CN110214192A - 用于评价测试物质的免疫原性的方法 - Google Patents

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CN110214192A CN201780084567.3A CN201780084567A CN110214192A CN 110214192 A CN110214192 A CN 110214192A CN 201780084567 A CN201780084567 A CN 201780084567A CN 110214192 A CN110214192 A CN 110214192A
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Abstract

本发明发现，通过使用在已被测试物质刺激的T细胞群体(优选为CD4+T细胞群体)中的在IL‑2分泌初期期间的时间点(优选为通过测试物质刺激之后24小时～72小时)的IL‑2分泌细胞的比例作为测试物质的免疫原性的指标，可以在短时间内评价测试物质的免疫原性。

Description

用于评价测试物质的免疫原性的方法
技术领域
本发明涉及用于评价免疫原性的方法，其特征在于在IL-2分泌细胞中检测IL-2的时间和方式。进一步地，本发明涉及用于筛选药物候选物质的方法，其特征在于评价测试物质的免疫原性。
背景技术
今日，许多具有复杂结构的药物如蛋白质在市场上是可获得的。在人体中异物进入体内引起免疫应答，在药物的领域中也是，在免疫应答中，源自蛋白质的活性成分被识别为外来蛋白质，这种药物作为抗原的作用可能导致抗药物抗体(ADA)的产生。ADA的产生可能具有不利的影响例如药物的治疗效果降低，在一些情况下，可诱发可以危及生命的免疫应答。
因此，在含有源自蛋白质的活性成分的药物的开发中，需要从开发的较早阶段评价大量测试物质的免疫原性。因此，已经对通过筛选用于选择较低免疫原性的测试物质作为候选物质的方法进行了研究。已知的手段为如下的测定方法，其中用测试物质刺激源自人组织的细胞，并使用通过免疫应答诱导的T细胞的增殖或在细胞增殖活跃时产生细胞因子如IL-2的细胞的数量作为指标来评价所述物质(例如：参见专利文献1及非专利文献1)。
关于T细胞的活化，已经报道了IL-2产生及IL-2受体α(CD25)表达的作用(例如，参见专非专利文献2)。在该报告中，将用肽刺激的树突细胞与T细胞进行共培养，其中所述肽源自已知具有非常强免疫原性的麦芽糖结合蛋白质(MBP)，所述共培养导致IL-2产生的诱导及T细胞增殖；然而，在细胞不进行共培养或在共培养前将抗IL-2受体α(CD25)抗体添加至树突细胞的情况下，即使用肽进行刺激，也几乎检测不到IL-2产生或细胞增殖。也有报道称，用如蛋白质制剂(例如，抗体制剂)那样的免疫原性更低的物质刺激，响应的T细胞非常少(非专利文献3、4)。实际上，已经报道了在活性T细胞增殖前的阶段，有很少的供体响应蛋白质制剂的刺激，就对于该刺激进行应答的特异性T细胞的增殖程度、表现为伴随细胞增殖而产生细胞因子的供体的频率而言，因用于进行刺激的蛋白质制剂而不同(非专利文献1)。因此，由相对于测试物质的免疫应答诱导的T细胞的增殖、当细胞增殖活跃时细胞因子的产生已作为用于评价测试物质的免疫原性的指标受到关注。
本说明书中引用的参考文献如下列出。这些文献中记载的内容通过参考全部并入本说明书。需要说明的是，这并不意味着将这些文献中的任一个作为相对于本说明书的现有技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2009-528044号公报
非专利文献
非专利文献1：PLoS One.2016 Aug 5；11(8):e0159328.
非专利文献2：Nat Med.2011 May；17(5):604-609.
非专利文献3：FASEB J.2011 Jun；25(6):2040-2048.
非专利文献4：Clin Immunol.2013 Dec；149(3):534-555.
发明概述
[本发明要解决的问题]
在常规的方法中，其中T细胞的免疫应答用于评价测试物质的免疫原性或对测试物质筛选药物候选物质，所述评价或筛选是在T细胞活跃增殖时(在测试物质的存在下，培养开始之后5～7天或以后)进行的。因此，需花费一定时间或更久的时间，以使得T细胞的增殖可在蛋白质水平检测。因此，从效率方面来看，所述常规方法作为用于选择适于药物的候选物质的工艺是不够的。本发明的目的是，在测试物质的存在下，在培养开始之后短时间内实现免疫原性的评价。
因此，本发明人进行了深入研究，以鉴定用于评价免疫原性或筛选药物候选物质的早期标记物。因此，本发明的目的是提供在T细胞免疫应答中在T细胞增殖变得活跃前(在测试物质的存在下，培养开始之后少于5天)的阶段，适于评价测试物质的免疫原性或筛选药物候选物质的指标。本发明的另一个目的是提供在T细胞免疫应答中，在短时间内用于评价测试物质的免疫原性或筛选药物候选物质的方法。并且，本发明提供了从测试物质中以有效率且低成本的方式选择候选物质的方法，其通过将用于评价测试物质的免疫原性或对测试物质筛选药物候选物质需要的每个循环的时间缩短，并从而允许更多的试错试验工艺。
[解决问题的方法]
为了解决上述课题，本发明人对用于缩短免疫原性评价所用时间的指标、可检测这些指标的时间和方式以及有效筛选候选物质的方式进行了深入研究。作为结果，发明人发现在T细胞增殖变得活跃前的初期应答阶段(在测试物质的存在下，培养开始之后少于5天)中分泌的IL-2作为用于评价免疫原性的指标出乎意料地有用，并且发现了用于检测在该阶段中仅以极其少数存在的IL-2分泌细胞的方法，及通过在短时间内实施整个评价***而以有效且低成本的方式筛选候选物质的方法。本发明人进而完成了本发明。
本发明提供以下技术方案：
[1]用于评价测试物质的免疫原性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将源自血液的细胞群体与测试物质培养，其中所述源自血液的细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，且基本上不包含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞；
(b)在IL-2分泌初期期间的时间点，检测在步骤(a)中培养的所述细胞群体中的IL-2分泌T细胞；和
(c)计算在步骤(b)中检测的所述IL-2分泌T细胞的比例；
[2]根据[1]所述的方法，其中，所述源自血液的细胞群体为源自外周血单核细胞(PBMC)的细胞群体；
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述血液源自人；
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述IL-2分泌初期期间的时间点为在所述T细胞的增殖变得活跃之前；
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，所述IL-2分泌初期期间的时间点为所述培养开始之后24小时和72小时之间；
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，所述测试物质选自由以下组成的组：蛋白质、肽、核酸、糖类、脂质、疫苗，及它们中的两种以上的缀合物，以及包含它们中的两种以上的组合的混合物；
[7]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，所述测试物质为蛋白质；
[8]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，所述测试物质为抗体；和
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，计算所述IL-2分泌T细胞的比例是通过流式细胞术测量所述细胞的数量。
本发明也提供以下技术方案：
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：假如在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的所述比例与对照水平相同或更低，则确定所述测试物质具有低免疫原性；
[11]根据[10]的方法，其中，所述对照水平为在已知具有低免疫原性的物质的存在下培养所述细胞群体时，在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例(低免疫原性对照水平)；
[12]根据[1]～[9]中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：假如在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的所述比例与对照水平相同或更高，则确定所述测试物质具有高免疫原性；
[13]根据[12]所述的方法，其中，所述对照水平为在已知具有高免疫原性的物质的存在下培养所述细胞群体时，在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例(高免疫原性对照水平)；
[14]根据[10]或[12]所述的方法，其中，所述对照水平为在所述测试物质的存在下培养步骤(a)的所述细胞群体时，在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例(阴性对照水平)；
[15]根据[1]～[9]中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：假如在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的所述比例低于对照水平，则选择所述测试物质作为药物候选物质；
[16]根据[1]～[9]中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：假如在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的所述比例高于对照水平，则确定供体(从其获得源自血液的细胞群体的受试者)对用所述测试物质的免疫疗法是高响应的；
[17]根据[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，将在步骤(c)中计算的检测的IL-2分泌T细胞的比例高于对照水平的供体定义为阳性供体，并且其中，所述方法进一步包括以下步骤：使用在相同测定中供体总数中阳性供体的比例作为用于评价免疫原性的指标；
[18]IL-2分泌T细胞用于评价测试物质的免疫原性的用途；
[19]IL-2分泌T细胞，其用于评价测试物质的免疫原性；
[20]用于评价免疫原性的方法，其中，将IL-2分泌T细胞的比例用作指标；
[21]筛选药物候选物质的方法，所述方法包括选择在[1]～[9]中任一项所述的方法中被评价为具有低免疫原性的测试物质作为药物候选物质；
[22]测量与测试物质培养的细胞群体中IL-2分泌CD4+ T细胞的比例的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将源自血液的细胞群体与测试物质培养，其中所述源自血液的细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，并且基本上不包含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞；
(b)在IL-2分泌初期期间的时间点，检测在步骤(a)中培养的所述细胞群体中的IL-2分泌T细胞；和
(c)计算在步骤(b)中检测的所述IL-2分泌T细胞的比例，
其中所述方法用于评价所述测试物质的免疫原性；
[23]用于选择具有降低的免疫原性的物质(修饰体)的方法，或用于评价修饰体(modified substance)的免疫原性是否降低的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将源自血液的细胞群体与修饰体或非修饰体培养，其中所述源自血液的细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，并且基本上不包含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞；
(b)在IL-2分泌初期期间的时间点，检测步骤(a)中培养的所述细胞群体中的IL-2分泌T细胞；
(c)计算在步骤(b)中检测的所述IL-2分泌T细胞的比例；以及
(d)假如当所述细胞群体与修饰体培养时，在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的所述比例低于当所述细胞群体与非修饰体培养时的所述比例，则确定所述修饰体的免疫原性已降低；
[24]筛选药物候选物质的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将源自血液的细胞群体与测试物质培养，其中所述源自血液的细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，且基本上不包含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞；
(b)在IL-2分泌初期期间的时间点，检测步骤(a)中培养的所述细胞群体中的IL-2分泌T细胞；
(c)计算在步骤(b)中检测的所述IL-2分泌T细胞的比例；以及
(d)假如在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例低于所述对照水平，则选择所述测试物质作为药物候选物质；
[25]用于预测受试者对用测试物质的免疫疗法的应答的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将细胞群体与测试物质培养，其中所述细胞群体源自从受试者获得的血液，并且其中所述细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，且基本上不包含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞；
(b)在IL-2分泌初期期间的时间点，检测步骤(a)中培养的所述细胞群体中的IL-2分泌T细胞；
(c)计算在步骤(b)中检测的所述IL-2分泌T细胞的比例；以及
(d)假如在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例高于所述对照水平，则确定所述受试者对用所述测试物质的免疫疗法的反应性高；以及
[26]用于评价测试物质的免疫原性的试剂盒，所述试剂盒包含IL-2检测试剂和具有已知免疫原性水平的对照物质。
[发明效果]
本发明能够提供在T细胞的免疫应答中，缩短评价测试物质的免疫原性的需要的时间或筛选药物候选物质需要的时间的方法。
并且，本发明能够提供用于从测试物质中以有效率且低成本的方式选择候选物质的方法，其通过将用于评价测试物质的免疫原性或筛选药物候选物质需要的每个循环的时间缩短，并允许更多的试错试验工艺。
附图说明
图1图示了在钥孔血蓝蛋白(KLH)(100μg/mL/孔)的存在下或非存在下培养了67小时的CD8-CD25低PBMC中，通过流式细胞术分析IL-2分泌CD4+ T细胞的比例的结果。NA(No Ag：无抗原)显示在测试物质的非存在下进行培养时，来自阴性对照的结果。
图2图示了在各种测试物质(100μg/mL/孔)的存在下培养24～72小时的CD8-CD25低PBMC中，IL-2分泌CD4+ T细胞的比例的最大值。数据显示对于各个作为使用的PBMC来源的供体的结果。NA(No Ag：无抗原)显示在测试物质的非存在下进行培养时，来自阴性对照的结果。
图3图示了在各种测试物质(100μg/mL/孔)的存在下培养67小时的CD8-CD25低PBMC中，IL-2分泌CD4+T细胞的比例的最大值。数据显示对于各个作为使用的PBMC来源的供体的结果。NA(No Ag：无抗原)显示在测试物质的非存在下进行培养时，来自阴性对照的结果。
图4图示了在各种测试物质(100μg/mL/孔)的存在下培养67小时的CD8-CD25低PBMC中，IL-2分泌CD4+T细胞的比例的最大值。数据显示对于各个作为使用的PBMC来源的供体的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例的最大值。NA(No Ag：无抗原)显示在测试物质的非存在下进行培养时，来自阴性对照的结果。
图5图示了在(A)流感HA疫苗、(B)抗体单独或者抗原抗体复合物、(C)LPS或者因子VIII或(D)HA肽或者IgG肽的存在下培养了24～67小时的CD8-CD25低PBMC中，IL-2分泌CD4+ T细胞的比例的最大值。NA(No Ag：无抗原)显示在测试物质的非存在下进行培养时，阴性对照的结果。
实施本发明的最优方式
本发明涉及基于IL-2分泌T细胞的比例用于评价免疫原性的方法。更具体而言，本发明涉及通过使用与测试物质共同培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例作为指标用于评价测试物质的免疫原性的方法，优选使用在IL-2分泌初期期间的时间点的IL-2分泌T细胞的比例，更优选使用在T细胞增殖活跃时期之前(在测试物质的存在下，培养开始之后少于5天、优选为培养开始之后24～72小时，例如：培养开始之后24～67小时、24～62小时、24～48小时、24～42小时、42～72小时、42～67小时、42～62小时、42～48小时、48～72小时、48～67小时、48～62小时、62～72小时、62～67小时或67～72小时)的IL-2分泌T细胞的比例，并且，甚至更优选为使用在测试物质的存在下，培养开始之后约42小时～约72小时的IL-2分泌T细胞的比例，或特别优选为使用在测试物质的存在下，培养开始之后约48小时～约67小时的IL-2分泌T细胞的比例。
在本发明的上下文中，短语“T细胞增殖活跃时期”可表述为，例如抗原特异性T细胞能够进行抗原非依赖地增殖的时期，或T细胞已经向它们的功能表达进行分化的时期。
本发明的上下文中，“测试物质”只要是待评价免疫原性的物质即可，没有特别限定，包括例如，蛋白质(例如：抗体或疫苗)、非蛋白质(例如：蛋白质以外的高分子化合物或低分子化合物，包括肽、核酸、糖类、脂质、或疫苗)、蛋白质与非蛋白质的缀合物(例如：糖基化的抗体)、非蛋白质与非蛋白质的缀合物(例如：糖脂质或肽核酸缀合物)，以及它们中的两种以上的组合的混合物。所述两种以上的组合，可以属于相同类别，也可以属于不同类别，对此没有限制。本发明中测试物质的实例可包括：抗体、肽、疫苗、免疫复合物、佐剂、血液成分、可能污染制剂的杂质例如内毒素。在本发明的特定的实施方案中，所述测试物质为抗体。
本发明的上下文中，待与测试物质共同培养的细胞群体为源自血液的细胞群体，该细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，且基本上不含有CD8+ T细胞(细胞毒性T细胞)或CD25+ T细胞(CD25阳性的活化T细胞和/或调节性T细胞)。优选地，例如，它是源自外周血单核细胞(PBMC)的细胞群体，该细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，且基本上不含有CD8+细胞或CD25+细胞的。上述血液优选源自哺乳动物，特别优选源自人。因此，待检测的IL-2优选为哺乳动物的IL-2、特别优选为人IL-2。上述血液可以为新鲜血液或保存血液，例如冷冻的血液。从取得的容易度的观点出发，优选为保存血液、特别优选为冷冻的血液。
用于从源自血液的细胞群体中除去CD8+ T细胞及CD25+ T细胞的方法，是本领域技术人员已知的。例如，如在本文实施例中所记载的，所述除去可以使用抗CD8抗体及抗CD25抗体实施。另一方面，预先从中除去CD8+ T细胞及CD25+ T细胞的血液的细胞群体，也可以用于本发明的方法。或者，也可以使用通过将CD4+CD25-T细胞添加至基本上不含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞的源自血液的细胞群体而制备的细胞群体。因此，本发明的方法可以包括：从源自血液的细胞群体除去CD8+ T细胞或CD25+ T细胞的步骤；提供已从中除去CD8+ T细胞及CD25+ T细胞的源自血液的细胞群体的步骤；或提供通过将CD4+CD25-T细胞添加至基本上不含CD8+ T细胞及CD25+ T细胞的细胞群体而制备的细胞群体的步骤。
在本发明中，上述细胞群体可以采用对本领域技术人员而言已知的方法进行培养。例如：所述培养可以通过在本文实施例中记载的方法实施，但不限于此。优选地，所述细胞群体以1x106细胞/ml制备于OpTmizer CTS T细胞扩增SFM(gibco)中，以1ml/孔接种于平底的24孔板中，于37℃在5％CO2培养箱中预温育1小时。之后加入测试物质，培养细胞群体直至适用于评价的时间点。当到达适当的时间点时，以10μl/孔添加IL-2捕获试剂(IL-2分泌测定试剂盒，Miltenyi Biotec)，并继续培养1小时。
在本发明中，供体是指作为源自血液的细胞群体的来源的受试者。
在本发明中，用作用于评价免疫原性的指标的IL-2分泌T细胞的比例，是与测试物质共同培养的全部细胞中IL-2分泌T细胞的比例。例如，其为在检测IL-2分泌CD4+ T细胞的时刻，培养***中包含的全部CD4+ T细胞(分母)中的IL-2分泌CD4+ T细胞(分子)的比例。
在本发明中，作为用于评价免疫原性的指标的IL-2分泌T细胞的比例，优选为在IL-2分泌初期的时间点的IL-2分泌T细胞的比例，更优选为在T细胞增殖变得活跃前(在测试物质的存在下，培养开始之后少于5天)的IL-2分泌T细胞的比例，特别优选为在测试物质的存在下，培养开始之后约24小时～约72小时的IL-2分泌T细胞的比例，或最优选为在测试物质的存在下，培养开始之后约48小时～约67小时的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例。
在本发明中，术语“抗体”以最宽含义使用，并涵盖了只要显示期望的抗原结合活性的各种抗体结构，包括但不限于：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如：双特异性抗体)和抗体片段。
“抗体片段”是指这样的分子：其并非完全抗体，但其中包含与所述完全抗体结合的抗原进行结合的该完全抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于：Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH和F(ab')2；二价抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如：scFv)；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
在本发明中，IL-2分泌T细胞可以通过本领域技术人员已知的方法检测。例如，如本文实施例中所记载的，可以使用流式细胞术来检测用市售的IL-2检测试剂标记了的IL-2阳性细胞。
在本发明中，测试物质的免疫原性可以通过将计算的IL-2分泌T细胞的比例与适当的对照水平进行比较来评价。本发明的上下文中，“对照水平”也可以称为对照值、参考值或标准值。例如，可以将在适当的参考物质(对照物质)的存在下培养的上述细胞群体中检测得的IL-2分泌T细胞的比例的平均值、中位数，或围绕这些值的预定的范围(例如：平均值+/-标准偏差)作为对照水平。对照水平可以基于与测定测试物质平行测量的值、或预先测量的值而确定。当对照水平是基于预先测量的值而确定时，对照水平优选为基于在与对于测定测试物质相同或同样的条件下预先测量的值。
在本发明的一个实施方案中，在评价免疫原性中，可以将在通过另一免疫原性评价方法已知为具有低免疫原性的物质(例如：在临床试验中抗药物抗体发生率较低的药物或具有低CD4+T细胞增殖诱导能力的物质)的存在下，培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例用作对照水平。该对照水平可以称为“低免疫原性对照水平”。在该情况下，当在测试物质的存在下培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例与低免疫原性对照水平相同或更低时，所述测试物质的免疫原性可评价为低；或者，当所述比例高于低免疫原性对照水平时，所述测试物质的免疫原性可评价为高。
在本发明的另一个实施方案中，在评价免疫原性中，可以将在通过另一免疫原性评价方法已知为具有高免疫原性的物质(例如：在临床试验中抗药物抗体发生率较高的药物或具有高CD4+T细胞增殖诱导能力的物质)的存在下，培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例用作对照水平。该对照水平可以称为“高免疫原性对照水平”。在该情况下，当在测试物质的存在下培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例与高免疫原性对照水平相同或更高时，所述测试物质的免疫原性可评价为高；或者，当上述比例低于高免疫原性对照水平时，所述测试物质的免疫原性可评价为不高。
在本发明的上下文中，已知具有低免疫原性的物质和已知具有高免疫原性的物质，可以是通过本发明的评价方法预先进行了免疫原性评价的物质，或者也可以是基于作为公知的免疫原性指标的临床试验中抗药物抗体的发生率(临床ADA发生率)或CD4+ T细胞增殖诱导能力而已知具有高免疫原性或低免疫原性的物质。已知具有低免疫原性的物质的实例(但不限于此)为蛋白质制剂依那西普(Enbrel)(注册商标)。已知具有高免疫原性的物质的实例(但不限于此)为KLH。与本发明的指标(IL-2分泌T细胞的比例)类似，这些指标是相对指标，并且本领域技术人员能够根据目的适当设定高或低(强或弱)免疫原性标准。例如，当临床抗药物抗体的发生率(出现频率)低于10％，或优选低于5％时，可将发生率评价为低(可将免疫原性评价为低)。另外，例如，当发生率为30％以上时，可将发生率评价为高(可将免疫原性评价为高)。
在本发明进一步另外的实施方案中，在评价免疫原性中，可将在测试物质的非存在下培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例用作对照水平。该对照水平可称为“阴性对照水平”。在本发明的特定的实施方案中，在测试物质的存在下培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例与阴性对照水平相同或更低时，则可将测试物质的免疫原性评价为低；或当所述比例高于阴性对照水平时，可将测试物质的免疫原性评价为不低。
本领域技术人员能够根据目的而设定适当的对照水平，并通过与该水平比较而评价测试物质的免疫原性的有无或高低(强弱)。也可通过将通过本发明方法计算的IL-2分泌T细胞的比例与上述的多个对照水平相比，来评价测试物质的免疫原性。根据目的，也可以以相对的方式，在多个测试物质之间基于它们的测量值进行免疫原性的评价。即使在该情况下，优选使用在测试物质的存在下，与用于培养及IL-2检测的条件相同的条件下测定的对照水平。
在本发明中，在测试物质的存在下，当培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例为对照水平的例如150％、200％、250％或更高时，可将测试物质评价为具有高免疫原性。另外，在测试物质的存在下，当培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例为对照水平的例如100％、75％、50％或更低时，可将该测试物质评价为具有低免疫原性。这样的评价标准可以根据使用的对照水平的类型或用于筛选的目的而适当设定。
本发明人阐明，在测试物质的存在下培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例，与已知的免疫原性指标(临床抗药物抗体发生率)相关(表1)。因此，在评价免疫原性中，在测试物质的存在下培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例，可用作“相对”评价指标。例如，在最优化用于治疗性抗体的候选物的工艺中，可将在不同的经修饰抗体的存在下培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例相互比较，即可选择具有相对低免疫原性的经修饰抗体作为用于开发治疗性抗体的候选。
在本发明的筛选方法中，假如在测试物质的存在下培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞的比例低于预定的对照水平(阈值)，则可选择所述测试物质作为用于具有低免疫原性的药物的候选物质。尽管对照水平可根据筛选的目的而设定，但优选将在相同的条件下获得的值或范围用作对照水平，例如检测IL-2分泌T细胞的时间。在筛选药物候选物质的方法中，可以将对于测试物质的IL-2分泌T细胞的比例与低免疫原性对照水平相比，所述低免疫原性对照水平为在已知具有低免疫原性的物质的存在下培养的细胞群体中IL-2分泌T细胞的比例。在用于最优化治疗性抗体候选物的工艺期间筛选具有低免疫原性的经修饰抗体的方法中，当在经修饰抗体的存在下培养的细胞群体中IL-2分泌T细胞的比例低于修饰前的抗体的该比例(对照水平)时，可选择所述物质作为用于治疗性抗体开发的候选物。另外，通过根据目的设定适当的值作为对照水平，可以从多种测试物质中将候选物质缩小范围，所述适当的值例如为来自多个样品的测量值的中位数、上位1/3的值(upper one-third)或下位1/3的值(lower one-third)等。
对照水平优选根据用于在测试物质的存在下的培养及用于检测IL-2的条件而适当设定。另外，也可以将从其检测到高于对照水平的IL-2分泌T细胞比例的细胞群体的供体定义为阳性供体，并使用在经测试供体总数中阳性供体的比例作为用于评价免疫原性的指标。因此，本发明的方法可以包括以下步骤：定义阳性供体，所述阳性供体为从其检测到高于对照水平的IL-2分泌T细胞比例的供体，并使用在相同测定中的供体总数中的阳性供体的比例作为用于评价免疫原性的指标。
本发明的免疫原性评价方法，具体包括以下步骤：
(a)将源自血液的细胞群体与测试物质培养，其中所述源自血液的细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，且基本上不含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞；
(b)在IL-2分泌初期期间的时间点，检测在步骤(a)中培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞；以及
(c)计算在步骤(b)中检测到的IL-2分泌T细胞的比例。
本发明也涉及IL-2分泌T细胞用于评价测试物质的免疫原性的用途，及用于评价测试物质的免疫原性的IL-2分泌T细胞。在这些发明中，IL-2分泌T细胞优选为在IL-2分泌初期期间的时间点的IL-2分泌T细胞，更优选为在T细胞增殖变得活跃之前的IL-2分泌T细胞，并且甚至更优选为在测试物质的存在下，培养开始之后24小时～72小时的IL-2分泌T细胞。
在本发明中，“包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞的细胞群体”可被称为基本上包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞的细胞群体，或以能够诱导免疫应答的比例包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞的细胞群体。
在本发明中，“基本上不含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞的细胞群体”是指这样的细胞群体，其中，CD8+ T细胞及CD25+ T细胞的合计与全部细胞的比例为10％以下，优选为5％以下，特别优选为1％以下。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性评价方法进一步包括以下步骤：将在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例与对照水平相比，其中，假如该比例与对照水平相同或更低，则表明测试物质的免疫原性低。在另一实施方案中，本发明的免疫原性评价方法进一步包括以下步骤：假如在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例与对照水平相同或更低，则确定测试物质的免疫原性低。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性评价方法进一步包括以下步骤：将在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例与对照水平相比，其中，假如该比例与对照水平相同或更高，则表明测试物质的免疫原性高。在另一实施方案中，本发明的免疫原性评价方法进一步包括以下步骤：假如在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例与对照水平相同或更高，则确定测试物质的免疫原性高。在另一实施方案中，本发明的免疫原性评价方法进一步包括以下步骤：假如在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例，显著高于在测试物质的非存在下实施步骤(a)时产生的比例(阴性对照水平)，则确定测试物质的免疫原性高。在进一步另外的实施方案中，本发明的免疫原性评价方法进一步包括以下步骤：假如在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例，等于或高于在已知具有高免疫原性的物质的存在下实施步骤(a)时产生的比例(高免疫原性对照水平)，则确定测试物质的免疫原性高。在另一实施方案中，本发明的免疫原性评价方法进一步包括以下步骤：假如在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例，等于或小于在已知具有低免疫原性的物质的存在下实施步骤(a)时产生的比例(低免疫原性对照水平)，则确定测试物质的免疫原性低。
本发明还涉及测量辅助T细胞(Th细胞)对于测试物质应答的方法，该方法用于评价测试物质的免疫原性。更具体而言，本发明涉及测量与测试物质共同培养的细胞群体中的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例的方法，该方法用于评价测试物质的免疫原性。在本发明测量方法的一个实施方案中，上述细胞群体为源自血液的细胞群体，所述源自血液的细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，且基本上不含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞。在本发明测量方法的一个实施方案中，上述比例为在IL-2分泌初期期间的时间点，上述细胞群体中IL-2分泌CD4+ T细胞的比例。时间点优选为细胞群体中CD4+ T细胞的增殖变得活跃前的时间，特别优选为培养开始之后24小时～72小时之间。
本发明涉及用于选择具有降低免疫原性的物质(修饰体)的方法，或用于评价修饰体的免疫原性是否降低的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：
(a)将源自血液的细胞群体与修饰体或非修饰体培养，其中所述源自血液的细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，且基本上不含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞；
(b)在IL-2分泌初期期间的时间点，检测步骤(a)中培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞；
(c)计算在步骤(b)中检测到的IL-2分泌T细胞的比例；以及
(d)假如当细胞群体与修饰体培养时，在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的所述比例，低于当细胞群体与非修饰体培养时的所述比例，则确定所述修饰体的免疫原性已降低。
在上述方法的另一实施方案中，通过将修饰体互相比较，可选择具有更低免疫原性的修饰体。在这样的实施方案中，上述步骤(d)为以下步骤：假如当细胞群体与修饰体培养时，在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的所述比例，低于当与其他修饰体培养时的所述比例，则确定相比于另一修饰体，所述修饰体的免疫原性已降低。
本发明也涉及筛选用于药物的候选物质(先导化合物)的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：
(a)将源自血液的细胞群体与测试物质培养，其中所述源自血液的细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，且基本上不含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞；
(b)在IL-2分泌初期期间的时间点，检测步骤(a)中培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞；
(c)计算在步骤(b)中检测到的IL-2分泌T细胞的比例；以及
(d)假如步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例低于对照水平，则选择测试物质作为药物候选物质。
在步骤(d)中，与在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例相比的对照水平，可以根据筛选的目的而适当设定。例如，在用于最优化药物候选物的工艺中，可以选择与其它测试物质相比，产生相对较低的IL-2分泌T细胞比例的测试物质作为候选物质。或者，可以选择与预定的对照水平相比，产生相对较低的IL-2分泌T细胞比例的物质作为候选物质。
本发明还涉及用于预测受试者对用测试物质的免疫疗法的应答的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：
(a)将细胞群体与测试物质培养，所述细胞群体源自从受试者获得的血液，且其中所述细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，且基本上不含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞；
(b)在IL-2分泌初期期间的时间点，检测步骤(a)中培养的细胞群体中的IL-2分泌T细胞；
(c)计算在步骤(b)中检测到的IL-2分泌T细胞的比例；以及
(d)假如在步骤(c)中计算的IL-2分泌T细胞的比例高于对照水平，则确定所述受试者对用所述测试物质的免疫疗法的反应性高。
本发明还涉及用于评价测试物质的免疫原性的试剂盒。除了IL-2检测试剂以外，该试剂盒任选地包含具有已知免疫原性水平的对照物质。本发明的试剂盒可以包含已知具有高免疫原性的高免疫原性对照物质和已知具有低免疫原性的低免疫原性对照物质。本发明的试剂盒，可以包含描述适于在测试物质的存在下在培养的细胞群体中检测IL-2分泌T细胞的时间等的包装说明书。
实施例
以下，参考实施例对本发明进行详细说明，但并不用于对本发明进行限定。
[材料和方法]
[冷冻PBMC的解冻]
将冷冻PBMC(Lonza公司)在37℃解冻，并在室温用培养基洗涤，以从细胞悬浊液中除去DMSO。洗涤之后，对细胞进行计数，以制备1×107细胞/mL的细胞悬浊液。
[CD8-PBMC的分选]
向1×107细胞/mL的PBMC悬浊液添加必要量(25μL/107PBMC)的Dynabeads(注册商标)CD8。通过颠倒混合将细胞与珠粒均匀之后，将它们在振荡下于4℃遮光反应30分钟。反应结束后，除去珠粒以收集CD8-PBMC悬浊液。离心和除去上清后，将细胞计数以制备2.5×107细胞/mL的细胞悬浊液。
[CD8-CD25低PBMC的分选]
向2.5×107细胞/mL的CD8-PBMC悬浊液添加了必要量(25μL/2.5x107CD8-PBMC)的Dynabeads(注册商标)CD25。通过颠倒混合将细胞与珠粒均匀之后，将它们在振荡下于4℃遮光反应30分钟。反应结束后，除去珠粒以收集CD8-CD25低PBMC悬浊液。离心和除去上清后，将细胞计数以制备1×106细胞/mL的细胞悬浊液。以1mL/孔将该细胞悬浊液接种至平底的24孔板中，在添加测试物质或阳性对照物质前，在37℃，5％CO2培养箱中进行约1小时的预温育。
[测试物质的添加和细胞培养]
向经预温育的细胞添加测试物质或阳性对照，并将细胞于37℃在5％CO2培养箱中培养不同的时间。
[IL-2分泌测定]
在测试物质或阳性对照物质的存在下或非存在下进行培养后，向各孔添加10μL的IL-2捕获试剂(IL-2分泌测定试剂盒，Miltenyi Biotec)，并将细胞于37℃在5％CO2培养箱中温育1小时。随后，收集细胞悬浊液，并在4℃下进行离心用于培养基去除和洗涤。使用流式细胞术洗涤/染色液，将经洗涤的细胞在冰上于4℃制备成150μL的细胞悬浊液，然后与抗体混合液(抗CD3抗体(BD)、抗CD4抗体(BD)和抗CD14抗体(BD)，和IL-2检测抗体(IL-2分泌测定试剂盒，Miltenyi Biotec))在圆底的96孔板中混合，然后在遮光下于4℃染色30min。接下来，除去未反应的抗体并洗涤，且将经洗涤的细胞使用7AAD(7-氨基-放线菌素D)于室温在遮光下进行核染色3分钟。
在淋巴细胞门(gate)中最大测量数为200000的条件下，将经染色的细胞进行流式细胞术测量。
[临床试验中抗药物抗体发生率的测量]
通过下述方法，测量针对每个测试物质的抗药物抗体(ADA)的出现，并计算检测到ADA出现的供体的频率(发生率)。
抗体A：ECL方法；依那西普和阿昔单抗(Reopro)：ELISA法；以及hA33：Biacore方法。
[实施例1]
[寻找适于评价免疫原性的早期标记物]
[1-1.对在细胞显示活跃的抗原特异性增殖前的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例的分析]
分析了IL-2分泌CD4+ T细胞子集在用免疫刺激物质刺激不同时间段的CD8-CD25低PBMC的群体中的比例。具体地，使用IL-2捕获试剂及IL-2检测抗体(IL-2分泌测定试剂盒，Miltenyi Biotec)，检测了在KLH的存在下培养24～72小时的CD8-CD25低PBMC的群体中的IL-2分泌CD4+ T细胞，并通过流式细胞术分析了CD8-CD25低PBMC的群体中IL-2分泌CD4+T细胞的比例。如图1及图2所示，当在KLH的存在下进行了42小时、48小时、67小时和72小时培养时，检测到了与在免疫刺激物质的非存在下(NA)培养相同时间的情况相比，更高比例的IL-2分泌T细胞。其中，在KLH的存在下培养了67小时的情况下，检测到了特别高比例的IL-2分泌T细胞，并且在已知具有相对高的免疫原性的抗hA33抗体的存在下进行培养时获得了相似的结果。对本领域技术人员而言，抗hA33抗体可以通过例如参考WO1994/013805的记载而产生。另一方面，甚至在这些的时间点，在依那西普(注册商标)的存在下进行培养时检测到的IL-2分泌T细胞的比例，与在免疫刺激物质的非存在下(NA)培养相同时间时的比例，处于相同的水平，其中所述依那西普为已知具有低免疫原性的市售可获得的药物。这些结果显示，在用测试物质刺激之后，在显示活跃增殖前的时间点的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例，可以用作用于评价测试物质的免疫原性的早期标记物。
[实施例2]
[通过免疫应答的在显示活跃的抗原特异性增殖前的IL-2分泌CD4+T细胞的比例和ADA发生率的比较]
[2-1.使用显示活跃的抗原特异性增殖前的IL-2分泌CD4+T细胞的比例作为指标，评价蛋白质制剂的免疫原性]
当将各种蛋白质制剂包括市售可获得的药物用作免疫刺激物质时，在显示活跃增殖之前，分析IL-2分泌CD4+ T细胞的比例。具体而言，从LONZA公司购买的源自16～31个供体(HLA-DRB1覆盖范围：高加索人70％和日本人60％)的冷冻PBMC中，在OpTmizer CTS T细胞扩增SFM(gibco)中以1x106细胞/ml制备CD8-CD25低PBMC，以1ml/孔将其接种至平底的24孔板中，并于37℃在5％CO2培养箱内预温育1小时。随后，添加各种测试物质，并进行培养67小时。通过向培养基中以10μl/孔添加Miltenyi Biotec IL-2捕获试剂(IL-2分泌测定试剂盒，Miltenyi Biotec)并进一步培养1小时，将培养的细胞群体中的IL-2分泌细胞进行标记。接下来，于室温收集经培养的CD8-CD25低PBMC，于4℃离心以除去上清。细胞在冰上于4℃悬浊于用于流式细胞术的洗涤/染色液中，移至圆底的96孔板中，并洗涤。在用抗CD3抗体(BD)、抗CD4抗体(BD)、抗CD14抗体(BD)以及IL-2检测抗体(IL-2分泌测定试剂盒，MiltenyiBiotec)染色之后，洗涤细胞。添加7AAD之后，对细胞进行流式细胞术，确定IL-2分泌CD4+ T细胞的比例。将结果示于图3。
如图3中所示，对于许多供体的PBMCs而言，在已知具有相对高的免疫原性的抗hA33抗体的存在下的培养，导致检测到高比例的IL-2-分泌CD4+ T细胞。然后，在市售可获得的药物阿昔单抗(注册商标)的存在下进行培养时，也对于源自多个供体的PBMC检测到了高比例的IL-2分泌CD4+ T细胞。另一方面，在已知免疫原性较低的上述的市售药物依那西普(注册商标)的存在下进行培养时，与在测试物质的非存在下培养的阴性对照(NA)相比，检测到较高比例的IL-2分泌CD4+ T细胞的例子仅有数个。这些结果与作为常规的免疫原性评价方法的临床抗药物抗体(ADA)发生率共同示于表1。
表1
在表1中，按从ADA发生率最低的测试物质依次示出结果。该顺序与图3中示出的IL-2分泌CD4+ T细胞比例的顺序一致。具体而言，对于在图3中显示高比例IL-2分泌CD4+ T细胞的阿昔单抗(注册商标)和抗hA33抗体而言，临床ADA发生率高，其与比例相关。另一方面，对于显示低比例IL-2分泌CD4+ T细胞的依那西普(注册商标)，ADA发生率低。
表1示出了当将高于无刺激阴性对照(NA)的比例的IL-2分泌CD4+ T细胞比例设定为0.07％以上时，被评价为阳性的PBMC的供体的数量和比例。作为使用该比例作为评价指标通过t检验进行评价的结果，评价为对于抗hA33抗体，检测到了与依那西普及阿昔单抗相比显著更大的数量的IL-2分泌CD4+ T细胞。可以进行药物候选物质的筛选，例如，通过将对照水平设为约20～60％、约20～50％、约20～40％、约20～30％等，所述对照水平是当将IL-2分泌CD4+ T细胞比例设定为0.07％以上时，阿昔单抗的阳性供体频率和抗hA33抗体的阳性供体频率之间的水平。
[2-2.使用显示活跃的抗原特异性增殖前的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例作为指标，经修饰抗体的免疫原性的评价]
接下来，通过使用显示活跃增殖前的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例作为指标，对分享共同结合靶标的多种不同类型的经修饰抗体的免疫原性进行了评价。具体而言，从源自10名供体的冷冻PBMC制备CD8-CD25低PBMC，并且在抗体A及其经修饰形式的抗体A2～A6、以及已知具有高免疫原性的抗hA33抗体的存在下培养细胞67小时。图4示出了如实施例2-1中所确定的培养的细胞群体中IL-2分泌细胞的比例的结果。
如图4所示，即使是对于结合至相同靶标的一系列的经修饰形式，每个经修饰形式也导致了在显示活跃增殖前检测到IL-2分泌CD4+T细胞的不同比例。对于这些结果，表2示出了当将高于抗体A的比例的IL-2分泌CD4+T细胞比例设定为0.07％以上时，被评价为阳性的PBMC供体的比例。当基于比例进行评价时，对于抗体A2～A6而言，阳性供体的频率与抗体A的频率相比略高，但与抗hA33抗体的频率相比足够低。因此，使用活跃增殖前的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例作为指标，可以从多种经修饰形式中，选择不具有高免疫原性的经修饰形式作为药物候选物质。这种评价体系的使用允许例如，以短时间内进行用于治疗性抗体候选物的最优化工艺中的基于免疫原性的筛选。
表2
表1及表2示出的结果表明，(1)通过使用显示活跃的增殖前的IL-2分泌CD4+T细胞比例作为指标，可以得到与使用ADA发生率作为指标时同样的评价结果；并且(2)根据评价体系的条件(例如，用测试物质刺激后，IL-2分泌CD4+ T细胞的检测时刻)而设定的适当的对照水平，在进行筛选以选择具有低免疫原性的测试物质作为用于药物开发的候选物质中有用。
[实施例3]
[使用活跃增殖前的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例作为指标，各种测试物质的免疫原性的评价]
使用本发明的评价指标(在T细胞的活跃增殖前的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例)，对各种测试物质的免疫原性进行了评价，其中在实施例2中发现本发明的评价指标产生的评价结果与使用已知的免疫原性评价指标(ADA发生率)的结果相同。具体而言，使用疫苗(流感HA疫苗：图5A)、抗体B或抗体B与其抗原的复合物(图5B)、或可能污染蛋白质制剂的杂质(内毒素(LPS)：图5C)作为测试物质，如实施例2中确定活跃增殖前的IL-2分泌CD4+T细胞的比例。将结果示于图5。
如图5A所示，在已知具有非常高免疫原性的流感HA疫苗的存在下培养细胞时，在疫苗浓度为0.003μg/ml或更高处，清楚地检测到了IL-2分泌CD4+ T细胞。
另外，当在具有高免疫原性的KLH的存在下培养细胞时，其中所述KLH用作用于免疫接种的载体蛋白，确定地检测到了IL-2分泌CD4+ T细胞。当将抗体单独用作测试物质时，其中该抗体可用作低免疫原性蛋白质制剂，几乎检测不到IL-2分泌CD4+ T细胞；并且，当使用由抗体和其抗原形成的复合物作为测试物质时，检测到了IL-2分泌CD4+ T细胞(图5B)。
当在各种浓度的内毒素(LPS)的存在下培养细胞时，其中所述内毒素是可能污染蛋白质制剂的杂质的实例，从LPS浓度为0.1ng/ml起，明确地检测到IL-2分泌CD4+ T细胞(图5C)。另一方面，当将作为血液成分的实例的血液凝固因子VIII(因子VIII)作为测试物质时，即使因子VIII浓度为10μg/ml，也不能确定地检测到IL-2分泌CD4+ T细胞(图5C)。
当使用具有小于蛋白质的分子量的肽作为测试物质时，如图5D所示，检测到非常少的IL-2分泌CD4+ T细胞。
因此，发现本发明的免疫原性评价方法对各种测试物质适用，并不限于蛋白质。
工业实用性
本发明的免疫原性评价方法的特征在于，使用在IL-2分泌初期期间的时间点检测的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例作为评价指标。更具体而言，本方法的特征在于，使用在CD4+T细胞对测试物质刺激进行应答而增殖变得活跃前的时间点检测的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例作为评价指标。通常，对抗体药物进行特异性应答的预存在的T细胞库的比例非常低，其范围为平均0.01～0.3个细胞每106个CD4+ T细胞。因此，对于免疫原性而言，一直认为由于细胞的活化或增殖很难在蛋白质水平被检测到，而难以在由测试物质诱导的增殖较弱的时期(测试物质存在下，培养开始之后少于5天、优选为24～72小时)的时间点进行评价。因此，本领域的公知技术常识是，使用在免疫应答中增殖变得活跃后的时间点的细胞因子的分泌或临床抗药物抗体(ADA)的出现频率作为用于免疫原性评价的指标。实际上，即使是使用已知具有相对高的免疫原性的抗hA33抗体进行刺激，在细胞增殖变得活跃前的IL-2分泌CD4+ T细胞的比例至多为0.25％(图3)。通常，具有这样低的阳性频率的评价体系是稳定性差的。但是，出乎意料地，对于根据临床抗药物抗体(ADA)出现频率而显示免疫原性低于抗hA33抗体的测试物质而言，即使根据在增殖变得活跃前的IL-2分泌CD4+ T细胞比例，也稳定地显示免疫原性低于抗hA33抗体，而且其结果与使用常规评价指标的评价结果具有良好的相关(表1)。即使在IL-2分泌初期期间的时间点的阳性的频率较低，但仍得到稳定的数据，认为这是由于本评价方法提供了巧妙的设计，例如：在与测试物质一起培养的细胞群体中基本上不含CD8+ T细胞和CD25+ T细胞(可以将CD8+ T细胞和CD25+ T细胞从细胞群体中预先除去)，而且通过对培养方法(细胞数量和培养基的种类)进行设计而减少了噪声，并且巧妙地使用IL-2捕获试剂及IL-2检测抗体的方法以允许高活性T细胞残留。
如上所述，本发明的免疫原性评价方法是有用的，在于所述方法能够在比之前已知的更短时间内对测试物质例如蛋白质制剂(例如，抗体药物)的免疫原性进行评价。使用具有这样的优点的本发明的方法，可以在筛选药物候选物质中实现高通量，并且能够对加速药物开发作出贡献。

Claims (9)

1.用于评价测试物质的免疫原性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将源自血液的细胞群体与测试物质培养，其中所述源自血液的细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)和CD4+ T细胞，并且基本上不包含CD8+ T细胞或CD25+ T细胞；
(b)在IL-2分泌初期期间的时间点，检测在步骤(a)中培养的所述细胞群体中的IL-2分泌T细胞；和
(c)计算在步骤(b)中检测的所述IL-2分泌T细胞的比例。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述源自血液的细胞群体为源自外周血单核细胞(PBMC)的细胞群体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述血液源自人。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述IL-2分泌初期期间的时间点为所述T细胞的增殖变得活跃之前。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述IL-2分泌初期期间的时间点为所述培养开始之后24小时和72小时之间。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述测试物质选自由以下组成的组：蛋白质、肽、核酸、糖类、脂质、疫苗，及它们中的两种以上的缀合物，以及包含它们中的两种以上的组合的混合物。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述测试物质为蛋白质。
8.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述测试物质为抗体。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，计算所述IL-2分泌细胞的比例是通过流式细胞术测量所述细胞的数量。
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