DE102017107857A1

DE102017107857A1 - Fluid cell for microscopic imaging and Ramspectroscopic material analysis of particle suspensions

Info

Publication number: DE102017107857A1
Application number: DE102017107857.6A
Authority: DE
Inventors: Karsten GOEDE; Markus Lankers; Oliver Valet; Lisa Krapf; Steve Bober
Original assignee: rap ID Particle Systems GmbH
Current assignee: Unchained Labs Inc
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2017-04-11
Publication date: 2017-10-19
Also published as: KR20200021920A; WO2018189274A1; CA3059520A1; AU2018250902A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Flüssigkeitszelle (1) zur mikroskopischen Bilderfassung und ramanspektroskopischen Materialanalyse einer Partikelsuspension in einem Auflicht-Mikroskop, aufweisend zumindest die folgenden Komponenten: – eine Messkammer (2), aufweisend einen Boden (3), ein dem Boden (3) gegenüberliegendes Messfenster (5) und eine Dichtung (6), wobei – der Boden (3) eine Ausnehmung (8) aufweist, die dazu ausgebildet ist, die Dichtung (6) aufzunehmen, oder wobei – der Boden (3) zumindest in einem Bereich der Auflage der Dichtung (6) planar ausgeführt ist, wobei der Boden (3) eine reflektierende Oberfläche (4) aufweist, die so beschaffen ist, dass durch das Messfenster (5) einfallendes Raman-Anregungslicht an der reflektierenden Oberfläche (4) gerichtet reflektiert wird, so dass das Untergrundsignal bei einer Ramanmessung reduziert wird und das Ramansignal eines Partikels in einer Suspension erhöht wird. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Mikroskop, welches eine solche Flüssigkeitszelle aufweist.The invention relates to a fluid cell (1) for microscopic image acquisition and Raman spectroscopic material analysis of a particle suspension in a reflected-light microscope, comprising at least the following components: a measuring chamber (2) comprising a bottom (3), a measuring window opposite the bottom (3) (5) and a seal (6), wherein - the bottom (3) has a recess (8) adapted to receive the seal (6), or wherein - the bottom (3) at least in an area of the support the seal (6) is made planar, wherein the bottom (3) has a reflective surface (4), which is designed such that Raman excitation light incident through the measurement window (5) is reflected in a directed manner on the reflective surface (4), so that the background signal is reduced in a Raman measurement and the Raman signal of a particle is increased in a suspension. Furthermore, the invention relates to a microscope having such a liquid cell.

Description

Die Erfindung betrifft eine Flüssigkeitszelle gemäß Anspruch 1, ein System gemäß Anspruch 8 sowie ein Mikroskop gemäß Anspruch 9.The invention relates to a fluid cell according to claim 1, a system according to claim 8 and a microscope according to claim 9.

Viele Pharmazeutika werden standardmäßig auf Fremdpartikel und/oder Proteinaggregate untersucht. Oftmals ist dies sogar durch behördliche Vorschriften wie durch die US FDA vorgeschrieben. Solche Vorschriften betreffen beispielsweise die maximalen Partikelzahlen, gegliedert nach verschiedenen Größenklassen. Um zu gewährleisten, dass Grenzwerte nicht überschritten werden, müssen Partikel identifiziert und quantifiziert werden. Dazu gehört, dass Aggregate in Proteinlösungen, Fremdpartikel und Luftblasen detektiert und unterschieden werden. Dies geschieht durch eine Vorrichtung die dazu eingerichtet ist, die Detektion von Partikeln sowie die Bestimmung deren Größe und Form zu ermöglichen. Die Detektion von Partikeln kann auf verschiedene Arten erfolgen. Üblich sind jedoch bildgebende Verfahren, wie beispielsweise Lichtmikroskopie.Many pharmaceuticals are analyzed by default for foreign particles and / or protein aggregates. Often this is even required by regulatory requirements such as the US FDA. Such regulations relate, for example, to the maximum particle numbers, broken down into different size classes. In order to ensure that limit values are not exceeded, particles must be identified and quantified. This includes detecting and distinguishing aggregates in protein solutions, foreign particles and air bubbles. This is done by a device which is adapted to allow the detection of particles and the determination of their size and shape. The detection of particles can be done in different ways. However, imaging techniques such as light microscopy are common.

Bildgebung von Partikeln in Flüssigkeitszellen und Durchflusszellen ist bereits aus dem Stand der Technik bekannt ( US 5,471,294 , EP 1329706 , US 7605919 ). Mit der FlowCam können zum Beispiel Bilder von Partikeln beim Durchfließen der Zelle aufgenommen und analysiert werden ( US 7605919 ). Über Formparameter der Partikel und Auswertealgorithmen können die Partikel verschiedenen Klassen (Beispielsweise Proteinaggregate, Luftblasen oder Silikontropfen) zugeordnet werden. Die genaue Bestimmung des Stoffes, aus dem das Partikel besteht, ist allerdings nicht möglich. Dabei wäre es bei derartigen Verfahren vorteilhaft, wenn die Bildgebung von Partikeln in einer Flüssigkeit mit der Bestimmung des Partikelmaterials durch Ramanspektroskopie in der gleichen Messzelle durchgeführt werden könnte. Dies würde es beispielsweise erlauben, verschiedene Proteine oder Polymere zu identifizieren bzw. differenzieren.Imaging of particles in fluid cells and flow cells is already known from the prior art ( US 5,471,294 . EP 1329706 . US 7605919 ). For example, the FlowCam can capture and analyze images of particles as they flow through the cell ( US 7605919 ). Using particle shape parameters and evaluation algorithms, the particles can be assigned to different classes (for example, protein aggregates, air bubbles or silicone droplets). The exact determination of the substance of which the particle is made, however, is not possible. It would be advantageous in such methods, if the imaging of particles in a liquid could be carried out with the determination of the particulate material by Raman spectroscopy in the same measuring cell. This would allow, for example, different proteins or polymers to be identified or differentiated.

Für eine kombinierte, bildgebende und zielgerichtete, d. h. basierend auf den aufgenommen Bildern, Raman-spektroskopische Messung müsste ein derartig eingerichtetes Mikroskop umfassende optische und mechanische Einrichtungen aufweisen. Dies liegt unter anderem daran, dass ramanspektroskopische Messungen üblicherweise Punktmessungen sind und sichergestellt werden muss, dass die ramanspektroskopische Messung am richtigen Ort durchgeführt wird. Nur so können die beiden Messmethoden zu einer korrelierten Gesamtmessaussage kombiniert werden.For a combined, imaging and targeted, d. H. based on the images taken, Raman spectroscopic measurement would have such a microscope equipped have comprehensive optical and mechanical devices. Among other things, this is because Raman spectroscopic measurements are usually point measurements and it must be ensured that the Raman spectroscopic measurement is carried out at the correct location. Only then can the two measuring methods be combined into a correlated overall measurement statement.

Es sind Verfahren bekannt, bei denen das Anfahren der Partikel in sogenannten „wet cells” zur Ramanspektroskopie automatisiert durchgeführt wird. Die automatische Erkennung der Größe und Form sowie des Ortes von Mikropartikeln in einer Suspension mit dem Ziel Schwingungsspektroskopie durchzuführen, wurde bereits von Malvern ( Malvern Application Note „Characterization of protein aggregates in suspension and on a filter membrane by Morphologically-Directed Raman Spectroscopy” ) beschrieben. Hier sind Ergebnisse veröffentlicht, die zeigen, dass mit kombinierter, automatisierter Erkennung von Partikeln und Ramanspektroskopie in der „thin-path wet cell” verschiedene Partikelspezies in einer Proteinlösung unterschieden werden können. Die Bildgebung der Probe erfolgt im Durchlicht, weshalb sowohl für die obere als auch die untere Seite der Messzelle ein transparentes Messfenster aus Quarz verwendet wird.Methods are known in which the start-up of the particles is carried out automatically in so-called "wet cells" for Raman spectroscopy. The automatic detection of the size and shape as well as the location of microparticles in a suspension with the aim of performing vibrational spectroscopy has already been investigated by Malvern ( Malvern Application Note "Characterization of Protein Aggregates in Suspension and on a Filter Membrane by Morphologically-Directed Raman Spectroscopy" ). Here are published results, which show that with combined, automated detection of particles and Raman spectroscopy in the "thin-path wet cell" different particle species can be distinguished in a protein solution. The imaging of the sample takes place in transmitted light, which is why a transparent measuring window made of quartz is used for both the upper and the lower side of the measuring cell.

Eine weitere Flüssigkeitszelle, die auch für die Ramanspektroskopie an Partikeln genutzt werden kann, ist in DE 10 2013 015 033 beschrieben. Die Abbildung in dieser Durchflusszelle erfolgt in Auflichtgeometrie.Another liquid cell, which can also be used for Raman spectroscopy on particles, is in DE 10 2013 015 033 described. The image in this flow cell is in incident light geometry.

Problematisch an beiden vorgenannten Messzellen ist der hohe Untergrund des Substrates. Das üblicherweise verwendete Glas oder Quarzglas erzeugt bei der Messung ebenfalls ein Ramansignal, welches das zu messende Signal der Probe so überlagern kann, dass dessen Qualität deutlich schlechter und damit die Identifizierung der Partikelsubstanz schwieriger wird. Dies wird insbesondere bei der Messung von Mikropartikeln relevant, da hier der durch das Anregungslicht belichtete Fleck deutlich größer als das zu analysierende Partikel und somit der Anteil des Hintergrundsignals sehr groß sein kann.The problem with both aforementioned measuring cells is the high background of the substrate. The commonly used glass or quartz glass also generates a Raman signal during the measurement, which can superimpose the signal to be measured on the sample so that its quality is significantly worse and thus the identification of the particle substance becomes more difficult. This becomes particularly relevant in the measurement of microparticles, since here the spot exposed by the excitation light can be significantly larger than the particle to be analyzed and thus the proportion of the background signal can be very large.

Neben dem hohen Untergrund der Messungen, sind auch folgende Probleme bei derartigen Messungen zu lösen.In addition to the high background of the measurements, the following problems in such measurements are to be solved.

Luftblasen, die sich beim Befüllen der Messkammer bilden können, müssen vermieden werden, da sie zu Messartefakten führen können. Die Bildung von Luftblasen ist besonders bei hochviskosen Suspensionen problematisch.Air bubbles that may form when filling the measuring chamber must be avoided as they can lead to measuring artifacts. The formation of air bubbles is particularly problematic in high viscosity suspensions.

Um eine möglichst vielseitigen Einsatzmöglichkeit der Flüssigkeitszelle zu gewährleisten, muss die Zelle aus inerten Materialien gefertigt sein und muss insbesondere einfach zu reinigen sein, damit eine Kontamination von folgenden Proben ausgeschlossen werden kann.In order to ensure the most versatile possible use of the liquid cell, the cell must be made of inert materials and in particular must be easy to clean, so that contamination of subsequent samples can be excluded.

Weiterhin ist die Schichtdicke der zu untersuchenden Suspension kritisch, da bei einer zu dicken Schicht eine optimale Fokussierung auf die Partikel nicht möglich ist. Umgekehrt besteht bei einer sehr dünnen Flüssigkeitsschicht die Gefahr, dass ein sehr hohes Hintergrundsignal durch das sich nahe dem Fokus befindende Fenstermaterial erzeugt wird. Dieses Hintergrundsignal überlagert das Ramansignal und erschwert die spektroskopische Bestimmung des Partikelmaterials.Furthermore, the layer thickness of the suspension to be examined is critical, since in the case of too thick a layer optimum focusing on the particles is not possible. Conversely, with a very thin layer of liquid, there is a risk that a very high background signal will occur due to the close proximity of the background Focusing window material is generated. This background signal superimposes the Raman signal and makes the spectroscopic determination of the particulate material more difficult.

Daneben sollte das untersuchbare Probenvolumen von variabler Größe sein, damit einerseits Proben mit niedriger Partikelzahl untersucht werden können (erfordert ein eher großes Volumen), andererseits aber Proben untersucht werden können, die nur ein in kleinen Mengen vorliegen (kleines Probenvolumen).In addition, the sample volume to be examined should be of variable size, so that on the one hand samples with a low particle number can be examined (requires a rather large volume), but on the other hand samples can be examined which are only one in small amounts (small sample volume).

Häufig ist der Bildkontrast, also der Kontrast zwischen Partikel und Hintergrund bei den bekannten Verfahren nicht ausreichend hoch. Dies führt zu Fehlern sowohl bei der Messung als auch bei der Auswertung der Messdaten.Frequently the image contrast, ie the contrast between particle and background, is not sufficiently high in the known methods. This leads to errors both in the measurement and in the evaluation of the measured data.

Eine weitere Schwierigkeit bei der Bestimmung des Partikelmaterials durch Ramanspektroskopie besteht darin, eine ausreichend hohe Signalqualität zu erreichen. Oft müssen zum Beispiel Protein-Aggregate in einer hochkonzentrierten Proteinlösung untersucht werden, deren Ramansignal sich nur wenig von dem der umgebenden Flüssigkeit unterscheidet.Another difficulty in determining particulate matter by Raman spectroscopy is to achieve sufficiently high signal quality. Often, for example, protein aggregates must be examined in a highly concentrated protein solution whose Raman signal differs only slightly from that of the surrounding fluid.

Die Aufgabe der Erfindung besteht somit darin, eine Flüssigkeitszelle bereitzustellen, mit der die Vielzahl der oben genannten Probleme in vorteilhafter Weise gelöst werden, insbesondere soll das Signal-zu-Rauschverhältnis bei Messungen in einer erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle hinsichtlich bildgestützter, ramanspektroskopischer Messungen verbessert werden. Weiterhin besteht die Aufgabe der Erfindung darin, ein Mikroskop bereitzustellen, mit dem die oben genannten Aufgaben vorteilhaft bewirkt werden können.The object of the invention is therefore to provide a liquid cell with which the plurality of the above problems are solved in an advantageous manner, in particular, the signal-to-noise ratio is to be improved in measurements in a liquid cell according to the invention with respect to image-based Raman spectroscopic measurements. Furthermore, the object of the invention is to provide a microscope, with which the above-mentioned objects can be advantageously effected.

Das erfindungsgemäße Problem wird durch eine Flüssigkeitszelle gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben und werden nachfolgend beschrieben.The problem of the invention is solved by a liquid cell according to claim 1. Advantageous embodiments of the invention are specified in the subclaims and are described below.

Danach weist eine Flüssigkeitszelle zur mikroskopischen Bilderfassung und bildgestützten, ramanspektroskopischen Materialanalyse einer Partikelsuspension in einem Auflicht-Mikroskop, zumindest die folgenden Komponenten auf:

– eine Messkammer, aufweisend einen Boden, ein dem Boden gegenüberliegendes insbesondere parallel zum Boden verlaufendes Messfenster und eine Dichtung, wobei
– der Boden eine Ausnehmung aufweist, die dazu ausgebildet ist, die Dichtung aufzunehmen, und wobei die Ausnehmung im erfindungsgemäßem, zusammengesetzten Zustand der Flüssigkeitszelle, die Dichtung aufnimmt, oder wobei
– der Boden zumindest in einem Bereich der Auflagefläche der Dichtung eben ausgeführt ist,

wobei der Boden eine insbesondere glatte, insbesondere bereichsweise glatte und reflektierende Oberfläche aufweist, die so beschaffen ist, dass durch das Messfenster einfallendes Licht, insbesondere Raman-Anregungslicht, an der reflektierenden Oberfläche gerichtet reflektiert wird, so dass das Untergrundsignal bei einer Ramanmessung reduziert wird und das Ramansignal eines in einer Suspension enthaltenen Partikels erhöht wird.Thereafter, a liquid cell for microscopic image acquisition and image-based, ramanspektroskopischen material analysis of a particle suspension in an incident light microscope, at least the following components:

- A measuring chamber, comprising a bottom, a bottom opposite, in particular parallel to the ground extending measuring window and a seal, wherein
- The bottom has a recess which is adapted to receive the seal, and wherein the recess in the inventive, assembled state of the liquid cell, the seal receives, or wherein
The base is designed to be flat, at least in a region of the bearing surface of the seal,

wherein the bottom has a particularly smooth, in particular partially smooth and reflective surface which is such that light incident through the measuring window, in particular Raman excitation light, is reflected at the reflecting surface, so that the background signal is reduced in a Raman measurement and the Raman signal of a particle contained in a suspension is increased.

Die reflektierende Oberfläche weist dabei einen Reflexionsgrad von insbesondere mehr als 70% in zumindest einem breiten Bereich des elektromagnetischen Spektrums auf – insbesondere im ultra-violetten, sichtbaren sowie im nahen infraroten Spektralbereich. Die Oberfläche ist so beschaffen, dass auftreffende Lichtstrahlen gerichtet reflektiert werden und zwar weitgehend unabhängig vom Einfallswinkel, d. h. die Reflexion ist insbesondere nicht nur auf Grenzwinkel für Totalreflexion beschränkt. Die reflektierende Oberfläche bewirkt in vorteilhafterweise, dass das Signal-zu-Rauschverhältnis bei ramanspektroskopischen Messungen verbessert wird, insbesondere dadurch, dass der Anregungslaser aufgrund der Reflexion die oder den Partikel zweimal anregt, und zwar beim Weg vom einem Objektiv zur Probe und auf dem Weg nach der Reflexion an der reflektierenden Oberfläche. Zudem wird ein Hintergrundsignal des Bodens unterdrückt, wodurch das Probensignal besser erfassbar wird. Der Boden sollte, um eine ausreichend gerichtete Reflexion ausreichende Güte zu bewirken und auch um vorteilhaft für eine Dunkelfeldbeleuchtung verwendbar zu sein, eine in ausreichendem Maße glatte und ebene Oberfläche aufweisen. Zur Charakterisierung der Glattheit bzw. Rauheit kann auch die sogenannte RZ-Zahl der Oberfläche herangezogen werden. Die RZ-Zahl charakterisiert die insbesondere gemittelte Rauheit einer Fläche. Die Ermittlung der RZ-Zahl ist dem Fachmann geläufig. Die RZ-Zahl sollte insbesondere kleiner als 0,1, bevorzugt kleiner als 0,01 sein. Die Erhöhung des Ramansignals ist also insbesondere nicht die Folge eines Proben-Oberflächeneffekts wie er beispielsweise in der „surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) verwendet wird.The reflective surface in this case has a reflectance of in particular more than 70% in at least a broad range of the electromagnetic spectrum - in particular in the ultraviolet, visible and in the near infrared spectral range. The surface is designed so that incident light rays are reflected directionally and largely independent of the angle of incidence, d. H. In particular, the reflection is not limited only to critical angles for total reflection. The reflective surface advantageously effects that the signal-to-noise ratio is improved in Raman spectroscopic measurements, in particular in that the excitation laser excites the particle or particles twice as a result of the reflection on the way from a lens to the sample and on the way to the reflection on the reflective surface. In addition, a background signal of the ground is suppressed, whereby the sample signal is better detectable. The floor should have a sufficiently smooth and level surface to effect sufficient directional reflection of sufficient quality, and also to be useful for dark field illumination. To characterize the smoothness or roughness, the so-called RZ number of the surface can also be used. The RZ number characterizes the particular averaged roughness of a surface. The determination of the RZ number is familiar to the person skilled in the art. The RZ number should in particular be less than 0.1, preferably less than 0.01. In particular, the increase in the Raman signal is therefore not the result of a sample surface effect, as used for example in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS).

Insbesondere erstreckt sich der Boden entlang einer Ebene.In particular, the floor extends along a plane.

Die Erfindung ermöglicht in vorteilhafter Weise den Einsatz von Mikroskopen bzw. von Objektiven mit vergleichsweise kleinen Arbeitsabständen, insbesondere bis hinunter zu 1 mm, und dadurch entsprechend großer numerischer Aperturen, was besonders hinsichtlich eines verbesserten Signal-zu-Rauschverhältnisses bei Ramanmessungen vorteilhaft ist.The invention advantageously makes it possible to use microscopes or objectives with comparatively small working distances, in particular down to 1 mm, and thus correspondingly large numerical apertures, which is particularly advantageous with regard to an improved signal-to-noise ratio. Ratio of noise in Raman measurements is advantageous.

Lösungen mit einer gekrümmten, beispielsweise mit einer kugel- oder zylinderförmigen Bodengeometrie oder Messkammergeometrie, sind der erfindungsgemäßen Lösung unterlegen, da sich eine gekrümmte Messkammergeometrie nicht für den Einsatz von Objektiven mit kurzen Arbeitsabständen eignet, sondern größere Arbeitsabstände, insbesondere mehr als 5 mm, und entsprechend niedrigeren numerischen Aperturen erfordert, um den vergrößerten Abstand der Messkammerdecke zum Boden zu kompensieren.Solutions with a curved, for example, with a spherical or cylindrical bottom geometry or Meßkammergeometrie are inferior to the solution according to the invention, since a curved measuring chamber geometry is not suitable for the use of lenses with short working distances, but larger working distances, in particular more than 5 mm, and accordingly Lower numerical apertures required to compensate for the increased distance of the measuring chamber ceiling to the ground.

Die numerische Apertur einer solchen gekrümmten Messkammergeometrie ist damit insbesondere im Vergleich zu der erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle mit einem ebenen Boden und einem insbesondere ebenen Messfenster – bei gleichem Linsendurchmesser – mehr als gedrittelt, was zu einer mehr als 9-mal niedrigeren Sammeleffizienz für das Ramansignal führt.The numerical aperture of such a curved measuring chamber geometry is thus more than in thirds compared to the liquid cell according to the invention with a flat bottom and a particularly flat measuring window - with the same lens diameter - resulting in a more than 9 times lower collection efficiency for the Raman signal.

Weiterhin bergen gekrümmte Messkammergeometrien die Gefahr einer optischen Refokussierung insbesondere des Anregungslichtes, was zu Fehlsignalen führen kann.Furthermore, curved measuring chamber geometries entail the risk of optical refocusing, in particular of the excitation light, which can lead to false signals.

Gemäß einer Alternative der Erfindung, weist der Boden eine Ausnehmung auf, die dazu eingerichtet ist, die Dichtung aufzunehmen. Diese Variante der Erfindung, ist insbesondere vorteilhaft, wenn Dichtungen verwendet werden sollten, die vergleichsweise dick sind, also eine vergleichsweise große Höhe, insbesondere mehr als 500 μm aufweisen.According to an alternative of the invention, the bottom has a recess which is adapted to receive the seal. This variant of the invention is particularly advantageous if seals should be used which are comparatively thick, ie have a comparatively large height, in particular more than 500 μm.

Hier kann es vorteilhaft sein, den Abstand zwischen Boden und Messfenster dadurch auf einen vordefinierten Wert, insbesondere kleiner als 500 μm, zu bringen, indem diese Dichtung in der Ausnehmung entsprechend versenkt wird. D. h. die ursprünglich ungeeignete Höhe der Dichtung wird durch die Tiefe der Ausnehmung kompensiert, so dass eine vergleichsweise dicke Dichtung verwendet werden kann. Dadurch vereinfacht sich insbesondere die Handhabung der Flüssigkeitszelle, da Dichtungen, die eine Höhe kleiner als 500 μm aufweisen, mit den Händen oder Werkzeugen, wie Pinzetten umso schwieriger zu handhaben sind, je kleiner die Höhe der Dichtung ist. Weiterhin sind solche vergleichsweisen dicken Dichtungen robuster und oftmals kostengünstiger zu beschaffen.Here, it may be advantageous to bring the distance between the bottom and the measuring window thereby to a predefined value, in particular less than 500 microns, by this seal is sunk in the recess accordingly. Ie. the originally inappropriate height of the seal is compensated by the depth of the recess, so that a comparatively thick seal can be used. This simplifies in particular the handling of the liquid cell, since seals that have a height less than 500 microns, with the hands or tools, such as tweezers are the more difficult to handle, the smaller the height of the seal. Furthermore, such comparatively thick seals are more robust and often cheaper to obtain.

Gemäß einer Alternative der Erfindung ist der Boden der Flüssigkeitszelle im Bereich der Auflage der Dichtung plan oder auch planar ausgeführt, weist also insbesondere keine Ausnehmung auf. Der so geformte Boden ist im Bereich der Dichtungsauflage insbesondere eben und formschlüssig mit den Bereichen des Bodens geformt, auf denen die Probe aufgebracht wird oder die von der Messkammer umfasst werden.According to an alternative of the invention, the bottom of the liquid cell in the region of the support of the seal is flat or planar, so in particular has no recess. In the region of the sealing support, the base thus formed is formed, in particular, in a flat and positive manner with the regions of the base on which the sample is applied or which is enclosed by the measuring chamber.

Mit einem so ausgestalteten Boden können auch sehr niedrige Dichtungen verwendet werden. Hier hat sich insbesondere gezeigt, dass beispielsweise Dichtungen aus Teflon (i. e. Polytetrafluorethylen, PTFE), insbesondere in Form von Teflonfolie oder anderen dichtenden, dünnen Materialien, wie beispielsweise Polyethylen, Polyvinylchlorid, Polycarbonat vorteilhaft zum Einsatz kommen können. Die Dicke solcher Folien (und damit die Höhe der resultierenden Dichtung) liegt insbesondere im Bereich weniger Mikrometer, beispielsweise zwischen 50 μm und 500 μm.With a floor designed in this way, even very low seals can be used. In particular, it has been shown that, for example, seals made of Teflon (in the sense of polytetrafluoroethylene, PTFE), in particular in the form of Teflon film or other sealing, thin materials, such as, for example, polyethylene, polyvinyl chloride, polycarbonate, can advantageously be used. The thickness of such films (and thus the height of the resulting seal) is in particular in the range of a few micrometers, for example between 50 μm and 500 μm.

Der Vorteil einer insbesondere ausnehmungslosen Flüssigkeitszelle ist insbesondere die vereinfachte Reinigung der Flüssigkeitszelle bzw. des Bodens, da bekanntermaßen jede Ausnehmung Ablagerungsbereiche für Verunreinigung ausbildet, z. B. an den Kanten.The advantage of a particular recessless liquid cell is in particular the simplified cleaning of the liquid cell or the soil, since, as is known, each recess forms deposit areas for contamination, z. B. at the edges.

Die flachen Dichtungen können auch eine deutlich größere Auflagefläche als die dicken Dichtungen aufweisen, da sie nicht in eine Ausnehmung einfügbar sein müssen. Eine solche vergrößerte Auflagefläche erhöht die mechanische Stabilität der Dichtung, insbesondere im Falle geringer Dichtungsdicken und verbessert die Handhabbarkeit.The flat seals can also have a significantly larger contact surface than the thick seals, since they do not have to be insertable into a recess. Such an enlarged bearing surface increases the mechanical stability of the seal, especially in the case of low sealing thicknesses and improves the handling.

Diese flachen Dichtungen für die ausnehmungslosen bzw. planaren Flüssigkeitszellen erlauben weiterhin in vorteilhafter Weise, von einer flach-zylindrischen Konfiguration des Messvolumens abzuweichen und zum Beispiel flach-quaderförmige Volumina zu verwenden. Letztere erlauben im Falle der Verwendung der Flüssigkeitszelle als Durchflusszelle ein günstigeres Strömungsprofil als Aufbauten, bei denen der Strömungsquerschnitt zum Beispiel in der Mitte zwischen Einlass und Auslass breiter wird, wie es im Falle eines flach-zylindrischen Volumens der Fall wäre.These flat seals for the recessless or planar fluid cells further advantageously allow to deviate from a flat-cylindrical configuration of the measurement volume and to use, for example, flat cuboidal volumes. The latter, in the case of using the liquid cell as a flow cell, allows a more favorable flow profile than constructions in which the flow cross section, for example, becomes wider in the middle between the inlet and the outlet, as would be the case in the case of a flat-cylindrical volume.

Daher ist gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung vorgesehen, dass die Flüssigkeitszelle eine quaderförmige Messkammer aufweist.It is therefore provided according to a further embodiment of the invention that the liquid cell has a cuboid measuring chamber.

Die erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle kann vorteilhaft in Mikroskopen zum Einsatz kommen, die über eine Epi-, oder Auflichtgeometrie bezüglich des Strahlengangs verfügen, bei denen sowohl die Beleuchtung als auch das Messsignal der Probe über die gleiche Linse oder das gleiche Objektiv erfolgt (Epi-Konfiguration). Diese Geometrie erweist sich oftmals als vorteilhaft, da so beispielsweise eine Zulauföffnung und auch eine Ablauföffnung im Boden angeordnet sein kann, der Boden der Flüssigkeitszelle also für Aufgaben, wie beispielsweise der Temperierung oder Durchflusserzeugung zur Verfügung steht, ohne mit der Optik des Mikroskops zu interferieren.The liquid cell according to the invention can advantageously be used in microscopes which have an epi or incident light geometry with respect to the beam path in which both the illumination and the measurement signal of the sample take place via the same lens or the same objective (epi configuration). This geometry often proves to be advantageous because, for example, an inlet opening and a drain opening can be arranged in the ground, the bottom of the liquid cell for tasks such as Temperature control or flow generation is available without interfering with the optics of the microscope.

Die erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle ist vorteilhaft in kombinierten Messapparaten einsetzbar, die in Auflichtgeometrie sowohl Bilderfassung als auch bildgestützte Raman-Spektroskopie durchführen. Eine solche erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle ist aus den Komponenten einfach aufbaubar und kann besonders wirtschaftlich hergestellt werden. Jede Komponente der Flüssigkeitszelle ist insbesondere modular austauschbar.The liquid cell according to the invention can be used advantageously in combined measuring apparatuses which perform both image acquisition and image-assisted Raman spectroscopy in incident light geometry. Such a liquid cell according to the invention can be constructed simply from the components and can be produced particularly economically. Each component of the liquid cell is in particular modular exchangeable.

Gemäß einer Ausführungsform weist der Boden eine Zulauföffnung und eine Ablauföffnung, zum Befüllen, Entleeren, Vakuumieren und/oder Erzeugen eines Durchflusses in der Messkammer, auf, wobei die Zulauf- und/oder die Ablauföffnung insbesondere in einem Bereich des Bodens angeordnet ist/sind, der Teil der Messkammer ist. Diese Öffnungen können weitere Anschlüsse umfassen oder solche Anschlüsse aufweisen.According to one embodiment, the base has an inlet opening and a drain opening, for filling, emptying, vacuuming and / or generating a flow in the measuring chamber, wherein the inlet and / or outlet opening is / are arranged in particular in a region of the floor, which is part of the measuring chamber. These openings may include other connections or have such connections.

Die Zulauf- und Ablauföffnung sind insbesondere zum vergleichsweise schnellen Durchpumpen und/oder Durchdrücken einer größeren Flüssigkeitsmenge ausgebildet. Wobei die Öffnungen für Flüssigkeitsmengen von insbesondere 20 μl bis 100 μl pro Minute ausgelegt sind.The inlet and outlet openings are designed in particular for comparatively fast pumping through and / or pushing through a larger amount of liquid. Wherein the openings are designed for liquid quantities of in particular 20 .mu.l to 100 .mu.l per minute.

Vorteilhaft ist es, wenn die Zulauf und/oder Ablauföffnung so ausgeführt sind, dass Kanülenspitzen mit den Öffnungen verbindbar, anbringbar oder flüssigkeitsschlüssig aufsetzbar sind. Die Öffnungen haben insbesondere einen Durchmesser von einem Millimeter.It is advantageous if the inlet and / or outlet opening are designed so that cannula tips can be connected to the openings connectable, attachable or liquid-fit can be placed. The openings have in particular a diameter of one millimeter.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung weist die reflektierende Oberfläche des Bodens ein Metall oder eine Metalllegierung auf, wobei insbesondere der Boden aus dem Metall oder der Metalllegierung besteht, die Oberfläche und der Boden also einstückig ausgebildet sind.According to one embodiment of the invention, the reflective surface of the bottom comprises a metal or a metal alloy, wherein in particular the bottom of the metal or the metal alloy, the surface and the bottom are thus formed in one piece.

So eignet sich beispielsweise ein Boden aus Edelstahl, der auf der reflektierenden Seite spiegelnd poliert ist. Ein solcher Boden ist in vorteilhafter Weise inert gegenüber den meisten Lösungen, kann leicht gereinigt werden und weist eine besondere Langlebigkeit auf.For example, a base made of stainless steel is mirror-polished on the reflective side. Such a soil is advantageously inert to most solutions, can be easily cleaned and has a particular longevity.

Auf dem reflektierenden Boden kann gegebenenfalls eine Schicht aufgebracht sein, die beispielsweise eine Anlagerung von Suspensionsbestandteilen verhindert oder die reflektierende Oberfläche vor Einflüssen des Lösungsmittels bzw. der Suspension schützt.Optionally, a layer can be applied on the reflective base, which, for example, prevents an accumulation of suspension constituents or protects the reflective surface against influences of the solvent or of the suspension.

Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung ist die reflektierende Oberfläche eine auf dem Boden angeordnete, beispielsweise galvanisch aufgebrachte, aufgedampfte oder aufgeklebte, reflektierende Schicht, wie beispielsweise Gold, Silber und/oder Nickel.In accordance with an alternative embodiment of the invention, the reflective surface is a reflective layer, such as, for example, gold, silver and / or nickel, which is arranged on the floor and is, for example, galvanically applied, vapor-deposited or glued on.

Der Boden kann insbesondere Glas, Quarzglas oder eine glasartiges Substrat aufweisen oder aus Glas, Quarzglas oder dem glasartigen Substrat bestehen, das als Substrat für die reflektierende Schicht dient.The bottom may in particular comprise glass, quartz glass or a vitreous substrate or consist of glass, quartz glass or the vitreous substrate which serves as a substrate for the reflective layer.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die reflektierende Oberfläche semitransparent und insbesondere auf einem transparenten Substrat angeordnet. Das Substrat bildet insbesondere den Boden aus.According to one embodiment of the invention, the reflective surface is semitransparent and in particular arranged on a transparent substrate. The substrate in particular forms the ground.

Das Substrat weist insbesondere Glas, Quarzglas oder galsartige Substanzen auf oder besteht aus Glas, Quarzglas oder glasartigen Substanzen. Der Vorteil von Glas, Quarzglas und glasartigen Substanzen ist der, dass diese Materialen die Eigenschaft besitzen molekular ebene, d. h. sehr flache, Oberflächen auszubilden können, ohne dass aufwendige Veredelungsschritte notwendig wären.The substrate comprises in particular glass, quartz glass or galsartige substances or consists of glass, quartz glass or glassy substances. The advantage of glass, quartz glass and vitreous substances is that these materials possess the property of molecular level, d. H. very flat, surfaces can be formed without complex refining steps would be necessary.

Die Semitransparenz der reflektierende Oberfläche bezieht sich darauf, dass bei einer gegebenen Wellenlänge des Lichtes, die Oberfläche einen Bruchteil des auftreffenden Lichtes reflektiert und für einen anderen Bruchteil des Lichtes transparent ist, d. h. der Reflexionsgrad insbesondere kleiner als 95% ist und der Transmissionsgrad insbesondere größer als 5% ist.The semitransparency of the reflective surface refers to that at a given wavelength of light, the surface reflects a fraction of the incident light and is transparent to another fraction of the light, i. H. the reflectance is in particular less than 95% and the transmittance is in particular greater than 5%.

Gemäß einer Ausführungsform der erfindung ist der Boden, insbesondere, wenn der Boden ein Glassubstrat oder Ähnliches aufweist, auf einem Unterteil angeordnet oder gelagert, wobei das Unterteil insbesondere eine Öffnung oder Ausnehmung insbesondere in der Mitte aufweist, so dass der Boden durch die Öffnung oder Ausnehmung optisch und/oder mechanisch, insbesondere für ein Mikroskopobjektiv zugänglich ist.According to one embodiment of the invention, the bottom, in particular, when the bottom has a glass substrate or the like, arranged or mounted on a lower part, wherein the lower part in particular an opening or recess, in particular in the middle, so that the bottom through the opening or recess optically and / or mechanically, in particular for a microscope objective is accessible.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die semitransparente Oberfläche eine auf dem transparenten Substrat angeordnete, semitransparente Schicht.According to one embodiment of the invention, the semitransparent surface is a semitransparent layer arranged on the transparent substrate.

Eine solche Schicht kann beispielweise ein Metall oder eine Metalllegierung aufweisen, wobei die Schicht insbesondere eine Dicke von 10 nm bis 200 nm, insbesondere eine Dicke zwischen 50 nm bis 150 nm, aufweist.Such a layer may, for example, comprise a metal or a metal alloy, the layer in particular having a thickness of 10 nm to 200 nm, in particular a thickness of between 50 nm and 150 nm.

Die semitransparente Schicht ist insbesondere eine Gold-, Silber- oder Nickelschicht, die insbesondere auf einem Substrat aus Glas oder Quarzglas aufgebracht, aufgedampft oder aufgeklebt ist.The semitransparent layer is in particular a gold, silver or nickel layer which especially applied to a substrate made of glass or quartz glass, vapor-deposited or glued.

Eine solche semitransparente Schicht erlaubt es, sowohl insbesondere durchlichtbasierte Mikroskopieverfahren als auch Ramanspektroskopie auf der gleichen Probe auszuführen, ohne dass eine andere Flüssigkeitszelle verwendet werden muss.Such a semitransparent layer makes it possible to carry out in particular light-based microscopy methods as well as Raman spectroscopy on the same sample without having to use another liquid cell.

Insbesondere kann das Material der semitransparenten Schicht so gewählt werden, dass die Schicht in einem ersten Wellenlängenbereich semitransparent ist und in einem zweiten Wellenlängenbereich des Lichtes überwiegend oder vollständig reflektierend ist, insbesondere einen Reflexionsgrad von mehr als 60% aufweist.In particular, the material of the semitransparent layer can be selected such that the layer is semitransparent in a first wavelength range and is predominantly or completely reflective in a second wavelength range of the light, in particular has a reflectance of more than 60%.

Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn die semitransparente Schicht im Bereich der ramanspektroskopischen Anregung, insbesondere im zweiten Wellenlängenbereich überwiegend reflektierend ist, insbesondere einen Reflexionsgrad von mehr als 60% aufweist und im Wellenlängenbereich eines verwendeten Durchlichtmikroskopie-Verfahrens, insbesondere im ersten Wellenlängenbereich, einen Transmissionsgrad von mindestens 30% aufweist.In particular, it is advantageous if the semitransparent layer in the region of Raman spectroscopic excitation, especially in the second wavelength range is predominantly reflective, in particular has a reflectance of more than 60% and in the wavelength range of a transmitted light microscopy method, in particular in the first wavelength range, a transmittance of at least 30%.

So ermöglicht die erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle ramanspektroskopische Messungen in Epi-Konfiguration und auch Durchlichtmikroskopie, was vorteilhafte Kontrastmechanismen zur optischen Abgrenzung des Partikels vom Hintergrund) eröffnet.Thus, the liquid cell according to the invention allows ramanspektroskopische measurements in epi configuration and also transmitted light microscopy, which opens up advantageous contrast mechanisms for the optical delimitation of the particle from the background).

Bei den schichtbasierten Ausführungsformen ist es beispielsweise auch vorgesehen, dass mehrere Schichten auf den Boden aufgebracht werden, dass beispielsweise eine Goldschicht auf eine Nickelschicht aufgedampft wird. Als oberste Schicht eine solchen Vielzahl an Schichten kann beispielsweise eine funktionelle Molekülschicht angeordnet sein.In the case of the layer-based embodiments, it is also provided, for example, that a plurality of layers are applied to the floor such that, for example, a gold layer is vapor-deposited onto a nickel layer. As the uppermost layer such a plurality of layers, for example, a functional molecular layer may be arranged.

Weiterhin kann die Vielzahl an Schichten auch dazu verwendet werden, optische Filterschichten, wie beispielsweise Bragg-Reflektoren, zu realisieren.Furthermore, the plurality of layers can also be used to realize optical filter layers, such as Bragg reflectors.

Dies schließt auch eine Schicht ein, die wie oben bereits erläutert, beispielsweise eine Anlagerung von Suspensionsbestandteilen verhindert oder die reflektierende Schicht ggf. vor schädlichen Einflüssen der Suspension schützt.This also includes a layer which, as already explained above, for example prevents an accumulation of suspension constituents or optionally protects the reflective layer from harmful influences of the suspension.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die reflektierende Oberfläche im sichtbaren Spektralbereich, insbesondere im Wellenlängenbereich von 300 nm bis 800 nm, insbesondere im Bereich von 210 nm bis 1200 nm durchgehend reflektierend, insbesondere mit einem Reflexionsgrad von mehr als 70%.According to one embodiment of the invention, the reflecting surface is continuously reflecting in the visible spectral range, in particular in the wavelength range from 300 nm to 800 nm, in particular in the range from 210 nm to 1200 nm, in particular with a reflectance of more than 70%.

Diese Variante der Erfindung gewährleistet in vorteilhafter Weise, dass eine erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle in vielen Anwendungen unabhängig von den Anregungs- und Detektionswellenlängen einsetzbar ist.This variant of the invention advantageously ensures that a liquid cell according to the invention can be used in many applications independently of the excitation and detection wavelengths.

Weiterhin lässt sich in vorteilhafterweise eine Dunkelfeldbeleuchtung mit einer solchen reflektierenden Oberfläche realisieren.Furthermore, it is advantageously possible to realize dark-field illumination with such a reflective surface.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, weist die Flüssigkeitszelle ein Andruckelement auf, das so ausgebildet ist, dass die Flüssigkeitszelle im zusammengesetzten Zustand der Erfindung in eine Schiebeführung eingeführt werden kann, wobei das Andruckelement, wenn die Flüssigkeitszelle in die Schiebeführung eingeführt ist, von der Schiebeführung niedergehalten wird, so dass das Andruckelement auf das Messfenster, die Dichtung und den Boden drückt, so dass die Messkammer abgedichtet wird, wobei das Andruckelement mit einem ersten Bereich auf oder oberhalb des Messfensters angeordnet ist und insbesondere mit einem zweiten Bereich auf oder oberhalb des Bodens angeordnet ist.According to a further embodiment of the invention, the liquid cell has a pressure element which is designed so that the liquid cell can be introduced into a sliding guide in the assembled state of the invention, wherein the pressure element, when the liquid cell is inserted into the sliding guide of the sliding guide is held down, so that the pressure element presses on the measuring window, the seal and the bottom, so that the measuring chamber is sealed, wherein the pressure element is arranged with a first region on or above the measuring window and in particular with a second region on or above the bottom is arranged.

Eine solche Flüssigkeitszelle wird im eingeschobenen Zustand flüssigkeits- und/oder gasdicht sein.Such a liquid cell will be liquid and / or gas tight in the inserted state.

Die Schiebeführung wirkt also insbesondere so mit dem Andruckelement und dem Boden zusammen, dass die Flüssigkeitszelle zusammengehalten wird.The sliding guide thus interacts in particular with the pressure element and the floor so that the fluid cell is held together.

Das Andruckelement verwirklicht in vorteilhafter Weise, dass die Flüssigkeitszelle schnell und unkompliziert zusammengebaut werden kann. Durch einfaches sandwichartiges Zusammenfügen der Komponenten und anschließendes Einschieben in eine Schiebeführung kann eine funktionstüchtige Flüssigkeitszelle erhalten werden.The pressure element realized in an advantageous manner that the liquid cell can be assembled quickly and easily. By simply sandwiching the components and then inserting them into a sliding guide, a functional liquid cell can be obtained.

Das Andruckelement ist insbesondere als Haltering ausführbar, so dass darüber hinaus auch im zusammengebauten Zustand der Flüssigkeitszelle eine Messung unter einem Mikroskop möglich ist, da in einem zentralen Bereich des Messfensters die Anregung und Detektion stattfinden kann, die ringförmige Ausgestaltung des Andruckelementes als Haltering also nicht mit der Optik eines Auflicht-Mikroskops interferiert.The pressure element is in particular executable as a retaining ring, so that beyond even in the assembled state of the liquid cell, a measurement under a microscope is possible, since in a central region of the measuring window, the excitation and detection can take place, the annular configuration of the pressure element as a retaining ring so not with the optics of a reflected-light microscope interferes.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist die Flüssigkeitszelle ein Abstandelement auf, wobei das Abstandelement auf dem Boden der Flüssigkeitszelle insbesondere außerhalb der Messkammer auf dem Boden der Flüssigkeitszelle angeordnet ist, wobei das Andruckelement mit dem zweiten Bereich auf dem Abstandselement aufliegt, so dass das Messfenster durch das Andruckelement nur bis auf einen vordefinierten Abstand an den Boden angedrückt werden kann, wobei die Höhe das Abstandselements besagten Abstand des Messfensters vom Boden definiert.According to a further embodiment of the invention, the liquid cell has a spacer element, wherein the spacer element is arranged on the bottom of the liquid cell, in particular outside the measuring chamber on the bottom of the liquid cell, wherein the pressure element rests with the second region on the spacer element, so that the measuring window can be pressed by the pressure element only up to a predefined distance to the ground, wherein the height of the distance element said distance of the measuring window defined by the ground.

Durch das Abstandselement sind insbesondere die Höhe und das Volumen der Messkammer, insbesondere der Abstand des Messfensters zum Boden der Messkammer, insbesondere durch die Höhe des Abstandselements einstellbar.In particular, the height and the volume of the measuring chamber, in particular the distance of the measuring window to the bottom of the measuring chamber, are adjustable by the spacing element, in particular by the height of the spacing element.

Durch das Abstandelement, das beispielsweise eine Unterlegscheibe oder ein Unterlegring sein kann, wird das modulare Prinzip der Flüssigkeitszelle vorteilhaft umgesetzt. Das Abstandselement ist insbesondere nicht fest mit dem Boden verbunden. Dadurch können Abstandelemente verschiedener Höhe verwendet werden, um unterschiedlich hohe Messkammern zu realisieren.By the spacer element, which may be for example a washer or a lower ring, the modular principle of the liquid cell is advantageously implemented. The spacer is in particular not firmly connected to the ground. As a result, spacers of different height can be used to realize different levels of measurement chambers.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist die Flüssigkeitszelle ein Einlageelement auf, wobei das Einlageelement in der Ausnehmung zwischen Boden und Dichtung angeordnet ist, so dass die Dichtung um die Höhe des Einlageelements in der Ausnehmung nach oben verlagert angeordnet ist, insbesondere so dass das Messfenster bei einem durch das Abstandelement vordefinierten Abstand des Messfensters vom Boden bereits so auf der Dichtung aufliegt, dass die Messkammer dicht ist, wobei das Einlageelement insbesondere so dimensioniert ist, dass die Höhe des Einlageelements der Höhe des Abstandelements entspricht, oder um einen festen Betrag in der Höhe des Abstandselements abweicht.According to a further embodiment of the invention, the liquid cell on an insert element, wherein the insert element is arranged in the recess between the bottom and the seal, so that the seal is arranged displaced by the height of the insert element in the recess upwards, in particular so that the measuring window at a predetermined by the spacer element distance of the measuring window from the ground already rests on the seal so that the measuring chamber is sealed, wherein the insert member is dimensioned in particular so that the height of the insert member corresponds to the height of the spacer element, or by a fixed amount in height of the spacer deviates.

Das Einlageelement, sorgt insbesondere dafür, dass eine Dichtigkeit auch für verschieden hohe Abstandselemente erreicht wird.The insert element, in particular ensures that a tightness is achieved even for different height spacers.

Das Einlageelement kann beispielsweise eine Einlegscheibe sein. Das Einlageelement ist insbesondere nicht fest mit dem Boden verbunden und trägt zum modularen Charakter der Erfindung bei.The insert element may for example be an insert. In particular, the insert element is not fixedly connected to the floor and contributes to the modular nature of the invention.

Insbesondere ist ein System vorstellbar, dass neben der Flüssigkeitszelle auch eine Vielzahl an unterschiedlichen Einlageelementen und Abstandelementen umfasst, die je nach Bedarf verwendet werden. Dadurch lässt sich eine Vielzahl an Flüssigkeitszellen realisieren, die in der Höhe und im Volumen der Messkammer variieren.In particular, a system is conceivable that in addition to the liquid cell also includes a plurality of different insert elements and spacers, which are used as needed. As a result, a large number of liquid cells can be realized, which vary in height and in the volume of the measuring chamber.

Insbesondere ist durch die Verwendung unterschiedlicher Abstandselemente und Einlageelemente gewährleistet, dass zum einen die Flüssigkeitsschichtdicke in der Messkammer individuell auf die jeweilige Probe eingestellt werden kann und zum anderen auch das Volumen der Messkammer ausreichend groß oder klein gestaltet werden kann.In particular, it is ensured by the use of different spacer elements and insert elements that on the one hand, the liquid layer thickness can be set individually in the measuring chamber to the respective sample and on the other hand, the volume of the measuring chamber can be made sufficiently large or small.

Das Einlageelement und das Abstandelement sind aufeinander abgestimmt, und zwar insbesondere so, dass ein Bruch durch Druck an den Außenkanten des Messfensters verhindert wird, und dennoch ein dichter Druckverschluss der Messkammer gewährleistet ist. Wie hoch die beiden Elemente im Einzelnen sein müssen ist dem Fachmann bekannt und kann unter anderem von der Tiefe der Ausnehmung, der Höhe der Dichtung und der Dicke des Messfensters abhängen.The insert element and the spacer element are matched to each other, in particular so that a break is prevented by pressure at the outer edges of the measuring window, and yet a tight pressure seal of the measuring chamber is ensured. How high the two elements must be in detail is known to the person skilled in the art and may depend inter alia on the depth of the recess, the height of the seal and the thickness of the measuring window.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist das Messfenster für Licht zumindest im Spektralbereich von 210 nm bis 1200 nm, bevorzugt im Spektralbereich 532 nm bis 785 nm, eine Transmission von größer als 80% auf, wobei das Messfenster insbesondere Quarzglas aufweist.According to a further embodiment of the invention, the measuring window for light, at least in the spectral range from 210 nm to 1200 nm, preferably in the spectral range 532 nm to 785 nm, a transmission of greater than 80%, wherein the measuring window in particular has quartz glass.

Mit einem solchen Messfenster ist es möglich, beispielsweise die Tryptophan-Fluoreszenz anzuregen und zu detektieren.With such a measuring window, it is possible, for example, to stimulate and detect the tryptophan fluorescence.

Das erfindungsgemäße Problem wird weiterhin auch durch ein System das die folgenden Merkmale aufweist gelöst

– eine Haltevorrichtung zum Verschließen und Fixieren einer Flüssigkeitszelle,
– eine erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle,

wobei die Haltevorrichtung eine Schiebeführung aufweist, welche in die Flüssigkeitszelle einschiebbar ist und wobei die Schiebeführung eine Andruckplatte aufweist, die dazu ausgebildet ist, das Messfenster auf die Dichtung zu drücken, wenn die Flüssigkeitszelle in der Haltevorrichtung aufgenommen ist.The problem according to the invention is furthermore solved by a system which has the following features

A holding device for closing and fixing a liquid cell,
A liquid cell according to the invention,

wherein the holding device comprises a sliding guide, which is insertable into the liquid cell, and wherein the sliding guide comprises a pressure plate, which is adapted to press the measuring window on the seal when the liquid cell is received in the holding device.

Das erfindungsgemäße Problem wird weiterhin durch ein Mikroskop mit den folgenden Merkmalen gelöst.The problem of the invention is further solved by a microscope having the following features.

Ein solches Mikroskop weist Mittel zu mikroskopischen Bilderfassung und ramanspektroskopischen Messungen einer Partikelsuspension auf, wobei das Mikroskop ein optisches Auflicht-Mikroskop ist und wobei das Mikroskop eine erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle und insbesondere eine Haltevorrichtung oder insbesondere ein erfindungsgemäßes System aufweist.Such a microscope has means for microscopic image acquisition and Raman spectroscopic measurements of a particle suspension, wherein the microscope is an optical epi-microscope and wherein the microscope has a liquid cell according to the invention and in particular a holding device or in particular a system according to the invention.

Mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop lassen sich in Auflichtgeometrie die vorgenannten Untersuchungen an Partikelsuspensionen durchführen, wobei in vorteilhafter Weise das Signal zu Rauschverhältnis insbesondere im Vergleich zu Flüssigkeitszellen mit einem nicht reflektierenden Substrat, durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle verbessert ist.With the microscope according to the invention, the abovementioned investigations on particle suspensions can be carried out in incident-light geometry, the signal-to-noise ratio, in particular in comparison with liquid cells with a non-reflecting substrate, advantageously being improved by the use of the liquid cell according to the invention.

Ein Mikroskop im Sinne der Erfindung ist ein Lichtmikroskop, das Optiken aufweist, die für den Einsatz insbesondere von 200 nm bis 1200 nm geeignet sind. A microscope according to the invention is a light microscope having optics that are suitable for use in particular from 200 nm to 1200 nm.

Ein Mittel zur mikroskopischen Bilderfassung umfasst beispielsweise ein Objektiv, einen Detektor wie beispielsweise eine Kamera, und/oder eine Lichtquelle, wie beispielsweise einen Laser, eine Halogenlampe oder andere Arten von Lichtquellen, wie Dioden oder Bogenlampen.A means for microscopic image acquisition includes, for example, a lens, a detector such as a camera, and / or a light source such as a laser, a halogen lamp, or other types of light sources such as diodes or arc lamps.

Ein Mittel für ramanspektroskopische Messungen umfasst beispielsweise einen Anregungslaser, einen Punktdetektor, sowie passende Filter für die Raman-Messung.A means for Raman spectroscopic measurements includes, for example, an excitation laser, a point detector, as well as suitable filters for the Raman measurement.

In einer Ausführungsform der Erfindung weist das Mikroskop Mittel auf, die eine Dunkelfeldbeleuchtung der Probe in der Flüssigkeitszelle ermöglichen, wobei der reflektierende Boden der Flüssigkeitszelle als Reflektor für die eingestrahlte Dunkelfeldbeleuchtung dient.In one embodiment of the invention, the microscope has means enabling a dark field illumination of the sample in the liquid cell, wherein the reflective bottom of the liquid cell serves as a reflector for the irradiated dark field illumination.

Ein solches Mittel zur Dunkelfeldbeleuchtung weist beispielsweise ein spezielles Dunkelfeld-Objektiv auf, mit dem eine solche Dunkelfeldbeleuchtung in Auflicht-Geometrie durchgeführt werden kann.Such a means for dark field illumination, for example, has a special darkfield lens, with which such a dark field illumination can be performed in incident light geometry.

Die Dunkelfeldbeleuchtung hat dabei den Vorteil, dass für gewisse Proben und Partikel Suspensionen ein höherer Bildkontrast erreicht werden kann. Insbesondere Proben, deren Brechungsindex sich nur wenig von dem Lösungsmittel unterscheidet, können mit Hilfe der Dunkelfeldbeleuchtung und der erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle vorteilhaft detektiert und vermessen werden.The dark field illumination has the advantage that for certain samples and particle suspensions a higher image contrast can be achieved. In particular, samples whose refractive index differs only slightly from the solvent can be advantageously detected and measured with the aid of the dark field illumination and the liquid cell according to the invention.

Dabei ist die Kombination von Dunkelfeldbeleuchtung mit dem reflektierenden Oberfläche des Bodens der Flüssigkeitszelle besonders vorteilhaft, da die reflektierende Oberfläche des Bodens die Dunkelfeldbeleuchtung reflektiert, so dass möglichst wenig Streulicht vom Boden in das Objektiv zurückgestreut wird, was zu einem erhöhten Bildkontrast und damit zu einer besseren Identifizierung von Partikeln in einer Suspension führt.In this case, the combination of dark-field illumination with the reflective surface of the bottom of the liquid cell is particularly advantageous because the reflective surface of the floor reflects the dark field illumination, so that as little stray light from the ground is scattered back into the lens, resulting in an increased image contrast and thus to a better Identification of particles in a suspension leads.

Die Oberflächengüte ist bei der Dunkelfeldbeleuchtung sehr wichtig, da bereits geringe Unebenheiten ein Signal bewirken, welches nicht unbedingt von dem zu unterscheiden ist, welches ein Partikel, der auf der Oberfläche liegt, erzeugt.The surface quality is very important in dark field lighting, since even small bumps cause a signal that is not necessarily different from that which generates a particle lying on the surface.

Um Strukturen/Partikel gut zu erfassen sollte die Oberflächenrauheit nicht in derselben Größenordnung sein, wie das Partikel selbst. Da erfindungsgemäß Partikel im Submikrometerbereich oder im Mikrometerbereich spektroskopiert werden sollen, ist die Oberflächenrauheit entsprechend geringer, also insbesondere im Nanometer oder Subnanometerbereich.In order to capture structures / particles well, the surface roughness should not be of the same order of magnitude as the particle itself. Since particles according to the invention are to be spectroscopically measured in the submicrometer range or in the micrometer range, the surface roughness is correspondingly lower, in particular in the nanometer or subnanometer range.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden nachfolgend anhand der Figurenbeschreibung von Ausführungsbeispielen erläutert. Die Figurenbeschreibung dient lediglich der Illustration einiger Ausführungsbeispiele und ist nicht als abschließende Offenbarung aller möglichen Ausführungsformen der Erfindung zu verstehen. Einzelne Merkmale die nur in Zusammenhang der Ausführungsbeispiele offenbart sind, können jedoch über die beispielhafte Offenbarung auch als Merkmale in den Ansprüchen verwendet werden, sofern sie nicht im Widerspruch zu anderen Merkmalen des Anspruchs stehen. Es zeigen:Further features and advantages of the invention will be explained below with reference to the description of the figures of exemplary embodiments. The description of the figures is merely illustrative of some embodiments and should not be taken as a final disclosure of all possible embodiments of the invention. However, individual features disclosed only in connection with the embodiments may also be utilized as features of the claims through the exemplary disclosure provided they do not conflict with other features of the claim. Show it:

1 eine schematische Abbildung eines Schnitts durch eine erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle; 1 a schematic illustration of a section through a liquid cell according to the invention;

2 eine schematische Abbildung eines Schnitts durch eine Variante der erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle; 2 a schematic illustration of a section through a variant of the liquid cell according to the invention;

3 verschiedene Darstellungen einer Haltevorrichtung mit einer Flüssigkeitszelle; 3 various representations of a holding device with a liquid cell;

4 Diagramm zur Wirkung einer reflektierenden Oberfläche auf ein Ramansignal; 4 Diagram of the effect of a reflecting surface on a Raman signal;

5 eine Ausführungsform der Flüssigkeitszelle ohne Einlageelement; 5 an embodiment of the liquid cell without insert element;

6 Bildfolge, die das Zusammensetzen einer erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle darstellt; 6 Image sequence illustrating the assembly of a liquid cell according to the invention;

7 eine schematische Abbildung eines Schnitts durch eine Variante der erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle; und 7 a schematic illustration of a section through a variant of the liquid cell according to the invention; and

8 verschiedene Ansichten einer erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle, die zur Durchlicht Mikroskopie geeignet ist. 8th different views of a liquid cell according to the invention, which is suitable for transmitted light microscopy.

In 1 und 2 ist ein Schnitt entlang der z-Achse z (Richtung der Höhe und Raman-Anregung) durch eine erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle 1 abgebildet. Die Flüssigkeitszelle 1 weist einen Boden 3 mit einer reflektierenden Oberfläche 4, 40 auf, wobei der Boden 3 eine Ausnehmung 8 umfasst, in die eine Dichtung 6, hier in Form eines O-Rings, eingesetzt ist. Zwischen Dichtung 6 und der Ausnehmung 8 ist ein Einlageelement 20, hier in Form einer Einlegescheibe, angeordnet. Die Ausnehmung 8 ist in diesem Beispiel in Form einer Nut ausgebildet. Auf der Dichtung 6 ist ein Messfenster 5 angeordnet. Der von der Dichtung 6, dem Messfenster 5 und dem Boden 3 eingeschlossene Raum bildet eine Messkammer 2.In 1 and 2 is a section along the z-axis z (direction of height and Raman excitation) through a liquid cell according to the invention 1 displayed. The liquid cell 1 has a floor 3 with a reflective surface 4 . 40 on, taking the floor 3 a recess 8th includes, in which a seal 6 , here in the form of an O-ring, is used. Between seal 6 and the recess 8th is an insert element 20 , here in the form of an insert disc arranged. The recess 8th is formed in this example in the form of a groove. On the seal 6 is a measurement window 5 arranged. The one of the seal 6 , the measurement window 5 and the floor 3 enclosed space forms a measuring chamber 2 ,

Ein Abstandselement 21 in Form einer Unterlegscheibe ist außerhalb der Messkammer 2 angeordnet, wobei das Abstandselement 21 in der Höhe (also entlang der z-Achse) so bemessen ist, dass einerseits die Dichtungswirkung über das Anpressen des Messfensters 5 auf die Dichtung 6 gewährleistet ist und andererseits auch gewährleistet ist, dass der Druck, der durch ein Andruckelement 9 in Kombination mit einer Schiebeführung 201) auf das Messfenster 5 vermittelt werden kann, nicht zu einem Bruch des Messfensters 5 führt. Mit anderen Worten, wird die tiefste Position des Andruckelements 9 im Bezug auf die z-Achse durch das Abstandselement 21 definiert. Der Boden 3 der Messkammer 2 weist zudem eine Zulauf- und eine Ablauföffnung 71, 72 auf. Durch diese Öffnungen 71, 72 kann eine Probenflüssigkeit ausgetauscht werden oder die Messkammer 2 gereinigt werden, ohne die Flüssigkeitszelle 1 auseinanderzubauen. A spacer 21 in the form of a washer is outside the measuring chamber 2 arranged, wherein the spacer element 21 in height (ie along the z-axis) is dimensioned so that on the one hand, the sealing effect on the pressing of the measuring window 5 on the seal 6 is guaranteed and on the other hand, it is ensured that the pressure by a pressure element 9 in combination with a sliding guide 201 ) on the measurement window 5 can not be mediated, not to a break of the measurement window 5 leads. In other words, the lowest position of the pressure element 9 with respect to the z-axis through the spacer 21 Are defined. The floor 3 the measuring chamber 2 also has an inlet and a drain opening 71 . 72 on. Through these openings 71 . 72 a sample liquid can be exchanged or the measuring chamber 2 be cleaned without the liquid cell 1 disassemble.

Die Flüssigkeitszelle 1 besteht aus nur wenigen Komponenten und ist modular aufgebaut (siehe 6), das heißt sie kann leicht gereinigt werden. Darüberhinaus können durch den modularen Aufbau die einzelnen Komponenten leicht ersetzt werden und für spezifische Anwendungen angepasst werden. Die Flüssigkeitszelle 1 ist so ausgelegt, dass die Schichtdicke der zu untersuchenden Probenlösung oder Suspension optimal für die Erkennung und bildgestützte Ramananalyse von Partikeln in Proteinformulierung ist. Weiterhin ist die Flüssigkeitszelle in den aufgeführten Beispielen kreisrund entlang der x-z Ebene ausgeführt. Andere Grundformen sind aber ohne weiteres denkbar und sollen hier nicht ausgeschlossen sein.The liquid cell 1 consists of only a few components and has a modular structure (see 6 ), which means it can be easily cleaned. Moreover, the modular design allows the individual components to be easily replaced and adapted for specific applications. The liquid cell 1 is designed so that the layer thickness of the sample solution or suspension to be tested is optimal for the detection and image-aided Raman analysis of particles in protein formulation. Furthermore, in the examples listed, the liquid cell is circular along the xz plane. Other basic forms are conceivable without further ado and should not be excluded here.

Der Boden 3 der Flüssigkeitselle 1 ist aus Edelstahl gefertigt. Er ist somit rostfrei, haltbar und tritt nicht mit der Probe in Wechselwirkung (inert). Der Boden 3 aus Edelstahl ist besonders gut zu reinigen.The floor 3 the liquid level 1 is made of stainless steel. It is thus stainless, durable and does not interact with the sample (inert). The floor 3 made of stainless steel is particularly easy to clean.

In 1 ist die Edelstahloberfläche 4 des Bodens 3 geschliffen und/oder poliert. Damit wird eine hochgradig ebene und auf Nanometer-Ebene glatte, reflektierende Oberfläche 4 bereitgestellt. Die Rauheit kann hierbei anhand der sogenannten RZ-Zahl charakterisiert werden. Vorteilhaft ist eine RZ-Zahl von kleiner als 0,1, bevorzugt kleiner als 0,01.In 1 is the stainless steel surface 4 of the soil 3 sanded and / or polished. This results in a highly level, and on the nanometer level smooth, reflective surface 4 provided. The roughness can be characterized by the so-called RZ number. An RZ number of less than 0.1, preferably less than 0.01, is advantageous.

In 2 ist eine Variante der Flüssigkeitszelle 1 abgebildet. Hier weist der Boden 3 auf Seite der Messkammer 2 eine reflektierende Schicht 40 als reflektierende Oberfläche 4 auf, die aus einem anderen Material als der Boden 3 gefertigt ist. Dies kann beispielsweise eine dünne Gold-, Silber- oder Nickelschicht sein, die auf einen Objektträger aufgedampft wurde. So kann je nach Anregungswellenlänge und zu messende Probe eine anderes reflektierendes Material verwendet werden. Zudem kann so eine kostengünstige Einwegvariante des Bodens 3 bereitgestellt werden. Auch hier ist die RZ-Zahl keiner als 0,1.In 2 is a variant of the fluid cell 1 displayed. Here is the floor 3 on the side of the measuring chamber 2 a reflective layer 40 as a reflective surface 4 on, made of a different material than the ground 3 is made. This may be, for example, a thin layer of gold, silver or nickel vapor deposited on a slide. Thus, depending on the excitation wavelength and the sample to be measured, another reflective material may be used. In addition, such a cost-effective disposable variant of the soil 3 to be provided. Again, the RZ number is none than 0.1.

Eine weitere Variante der Flüssigkeitszelle ist in 5 abgebildet, einmal als reiner Schnittansicht und auch als Halbschnitt. Die Bezugszeichen und Anordnung der Komponenten sind im Wesentlichen gleich zu den Varianten in 1 und 2. Im Unterschied zu 1 und 2 weist die Flüssigkeitszelle in 5 jedoch kein Einlageelement 20 auf. Bei dieser Variante ist das Abstandelement 21, die Dicke der Dichtung 6 und die Nuttiefe (Ausnehmung 8) genau so gewählt, dass auf das Einlageelement 20 verzichtet werden kann.Another variant of the fluid cell is in 5 shown, once as a pure sectional view and also as a half-cut. The reference numerals and arrangement of the components are substantially equal to the variants in 1 and 2 , In contrast to 1 and 2 points the liquid cell in 5 but no insert element 20 on. In this variant, the spacer element 21 , the thickness of the seal 6 and the groove depth (recess 8th ) just chosen so that on the insert element 20 can be waived.

In 7 ist ein Schnitt entlang der z-Achse z (Richtung der Höhe und Raman-Anregung) durch eine erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle 1 abgebildet. Die Flüssigkeitszelle 1 weist einen Boden 3 mit einer reflektierenden Oberfläche 40 auf, wobei der Boden 3 aus einem transparenten Substrat, nämlich Glas gefertigt ist und die reflektierende Oberfläche semitransparent ist, d. h. eine Metallschicht von nur 50 nm aufweist. Im Unterschied zu den Beispielen aus 1 und 2 weist der Boden keine Ausnehmung auf, in die die Dichtung 6 eingelegt ist, sondern ist im Bereich der Auflagefläche der Dichtung 6 plan. Die Dichtung 6 ist aus einer Teflon Folie gefertigt und nur 100 μm hoch, so dass keine Ausnehmung benötigt wird. Mit dieser Flüssigkeitszelle kann aufgrund des transparenten Bodens 3 und der semitransparenten Metallschicht sowohl Ramanspektroskopie in Epi-Konfiguration als auch Durchlichtmikroskopie durchgeführt werden, ohne dass die Vorteile der reflektierenden Flüssigkeitszelle für die Ramanspektroskopie merklich beinträchtig würden.In 7 is a section along the z-axis z (direction of height and Raman excitation) through a liquid cell according to the invention 1 displayed. The liquid cell 1 has a floor 3 with a reflective surface 40 on, taking the floor 3 is made of a transparent substrate, namely glass and the reflective surface is semitransparent, ie has a metal layer of only 50 nm. Unlike the examples from 1 and 2 the bottom has no recess into which the seal 6 is inserted, but is in the region of the bearing surface of the seal 6 plan. The seal 6 is made of a Teflon film and only 100 microns high, so that no recess is needed. With this liquid cell can due to the transparent soil 3 and the semitransparent metal layer, both Raman spectroscopy in epi configuration and transmitted light microscopy could be performed without appreciably affecting the advantages of the reflective liquid cell for Raman spectroscopy.

In 8 ist eine weitere Ausführungsform der Erfindung in verschiedenen Ansichten dargestellt. Im Einzelnen ist in A) eine Schnittansicht durch die Flüssigkeitszelle 1, in B) eine vergrößerte Detailansicht der Schnittansicht A), in C) eine perspektivische Schnittansicht von unterhalb der Flüssigkeitszelle 1 und in D) eine perpektivische Schnittansicht der Flüssigkeitszelle 1 von schräg oben dargestellt.In 8th a further embodiment of the invention is shown in different views. In detail, in A) is a sectional view through the liquid cell 1 , in B) an enlarged detail view of the sectional view A), in C) is a perspective sectional view from below the liquid cell 1 and in D) a perspective sectional view of the fluid cell 1 shown diagonally from above.

Diese Ausfüghrungsform weist einen Boden 3 auf, der eine 50 nm dicke und daher semitransparente Goldschicht auf einem Glassubstrat umfasst. Der Boden ist auf einem Unterteil 30 angeordnet, wobei das Unterteil aus einem Metall gefertigt ist und in der Mitte eine Ausnehmung 31 aufweist, so dass der der Boden auch von unten insbesondere für ein Mikroskop-Objektiv optisch sowie mechanisch zugänglich ist. Diese Ausführungsform ist daher besonders geeignet, um die Flüssigkeitszelle 1 auch im Durchlicht zu mikroskopieren.This embodiment has a bottom 3 which comprises a 50 nm thick and therefore semitransparent gold layer on a glass substrate. The floor is on a lower part 30 arranged, wherein the lower part is made of a metal and in the middle of a recess 31 has, so that the bottom is optically and mechanically accessible from below, in particular for a microscope objective. This embodiment is therefore particularly suitable for the liquid cell 1 also in transmitted light to microscopy.

Das Messfenster 5 wird wie in den anderen dargestellten Ausführungsformen durch ein Andruckelement 9 mit dem Unterteil und dem Boden verbunden, insbeosndere wenn die Flüssigkeitszelle eine dafür vorgesehene Halterung eingeführt wird, die das Andruckelement und den Boden aneinander drückt.The measurement window 5 is as in the other illustrated embodiments by a presser 9 connected to the lower part and the bottom, insbeosndere when the liquid cell a designated holder is introduced, which presses the pressure element and the ground together.

Zwischen Messfenster 5 und Boden ist am Rand eine dünne Teflonfolie angeordnet, die als Dichtung 6 der Flüssigkeitszelle 1 dient.Between measurement window 5 and bottom is a thin Teflon film arranged on the edge, which serves as a seal 6 the liquid cell 1 serves.

Weiterhin können an der Flüssigkeitszelle auch ein Zu- und Ablauföffnungen angeordnet sein (nicht dargestellt), die beispielsweise als Öffnungen im Boden realisiert sein können.Furthermore, an inlet and outlet openings (not shown) can be arranged on the liquid cell, which can be realized for example as openings in the ground.

Die folgenden Ausführungen gelten, sofern in der jeweiligen Ausführungsform realisierbar, entsprechend für alle Ausführungsbeispiele der Flüssigkeitszelle 1.The following statements apply, provided that they can be realized in the respective embodiment, correspondingly for all embodiments of the liquid cell 1 ,

Durch den Spiegeleffekt der reflektierenden Oberfläche 4, 40 wird das Anregungslicht, beispielswiese der Licht des Anregungslasers, zweimal durch die Probe geleitet, und führt so zu einem idealerweise doppelt so hohen Ramansignal. Weiterhin verursacht die reflektierende Oberfläche und im Gegensatz zu vielen anderen Materialien wie Glas kein Untergrundsignal (1 und 2).Through the mirror effect of the reflective surface 4 . 40 For example, the excitation light, for example the light from the excitation laser, is passed twice through the sample, thus resulting in an ideally twice as high Raman signal. Furthermore, the reflective surface and unlike many other materials such as glass does not cause a background signal ( 1 and 2 ).

Die Bildgebung erfolgt durch ein zumindest im sichtbaren Bereich des Spektrums transparentes Messfenster 5, wobei sich der transparente Bereich bis in den nahen Infrarot-Bereich (bis ca. 1000 nm) und ultra-violetten Bereich (bis ca. 210 nm) erstrecken kann. Ein Set von verschiedenen Messfenstern 5 kann in die Flüssigkeitszelle 1 eingesetzt werden, so dass für jede Messung ein Messfenster 5 mit optimaler Dicke und Transmission bereitgestellt werden kann.The imaging is performed by a transparent at least in the visible region of the spectrum measurement window 5 , wherein the transparent region may extend into the near infrared region (up to about 1000 nm) and ultraviolet region (up to about 210 nm). A set of different measurement windows 5 can in the liquid cell 1 be used, so that for each measurement a measurement window 5 can be provided with optimum thickness and transmission.

Als Messfenster 5 wird beispielsweise eine transparente Scheibe aus Quarzglas, Gorillaglas, Lotusglas oder Willowglas mit einem Durchmesser von ca. 50 mm verwendet. Die Dicke des Messfensters 5 beträgt ungefähr 500 μm und ist somit einerseits stabil genug um Verformungen und Bruch durch Druck zu widerstehen, andererseits ausreichend dünn, um optische Aberrationen und damit eine Verschlechterung der Bildgebung und Spektroskopie zu minimieren.As a measurement window 5 For example, a transparent disk of quartz glass, gorilla glass, lotus glass or willow glass with a diameter of about 50 mm is used. The thickness of the measurement window 5 is about 500 microns, and thus on the one hand stable enough to withstand deformation and breakage by pressure, on the other hand sufficiently thin to minimize optical aberrations and thus a deterioration of imaging and spectroscopy.

Für eine Anregung der Tryptophan Autofluoreszenz mit 266 nm wird bevorzugt ein Messfenster 5 aus Quarz verwendet, welches sowohl im UV als auch im sichtbaren Spektralbereich transparent ist.For a stimulation of tryptophan autofluorescence at 266 nm, a measurement window is preferred 5 made of quartz, which is transparent in the UV as well as in the visible spectral range.

Die Schichtdicke der Suspension kann durch den Abstand des Bodens 3 zum Messfenster 5 zwischen 50 μm und 500 μm eingestellt werden. In diesem Bereich ist einerseits eine gute Fokussierung auf die Probenpartikel möglich, andererseits ist das Untergrundsignal durch Ramananregung des Fenstermaterials gering.The layer thickness of the suspension can be determined by the distance of the soil 3 to the measurement window 5 be set between 50 microns and 500 microns. In this area, on the one hand a good focus on the sample particles is possible, on the other hand, the background signal is low by Raman excitation of the window material.

Materialien, welche die Messkammer 2 ausbilden, sind alle hochgradig inert.Materials that the measuring chamber 2 are all highly inert.

Der Außendurchmesser der ringförmigen Nut (entspricht in diesem Beispiel der Ausnehmung 8) beträgt 45 mm, wodurch die abbildbare Fläche der Messkammer 2 definiert ist. Die Nuttiefe beträgt 1,7 mm. In die Nut wird zunächst eine Einlegscheibe als Einlageelement 20 eingelegt auf die dann die Dichtung 6 aufgelegt wird. Die Schichtdicke der zu untersuchenden Flüssigkeit liegt zwischen 50 μm (ohne Einlegscheibe oder sehr geringe Höhe der Einlegscheibe) und 500 μm (Einlegscheibe ist 500 μm hoch) und wird über die Höhe des Abstandselements 21 bestimmt, wobei die Höhe des Einlageelements 20, hier also der Einlegscheibe entsprechend angepasst wird, so dass die Messkammer dicht ist. Das zu untersuchende Probenvolumen wird also auch durch die Höhe des Abstandelements 21 bestimmt und beträgt somit zwischen 80 μl und 800 μl. Der O-Ring 6 weist PTFE oder Viton auf, welches lösungsmittelbeständig ist und nicht mit der zu untersuchenden Flüssigkeit in Wechselwirkung tritt. Der O-Ring hat eine Schnurdicke (Höhe) von 2 mm. Nuttiefe und O-Ringdicke bleiben im Wesentlichen gleich. Das Einlageelement 20 ist der Höhe nach der dem Abstandselement 21 angepasst.The outer diameter of the annular groove (corresponds to the recess in this example 8th ) is 45 mm, which makes the imageable surface of the measuring chamber 2 is defined. The groove depth is 1.7 mm. In the groove is first an insert as insert element 20 then put on the seal 6 is hung up. The layer thickness of the liquid to be examined is between 50 μm (without washer or very small height of the washer) and 500 μm (washer is 500 μm high) and is over the height of the spacer element 21 determined, the height of the insert element 20 , Here so the washer is adjusted accordingly, so that the measuring chamber is tight. The sample volume to be examined is therefore also determined by the height of the spacer element 21 determined and is thus between 80 ul and 800 ul. The O-ring 6 has PTFE or Viton, which is resistant to solvents and does not interact with the fluid under investigation. The O-ring has a cord thickness (height) of 2 mm. Groove depth and O-ring thickness remain essentially the same. The insert element 20 is the height of the spacer element 21 customized.

Zusammenbau der FlüssigkeitszelleAssembly of the fluid cell

In 6 ist der Zusammenbau einer erfindungsgemäßen Flüssigkeitszelle als Bildfolge dargestellt. Beginnend bei A) werden die Schritte des Zusammenbaus alphabetisch bis F) vollzogen, um zur zusammengebauten Flüssigkeitszelle zu gelangen.

A) Alle Einzelteile der modularen Flüssigkeitszelle sind noch nicht zusammengefügt sondern liegen vereinzelt vor. In diesem Beispiel sind das, der Boden 3, das Messfenster 5 (hier mit einer gestrichelten Umrandung dargestellt), eine Einlegscheibe als Einlageelement 20, ein Unterlegscheibe als Abstandselement 21, eine Dichtung 6, sowie eine Andruckelement 9. Der Boden weist in diesem Beispiel keine Zulauf- und Ablauföffnung auf. Alternativ ist aber auch ein Boden 3 mit diesen Öffnungen 71, 72 denkbar.
B) Die Einlegescheibe 20 wird in die Ausnehmung 8 des Bodens 3 eingelegt.
C) Sodann wird die Dichtung 6 auf die Einlegscheibe in der Ausnehmung 8 des Bodens 3 gelegt.
D) Anschließend wird das Abstandselement 21 auf den Boden 3 gelegt.
E) Sodann wird das Messfenster 5 auf die Dichtung 6 gelegt.
F) Dann wird das Andruckelement 9 auf das Messfenster 5 und das Abstandselement 21 gelegt.

In 6 the assembly of a liquid cell according to the invention is shown as a sequence of images. Beginning at A), the steps of assembly are performed alphabetically to F) to arrive at the assembled liquid cell.

A) All individual parts of the modular liquid cell are not yet joined but are isolated. In this example, that's the ground 3 , the measurement window 5 (shown here with a dashed border), an insert as insert element 20 , a washer as a spacer 21 , a seal 6 , as well as a pressure element 9 , The bottom has in this example no inlet and outlet opening. Alternatively, it is also a floor 3 with these openings 71 . 72 conceivable.
B) The insert disc 20 gets into the recess 8th of the soil 3 inserted.
C) Then the seal 6 on the washer in the recess 8th of the soil 3 placed.
D) Subsequently, the spacer element 21 on the ground 3 placed.
E) Then the measuring window 5 on the seal 6 placed.
F) Then the pressure element 9 on the measurement window 5 and the spacer 21 placed.

In diesem zusammengebauten Zustand, ist die Flüssigkeitszelle 1 in eine Haltevorrichtung 200 mit Schiebeführung 201 einschiebbar. Die Haltevorrichtung 200 ist auf einem Mikroskoptisch 203 angeordnet. Weiterhin umfasst die Haltevorrichtung 200 im Bereich der Schiebführung 201 eine Andruckplatte 202, die dazu ausgebildet ist, Druck auf die Seiten einer eingeschobenen Flüssigkeitszelle 1 in der Schiebeführung 201 auszuüben. Diese beiden Komponenten bilden das erfindungsgemäße System. In this assembled state, the fluid cell is 1 in a holding device 200 with sliding guide 201 insertable. The holding device 200 is on a microscope stage 203 arranged. Furthermore, the holding device comprises 200 in the area of the sliding guide 201 a pressure plate 202 , which is adapted to pressure on the sides of an inserted liquid cell 1 in the sliding guide 201 exercise. These two components form the system according to the invention.

In 3 ist das System aus Haltevorrichtung 200 mit eingeschobener Flüssigkeitszelle 1 abgebildet. Die Schiebeführung 201 greift bereichsweise um das Andruckelement 9. Der Boden 3 wird durch die Andruckplatte 202 in der Schiebeführung 201 nach oben gedrückt (Richtung z-Achse) an die obere Führung gedrückt, so dass das Andruckelement 9 die Flüssigkeitszelle 1 abdichtet und die Flüssigkeitszelle 1 stabil zusammengesetzt bleibt.In 3 is the system of holding device 200 with inserted liquid cell 1 displayed. The sliding guide 201 In some areas, it engages around the pressure element 9 , The floor 3 is through the pressure plate 202 in the sliding guide 201 pressed upward (direction z-axis) pressed against the upper guide, so that the pressure element 9 the fluid cell 1 seals and the liquid cell 1 remains stable.

In 3 weist der Boden 3 eine Zulauf- und eine Ablauföffnung 71, 72 auf.In 3 points the ground 3 an inlet and a drain opening 71 . 72 on.

Handhabung/Befüllung der FlüssigkeitszelleHandling / filling of the liquid cell

Die Befüllung der Flüssigkeitszelle 1 mit Probenflüssigkeit kann bei geöffneter (mit offenem oder ohne Messfenster 5) Flüssigkeitszelle 1 oder bei geschlossener Flüssigkeitszelle 1 (mit geschlossenem aufliegendem Messfenster 5) erfolgen. Bei geschlossener Flüssigkeitszelle 1 ist die Probenflüssigkeit über die Zulauf- 71 und Ablauföffnung 72 einfüllbar bzw. abziehbar.The filling of the liquid cell 1 with sample liquid can be opened (with open or without measuring window 5 ) Liquid cell 1 or with closed liquid cell 1 (with closed resting measuring window 5 ) respectively. With closed liquid cell 1 is the sample liquid via the inlet 71 and drain opening 72 fillable or removable.

Die Zulauf- 71 und Ablauföffnung 72 sind dabei im Boden 3 der Flüssigkeitszelle 1 so angeordnet, dass die Messkammer 2 befüllt und entlüftet werden kann. Über die Ablauföffnung 72 kann ein Unterdruck in der Messkammer 2 erzeugt werden, der ein blasenfreies Füllen der Messkammer 2 ermöglicht. Dadurch wird vermieden, dass Luft oder Gasblasen in der Suspension die automatische Partikelerkennung verfälschen. Die Befüllung der Messkammer 2 erfolgt beispielsweise mit einer Pipette/Pipettenspitze oder durch den Anschluss von Schläuchen über ein Luer System.The feed 71 and drain opening 72 are in the ground 3 the liquid cell 1 so arranged that the measuring chamber 2 can be filled and vented. About the drain hole 72 can be a negative pressure in the measuring chamber 2 produced, the bubble-free filling of the measuring chamber 2 allows. This avoids that air or gas bubbles in the suspension distort the automatic particle recognition. The filling of the measuring chamber 2 takes place, for example, with a pipette / pipette tip or by connecting hoses via a Luer system.

Die Bildgebung erfolgt sodann in Auflichtgeometrie des Mikroskops. Die gesamte Fläche der Messkammer 2 kann abgebildet werden. Die Partikelerkennung erfolgt dabei beispielsweise automatisch durch einen Algorithmus.The imaging then takes place in incident light geometry of the microscope. The entire surface of the measuring chamber 2 can be pictured. The particle recognition takes place for example automatically by an algorithm.

Mikroskopmicroscope

Ein geeignetes Mikroskop weist für die Bilderfassung und Partikelerkennung ein 10× (typische NA 0,25) oder 20× Objektiv (typische NA 0,45) auf. Die entsprechenden Schärfentiefen liegen bei ca. 20 μm bzw. ca. 5 μm. Die Bilderfassung erfolgt dabei vorzugsweise mit Dunkelfeld-Beleuchtung die aufgrund der glatten, reflektierenden Oberfläche 4 des Bodens 3 möglich ist. Dadurch wird ein höherer Kontrast zwischen Partikeln und Hintergrund erreicht, der die automatische computergestützte Partikelerkennung verbessert.A suitable microscope has a 10x (typical NA 0.25) or 20x objective (typical NA 0.45) for image acquisition and particle detection. The corresponding depths of field are about 20 μm or about 5 μm. The image capture is preferably done with dark field illumination due to the smooth, reflective surface 4 of the soil 3 is possible. This achieves a higher particle-to-background contrast that enhances automatic computer-aided particle detection.

Insbesondere bei der Ausführung der Flüssigkeitszelle 1 mit variabler Schichtdicke können so die Bedingungen für unterschiedlich große Partikel jeweils optimiert werden. Für kleine Partikel wird eine geringe Schichtdicke eingestellt und das 20× Objektiv verwendet, für größere eine große Schichtdicken und das 10× Objektiv.In particular, in the execution of the liquid cell 1 With variable layer thickness, the conditions for differently sized particles can be optimized in each case. For small particles, a small layer thickness is set and the 20 × objective used, for larger a large layer thicknesses and the 10 × objective.

Unabhängig von dem verwendeten Objektiv kann bei Verwendung eines im UV transmittierenden Messfensters 5 die Bilderfassung über die Tryptophan Autofluoreszenz erfolgen.Regardless of the lens used, when using a measuring window transmitting in the UV 5 Image capture via tryptophan autofluorescence.

Die Partikel werden durch automatisierte, bildgestützte Ramanspektroskopie analysiert. Dazu wird ein Laser mit der Wellenlänge 532 nm verwendet, die von Proteinen stark gestreut wird. Die Einstrahlung des Laserlichts sowie die Detektion des Ramansignals können durch ein 50× oder 100× Objektiv erfolgen.The particles are analyzed by automated, image-based Raman spectroscopy. For this purpose, a laser with the wavelength 532 nm is used, which is strongly scattered by proteins. The irradiation of the laser light and the detection of the Raman signal can be done through a 50 × or 100 × objective.

In 4 ist die Wirkung einer reflektierenden Nickel-Oberfläche 101 im Vergleich zu einem Substrat aus Gorillaglas 102 auf ein gemessenes Ramansignal 103, 104 dargestellt.In 4 is the effect of a reflective nickel surface 101 compared to a gorilla glass substrate 102 on a measured Raman signal 103 . 104 shown.

In der oberen linken Ecke des Diagramms ist ein mikroskopisches Bild der Nickel-Oberfläche 101 sowie eine Abbildung einer Gorillaglas Oberfläche eingefügt. Die Bilder sind annähernd gleich im Kontrast, so dass bei der Bilderfassung keine Unterschiede feststellbar sind. Die im Hellfeld in der Flüssigkeitszelle aufgenommenen Bilder zeigen die Positionen jeweils eines vergleichbaren Partikels, an dem die jeweiligen Ramanspektren aufgenommen wurden.In the upper left corner of the diagram is a microscopic image of the nickel surface 101 as well as a picture of a gorilla glass surface inserted. The images are approximately the same in contrast, so that no differences can be detected during image acquisition. The images recorded in the bright field in the liquid cell show the positions of a respective comparable particle on which the respective Raman spectra were recorded.

Eine Ramanmessung 103, 104 der Proteine, zeigt allerdings deutlich Unterschiede. Das gemessene Ramansignal 104 auf dem Gorillaglassubstrat weist deutlich geringere Proteinsignalhöhen 100 als die vergleichbare Messung der gleichen Suspension auf einer reflektierenden Nickeloberfläche 103. Zwar nimmt auch der Untergrund (gestrichelte Linie) bei der Nickeloberfläche zu, dieser kann jedoch einfach vom Signal 103 abgezogen werden, um zu einem korrigierten Signal zu gelangen. Die Signalhöhen 100 der Proteine auf der Nickeloberfläche 103 sind deutlich höher als bei der Messung auf Gorillaglas 104.A Raman measurement 103 . 104 The proteins, however, clearly shows differences. The measured Raman signal 104 on the gorilla inlet substrate has significantly lower protein signal levels 100 as the comparable measurement of the same suspension on a reflective nickel surface 103 , Although the background (dashed line) increases in the nickel surface, but this can easily from the signal 103 be deducted to arrive at a corrected signal. The signal levels 100 the proteins on the nickel surface 103 are significantly higher than when measuring on gorilla glass 104 ,

Außerdem sind auf der Nickeloberfläche 101, 103 keine Ramansignale vom Substrat selbst detektierbar. Auf dem Gorillaglas Substrat 102, 104 sind allerdings probenfremde Signale 105 zu erkennen.Also, on the nickel surface 101 . 103 no Raman signals from the substrate itself detectable. On the gorilla glass substrate 102 . 104 are, however, non-sample signals 105 to recognize.

Die hier offenbarte erfindungsgemäße Flüssigkeitszelle, das System aus Flüssigkeitszelle und Haltevorrichtung 200 und das erfindungsgemäße Mikroskop tragen also wesentlich zu einer Verbesserung von bildgestützten, ramanspektroskopischen Analyse von Proteinsuspensionen in Auflicht-Mikroskopen bei.The liquid cell according to the invention disclosed herein, the system of liquid cell and holding device 200 and the microscope of the invention thus contribute significantly to an improvement of image-based Raman spectroscopic analysis of protein suspensions in incident-light microscopes.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

US 5471294 [0003] US 5471294 [0003]
EP 1329706 [0003] EP 1329706 [0003]
US 7605919 [0003, 0003] US 7605919 [0003, 0003]
DE 102013015033 [0006] DE 102013015033 [0006]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Malvern Application Note „Characterization of protein aggregates in suspension and on a filter membrane by Morphologically-Directed Raman Spectroscopy” [0005] Malvern Application Note "Characterization of Protein Aggregates in Suspension and on a Filter Membrane by Morphologically-Directed Raman Spectroscopy" [0005]

Claims

Flüssigkeitszelle (1) zur mikroskopischen Bilderfassung und Raman-spektroskopischen Materialanalyse einer Partikelsuspension in einem Auflicht-Mikroskop, aufweisend zumindest die folgenden Komponenten: – eine Messkammer (2), aufweisend einen Boden (3), ein dem Boden (3) gegenüberliegendes Messfenster (5) und eine Dichtung (6), wobei – der Boden (3) eine Ausnehmung (8) aufweist, die dazu ausgebildet ist, die Dichtung (6) aufzunehmen, oder wobei – der Boden (3) zumindest in einem Bereich der Auflage der Dichtung (6) planar ausgeführt ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden (3) eine reflektierende Oberfläche (4) aufweist, die so beschaffen ist, dass durch das Messfenster (5) einfallendes Raman-Anregungslicht an der reflektierenden Oberfläche (4) gerichtet reflektiert wird, so dass das Ramansignal eines Partikels, insbesondere aufgrund der zweimaligen Anregungschance, erhöht wird.Liquid cell ( 1 ) for microscopic image acquisition and Raman spectroscopic material analysis of a particle suspension in a reflected-light microscope, comprising at least the following components: - a measuring chamber ( 2 ), having a bottom ( 3 ), the ground ( 3 ) opposite measuring window ( 5 ) and a seal ( 6 ), where - the soil ( 3 ) a recess ( 8th ), which is adapted to the seal ( 6 ) or where - the soil ( 3 ) at least in a region of the support of the seal ( 6 ) is planar, characterized in that the ground ( 3 ) a reflective surface ( 4 ), which is such that through the measuring window ( 5 ) incident Raman excitation light on the reflective surface ( 4 ) is reflected, so that the Raman signal of a particle, in particular due to the two-time excitation, is increased.

Flüssigkeitszelle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die reflektierende Oberfläche (4) des Bodens (3) ein Metall oder eine Metalllegierung aufweist, wobei insbesondere der Boden (3) aus dem Metall oder der Metalllegierung besteht.Liquid cell according to claim 1, characterized in that the reflective surface ( 4 ) of the soil ( 3 ) comprises a metal or a metal alloy, wherein in particular the bottom ( 3 ) consists of the metal or the metal alloy.

Flüssigkeitszelle nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass die reflektierende Oberfläche (4) eine auf dem Boden (3) angeordnete reflektierende Schicht (40) ist, wobei die reflektierende Schicht (40) insbesondere semitransparent ist.Liquid cell according to claim 1 or 2, characterized in that the reflective surface ( 4 ) one on the ground ( 3 ) arranged reflective layer ( 40 ), wherein the reflective layer ( 40 ) is semitransparent in particular.

Flüssigkeitszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden (3) eine Zulauföffnung (71) und eine Ablauföffnung (72), zum Befüllen, Entleeren, Vakuumieren und/oder Erzeugen eines Durchflusses in der Messkammer (2), aufweist, wobei die Zulauf- und/oder die Ablauföffnung (71, 72) insbesondere in einem Bereich des Bodens (3) angeordnet ist/sind, der Teil der Messkammer (2) ist.Liquid cell according to one of the preceding claims, characterized in that the bottom ( 3 ) an inlet opening ( 71 ) and a drain opening ( 72 ), for filling, emptying, vacuuming and / or generating a flow in the measuring chamber ( 2 ), wherein the inlet and / or the drain opening ( 71 . 72 ) especially in a region of the soil ( 3 ) is / are the part of the measuring chamber ( 2 ).

Flüssigkeitszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die reflektierende Oberfläche (4) im Wellenlängenbereich von 300 nm bis 800 nm, insbesondere von 210 nm bis 1200 nm durchgehend reflektierend ist.Liquid cell according to one of the preceding claims, characterized in that the reflective surface ( 4 ) is continuously reflecting in the wavelength range from 300 nm to 800 nm, in particular from 210 nm to 1200 nm.

Flüssigkeitszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitszelle (1) ein Andruckelement (9) aufweist, das so ausgebildet ist, dass die Flüssigkeitszelle (1) in eine Schiebeführung eingeführt werden kann, wobei das Andruckelement (9) von der Schiebeführung niedergehalten wird, so dass das Andruckelement (9) auf das Messfenster (5), die Dichtung (6) und den Boden (3) sowie insbesondere an ein Unterteil (30) drückt, so dass die Messkammer (2) abgedichtet wird, wobei das Andruckelement (9) mit einem ersten Bereich auf oder oberhalb des Messfensters (5) angeordnet ist und insbesondere mit einem zweiten Bereich auf oder oberhalb des Bodens (3) angeordnet ist.Liquid cell according to one of the preceding claims, characterized in that the liquid cell ( 1 ) a pressure element ( 9 ), which is designed such that the liquid cell ( 1 ) can be inserted in a sliding guide, wherein the pressure element ( 9 ) is held down by the sliding guide, so that the pressure element ( 9 ) on the measurement window ( 5 ), the seal ( 6 ) and the ground ( 3 ) and in particular to a lower part ( 30 ), so that the measuring chamber ( 2 ) is sealed, wherein the pressure element ( 9 ) with a first area on or above the measurement window ( 5 ) and in particular with a second area on or above the floor ( 3 ) is arranged.

Flüssigkeitszelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitszelle ein Abstandelement (21) aufweist, wobei das Abstandelement (21) auf dem Boden (3) der Flüssigkeitszelle (1) insbesondere außerhalb der Messkammer (2) auf dem Boden (3) der Flüssigkeitszelle (1) angeordnet ist, wobei das Andruckelement (9) mit dem zweiten Bereich auf dem Abstandselement (21) aufliegt, so dass das Messfenster (5) durch das Andruckelement (9) nur bis auf einen vordefinierten Abstand an den Boden (3) angedrückt werden kann, wobei die Höhe das Abstandselements (21) besagten Abstand des Messfensters (5) vom Boden (3) vorgibt.Liquid cell according to claim 6, characterized in that the liquid cell is a spacer element ( 21 ), wherein the spacer element ( 21 ) on the ground ( 3 ) of the liquid cell ( 1 ) especially outside the measuring chamber ( 2 ) on the ground ( 3 ) of the liquid cell ( 1 ) is arranged, wherein the pressure element ( 9 ) with the second area on the spacer element ( 21 ) rests, so that the measuring window ( 5 ) by the pressure element ( 9 ) only up to a predefined distance to the ground ( 3 ) can be pressed, wherein the height of the spacer element ( 21 ) said distance of the measuring window ( 5 ) from the ground ( 3 ) pretends.

Flüssigkeitszelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitszelle (1) ein Einlageelement (20) aufweist, wobei das Einlageelement (20) in der Ausnehmung (8) zwischen Boden (3) und Dichtung (6) angeordnet ist, so dass die Dichtung (6) um die Höhe des Einlageelements (21) in der Ausnehmung (8) nach oben verlagert angeordnet ist, insbesondere so, dass das Messfenster (5) bei einem durch das Abstandelement (20) vordefinierten Abstand des Messfensters (5) vom Boden (3) bereits so auf der Dichtung (6) aufliegt, dass die Messkammer (2) dicht ist, wobei das Einlageelement (20) insbesondere so dimensioniert ist, dass die Höhe des Einlageelements (21) der Höhe des Abstandelements (21) entspricht, oder um einen festen Betrag in der Höhe des Abstandselements (21) abweicht.Liquid cell according to one of the preceding claims, characterized in that the liquid cell ( 1 ) an insert element ( 20 ), wherein the insert element ( 20 ) in the recess ( 8th ) between ground ( 3 ) and seal ( 6 ) is arranged so that the seal ( 6 ) around the height of the insert element ( 21 ) in the recess ( 8th ) is arranged displaced upward, in particular so that the measuring window ( 5 ) at a through the spacer element ( 20 ) predefined distance of the measuring window ( 5 ) from the ground ( 3 ) already so on the seal ( 6 ) rests that the measuring chamber ( 2 ) is tight, wherein the insert element ( 20 ) is dimensioned in particular so that the height of the insert element ( 21 ) the height of the spacer element ( 21 ) or by a fixed amount in the height of the spacer element ( 21 ) deviates.

System aufweisend – eine Haltevorrichtung (200) zum Verschließen und Fixieren einer Flüssigkeitszelle (1), – eine Flüssigkeitszelle (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Haltevorrichtung (200) eine Schiebeführung (201) aufweist, in welche die Flüssigkeitszelle (1) einschiebbar ist und wobei die Schiebeführung (201) eine Andruckplatte (202) aufweist, die dazu ausgebildet ist, das Messfenster (5) auf die Dichtung (6) zu drücken, wenn die Flüssigkeitszelle (1) in der Haltevorrichtung (200) aufgenommen ist.System comprising - a holding device ( 200 ) for closing and fixing a liquid cell ( 1 ), - a liquid cell ( 1 ) according to one of the preceding claims, wherein the holding device ( 200 ) a sliding guide ( 201 ) into which the liquid cell ( 1 ) and wherein the sliding guide ( 201 ) a pressure plate ( 202 ), which is adapted to the measuring window ( 5 ) on the seal ( 6 ) when the liquid cell ( 1 ) in the holding device ( 200 ) is recorded.

Mikroskop aufweisend Mittel zur mikroskopischen Bilderfassung und Raman-spektroskopischen Messungen einer Partikelsuspension, wobei das Mikroskop ein Auflicht-Mikroskop ist und wobei das Mikroskop eine Flüssigkeitszelle (1) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und insbesondere eine Haltevorrichtung (200) mit den Merkmalen des Anspruchs 8 aufweist, oder insbesondere ein System gemäß Anspruch 8 aufweist.Microscope comprising means for microscopic image acquisition and Raman spectroscopic measurements of a particle suspension, wherein the microscope is a reflected light microscope and wherein the microscope is a liquid cell ( 1 ) according to one of claims 1 to 7 and in particular a holding device ( 200 ) with the features of claim 8 has, or in particular has a system according to claim 8.

Mikroskop gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop zur Dunkelfeldbeleuchtung eingerichtet ist und die reflektierende Oberfläche (4) des Bodens (3) der Flüssigkeitszelle (1) als Reflektor für die eingestrahlte Dunkelfeldbeleuchtung dient.Microscope according to claim 10, characterized in that the microscope is arranged for dark field illumination and the reflective surface ( 4 ) of the soil ( 3 ) of the liquid cell ( 1 ) serves as a reflector for the irradiated dark field illumination.