.

Insbesondere erstreckt sich der Boden entlang einer Ebene. In particular, the floor extends along a plane.

Die Erfindung ermöglicht in vorteilhafter Weise den Einsatz von Mikroskopen bzw. von Objektiven mit vergleichsweise kleinen Arbeitsabständen, insbesondere bis hinunter zu 1 mm, und dadurch entsprechend großer numerischer Aperturen, was besonders hinsichtlich eines verbesserten Signal-zu-Rauschverhältnisses bei Ramanmessungen vorteilhaft ist. The invention advantageously makes it possible to use microscopes or objectives with comparatively small working distances, in particular down to 1 mm, and thus correspondingly large numerical apertures, which is particularly advantageous with regard to an improved signal-to-noise ratio in Raman measurements.

Lösungen mit einer gekrümmten, beispielsweise mit einer kugel- oder Solutions with a curved, for example with a ball or

zylinderförmigen Bodengeometrie oder Messkammergeometrie, sind der cylindrical bottom geometry or measuring chamber geometry are the

erfindungsgemäßen Lösung unterlegen, da sich eine gekrümmte Underlay solution according to the invention, as a curved

Messkammergeometrie nicht für den Einsatz von Objektiven mit kurzen  Measuring chamber geometry not for the use of lenses with short

Arbeitsabständen eignet, sondern größere Arbeitsabstände, insbesondere mehr als 5 mm, und entsprechend niedrigeren numerischen Aperturen erfordert, um den vergrößerten Abstand der Messkammerdecke zum Boden zu kompensieren. Die numerische Apertur einer solchen gekrümmten Messkammergeometrie ist damit insbesondere im Vergleich zu der erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle mit einem ebenen Boden und einem insbesondere ebenen Messfenster - bei gleichem Working distances, but larger working distances, in particular more than 5 mm, and correspondingly lower numerical apertures required to compensate for the increased distance of the measuring chamber ceiling to the ground. The numerical aperture of such a curved measuring chamber geometry is thus in particular in comparison to the liquid cell according to the invention with a flat bottom and a particularly flat measuring window - with the same

Linsendurchmesser - mehr als gedrittelt, was zu einer mehr als 9-mal niedrigeren Sammeleffizienz für das Ramansignal führt. Weiterhin bergen gekrümmte Messkammergeometrien die Gefahr einer optischen Refokussierung insbesondere des Anregungslichtes, was zu Fehlsignalen führen kann. Lens diameter - more than in thirds, resulting in more than 9 times lower collection efficiency for the Raman signal. Furthermore, curved measuring chamber geometries entail the risk of optical refocusing, in particular of the excitation light, which can lead to false signals.

Gemäß der Erfindung ist der Boden der Flüssigkeitszelle im Bereich der Auflage der Dichtung plan oder auch planar ausgeführt, weist also insbesondere keine According to the invention, the bottom of the liquid cell in the region of the support of the seal is flat or even planar, that is, it has no particular

Ausnehmung auf. Der so geformte Boden ist im Bereich der Dichtungsauflage insbesondere eben und form schlüssig mit den Bereichen des Bodens geformt, auf denen die Probe aufgebracht wird oder die von der Messkammer umfasst werden. Mit einem so ausgestalteten Boden können auch sehr niedrige Dichtungen verwendet werden. Hier hat sich insbesondere gezeigt, dass beispielsweise Recess on. In the region of the sealing support, the thus formed bottom is in particular flat and form-fitting with the regions of the bottom on which the sample is applied or which are encompassed by the measuring chamber. With a floor designed in this way, even very low seals can be used. This has been shown in particular that, for example

Dichtungen aus Teflon (i.e. Polytetrafluorethylen, PTFE), insbesondere in Form von Teflonfolie oder anderen dichtenden, dünnen Materialien, wie beispielsweise Teflon (i.e., polytetrafluoroethylene, PTFE) seals, especially in the form of Teflon film or other sealing, thin materials, such as

Polyethylen, Polyvinylchlorid, Polycarbonat vorteilhaft zum Einsatz kommen können. Die Dicke solcher Folien (und damit die Höhe der resultierenden Dichtung) liegt insbesondere im Bereich weniger Mikrometer, beispielsweise zwischen 50 μιτι und 500 [im. Polyethylene, polyvinyl chloride, polycarbonate can be used advantageously. The thickness of such films (and thus the height of the resulting seal) is in particular in the range of a few micrometers, for example between 50 μm and 500 μm.

Der Vorteil einer insbesondere ausnehmungslosen Flüssigkeitszelle ist insbesondere die vereinfachte Reinigung der Flüssigkeitszelle bzw. des Bodens, da The advantage of a particular recessless liquid cell is in particular the simplified cleaning of the liquid cell or the soil since

bekanntermaßen jede Ausnehmung Ablagerungsbereiche für Verunreinigung ausbildet, z.B. an den Kanten. As is known, each recess forms deposit areas for contamination, e.g. at the edges.

Die flachen Dichtungen können auch eine deutlich größere Auflagefläche als die dicken Dichtungen aufweisen, da sie nicht in eine Ausnehmung einfügbar sein müssen. Eine solche vergrößerte Auflagefläche erhöht die mechanische Stabilität der Dichtung, insbesondere im Falle geringer Dichtungsdicken und verbessert die Handhabbarkeit. The flat seals can also have a significantly larger contact surface than the thick seals, since they do not have to be insertable into a recess. Such an enlarged bearing surface increases the mechanical stability of the seal, especially in the case of low sealing thicknesses and improves the handling.

Diese flachen Dichtungen für die ausnehmungslosen bzw. planaren These flat seals for the recessless or planar

Flüssigkeitszellen erlauben weiterhin in vorteilhafter Weise, von einer flach- zylindrischen Konfiguration des Messvolumens abzuweichen und zum Beispiel flach- quaderförmige Volumina zu verwenden. Letztere erlauben im Falle der Verwendung der Flüssigkeitszelle als Durchflusszelle ein günstigeres Strömungsprofil als Liquid cells furthermore advantageously allow a deviation from a flat-cylindrical configuration of the measuring volume and, for example, to use flat cuboidal volumes. The latter allow a more favorable flow profile when using the liquid cell as a flow cell

Aufbauten, bei denen der Strömungsquerschnitt zum Beispiel in der Mitte zwischen Einlass und Auslass breiter wird, wie es im Falle eines flach-zylindrischen Volumens der Fall wäre. Constructions in which the flow cross-section, for example, in the middle between inlet and outlet becomes wider, as would be the case in the case of a flat-cylindrical volume.

Daher ist gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung vorgesehen, dass die Flüssigkeitszelle eine quaderförmige Messkammer aufweist. It is therefore provided according to a further embodiment of the invention that the liquid cell has a cuboid measuring chamber.

Die erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle kann vorteilhaft in Mikroskopen zum Einsatz kommen, die über eine Epi-, oder Auflichtgeometrie bezüglich des Strahlengangs verfügen, bei denen sowohl die Beleuchtung als auch das Messsignal der Probe über die gleiche Linse oder das gleiche Objektiv erfolgt (Epi-Konfiguration). Diese Geometrie erweist sich oftmals als vorteilhaft, da so beispielsweise eine Zulauföffnung und auch eine Ablauföffnung im Boden angeordnet sein kann, der Boden der Flüssigkeitszelle also für Aufgaben, wie beispielsweise der Temperierung oder Durchflusserzeugung zur Verfügung steht, ohne mit der Optik des Mikroskops zu interferieren. Die erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle ist vorteilhaft in kombinierten The liquid cell according to the invention can advantageously be used in microscopes which have an epi or incident light geometry with respect to the beam path in which both the illumination and the measurement signal of the sample take place via the same lens or the same objective (epi configuration). This geometry often proves to be advantageous, as for example a Inlet opening and a drain opening can be arranged in the ground, the bottom of the liquid cell so for tasks such as the temperature or flow generation is available without interfering with the optics of the microscope. The liquid cell according to the invention is advantageously combined

Messapparaten einsetzbar, die in Auflichtgeometrie sowohl Bilderfassung als auch bildgestützte Raman-Spektroskopie durchführen. Eine solche erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle ist aus den Komponenten einfach aufbaubar und kann besonders wirtschaftlich hergestellt werden. Jede Komponente der Flüssigkeitszelle ist insbesondere modular austauschbar.  Measuring devices can be used, which perform in incident light both image acquisition and image-enhanced Raman spectroscopy. Such a liquid cell according to the invention can be constructed simply from the components and can be produced particularly economically. Each component of the liquid cell is in particular modular exchangeable.

Gemäß einer Ausführungsform weist der Boden eine Zulauföffnung und eine Ablauföffnung, zum Befüllen, Entleeren, Vakuumieren und/oder Erzeugen eines Durchflusses in der Messkammer, auf, wobei die Zulauf- und/oder die Ablauföffnung insbesondere in einem Bereich des Bodens angeordnet ist / sind, der Teil der Messkammer ist. Diese Öffnungen können weitere Anschlüsse umfassen oder solche Anschlüsse aufweisen. According to one embodiment, the base has an inlet opening and a drain opening, for filling, emptying, vacuuming and / or generating a flow in the measuring chamber, wherein the inlet and / or outlet opening is / are arranged in particular in a region of the floor, which is part of the measuring chamber. These openings may include other connections or have such connections.

Die Zulauf- und Ablauföffnung sind insbesondere zum vergleichsweise schnellen Durchpumpen und/oder Durchdrücken einer größeren Flüssigkeitsmenge ausgebildet. Wobei die Öffnungen für Flüssigkeitsmengen von insbesondere 20 μΙ bis 10ΟμΙ pro Minute ausgelegt sind. The inlet and outlet openings are designed in particular for comparatively fast pumping through and / or pushing through a larger amount of liquid. Wherein the openings are designed for liquid quantities of in particular 20 μΙ to 10ΟμΙ per minute.

Vorteilhaft ist es, wenn die Zulauf und/oder Ablauföffnung so ausgeführt sind, dass Kanülenspitzen mit den Öffnungen verbindbar, anbringbar oder flüssigkeitsschlüssig aufsetzbar sind. Die Öffnungen haben insbesondere einen Durchmesser von einem Millimeter. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung weist die reflektierende Oberfläche des Bodens ein Metall oder eine Metalllegierung auf, wobei insbesondere der Boden aus dem Metall oder der Metalllegierung besteht, die Oberfläche und der Boden also einstückig ausgebildet sind. It is advantageous if the inlet and / or outlet opening are designed so that cannula tips can be connected to the openings connectable, attachable or liquid-fit can be placed. The openings have in particular a diameter of one millimeter. According to one embodiment of the invention, the reflective surface of the bottom comprises a metal or a metal alloy, wherein in particular the bottom of the metal or the metal alloy, the surface and the bottom are thus formed in one piece.

So eignet sich beispielsweise ein Boden aus Edelstahl, der auf der reflektierenden Seite spiegelnd poliert ist. Ein solcher Boden ist in vorteilhafter Weise inert gegenüber den meisten Lösungen, kann leicht gereinigt werden und weist eine besondere Langlebigkeit auf. Auf dem reflektierenden Boden kann gegebenenfalls eine Schicht aufgebracht sein, die beispielsweise eine Anlagerung von Suspensionsbestandteilen verhindert oder die reflektierende Oberfläche vor Einflüssen des Lösungsmittels bzw. der For example, a base made of stainless steel is mirror-polished on the reflective side. Such a soil is advantageously inert to most solutions, can be easily cleaned and has a particular longevity. Optionally, a layer may be applied to the reflective base, which, for example, prevents an attachment of suspension constituents or prevents the reflective surface from being influenced by the solvent or the solvent

Suspension schützt. Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung ist die reflektierende Oberfläche eine auf dem Boden angeordnete, beispielsweise galvanisch Suspension protects. According to an alternative embodiment of the invention, the reflective surface is arranged on the floor, for example galvanically

aufgebrachte, aufgedampfte oder aufgeklebte, reflektierende Schicht, wie applied, vapor-deposited or glued, reflective layer, such as

beispielsweise Gold, Silber und/oder Nickel. for example, gold, silver and / or nickel.

Der Boden kann insbesondere Glas, Quarzglas oder eine glasartiges Substrat aufweisen oder aus Glas, Quarzglas oder dem glasartigen Substrat bestehen, das als Substrat für die reflektierende Schicht dient. The bottom may in particular comprise glass, quartz glass or a vitreous substrate or consist of glass, quartz glass or the vitreous substrate which serves as a substrate for the reflective layer.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die reflektierende Oberfläche semitransparent und insbesondere auf einem transparenten Substrat angeordnet. Das Substrat bildet insbesondere den Boden aus. Das Substrat weist insbesondere Glas, Quarzglas oder galsartige Substanzen auf oder besteht aus Glas, Quarzglas oder glasartigen Substanzen. Der Vorteil von Glas, Quarzglas und glasartigen Substanzen ist der, dass diese Materialen die Eigenschaft besitzen molekular ebene, d.h. sehr flache, Oberflächen auszubilden können, ohne dass aufwendige Veredelungsschritte notwendig wären. Die Semitransparenz der reflektierende Oberfläche bezieht sich darauf, dass bei einer gegebenen Wellenlänge des Lichtes, die Oberfläche einen Bruchteil des auftreffenden Lichtes reflektiert und für einen anderen Bruchteil des Lichtes transparent ist, d.h. der Reflexionsgrad insbesondere kleiner als 95% ist und der Transmissionsgrad insbesondere größer als 5% ist. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist der Boden, insbesondere, wenn der Boden ein Glassubstrat oder Ähnliches aufweist, auf einem Unterteil angeordnet oder gelagert, wobei das Unterteil insbesondere eine Öffnung oder Ausnehmung insbesondere in der Mitte aufweist, so dass der Boden durch die Öffnung oder Ausnehmung optisch und/oder mechanisch, insbesondere für ein Mikroskopobjektiv zugänglich ist. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die semitransparente Oberfläche eine auf dem transparenten Substrat angeordnete, semitransparente Schicht. According to one embodiment of the invention, the reflective surface is semitransparent and in particular arranged on a transparent substrate. The substrate in particular forms the ground. The substrate comprises in particular glass, quartz glass or galsartige substances or consists of glass, quartz glass or glassy substances. The advantage of glass, quartz glass and vitreous substances is that these materials have the property of being able to form molecularly flat, ie very flat, surfaces without the need for expensive refining steps. The semitransparency of the reflective surface refers to the fact that at a given wavelength of light, the surface reflects a fraction of the incident light and is transparent to another fraction of the light, ie the reflectance is in particular less than 95% and the transmittance in particular greater than 5% is. According to one embodiment of the invention, the bottom, in particular, when the bottom has a glass substrate or the like, arranged or mounted on a lower part, wherein the lower part in particular an opening or recess, in particular in the middle, so that the bottom through the opening or recess optically and / or mechanically, in particular for a microscope objective is accessible. According to one embodiment of the invention, the semitransparent surface is a semitransparent layer arranged on the transparent substrate.

Eine solche Schicht kann beispielweise ein Metall oder eine Metalllegierung aufweisen, wobei die Schicht insbesondere eine Dicke von 10 nm bis 200 nm, insbesondere eine Dicke zwischen 50 nm bis 150 nm, aufweist. Such a layer may, for example, comprise a metal or a metal alloy, the layer in particular having a thickness of 10 nm to 200 nm, in particular a thickness of between 50 nm and 150 nm.

Die semitransparente Schicht ist insbesondere eine Gold-, Silber- oder Nickelschicht, die insbesondere auf einem Substrat aus Glas oder Quarzglas aufgebracht, aufgedampft oder aufgeklebt ist. The semitransparent layer is in particular a gold, silver or nickel layer which is applied, vapor-deposited or glued on in particular on a substrate made of glass or quartz glass.

Eine solche semitransparente Schicht erlaubt es, sowohl insbesondere Such a semitransparent layer allows, in particular

durchlichtbasierte Mikroskopieverfahren als auch Ramanspektroskopie auf der gleichen Probe auszuführen, ohne dass eine andere Flüssigkeitszelle verwendet werden muss. perform light-based microscopy as well as Raman spectroscopy on the same sample without the need to use another fluid cell.

Insbesondere kann das Material der semitransparenten Schicht so gewählt werden, dass die Schicht in einem ersten Wellenlängenbereich semitransparent ist und in einem zweiten Wellenlängenbereich des Lichtes überwiegend oder vollständig reflektierend ist, insbesondere einen Reflexionsgrad von mehr als 60% aufweist. In particular, the material of the semitransparent layer can be selected such that the layer is semitransparent in a first wavelength range and is predominantly or completely reflective in a second wavelength range of the light, in particular has a reflectance of more than 60%.

Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn die semitransparente Schicht im Bereich der ramanspektroskopischen Anregung, insbesondere im zweiten Wellenlängenbereich überwiegend reflektierend ist, insbesondere einen Reflexionsgrad von mehr als 60% aufweist und im Wellenlängenbereich eines verwendeten Durchlichtmikroskopie-In particular, it is advantageous if the semitransparent layer is predominantly reflective in the region of the Raman spectroscopic excitation, in particular in the second wavelength range, in particular has a reflectance of more than 60% and in the wavelength range of a transmitted light microscopy used.

Verfahrens, insbesondere im ersten Wellenlängenbereich, einen Transmissionsgrad von mindestens 30% aufweist. Method, in particular in the first wavelength range, a transmittance of at least 30%.

So ermöglicht die erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle ramanspektroskopische Messungen in Epi-Konfiguration und auch Durchlichtmikroskopie, was vorteilhafte Kontrastmechanismen zur optischen Abgrenzung des Partikels vom Hintergrund) eröffnet. Thus, the liquid cell according to the invention allows ramanspektroskopische measurements in epi configuration and also transmitted light microscopy, which opens up advantageous contrast mechanisms for the optical delimitation of the particle from the background).

Bei den schichtbasierten Ausführungsformen ist es beispielsweise auch vorgesehen, dass mehrere Schichten auf den Boden aufgebracht werden, dass beispielsweise eine Goldschicht auf eine Nickelschicht aufgedampft wird. Als oberste Schicht eine solchen Vielzahl an Schichten kann beispielsweise eine funktionelle Molekülschicht angeordnet sein. Weiterhin kann die Vielzahl an Schichten auch dazu verwendet werden, optische Filterschichten, wie beispielsweise Bragg- eflektoren, zu realisieren. In the case of the layer-based embodiments, it is also provided, for example, that a plurality of layers are applied to the floor such that, for example, a gold layer is vapor-deposited onto a nickel layer. As the uppermost layer such a plurality of layers, for example, a functional molecular layer may be arranged. Furthermore, the plurality of layers can also be used to realize optical filter layers, such as Bragg eflektoren.

Dies schließt auch eine Schicht ein, die wie oben bereits erläutert, beispielsweise eine Anlagerung von Suspensionsbestandteilen verhindert oder die reflektierende Schicht ggf. vor schädlichen Einflüssen der Suspension schützt. This also includes a layer which, as already explained above, for example prevents an accumulation of suspension constituents or optionally protects the reflective layer from harmful influences of the suspension.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die reflektierende Oberfläche im sichtbaren Spektralbereich, insbesondere im Wellenlängenbereich von 300 nm bis 800 nm, insbesondere im Bereich von 210 nm bis 1200 nm durchgehend According to one embodiment of the invention, the reflective surface in the visible spectral range, in particular in the wavelength range of 300 nm to 800 nm, in particular in the range of 210 nm to 1200 nm continuously

reflektierend, insbesondere mit einem Reflexionsgrad von mehr als 70%. Diese Variante der Erfindung gewährleistet in vorteilhafter Weise, dass eine erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle in vielen Anwendungen unabhängig von den Anregungs- und Detektionswellenlängen einsetzbar ist. reflective, in particular with a reflectance of more than 70%. This variant of the invention advantageously ensures that a liquid cell according to the invention can be used in many applications independently of the excitation and detection wavelengths.

Weiterhin lässt sich in vorteilhafterweise eine Dunkelfeldbeleuchtung mit einer solchen reflektierenden Oberfläche realisieren. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, weist die Flüssigkeitszelle ein Andruckelement auf, das so ausgebildet ist, dass die Flüssigkeitszelle im Furthermore, it is advantageously possible to realize dark-field illumination with such a reflective surface. According to a further embodiment of the invention, the liquid cell to a pressure element, which is formed so that the liquid cell in

zusammengesetzten Zustand der Erfindung in eine Schiebeführung eingeführt werden kann, wobei das Andruckelement, wenn die Flüssigkeitszelle in die assembled state of the invention can be inserted into a sliding guide, wherein the pressure element when the liquid cell in the

Schiebeführung eingeführt ist, von der Schiebeführung niedergehalten wird, so dass das Andruckelement auf das Messfenster, die Dichtung und den Boden drückt, so dass die Messkammer abgedichtet wird, wobei das Andruckelement mit einem ersten Bereich auf oder oberhalb des Messfensters angeordnet ist und insbesondere mit einem zweiten Bereich auf oder oberhalb des Bodens angeordnet ist. Sliding guide is held down by the sliding guide, so that the pressure element presses on the measuring window, the seal and the bottom, so that the measuring chamber is sealed, wherein the pressure element is arranged with a first region on or above the measuring window, and in particular with a second area is arranged on or above the floor.

Eine solche Flüssigkeitszelle wird im eingeschobenen Zustand flüssigkeits- und/oder gasdicht sein. Such a liquid cell will be liquid and / or gas tight in the inserted state.

Die Schiebeführung wirkt also insbesondere so mit dem Andruckelement und dem Boden zusammen, dass die Flüssigkeitszelle zusammengehalten wird. The sliding guide thus interacts in particular with the pressure element and the floor so that the fluid cell is held together.

Das Andruckelement verwirklicht in vorteilhafter Weise, dass die Flüssigkeitszelle schnell und unkompliziert zusammengebaut werden kann. Durch einfaches sandwichartiges Zusammenfügen der Komponenten und anschließendes Einschieben in eine Schiebeführung kann eine funktionstüchtige Flüssigkeitszelle erhalten werden. The pressure element realized in an advantageous manner that the liquid cell can be assembled quickly and easily. By simply sandwiching the components and then Insertion in a sliding guide, a functional liquid cell can be obtained.

Das Andruckelement ist insbesondere als Haltering ausführbar, so dass darüber hinaus auch im zusammengebauten Zustand der Flüssigkeitszelle eine Messung unter einem Mikroskop möglich ist, da in einem zentralen Bereich des Messfensters die Anregung und Detektion stattfinden kann, die ringförmige Ausgestaltung des Andruckelementes als Haltering also nicht mit der Optik eines Auflicht-Mikroskops interferiert. The pressure element is in particular executable as a retaining ring, so that beyond even in the assembled state of the liquid cell, a measurement under a microscope is possible, since in a central region of the measuring window, the excitation and detection can take place, the annular configuration of the pressure element as a retaining ring so not with the optics of a reflected-light microscope interferes.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist die Flüssigkeitszelle ein Abstandelement auf, wobei das Abstandelement auf dem Boden der According to a further embodiment of the invention, the liquid cell has a spacer element, wherein the spacer element on the bottom of the

Flüssigkeitszelle insbesondere außerhalb der Messkammer auf dem Boden der Flüssigkeitszelle angeordnet ist, wobei das Andruckelement mit dem zweiten Bereich auf dem Abstandselement aufliegt, so dass das Messfenster durch das  Liquid cell is arranged in particular outside the measuring chamber on the bottom of the liquid cell, wherein the pressure element rests with the second region on the spacer element, so that the measuring window through the

Andruckelement nur bis auf einen vordefinierten Abstand an den Boden angedrückt werden kann, wobei die Höhe das Abstandselements besagten Abstand des Messfensters vom Boden definiert. Pressure element can be pressed against the ground only up to a predefined distance, wherein the height of the spacer element said distance of the measuring window defined by the ground.

Durch das Abstandselement sind insbesondere die Höhe und das Volumen der Messkammer, insbesondere der Abstand des Messfensters zum Boden der By the spacer element in particular the height and the volume of the measuring chamber, in particular the distance of the measuring window to the bottom of the

Messkammer, insbesondere durch die Höhe des Abstandselements einstellbar. Durch das Abstandelement, das beispielsweise eine Unterlegscheibe oder einMeasuring chamber, in particular adjustable by the height of the spacer element. By the spacer element, for example, a washer or a

Unterlegring sein kann, wird das modulare Prinzip der Flüssigkeitszelle vorteilhaft umgesetzt. Das Abstandselement ist insbesondere nicht fest mit dem Boden verbunden. Dadurch können Abstandelemente verschiedener Höhe verwendet werden, um unterschiedlich hohe Messkammern zu realisieren. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, weist die Flüssigkeitszelle ein Einlageelement auf, wobei das Einlageelement in der Ausnehmung zwischen Boden und Dichtung angeordnet ist, so dass die Dichtung um die Höhe des Can be Unterlegring, the modular principle of the liquid cell is advantageously implemented. The spacer is in particular not firmly connected to the ground. As a result, spacers of different height can be used to realize different levels of measurement chambers. According to a further embodiment of the invention, the liquid cell has an insert element, wherein the insert element is arranged in the recess between bottom and seal, so that the seal around the height of the

Einlageelements in der Ausnehmung nach oben verlagert angeordnet ist, insbesondere so dass das Messfenster bei einem durch das Abstandelement vordefinierten Abstand des Messfensters vom Boden bereits so auf der Dichtung aufliegt, dass die Messkammer dicht ist, wobei das Einlageelement insbesondere so dimensioniert ist, dass die Höhe des Einlageelements der Höhe des Abstandelements entspricht, oder um einen festen Betrag in der Höhe des Inserting element is arranged displaced upward in the recess, in particular so that the measuring window already rests on the seal at a predefined by the spacer element distance of the measuring window from the bottom, that the measuring chamber is sealed, wherein the insert element is particularly dimensioned such that the height of the insert element the height of Distance element corresponds to, or by a fixed amount in height of the

Abstandselements abweicht. Distance element deviates.

Das Einlageelement, sorgt insbesondere dafür, dass eine Dichtigkeit auch für verschieden hohe Abstandselemente erreicht wird. Das Einlageelement kann beispielsweise eine Einlegscheibe sein. Das The insert element, in particular ensures that a tightness is achieved even for different height spacers. The insert element may for example be an insert. The

Einlageelement ist insbesondere nicht fest mit dem Boden verbunden und trägt zum modularen Charakter der Erfindung bei.  In particular insert element is not firmly connected to the ground and contributes to the modular nature of the invention.

Insbesondere ist ein System vorstellbar, dass neben der Flüssigkeitszelle auch eine Vielzahl an unterschiedlichen Einlageelementen und Abstandelementen umfasst, die je nach Bedarf verwendet werden. Dadurch lässt sich eine Vielzahl an In particular, a system is conceivable that in addition to the liquid cell also includes a plurality of different insert elements and spacers, which are used as needed. This can be a variety of

Flüssigkeitszellen realisieren, die in der Höhe und im Volumen der Messkammer variieren.  Liquid cells realize that vary in the height and volume of the measuring chamber.

Insbesondere ist durch die Verwendung unterschiedlicher Abstandselemente und Einlageelemente gewährleistet, dass zum einen die Flüssigkeitsschichtdicke in der Messkammer individuell auf die jeweilige Probe eingestellt werden kann und zum anderen auch das Volumen der Messkammer ausreichend groß oder klein gestaltet werden kann. In particular, it is ensured by the use of different spacer elements and insert elements that on the one hand, the liquid layer thickness can be set individually in the measuring chamber to the respective sample and on the other hand, the volume of the measuring chamber can be made sufficiently large or small.

Das Einlageelement und das Abstandelement sind aufeinander abgestimmt, und zwar insbesondere so, dass ein Bruch durch Druck an den Außenkanten des Messfensters verhindert wird, und dennoch ein dichter Druckverschluss derThe insert element and the spacer element are matched to each other, in particular so that a break is prevented by pressure at the outer edges of the measuring window, and yet a tight pressure closure of

Messkammer gewährleistet ist. Wie hoch die beiden Elemente im Einzelnen sein müssen ist dem Fachmann bekannt und kann unter anderem von der Tiefe der Ausnehmung, der Höhe der Dichtung und der Dicke des Messfensters abhängen. Measuring chamber is guaranteed. How high the two elements must be in detail is known to the person skilled in the art and may depend inter alia on the depth of the recess, the height of the seal and the thickness of the measuring window.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist das Messfenster für Licht zumindest im Spektralbereich von 210 nm bis 1200 nm, bevorzugt im According to a further embodiment of the invention, the measuring window for light, at least in the spectral range of 210 nm to 1200 nm, preferably in

Spektralbereich 532 nm bis 785 nm, eine Transmission von größer als 80% auf, wobei das Messfenster insbesondere Quarzglas aufweist.  Spectral range 532 nm to 785 nm, a transmission of greater than 80%, the measuring window in particular having quartz glass.

Mit einem solchen Messfenster ist es möglich, beispielsweise die Tryptophan- Fluoreszenz anzuregen und zu detektieren. Das erfindungsgemäße Problem wird weiterhin auch durch ein System das die folgenden Merkmale aufweist gelöst eine Haltevorrichtung zum Verschließen und Fixieren einer With such a measuring window, it is possible, for example, to stimulate and detect the tryptophan fluorescence. The problem of the invention is further solved by a system having the following features a holding device for closing and fixing a

Flüssigkeitszelle, - eine erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle, wobei die Haltevorrichtung eine Schiebeführung aufweist, welche in die  Liquid cell, - a liquid cell according to the invention, wherein the holding device has a sliding guide, which in the

Flüssigkeitszelle einschiebbar ist und wobei die Schiebeführung eine Andruckplatte aufweist, die dazu ausgebildet ist, das Messfenster auf die Dichtung zu drücken, wenn die Flüssigkeitszelle in der Haltevorrichtung aufgenommen ist. Das erfindungsgemäße Problem wird weiterhin durch ein Mikroskop mit den folgenden Merkmalen gelöst. Liquid cell is inserted and wherein the sliding guide has a pressure plate which is adapted to press the measuring window on the seal when the liquid cell is received in the holding device. The problem of the invention is further solved by a microscope having the following features.

Ein solches Mikroskop weist Mittel zu mikroskopischen Bilderfassung und ramanspektroskopischen Messungen einer Partikelsuspension auf, wobei das Mikroskop ein optisches Auflicht-Mikroskop ist und wobei das Mikroskop eine erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle und insbesondere eine Haltevorrichtung oder insbesondere ein erfindungsgemäßes System aufweist. Such a microscope has means for microscopic image acquisition and Raman spectroscopic measurements of a particle suspension, wherein the microscope is an optical epi-microscope and wherein the microscope has a liquid cell according to the invention and in particular a holding device or in particular a system according to the invention.

Mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop lassen sich in Auflichtgeometrie die vorgenannten Untersuchungen an Partikelsuspensionen durchführen, wobei in vorteilhafter Weise das Signal zu Rauschverhältnis insbesondere im Vergleich zu Flüssigkeitszellen mit einem nicht reflektierenden Substrat, durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle verbessert ist. With the microscope according to the invention, the abovementioned investigations on particle suspensions can be carried out in incident-light geometry, the signal-to-noise ratio, in particular in comparison to liquid cells with a non-reflecting substrate, advantageously being improved by the use of the liquid cell according to the invention.

Ein Mikroskop im Sinne der Erfindung ist ein Lichtmikroskop, das Optiken aufweist, die für den Einsatz insbesondere von 200 nm bis 1200 nm geeignet sind. A microscope according to the invention is a light microscope having optics that are suitable for use in particular from 200 nm to 1200 nm.

Ein Mittel zur mikroskopischen Bilderfassung umfasst beispielsweise ein Objektiv, einen Detektor wie beispielsweise eine Kamera, und/oder eine Lichtquelle, wie beispielsweise einen Laser, eine Halogenlampe oder andere Arten von Lichtquellen, wie Dioden oder Bogenlampen. A means for microscopic image acquisition includes, for example, a lens, a detector such as a camera, and / or a light source such as a laser, a halogen lamp, or other types of light sources such as diodes or arc lamps.

Ein Mittel für ramanspektroskopische Messungen umfasst beispielsweise einen Anregungslaser, einen Punktdetektor, sowie passende Filter für die Raman- Messung. In einer Ausführungsform der Erfindung weist das Mikroskop Mittel auf, die eine Dunkelfeldbeleuchtung der Probe in der Flüssigkeitszelle ermöglichen, wobei der reflektierende Boden der Flüssigkeitszelle als Reflektor für die eingestrahlte A means for Raman spectroscopic measurements includes, for example, an excitation laser, a point detector, as well as suitable filters for the Raman measurement. In one embodiment of the invention, the microscope has means enabling a dark field illumination of the sample in the liquid cell, wherein the reflective bottom of the liquid cell serves as a reflector for the irradiated

Dunkelfeldbeleuchtung dient. Ein solches Mittel zur Dunkelfeldbeleuchtung weist beispielsweise ein spezielles Dunkelfeld-Objektiv auf, mit dem eine solche Dunkelfeldbeleuchtung in Auflicht- Geometrie durchgeführt werden kann. Dark field illumination is used. Such a means for dark field illumination, for example, has a special darkfield lens, with which such a dark field illumination can be performed in incident light geometry.

Die Dunkelfeldbeleuchtung hat dabei den Vorteil, dass für gewisse Proben und Partikel Suspensionen ein höherer Bildkontrast erreicht werden kann. Insbesondere Proben, deren Brechungsindex sich nur wenig von dem Lösungsmittel unterscheidet, können mit Hilfe der Dunkelfeldbeleuchtung und der erfindungsgemäßen The dark field illumination has the advantage that for certain samples and particle suspensions a higher image contrast can be achieved. In particular, samples whose refractive index differs only slightly from the solvent, with the help of the dark field illumination and the inventive

Flüssigkeitszelle vorteilhaft detektiert und vermessen werden. Liquid cell advantageously detected and measured.

Dabei ist die Kombination von Dunkelfeldbeleuchtung mit dem reflektierenden Oberfläche des Bodens der Flüssigkeitszelle besonders vorteilhaft, da die The combination of dark field illumination with the reflective surface of the bottom of the liquid cell is particularly advantageous because the

reflektierende Oberfläche des Bodens die Dunkelfeldbeleuchtung reflektiert, so dass möglichst wenig Streulicht vom Boden in das Objektiv zurückgestreut wird, was zu einem erhöhten Bildkontrast und damit zu einer besseren Identifizierung von reflective surface of the ground reflects the dark field illumination, so that as little stray light from the ground is scattered back into the lens, resulting in an increased image contrast and thus a better identification of

Partikeln in einer Suspension führt. Particles in a suspension leads.

Die Oberflächengüte ist bei der Dunkelfeldbeleuchtung sehr wichtig, da bereits geringe Unebenheiten ein Signal bewirken, welches nicht unbedingt von dem zu unterscheiden ist, welches ein Partikel, der auf der Oberfläche liegt, erzeugt. The surface quality is very important in dark field lighting, since even small bumps cause a signal that is not necessarily different from that which generates a particle lying on the surface.

Um Strukturen / Partikel gut zu erfassen sollte die Oberflächenrauheit nicht in derselben Größenordnung sein, wie das Partikel selbst. Da erfindungsgemäß Partikel im Submikrometerbereich oder im Mikrometerbereich spektroskopiert werden sollen, ist die Oberflächenrauheit entsprechend geringer, also insbesondere im Nanometer oder Subnanometerbereich. In order to capture structures / particles well, the surface roughness should not be of the same order of magnitude as the particle itself. Since particles according to the invention are to be spectroscopically measured in the submicrometer range or in the micrometer range, the surface roughness is correspondingly lower, ie in particular in the nanometer or subnanometer range.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden nachfolgend anhand der Figurenbeschreibung von Ausführungsbeispielen erläutert. Die Figurenbeschreibung dient lediglich der Illustration einiger Ausführungsbeispiele und ist nicht als abschließende Offenbarung aller möglichen Ausführungsformen der Erfindung zu verstehen. Einzelne Merkmale die nur in Zusammenhang der Ausführungsbeispiele offenbart sind, können jedoch über die beispielhafte Offenbarung auch als Merkmale in den Ansprüchen verwendet werden, sofern sie nicht im Widerspruch zu anderen Merkmalen des Anspruchs stehen. Es zeigen: Further features and advantages of the invention will be explained below with reference to the description of the figures of exemplary embodiments. The description of the figures is merely illustrative of some embodiments and should not be taken as a final disclosure of all possible embodiments of the invention. However, individual features disclosed only in the context of the embodiments may also be included as features through the exemplary disclosure in the claims, unless they conflict with other features of the claim. Show it:

Fig. 1 eine schematische Abbildung eines Schnitts durch eine erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle; 1 shows a schematic illustration of a section through a liquid cell according to the invention;

Fig. 2 eine schematische Abbildung eines Schnitts durch eine Variante der Fig. 2 is a schematic illustration of a section through a variant of

erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle;  fluid cell according to the invention;

Fig. 3 verschiedene Darstellungen einer Haltevorrichtung mit einer Flüssigkeitszelle; 3 shows different representations of a holding device with a liquid cell;

Fig. 4 Diagramm zur Wirkung einer reflektierenden Oberfläche auf ein Ramansignal; 4 shows a diagram of the effect of a reflecting surface on a Raman signal;

Fig. 5 eine Ausführungsform der Flüssigkeitszelle ohne Einlageelement; 5 shows an embodiment of the liquid cell without insert element;

Fig. 6 Bildfolge, die das Zusammensetzen einer erfindungsgemäßen Fig. 6 image sequence, the assembly of an inventive

Flüssigkeitszelle darstellt;  Fluid cell represents;

Fig. 7 eine schematische Abbildung eines Schnitts durch eine Variante der Fig. 7 is a schematic illustration of a section through a variant of

erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle; und  fluid cell according to the invention; and

Fig. 8 verschiedene Ansichten einer erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle, die zur Durchlicht Mikroskopie geeignet ist. Fig. 8 different views of a liquid cell according to the invention, which is suitable for transmitted light microscopy.

In Fig. 1 und Fig. 2 ist ein Schnitt entlang der z-Achse z (Richtung der Höhe und Raman-Anregung) durch eine erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle 1 abgebildet. Die Flüssigkeitszelle 1 weist einen Boden 3 mit einer reflektierenden Oberfläche 4, 40 auf, wobei der Boden 3 eine Ausnehmung 8 umfasst, in die eine Dichtung 6, hier in Form eines O-Rings, eingesetzt ist. Zwischen Dichtung 6 und der Ausnehmung 8 ist ein Einlageelement 20, hier in Form einer Einlegescheibe, angeordnet. Die In FIG. 1 and FIG. 2, a section along the z-axis z (direction of the height and Raman excitation) is represented by a liquid cell 1 according to the invention. The liquid cell 1 has a bottom 3 with a reflecting surface 4, 40, wherein the bottom 3 comprises a recess 8 into which a seal 6, here in the form of an O-ring, is inserted. Between seal 6 and the recess 8, a insert element 20, here in the form of an insert disc, arranged. The

Ausnehmung 8 ist in diesem Beispiel in Form einer Nut ausgebildet. Auf der Dichtung 6 ist ein Messfenster 5 angeordnet. Der von der Dichtung 6, dem Messfenster 5 und dem Boden 3 eingeschlossene Raum bildet eine Messkammer 2. Recess 8 is formed in this example in the form of a groove. On the seal 6, a measuring window 5 is arranged. The enclosed by the seal 6, the measuring window 5 and the bottom 3 space forms a measuring chamber. 2

Ein Abstandselement 21 in Form einer Unterlegscheibe ist außerhalb der A spacer 21 in the form of a washer is outside the

Messkammer 2 angeordnet, wobei das Abstandselement 21 in der Höhe (also entlang der z-Achse) so bemessen ist, dass einerseits die Dichtungswirkung über das Anpressen des Messfensters 5 auf die Dichtung 6 gewährleistet ist und andererseits auch gewährleistet ist, dass der Druck, der durch ein Andruckelement 9 in Kombination mit einer Schiebeführung 201 ) auf das Messfenster 5 vermittelt werden kann, nicht zu einem Bruch des Messfensters 5 führt. Mit anderen Worten, wird die tiefste Position des Andruckelements 9 im Bezug auf die z-Achse durch das Abstandselement 21 definiert. Der Boden 3 der Messkammer 2 weist zudem eine Zulauf- und eine Ablauföffnung 71 , 72 auf. Durch diese Öffnungen 71 , 72 kann eine Probenflüssigkeit ausgetauscht werden oder die Messkammer 2 gereinigt werden, ohne die Flüssigkeitszelle 1 auseinanderzubauen. Measuring chamber 2 is arranged, wherein the spacer element 21 in height (ie along the z-axis) is dimensioned so that on the one hand the sealing effect on the pressing of the measuring window 5 is ensured on the seal 6 and on the other hand, it is ensured that the pressure by a pressure element 9 in combination with a sliding guide 201) can be imparted to the measuring window 5, does not lead to a breakage of the measuring window 5. In other words, the lowest position of the pressing member 9 with respect to the z-axis is defined by the spacer 21. The bottom 3 of the measuring chamber 2 also has an inlet and a drain opening 71, 72. Through these openings 71, 72, a sample liquid can be exchanged or the measuring chamber 2 can be cleaned without disassembling the liquid cell 1.

Die Flüssigkeitszelle 1 besteht aus nur wenigen Komponenten und ist modular aufgebaut (siehe Fig. 6), das heißt sie kann leicht gereinigt werden. Darüberhinaus können durch den modularen Aufbau die einzelnen Komponenten leicht ersetzt werden und für spezifische Anwendungen angepasst werden. Die Flüssigkeitszelle 1 ist so ausgelegt, dass die Schichtdicke der zu untersuchenden Probenlösung oder Suspension optimal für die Erkennung und bildgestützte Ramananalyse von Partikeln in Proteinformulierung ist. Weiterhin ist die Flüssigkeitszelle in den aufgeführten Beispielen kreisrund entlang der x-z Ebene ausgeführt. Andere Grundformen sind aber ohne weiteres denkbar und sollen hier nicht ausgeschlossen sein. The liquid cell 1 consists of only a few components and is modular (see Fig. 6), that is, it can be easily cleaned. Moreover, the modular design allows the individual components to be easily replaced and adapted for specific applications. The liquid cell 1 is designed so that the layer thickness of the sample solution or suspension to be examined is optimal for the recognition and image-based Raman analysis of particles in protein formulation. Furthermore, in the examples listed, the liquid cell is circular along the x-z plane. Other basic forms are conceivable without further ado and should not be excluded here.

Der Boden 3 der Flüssigkeitselle 1 ist aus Edelstahl gefertigt. Er ist somit rostfrei, haltbar und tritt nicht mit der Probe in Wechselwirkung (inert). Der Boden 3 aus Edelstahl ist besonders gut zu reinigen. In Fig. 1 ist die Edelstahloberfläche 4 des Bodens 3 geschliffen und/oder poliert. Damit wird eine hochgradig ebene und auf Nanometer-Ebene glatte, reflektierende Oberfläche 4 bereitgestellt. Die Rauheit kann hierbei anhand der sogenannten RZ- Zahl charakterisiert werden. Vorteilhaft ist eine RZ-Zahl von kleiner als 0,1 , bevorzugt kleiner als 0,01. In Fig. 2 ist eine Variante der Flüssigkeitszelle 1 abgebildet. Hier weist der Boden 3 auf Seite der Messkammer 2 eine reflektierende Schicht 40 als reflektierende Oberfläche 4 auf, die aus einem anderen Material als der Boden 3 gefertigt ist. Dies kann beispielsweise eine dünne Gold-, Silber- oder Nickelschicht sein, die auf einen Objektträger aufgedampft wurde. So kann je nach Anregungswellenlänge und zu messende Probe eine anderes reflektierendes Material verwendet werden. Zudem kann so eine kostengünstige Einwegvariante des Bodens 3 bereitgestellt werden. Auch hier ist die RZ-Zahl keiner als 0,1. Eine weitere Variante der Flüssigkeitszelle ist in Fig. 5 abgebildet, einmal als reiner Schnittansicht und auch als Halbschnitt. Die Bezugszeichen und Anordnung der Komponenten sind im Wesentlichen gleich zu den Varianten in Fig. 1 und Fig. 2. Im Unterschied zu Fig. 1 und Fig. 2 weist die Flüssigkeitszelle in Fig. 5 jedoch kein Einlageelement 20 auf. Bei dieser Variante ist das Abstandelement 21 , die Dicke der Dichtung 6 und die Nuttiefe (Ausnehmung 8) genau so gewählt, dass auf das Einlageelement 20 verzichtet werden kann. The bottom 3 of the Flüssigkeitselle 1 is made of stainless steel. It is thus stainless, durable and does not interact with the sample (inert). The bottom 3 made of stainless steel is particularly easy to clean. In Fig. 1, the stainless steel surface 4 of the bottom 3 is ground and / or polished. This provides a highly level and smooth surface 4 on the nanometer level. The roughness can be characterized by the so-called RZ number. An RZ number of less than 0.1, preferably less than 0.01, is advantageous. 2, a variant of the liquid cell 1 is shown. Here, the bottom 3 on the side of the measuring chamber 2 on a reflective layer 40 as a reflective surface 4, which is made of a different material than the bottom 3. This may be, for example, a thin layer of gold, silver or nickel vapor deposited on a slide. Thus, depending on the excitation wavelength and the sample to be measured, another reflective material may be used. In addition, such a cost-effective disposable variant of the bottom 3 can be provided. Again, the RZ number is none than 0.1. Another variant of the liquid cell is shown in Fig. 5, once as a pure sectional view and also as a half-section. The reference numerals and the arrangement of the components are essentially identical to the variants in FIGS. 1 and 2. In contrast to FIGS. 1 and 2, however, the liquid cell in FIG. 5 has no insert element 20. In this variant, the spacer element 21, the thickness of the seal 6 and the groove depth (recess 8) are chosen exactly so that the insert element 20 can be dispensed with.

In Fig. 7 ist ein Schnitt entlang der z-Achse z (Richtung der Höhe und Raman- Anregung) durch eine erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle 1 abgebildet. Die FIG. 7 shows a section along the z-axis z (direction of the height and Raman excitation) through a liquid cell 1 according to the invention. The

Flüssigkeitszelle 1 weist einen Boden 3 mit einer reflektierenden Oberfläche 40 auf, wobei der Boden 3 aus einem transparenten Substrat, nämlich Glas gefertigt ist und die reflektierende Oberfläche semitransparent ist, d.h. eine Metallschicht von nur 50 nm aufweist. Im Unterschied zu den Beispielen aus Fig. 1 und Fig. 2 weist der Boden keine Ausnehmung auf, in die die Dichtung 6 eingelegt ist, sondern ist im Bereich der Auflagefläche der Dichtung 6 plan. Die Dichtung 6 ist aus einer Teflon Folie gefertigt und nur 100 μιτι hoch, so dass keine Ausnehmung benötigt wird. Mit dieser Fluid cell 1 has a bottom 3 with a reflective surface 40, the bottom 3 being made of a transparent substrate, namely glass, and the reflective surface being semitransparent, i. has a metal layer of only 50 nm. In contrast to the examples of FIG. 1 and FIG. 2, the bottom has no recess into which the seal 6 is inserted, but is planar in the area of the bearing surface of the seal 6. The seal 6 is made of a Teflon film and only 100 μιτι high, so that no recess is needed. With this

Flüssigkeitszelle kann aufgrund des transparenten Bodens 3 und der Liquid cell can due to the transparent bottom 3 and the

semitransparenten Metallschicht sowohl Ramanspektroskopie in Epi-Konfiguration als auch Durchlichtmikroskopie durchgeführt werden, ohne dass die Vorteile der reflektierenden Flüssigkeitszelle für die Ramanspektroskopie merklich beinträchtig würden. Semi-transparent metal layer both Raman spectroscopy in epi configuration and transmitted light microscopy can be performed without the benefits of the reflective liquid cell for Raman spectroscopy would significantly affect.

In Fig. 8 ist eine weitere Ausführungsform der Erfindung in verschiedenen Ansichten dargestellt. Im Einzelnen ist in A) eine Schnittansicht durch die Flüssigkeitszelle 1 , in B) eine vergrößerte Detailansicht der Schnittansicht A), in C) eine perspektivische Schnittansicht von unterhalb der Flüssigkeitszelle 1 und in D) eine perpektivische Schnittansicht der Flüssigkeitszelle 1 von schräg oben dargestellt. In Fig. 8, another embodiment of the invention is shown in different views. Specifically, A) is a sectional view through the liquid cell 1, B) an enlarged detail view of the sectional view A), C) a perspective sectional view from below the liquid cell 1, and D) a perspective sectional view of the liquid cell 1 obliquely from above.

Diese Ausführungsform weist einen Boden 3 auf, der eine 50 nm dicke und daher semitransparente Goldschicht auf einem Glassubstrat umfasst. Der Boden ist auf einem Unterteil 30 angeordnet, wobei das Unterteil aus einem Metall gefertigt ist und in der Mitte eine Ausnehmung 31 aufweist, so dass der der Boden auch von unten insbesondere für ein Mikroskop-Objektiv optisch sowie mechanisch zugänglich ist. Diese Ausführungsform ist daher besonders geeignet, um die Flüssigkeitszelle 1 auch im Durchlicht zu mikroskopieren. Das Messfenster 5 wird wie in den anderen dargestellten Ausführungsformen durch ein Andruckelement 9 mit dem Unterteil und dem Boden verbunden, insbeosndere wenn die Flüssigkeitszelle eine dafür vorgesehene Halterung eingeführt wird, die das Andruckelement und den Boden aneinander drückt. Zwischen Messfenster 5 und Boden ist am Rand eine dünne Teflonfolie angeordnet, die als Dichtung 6 der Flüssigkeitszelle 1 dient. This embodiment has a bottom 3 comprising a 50 nm thick and therefore semitransparent gold layer on a glass substrate. The bottom is arranged on a lower part 30, wherein the lower part is made of a metal and in the middle has a recess 31, so that the bottom is optically and mechanically accessible from below, in particular for a microscope objective. This embodiment is therefore particularly suitable for microscoping the liquid cell 1 also in transmitted light. The measuring window 5 is connected, as in the other embodiments shown, by a pressure element 9 to the lower part and the bottom, in particular when the liquid cell is provided with a holder provided for this purpose, which presses the pressure element and the base against one another. Between the measuring window 5 and bottom a thin Teflon film is arranged at the edge, which serves as a seal 6 of the liquid cell 1.

Weiterhin können an der Flüssigkeitszelle auch ein Zu- und Ablauföffnungen angeordnet sein (nicht dargestellt), die beispielsweise als Öffnungen im Boden realisiert sein können. Die folgenden Ausführungen gelten, sofern in der jeweiligen Ausführungsform realisierbar, entsprechend für alle Ausführungsbeispiele der Flüssigkeitszelle 1 . Furthermore, an inlet and outlet openings (not shown) can be arranged on the liquid cell, which can be realized for example as openings in the ground. The following statements apply, provided that they can be implemented in the respective embodiment, correspondingly for all embodiments of the liquid cell 1.

Durch den Spiegeleffekt der reflektierenden Oberfläche 4, 40 wird das Due to the mirror effect of the reflective surface 4, 40 is the

Anregungslicht, beispielswiese der Licht des Anregungslasers, zweimal durch die Probe geleitet, und führt so zu einem idealerweise doppelt so hohen Ramansignal. Weiterhin verursacht die reflektierende Oberfläche und im Gegensatz zu vielen anderen Materialien wie Glas kein Untergrundsignal (Fig. 1 und 2). Excitation light, for example, the light of the excitation laser, passed twice through the sample, and thus leads to an ideally twice as high Raman signal. Furthermore, the reflective surface, unlike many other materials such as glass, does not cause a background signal (Figures 1 and 2).

Die Bildgebung erfolgt durch ein zumindest im sichtbaren Bereich des Spektrums transparentes Messfenster 5, wobei sich der transparente Bereich bis in den nahen Infrarot-Bereich (bis ca. 1000 nm) und ultra-violetten Bereich (bis ca. 210 nm) erstrecken kann. Ein Set von verschiedenen Messfenstern 5 kann in die Imaging takes place by means of a measuring window 5 which is transparent at least in the visible region of the spectrum, it being possible for the transparent region to extend into the near infrared region (up to about 1000 nm) and the ultraviolet region (up to about 210 nm). A set of different measuring windows 5 can be found in the

Flüssigkeitszelle 1 eingesetzt werden, so dass für jede Messung ein Messfenster 5 mit optimaler Dicke und Transmission bereitgestellt werden kann.  Liquid cell 1 are used, so that for each measurement, a measuring window 5 can be provided with optimum thickness and transmission.

Als Messfenster 5 wird beispielsweise eine transparente Scheibe aus Quarzglas, Gorillaglas, Lotusglas oder Willowglas mit einem Durchmesser von ca. 50 mm verwendet. Die Dicke des Messfensters 5 beträgt ungefähr 500 μιτι und ist somit einerseits stabil genug um Verformungen und Bruch durch Druck zu widerstehen, andererseits ausreichend dünn, um optische Aberrationen und damit eine As a measuring window 5, for example, a transparent disk of quartz glass, gorilla glass, lotus glass or willow glass with a diameter of about 50 mm is used. The thickness of the measuring window 5 is about 500 μιτι and thus on the one hand stable enough to withstand deformation and breakage by pressure, on the other hand sufficiently thin to optical aberrations and thus a

Verschlechterung der Bildgebung und Spektroskopie zu minimieren. To minimize degradation of imaging and spectroscopy.

Für eine Anregung der Tryptophan Autofluoreszenz mit 266 nm wird bevorzugt ein Messfenster 5 aus Quarz verwendet, welches sowohl im UV als auch im sichtbaren Spektralbereich transparent ist. Die Schichtdicke der Suspension kann durch den Abstand des Bodens 3 zum Messfenster 5 zwischen 50 μιη und 500 μιτι eingestellt werden. In diesem Bereich ist einerseits eine gute Fokussierung auf die Probenpartikel möglich, andererseits ist das Untergrundsignal durch Ramananregung des Fenstermaterials gering. Materialien, welche die Messkammer 2 ausbilden, sind alle hochgradig inert. For a stimulation of tryptophan autofluorescence at 266 nm, a measurement window 5 made of quartz is preferably used, which is transparent both in the UV and in the visible spectral range. The layer thickness of the suspension can be adjusted by the distance of the bottom 3 to the measuring window 5 between 50 μιη and 500 μιτι. In this area, on the one hand a good focus on the sample particles is possible, on the other hand, the background signal is low by Raman excitation of the window material. Materials that form the measuring chamber 2 are all highly inert.

Der Außendurchmesser der ringförmigen Nut (entspricht in diesem Beispiel der Ausnehmung 8) beträgt 45 mm, wodurch die abbildbare Fläche der Messkammer 2 definiert ist. Die Nuttiefe beträgt 1 ,7 mm. In die Nut wird zunächst eine Einlegscheibe als Einlageelement 20 eingelegt auf die dann die Dichtung 6 aufgelegt wird. Die Schichtdicke der zu untersuchenden Flüssigkeit liegt zwischen 50 μιτι (ohne The outer diameter of the annular groove (corresponds to the recess 8 in this example) is 45 mm, whereby the imageable surface of the measuring chamber 2 is defined. The groove depth is 1, 7 mm. In the groove, an insert is first inserted as insert element 20 on which then the seal 6 is placed. The layer thickness of the liquid to be examined is between 50 μιτι (without

Einlegscheibe oder sehr geringe Höhe der Einlegscheibe) und 500 μιτι Washer or very low height of the washer) and 500 μιτι

(Einlegscheibe ist 500 μιτι hoch) und wird über die Höhe des Abstandselements 21 bestimmt, wobei die Höhe des Einlageelements 20, hier also der Einleg Scheibe entsprechend angepasst wird, so dass die Messkammer dicht ist. Das zu (Washer is 500 μιτι high) and is determined by the height of the spacer 21, wherein the height of the insert member 20, here so the Einleg disc is adjusted accordingly, so that the measuring chamber is tight. That too

untersuchende Probenvolumen wird also auch durch die Höhe des Abstandelements 21 bestimmt und beträgt somit zwischen 80 μΙ und 800 μΙ. Der O-Ring 6 weist PTFE oder Viton auf, welches lösungsmittelbeständig ist und nicht mit der zu Examining sample volume is thus determined by the height of the spacer element 21 and is thus between 80 μΙ and 800 μΙ. The O-ring 6 has PTFE or Viton, which is resistant to solvents and not with the

untersuchenden Flüssigkeit in Wechselwirkung tritt. Der O-Ring hat eine Schnurdicke (Höhe) von 2 mm. Nuttiefe und O-Ringdicke bleiben im Wesentlichen gleich. Das Einlageelement 20 ist der Höhe nach der dem Abstandselement 21 angepasst. interacting fluid. The O-ring has a cord thickness (height) of 2 mm. Groove depth and O-ring thickness remain essentially the same. The insert element 20 is adapted to the height of the spacer 21.

Zusammenbau der Flüssiqkeitszelle Assembly of the liquid cell

In Fig. 6 ist der Zusammenbau einer erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle als Bildfolge dargestellt. Beginnend bei A) werden die Schritte des Zusammenbaus alphabetisch bis F) vollzogen, um zur zusammengebauten Flüssigkeitszelle zu gelangen. FIG. 6 shows the assembly of a liquid cell according to the invention as a sequence of images. Beginning at A), the steps of assembly are performed alphabetically to F) to arrive at the assembled liquid cell.

A) Alle Einzelteile der modularen Flüssigkeitszelle sind noch nicht A) All the parts of the modular fluid cell are not yet

zusammengefügt sondern liegen vereinzelt vor. In diesem Beispiel sind das, der Boden 3, das Messfenster 5 (hier mit einer gestrichelten Umrandung dargestellt), eine Einlegscheibe als Einlageelement 20, ein Unterlegscheibe als Abstandselement 21 , eine Dichtung 6, sowie eine Andruckelement 9. Der joined together but are isolated. In this example, the bottom 3, the measuring window 5 (shown here with a dashed border), an insert washer 20, a washer spacer element 21, a seal 6, and a pressure element 9. Der

Boden weist in diesem Beispiel keine Zulauf- und Ablauföffnung auf. Soil has no inlet and outlet opening in this example.

Alternativ ist aber auch ein Boden 3 mit diesen Öffnungen 71 , 72 denkbar. B) Die Einlegescheibe 20 wird in die Ausnehmung 8 des Bodens 3 eingelegt.Alternatively, however, a bottom 3 with these openings 71, 72 is conceivable. B) The insert disc 20 is inserted into the recess 8 of the bottom 3.

C) Sodann wird die Dichtung 6 auf die Einlegscheibe in der Ausnehmung 8 des Bodens 3gelegt. C) Then, the seal 6 is placed on the washer in the recess 8 of the bottom 3.

D) Anschließend wird das Abstandselement 21 auf den Boden 3 gelegt.  D) Subsequently, the spacer 21 is placed on the floor 3.

E) Sodann wird das Messfenster 5 auf die Dichtung 6 gelegt.  E) Then the measuring window 5 is placed on the seal 6.

F) Dann wird das Andruckelement 9 auf das Messfenster 5 und das  F) Then, the pressure element 9 on the measuring window 5 and the

Abstandselement 21 gelegt.  Distance element 21 placed.

In diesem zusammengebauten Zustand, ist die Flüssigkeitszelle 1 in eine In this assembled state, the liquid cell 1 is in one

Haltevorrichtung 200 mit Schiebeführung 201 einschiebbar. Die Haltevorrichtung 200 ist auf einem Mikroskoptisch 203 angeordnet. Weiterhin umfasst die Haltevorrichtung 200 im Bereich der Schiebführung 201 eine Andruckplatte 202, die dazu ausgebildet ist, Druck auf die Seiten einer eingeschobenen Flüssigkeitszelle 1 in der Holding device 200 with sliding guide 201 can be inserted. The holding device 200 is arranged on a microscope stage 203. Furthermore, the holding device 200 in the region of the sliding guide 201 comprises a pressure plate 202, which is adapted to pressure on the sides of an inserted liquid cell 1 in the

Schiebeführung 201 auszuüben. Diese beiden Komponenten bilden das Exercise sliding guide 201. These two components make up that

erfindungsgemäße System. In Fig. 3 ist das System aus Haltevorrichtung 200 mit eingeschobener inventive system. In Fig. 3, the system is made of holding device 200 with inserted

Flüssigkeitszelle 1 abgebildet. Die Schiebeführung 201 greift bereichsweise um das Andruckelement 9. Der Boden 3 wird durch die Andruckplatte 202 in der  Liquid cell 1 shown. The sliding guide 201 engages in areas around the pressure element 9. The bottom 3 is by the pressure plate 202 in the

Schiebeführung 201 nach oben gedrückt (Richtung z-Achse) an die obere Führung gedrückt, so dass das Andruckelement 9 die Flüssigkeitszelle 1 abdichtet und die Flüssigkeitszelle 1 stabil zusammengesetzt bleibt. Sliding guide 201 pushed up (z-axis direction) pressed to the upper guide, so that the pressure element 9 seals the liquid cell 1 and the liquid cell 1 remains stably assembled.

In Fig. 3 weist der Boden 3 eine Zulauf- und eine Ablauföffnung 71 , 72 auf. Handhabung / Befüllung der Flüssigkeitszelle In Fig. 3, the bottom 3 has an inlet and a drain opening 71, 72. Handling / filling of the liquid cell

Die Befüllung der Flüssigkeitszelle 1 mit Probenflüssigkeit kann bei geöffneter (mit offenem oder ohne Messfenster 5) Flüssigkeitszelle 1 oder bei geschlossener Flüssigkeitszelle 1 (mit geschlossenem aufliegendem Messfenster 5) erfolgen. Bei geschlossener Flüssigkeitszelle 1 ist die Probenflüssigkeit über die Zulauf- 71 und Ablauföffnung 72 einfüllbar bzw. abziehbar. The liquid cell 1 can be filled with sample liquid when the liquid cell 1 is open (with or without the measuring window 5) or when the liquid cell 1 is closed (with the measuring window 5 closed). When the liquid cell 1 is closed, the sample liquid can be introduced or withdrawn via the inlet 71 and outlet opening 72.

Die Zulauf- 71 und Ablauföffnung 72 sind dabei im Boden 3 der Flüssigkeitszelle 1 so angeordnet, dass die Messkammer 2 befüllt und entlüftet werden kann. Über die Ablauföffnung 72 kann ein Unterdruck in der Messkammer 2 erzeugt werden, der ein blasenfreies Füllen der Messkammer 2 ermöglicht. Dadurch wird vermieden, dass Luft oder Gasblasen in der Suspension die automatische Partikelerkennung verfälschen. Die Befüllung der Messkammer 2 erfolgt beispielsweise mit einer Pipette / Pipettenspitze oder durch den Anschluss von Schläuchen über ein Luer System. Die Bildgebung erfolgt sodann in Auflichtgeometrie des Mikroskops. Die gesamte Fläche der Messkammer 2 kann abgebildet werden. Die Partikelerkennung erfolgt dabei beispielsweise automatisch durch einen Algorithmus. The inlet 71 and outlet opening 72 are arranged in the bottom 3 of the liquid cell 1 so that the measuring chamber 2 can be filled and vented. Via the drain opening 72, a negative pressure in the measuring chamber 2 can be generated, the one Bubble-free filling of the measuring chamber 2 allows. This avoids that air or gas bubbles in the suspension distort the automatic particle recognition. The filling of the measuring chamber 2 takes place, for example, with a pipette / pipette tip or by connecting hoses via a Luer system. The imaging then takes place in incident light geometry of the microscope. The entire surface of the measuring chamber 2 can be imaged. The particle recognition takes place for example automatically by an algorithm.

Mikroskop microscope

Ein geeignetes Mikroskop weist für die Bilderfassung und Partikelerkennung ein 10x (typische NA 0,25) oder 20x Objektiv (typische NA 0,45) auf. Die entsprechenden Schärfentiefen liegen bei ca. 20 μιτι bzw. ca. 5 μιτι. Die Bilderfassung erfolgt dabei vorzugsweise mit Dunkelfeld-Beleuchtung die aufgrund der glatten, reflektierenden Oberfläche 4 des Bodens 3 möglich ist. Dadurch wird ein höherer Kontrast zwischen Partikeln und Hintergrund erreicht, der die automatische computergestützte A suitable microscope has a 10x (typical NA 0.25) or 20x objective (typical NA 0.45) for image acquisition and particle detection. The corresponding depths of field are at about 20 μιτι or about 5 μιτι. The image acquisition is preferably carried out with dark field illumination which is possible due to the smooth, reflective surface 4 of the bottom 3. This achieves a higher contrast between particles and background, which is automatically computerized

Partikelerkennung verbessert. Particle detection improved.

Insbesondere bei der Ausführung der Flüssigkeitszelle 1 mit variabler Schichtdicke können so die Bedingungen für unterschiedlich große Partikel jeweils optimiert werden. Für kleine Partikel wird eine geringe Schichtdicke eingestellt und das 20x Objektiv verwendet, für größere eine große Schichtdicken und das 10x Objektiv. Unabhängig von dem verwendeten Objektiv kann bei Verwendung eines im UV transmittierenden Messfensters 5 die Bilderfassung über die Tryptophan In particular, in the embodiment of the liquid cell 1 with variable layer thickness so the conditions for different sized particles can be optimized in each case. For small particles, a small layer thickness is set and the 20x objective used, for larger a large layer thicknesses and the 10x objective. Regardless of the lens used when using a transmissive in the UV measurement window 5, the image capture on the tryptophan

Autofluoreszenz erfolgen. Autofluorescence done.

Die Partikel werden durch automatisierte, bildgestützte Ramanspektroskopie analysiert. Dazu wird ein Laser mit der Wellenlänge 532 nm verwendet, die von Proteinen stark gestreut wird.. Die Einstrahlung des Laserlichts sowie die Detektion des Ramansignals können durch ein 50x oder 100x Objektiv erfolgen. The particles are analyzed by automated, image-based Raman spectroscopy. For this purpose, a laser with the wavelength of 532 nm is used, which is strongly scattered by proteins .. The irradiation of the laser light and the detection of the Raman signal can be done by a 50x or 100x objective.

In Fig. 4 ist die Wirkung einer reflektierenden Nickel-Oberfläche 101 im Vergleich zu einem Substrat aus Gorillaglas 102 auf ein gemessenes Ramansignal 103, 104 dargestellt. In der oberen linken Ecke des Diagramms ist ein mikroskopisches Bild der Nickel- Oberfläche 101 sowie eine Abbildung einer Gorillaglas Oberfläche eingefügt. Die Bilder sind annähernd gleich im Kontrast, so dass bei der Bilderfassung keine Unterschiede feststellbar sind. Die im Hellfeld in der Flüssigkeitszelle FIG. 4 shows the effect of a reflecting nickel surface 101 compared to a substrate made of gorilla glass 102 on a measured Raman signal 103, 104. In the upper left corner of the diagram is a microscopic image of the nickel surface 101 and a picture of a gorilla glass surface inserted. The images are approximately the same in contrast, so that no differences can be detected during image acquisition. The bright field in the liquid cell

aufgenommenen Bilder zeigen die Positionen jeweils eines vergleichbaren Partikels, an dem die jeweiligen Ramanspektren aufgenommen wurden. The pictures taken show the positions of a comparable particle on which the respective Raman spectra were recorded.

Eine Ramanmessung 103, 104 der Proteine, zeigt allerdings deutlich Unterschiede. Das gemessene Ramansignal 104 auf dem Gorillaglassubstrat weist deutlich geringere Proteinsignalhöhen 100 als die vergleichbare Messung der gleichen Suspension auf einer reflektierenden Nickeloberfläche 103. Zwar nimmt auch der Untergrund (gestrichelte Linie) bei der Nickeloberfläche zu, dieser kann jedoch einfach vom Signal 103 abgezogen werden, um zu einem korrigierten Signal zu gelangen. Die Signalhöhen 100 der Proteine auf der Nickeloberfläche 103 sind deutlich höher als bei der Messung auf Gorillaglas 104. Außerdem sind auf der Nickeloberfläche 101 , 103 keine Ramansignale vom Substrat selbst detektierbar. Auf dem Gorillaglas Substrat 102, 104 sind allerdings A Raman measurement 103, 104 of the proteins, however, clearly shows differences. The measured Raman signal 104 on the gorilla inlet substrate has significantly lower protein signal levels 100 than the comparable measurement of the same suspension on a reflective nickel surface 103. Although the background (dashed line) at the nickel surface also increases, this can be easily subtracted from the signal 103 to arrive at a corrected signal. The signal levels 100 of the proteins on the nickel surface 103 are significantly higher than in the measurement on gorilla glass 104. In addition, no Raman signals are detectable on the nickel surface 101, 103 from the substrate itself. However, on the gorilla glass substrate 102, 104 are

probenfremde Signale 105 zu erkennen. to recognize external signals 105.

Die hier offenbarte erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle, das System aus The liquid cell of the invention disclosed herein, the system

Flüssigkeitszelle und Haltevorrichtung 200 und das erfindungsgemäße Mikroskop tragen also wesentlich zu einer Verbesserung von bildgestützten, The liquid cell and holding device 200 and the microscope according to the invention therefore contribute substantially to an improvement of image-based,

ramanspektroskopischen Analyse von Proteinsuspensionen in Auflicht-Mikroskopen bei. Raman spectroscopic analysis of protein suspensions in incident light microscopes at.

Claims

Patentansprüche claims

1. Flüssigkeitszelle (1 ) zur mikroskopischen Bilderfassung und Raman- spektroskopischen Materialanalyse einer Partikelsuspension in einem Auflicht-Mikroskop, aufweisend zumindest die folgenden Komponenten: eine Messkammer (2), aufweisend einen Boden (3) , ein dem Boden (3) gegenüberliegendes Messfenster (5) und eine Dichtung (6), wobei der Boden (3) zumindest in einem Bereich der Auflage der Dichtung (6) planar ausgeführt ist, 1. Liquid cell (1) for microscopic image acquisition and Raman spectroscopic material analysis of a particle suspension in an incident light microscope, comprising at least the following components: a measuring chamber (2), comprising a bottom (3), a measuring window opposite the bottom (3) 5) and a seal (6), wherein the bottom (3) at least in a region of the support of the seal (6) is designed to be planar,

dadurch gekennzeichnet, dass  characterized in that

der Boden (3) eine reflektierende Oberfläche (4) aufweist, die so beschaffen ist, dass durch das Messfenster (5) einfallendes Raman-Anregungslicht an der reflektierenden Oberfläche (4) gerichtet reflektiert wird, so dass das Ramansignal eines Partikels, insbesondere aufgrund der zweimaligen Anregungschance, erhöht wird.  the bottom (3) has a reflecting surface (4) which is designed such that Raman excitation light incident through the measuring window (5) is reflected in a directed manner on the reflecting surface (4), so that the Raman signal of a particle, in particular due to the twice stimulation chance, is increased.

2. Flüssigkeitszelle gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die 2. A liquid cell according to claim 1, characterized in that the

reflektierende Oberfläche (4) des Bodens (3) ein Metall oder eine  reflective surface (4) of the bottom (3) a metal or a

Metalllegierung aufweist, wobei insbesondere der Boden (3) aus dem Metall oder der Metalllegierung besteht.  Metal alloy, wherein in particular the bottom (3) consists of the metal or the metal alloy.

3. Flüssigkeitszelle nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass die reflektierende Oberfläche (4) eine auf dem Boden (3) angeordnete reflektierende Schicht (40) ist, wobei die reflektierende Schicht (40) insbesondere semitransparent ist. 3. A liquid cell according to claim 1 or 2, characterized in that the reflective surface (4) on the bottom (3) arranged reflective layer (40), wherein the reflective layer (40) is in particular semitransparent.

4. Flüssigkeitszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch 4. Liquid cell according to one of the preceding claims, characterized

gekennzeichnet, dass der Boden (3) eine Zulauföffnung (71 ) und eine Ablauföffnung (72), zum Befüllen, Entleeren, Vakuumieren und/oder  in that the bottom (3) has an inlet opening (71) and a drain opening (72) for filling, emptying, vacuuming and / or

Erzeugen eines Durchflusses in der Messkammer (2), aufweist, wobei die Zulauf- und/oder die Ablauföffnung (71 , 72) insbesondere in einem Bereich des Bodens (3) angeordnet ist / sind, der Teil der Messkammer (2) ist.  Generating a flow in the measuring chamber (2), wherein the inlet and / or the drain opening (71, 72) is / are arranged in particular in a region of the bottom (3), which is part of the measuring chamber (2).

5. Flüssigkeitszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch 5. Liquid cell according to one of the preceding claims, characterized

gekennzeichnet, dass die reflektierende Oberfläche (4) im  characterized in that the reflective surface (4) in

Wellenlängenbereich von 300 nm bis 800 nm, insbesondere von 210 nm bis 1200 nm durchgehend reflektierend ist. Flüssigkeitszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitszelle (1 ) ein Andruckelement (9) aufweist, das so ausgebildet ist, dass die Flüssigkeitszelle (1 ) in eine Wavelength range of 300 nm to 800 nm, in particular from 210 nm to 1200 nm is continuously reflective. Liquid cell according to one of the preceding claims, characterized in that the liquid cell (1) has a pressure element (9), which is formed so that the liquid cell (1) into a

Schiebeführung eingeführt werden kann, wobei das Andruckelement (9) von der Schiebeführung niedergehalten wird, so dass das Andruckelement (9) auf das Messfenster (5), die Dichtung (6) und den Boden (3) sowie insbesondere an ein Unterteil (30) drückt, so dass die Messkammer (2) abgedichtet wird, wobei das Andruckelement (9) mit einem ersten Bereich auf oder oberhalb des Messfensters (5) angeordnet ist und insbesondere mit einem zweiten Bereich auf oder oberhalb des Bodens (3) angeordnet ist. Sliding guide can be introduced, wherein the pressure element (9) is held down by the sliding guide, so that the pressure element (9) on the measuring window (5), the seal (6) and the bottom (3) and in particular to a lower part (30) presses, so that the measuring chamber (2) is sealed, wherein the pressure element (9) with a first region on or above the measuring window (5) is arranged and in particular with a second region on or above the bottom (3) is arranged.

Flüssigkeitszelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Liquid cell according to claim 6, characterized in that the

Flüssigkeitszelle ein Abstandelement (21 ) aufweist, wobei das Liquid cell has a spacer element (21), wherein the

Abstandelement (21 ) auf dem Boden (3) der Flüssigkeitszelle (1 ) Distance element (21) on the bottom (3) of the liquid cell (1)

insbesondere außerhalb der Messkammer (2) auf dem Boden (3) der Flüssigkeitszelle (1 ) angeordnet ist, wobei das Andruckelement (9) mit dem zweiten Bereich auf dem Abstandselement (21 ) aufliegt, so dass das in particular outside the measuring chamber (2) on the bottom (3) of the liquid cell (1) is arranged, wherein the pressure element (9) rests with the second region on the spacer element (21), so that the

Messfenster (5) durch das Andruckelement (9) nur bis auf einen Measuring window (5) by the pressure element (9) only to one

vordefinierten Abstand an den Boden (3) angedrückt werden kann, wobei die Höhe das Abstandselements (21 ) besagten Abstand des Messfensters (5) vom Boden (3) vorgibt. predefined distance to the bottom (3) can be pressed, wherein the height of the spacer element (21) said distance of the measuring window (5) from the bottom (3).

System aufweisend eine Haltevorrichtung (200) zum Verschließen und Fixieren einer Flüssigkeitszelle (1 ), eine Flüssigkeitszelle (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Haltevorrichtung (200) eine Schiebeführung (201 ) aufweist, in welche die Flüssigkeitszelle (1 ) einschiebbar ist und wobei die System comprising a holding device (200) for closing and fixing a liquid cell (1), a liquid cell (1) according to one of the preceding claims, wherein the holding device (200) has a sliding guide (201) into which the liquid cell (1) can be inserted and where the

Schiebeführung (201 ) eine Andruckplatte (202) aufweist, die dazu ausgebildet ist, das Messfenster (5) auf die Dichtung (6) zu drücken, wenn die Sliding guide (201) has a pressure plate (202) which is adapted to press the measuring window (5) on the seal (6) when the

Flüssigkeitszelle (1 ) in der Haltevorrichtung (200) aufgenommen ist. Liquid cell (1) is received in the holding device (200).

Mikroskop aufweisend Mittel zur mikroskopischen Bilderfassung und spektroskopischen Messungen einer Partikelsuspension, wobei das Microscope comprising means for microscopic image acquisition and spectroscopic measurements of a particle suspension, wherein the

Mikroskop ein Auflicht-Mikroskop ist und wobei das Mikroskop eine Flüssigkeitszelle (1 ) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 aufweist, oder insbesondere ein System gemäß Anspruch 8 aufweist. Microscope is a reflected-light microscope and wherein the microscope is a Liquid cell (1) according to one of claims 1 to 7, or in particular a system according to claim 8.

10. Mikroskop gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop zur Dunkelfeldbeleuchtung eingerichtet ist und die reflektierende Oberfläche (4) des Bodens (3) der Flüssigkeitszelle (1 ) als Reflektor für die eingestrahlte10. A microscope according to claim 9, characterized in that the microscope for dark field illumination is set up and the reflective surface (4) of the bottom (3) of the liquid cell (1) as a reflector for the irradiated

Dunkelfeldbeleuchtung dient. Dark field illumination is used.