WO2018124005A1 - 被験物質の免疫原性を評価する方法 - Google Patents

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secreting
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immunogenicity
cell population
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千代美 久保
茂記 本山
義之 荒田
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中外製薬株式会社
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
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    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/55—IL-2

Definitions

  • the present invention relates to an immunogenicity evaluation method characterized by the detection time and detection method of IL-2 in IL-2 secreting cells. Furthermore, the present invention relates to a method for screening a drug candidate substance, characterized by evaluating the immunogenicity of a test substance.
  • ADA Anti-drug antibodies
  • test substances with lower immunogenicity are selected as candidates by screening.
  • Methods are being researched.
  • One approach is to stimulate human tissue-derived cells with a test substance and use the number of cells producing IL-2 and other cytokines as an evaluation index when T cells proliferate and the cell proliferates during an immune response. It has been known. (For example, refer to Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Documents 3 and 4 it has been reported that even when stimulated with a substance that is not so immunogenic, such as a protein preparation (for example, an antibody preparation), there are very few T cells that react with the substance. In fact, there are few donors that produce cytokines by stimulation of protein preparations before T cells actively proliferate, and the level of specific T cell proliferation in response to the stimulation and It has been reported that the frequency of donors produced varies depending on the protein preparation used for stimulation (Non-patent Document 1). Thus, as an index for evaluating the immunogenicity of a test substance, attention is focused on the proliferation of T cells due to an immune response to the test substance and the production of cytokines when the cell proliferation is active.
  • the conventional method when the immunogenicity of a test substance is evaluated using the immune response of T cells, or when a drug candidate substance is screened from the test substance, proliferation of T cells becomes active. It takes a certain amount of time before T cell proliferation can be detected at the protein level because it is evaluated or screened at a certain time (5-7 days after the start of culture in the presence of the test substance) . Therefore, the conventional method is not sufficient in terms of efficiency as a process for selecting candidate substances suitable for pharmaceutical products.
  • This invention makes it a subject to evaluate immunogenicity for a short time after the culture
  • the present inventors conducted intensive studies to identify early markers useful for evaluating immunogenicity and, consequently, screening for drug candidates. That is, the present invention evaluates the immunogenicity of a test substance or a drug candidate substance before T cell proliferation becomes active in an immune response of T cells (less than 5 days after the start of culture in the presence of the test substance)
  • An object of the present invention is to provide an index suitable for screening.
  • Another object of the present invention is to provide a method for evaluating the immunogenicity of a test substance or screening a drug candidate substance in a short time in an immune response of a T cell.
  • the candidate substance can be selected from the test substances efficiently and at low cost by reducing the time required for the immunogenicity evaluation of the test substance and screening of the drug candidate substance, and performing more trial and error. Provide a method.
  • the present inventors have established an index useful for shortening the time required for immunogenicity evaluation, a timing and method for detecting the index, and an efficient screening of candidate substances.
  • an immunogenicity evaluation index A method for detecting IL-2 secreting cells, which are extremely few at that stage, and a method for screening candidate substances efficiently and at low cost by implementing the entire evaluation system in a short time.
  • a method for evaluating the immunogenicity of a test substance comprising the following steps: (A) culturing a cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells, together with a test substance; (B) a step of detecting T cells secreting IL-2 in the cell population cultured in step (a) at a time point in the early stage of IL-2 secretion, (C) A step of calculating a ratio occupied by the IL-2 secreting T cells detected in the step (b).
  • APC antigen-presenting cells
  • CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells
  • [2] The method according to [1], wherein the cell population derived from blood is a cell population derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the time point of the initial stage of IL-2 secretion is before the proliferation of the T cells becomes active.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the time point of the initial IL-2 secretion is between 24 hours and 72 hours after the start of the culture.
  • the test substance is selected from the group consisting of proteins, peptides, nucleic acids, carbohydrates, lipids, vaccines, two or more conjugates thereof, and a mixture containing two or more combinations thereof.
  • the calculation of the ratio of the IL-2 secreting T cells is to measure the number of the cells by flow cytometry.
  • the present invention also provides the following inventions.
  • the method further includes the step of determining that the immunogenicity of the test substance is low when the proportion of the IL-2 secreting T cells calculated in the step (c) is equal to or lower than the control level, [1] ] To [9].
  • the proportion of IL-2 secreting T cells calculated in step (c) when the control level is cultured in the presence of a substance known to have low immunogenicity (low immunogenic control) The method of [10], which is a level).
  • the method further includes the step of determining that the immunogenicity of the test substance is high when the ratio of the IL-2 secreting T cells calculated in the step (c) is equal to or higher than the control level, [1] ] To [9].
  • the control level is the ratio (negative control level) occupied by IL-2 secreting T cells calculated in step (c) when the cell population of step (a) is cultured in the absence of the test substance.
  • the method further includes the step of selecting the test substance as a drug candidate substance when the ratio of the IL-2 secreting T cells calculated in the step (c) is lower than the control level, [1] to [9] Either way.
  • IL-2 secreting T cells for use in evaluating the immunogenicity of a test substance.
  • a method for measuring the ratio of IL-2 secreting CD4 + T cells in a cell population cultured with a test substance for evaluating the immunogenicity of the test substance comprising the following steps: (A) culturing a cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells, together with a test substance; (B) a step of detecting T cells secreting IL-2 in the cell population cultured in step (a) at a time point in the early stage of IL-2 secretion, (C) A step of calculating a ratio occupied by the IL-2 secreting T cells detected in the step (b).
  • APC antigen-presenting cells
  • CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells
  • a method for selecting a substance (variant) having reduced immunogenicity or a method for evaluating whether the immunogenicity of the variant has been reduced comprising the following steps: (A) A step of culturing a cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells together with a modified or non-modified product , (B) a step of detecting T cells secreting IL-2 in the cell population cultured in step (a) at a time point in the early stage of IL-2 secretion, (C) calculating the proportion of IL-2 secreting T cells detected in step (b), (D) When the proportion of IL-2 secreting T cells calculated in step (c) when cultured with the modified body is lower than the ratio when cultured with the unmodified body, the immunity of the modified body A step of determining that the originality is reduced.
  • APC antigen-presenting cells
  • CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8
  • a method for screening a drug candidate substance comprising the following steps: (A) culturing a cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells, together with a test substance; (B) a step of detecting T cells secreting IL-2 in the cell population cultured in step (a) at a time point in the early stage of IL-2 secretion, (C) calculating the proportion of IL-2 secreting T cells detected in step (b), (D) A step of selecting as a drug candidate substance when the proportion of IL-2 secreting T cells calculated in step (c) is lower than the control level.
  • APC antigen-presenting cells
  • CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells
  • a method for predicting a response to immunotherapy by a subject test substance comprising the following steps: (A) A cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells derived from blood obtained from a subject and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells is cultured with a test substance.
  • APC antigen-presenting cells
  • CD4 + T cells derived from blood obtained from a subject and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells
  • Process (B) a step of detecting T cells secreting IL-2 in the cell population cultured in step (a) at a time point in the early stage of IL-2 secretion, (C) calculating the proportion of IL-2 secreting T cells detected in step (b), (D) A step of determining that the subject has high responsiveness to immunotherapy with the test substance when the ratio of the IL-2 secreting T cells calculated in step (c) is higher than the control level.
  • a kit for evaluating the immunogenicity of a test substance comprising an IL-2 detection reagent and a control substance known to have high immunogenicity.
  • the present invention it is possible to provide a method for shortening the time required for evaluating the immunogenicity of a test substance or the time required for screening a drug candidate substance in an immune response of T cells. Furthermore, according to the present invention, the time of one cycle required for the evaluation of the immunogenicity of a test substance and the screening of a drug candidate substance can be shortened, and more trial and error can be performed. A method for selecting a candidate substance at a cost can be provided.
  • FIG. 3 is a graph showing the maximum value of the ratio of IL-2 secreting CD4 + T cells in CD8 ⁇ CD25 low PBMC cultured for 24 to 72 hours in the presence of various test substances (100 ⁇ g / mL / well). The data shows the results for each donor from which the PBMC used were derived.
  • NA No Ag: no antigen indicates the result of a negative control cultured in the absence of the test substance. It is a figure which shows the maximum value of the ratio of the IL-2 secretion CD4 + T cell in CD8 - CD25 low PBMC cultured for 67 hours in presence of various test substances (100 microgram / mL / well). The data shows the results for each donor from which the PBMC used were derived. NA (No Ag: no antigen) indicates the result of a negative control cultured in the absence of the test substance.
  • A influenza HA vaccine
  • B antibody alone or antigen-antibody complex
  • C LPS or Factor VIII
  • D HA peptide or IgG peptide
  • the present invention relates to an immunogenicity evaluation method based on the proportion of IL-2 secreting T cells. More specifically, the present invention relates to the proportion of IL-2 secreting T cells in the cell population cultured with the test substance, preferably the proportion of IL-2 secreting T cells at the time point of early IL-2 secretion, more preferably Is before active T cell proliferation (less than 5 days after the start of culture in the presence of the test substance, preferably 24-72 hours after the start of culture, for example, 24-67 hours, 24-62 hours after the start of culture) , 24-48 hours, 24-42 hours, 42-72 hours, 42-67 hours, 42-62 hours, 42-48 hours, 48-72 hours, 48-67 hours, 48-62 hours, 62-72 hours , 62-67 hours, 67-72 hours, etc.) of IL-2 secreting T cells, even more preferably about 42 hours to about 72 hours after initiation of culture in the presence of the test substance, particularly preferably The present invention relates to a method for evaluating the immunogenic
  • test substance is not particularly limited as long as it is a substance to be evaluated for immunogenicity.
  • a protein eg, antibody or vaccine
  • non-protein eg, peptide, nucleic acid, High molecular weight or low molecular weight compounds other than proteins, including carbohydrates, lipids, or vaccines
  • protein and non-protein conjugates eg, glycosylated antibodies
  • non-protein and non-protein conjugates eg , Glycolipid or peptide nucleic acid conjugates
  • mixtures in which two or more thereof are combined Two or more combinations may belong to the same category or may belong to different categories, and are not limited.
  • test substance in the present invention examples include impurities such as antibodies, peptides, vaccines, immune complexes, adjuvants, blood components, and endotoxins that can be mixed into the preparation.
  • impurities such as antibodies, peptides, vaccines, immune complexes, adjuvants, blood components, and endotoxins that can be mixed into the preparation.
  • the test substance is an antibody.
  • the cell population cultured with the test substance comprises antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells derived from blood, CD8 + T cells (cytotoxic T cells) and CD25 + T
  • An antigen-presenting cell (APC) that is a cell population substantially free of cells (CD25 positive activated T cells and / or regulatory T cells), preferably derived from, for example, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) And a CD4 + T cell, and a cell population substantially free of CD8 + and CD25 + cells.
  • the blood is preferably derived from mammals, particularly preferably from humans.
  • the IL-2 to be detected is preferably mammalian IL-2, particularly preferably human IL-2.
  • the blood may be fresh blood or stored blood, for example frozen blood. Preferred is preserved blood from the viewpoint of easy availability, and particularly preferred is frozen blood.
  • Methods for removing CD8 + T cells and CD25 + T cells from blood-derived cell populations are known to those skilled in the art and include, for example, anti-CD8 antibodies and anti-CD8 antibodies as described in the Examples section herein. It can be performed using a CD25 antibody.
  • a cell population from which CD8 + T cells and CD25 + T cells have been removed from blood in advance can be used in the method of the present invention.
  • a cell population derived from blood that is substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells, and CD4 + CD25 ⁇ T cells added thereto can be used.
  • the method of the present invention may include the step of removing the CD8 + T cells and CD25 + T cells from a cell population derived from blood, blood derived, CD8 + T cells and CD25 + T cells removed Preparing a prepared cell population, or preparing a cell population substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells plus CD4 + CD25 - T cells. But you can.
  • the culture of the cell population can be carried out by a method known to those skilled in the art, for example, by the method described in the Examples section of the present specification. It is not limited.
  • the cell population is prepared to 1x10 6 / ml with OpTmizer CTS T-cell Expansion SFM (gibco), seeded at 1 ml / well in a flat-bottomed 24 well plate, and pre-cultured in a 37 ° C, 5% CO 2 incubator for 1 hour To do.
  • the test substance is then added and incubated to the appropriate time point for evaluation. When the appropriate time point is reached, add IL-2 catch reagent (IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec) at 10 ⁇ l / well and further incubate for 1 hour.
  • IL-2 catch reagent IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec
  • a donor refers to a subject from which a blood-derived cell population has been obtained.
  • the ratio of IL-2 secreting T cells as an evaluation index of immunogenicity is the ratio of IL-2 secreting T cells in all cells cultured with the test substance.
  • IL-2 secreting CD4 + T cells Is the ratio of IL-2 secreting CD4 + T cells (molecules) in all CD4 + T cells (denominator) included in the culture system at the timing of detecting
  • the ratio of IL-2 secreting T cells as an immunogenicity evaluation index is preferably the ratio of IL-2 secreting T cells at the time point of the early stage of IL-2 secretion, more preferably T cell
  • the percentage of IL-2 secreting T cells before proliferation becomes active (less than 5 days after the start of culture in the presence of the test substance), particularly preferably from about 24 hours after the start of culture in the presence of the test substance
  • an antibody is used in the broadest sense and is not limited to these as long as it exhibits a desired antigen-binding activity. However, it is not limited to these antibodies, but includes monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (for example, bispecific antibodies) And various antibody structures, including antibody fragments.
  • An antibody fragment refers to a molecule other than the complete antibody, including a part of the complete antibody that binds to an antigen to which the complete antibody binds. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab ′, Fab′-SH, F (ab ′) 2; diabody; linear antibody; single chain antibody molecule (eg, scFv And multispecific antibodies formed from antibody fragments.
  • detection of IL-2 secreting T cells can be performed by methods known to those skilled in the art, for example, commercially available IL-2 as described in the Examples section of this specification.
  • IL-2 positive cells labeled with a detection reagent can be detected using flow cytometry.
  • the immunogenicity of a test substance can be evaluated by comparing the calculated ratio of IL-2 secreting T cells with an appropriate control level.
  • the “control level” can also be referred to as a control value, a reference value, or a standard value.
  • the cell population is cultured in the presence of an appropriate reference material (control material).
  • the control level can be the mean, median, or a predetermined range around these values (eg, mean +/ ⁇ standard deviation) of the percentage of IL-2 secreting T cells detected.
  • the control level can be set based on a value measured together when assaying for the test substance or a value measured in advance. When setting a control level based on a value measured in advance, it is preferable to set the control level based on a value measured in advance under the same or equivalent conditions as the assay for the test substance.
  • a substance known to have low immunogenicity by other immunogenicity evaluation methods for example, a drug having a low expression rate of an anti-drug antibody in clinical trials, or a CD4 + T cell proliferation inducing ability
  • the proportion of IL-2 secreting T cells in the cell population cultured in the presence of a low-substance substance can be used as a control level in the evaluation of immunogenicity, and the control level is referred to as “low immunogenic control level”. Can be called.
  • the test substance is evaluated as having low immunogenicity
  • the test substance can be evaluated as having high immunogenicity.
  • a substance known to have high immunogenicity by other immunogenicity evaluation methods for example, a drug having a high expression rate of an anti-drug antibody in a clinical trial, or CD4 + T cell proliferation induction
  • the ratio of IL-2 secreting T cells in a cell population cultured in the presence of a substance having a high ability can be used as a control level in the evaluation of immunogenicity, and the control level is “high immunogenic control level”. It can be called.
  • the test substance is evaluated as having high immunogenicity
  • the ratio is low compared to the high immunogenic control level, it can be evaluated that the immunogenicity of the test substance is not high.
  • substances known to have low immunogenicity and substances known to have high immunogenicity are substances whose immunogenicity has been previously evaluated by the evaluation method of the present invention. It may be a known immunogenicity indicator, a substance whose immunogenicity is known based on the clinical drug ADA incidence and the ability to induce CD4 + T cell proliferation. There may be.
  • An example of (but not limited to) a substance that has been shown to be less immunogenic includes, but is not limited to, the protein formulation Enbrel®.
  • An example of a substance known to be highly immunogenic (but not limited to) is KLH.
  • indices are also relative indices similar to the indices of the present invention (ratio of IL-2 secreting T cells), and those skilled in the art will appropriately set the standard of immunogenicity according to the purpose. can do. For example, when the expression rate (frequency of appearance) of an anti-drug antibody in a clinical trial is less than 10%, preferably less than 5%, the expression rate can be evaluated as low (low immunogenicity). Further, for example, when the expression rate is about 30% or more, it can be evaluated that the expression rate is high (high immunogenicity).
  • the proportion of IL-2 secreting T cells in the cell population cultured in the absence of the test substance can be used as a control level in the evaluation of immunogenicity. It can be referred to as the “negative control level”.
  • the immunogenicity of the test substance when the proportion of IL-2 secreting T cells in the cell population cultured in the presence of the test substance is equal or lower than the negative control level Can be evaluated as low and when it is high compared to the negative control level, the immunogenicity of the test substance can be evaluated as not low.
  • a person skilled in the art can evaluate the presence or absence and the level (strength) of the immunogenicity of a test substance by setting an appropriate control level according to the purpose and comparing it. Further, the immunogenicity of a test substance may be evaluated by comparing the ratio of IL-2 secreting T cells calculated in the method of the present invention with the above-mentioned plurality of control levels. Depending on the purpose, immunogenicity may be relatively evaluated based on a plurality of measured values of test substances. Even in that case, it is preferable to use a control level measured under conditions equivalent to the conditions of culture in the presence of the test substance and IL-2 detection.
  • the immunogen of the test substance when the proportion of IL-2 secreting T cells in a cell population cultured in the presence of a test substance is higher than the control level by, for example, 150%, 200%, 250%, or more, the immunogen of the test substance It can be evaluated that the property is high.
  • the immunogenicity of the test substance is reduced when the proportion of IL-2 secreting T cells in the cell population cultured in the presence of the test substance is lower than the control level by, for example, 100%, 75%, 50%, or more. It can be evaluated as low.
  • it can set suitably by the kind of the control level to be used or the purpose of the screening to be implemented.
  • the proportion of IL-2 secreting T cells in the cell population cultured in the presence of the test substance correlates with a known immunogenicity index (expression rate of anti-drug antibody in clinical trials). Clarified (Table 1). Therefore, the proportion of IL-2 secreting T cells in the cell population cultured in the presence of the test substance can be used as a “relative” evaluation index in the evaluation of immunogenicity. For example, in the optimization process of antibody drug candidates, the proportion of IL-2 secreting T cells in cell populations cultured in the presence of different types of modified antibodies is compared with each other, and the proportion is relatively low, that is, Modified antibodies with relatively low immunogenicity can be selected as candidates for antibody drug development.
  • the test substance when the proportion of IL-2 secreting T cells in a cell population cultured in the presence of a test substance is lower than a predetermined control level (threshold), the test substance is a pharmaceutical product with low immunogenicity. Can be selected as a candidate substance.
  • the control level can be set according to the purpose of screening, but the value or range when the conditions such as the timing for detecting IL-2 secreting T cells are equivalent is preferably used as the control level.
  • IL-2 secreting T cells for a cell population cultured in the presence of a substance known to have low immunogenicity is obtained by using the ratio of IL-2 secreting T cells for the test substance. Can be compared to a low immunogenic control level.
  • the proportion of IL-2 secreting T cells in the cell population cultured in the presence of the modified antibody is the proportion of the antibody before modification ( If the level is lower than the control level, the substance can be selected as a candidate for antibody drug development.
  • appropriate values according to the purpose such as the median value, the upper 1/3 value, and the lower 1/3 value of the measurement results of multiple samples are set as control levels, and the candidate substances are selected from a large number of test substances. It is also possible to narrow down.
  • the control level is preferably set as appropriate according to the conditions of culture in the presence of the test substance and IL-2 detection.
  • a donor from which a cell population in which a higher percentage of IL-2 secreting T cells was detected than the control level was obtained was defined as a positive donor, and the ratio of the number of positive donors to the total number of donors tested was an immunogenicity evaluation index. It can also be. Therefore, in the method of the present invention, a donor in which a proportion of IL-2 secreting T cells accounted for higher than the control level is detected as a positive donor, and a positive donor in the total number of donors in the same test. The step of using the above ratio as an evaluation index of immunogenicity may be included.
  • the immunogenicity evaluation method of the present invention specifically includes the following steps: (A) culturing a cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells, together with a test substance; (B) a step of detecting T cells secreting IL-2 in the cell population cultured in step (a) at a time point in the early stage of IL-2 secretion, (C) A step of calculating a ratio occupied by the IL-2 secreting T cells detected in the step (b).
  • APC antigen-presenting cells
  • CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells
  • the present invention also relates to the use of IL-2 secreting T cells for assessing the immunogenicity of a test substance and IL-2 secreting T cells for use in assessing the immunogenicity of a test substance.
  • the IL-2 secreting T cells are preferably IL-2 secreting T cells at a time point in the early stage of IL-2 secretion, and more preferably IL-2 secretion before T cell proliferation becomes active.
  • a cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells can be substantially referred to as a cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells, or an immune response. It can also be referred to as a cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells at a rate that induces.
  • the “cell population substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells” means that the total proportion of CD8 + T cells and CD25 + T cells in the cell population is 10% or less , Preferably 5% or less, particularly preferably 1% or less.
  • the immunogenicity evaluation method of the present invention is a step of comparing the ratio of the IL-2 secreting T cells calculated in step (c) with a control level, wherein the ratio is equal to the control level or The method further includes a step of indicating that the test substance is less immunogenic if lower.
  • the immunogenicity evaluation method of the present invention is such that the immunogenicity of a test substance is reduced when the proportion of IL-2 secreting T cells calculated in step (c) is equal to or lower than the control level.
  • the method further includes the step of determining low.
  • the immunogenicity evaluation method of the present invention is a step of comparing the ratio of the IL-2 secreting T cells calculated in step (c) with a control level, wherein the ratio is equal to the control level or The method further includes a step indicating that the immunogenicity of the test substance is higher when it is higher.
  • the immunogenicity evaluation method of the present invention is such that the immunogenicity of a test substance is higher when the proportion of IL-2 secreting T cells calculated in step (c) is equal to or higher than the control level.
  • the method further includes the step of determining high.
  • the proportion of IL-2 secreting T cells calculated in step (c) is the same as that in step (a) in the absence of a test substance.
  • the method further includes the step of determining that the immunogenicity of the test substance is high when it is significantly higher than the ratio (negative control level) when performed.
  • the immunogenicity evaluation method of the present invention is such that the proportion of IL-2 secreting T cells calculated in step (c) is high in immunogenicity in the culture step of step (a).
  • the method further includes the step of determining that the immunogenicity of the test substance is high when the ratio (high immunogenicity control level) when performed in the presence of the known substance is equal to or higher than the ratio.
  • the immunogenicity evaluation method of the present invention shows that the proportion of IL-2 secreting T cells calculated in step (c) is less immunogenic than the culture step of step (a).
  • the method further includes the step of determining that the test substance is low in immunogenicity when it is equal to or less than the ratio (low immunogenicity control level) when performed in the presence of the test substance.
  • the present invention also relates to a method for measuring a helper T cell (Th cell) response to a test substance for evaluating the immunogenicity of the test substance. More specifically, the present invention relates to a method for measuring the proportion of IL-2 secreting CD4 + T cells in a cell population cultured with a test substance for evaluating the immunogenicity of the test substance.
  • the cell population is a blood-derived cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells, and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells. is there.
  • the ratio is a ratio of IL-2 secreting CD4 + T cells at the time point of the early stage of IL-2 secretion in the cell population.
  • the time point is preferably the timing before the proliferation of CD4 + T cells in the cell population becomes active, and particularly preferably between 24 hours and 72 hours after the start of the culture.
  • the present invention also relates to a method for selecting a substance (variant) having reduced immunogenicity, or a method for evaluating whether the immunogenicity of a variant has been reduced.
  • the method includes the following steps: (A) A step of culturing a cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells together with a modified or non-modified product , (B) a step of detecting T cells secreting IL-2 in the cell population cultured in step (a) at a time point in the early stage of IL-2 secretion, (C) calculating the proportion of IL-2 secreting T cells detected in step (b), (D) When the proportion of IL-2 secreting T cells calculated in step (c) when cultured with the modified body is lower than the ratio when cultured with the unmodified body, the immunity of the modified body A step of determining that the originality is reduced.
  • APC antigen-presenting cells
  • variants with reduced immunogenicity can be selected by comparing variants.
  • the proportion of the IL-2 secreting T cells calculated in the step (c) is the same as when cultured with another variant. It is a step of determining that the immunogenicity of the variant is reduced compared to the other variant when lower than the ratio.
  • the present invention also relates to a method for screening a drug candidate substance (lead compound).
  • the method includes the following steps: (A) culturing a cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells, together with a test substance; (B) a step of detecting T cells secreting IL-2 in the cell population cultured in step (a) at a time point in the early stage of IL-2 secretion, (C) calculating the proportion of IL-2 secreting T cells detected in step (b), (D) A step of selecting as a drug candidate substance when the proportion of IL-2 secreting T cells calculated in step (c) is lower than the control level.
  • APC antigen-presenting cells
  • CD4 + T cells derived from blood and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells
  • the control level to be compared with the ratio of the IL-2 secreting T cells calculated in the step (c) can be appropriately set according to the purpose of screening.
  • those having a relatively low IL-2 secreting T cell ratio as compared to other test substances can be selected as candidate substances.
  • a substance having a relatively low IL-2 secreting T cell ratio compared to a preset control level can be selected as a candidate substance.
  • the invention also relates to a method for predicting a response to immunotherapy by a subject test substance.
  • the method includes the following steps: (A) A cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells derived from blood obtained from a subject and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells is cultured with a test substance.
  • a cell population containing antigen-presenting cells (APC) and CD4 + T cells derived from blood obtained from a subject and substantially free of CD8 + T cells and CD25 + T cells is cultured with a test substance.
  • Process (B) a step of detecting T cells secreting IL-2 in the cell population cultured in step (a) at a time point in the early stage of IL-2 secretion, (C) calculating the proportion of IL-2 secreting T cells detected in step (b), (D) A step of determining that the subject has high responsiveness to immunotherapy with the test substance when the ratio of the IL-2 secreting T cells calculated in step (c) is higher than the control level.
  • the present invention also relates to a kit for evaluating the immunogenicity of a test substance.
  • the kit optionally contains a control substance that is known to be highly immunogenic.
  • the kit of the present invention can include a highly immunogenic control substance known to be highly immunogenic and a low immunogenic control substance known to be less immunogenic.
  • the kit of the present invention can include a package insert describing the timing suitable for detecting IL-2 secreting T cells in a cell population cultured in the presence of a test substance.
  • test substance and cell culture A test substance or a positive control substance was added to the cells after the preculture, and the cells were cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for various times.
  • IL-2 secretion assay After culturing in the presence or absence of the test substance or positive control substance, add 10 ⁇ L of IL-2 catch reagent (IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec) to each well, 37 ° C, 5% CO 2 incubator Incubated for 1 hour. Subsequently, the cell suspension was recovered, and the culture solution was removed and washed by centrifugation at 4 ° C.
  • IL-2 catch reagent IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec
  • the cells were washed on a 96-well round-bottom plate as a 150 ⁇ L cell suspension using 4 ° C flow cytometry washing / staining solution on ice (anti-CD3 antibody (BD), anti-CD4 antibody (BD ), Anti-CD14 antibody (BD), IL-2 Detection Antibody (IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec)), and stained at 4 ° C. for 30 minutes under light shielding. Subsequently, the unreacted antibody was removed and washed, and the washed cells were stained with 7AAD (7-Amino-Actinomycin D) for 3 minutes at room temperature in the dark at room temperature. The stained cells were subjected to flow cytometry measurement under the condition of a maximum measurement number of 200,000 using a lymphocyte gate.
  • 7AAD 7-Amino-Actinomycin D
  • the anti-hA33 antibody can be prepared by those skilled in the art by referring to the description of WO1994 / 013805, for example.
  • the ratio of IL-2 secreting T cells detected when cultured in the presence of the commercially available drug Enbrel (Enbrel (registered trademark)), which is known to have low immunogenicity is It was similar to the case of culturing for the same time in the absence of immunostimulant (NA).
  • LONZA HLA-DRB1 coverage: Caucasian 70%, Japanese 60%
  • OpTmizer CTS T-cell Expansion SFM gibco
  • IL-2 secreting cells in the cultured cell population are labeled by adding Miltenyi Biotec IL-2 catch reagent (IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec) to the medium at 10 ⁇ l / well and further culturing for 1 hour. did. Subsequently, the cultured CD8 - CD25 low PBMC was collected at room temperature and then centrifuged at 4 ° C. to remove the supernatant. The cells were suspended in 4 ° C. flow cytometry washing / staining solution on ice, transferred to a round-bottom 96-well plate, and washed.
  • Miltenyi Biotec IL-2 catch reagent IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec
  • the cells were stained with anti-CD3 antibody (BD), anti-CD4 antibody (BD), anti-CD14 antibody (BD) and IL-2 Detection Antibody (IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec) and then washed. After adding 7AAD, it was subjected to flow cytometry, and the ratio of IL-2 secreting CD4 + T cells was measured. The results are shown in FIG.
  • Table 1 shows the results in order from the test substance having the lowest ADA expression rate. This order was consistent with the order of the percentage of IL-2 secreting CD4 + T cells shown in FIG. Specifically, Reopro (Reopro (registered trademark)) and anti-hA33 antibody, which showed a high IL-2 secreting CD4 + T cell ratio in FIG. 3, have a high ADA expression rate in clinical trials in correlation with the ratio. On the other hand, Enbrel (Enbrel (registered trademark)), which had a low IL-2 secreting CD4 + T cell ratio, had a low ADA expression rate.
  • Table 1 also shows the number and proportion of PBMC donors that are evaluated as positive when the IL-2 secreting CD4 + T cell ratio is set to 0.07% or higher, compared to the unstimulated negative control (NA). .
  • NA unstimulated negative control
  • Table 1 shows the number and proportion of PBMC donors that are evaluated as positive when the IL-2 secreting CD4 + T cell ratio is set to 0.07% or higher, compared to the unstimulated negative control (NA).
  • NA unstimulated negative control
  • FIG. 4 shows the results of measuring the ratio of IL-2 secreting cells in the cultured cell population in the same manner as in Example 2-1.
  • the evaluation index of the present invention (IL-2 secreting CD4 + T cells before active proliferation of T cells), which was found to give an evaluation result equivalent to the ADA expression rate, which is a known immunogenicity evaluation index in Example 2.
  • a vaccine influenza HA vaccine: FIG. 5A
  • an antibody B or a complex of antibody B and its antigen FIG. 5B
  • an impurity endotoxin (LPS): FIG. 5C
  • the proportion of IL-2 secreting CD4 + T cells before active proliferation was measured in the same manner as in Example 2. The results are shown in FIG.
  • the immunogenicity evaluation method of the present invention is characterized in that the ratio of IL-2 secreting CD4 + T cells detected at the time point in the early stage of IL-2 secretion is used as an evaluation index. More specifically, the evaluation index is the ratio of IL-2 secreting CD4 + T cells detected at a time point before CD4 + T cell proliferation becomes active in response to stimulation by a test substance. And In general, the proportion of pre-existing T cell repertoires that react specifically with antibody drugs is extremely low, with an average value range of 0.01 to 0.3 per 10 6 CD4 + T cells. Evaluation of immunogenicity at the time point of less than 5 days after initiation of culture in the presence of the test substance (preferably 24-72 hours) is considered difficult because cell activation or proliferation can hardly be detected at the protein level.
  • the previous IL-2 secreting CD4 + T cell ratio was also stable and lower than that of anti-hA33 antibody, and was well correlated with the evaluation results obtained with the conventional evaluation index (Table 1).
  • This may be previously except CD8 + T cells and CD25 + T cells from a cell population) cell population CD8 + T cells and CD25 + T cells that is substantially free of culture with test substance, Evaluation system such as reducing noise by devising the culture method (number of cells, type of medium), leaving highly active T cells by devising the method of using IL-2 catch reagent and IL-2 Detection Antibody, etc. This suggests that stable data could be obtained even with a low positive frequency at the time point of the early stage of IL-2 secretion.
  • the immunogenicity evaluation method of the present invention is useful in that it can evaluate the immunogenicity of a test substance such as a protein preparation (eg, antibody drug) in a shorter time than previously known. is there.
  • a test substance such as a protein preparation (eg, antibody drug)
  • high throughput can be realized in screening of drug candidate substances, which can contribute to acceleration of drug development.

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Abstract

被験物質で刺激されたT細胞集団（好ましくはCD4+T細胞集団）におけるIL-2分泌初期のタイムポイント（好ましくは被験物質による刺激後24時間～72時間）でのIL-2分泌細胞の割合を当該被験物質の免疫原性の指標とすることで、被験物質の免疫原性を短期間で評価できることを見出した。

Description

被験物質の免疫原性を評価する方法
　本発明は、ＩＬ－２分泌細胞におけるＩＬ－２の検出時期および検出方法を特徴とする、免疫原性の評価方法に関する。さらに、本発明は、被験物質の免疫原性を評価することを特徴とする、医薬品候補物質のスクリーニング方法に関する。
　今日、タンパク質などの複雑な構造をした医薬品は数多く上市されている。人体は、体内に異物が入ると免疫応答を引き起こすが、医薬品の分野でも、有効成分がタンパク質に由来するものは、免疫応答の中で異質なタンパク質とみなされ、その医薬品が抗原として作用し、抗薬物抗体（ADA）が産生される可能性はある。ADAが産生されると、医薬品による治療効果が低下するなどの好ましくない影響が出ることや、場合によっては生命の危機につながりかねない免疫応答が惹起され得る。
　このため、有効成分がタンパク質由来の医薬品開発においては、開発の早い段階から多数の被験物質の免疫原性を評価する必要があり、スクリーニングによって免疫原性のより低い被験物質を候補物質として選択する方法の研究が行われている。ひとつのアプローチとして、被験物質でヒト組織由来の細胞を刺激し、免疫応答によるT細胞の増殖や細胞増殖が活発なタイミングでのIL-2などのサイトカインの産生細胞数を評価指標とするアッセイ方法が知られている。（例えば、特許文献１、および非特許文献１参照）。
　T細胞の活性化については、IL-2産生およびIL-2受容体α（CD25）発現の役割が報告されている。（例えば、非特許文献２参照）。この報告において、免疫原性が非常に強いことが知られているマルトース結合タンパク質（MBP）由来ペプチドで刺激した樹状細胞とT細胞を共培養すると、IL-2産生及びT細胞の増殖が誘導されるが、共培養しない場合や抗IL-2受容体α（CD25）抗体を樹状細胞に添加して共培養した場合は当該ペプチドで刺激してもIL-2産生及び増殖はほとんど検出されていない。また、タンパク質製剤（例えば抗体製剤）のように免疫原性がそれほど高くない物質で刺激しても、それに反応するT細胞は極めて少ないことが報告されている（非特許文献３、４）。実際、T細胞が活発に増殖する前の段階ではタンパク質製剤の刺激によってサイトカインを産生するドナーは殆ど認められないこと、当該刺激に応答した特異的なT細胞増殖の程度や増殖に伴ってサイトカインを産生するドナーの頻度は刺激に用いたタンパク質製剤によって異なること、が報告されている（非特許文献１）。このように、被験物質の免疫原性を評価するための指標としては、被験物質に対する免疫応答によるT細胞の増殖や細胞増殖が活発なタイミングでのサイトカインの産生が注目されている。
　本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。なお、これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
特表２００９－５２８０４４号公報
PLoS One. 2016 Aug 5;11(8):e0159328. Nat Med. 2011 May; 17(5): 604-609. FASEB J. 2011 Jun;25(6):2040-2048. Clin Immunol. 2013 Dec;149(3):534-555.
　しかしながら、従来の方法は、T細胞の免疫応答を利用して被験物質の免疫原性を評価する、または被験物質の中から医薬品候補物質をスクリーニングする際に、T細胞の増殖が活発になっている時点（被験物質の存在下での培養開始後5～7日間以降）で評価またはスクリーニングする方法であるため、T細胞の増殖をタンパク質レベルで検出できるようになるまでに一定以上の時間がかかる。そのため、従来の方法は医薬品に適する候補物質を選択するプロセスとしては効率性の面から十分ではない。本願発明は、被験物質の存在下での培養開始後短時間で免疫原性を評価することを課題とする。
　そこで、本発明者らは、免疫原性の評価、ひいては医薬品候補物質のスクリーニングに有用な早期マーカーを同定するために鋭意研究を行った。すなわち、本発明は、T細胞の免疫応答においてT細胞増殖が活発になる前（被験物質の存在下での培養開始後5日未満）の段階で被験物質の免疫原性を評価または医薬品候補物質をスクリーニングするのに適した指標を提供することを目的とする。また本発明は、T細胞の免疫応答において、被験物質の免疫原性の評価、または医薬品候補物質のスクリーニングを短時間で実施する方法を提供することを目的とする。さらに、被験物質の免疫原性評価や医薬品候補物質のスクリーニングに要する１サイクルの時間を短縮し、試行錯誤をより多く行えることにより、被験物質の中から効率的かつ低コストで候補物質を選択する方法を提供する。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、免疫原性の評価にかかる時間を短縮するために有用な指標、その指標を検出可能な時期ならびに検出方法、および効率的な候補物質のスクリーニング方法について鋭意検討した結果、意外にもT細胞増殖が活発になる前の初期反応段階（被験物質の存在下での培養開始後5日間未満）で分泌されるIL-2が免疫原性評価指標として有用であること、その段階では極めて少数しか存在しないIL-2分泌細胞を検出する方法、および評価系全体を短時間で実施することにより効率的かつ低コストで候補物質をスクリーニングする方法を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
［１］以下の工程を含む、被験物質の免疫原性を評価する方法：
　（a）血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
　（b）工程（a）で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
　（c）工程（b）で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程。
［２］血液に由来する前記細胞集団が、末梢血単核球細胞（PBMC）に由来する細胞集団である、［１］の方法。
［３］前記血液がヒト由来である、［１］または［２］の方法。
［４］前記IL-2分泌初期のタイムポイントが、前記T細胞の増殖が活発になる前である、［１］～［３］のいずれかの方法。
［５］前記IL-2分泌初期のタイムポイントが、前記培養開始後24時間～72時間の間である、［１］～［４］のいずれかの方法。
［６］前記被験物質がタンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、ワクチン、およびそれらのうち二つ以上のコンジュゲート、ならびにそれらのうち二つ以上の組み合わせを含む混合物からなる群より選択される、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］前記被験物質がタンパク質である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［８］前記被験物質が抗体である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［９］前記IL-2分泌T細胞が占める割合の算出が、フローサイトメトリーで当該細胞数を測定することである、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
　本発明は、以下の発明も提供する。
［１０］工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルと同等またはそれより低い場合に前記被験物質の免疫原性が低いと決定する工程をさらに含む、［１］～［９］のいずれかの方法。
［１１］前記対照レベルが、免疫原性が低いことがわかっている物質の存在下で培養した場合に工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合（低免疫原性対照レベル）である、［１０］の方法。
［１２］工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルと同等またはそれより高い場合に前記被験物質の免疫原性が高いと決定する工程をさらに含む、［１］～［９］のいずれかの方法。
［１３］前記対照レベルが、免疫原性が高いことがわかっている物質の存在下で培養した場合に工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合（高免疫原性対照レベル）である、［１２］の方法。
［１４］前記対照レベルが、工程（a）の細胞集団を被験物質の非存在下で培養した場合に工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合（陰性対照レベル）である、［１０］または［１２］の方法。
［１５］工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより低い場合に前記被験物質を医薬品の候補物質として選択する工程をさらに含む、［１］～［９］のいずれかの方法。
［１６］工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより高い場合に、ドナー（血液由来の細胞集団を得た対象）において前記被験物質による免疫療法に対する応答性が高いと決定する工程をさらに含む、［１］～［９］のいずれかの方法。
［１７］工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより高い割合のIL-2分泌T細胞が検出されたドナーを陽性ドナーとし、同一試験中の総ドナー数における陽性ドナーの割合を免疫原性の評価指標とする工程をさらに含む、［１］～［９］のいずれかの方法。
［１８］被験物質の免疫原性を評価するための、IL-2分泌T細胞の使用。
［１９］被験物質の免疫原性の評価において使用するためのIL-2分泌T細胞。
［２０］IL-2分泌T細胞の割合を指標とする、免疫原性を評価する方法。
［２１］［１］～［９］のいずれかの方法において免疫原性が低いと評価された被験物質を医薬品の候補物質として選択することを特徴とする、医薬品の候補物質をスクリーニングする方法。
［２２］以下の工程を含む、被験物質の免疫原性を評価するための、被験物質と共に培養された細胞集団におけるIL-2分泌CD4+T細胞が占める割合を測定する方法：
　（a）血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
　（b）工程（a）で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
　（c）工程（b）で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程。
［２３］以下の工程を含む、免疫原性が低減された物質（改変体）を選択するための方法、または改変体の免疫原性が低減されているか評価する方法：
　（a）血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を改変体または非改変体とともに培養する工程、
　（b）工程（a）で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
　（c）工程（b）で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程、
　（d）改変体とともに培養した場合に工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が、非改変体とともに培養した場合の前記割合よりも低い場合に、前記改変体の免疫原性が低減されていると判定する工程。
［２４］以下の工程を含む、医薬品の候補物質をスクリーニングする方法：
　（a）血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
　（b）工程（a）で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
　（c）工程（b）で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程、
　（d）工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより低い場合に医薬品の候補物質として選択する工程。
［２５］以下の工程を含む、対象の被験物質による免疫療法に対する応答を予測する方法：
　（a）対象から得られた血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
　（b）工程（a）で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
　（c）工程（b）で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程、
　（d）工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより高い場合に前記対象の前記被験物質による免疫療法に対する応答性が高いと決定する工程。
［２６］IL-2検出試薬および免疫原性の高さがわかっている対照物質を含む、被験物質の免疫原性を評価するためのキット。
　本発明によれば、T細胞の免疫応答において、被験物質の免疫原性の評価にかかる時間、あるいは医薬品候補物質のスクリーニングにかかる時間を短縮する方法を提供することができる。
　さらに、本発明によれば、被験物質の免疫原性の評価や医薬品候補物質のスクリーニングに要する１サイクルの時間を短縮し、試行錯誤をより多く行えることにより、被験物質の中から効率的かつ低コストで候補物質を選択する方法を提供することができる。
KLH（Keyhole limpet hemocyanin）（100μg/mL/well）の存在下または非存在下で67時間培養したCD8-CD25lowPBMCにおけるIL-2分泌CD4+T細胞の割合をフローサイトメトリーにより分析した結果を示す図である。NA（No Ag：抗原無し）は被験物質の非存在下で培養した陰性対照の結果を示す。 各種被験物質（100μg/mL/well）の存在下で24～72時間培養したCD8-CD25lowPBMCにおけるIL-2分泌CD4+T細胞の割合の最大値を示す図である。データは、用いたPBMCが由来するドナーごとの結果を示している。NA（No Ag：抗原無し）は被験物質の非存在下で培養した陰性対照の結果を示す。 各種被験物質（100μg/mL/well）の存在下で67時間培養したCD8-CD25lowPBMCにおけるIL-2分泌CD4+T細胞の割合の最大値を示す図である。データは、用いたPBMCが由来するドナーごとの結果を示している。NA（No Ag：抗原無し）は被験物質の非存在下で培養した陰性対照の結果を示す。 各種被験物質（100μg/mL/well）の存在下で67時間培養したCD8-CD25lowPBMCにおけるIL-2分泌CD4+T細胞の割合の最大値を示す図である。データは、用いたPBMCが由来するドナーごとのIL-2分泌CD4+T細胞の割合の最大値を示している。NA（No Ag：抗原無し）は被験物質の非存在下で培養した陰性対照の結果を示す。 インフルエンザHAワクチン（Ａ）、抗体単独もしくは抗原抗体複合体（Ｂ）、LPSもしくはFactor VIII（Ｃ）、またはHAペプチドもしくはIgGペプチド（Ｄ）の存在下で24～67時間培養したCD8-CD25lowPBMCにおけるIL-2分泌CD4+T細胞の割合の最大値を示す図である。データは、用いたPBMCが由来するドナーごとの結果を示している。NA（No Ag：抗原無し）は被験物質の非存在下で培養した陰性対照の結果を示す。
　本発明は、IL-2分泌T細胞の割合に基づく免疫原性の評価方法に関する。より具体的には、本発明は、被験物質と共に培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合、好ましくはIL-2分泌初期のタイムポイントにおけるIL-2分泌T細胞の割合、より好ましくはT細胞の増殖が活発な時より前（被験物質の存在下での培養開始後5日間未満、好ましくは培養開始後24～72時間、例えば、培養開始後24～67時間、24～62時間、24～48時間、24～42時間、42～72時間、42～67時間、42～62時間、42～48時間、48～72時間、48～67時間、48～62時間、62～72時間、62～67時間、67～72時間等）のIL-2分泌T細胞の割合、さらにより好ましくは被験物質の存在下での培養開始後約42時間～約72時間、特に好ましくは被験物質の存在下での培養開始後約48時間～約67時間、におけるIL-2分泌T細胞の割合を指標として被験物質の免疫原性を評価する方法に関する。
　本発明との関連において、「T細胞の増殖が活発な時」は、例えば、抗原特異的なT細胞が抗原非依存的に増殖できる時期、あるいはT細胞が機能発現に向けて分化した時期と表現することもできる。
　本発明との関連において、「被験物質」は、免疫原性の評価対象となる物質であれば特に限定されないが、例えば、タンパク質（例えば、抗体またはワクチン）、非タンパク質（例えば、ペプチド、核酸、糖質、脂質、またはワクチンを含む、タンパク質以外の高分子化合物または低分子化合物）、タンパク質と非タンパク質とのコンジュゲート（例えば、糖鎖修飾抗体）、非タンパク質と非タンパク質とのコンジュゲート（例えば、糖脂質またはペプチド核酸コンジュゲート）、ならびにそれらから二つ以上組み合わされる混合物を挙げることができる。二つ以上の組み合わせは、同一カテゴリーに属するものでもよく、異なるカテゴリーに属するものでもよく、限定されない。本発明における被験物質の例として、抗体、ペプチド、ワクチン、免疫複合体、アジュバント、血液成分、製剤に混入しうるエンドトキシン等の不純物を挙げることができる。本発明の特定の態様において、被験物質は抗体である。
　本発明との関連において、被験物質と共に培養する細胞集団は、血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞（細胞障害性T細胞）およびCD25+T細胞（CD25陽性の活性化T細胞および/または制御性T細胞）を実質的に含まない細胞集団であり、好ましくは例えば末梢血単核球細胞（PBMC）に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+細胞およびCD25+細胞を実質的に含まない細胞集団である。前記血液は好ましくは哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。したがって検出されるIL-2は好ましくは哺乳動物のIL-2であり、特に好ましくはヒトIL-2である。前記血液は、新鮮血液であってもよいし、保存血液、例えば凍結された血液であってもよい。好ましくは、入手の容易さの観点から保存血液であり、特に好ましくは凍結血液である。
　血液に由来する細胞集団からCD8+T細胞およびCD25+T細胞を除去する方法は当業者に公知であり、例えば、本明細書の実施例の項に記載されているように抗CD8抗体および抗CD25抗体を利用して実施することができる。一方、血液から予めCD8+T細胞およびCD25+T細胞が除去された細胞集団を本発明の方法に利用することもできる。あるいは、血液に由来する細胞集団であってCD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団に、CD4+CD25-T細胞を加えたものを利用することもできる。したがって、本発明の方法は、血液に由来する細胞集団からCD8+T細胞およびCD25+T細胞を除去する工程を含んでもよいし、血液に由来する、CD8+T細胞およびCD25+T細胞が除去された細胞集団を用意する工程を含んでもよいし、あるいはCD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団に、CD4+CD25-T細胞を加えたものを用意する工程を含んでもよい。
　本発明において、前記細胞集団の培養は、当業者に公知の方法によって実施することができ、例えば、本明細書の実施例の項に記載された方法によって実施することができるが、当該方法に限定されるものではない。好ましくは、細胞集団はOpTmizer CTS T-cell Expansion SFM (gibco)で1x106/mlに調製し、1ml/wellで平底の24well plateに播種し37℃、5％CO2インキュベーター内で1時間前培養する。その後被験物質を加え、評価に適切なタイムポイントまで培養する。適切なタイムポイントになったらIL-2 catch reagent (IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec) を10μl/wellで添加し、更に1時間培養する。
　本発明において、ドナーとは、血液由来の細胞集団を得た対象をいう。
　本発明において、免疫原性の評価指標とするIL-2分泌T細胞の割合は、被験物質と共に培養した全細胞におけるIL-2分泌T細胞の割合であり、例えばIL-2分泌CD4+T細胞を検出するタイミングでの培養系に含まれる全てのCD4+T細胞（分母）におけるIL-2分泌CD4+T細胞（分子）の割合である。
　本発明において、免疫原性の評価指標とするIL-2分泌T細胞の割合は、好ましくはIL-2分泌初期のタイムポイントにおけるIL-2分泌T細胞の割合であり、より好ましくはT細胞の増殖が活発になる前（被験物質の存在下での培養開始後5日間未満）のIL-2分泌T細胞の割合であり、特に好ましくは被験物質の存在下での培養開始後約24時間～約72時間におけるIL-2分泌T細胞の割合であり、最も好ましくは被験物質の存在下での培養開始後約48時間～約67時間におけるIL-2分泌CD4+T細胞の割合である。
　本発明において、抗体とは最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
　また、抗体断片とは、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
　本発明において、IL-2分泌T細胞の検出は、当業者に公知の方法によって実施することができ、例えば、本明細書の実施例の項に記載されているように、市販のIL-2検出試薬により標識されたIL-2陽性細胞をフローサイトメトリーを利用して検出することができる。
　本発明において、算出されたIL-2分泌T細胞の割合を適切な対照レベルと比較することによって被験物質の免疫原性を評価することができる。本発明との関連において、「対照レベル」とは、対照値、参照値、基準値と呼ぶこともでき、例えば、適切な参照物質（対照物質）の存在下で前記の細胞集団を培養して検出したIL-2分泌T細胞の割合の平均値、中央値、またはそれらの値の前後の所定の範囲（例えば、平均値＋/－標準偏差）を対照レベルとすることができる。対照レベルは、被験物質についてアッセイする際に共に測定された値、または予め測定された値に基づいて設定することができる。予め測定された値に基づいて対照レベルを設定する場合、被験物質についてのアッセイと同じまたは同等の条件で予め測定された値に基づいて対照レベルを設定することが好ましい。
　本発明の一態様において、他の免疫原性評価方法により免疫原性が低いことがわかっている物質（例えば、臨床試験における抗薬物抗体の発現率が低い薬物、あるいはCD4+T細胞増殖誘導能が低い物質）の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合を免疫原性の評価における対照レベルとすることができ、当該対照レベルは「低免疫原性対照レベル」と称することができる。その場合、被験物質の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合が低免疫原性対照レベルと同等またはより低い場合に、当該被験物質の免疫原性は低いと評価することができ、また、前記割合が低免疫原性対照レベルと比較して高い場合に、当該被験物質の免疫原性は高いと評価することができる。
　本発明の別の態様において、他の免疫原性評価方法により免疫原性が高いことがわかっている物質（例えば、臨床試験における抗薬物抗体の発現率が高い薬物、あるいはCD4+T細胞増殖誘導能が高い物質）の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合を免疫原性の評価における対照レベルとすることができ、当該対照レベルは「高免疫原性対照レベル」と称することができる。その場合、被験物質の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合が高免疫原性対照レベルと同等またはより高い場合に、当該被験物質の免疫原性は高いと評価することができ、また、前記割合が高免疫原性対照レベルと比較して低い場合に、当該被験物質の免疫原性は高くないと評価することができる。
　本発明との関連において、免疫原性が低いことがわかっている物質および免疫原性が高いことがわかっている物質は、本発明の評価方法によって予め免疫原性が評価されている物質であってもよいし、公知の免疫原性指標である、臨床試験における抗薬物抗体の発現率（clinical ADA incidence）やCD4+T細胞増殖誘導能に基づいて免疫原性の高低がわかっている物質であってもよい。免疫原性が低いことがわかっている物質の例として（これに限定されないが）、タンパク質製剤のエンブレル（登録商標）が挙げられる。また、免疫原性が高いことがわかっている物質の例として（これに限定されないが）、KLHが挙げられる。これらの指標も本発明の指標（IL-2分泌T細胞の割合）と同様に相対的な指標であり、当業者であれば免疫原性の高低（強弱）の基準を目的に応じて適宜設定することができる。例えば、臨床試験における抗薬物抗体の発現率（出現頻度）が10％未満、好ましくは5%未満である場合に当該発現率が低い（免疫原性が低い）と評価することができる。また、例えば、当該発現率が約30％以上である場合に当該発現率が高い（免疫原性が高い）と評価することができる。
　本発明のさらに別の態様において、被験物質の非存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合を免疫原性の評価における対照レベルとすることもでき、当該対照レベルは「陰性対照レベル」と称することができる。本発明の特定の態様において、被験物質の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合が、陰性対照レベルと比較して同等またはそれより低い場合に被験物質の免疫原性は低いと評価することができ、陰性対照レベルと比較して高い場合に被験物質の免疫原性は低くないと評価することができる。
　当業者であれば、目的に応じて適切な対照レベルを設定し、それと比較することによって被験物質の免疫原性の有無や高低（強弱）を評価することができる。また、本発明の方法において算出されるIL-2分泌T細胞の割合を上記の複数の対照レベルと比較することによって被験物質の免疫原性を評価してもよい。目的によっては、被験物質同士の複数の測定値に基づいて相対的に免疫原性を評価してもよい。その場合も、被験物質の存在下での培養およびIL-2検出の条件と同等の条件で測定された対照レベルを用いることが好ましい。
　本発明において、被験物質の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞の割合が対照レベルから例えば150％、200％、250％、またはそれ以上高い場合に、当該被験物質の免疫原性が高いと評価することができる。また、被験物質の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞の割合が対照レベルから例えば100％、75％、50％、またはそれ以上低い場合に、当該被験物質の免疫原性が低いと評価することができる。これらの評価基準については、用いる対照レベルの種類によって、あるいは実施するスクリーニングの目的によって、適宜設定することができる。
　本発明者らは、被験物質の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合は、公知の免疫原性指標（臨床試験における抗薬物抗体の発現率）と相関することを明らかにした（表１）。したがって、被験物質の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合は、免疫原性の評価における「相対的な」評価指標として利用することができる。例えば、抗体医薬品候補の最適化プロセスにおいて、異なる複数種の改変抗体の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合を相互に比較し、当該割合が相対的に低い、すなわち免疫原性が相対的に低い改変抗体を抗体医薬品開発の候補として選択することができる。
　本発明のスクリーニング方法において、被験物質の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合が所定の対照レベル（閾値）より低い場合に、当該被験物質を免疫原性が低い医薬品の候補物質として選択することができる。前記対照レベルはスクリーニングの目的に応じて設定され得るが、IL-2分泌T細胞を検出するタイミング等の条件が同等の場合の値または範囲を対照レベルとすることが好ましい。医薬品の候補物質のスクリーニング方法においては、被験物質についてのIL-2分泌T細胞割合を、免疫原性が低いことがわかっている物質の存在下で培養した細胞集団についてのIL-2分泌T細胞の割合である低免疫原性対照レベルと比較することができる。抗体医薬品候補の最適化プロセスにおける免疫原性の低い改変抗体のスクリーニング方法においては、改変抗体の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合が改変前の抗体における当該割合（対照レベル）より低い場合に当該物質を抗体医薬品開発の候補として選択することができる。また、多検体の測定結果の中央値、上位1/3の値、下位1/3の値などの目的に応じた適切な値を対照レベルとして設定し、多数の被験物質の中から候補物質の絞り込みを行うこともできる。
　前記対照レベルは、被験物質の存在下での培養およびIL-2検出の条件によって適宜設定することが好ましい。また、前記対照レベルより高い割合のIL-2分泌T細胞が検出された細胞集団が得られたドナーを陽性ドナーとし、試験された総ドナー数における陽性ドナー数の割合を免疫原性の評価指標とすることもできる。したがって、本発明の方法は、IL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより高い割合のIL-2分泌T細胞が検出されたドナーを陽性ドナーとし、同一試験中の総ドナー数における陽性ドナーの割合を免疫原性の評価指標とする工程を含んでもよい。
　本発明の免疫原性評価方法は、具体的には以下の工程を含む：
　（a）血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
　（b）工程（a）で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
　（c）工程（b）で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程。
　本発明はまた、被験物質の免疫原性を評価するためのIL-2分泌T細胞の使用、および被験物質の免疫原性の評価において使用するためのIL-2分泌T細胞にも関する。これらの発明において、IL-2分泌T細胞は、好ましくはIL-2分泌初期のタイムポイントにおけるIL-2分泌T細胞であり、より好ましくはT細胞の増殖が活発になる前のIL-2分泌T細胞であり、さらに好ましくは被験物質の存在下での培養開始後24時間～72時間のIL-2分泌T細胞である。
　本発明において、「抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含む細胞集団」とは、実質的に抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含む細胞集団ということもでき、あるいは免疫応答が惹起される割合で抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含む細胞集団ということもできる。
　本発明において、「CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団」とは、当該細胞集団におけるCD8+T細胞およびCD25+T細胞の合計が全体に占める割合が10％以下、好ましくは5％以下、特に好ましくは1％以下である細胞集団を意味する。
　一態様において、本発明の免疫原性評価方法は、工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を対照レベルと比較する工程であって、該割合が対照レベルと同等またはそれより低い場合に被験物質の免疫原性が低いことを示す、工程をさらに含む。別の態様において、本発明の免疫原性評価方法は、工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルと同等またはそれより低い場合に被験物質の免疫原性が低いと決定する工程をさらに含む。
　一態様において、本発明の免疫原性評価方法は、工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を対照レベルと比較する工程であって、該割合が対照レベルと同等またはそれより高い場合に被験物質の免疫原性が高いことを示す、工程をさらに含む。別の態様において、本発明の免疫原性評価方法は、工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルと同等またはそれより高い場合に被験物質の免疫原性が高いと決定する工程をさらに含む。また別の態様において、本発明の免疫原性評価方法は、工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が、工程（a）の培養工程を被験物質の非存在下で実施した場合の該割合（陰性対照レベル）より有意に高い場合に被験物質の免疫原性が高いと決定する工程をさらに含む。さらに別の態様において、本発明の免疫原性評価方法は、工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が、工程（a）の培養工程を免疫原性が高いことがわかっている物質の存在下で実施した場合の該割合（高免疫原性対照レベル）と同等以上である場合に被験物質の免疫原性が高いと決定する工程をさらに含む。他の態様において、本発明の免疫原性評価方法は、工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が、工程（a）の培養工程を免疫原性が低いことがわかっている物質の存在下で実施した場合の該割合（低免疫原性対照レベル）と同等以下である場合に被験物質の免疫原性が低いと決定する工程をさらに含む。
　本発明はまた、被験物質の免疫原性を評価するための、被験物質に対するヘルパーT細胞（Th細胞）応答を測定する方法に関する。より具体的には、本発明は、被験物質の免疫原性を評価するための、被験物質と共に培養された細胞集団におけるIL-2分泌CD4+T細胞が占める割合を測定する方法に関する。本発明の測定方法の一態様において、前記細胞集団は、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない血液由来の細胞集団である。本発明の測定方法の一態様において、前記割合は、前記細胞集団におけるIL-2分泌初期のタイムポイントでのIL-2分泌CD4+T細胞の割合である。前記タイムポイントは、好ましくは前記細胞集団におけるCD4+T細胞の増殖が活発になる前のタイミングであり、特に好ましくは、前記培養開始後24時間～72時間の間である。
　本発明は、免疫原性が低減された物質（改変体）を選択するための方法、または改変体の免疫原性が低減されているか評価する方法にも関する。一態様において、当該方法は以下の工程を含む：
　（a）血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を改変体または非改変体とともに培養する工程、
　（b）工程（a）で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
　（c）工程（b）で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程、
　（d）改変体とともに培養した場合に工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が、非改変体とともに培養した場合の前記割合よりも低い場合に、前記改変体の免疫原性が低減されていると判定する工程。
　前記方法の別の態様において、改変体同士を比較して免疫原性がより低減された改変体を選択することができる。このような態様においては、前記工程（d）は、ある改変体とともに培養した場合に工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が、別の改変体とともに培養した場合の前記割合よりも低い場合に、前記改変体の免疫原性が前記別の改変体と比べて低減されていると判定する工程である。
　本発明は、医薬品の候補物質（リード化合物）をスクリーニングする方法にも関する。一態様において、当該方法は以下の工程を含む：
　（a）血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
　（b）工程（a）で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
　（c）工程（b）で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程、
　（d）工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより低い場合に医薬品の候補物質として選択する工程。
　工程（d）において、工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合の比較対象とする対照レベルは、スクリーニングの目的に応じて適宜設定することができる。例えば、医薬品候補の最適化プロセスにおいて、他の被験物質と比べて相対的に前記IL-2分泌T細胞割合が低いものを候補物質として選択することができる。あるいは、予め設定された対照レベルと比べて相対的に前記IL-2分泌T細胞割合が低いものを候補物質として選択することもできる。
　本発明は、対象の被験物質による免疫療法に対する応答を予測する方法にも関する。一態様において、当該方法は以下の工程を含む：
　（a）対象から得られた血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
　（b）工程（a）で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
　（c）工程（b）で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程、
　（d）工程（c）で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより高い場合に前記対象の前記被験物質による免疫療法に対する応答性が高いと決定する工程。
　本発明は、被験物質の免疫原性を評価するためのキットにも関する。当該キットはIL-2検出試薬の他に、任意で免疫原性の高さがわかっている対照物質を含む。本発明のキットは、免疫原性が高いことがわかっている高免疫原性対照物質および免疫原性が低いことがわかっている低免疫原性対照物質を含むことができる。本発明のキットは、被験物質の存在下で培養される細胞集団におけるIL-2分泌T細胞の検出に適したタイミング等を記した添付文書を含むことができる。
　以下に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、これは本発明を何ら限定するものではない。
〔材料と方法〕
〔凍結PBMCの融解〕
　凍結PBMC（Lonza社）を37℃で融解し、室温の培地で洗浄して細胞懸濁液からDMSOを除去した。洗浄後の細胞をカウントして1×107個/mLの細胞懸濁液を調製した。
〔CD8-PBMCのソーティング〕
　1×107個/mLのPBMC懸濁液に必要量（25μL/107個のPBMC）のDynabeads（登録商標） CD8を加えた。転倒混和により細胞とビーズを均一にした後、振とうさせながら4℃、遮光下で30分間反応させた。反応終了後、ビーズを除去してCD8-PBMC懸濁液を回収し、遠心分離して上清を除去した細胞をカウントして2.5×107個/mLの細胞懸濁液を調製した。
〔CD8-CD25low PBMCのソーティング〕
　2.5×107個/mLのCD8-PBMC懸濁液に必要量（25μL/2.5×107個のCD8-PBMC）のDynabeads（登録商標） CD25を加えた。転倒混和により細胞とビーズを均一にした後、振とうさせながら4℃、遮光下で30分間反応させた。反応終了後、ビーズを除去してCD8-CD25lowPBMC懸濁液を回収し、遠心分離して上清を除去した細胞をカウントして1×106個/mLの細胞懸濁液を調製した。当該細胞懸濁液を1 mL/wellで24well平底プレートに播種し、被験物質または陽性対照物質添加前に37℃、5% CO2インキュベーターで約1時間の前培養を行った。
〔被験物質の添加と細胞培養〕
　前培養後の細胞に被験物質または陽性対照物質を添加し、37℃、5% CO2インキュベーターで種々の時間、細胞培養を行った。
〔IL-2分泌アッセイ〕
　被験物質または陽性対照物質の存在下または非存在下での培養後、IL-2 catch reagent（IL-2 secretion assay kit、Miltenyi Biotec）を各wellに10μL添加し、37℃、5% CO2インキュベーターで1時間インキュベートした。続いて、細胞懸濁液を回収し、4℃での遠心分離により培養液の除去と洗浄を行った。洗浄後の細胞は氷上で4℃のフローサイトメトリー洗浄・染色液を用いて150 μLの細胞懸濁液として96well丸底プレートにて抗体混合液（抗CD3抗体（BD）、抗CD4抗体（BD）、抗CD14抗体（BD）、IL-2 Detection Antibody（IL-2 secretion assay kit、Miltenyi Biotec））と混合し、遮光下で30min、4℃で染色した。続いて、未反応の抗体の除去と洗浄を行い、洗浄後の細胞を7AAD（7-Amino-Actinomycin D）を用いて遮光下で3分間、室温で核染色を行った。
　染色後の細胞を、リンパ球ゲートで最大測定数200000の条件でのフローサイトメトリー測定に供した。
〔臨床試験における抗薬物抗体の発現率の測定〕
　各被験物質に対する抗薬物抗体（ADA）の発現を以下の方法により測定し、ADAの発現が検出されたドナーの頻度（発現率）を算出した。
抗体A：ECL法、Enbrel、Reopro:ELISA法、hA33:Biacore法
〔免疫原性の評価に適した早期マーカーの探索〕
〔１－１．活発な抗原特異的な増殖を示す前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合の分析〕
　免疫刺激物質で種々の時間刺激したCD8-CD25lowPBMCの集団におけるIL-2分泌CD4+T細胞サブセットの割合を分析した。具体的には、KLHの存在下で24～72時間培養したCD8-CD25lowPBMCの集団におけるIL-2分泌CD4+T細胞をIL-2 catch reagent及びIL-2 Detection Antibody（IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec）を用いて検出し、CD8-CD25lowPBMCの集団におけるIL-2分泌CD4+T細胞の割合をフローサイトメトリーにより分析した。図１および図２に示されているように、KLHの存在下で42、48、67、72時間培養した場合、免疫刺激物質の非存在下（NA）で同時間培養した場合と比べて高い割合のIL-2分泌T細胞が検出された。中でも、KLHの存在下で67時間培養した場合に特に高い割合のIL-2分泌T細胞が検出され、免疫原性が比較的高いことが知られている抗hA33抗体の存在下で培養した場合も同様であった。なお、抗hA33抗体は、当業者であれば、例えばWO1994/013805の記載を参照することにより作製することができる。一方、これらのタイムポイントにおいても、免疫原性が低いことが知られている市販医薬品Enbrel（エンブレル（登録商標））の存在下で培養した場合に検出されたIL-2分泌T細胞の割合は、免疫刺激物質の非存在下（NA）で同時間培養した場合と同程度であった。これらの結果は、被験物質による刺激後、活発な増殖を示す前のタイムポイントにおけるIL-2分泌CD4+T細胞の割合を、被験物質の免疫原性を評価するための早期マーカーとして利用できることを示している。
〔免疫応答による活発な抗原特異的な増殖を示す前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合とADA発現率との比較〕
〔２－１．活発な抗原特異的な増殖を示す前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合を指標としたタンパク質製剤の免疫原性の評価〕
　市販の医薬品を含む種々のタンパク質製剤を免疫刺激物質とした場合の活発な増殖を示す前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合を分析した。具体的には、LONZA社より購入した16～31人のドナー（HLA-DRB1 coverage: Caucasian 70%、Japanese 60%）に由来する凍結PBMCからCD8-CD25lowPBMCをOpTmizer CTS T-cell Expansion SFM (gibco)で1x106/mlに調製し、1ml/wellで平底の24ウェルプレートに播種し37℃、5％CO2インキュベーター内で1時間前培養した。その後、種々の被験物質を添加し67時間培養した。培養した細胞集団におけるIL-2分泌細胞を、培地中にMiltenyi Biotec社のIL-2 catch reagent (IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec) を10μl/wellで添加し更に1時間培養することで標識した。続いて、培養後のCD8-CD25lowPBMCを室温で回収後、4℃で遠心分離し、上清を除去した。氷上で細胞を4℃のフローサイトメトリー用洗浄・染色液に懸濁し、丸底の96ウェルプレートに移し、洗浄した。細胞を抗CD3抗体（BD）、抗CD4抗体（BD）、抗CD14抗体（BD)並びにIL-2 Detection Antibody (IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec)で染色後、洗浄した。7AADを添加後、フローサイトメトリーに供し、IL-2分泌CD4+T細胞の割合を測定した。結果を図３に示す。
　図３に示されているように、免疫原性が比較的高いことが知られている抗hA33抗体の存在下で培養した場合は、多くのドナー由来のPBMCについて高い割合のIL-2分泌CD4+T細胞が検出された。次いで、市販医薬品であるReopro（レオプロ（登録商標））の存在下で培養した場合にも複数のドナー由来のPBMCについて高い割合のIL-2分泌CD4+T細胞が検出された。一方、免疫原性が低いことが知られている前述の市販医薬品Enbrel（エンブレル（登録商標））の存在下で培養した場合は、被験物質の非存在下で培養した陰性対照（NA）と比べて高い割合のIL-2分泌CD4+T細胞が検出された例はわずかであった。これらの結果を、従来の免疫原性評価方法である臨床試験における抗薬物抗体（ADA）の発現率と共に表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１には、ADA発現率が低かった被験物質から順に結果を示している。この順は、図３に示されているIL-2分泌CD4+T細胞割合の順と一致していた。具体的には、図３において高いIL-2分泌CD4+T細胞割合を示したReopro（レオプロ（登録商標））、抗hA33抗体については、当該割合と相関して臨床試験におけるADA発現率が高く、一方、IL-2分泌CD4+T細胞割合が低かったEnbrel（エンブレル（登録商標））についてはADA発現率が低かった。
　表１には、無刺激の陰性対照（NA）よりも高いIL-2分泌CD4+T細胞割合を0.07％以上に設定した場合に陽性と評価されるPBMCのドナーの数およびその割合も示した。この割合を評価指標としてt検定により評価した結果、抗hA33抗体について、EnbrelおよびReoproと比べて有意に多くのIL-2分泌CD4+T細胞が検出されたと評価された。例えば、IL-2分泌CD4+T細胞割合を0.07％以上に設定した場合のReoproの陽性ドナー頻度と抗hA33抗体の陽性ドナー頻度の間である約20～60％、約20～50％、約20～40％、約20～30％等を対照レベルとして、医薬品の候補物質のスクリーニングを行うことができる。
〔２－２．活発な抗原特異的な増殖を示す前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合を指標とした改変抗体の免疫原性の評価〕
　次に、結合標的が共通の異なる複数種の改変抗体の免疫原性を、活発な増殖を示す前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合を指標として評価した。具体的には、10人のドナーに由来する凍結PBMCからCD8-CD25lowPBMCを調製し、抗体Aおよびその改変体である抗体A2～A6、ならびに免疫原性が高いことが公知の抗hA33抗体の存在下で67時間培養した。培養した細胞集団におけるIL-2分泌細胞の割合を、実施例２－１と同様に測定した結果を図４に示す。
　図４に示されているように、結合標的を共通とする一連の改変体群であっても、活発な増殖を示す前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合は改変体によって異なる結果が検出された。これらの結果について、抗体Aよりも高いIL-2分泌CD4+T細胞割合を0.07％以上に設定した場合に陽性と評価されるPBMCのドナーの割合を表２に示した。この割合に基づいて評価した場合、抗体A2～A6についての陽性ドナーの頻度は、抗体Aの場合と比べるとわずかに高かったが、抗hA33抗体の場合と比べると十分低かった。したがって、活発な増殖前のIL-2分泌CD4+T細胞割合を指標として、種々の改変体の中から免疫原性の高くないものを医薬品の候補物質を選択することができる。このような評価系を利用することにより、例えば抗体医薬品候補の最適化プロセスにおける免疫原性に基づく篩い分けを、短いスパンで実施することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１および表２の結果より、（１）活発な増殖を示す前のIL-2分泌CD4+T細胞割合を指標とすることによって、ADA発現率を指標とした場合と同等の評価結果が得られること；（２）評価系の条件（例えば、被験物質による刺激後のIL-2分泌CD4+T細胞検出のタイミング）に応じて設定される適切な対照レベルが、免疫原性の低い被験物質を医薬品の開発候補物質として選択するスクリーニングに有用であることが示された。
〔活発な増殖前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合を指標とした種々の被験物質の免疫原性の評価〕
　実施例２において公知の免疫原性評価指標であるADA発現率と同等の評価結果が得られることがわかった本発明の評価指標（T細胞の活発な増殖前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合）を用いて、種々の被験物質の免疫原性の評価を行った。具体的には、ワクチン（インフルエンザHAワクチン：図５Ａ）、抗体Bもしくは抗体Bとその抗原との複合体（図５Ｂ）、またはタンパク質製剤に混入しうる不純物（エンドトキシン（LPS）：図５Ｃ）を被験物質とし、実施例２と同様に活発な増殖前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合を測定した。結果を図５に示す。
　図５Ａに示されているように、免疫原性が極めて高いことが知られているインフルエンザHAワクチンの存在下で細胞培養を行った場合は、ワクチン濃度0.003μg/mlから明確なIL-2分泌CD4+T細胞が検出された。
　また、免疫感作の際のキャリアタンパク質として用いられる高免疫原性のKLHの存在下で細胞培養を行った場合も明確なIL-2分泌CD4+T細胞が検出されたが、低免疫原性タンパク質製剤として用いられうる抗体単独を被験物質とした場合にはIL-2分泌CD4+T細胞はほとんど検出されず、当該抗体と抗原との複合体を被験物質とした場合はIL-2分泌CD4+T細胞が検出された（図５Ｂ）。
　タンパク質製剤に混入しうる不純物の例として種々の濃度のエンドトキシン（LPS）の存在下で細胞培養を行った場合、LPS濃度が0.1 ng/ml以上で明確なIL-2分泌CD4+T細胞が検出された（図５Ｃ）。一方、血液成分の例として血液凝固第VIII因子（Factor VIII）を被験物質とした場合は、Factor VIII濃度が10μg/mlであっても明確なIL-2分泌CD4+T細胞は検出されなかった（図５Ｃ）。
　タンパク質より分子量の小さいペプチドを被験物質とした場合は、図５Ｄに示されているように、検出されたIL-2分泌CD4+T細胞はごくわずかであった。
　したがって、本発明の免疫原性評価方法は、タンパク質に限定しない種々の被験物質について適用可能であることが明らかとなった。
　本発明の免疫原性評価方法は、IL-2分泌初期のタイムポイントで検出されたIL-2分泌CD4+T細胞の割合を評価指標とすることを特徴とする。より具体的には、被験物質による刺激に応答してCD4+T細胞の増殖が活発になる前のタイムポイントで検出されたIL-2分泌CD4+T細胞の割合を評価指標とすることを特徴とする。一般的に抗体医薬品に特異的に反応するpre-existing T細胞レパトアの割合は106個のCD4+T細胞当たり平均値範囲0.01～0.3個と極めて低いため、被験物質による増殖誘導の弱い時期（被験物質存在下での培養開始後5日間未満、好ましくは24～72時間）のタイムポイントでの免疫原性の評価は細胞の活性化又は増殖をタンパク質レベルで殆ど検出できず困難と考えられており、免疫応答による増殖が活発になった以後のタイムポイントでのサイトカイン分泌や、臨床試験における抗薬物抗体（ADA）の発現頻度を免疫原性の評価指標とするのが技術常識であった。実際、免疫原性が比較的高いことが知られていた抗hA33抗体による刺激であっても、増殖が活発になる前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合は高くても0.25％であった（図３）。一般的に、このような低い陽性頻度での評価系は安定性に乏しいことが多い。しかし、驚いたことに、従来の評価指標である臨床試験での抗薬物抗体（ADA）の発現頻度において抗hA33抗体よりも免疫原性が低いという結果が得られた被験物質について、活発な増殖前のIL-2分泌CD4+T細胞割合についても安定して抗hA33抗体より低い結果が得られ、しかも従来の評価指標による評価結果とよく相関していた（表１）。これは、被験物質とともに培養する細胞集団にCD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まないこと（細胞集団からCD8+T細胞およびCD25+T細胞を予め除いておいてもよい）、培養方法（細胞数、培地の種類）の工夫によりノイズを低減すること、IL-2 catch reagent及びIL-2 Detection Antibodyの使用方法の工夫によって活性が高いT細胞を残存させること、等の評価系の工夫によりIL-2分泌初期のタイムポイントにおける低い陽性頻度でも安定したデータを得ることができたと考えられる。
　このように、本発明の免疫原性評価方法は、タンパク質製剤（例えば抗体医薬品）などの被験物質の免疫原性を、これまでに知られていたより短時間で評価することができる点で有用である。このような優位性を有する本発明の方法を利用することにより、医薬品の候補物質のスクリーニングにおいて高いスループット性を実現することができ、医薬品開発の加速に貢献することができる。

Claims (9)

  1. 　以下の工程を含む、被験物質の免疫原性を評価する方法：
    　（a）血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
    　（b）工程（a）で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
    　（c）工程（b）で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程。
  2. 　血液に由来する前記細胞集団が、末梢血単核球細胞（PBMC）に由来する細胞集団である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記血液がヒト由来である、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 　前記IL-2分泌初期のタイムポイントが、前記T細胞の増殖が活発になる前である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記IL-2分泌初期のタイムポイントが、前記培養開始後24時間～72時間の間である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記被験物質が、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、ワクチン、およびそれらのうち二つ以上のコンジュゲート、ならびにそれらのうち二つ以上の組み合わせを含む混合物からなる群より選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記被験物質がタンパク質である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記被験物質が抗体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記IL-2分泌T細胞が占める割合の算出が、フローサイトメトリーで当該細胞数を測定することである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
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