DE202019101669U1 - Device for field flux fractionation in combination with Raman spectroscopy - Google Patents

Abstract

Vorrichtung zur kontinuierlichen Erkennung und Charakterisierung von Substanzen, die in wässrigen oder organischen Flüssigkeiten gelöst, dispergiert oder suspendiert sind, umfassend
a) ein chromatographisches System zur Probentrennung basierend auf einem Verfahren der Feldflussfraktionierung (FFF),
b) eine Durchfluss-Messzelle, die stromabwärts im Flusspfad des Trennsystems angeordnet ist und über mindestens eine lichtdurchlässige Wandfläche (Fenster) verfügt,
c) ein Raman-Spektrometer, das an der Durchfluss-Messzelle angeordnet ist und von der fraktionierten Probe gestreutes Licht registriert sowie
d) eine Steuerungs- und Berechnungseinheit zur Steuerung der Systemkomponenten und zur Auswertung und Visualisierung der Messdaten aus dem Raman-Spektrometer und anderer Detektoren.

Apparatus for the continuous detection and characterization of substances dissolved, dispersed or suspended in aqueous or organic liquids comprising
a) a chromatographic system for sample separation based on a method of field flow fractionation (FFF),
b) a flow measuring cell, which is arranged downstream in the flow path of the separation system and has at least one translucent wall surface (window),
c) a Raman spectrometer located on the flow cell and registering light scattered from the fractionated sample and
d) a control and calculation unit for controlling the system components and for evaluating and visualizing the measurement data from the Raman spectrometer and other detectors.

Description

Technisches GebietTechnical area

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur kontinuierlichen Erkennung und Charakterisierung von Substanzen anhand der spektralen Eigenschaften von in wässrigen oder organischen Flüssigkeiten gelösten, dispergierten oder suspendierten Substanzen mittels Raman-Spektroskopie in Verbindung mit verschiedenen Methoden der Probentrennung. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen umfassen ein chromatographisches System zur Probentrennung basierend auf einem Verfahren der Feldflussfraktionierung (FFF), ein Mess- und Analysesystem zur spektrographischen Untersuchung des aufgetrennten Probenmaterials sowie eine Steuerungs- und Berechnungseinheit zur Steuerung der Systemkomponenten und zur Auswertung der Messdaten.The invention relates to a device for the continuous detection and characterization of substances based on the spectral properties of dissolved, suspended or suspended substances in aqueous or organic liquids by means of Raman spectroscopy in conjunction with various methods of sample separation. The devices according to the invention comprise a chromatographic system for sample separation based on a method of field flow fractionation (FFF), a measurement and analysis system for spectrographic examination of the separated sample material and a control and calculation unit for controlling the system components and for evaluating the measurement data.

Die Feldflussfraktionierung ist ein bekanntes Trennverfahren, deren Grundprinzipien z.B. beschrieben werden in US 4,147,621 .The Feldflussfraktionierung is a well-known separation process whose basic principles are described eg in US 4,147,621 ,

Stand der TechnikState of the art

Raman-Spektroskopie kann verwendet werden um anorganische Materialien ebenso wie Polymere anhand ihrer spektralen Eigenschaften zu erkennen. Raman-Spektrometer sind analytische Detektoren, die sich durch eine hohe Empfindlichkeit auszeichnen und sich durch schnelle Datenerfassung gut für „Echtzeit“-Anwendungen eignen. Mit diesen Detektoren können kleinste Mengen von Substanzen hinsichtlich ihrer chemischen und strukturellen Zusammensetzung untersucht und identifiziert werden.Raman spectroscopy can be used to detect inorganic materials as well as polymers based on their spectral properties. Raman spectrometers are high-sensitivity analytical detectors that are well-suited for "real-time" applications with fast data acquisition. With these detectors, smallest amounts of substances can be examined and identified with regard to their chemical and structural composition.

Bei der Raman-Spektroskopie wird das zu untersuchende Material mit monochromatischem Licht - üblicherweise aus einem Laser - bestrahlt. Neben der eingestrahlten Frequenz (Rayleigh-Streuung) kann das vom bestrahlten Material reflektierte bzw. gestreute Licht noch weitere Frequenzen enthalten. Die Frequenzunterschiede zum eingestrahlten Licht entsprechen den für das Material charakteristischen Energien von Rotations-, Schwingungs-, Phonon- oder Spin-Flip-Prozessen. Aus dem erhaltenen Spektrum lassen sich, ähnlich dem Spektrum der Infrarotspektroskopie, Rückschlüsse auf die untersuchte Substanz ziehen. Die in einem Raman-Spektrum auftretenden Linien werden auch als Stokes-Linien bezeichnet. (Quelle: Wikipedia)In Raman spectroscopy, the material to be examined is irradiated with monochromatic light - usually from a laser. In addition to the incident frequency (Rayleigh scattering), the light reflected or scattered by the irradiated material may also contain other frequencies. The frequency differences to the incident light correspond to the characteristic of the material energy of rotation, vibration, phonon or spin-flip processes. From the spectrum obtained, it is possible to draw conclusions about the investigated substance, similar to the spectrum of infrared spectroscopy. The lines appearing in a Raman spectrum are also called Stokes lines. (Source: Wikipedia)

Mit der Raman-Spektroskopie kann also eine einzelne bestimmte Substanz (Material) anhand des erfassten Spektrums relativ sicher erkannt werden. Problematisch ist der Einsatz der Raman-Spektroskopie bei komplexer Probenzusammensetzung bzw. wenn eine Probe z. B. aus einem Gemisch verschiedener Komponenten besteht. In diesem Fall kommen häufig zeitaufwändige, bildgebende Verfahren zum Einsatz, bei denen die Probe zweidimensional abgetastet wird. Ein Beispiel hierfür wurde bereits in der Offenlegungsschrift DE 10 2017 107 857 A1 2017.10.19 mit der Bezeichnung „Flüssigkeitszelle zur mikroskopischen Bildgebung und raman-spektroskopischen Materialanalyse von Partikelsuspensionen“ beschrieben. Eine kontinuierliche Erfassung eines durch eine Messzelle strömenden, flüssigen bzw. in wässrigen oder organischen Flüssigkeiten gelösten, dispergierten oder suspendierten heterogenen Probenmaterials ist damit nicht möglich.With Raman spectroscopy, therefore, a single specific substance (material) can be detected relatively reliably on the basis of the acquired spectrum. The problem is the use of Raman spectroscopy in complex sample composition or when a sample z. B. consists of a mixture of different components. In this case, time-consuming imaging techniques are often used in which the sample is scanned two-dimensionally. An example of this has already been disclosed in the published patent application DE 10 2017 107 857 A1 2017.10.19 entitled "Liquid Cell for Microscopic Imaging and Raman Spectroscopic Material Analysis of Particle Suspensions". A continuous detection of a flowing through a measuring cell, liquid or dissolved in aqueous or organic liquids, dispersed or suspended heterogeneous sample material is thus not possible.

Deshalb ist es vorteilhaft, die einzelnen Bestandteile einer Probe vor Überführung in die Messzelle eines Raman-Spektrometers zunächst mittels eines geeigneten chromatographischen Trennverfahrens, wie z.B. der Gel-Permeations-Chromatographie (GPC), der Größenausschluss-Chromatographie (SEC, Size Exclusion Chromatography) oder der Feldflussfraktionierung (FFF), aufzutrennen, so dass diese nacheinander in die Messzelle des Spektrometers eingeleitet werden. Im Fall der Feldflussfraktionierung können z. B. die Asymmetrische Fluss FFF (AF4), die Hohlfaser-Fluss-FFF (HF5), die Thermische FFF (TF3) oder die Zentrifugal FFF (CF3) verwendet werden.Therefore, it is advantageous to first prepare the individual components of a sample prior to transfer to the measuring cell of a Raman spectrometer by means of a suitable chromatographic separation method, such as e.g. gel permeation chromatography (GPC), Size Exclusion Chromatography (SEC), or Field Flow Fractionation (FFF), so that they are sequentially introduced into the measuring cell of the spectrometer. In the case of Feldflussfraktionierung z. As the Asymmetrical Flow FFF (AF4), the Hollow Fiber Flow FFF (HF5), the Thermal FFF (TF3) or the Centrifugal FFF (CF3) can be used.

Die Feldflussfraktionierung (FFF) ist in einer Vielzahl von Implementierungen bekannt, um Populationen von (enthaltenen) Makromolekülen oder Nanopartikeln (kolloidale Partikel) in einem Größenbereich von etwa 0,5 nm bis zu einigen Mikrometern in Teilbereiche nach Partikelgröße und -dichte zu trennen, um eine genauere Bestimmung der Partikelgrößen- und -dichten -verteilung zu ermöglichen. FFF wird in US 4,147,621 näher beschrieben, das hiermit durch Bezugnahme auf selbiges zum Bestandteil dieser Ausführungen wird.Field flux fractionation (FFF) is known in a variety of implementations to separate populations of macromolecules or nanoparticles (colloidal particles) ranging in size from about 0.5 nm to several microns into particle size and density subregions to allow more accurate determination of particle size and density distribution. FFF will be in US 4,147,621 described in more detail, which is hereby incorporated by reference into the same part of these embodiments.

Es ist besonders praktisch, wenn die Fraktionierung und Erfassung einer Probe kontinuierlich erfolgen kann. FFF-Verfahren ermöglichen dies für einen weiteren Größenbereich sowie schneller und effektiver als einige andere Verfahren, wie beispielsweise die Verwendung einer SEC-Säule (Size Exclusion Chromatography).It is particularly convenient if fractionation and detection of a sample can be continuous. FFF techniques make this possible for a wider range of sizes as well as faster and more effectively than some other methods, such as the use of a SEC (Size Exclusion Chromatography) column.

Grundsätzlich besteht eine FFF-Technik darin, eine Suspension bzw. Dispersion von Partikeln axial durch einen kleinen Kanal strömen zu lassen, der einen Bruchteil eines Millimeters hoch, einige Millimeter breit und einige Zentimeter lang sein kann, wobei eine Kraft / ein Kraftfeld senkrecht zur Strömung aufgebracht wird. Wir gehen von einer vertikalen Ausrichtung aus, aber die Orientierung ist in der Regel nicht bedeutend. Das Kraftfeld kann auf verschiedene Weise entstehen. Hierfür werden eine Querströmung (AF4), aber auch Gravitation oder Temperaturverlauf verwendet. Diese Kraft treibt die Probenpartikel zum Boden des Kanals hin. Bei AF4 geschieht dies, indem der Boden aus einer Membran besteht, die für das Lösungsmittel (die Trägerflüssigkeit), worin die Partikel suspendiert sind, durchlässig ist, sodass das Material selbst in der Kanalkammer verbleibt. Dieser Tendenz, dass sich die Partikel in der Nähe der Wand aufhalten, wirkt die natürliche Brownsche Bewegung (Diffusion) der Partikel entgegen. Während die Suspension entlang des Kanals fließt, werden die kleineren Partikel durch die Wechselwirkung mit der Membran (Wand) weniger behindert und neigen dazu, den Kanal vor den größeren Partikeln zu verlassen (zu eluieren). In der Praxis kann bei einem Kanal von wenigen Zentimetern Länge und einer Durchflussrate von 0,5 ml pro Minute eine Probe der Größe 20 Nanometer (nm) nach ca. 8 Minuten austreten, während eine Probe von 100 nm erst nach 20 Minuten aus dem Kanal austritt. Ein Beispiel für die Elution eines bimodalen Gemisches ist in dargestellt. Die untere (durchgezogene) Linie stellt die Intensität des von einem UV-Detektor gemessenen Signals als Funktion der Zeit oder des Elutionsvolumens dar und repräsentiert die durchströmende Probenmenge. Zeit und Elutionsvolumen entsprechen einander, da die Flüssigkeit mit einer konstanten Flussrate gepumpt wird. Parallel dazu kann eine kontinuierliche Größenmessung mittels dynamischer Lichtstreuung durchgeführt werden, um den z-gemittelten hydrodynamischen Durchmesser der Partikel bzw. Moleküle zu erfassen. Wenn die Probenzusammensetzung bekannt ist oder nur relative Messungen erforderlich sind, ist eine solch absolute Detektionsmethode möglicherweise nicht erforderlich, aber sie kann ein wertvolles Mittel zur Diagnose sein.Basically, an FFF technique is to allow a suspension or dispersion of particles to flow axially through a small channel, which may be a fraction of a millimeter high, a few millimeters wide and a few centimeters long, with a force / field perpendicular to the flow is applied. We assume a vertical orientation, but orientation is usually not significant. The force field can arise in different ways. For this purpose, a cross flow (AF4), but also gravity or Temperature history used. This force drives the sample particles towards the bottom of the channel. In AF4 this is done by making the bottom of a membrane which is permeable to the solvent (the carrier liquid) in which the particles are suspended so that the material itself remains in the channel chamber. This tendency for the particles to be near the wall counteracts the natural Brownian motion (diffusion) of the particles. As the suspension flows along the channel, the smaller particles are less obstructed by the interaction with the membrane (wall) and tend to leave (elute) the channel before the larger particles. In practice, with a channel a few centimeters in length and a flow rate of 0.5 ml per minute, a sample of size 20 Nanometer (nm) emerge after approximately 8 minutes, while a sample of 100 nm emerges from the channel only after 20 minutes. An example of the elution of a bimodal mixture is in shown. The lower (solid) line represents the intensity of the signal measured by a UV detector as a function of time or elution volume and represents the amount of sample flowing therethrough. Time and elution volumes are equal because the liquid is pumped at a constant flow rate. Parallel to this, a continuous size measurement can be carried out by means of dynamic light scattering in order to detect the z-averaged hydrodynamic diameter of the particles or molecules. If the sample composition is known or only relative measurements are required, such an absolute detection method may not be necessary, but it can be a valuable means of diagnosis.

Zur besseren Erfassung einzelner Partikel oder Makromoleküle kann der Effekt der „Optischen Pinzette“ (engl. „optical tweezers“) verwendet werden, durch den sehr kleine, eigentlich freischwebende Partikel (im Nano- bis Mikrometerbereich) für bestimmte Zeit im Fokus eines konzentrierten, kohärenten Lichtstrahls (z. B. Laser) festgehalten werden können. Die erste wissenschaftliche Untersuchung von Kräften auf Teilchen in der Größenordnung von Mikrometern, verursacht durch Streuung von Licht und Gradientenkräfte, wurde 1970 vom Physiker Arthur Ashkin veröffentlicht.To better capture individual particles or macromolecules, the effect of "optical tweezers" can be used, through the very small, actually free-floating particles (in the nanometer to micrometer range) for a certain time in the focus of a concentrated, coherent Light beam (eg laser) can be recorded. The first scientific investigation of forces on particles of the order of microns, caused by scattering of light and gradient forces, was published in 1970 by physicist Arthur Ashkin.

Darstellung der ErfindungPresentation of the invention

Als Hauptanspruch weist die Erfindung eine Vorrichtung zur Identifizierung, Charakterisierung und Quantifizierung von Partikeln und Makromolekülen (Polymeren) auf, die in einer Flüssigkeit gelöst, dispergiert oder suspendiert sind. Die Vorrichtung beinhaltet eine geschlossene Wandfläche, die einen Fraktionierungskanal mit einer Eintrittsöffnung, einer Austrittsöffnung und einer Strömungsachse definiert, die sich stromabwärts von der Eintrittsöffnung des Kanals zur Austrittsöffnung erstreckt. Ein Krafteinleitungs-Subsystem erzeugt ein Kraftfeld, das senkrecht zu mindestens einem Teil der Strömungsachse des Fraktionierungskanals ausgerichtet ist. Ein Teilsystem zur Messung der spektralen Eigenschaften von Substanzen befindet sich hydraulisch stromabwärts von mindestens einem Teil der geschlossenen Wandfläche, die den Fraktionierungskanal definiert, und beinhaltet eine Durchfluss-Messzelle, die angeordnet ist, um die chemische und strukturelle Zusammensetzung von in wässrigen oder organischen Flüssigkeiten gelösten, dispergierten bzw. suspendierten Substanzen im Teilsystem zur Messung der spektralen Eigenschaften von Substanzen mittels Raman-Spektroskopie zu ermitteln, sowie ein Raman-Spektrometer, das an der Messzelle angebracht ist und über einen Signalausgang verfügt. Eine Berechnungseinheit hat einen Signaleingang, der vom Signalausgang des Raman-Spektrometers gespeist wird, eine Signal-Verarbeitungslogik, die auf das Signal des Raman-Spektrometers reagiert und entsprechend Spektren aufzeichnet und auswertet.As a main claim, the invention comprises an apparatus for identifying, characterizing and quantifying particles and macromolecules (polymers) dissolved, dispersed or suspended in a liquid. The apparatus includes a closed wall surface defining a fractionating channel having an inlet opening, an outlet opening and a flow axis extending downstream from the inlet opening of the channel to the outlet opening. A force introduction subsystem generates a force field that is oriented perpendicular to at least a portion of the flow axis of the fractionation channel. A subsystem for measuring the spectral properties of substances is located hydraulically downstream of at least a portion of the closed wall surface defining the fractionation channel, and includes a flow-through measuring cell arranged to resolve the chemical and structural composition of aqueous and organic liquids , Disperse or suspended substances in the subsystem for measuring the spectral properties of substances by Raman spectroscopy to determine and a Raman spectrometer, which is attached to the measuring cell and has a signal output. A computing unit has a signal input fed from the signal output of the Raman spectrometer, a signal processing logic that responds to the Raman spectrometer signal and records and evaluates spectra accordingly.

In bevorzugten Ausführungsformen kann die Vorrichtung ferner eine geschlossene Wandfläche beinhalten, die einen Proben-Injektionskanal definiert, der hydraulisch mit einem Abschnitt der geschlossenen Wandfläche verbunden ist, der den Fraktionierungskanal stromaufwärts der Messzelle definiert, des Weiteren eine Pumpe mit einem Eingang, der von einer Trägerflüssigkeitsquelle gespeist wird, und einem Ausgang, der hydraulisch mit der Eintrittsöffnung der geschlossenen Wandfläche verbunden ist, die den Fraktionierungskanal definiert. Die Vorrichtung kann ferner eine gemeinsame Systemsteuerung beinhalten, mit Steuerausgängen, die funktionell mit den Steuer-Eingängen der Pumpe und des Teilsystems zur Messung der spektralen Eigenschaften der Probensubstanzen verbunden sind. Das Subsystem zur Krafteinleitung kann hydraulisch sein. Das Krafteinleitungs-Subsystem kann eine Pumpe beinhalten. Des Weiteren kann die Vorrichtung eine Anzeige mit einem Eingang beinhalten, der funktionell mit dem Signalausgang des Raman-Spektrometers verbunden ist, um ein Spektrogramm des vom Raman-Spektrometer erfassten, von der Probe gestreuten Lichts anzuzeigen. Die Vorrichtung kann ferner eine Zeitreferenz beinhalten, wobei die Berechnungseinheit vom Teilsystem zur Messung der spektralen Partikeleigenschaften und von der Zeitreferenz gespeist wird, und in der Lage ist, Ausgangssignale und verarbeitete Daten zur Verfügung zu stellen, die Veränderungen der Partikeleigenschaften über den Zeitverlauf aufzeigen. Die Berechnungseinheit kann auch eine Verarbeitungslogik zur Berechnung der Partikelgröße beinhalten.In preferred embodiments, the apparatus may further include a closed wall surface defining a sample injection channel hydraulically connected to a portion of the closed wall surface defining the fractionation channel upstream of the measurement cell, further comprising a pump having an input from a carrier liquid source is fed, and an output which is hydraulically connected to the inlet opening of the closed wall surface which defines the fractionation channel. The apparatus may further include a common system controller having control outputs operatively connected to the control inputs of the pump and the subsystem for measuring the spectral properties of the sample substances. The force application subsystem can be hydraulic. The force introduction subsystem may include a pump. Furthermore, the device may include a display having an input operatively connected to the signal output of the Raman spectrometer for displaying a spectrogram of the light scattered by the sample detected by the Raman spectrometer. The apparatus may further include a time reference, wherein the computing unit is powered by the spectral particle characteristics and time reference subsystem, and is capable of providing output signals and processed data indicative of changes in particle properties over time. The calculation unit may also include a processing logic for calculating the particle size.

In bevorzugten Ausführungsformen kann das Teilsystem zur Messung der spektralen Partikeleigenschaften eine von einer Trägerflüssigkeit gelöste, dispergierte oder suspendierte Probe erfassen. Die Anzeigeeinheit kann dem Bediener der Vorrichtung die verschiedenen Spektrogramme (Intensitäts-Wellenlängen-Diagramme) des von der Probe gestreuten Lichts anzeigen. Ferner kann die Berechnungseinheit unterschiedliche Größen- und Mengenwerte sowie weitere Materialeigenschaften für verschiedene Fraktionen ableiten.In preferred embodiments, the subsystem for measuring the spectral Particle properties detect a dissolved, dispersed or suspended from a carrier liquid sample. The display unit may display to the operator of the device the various spectrograms (intensity-wavelength diagrams) of the light scattered by the sample. Furthermore, the calculation unit can derive different size and quantity values as well as further material properties for different fractions.

Als weiteren Anspruch weist die Erfindung eine Vorrichtung zur Identifizierung, Charakterisierung und evtl. Quantifizierung von Partikeln und Makromolekülen auf, die in einer Flüssigkeit gelöst, dispergiert oder suspendiert sind, und umfasst a) eine Vorrichtung zum Einbringen einer Fluidprobe, die gelöste, dispergierte oder suspendierte Partikel bzw. Makromoleküle unterschiedlicher Größe und/oder Dichte beinhaltet, b) eine Vorrichtung zum Trennen der Fluidprobe in eine Reihe von verschiedenen Fraktionen, die Partikel bzw. Makromoleküle mit jeweils ähnlicher Größe bzw. Dichte beinhalten, c) Vorrichtungen zum Erfassen der Eigenschaften der in der Probe enthaltenen Partikel bzw. Makromoleküle in den Fraktionen sowie d) eine von den Erfassungsvorrichtungen gespeiste Vorrichtung zum Speichern und Visualisieren der erfassten Daten und Signale sowie zum Ableiten verschiedener Materialeigenschaften für die verschiedenen Fraktionen.In another aspect, the invention features an apparatus for identifying, characterizing and possibly quantifying particles and macromolecules dissolved, dispersed or suspended in a liquid and comprises a) a device for introducing a fluid sample which has dissolved, dispersed or suspended B) a device for separating the fluid sample into a series of different fractions containing particles or macromolecules each having a similar size or density, c) devices for detecting the properties of in d) a device fed by the detection devices for storing and visualizing the acquired data and signals as well as for deriving different material properties for the different fractions.

Als weiteren Hauptanspruch führen erfindungsgemäße Systeme an der eluierenden Probe eine Lichtstreumessung mittels Raman-Spektroskopie in Verbindung mit oder an Stelle einer Größenmessung durch. Dies kann in einer geeigneten Messzelle erfolgen (siehe ), an der ein geeignetes Raman-Spektrometer angeordnet ist, um die Probe mit monochromem Licht zu bestrahlen und das von den Partikeln bzw. Makromolekülen gestreute Licht zu messen. Die Messzelle kann über ein dünnes Rohr mit dem Ausgang des Kanals verbunden sein. Da die Diffusion der Partikel langsam erfolgt - wenige Mikrometer pro Sekunde oder weniger - ist es möglich, die separierten Partikel bzw. Moleküle einige Zeit nach Verlassen des Trennkanals zu messen, ohne dass eine wesentliche Wiedervermischung stattfindet. Vielmehr ist es wichtig, eine kleine Messzelle zu verwenden, um eine übermäßige Vermischung zu vermeiden.As a further main claim, systems according to the invention carry out a light scattering measurement by means of Raman spectroscopy on the eluting sample in conjunction with or instead of a size measurement. This can be done in a suitable measuring cell (see ) to which a suitable Raman spectrometer is arranged to irradiate the sample with monochromatic light and to measure the light scattered from the particles or macromolecules. The measuring cell can be connected to the outlet of the channel via a thin tube. Since the diffusion of the particles is slow - a few microns per second or less - it is possible to measure the separated particles or molecules some time after leaving the separation channel, without any significant remixing takes place. Rather, it is important to use a small measuring cell to avoid excessive mixing.

In bevorzugten Ausführungsformen kann das von der Probe gestreute Licht und damit die Sensitivität des verwendeten Raman-Spektrometers durch verschiedene Maßnahmen verstärkt werden. So können die untere und die seitlichen Wandflächen reflektierend z.B. mit Gold oder Silber beschichtet sein, um die Lichtmenge, die im Fokusbereich des Raman-Spektrometers auf die Probenpartikel trifft, zu erhöhen. Des Weiteren kann beim Raman-Spektrometer ein sogenanntes „Wasser-Immersions-Objektiv“ verwendet werden, wobei ein Wassertropfen zwischen dem Objektiv und der transparenten Abdeckung der Messzelle die Reflexionen an den Grenzflächen verringert. Ferner kann der Effekt der „Optischen Pinzette“ verwendet werden, durch den sehr kleine, eigentlich freischwebende Partikel für bestimmte Zeit im Fokus eines konzentrierten, kohärenten Lichtstrahls (z.B. Laser) festgehalten werden können, und damit wesentlich mehr Licht ins Objektiv des Raman-Spektrometers streuen als wenn sie nur darunter durchströmen.In preferred embodiments, the light scattered by the sample and thus the sensitivity of the Raman spectrometer used can be enhanced by various means. Thus, the bottom and side panels can be reflective, e.g. coated with gold or silver to increase the amount of light that hits the sample particles in the focus area of the Raman spectrometer. Furthermore, in the Raman spectrometer, a so-called "water immersion objective" can be used, wherein a drop of water between the objective and the transparent cover of the measuring cell reduces the reflections at the interfaces. Furthermore, the effect of "optical tweezers" can be used by the very small, actually free-floating particles for a certain time in the focus of a concentrated, coherent light beam (eg laser) can be recorded, and thus scatter much more light into the lens of the Raman spectrometer as if they only flow underneath.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Probe“ jegliche Art von Analyten, die sich mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtungen auftrennen und detektieren lassen. Dies können Substanzen mit einem Molekulargewicht von 500 Da bis 16 MDa oder mit einer Größe von 1 nm bis 5 µm sein, die in der jeweils verwendeten mobilen Phase gelöst, dispergiert oder suspendiert vorliegen.In the context of the present invention, the term "sample" means any type of analyte which can be separated and detected with the aid of the devices according to the invention. These may be substances with a molecular weight of 500 Da to 16 MDa or with a size of 1 nm to 5 μm, which are dissolved, dispersed or suspended in the particular mobile phase used.

Der Begriff „Probe“ umfasst insbesondere auch Gemische, wobei das Molekulargewicht und/oder die Größe der einzelnen Bestandteile gleich oder verschieden sein kann.In particular, the term "sample" also includes mixtures, wherein the molecular weight and / or the size of the individual constituents may be the same or different.

Einen Vorteil durch die Kopplung eines hochentwickelten Instruments zur Raman-Spektroskopie an ein FFF-System sehen wir insbesondere für die Identifizierung von Substanzen in einer Fluidprobe, wenn eine Größenverteilung und Heterogenität der Partikel bzw. Makromoleküle vorhanden ist. Eine Ramanspektroskopische Messung eines Gemischs von Substanzen ergibt eine Überlagerung der Licht-Spektren, die von den verschiedenen Substanzen der Probe zurückgestreut werden, wodurch diese nicht klar identifiziert und quantifiziert werden können. Eine zweidimensionale Abtastung einer statischen Probe und Auswertung durch Bildanalyse ist dagegen relativ zeitaufwändig. Daher kann die Trennung kleiner und großer Partikel bzw. Makromoleküle vor der Erfassung mit einem Raman-Spektrometer die Erkennung und Quantifizierung erheblich verbessern und beschleunigen.An advantage of coupling a sophisticated Raman spectroscopic instrument to an FFF system is the identification of substances in a fluid sample, especially when there is a size distribution and heterogeneity of the particles or macromolecules. A Raman spectroscopic measurement of a mixture of substances results in a superimposition of the light spectra scattered back from the different substances of the sample, whereby these can not be clearly identified and quantified. By contrast, a two-dimensional scanning of a static sample and evaluation by image analysis is relatively time-consuming. Therefore, the separation of small and large particles or macromolecules before detection with a Raman spectrometer can significantly improve detection and quantification and accelerate.

Figurenlistelist of figures

• zeigt den schematischen Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur kontinuierlichen Erkennung von Substanzen auf Basis eines FFF-Trennsystems kombiniert mit einem Raman-Spektrometer und weiteren Detektoren. shows the schematic structure of a device according to the invention for the continuous detection of substances based on a FFF separation system combined with a Raman spectrometer and other detectors.
• zeigt ein Beispiel für den prinzipiellen Aufbau einer einfachen Durchfluss-Messzelle. Die Deckplatte der Messzelle besteht aus transparentem Material (z. B. Glas). shows an example of the basic structure of a simple flow measuring cell. The cover plate of the measuring cell is made of transparent material (eg glass).
• zeigt ein veranschaulichendes Diagramm mit dem zeitlichen Verlauf des Signals eines UV-Detektors und des geometrischen Durchmessers einer gemischten Probe aus zwei unterschiedlichen Materialstandards, gemessen bzw. berechnet mit einem AF2000-FFF-System. shows an illustrative diagram with the time course of the signal of a UV detector and the geometric diameter of a mixed sample of two different material standards, measured or calculated with an AF2000-FFF system.
• zeigt ein veranschaulichendes Raman-Spektrogramm des beispielhaften Messlaufs aus nach 34 Minuten seit Beginn der Messung. FIG. 12 depicts an illustrative Raman spectrogram of the exemplary measurement run. FIG after 34 minutes since the start of the measurement.
• zeigt ein veranschaulichendes Raman-Spektrogramm des beispielhaften Messlaufs aus nach 39 Minuten seit Beginn der Messung. FIG. 12 depicts an illustrative Raman spectrogram of the exemplary measurement run. FIG after 39 minutes since the start of the measurement.

Wege zur Ausführung der ErfindungWays to carry out the invention

Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtungen werden im Folgenden mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen und die darin verwendeten Bezugszeichen erläutert.Preferred embodiments of the devices according to the invention are explained below with reference to the accompanying drawings and the reference numerals used therein.

Wie zeigt, beinhaltet ein erfindungsgemäßes Partikelcharakterisierungssystem einen Trennkanal 1, der von einer Pumpe 5 aus einem Flüssigkeitsbehälter 6 gespeist wird. Am stromaufwärts gelegenen Ende des Kanals ist eine Probeneinspritzeinrichtung 7 vorgesehen und zwischen einem stromabwärts gelegenen Ende des Trennkanals und einer Durchfluss-Messzelle 3 bzw. weiteren möglichen Detektionsvorrichtungen 9 und 10 ist eine Verbindung 11, wie beispielsweise ein Kapillarschlauch, vorgesehen. Am Ausgang der Messzelle ist ein Abfallbehälter 12 vorgesehen, der ebenfalls über eine Schlauch- bzw. Rohrleitung angeschlossen ist und die Trägerflüssigkeit mit der Probe auffängt. Ein Krafteinleitungs-Subsystem 8 wie beispielsweise eine Querstromregelpumpe kann ebenfalls am Kanal vorgesehen sein. Zur Steuerung der Pumpe, des Krafteinleitungs-Subsystems, des Raman-Spektrometers und evtl. weiterer Detektoren kann eine Systemsteuerung 4 angeschlossen sein.As shows, a particle characterization system according to the invention includes a separation channel 1 that by a pump 5 from a liquid container 6 is fed. At the upstream end of the channel is a sample injector 7 provided and between a downstream end of the separation channel and a flow measuring cell 3 or other possible detection devices 9 and 10 is a connection 11 , such as a capillary tube provided. At the output of the measuring cell is a waste container 12 provided, which is also connected via a hose or pipe and traps the carrier liquid with the sample. A force introduction subsystem 8th such as a cross flow control pump may also be provided on the channel. To control the pump, the force introduction subsystem, the Raman spectrometer and possibly other detectors can be a system control 4 be connected.

In einer alternativen Ausführungsform kann das Kraftfeld des FFF-Trennsystems eine Zentrifugalkraft sein. In diesem Fall wird das Kraftfeld durch die Rotation eines Ringförmigen Trennkanals erzeugt.In an alternative embodiment, the force field of the FFF separation system may be a centrifugal force. In this case, the force field is generated by the rotation of an annular separation channel.

In einer alternativen Ausführungsform kann ein Temperaturverlauf quer zur Flussrichtung der Trägerflüssigkeit im FFF-Trennkanal die Trennwirkung der Probenbestandteile hervorrufen.In an alternative embodiment, a temperature profile transverse to the flow direction of the carrier liquid in the FFF separation channel can cause the separation effect of the sample components.

Bezugnehmend auf die - wird nun ein modellhaftes Trenn- und Charakterisierungssystem vorgestellt. Je nach Art und Größe der Probe - organische Makromoleküle (Polymere) oder anorganische Partikel - können unterschiedliche FFF-Trennmethoden (Asymmetrischer Querfluss AF, Zentrifugal CF oder Thermische FFF/TF) und unterschiedliche Trägerflüssigkeiten zum Einsatz kommen. Entsprechend ist darauf zu achten, dass alle Komponenten, die mit der Trägerflüssigkeit und der Probensubstanz in Berührung kommen, damit kompatibel sind. Neben einem Raman-Spektrometer können weitere Detektoren zur Mengen- und Größenbestimmung zum Einsatz kommen (z.B. RI-, UV- bzw. MALS-Detektor).Referring to the - Now a model separation and characterization system is presented. Depending on the type and size of the sample - organic macromolecules (polymers) or inorganic particles - different FFF separation methods (Asymmetric Cross Flow AF, Centrifugal CF or Thermal FFF / TF) and different carrier fluids can be used. Accordingly, it must be ensured that all components which come into contact with the carrier liquid and the sample substance are compatible with it. In addition to a Raman spectrometer, other detectors can be used to determine the quantity and size (eg RI, UV or MALS detector).

Die Trägerflüssigkeitspumpe 5 befördert Trägerflüssigkeit aus dem Trägerflüssigkeitsbehälter 6 in einem konstanten Volumenstrom durch den FFF-Trennkanal 1. Zu einem bestimmten Zeitpunkt bzw. für ein kurzes Zeitintervall wird stattdessen eine Fluidprobe mit dem Probenmaterial in den Kanal eingeleitet. Bedingt durch die Trennwirkung des Kraftfeldes eluieren unterschiedliche Bestandteile der Probe zu unterschiedlicher Zeit aus dem Kanal und werden mit der Trägerflüssigkeit durch die Detektoren 9 bzw. 10 und die Messzelle 3 des Spektrometers 2 geleitet. Mithilfe eines RI- oder UV-Detektors 9 kann dabei der zeitliche Verlauf der Mengenanteile im Detektorfluss erfasst und aufgezeichnet werden. Mithilfe eines MALS-Detektors 10 (Multi-Angle Light Scattering) können auch die Größen (Dgeo, geometrischer Durchmesser) der Partikel ermittelt werden. zeigt ein beispielhaftes Diagramm mit dem zeitlichen Verlauf des Signals eines UV-Detektors und des berechneten geometrischen Durchmessers einer gemischten Probe aus zwei unterschiedlichen Materialstandards Polystyrol (PS) 350 nm und Polymethylmethacrylat (PMMA) 500 nm. Während in diesem Beispieldiagramm die Mengenanteile im UV-Signal kaum zu unterscheiden sind, zeigt der berechnete geometrische Durchmesser einen deutlichen Anstieg von 350 nm auf über 500 nm innerhalb einer Messdauer von 33 bis 40 Minuten nach Beginn der Messung.The carrier liquid pump 5 conveys carrier liquid from the carrier liquid container 6 in a constant volume flow through the FFF separation channel 1 , At a certain time or for a short time interval, instead, a fluid sample with the sample material is introduced into the channel. Due to the separation effect of the force field, different components of the sample elute from the channel at a different time and are mixed with the carrier liquid through the detectors 9 or. 10 and the measuring cell 3 of the spectrometer 2 directed. Using an RI or UV detector 9 In this case, the time profile of the proportions in the detector flow can be recorded and recorded. Using a MALS detector 10 (Multi-Angle Light Scattering), the sizes (Dgeo, geometric diameter) of the particles can be determined. shows an exemplary diagram with the time course of the signal of a UV detector and the calculated geometric diameter of a mixed sample of two different material standards polystyrene (PS) 350 nm and polymethyl methacrylate (PMMA) 500 nm. While in this example diagram, the proportions in the UV signal are hardly distinguishable, the calculated geometric diameter shows a significant increase from 350 nm to over 500 nm within a measurement period of 33 to 40 minutes after the start of the measurement.

zeigt eine beispielhafte Durchfluss-Messzelle mit einem dünnen Messkanal 13, zwei dünnen Rohrleitungen 14 als Zu- und Ablauf für die Probenflüssigkeit und eine lichtdurchlässige Deckplatte 15 zur Bestrahlung und Beobachtung der Probe mit einem Raman-Spektrometer. Zur Verstärkung des einfallenden und des gestreuten Lichts können die nicht-transparenten Innenwände des Messkanals metallisch (Silber/Gold) reflektierend beschichtet sein. Die Probe wird während eines Messlaufes mit der Trägerflüssigkeit kontinuierlich durch die Messzelle geleitet, wo sie mit einem durch die Deckplatte einfallenden, konzentrierten, monochromen Lichtstrahl (Laser) bestrahlt wird. Die einzelnen Probenpartikel oder Makromoleküle können dabei durch den Effekt der „Optischen Pinzette“ kurzzeitig im Beobachtungsbereich des Raman-Spektrometers festgehalten werden. Das von der Probe gestreute Licht wird von dem, über der Deckplatte angeordneten Raman-Spektrometer aufgefangen und analysiert. shows an exemplary flow measuring cell with a thin measuring channel 13 , two thin pipes 14 as inlet and outlet for the sample liquid and a translucent cover plate 15 for irradiation and observation of the sample with a Raman spectrometer. To reinforce the incident and the scattered light, the non-transparent inner walls of the measuring channel can be metallically coated (silver / gold) in a reflective manner. The sample is continuously passed through the measuring cell during a measuring run with the carrier liquid, where it is irradiated with a concentrated, monochrome light beam (laser) incident through the cover plate. The individual sample particles or macromolecules can be temporarily held in the observation area of the Raman spectrometer by the effect of the "optical tweezers". The light scattered from the sample is collected and analyzed by the Raman spectrometer located above the top plate.

In bestimmten Zeitabständen (z.B. alle 10 Sekunden) wird jeweils mit dem Raman-Spektrometer 2 ein Spektrogramm des von der Probe in der Messzelle 3 gestreuten Lichts erfasst. Die beispielhaften und zeigen jeweils ein Spektrogramm aus den Maxima der beiden Beispiel-Fraktionen. Die Spektrogramme zeigen für die einzelnen, in der Probe enthaltenen Substanzen typische relative Wellenlängen (Stokes-Linien). So sind im beispielhaften Spektrogramm nach 34 Minuten Messdauer klar die für Polystyrol (PS) typischen Intensitätslinien bei 1008 und 3060 cm^-1 zu erkennen. Im beispielhaften Spektrogramm nach 39 Minuten Messdauer dagegen dominieren die für Polymethylmethacrylat (PMMA) typischen Intensitätslinien bei 817 und 2940 cm^-1 und identifizieren damit diese Substanz. At certain intervals (eg every 10 seconds) is used with the Raman spectrometer 2 a spectrogram of the sample in the measuring cell 3 Scattered light detected. The exemplary ones and each show a spectrogram from the maxima of the two example fractions. The spectrograms show typical relative wavelengths (Stokes lines) for the individual substances contained in the sample. For example, in the exemplary spectrogram, the intensity lines typical for polystyrene (PS) at 1008 and 3060 cm ^-1 are clearly visible after 34 minutes of measurement. By contrast, in the exemplary spectrogram after 39 minutes of measurement, the intensity lines typical for polymethyl methacrylate (PMMA) dominate at 817 and 2940 cm ^-1 and thus identify this substance.

Obgleich die dargestellte Anordnung bevorzugt wird, sind auch andere Anordnungen/Ausführungsformen möglich. Jedoch sollten nun zahlreiche Änderungen/Variationen für den Fachmann ersichtlich sein, die als in den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung fallend erachtet werden. Daher ist vorgesehen, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung nur durch den Umfang der beigefügten Ansprüche begrenzt wird. Darüber hinaus soll die Reihenfolge der aufgelisteten Ansprüche nicht so ausgelegt werden, dass sie den Umfang einer bestimmten Bestimmung in den Ansprüchen einschränkt.Although the arrangement shown is preferred, other arrangements / embodiments are possible. However, numerous changes / variations should now be apparent to those skilled in the art, which are deemed to fall within the scope of the present invention. Therefore, it is intended that the scope of the present invention be limited only by the scope of the appended claims. In addition, the order of listed claims should not be construed to limit the scope of any particular provision in the claims.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

• US 4147621 [0002, 0007]US 4147621 [0002, 0007]
• DE 102017107857 A1 [0005]DE 102017107857 A1 [0005]

Claims (4)

Vorrichtung zur kontinuierlichen Erkennung und Charakterisierung von Substanzen, die in wässrigen oder organischen Flüssigkeiten gelöst, dispergiert oder suspendiert sind, umfassend a) ein chromatographisches System zur Probentrennung basierend auf einem Verfahren der Feldflussfraktionierung (FFF), b) eine Durchfluss-Messzelle, die stromabwärts im Flusspfad des Trennsystems angeordnet ist und über mindestens eine lichtdurchlässige Wandfläche (Fenster) verfügt, c) ein Raman-Spektrometer, das an der Durchfluss-Messzelle angeordnet ist und von der fraktionierten Probe gestreutes Licht registriert sowie d) eine Steuerungs- und Berechnungseinheit zur Steuerung der Systemkomponenten und zur Auswertung und Visualisierung der Messdaten aus dem Raman-Spektrometer und anderer Detektoren.Apparatus for the continuous detection and characterization of substances dissolved, dispersed or suspended in aqueous or organic liquids comprising a) a chromatographic system for sample separation based on a method of field flow fractionation (FFF), b) a flow measuring cell, which is arranged downstream in the flow path of the separation system and has at least one translucent wall surface (window), c) a Raman spectrometer located on the flow cell and registering light scattered from the fractionated sample and d) a control and calculation unit for controlling the system components and for evaluating and visualizing the measurement data from the Raman spectrometer and other detectors. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das System zur Probentrennung nach dem Prinzip der Asymmetrischen-Fluss-Feldflussfraktionierung (AF4) mit einem steuerbaren Querfluss als Trennkraft arbeitet.Device after Claim 1 wherein the sample separation system operates on the principle of Asymmetric Flow Field Flow Fractionation (AF4) with a controllable crossflow as the separation force. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das System zur Probentrennung nach dem Prinzip der Zentrifugal-Feldflussfraktionierung (CF3) mit einer steuerbaren Zentrifugalbeschleunigung als Trennkraft arbeitet.Device after Claim 1 in which the sample separation system operates on the principle of centrifugal field flow fractionation (CF3) with a controllable centrifugal acceleration as the separating force. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das System zur Probentrennung auf dem Prinzip der Thermischen-Feldflussfraktionierung (TF3) mit einem steuerbaren Temperaturverlauf als Trennfeld basiert.Device after Claim 1 , wherein the system for sample separation based on the principle of thermal field flow fractionation (TF3) with a controllable temperature profile as a separation field.

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