WO2018079702A1 - ラクトフェリン／アルブミン融合タンパク質及びその製造方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a lactoferrin / albumin fusion protein and a method for producing the same.
  • Lactoferrin is a glycoprotein having a molecular weight of about 80,000, which is mainly present in mammalian milk and is also found in neutrophils, tears, saliva, nasal discharge, bile, semen and the like. Lactoferrin belongs to the transferrin family because it binds iron.
  • the physiological activities of lactoferrin include antibacterial action, iron metabolism regulation action, cell proliferation activation action, hematopoiesis action, anti-inflammatory action, antioxidant action, phagocytic action, antiviral action, bifidobacteria growth promotion action, anti Cancer, metastasis, and translocation are known. Furthermore, it has also been clarified that lactoferrin has a lipid metabolism improving action, an analgesic / anti-stress action, and an anti-aging action (Non-patent Documents 1 and 2).
  • lactoferrin is a physiologically active protein that exhibits various functions, and is expected to be used in applications such as pharmaceuticals and foods to restore or enhance health.
  • Foods containing lactoferrin have already been marketed. Has been.
  • lactoferrin When lactoferrin is administered orally, the burden on the administration control is less than that of injections, and it is known that the lactoferrin receptor is present in the small intestinal mucosa. Recently, a small amount of lactoferrin is taken into the body from the intestinal tract. It has been clarified that the biological activity is expressed (Non-patent Document 3).
  • Non-patent document 4 when lactoferrin is ingested orally, it is hydrolyzed by the acid protease pepsin present in gastric juice and decomposed into peptides, so that most of the orally ingested lactoferrin molecules can reach the intestinal tract.
  • Non-patent document 4 Therefore, in order to enhance the biological activity of lactoferrin, it is important that lactoferrin reaches the intestine without being hydrolyzed by pepsin in gastric juice.
  • Such a method is known as a pharmaceutical treatment for enteric coating, for example, coating with an enteric layer containing a component that does not dissolve at low pH but dissolves near neutrality (Patent Document 1).
  • these preparations have the disadvantage that complicated steps are required.
  • Non-patent Document 2 serum albumin fusion proteins have been developed (Non-patent Documents 5 and 6) and are also on the market. Serum albumin is a protein with a molecular weight of approximately 66,000, accounting for approximately 60% of the serum protein, and is the protein with the highest content of serum proteins.
  • serum albumin in blood vessels is to control blood vessel osmotic pressure by water retention, but also has the function of binding fatty acids, hormones, drugs, etc., and transporting them to the necessary tissues.
  • Adults are made around 9 grams per day, with approximately 40% distributed in blood vessels and the remaining 60% distributed outside blood vessels.
  • serum albumin has an accumulation property with respect to tumors
  • a pharmaceutical with enhanced anticancer activity which is bound with a polymer compound such as paclitaxel
  • the serum albumin fusion protein can be selectively transported to tumor tissues as well as blood stability.
  • An object of the present invention is to provide a lactoferrin fusion protein with high clinical usefulness, a method for producing the same, and the like. Furthermore, the present invention provides a lactoferrin fusion protein that retains the biological activity of natural lactoferrin and has a significantly prolonged body life, and is more clinically useful than natural lactoferrin and recombinant lactoferrin, and a method for producing the same. The purpose is to do.
  • the present invention provides the following fusion proteins and methods.
  • HSA human serum albumin
  • LF lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin
  • Y is a protein or peptide containing human serum albumin or a fragment of human serum albumin
  • s is a sequence of 0 to 10 arbitrary amino acids
  • n is 1 to (Represents an integer of 10) Or a variant thereof.
  • An expression vector comprising the nucleic acid molecule according to (9).
  • a host cell comprising the expression vector according to (10).
  • a non-human transgenic animal comprising the nucleic acid molecule according to (9).
  • a pharmaceutical composition comprising the fusion protein according to any one of (1) to (8) above or a variant thereof and a carrier.
  • the pharmaceutical composition according to the above for treating a tumor.
  • the pharmaceutical composition according to the above (16), wherein the tumor is lung cancer.
  • a method for treating a tumor comprising administering a therapeutically effective amount of the fusion protein according to (1) or a variant thereof to a patient.
  • the tumor is lung cancer.
  • the fusion protein according to (20) or a variant thereof, wherein the tumor is lung cancer.
  • Use of the fusion protein according to (1) or a variant thereof in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating a tumor is lung cancer.
  • the fusion protein of the present invention or a variant thereof retains the iron binding ability of lactoferrin, and at least the important organism of lactoferrin based on the iron binding ability Activity is retained. Moreover, since it has bioavailability and resistance to protease, it can exhibit biological activity in the body for a long time. Furthermore, the fusion protein of the present invention is characterized by being less susceptible to digestive degradation by pepsin in the stomach. For this reason, it can reach the intestines sufficiently without pharmaceutical treatment for further enterolysis, such as coating with an enteric layer that contains components that do not dissolve at low pH and dissolve near neutrality. sell.
  • Lactoferrin is very safe and has various biological activities. Therefore, according to the present invention, it can be applied more advantageously as a therapeutic or prophylactic agent for diseases or symptoms for which there is no effective therapeutic agent.
  • the fusion protein of the present invention can be used for lifestyle-related diseases (arteriosclerosis, hypercholesterolemia, hyperlipidemia, hypertension, diabetes, fatty liver, etc.), cancer (carcinogenesis prevention, secondary prevention of cancer, metastasis suppression).
  • Infection periodontal disease, alveolar pus effusion, bad breath, oral candidiasis, stomatitis, stomatitis, rhinitis, esophagitis, cholecystitis, urinary tract infection, gonorrhea infection, athlete's foot, acne, herpes virus infection, elderly It can be applied to pneumonia, postoperative infections, etc., and has the effect of enhancing the action of antibiotics.
  • lactoferrin also has an effect of bringing about immune tolerance, and the fusion protein of the present invention or the pharmaceutical composition containing the same is also applied to allergic diseases such as hay fever, atopic dermatitis, seborrhea and urticaria. Is possible.
  • lactoferrin has a strong antioxidative stress action based on iron chelating action
  • the fusion protein of the present invention or a pharmaceutical composition containing the same has anti-inflammatory properties such as Wilson's disease and fulminant hepatitis. It can also be applied to aging / rejuvenation, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, mucosal epithelial cell keratinization suppression, and rejuvenation.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the production of an hLF-HSA fusion protein expression vector (pOptiVEC / hLF-HSA) in which a human lactoferrin (hLF) cDNA containing a signal sequence and a human serum albumin (HSA) cDNA produced by PCR are fused.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of production of an HSA-hLF fusion protein expression vector (pOptiVEC / HSA-hLF) obtained by fusing human serum albumin (HSA) cDNA containing a signal sequence and human lactoferrin (hLF) cDNA produced by PCR.
  • Intracellular uptake of fluorescently labeled Aspergillus-derived recombinant hLF (rhLF), hLF-HSA, and HSA-hLF fusion protein into human small intestinal epithelial cell Caco-2 was analyzed using a confocal laser scanning microscope.
  • the figure shows the analysis of intracellular uptake of Aspergillus-derived recombinant hLF (rhLF), hLF-HSA, and HSA-hLF fusion protein into human small intestinal epithelial cell Caco-2 by Western blot using a polyclonal antibody against hLF It is.
  • FIG. It is a figure which shows the blood stability in rats of both hLF-HSA and HSA-hLF fusion protein (rhLF is quoted from Shiga, Y et al. Eur J Pharm Sci. Vol.67, 136-143, 2015). It is a figure which shows the half life and AUC value in the rat of hLF-HSA and HSA-hLF both fusion protein.
  • the numerical values in the graph indicate the relative values of both hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins based on the value of hLF. It is a figure which shows the antitumor activity with respect to the low differentiation type human lung adenocarcinoma cell of hLF-HSA and HSA-hLF. It is a figure which shows the influence on the anti-tumor effect by the covalent bond of fusion protein. It is a figure which shows the antitumor activity with respect to a differentiation type human lung adenocarcinoma cell of hLF-HSA and HSA-hLF. It is a figure which shows the activity with respect to a human lung normal cell of hLF-HSA and HSA-hLF.
  • the fusion protein with lactoferrin or a lactoferrin biologically active fragment or peptide of the present invention is represented by the following general formula.
  • (LF-sY) n or (Ys-LF) n Formula I
  • LF represents lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin
  • Y represents a protein or peptide containing human serum albumin or a fragment of human serum albumin
  • s represents a sequence of any amino acid from 0 to 10
  • n represents an integer of 1 to 10.
  • (LF-sY) represents a protein fused with hLF on the N-terminal side and HSA on the C-terminal side
  • (Ys-LF) represents HSA on the N-terminal side and hLF on the C-terminal side. Represents a fused protein.
  • (LF-sY) n type fusion protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 with 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7% or more , 99.8% or more, or a protein comprising or consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 99.9% or more.
  • the (LF-s-Y) n type fusion protein is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the (Ys-LF) n type fusion protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 with 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7% or more , 99.8% or more, or a protein comprising or consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 99.9% or more.
  • the (Y-s-LF) n type fusion protein is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • the fusion protein of the present invention is a biologically active fusion protein containing human serum albumin (HSA) or a fragment of human serum albumin, and lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin.
  • HSA human serum albumin
  • lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin.
  • Human serum albumin In the fusion protein of the present invention, the albumin may be a full-length albumin or a partial peptide of albumin that is compatible with a living body or pharmacologically inactive. Albumin may be derived from humans and various animals (such as cows, horses, buoys, sheep, goats, camels, etc.) or derived from chicken eggs, preferably human serum albumin (HSA). .
  • the amino acid sequence of human serum albumin (GenBank: AAA98797.1, SEQ ID NO: 2) and the CDS sequence (GenBank: M12523.1, SEQ ID NO: 1) are known.
  • human serum albumin may be identical to the native sequence (SEQ ID NO: 2) and may have mutations.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% More than 98%, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more sequence identity
  • a protein having an amino acid sequence having In general, the larger the sequence identity value, the better.
  • Human serum albumin fragments or peptides include 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Alternatively, those consisting of a sequence occupying 90% or more can be used.
  • Lactoferrin used in the present invention may have the same amino acid sequence as natural lactoferrin obtained from humans and various animals (cow, horses, bunyu, sheep, goats, camels, etc.). As long as it has the physiological activity of lactoferrin, it may have a mutation in which some amino acids are deleted, added or substituted.
  • the human lactoferrin GenBank: AAN75578.2, SEQ ID NO: 4
  • CDS sequence GenBank: AY178998.2, SEQ ID NO: 3
  • Various functional (biologically active) fragments and peptides of lactoferrin are known (eg, “Program / Abstract Collection 2nd Clinical Lactoferrin Symposium 2009”, pp.
  • the physiological activity of lactoferrin includes antibacterial action, iron metabolism regulation action, cell proliferation activation action, hematopoiesis action, anti-inflammatory action, antioxidant action, phagocytosis action, antiviral action, It means a wide range of physiological activities including bifidobacteria growth promoting action, anticancer action, cancer metastasis inhibiting action, translocation inhibiting action, lipid metabolism improving action, analgesic action, antistress action and the like.
  • bioactive fragment or peptide of lactoferrin is 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Alternatively, those comprising a sequence occupying 90% or more can be used.
  • the bioactive fragment or peptide of lactoferrin is 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Those consisting of a continuous amino acid sequence occupying 80% or more, or 90% or more can be used.
  • the fusion protein of the present invention has an iron chelate (binding) ability equivalent to that of natural lactoferrin (or a recombinant lactoferrin having a sequence equivalent to that of nature).
  • the iron binding ability of natural lactoferrin (or recombinant lactoferrin having a sequence equivalent to that of nature) is 100% as measured by the method of Examples described later
  • the fusion protein of the present invention is , At least 50% or more (eg, about 50% to about 150% or about 50% to about 120%) of iron binding ability
  • the fusion protein of the present invention contains natural lactoferrin (or About 70% to about 100% or more (for example, about 70% to about 150% or about 70% to about 120%) of recombinant lactoferrin having a sequence equivalent to that in nature, or about 90% or more It has iron binding ability.
  • the iron binding capacity may have an error of about 2% soil, 5% soil, 10% soil, or 20% soil when measured by the method described in the
  • the human serum albumin used in the present invention is preferably one that is hardly decomposed from a state fused with human lactoferrin.
  • hLF-HSA which is a protein fused with human lactoferrin at the N-terminal side and human serum albumin at the C-terminal side, has human serum albumin at the N-terminal side and human lactoferrin at the C-terminal side.
  • HSA-hLF which is a protein fused so as to be located on the side, may also be used. At least, hLF-HSA has excellent heat stability and resistance to pepsin digestion.
  • the fusion protein of the present invention may further comprise an additional amino acid sequence.
  • Human serum albumin and lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin can have any amino acid sequence of a suitable length as a spacer sequence.
  • the spacer sequence (s) can be, for example, a sequence of 0 to 10, or 0 to 5 arbitrary amino acids.
  • Other additional sequences may provide steric advantages such as spacer sequences, and may have some function as fusion proteins, such as signal peptides and tag sequences used for purification. You may give to.
  • the fusion protein of the present invention is considered to be incorporated in the small intestine via at least one known receptor selected from the group consisting of a lactoferrin receptor and an albumin receptor (Malin Bern, Kine Marita Knudsen Sand, Jeannette Nilsen, Inger Sandlie, Jan Terje Andersen, Journal of Controlled Release 211 (2015) 144-162).
  • the fusion protein of the present invention can be produced by gene recombination.
  • a lactoferrin gene having a desired amino acid sequence and a human serum lactoferrin gene are linked by a conventional method to construct an expression vector containing other elements necessary for expression in a desired host cell.
  • the fusion protein can be expressed by introducing it into the cell, and the expressed fusion protein can be recovered from the cells or medium (Reference: Shiga, Y et al. Eur J Pharm Sci. Vol.67, 136-143, 2015).
  • Nucleic acid molecules encoding the fusion protein and the like of the present invention can be designed and prepared by known sequences and standard gene manipulation techniques (literature: Ikuta, S et al. J Control Release vol.147, 17-23, 2010). Genes encoding lactoferrin and human serum albumin can be cloned from various commonly available genomic or cDNA libraries using probes based on known nucleic acid or amino acid sequences, or by the polymerase chain reaction (PCR) method. It can be obtained by synthesis. Desired modifications or mutations may be introduced into these genes.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Host cells and vector systems used to replicate nucleic acid molecules, and host and vector systems used to express fusion proteins are known in many eukaryotic cells (mammalian cells, plant cells, yeast, insects). Cells) and prokaryotic cells (bacteria etc.).
  • a vector for expressing the fusion protein of the present invention comprises a sequence encoding lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin and a sequence encoding human serum albumin (or a sequence encoding human serum albumin and an organism of lactoferrin or lactoferrin
  • active fragment or peptide-encoding sequence in general, in an operably linked state, including elements such as a transcription promoter, secretory signal peptide sequence, transcription terminator, poly A signal, and more usually drug resistance Contains a selectable marker such as a gene.
  • vectors can be used to transform host cells according to various known techniques.
  • the fusion protein of the present invention can be produced in these animals and plants by producing transgenic plants and transgenic animals.
  • the fusion protein of the present invention can be secreted into milk by incorporating a nucleic acid molecule encoding the fusion protein of the present invention into the genome of a non-human animal such as sheep or goat.
  • useful plants that produce the fusion protein of the present invention can be produced by being incorporated into plants (for example, JP-T-2004-528022).
  • the fusion protein of the present invention can be obtained by appropriately using various chromatographic techniques such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography and affinity chromatography from the medium of host cells transformed with the expression vector of the present invention. It can be separated and purified. Particularly preferred purification methods include ion exchange chromatography.
  • the fusion protein of the present invention sufficiently retains the biological activity of lactoferrin, it can be administered alone or in combination with other drugs as a prophylactic or therapeutic agent for diseases in which lactoferrin is effective.
  • the fusion protein of the present invention can be made into a pharmaceutical composition of a desired dosage form by blending various carriers known in the field of pharmaceutics, therapeutically inert bases and / or additives. it can.
  • the term “medicament or pharmaceutical composition” in the context of the present invention includes not only humans but also animals (ie, veterinary medicine, etc.).
  • Various components and dosage forms that can be contained in such a pharmaceutical composition are well known to those skilled in the art.
  • Pepsin resistance The fusion protein of the present invention has improved pepsin resistance. Since pepsin is the main proteolytic enzyme in gastric juice, improving pepsin resistance can provide a fusion protein that is difficult to digest in the stomach. Pepsin resistance can be measured by a known method. For example, after adding a pepsin solution to a protein solution with an appropriate concentration and digesting it, the digested protein is detected or measured by gel electrophoresis such as SDS-PAGE, etc.
  • the fusion protein of the present invention has antitumor activity.
  • the antitumor activity refers to an activity that inhibits the growth of tumor cells.
  • Anti-tumor activity may also be referred to herein as an anti-tumor effect.
  • the antitumor activity of the fusion protein of the present invention is determined by starting culturing the same number of tumor cells in the presence (sample group) and absence (control group) of the fusion protein of the present invention, and after a certain period (for example, 24 hours later). 48 hours and 72 hours later), the number of tumor cells in the sample group is smaller than the number of tumor cells in the control group.
  • the tumor may be a benign tumor or a malignant tumor.
  • tumors examples include (1) sarcomas such as osteosarcoma and soft tissue sarcomas, (2) breast cancer, lung carcinoma, bladder carcinoma, thyroid carcinoma, prostate carcinoma, colon carcinoma, colorectal carcinoma, pancreatic carcinoma, Gastric carcinoma, liver carcinoma, uterine carcinoma, cervical carcinoma, ovarian carcinoma, etc., (3) lymphoma such as Hodgkin and non-Hodgkin lymphoma, (4) neuroblastoma, (5) melanoma, (6) myeloma, ( 7) Wilms tumor, (8) Leukemia such as acute myeloid leukemia (AML), chronic myeloid leukemia (CML), acute lymphocytic leukemia (ALL) and chronic lymphocytic leukemia (CLL), (9) glioma, (10 ) Retinoblastoma and the like, but not limited thereto.
  • sarcomas such as osteosarcoma and soft tissue sarcomas
  • breast cancer lung carcinoma, bladder carcinoma
  • the tumor is a lung cancer type, and even lung adenocarcinoma.
  • the tumor cells may be any of differentiated, poorly differentiated, and undifferentiated types, but certain embodiments exhibit particularly strong antitumor effects against differentiated and poorly differentiated types.
  • the fusion protein of the present invention has a marked antitumor activity compared to when HSA or rhLF is administered alone.
  • the fusion protein of the present invention in which HSA and rhLF are covalently bonded exhibits higher antitumor activity than when HSA and rhLF are used together without being covalently bonded.
  • the fusion protein of the present invention selectively shows a cell proliferating action on tumor cells and does not show a cell proliferating action on normal cells. For this reason, it can be seen that the fusion protein of the present invention does not cause side effects, or produces anti-tumor activity with low side effects.
  • the present invention further provides a method for treating a tumor, comprising administering a therapeutically effective amount of the fusion protein of the present invention or a variant thereof to a patient.
  • the present invention also provides the fusion protein of the present invention or a variant thereof for use in the treatment of tumors.
  • the present invention also provides the use of the fusion protein of the present invention or a variant thereof in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of tumors.
  • lactoferrin-related diseases include lifestyle-related diseases (arteriosclerosis, hypercholesterolemia, hyperlipidemia, hypertension, diabetes, fatty liver, etc.), cancer (carcinogenesis prevention, secondary prevention of cancer, metastasis suppression, Enhancement of the action of anticancer drugs, etc.), autoimmune diseases (dry eyes and dry mice caused by Sjogren's syndrome, rheumatoid arthritis, malignant rheumatoid arthritis, collagen disease, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, systemic lupus erythematosus, etc.), mental Neurological diseases (dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Tencan, depression, Hikikomori, schizophrenia, various stress diseases, climacteric disorders, etc.) Pain relief (Opioid enhancing effects such as morphine, cancer pain,
  • lactoferrin-related diseases include Wilson's disease and fulminant hepatitis that can be treated based on the antioxidant stress effects of lactoferrin, anti-aging / rejuvenation effects on the skin and eyes, age-related macular degeneration, diabetes Retinopathy is included.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating a tumor, comprising the fusion protein of the present invention.
  • the tumor is as described above.
  • the patient is not particularly limited as long as it is a mammal, but is preferably a human.
  • the patient includes a fetus.
  • administering means that the fusion protein of the invention is delivered into the patient's body.
  • the administration route is not particularly limited and may be either oral administration or parenteral administration.
  • parenteral administration intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular injection, transdermal administration, nasal administration, sublingual administration Either administration or local administration may be used.
  • the composition of the present invention may contain a therapeutically effective amount of the fusion protein of the present invention which is an active ingredient.
  • the “therapeutically effective amount” means that by administering the amount of the active ingredient to the subject, the symptoms of the disease to be treated are reduced as compared to the case where the active ingredient is not administered, and It refers to an amount that does not worsen, and also includes the meaning of an effective amount in prevention.
  • a therapeutically effective amount is 0.001-10 g / kg / day, 0.005-10 g / kg / day, 0.01-10 g / kg / day as the amount of lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin.
  • the therapeutically effective amount is 10 mg to 15,000 mg, 10 mg to 12,000 mg, 10 mg to 10,000 mg, 10 mg to 10,000 mg, as the amount of lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin per day, The amount is 20 mg to 10,000 mg, 20 mg to 8,000 mg, 30 mg to 8,000 mg, 30 mg to 6,000 mg.
  • the therapeutically effective amount is 0.001 to 10 g / kg / day, 0.005 to 10 g / kg / day, 0.01 to 10 g / kg as the amount of lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin.
  • the therapeutically effective amount is 10 mg to 15,000 mg, 10 mg to 12,000 mg, 10 mg to 10,000 mg, 10 mg to 10,000 mg, as the amount of lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin per day, The amount is 20 mg to 10,000 mg, 20 mg to 8,000 mg, 30 mg to 8,000 mg, 30 mg to 6,000 mg.
  • Such daily doses can be administered to a patient in need of treatment at once or in divided portions.
  • the dose and frequency of administration of the composition of the present invention vary depending on various factors such as the subject's species, body weight, sex, age, disease progression, and administration route, but doctors, veterinarians, dentists A person skilled in the art such as a doctor or a pharmacist can determine the dose in consideration of each factor.
  • the above-mentioned therapeutically effective amount, dosage and administration frequency list typical numerical values, and it is fully conceivable that even if a numerical value exceeding or below this value is effective for treatment. Therefore, numerical values exceeding or below the therapeutically effective amount, dosage and administration frequency are also included as the therapeutically effective amount, dosage and administration frequency of the composition of the present invention.
  • the effective dose of the therapeutic agent or pharmaceutical composition containing the fusion protein or the like of the present invention varies depending on the type or degree of the disease or symptom to be treated or prevented, the condition of the administration subject, the dosage form, the administration route, etc. It can be appropriately selected based on the amount of lactoferrin and the amount of albumin.
  • Example 1 Preparation of a fusion protein of human lactoferrin (hLF) and human serum albumin (HSA)
  • hLF is N-terminal and HSA is C
  • HSA-HSA human serum albumin
  • rhLF means recombinant hLF derived from Aspergillus.
  • hLF-HSA expression vector The hLF cDNA fragment containing the signal sequence is expressed in the expression vector pOptiVEC / hLF-dFc (Shiga, Y et al. Eur J Pharm Sci for known DHFR-deficient Chinese hamster ovary cells (CHO [DG44]). Vol. 67, 136-143, 2015) was prepared by digesting with Xho I and BamH I.
  • human HSA cDNA was obtained by using the vector pPIC9-HSA-trx ⁇ ⁇ ⁇ (Ikuta, S et al. J Control Release vol. 147, 17-23, 2010) as a template, BamHI-c-HSA (73-92 ) (5'-CGCGGATCCCGATGCACACAAGAGTGAGGT-3 ': SEQ ID NO: 5) [introduced underlined BamH I site]), NotI-HSA (1830-1811 (530-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3': SEQ ID NO: 6) [Introduced underlined Not I site on the 3 'end] and DNA synthase using "PrimeStar (registered trademark) HS (premix)" (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.) HSA cDNA was obtained by PCR, and the obtained DNA fragment was digested with BamH I and Not I to excise the DNA
  • hLF-HSA sequence SEQ ID NO: 7
  • amino acid numbers 1 to 711 SEQ ID NO: 8
  • amino acid numbers 712 to 713 SEQ ID NO: 713
  • amino acid numbers 714 to 1298 SEQ ID NO: 9 is the amino acid sequence of human serum albumin (HSA).
  • HSA cDNA containing a signal sequence was obtained by RT-PCR using total RNA extracted from HepG2, which is a human liver cancer-derived cell line, and using the total RNA as a template.
  • HepG2 was cultured in D-MEM (low glucose) medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 10% fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • Total RNA was extracted from 1 ⁇ 10 6 cells of HepG2 cells using the RNA extraction reagent ISOGEN (trade name, manufactured by Nippon Gene). The method followed the protocol attached to the reagent.
  • Total cDNA was synthesized using the obtained 2 ⁇ g of total RNA as a template, using an oligo dT primer (oligo (dT) 15 , Promega) and reverse transcriptase (ReverTra Ace, trade name, manufactured by Toyobo). The method followed the protocol attached to the reagent.
  • the HSA cDNA fragment was obtained by PCR using the obtained total cDNA as a template.
  • N-EcoRI-HSA 5'-CGGAATTCATGAAGTGGGTAACCTTTAT-3 ': SEQ ID NO: 10; [Introducing an underlined EcoRI site upstream of the start codon ATG]), Using HSA-XhoI-C (5′-CCGCTCGAGTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3 ′: SEQ ID NO: 11) [introduced underlined Xho I site on the 3 ′ end], the DNA synthase was “PrimeStar (registered trademark) HS (premix ) "(Trade name, manufactured by Takara Bio Inc.) was used to amplify the HSA cDNA.
  • the hLF cDNA fragment is a vector containing the full-length hLF cDNA sequence “pBSIILfAL” (Shiga, Y et al Eur J Pharm Sci. Vol.67, 136-143, 2015) ⁇ ⁇ as a template, S_LFex_XhoI_ATG ( 5'-CTCGAGATGGGCCGTAGGA-3 ': SEQ ID NO: 12) [Introduced underlined Xho I site upstream]), hLF reverse (Not-hLF-2136R) (5'-GCGGCCGCTTACTTCCTGAGGAACTCAC-3': SEQ ID NO: 13) [Introduced underlined Not I site on the 3 'end] and DNA synthase using “PrimeStar HS (premix)” (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.), hLF cDNA Was amplified.
  • S_LFex_XhoI_ATG 5'-CTCGAGATGGGCCGTAG
  • HSA-hLF sequence The amino acid sequence of the human serum albumin (HSA) / human lactoferrin (hLF) fusion protein encoded by the fusion protein HSA-hLF expression vector pOptiVEC / HSA-hLF is shown as the HSA-hLF sequence (SEQ ID NO: 14).
  • amino acid numbers 1 to 609 (SEQ ID NO: 15) are human serum albumin (HSA) containing a signal sequence
  • amino acid numbers 610 to 612 are spacers
  • amino acid number 613 ⁇ 1304 SEQ ID NO: 16) is the amino acid sequence of human lactoferrin (hLF).
  • DHFR-deficient Chinese hamster ovary-derived cells (a type of CHO cells) DG44) was used.
  • DHFR is dihydrofolate reductase and is essential for biosynthesis of nucleic acids.
  • MTX methotrexate
  • DHFR production is inhibited.
  • MTX methotrexate
  • the cells amplify the DHFR gene in order to survive, and the genes existing in the vicinity of the DHFR gene are also amplified, so that the protein expression of the gene is amplified. In this way, the target protein can be highly expressed.
  • the expression vectors pOptiVEC / hLF-HSA and pOptiVEC / HSA-hLF prepared in 1 and 2 were linearized by digestion with the restriction enzyme PvuI for efficient introduction into cells. Electroporation was performed with Gene Pulser Xcell (registered trademark) manufactured by Bio-Rad.
  • CHO (DG44) cells were cultured in ribonucleoside and deoxyribonucleoside-containing ⁇ -MEM medium (Product No. 21444, manufactured by Nacalai Tesque) containing 10% FBS. The cells were centrifuged at 4.0 ⁇ 10 5 cells, and after removing the supernatant, the cells were suspended in 50 ⁇ l of PBS.
  • the pellet was again suspended in ⁇ -MEM medium containing 1 ml of 10% FBS-containing ribonucleoside and deoxyribonucleoside, and then transferred to a 12-well plate for cell culture. After culturing at 37 ° C for 2 days with 5% CO 2 , replace the medium with ribonucleoside and deoxyribonucleoside-free MEM ⁇ medium (Product No. 135-15175, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) containing 10% FBS, and continue the culture. It was. The grown cells were scaled up from a 12-well plate to a T75 cm 2 flask and cultured.
  • MTX methotrexate
  • hLF-HSA and HSA-hLF fusion protein Mass expression was performed by static culture using a 175 cm 2 T flask (Greiner).
  • DG44 (hLF-HSA) cells and DG44 (HSA-hLF) were cultured in ribonucleoside and deoxyribonucleoside-free MEM ⁇ medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) containing 10% FBS until 70% confluent. After removing the culture supernatant and washing the adhering cells with PBS, 30 ml of “Hybridoma Serum Free Medium” (trade name, Invitrogen) was added and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 4 days.
  • “Hybridoma Serum Free Medium” trade name, Invitrogen
  • the culture supernatant was transferred to 50 ml centrifuge, centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was transferred to a storage container.
  • 30 ml of new “Hybridoma Serum Free Medium” (trade name, Invitrogen) was added to the cells, and the cells were further cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 4 days to prepare a culture supernatant.
  • the cells were removed by centrifugation, and the obtained culture supernatant was added with sodium azide at a final concentration of 0.02% and stored at 4 ° C.
  • hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins For purification, the culture supernatant (containing a final concentration of 0.02% sodium azide) containing hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins obtained by mass expression is used as is. used. Since human lactoferrin (hLF) is known to bind strongly to heparin, affinity purification using Heparin Sepharose 6 Fast Flow (trade name, GE Healthcare) can be used for hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins. Purification was performed.
  • Heparin Sepharose 6 Fast Flow Pack 2 ml of “Heparin Sepharose 6 Fast Flow” (trade name, GE Healthcare) into “Poly-Prep Chromatography Columns” (trade name, Bio-Rad), and add 10 mM phosphorus for 5 column volumes (CV). Equilibrated with sodium acid buffer (pH 7.0). The fusion protein was adsorbed to “Heparin Sepharose 6 Fast Flow” by bringing it into contact with Heparin Sepharose 6 Fast Flow in such a manner that 500 mL of the culture supernatant was refluxed at 10 ° C. After reflux, the culture supernatant that had been refluxed was collected as a flow-through fraction.
  • Lactoferrin is a nonheme iron-binding glycoprotein with a molecular weight of 80,000 and consists of two regions called N lobe and C lobe. It has the ability to reversibly chelate two iron ions (Fe 3+ ) per protein molecule in the presence of (CO 3 2 ⁇ ) (Anderson et al., Nature, 344, 784-78 (1990)). First, the amount of iron ions (Fe 3+ ) bound to the hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins prepared in 4. and 5. ”Was measured.
  • LF Lactoferrin
  • HSA-hLF As a result, 130 mg of hLF-HSA per mg of protein converted to hLF and 1161 ng of Fe 3+ were bound to HSA-hLF, which is the theoretical value when two iron ions (Fe 3+ ) were bound per molecule of protein. The value was almost close to (about 1400 ng of Fe 3+ per 1 mg of hLF). Therefore, both hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins were shown to have the ability to bind iron ions. Furthermore, the iron binding ability of the hLF-HSA fusion protein was measured by the following method.
  • Iron ions (Fe 3+ ) are released from each prepared fusion protein using a phosphate buffer (pH 7.5) containing 10 mM HCl (pH 2.0) and 0.1% EDTA, and apo-type lactoferrin (iron-removed type) Lactoferrin) was prepared.
  • iron recombined lactoferrin was prepared by adding iron ions (Fe 3+ ) in the presence of carbonate ions (CO 3 2 ⁇ ).
  • hLF Aspergillus-derived recombinant hLF
  • HSA human serum albumin
  • hLF-HSA fusion protein was dialyzed against 10 mM HCl (pH 2.0) for 24 hours, and further 0.1 Iron was removed by dialysis for 24 hours against 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing% EDTA and 150 mM NaCl. The sample obtained by iron removal was iron-removed lactoferrin.
  • iron recombination After deironation with hydrochloric acid and EDTA, dialyzed for 24 hours against phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.001% ammonium iron citrate, 50 mM sodium bicarbonate and 150 mM NaCl, and 150 mM NaCl Iron recombined lactoferrin was obtained by performing dialysis for 24 hours once against 50 mM phosphate buffer (pH 6.6). The iron ions bound to the protein were measured using a serum iron measurement kit “Fe C-Test Wako” (trade name, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the binding capacity of iron was calculated as the binding amount of iron bound per 1 mg of hLF protein quantified by Bradford method (in the case of HSA fusion protein, 1 mg in terms of hLF calculated using molecular weight).
  • the hLF-HSA fusion protein retained 100% iron binding capacity compared to rhLF.
  • Example 3 Examination of thermal stability of hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins using CD spectra Analysis of thermal stability of HSA-hLF and hLF-HSA fusion proteins using circular dichroism (CD) spectra did.
  • Circular dichroism (CD) spectrum is a method to measure the difference in absorption between right and left circularly polarized light when a wavelength is applied to a substance. It is possible to estimate.
  • hLF Aspergillus-derived recombinant hLF
  • HSA human serum albumin
  • HSA-hLF fusion protein suspended at 0.1 mg / ml in PBS (-)
  • a CD spectrum having a wavelength of 200 nm to 250 nm was measured at 25 ° C. (using a circular dichroism dispersometer J-1500, manufactured by JASCO Corporation).
  • the results are shown in FIG.
  • the secondary structure of both HSA-hLF and hLF-HSA fusion proteins was confirmed, and it was confirmed that the fusion of hLF and HSA did not change the secondary structure of hLF.
  • the thermal stability of each protein was examined.
  • the wavelength to be measured is around 225 nm.
  • the CD spectrum at a wavelength of 225 nm was measured while increasing by 1 ° C. from 30 to 90 ° C.
  • the denaturation temperature (Tm value) when the secondary structure was changed was calculated using a thermal denaturation analysis program Spectra Manager Ver.2 of JASCO Corporation. It has been reported that the higher the amount of iron bound to hLF, the higher the thermal stability (Spreedhara, A. et al., Biometals 23, 1159-1170, 2010). The iron content was measured using “Fe C-Test Wako” (trade name, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • each sample bound approximately the same amount of iron as rhLF: 1222 ng / mg, hLF-HSA: 1302 ng / mg, and HSA-hLF 1161 ng / mg.
  • the results of thermal stability of each protein are shown in FIG.
  • the denaturation temperature (Tm value) of each protein was rhLF: 90 ° C or higher, HSA: 61.6 ° C, hLF-HSA: 82.2 ° C, HSA-hLF: 64.5 ° C. Tm values of both fusion proteins were lower than rhLF
  • the hLF-HSA fusion protein retained higher thermal stability than HSA-hLF.
  • Example 4 Digestion resistance of HSA-hLF and hLF-HSA fusion proteins to pepsin Each protein solution adjusted to a concentration of 1.2 mg / ml (recombinant hLF (rhLF) derived from Aspergillus, human serum albumin (HSA, Jun Wako) (Manufactured by Yakuhin Co., Ltd.), hLF-HSA, HSA-hLF fusion protein) 35 ⁇ l, 10 mM HCl (pH 2.0) 40.6 ⁇ l were mixed and allowed to stand at 37 ° C. for 5 minutes.
  • rhLF derived from Aspergillus, human serum albumin
  • HSA-hLF fusion protein 35 ⁇ l
  • 10 mM HCl pH 2.0
  • Figure 7 shows, from left to right, samples that were allowed to stand for 0, 5, 10, 20, 40, and 80 minutes at 37 ° C without adding pepsin to each protein (indicated as Pepsin (-)). Is a result of electrophoresis of a sample (denoted as Pepsin (+)) that was allowed to stand at 37 ° C. for 0, 5, 10, 20, 40, and 80 minutes.
  • the density of each band was analyzed using CS Analyzer (manufactured by ATTO), which is software for digitizing the density of the stained band.
  • the relative concentration was graphed with the density of the band at 0 minutes digestion time being 100% (FIG. 8).
  • the control hLF was completely degraded within 5 minutes, whereas both hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins were resistant to digestion.
  • Digestion degradation half-life of each protein with pepsin is calculated as 5 min for hLF, 3.1 min for HSA, 80 min for hLF-HSA, 9.3 min for HSA-hLF, especially hLF-HSA is prominent for pepsin Showed good resistance to digestion.
  • Example 5 Intracellular uptake and extracellular release of human small intestinal epithelial-like cells Caco-2 LF is taken up from the intestinal tract in the form of a complete molecule, transferred to the thoracic lymph fluid in the form of a complete molecule, and then vena cava It is known that it shifts to the whole body (Takeuchi et al., Exp Physiol., Vol.89, 263-270, 2004). Intracellular uptake and extracellular release of LF into human small intestinal epithelial-like cell Caco-2 are thought to mimic intestinal absorption of LF.
  • hLF aspergillus-derived recombinant hLF
  • hLF-HSA hLF-HSA
  • HSA-hLF fusion protein is labeled with a fluorescent probe, reacted with Caco-2 cells, and taken up into the cells by confocal laser scanning Observed with a microscope.
  • each unlabeled protein was incorporated into Caco-2 cells, and then cell lysate of Caco-2 cells was prepared, and the intracellular state of each protein was analyzed by Western blotting using a polyclonal antibody against LF. .
  • each protein released from the cells was analyzed by Western blotting using a polyclonal antibody against hLF.
  • Alexa Fluor registered trademark 488 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) which is a fluorescent probe. Add 100 ⁇ l of DMSO to 1 mg of Alexa Fluor (registered trademark) 488, then mix each protein with 1 M NaHCO 3 and Alexa Fluor (registered trademark) 488 at a molar ratio of 1:10, and react at room temperature for 1 hour I let you.
  • reaction solution is dialyzed against 1 x PBS (-) for 24 hours to remove free Alexa Fluor (registered trademark) 488 that did not bind to the protein, and Alexa Fluor (registered trademark) 488 labeled protein It was.
  • Caco-2 cells were seeded in a 12-well plate at a cell concentration of 5 ⁇ 10 4 cells / ml, and cultured for 1 week at 37 ° C. and 5% CO 2 while changing the medium every 2 days.
  • PBS ( ⁇ ) was added to Caco-2 cells at 500 ⁇ l / well and washed three times to completely remove the medium components.
  • 15 ⁇ g / well of each Alexa-labeled protein suspended in PBS ( ⁇ ) was added and reacted at 4 ° C. and 37 ° C. for 1 hour.
  • the 37 ° C. reaction was performed both when the ATP synthesis inhibitor NaN 3 was added at a final concentration of 0.2% and when 150 ⁇ g of unlabeled bovine lactoferrin (bLF) was added.
  • each Alexa-labeled protein was removed, and 500 ⁇ l / well of cooled PBS ( ⁇ ) was added, followed by washing once. After washing, 200 ⁇ l / well of 0.25% Trypsin / EDTA was added and reacted at room temperature for 3 minutes, and the cells were detached from the plate. All the cells were collected in a centrifuge tube, washed with chilled PBS ( ⁇ ), and then treated with 4% PFA / PBS ( ⁇ ) for 15 minutes to fix the cells.
  • the cells were detached from the plate using 0.25% Trypsin / 1 mM EDTA, and the cells were collected in a 1.5 ml centrifuge tube. The cells were washed by adding 500 ⁇ l / ml of cooled PBS ( ⁇ ), and then centrifuged at 200 ⁇ g for 2 minutes at 4 ° C. to collect the cells. This washing operation is performed three times. Finally, 100 ⁇ l of lysed lysis buffer (PBS (-) solution containing 1% Triton X-100 and protein inhibitor) is added to the cells, and then at 4 ° C for 30 minutes. The cells were destroyed by the reaction.
  • PBS (-) solution containing 1% Triton X-100 and protein inhibitor
  • the protein in each lane was transferred to a nitrocellulose blotting membrane (Protran (registered trademark) Premium 0.45 ⁇ m NC, manufactured by GE Healthcare) according to a conventional method, and Human Lactoferrin antibody (Rabbit polyclonal, A80 as a primary antibody) -144A, manufactured by Betheyl), and anti-Rabbit IgG (Fc), Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated, 016-23943, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as secondary antibodies.
  • the band was detected by chemiluminescence (Immunozeta, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, rhLF incorporated into the cells at 37 ° C.
  • rhLF reacted with cells at 4 ° C. had a thinner band than when reacted with cells at 37 ° C. (left in FIG. 10, rhLF).
  • hLF-HSA incorporated into cells at 37 ° C. was detected as a complete molecule at the same position as the control hLF-HSA.
  • hLF-HSA reacted with cells at 4 ° C. had a thinner band than when reacted with cells at 37 ° C. (center of FIG. 10, hLF-HSA).
  • HSA-hLF was taken up into Caco2 cells in the same complete form as rhLF.
  • HSA-hLF having a molecular weight of about 140 kDa was reacted with cells at 37 ° C.
  • a band was mainly detected at a position of about 80 kDa (FIG. 10, right, HSA-hLF).
  • HSA-hLF was taken up into cells, the binding site between HSA and hLF was degraded, and 80 kDa hLF was detected by the anti-hLF antibody. Therefore, HSA-hLF was found to be degraded when taken up by Caco2 cells.
  • the cells were detached from the plate using 0.25% Trypsin / 1 mM EDTA, and the cells were collected in a 1.5 ml centrifuge tube. The cells were washed 3 times by adding 1 ml of chilled PBS (-), and then the cells were collected by centrifugation at 200 xg for 2 minutes at 4 ° C (the third wash was analyzed by Western blotting) did). 200 ⁇ l of D-MEM medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and reacted at 37 ° C. for 30, 60 and 120 minutes to release each protein into the medium.
  • D-MEM medium manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the medium was centrifuged at 6000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was analyzed by Western blotting using a polyclonal antibody against hLF.
  • Western blotting was performed by the method described in the above intracellular uptake. The results are shown in FIG. rhLF was released into the medium in the complete form of 80 kDa. In addition, hLF-HSA was released into the medium in a complete form similar to rhLF. On the other hand, in intracellular uptake, HSA-hLF, which was suggested to decompose the binding site between HSA and hLF, was released only into the culture medium.
  • Example 6 Examination of blood stability in rats using both hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins
  • the external cervix A blood collection cannula was placed in the vein.
  • Both hLF-HSA and HSA-hLF fusion protein were administered by femoral vein injection so that the body weight was 1 mg / kg body weight in terms of hLF.
  • Blood was collected from a cannula placed in the external jugular vein before and after administration 1, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 180, and 240 minutes, and plasma hLF concentration was determined by ELISA ("AssayMax Human Lactoferrin ELISA kit" , Manufactured by Assaypro).
  • each calibration curve was prepared using both hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins with known concentrations by the Bradford method. Since both hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins were linear at 0.24 to 15.0 ng / ml, each plasma sample was diluted so that the measured value was within this range, and the protein concentration was measured.
  • the half-life of the Aspergillus-derived recombinant hLF administration group is 12.6 minutes, whereas the half-life of the hLF-HSA and HSA-hLF fusion protein administration groups is 64 minutes, 404 minutes and about 5.1 times that of the hLF administration group, respectively. Doubled to 32.1 times ( Figure 13).
  • AUC As for AUC, the hLF-HSA and HSA-hLF fusion protein administration groups showed a marked improvement in blood stability, approximately 1.8 times and 4.2 times the hLF administration group.
  • both hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins showed improved molecular stability compared to rhLF.
  • hLF-HSA showed a significant improvement in molecular stability.
  • both hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins showed improved blood stability compared to rhLF.
  • HSA-hLF fusion protein showed a significant improvement in blood stability compared to hLF-HSA.
  • Example 7 Measurement of iron binding ability of hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins (deironation and iron rebinding with sodium thiocyanate and EDTA)
  • the hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins prepared by the methods described in 4. and 5., and the amount of iron ions (Fe 3+ ) bound to rhLF before deironing operation were manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Fe C-Test Wako 1207 ng of hLF-HSA, 819 ng of HSA-hLF, and 1966 ng of Fe 3+ were bound to 1 mg of hLF-converted protein.
  • Iron recombination was carried out after deironation by dialysis for 24 hours against phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.001% ammonium iron citrate, 50 mM sodium bicarbonate and 150 mM NaCl, and 50 mM phosphate buffer (pH 6.6 containing 150 mM NaCl). ) was once dialyzed for 24 hours to give iron-rebound lactoferrin.
  • the iron ions bound to the protein were measured using a serum iron measurement kit “Fe C-Test Wako” (trade name, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the binding capacity of iron was calculated as the binding amount of iron bound per 1 mg of hLF protein quantified by Bradford method (in the case of HSA fusion protein, 1 mg in terms of hLF calculated using molecular weight). The results are shown in the table. Assuming that the binding activity of rhLF is 100%, rhLF-HSA and rHSA-hLF fusion proteins showed iron binding capacity of 147% and 69.5%.
  • Example 8 Anti-tumor effect of HSA fusion protein on poorly differentiated human lung adenocarcinoma cells
  • the poorly differentiated human lung adenocarcinoma cell line PC-14 was purchased from Immune Biological Laboratories (IBL), 10% The cells were cultured in RPMI-1640 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing FBS. 100 ⁇ l / well of 0.1% porcine gelatin (manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.) solution was added to a 96-well plate for cell culture and allowed to stand for 1 hour, and the plate was coated with gelatin.
  • PC-14 was suspended in RPMI-1640 medium containing 10% FBS at 2.5 ⁇ 10 4 cells / ml, cells were seeded at 200 ⁇ l / well, and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • rhMI human serum albumin
  • HSA-HSA human serum albumin
  • HSA-hLF fusion protein containing RPMI-1640 containing 10% FBS (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0, 5, 10 ⁇ M ( HSA-hLF was adjusted to 0, 5 ⁇ M).
  • hLF-HSA and HSA-hLF fusion proteins showed significant cell growth inhibition, and HSA-hLF showed stronger cell growth inhibition than hLF-HSA. From the above, it was shown that the antitumor effect of hLF by HSA fusion was enhanced.
  • Example 9 Influence of anti-tumor effect by covalent bond of fusion protein
  • HSA and rhLF coexistence of HSA and rhLF is required, or both molecules are fused by covalent bond
  • Example 10 Anti-tumor effect of HSA fusion protein on differentiated human lung adenocarcinoma cells
  • Differentiated human lung adenocarcinoma cell line PC-9 was purchased from Immunological Research Institute (IBL) and 10% FBS was obtained.
  • IBL Immunological Research Institute
  • FBS FBS
  • 100 ⁇ l / well of 0.1% porcine gelatin (manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.) solution was added to a 96-well plate for cell culture and allowed to stand for 1 hour, and the plate was coated with gelatin.
  • PC-9 was suspended in RPMI-1640 medium containing 10% FBS at 2.5 ⁇ 10 4 cells / ml, cells were seeded at 200 ⁇ l / well, and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 . . rhMI, human serum albumin (HSA, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), hLF-HSA, HSA-hLF fusion protein containing RPMI-1640 containing 10% FBS (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0, 5, 10 ⁇ M ( HSA-hLF was adjusted to 0, 5 ⁇ M).
  • HSA human serum albumin
  • the fusion protein of the present invention has an antitumor effect also on differentiated human lung adenocarcinoma cells.
  • WI-38 was purchased from JCRB cell bank and cultured in D-MEM low glucose (Wako Pure Chemical Industries) containing 10% FBS. 100 ⁇ l / well of 0.1% porcine gelatin (manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.) solution was added to a 96-well plate for cell culture and allowed to stand for 1 hour, and the plate was coated with gelatin.
  • D-MEM low glucose medium containing 10% FBS containing 10% FBS
  • a protein solution was prepared so that rhLF, HSA, and hLF-HSA fusion protein were 10 ⁇ M and HSA-hLF was 5 ⁇ M.
  • the medium of the cells adhered to the plate was discarded, each prepared protein solution was added at 100 ⁇ l / well, and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 for 72 hours.
  • Cell Counting Kit-8 manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.
  • color was developed at 37 ° C. and 5% CO 2 for 2 hours.
  • the antitumor action of hLF is enhanced by HSA fusion, and that the antitumor action is not shown in normal cells. Therefore, it can be seen that the fusion protein of the present invention exhibits antitumor activity, but does not cause side effects, or even has low side effects.
  • the present invention provides a human lactoferrin (hLF) -human serum albumin (HSA) fusion protein with greatly improved molecular stability.
  • the present invention further provides a human lactoferrin (hLF) -human serum albumin (HSA) fusion protein that exhibits anti-tumor activity specifically against tumor cells rather than normal cells.

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Abstract

本発明は、臨床的有用性の高いラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法等を提供する。さらに、本発明は、天然ラクトフェリンの生物活性を保持し体内寿命が有意に延長されており、天然ラクトフェリン及び遺伝子組換え型ラクトフェリンよりも臨床的有用性に優れるラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法等を提供する。本発明の融合タンパク質はその改変体は、ラクトフェリンが有する鉄の結合能が保持されており、したがって、少なくとも鉄結合能に基づくラクトフェリンの重要な生物活性が保持されている。また、生体学的利用能、プロテアーゼに対する抵抗性を有しているため、体内で長時間にわたって生物活性を発揮することができる。さらに、本発明の融合タンパク質は、胃でのペプシンによる消化分解を受けにくくなるという特徴を有する。

Description

ラクトフェリン／アルブミン融合タンパク質及びその製造方法
　本願発明は、ラクトフェリン/アルブミン融合タンパク質及びその製造方法に関するものである。
　ラクトフェリンは、主に哺乳動物の乳汁中に存在し、好中球、涙、唾液、鼻汁、胆汁、***などにも見出されている、分子量約80,000の糖タンパク質である。ラクトフェリンは、鉄を結合することから、トランスフェリンファミリーに属する。ラクトフェリンの生理活性としては、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用冗進作用、抗ウイルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用などが知られている。さらに、ラクトフェリンが脂質代謝改善作用、鎮痛・抗ストレス作用、アンチエイジング作用を有することも明らかにされている（非特許文献1、非特許文献2）。
　このように、ラクトフェリンは、多様な機能を示す生理活性タンパク質であり、健康の回復または増進のため、医薬品や食品などの用途に使用されることが期待されており、ラクトフェリンを含む食品は既に市販されている。ラクトフェリンを経口的に投与した場合、注射剤よりも投与対照に対する負担が少なく、また、ラクトフェリン受容体が小腸粘膜に存在することが知られており、最近、小量のラクトフェリンが腸管から体内に取り込まれて、生物活性を発現していることが明らかにされている（非特許文献3）。しかし、ラクトフェリンは、経口的に摂取した場合、胃液中に存在する酸性プロテアーゼのペプシンにより加水分解を受け、ペプチドに分解されるため、経口摂取されたラクトフェリン分子は大部分が腸管まで到達することができない（非特許文献4）。そのため、ラクトフェリンの持つ生物活性を増進する為には、ラクトフェリンが、胃液中でのペプシンによる加水分解を受けない状態で腸管まで到達することが重要である。このような方法には、腸溶化のための製剤的な処理、例えば、低pHで溶けず、中性付近で溶解する成分を含有する腸溶層によるコーティング等が知られるが（特許文献1）、これらの製剤処理には煩雑な工程が必要であるという欠点がある。
　また、ラクトフェリン自体を注射剤とした場合には、ラクトフェリンが血中で分解し、さらに速やかに肝臓に集積するため、血中安定性の低さが報告されている。そのため、血中安定性を上げたIgGのFc領域を結合させた融合タンパク質が医薬品として利用されており、ラクトフェリンにおいても同様な技術が開発されている（特許文献2）。
　また、血中安定性を上げる方法としてIgGのFc領域を融合させる以外に、血清アルブミン融合タンパク質が開発され（非特許文献5、非特許文献6）、上市もされている。血清アルブミンは分子量約66,000のタンパク質で、血清タンパク質の約6割を占め、血清中のタンパク質で最も含有量の高いタンパク質である。血管中の血清アルブミンの機能は、保水による血管浸透圧の制御であるが、脂肪酸やホルモン、薬物などを結合し、必要な組織に輸送する働きも持つ。また、成人は、一日当たり9グラム前後作られ、約4割が血管に、残り6割が血管外に分布している。
　さらに、血清アルブミンは腫瘍に対して集積性があるため、パクリタキセルのような高分子化合物を結合させた抗がん活性を高めた医薬品も上市されている。このように血清アルブミン融合タンパク質は、血中安定性だけではなく、腫瘍組織への選択的輸送が可能となる。
特開2015-027981 特許第5855239
Pharmaceuticals (Basel). 2016 Sep 27;9(4). pii: E61.Lactoferrin from Milk Nutraceutical and Pharmacological Properties. Giansanti F, Panella G, Leboffe L, Antonini G. Suzuki YA, Shin K, Lonnerdal B. Biochemistry. 2001 Dec　25;40(51):15771-9. Ono T, Morishita S, Fujisaki C, Ohdera M, Murakoshi M, Iida N, Kato H, Miyashita K, Iigo M, Yoshida T, Sugiyama K, Nishino H.Br J Nutr. 2011 Jan;105(2):200-11. Malin Bern , Kine Marita Knudsen Sand , Jeannette Nilsen, Inger Sandlie, Jan Terje Andersen, Journal of Controlled Release 211 (2015) 144-162） Sleep D, Cameron J, Evans LR. Biochim Biophys Acta. 2013 Dec;1830(12):5526-34.
　本発明は、臨床的有用性の高いラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法等を提供することを目的とする。さらに、本発明は、天然ラクトフェリンの生物活性を保持し体内寿命が有意に延長されており、天然ラクトフェリン及び遺伝子組換え型ラクトフェリンよりも臨床的有用性に優れるラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法等を提供することを目的とする。
　即ち、本発明は、以下の融合タンパク質および方法を提供する。
（1）　（i）ヒト血清アルブミン（HSA）又はヒト血清アルブミンの断片もしくはペプチドと、
　（ii）ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとの融合タンパク質であって、
　（LF-s-Y）n　又は　（Y-s-LF）n
　〔式中、LFはラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチド、Yはヒト血清アルブミンもしくはヒト血清アルブミンの断片を含むタンパク質又はペプチド、sは0～10個の任意のアミノ酸の配列、nは1～10の整数を表す〕
で表される融合タンパク質、又はその改変体。
（2）（LF-s-Y）n
で表される前記（1）に記載の融合タンパク質、又はその改変体。
（3）（Y-s-LF）n
で表される上記（1）に記載の融合タンパク質、又はその改変体。
（4）　SEQ ID NO: 7に示すアミノ酸配列を含む、上記（1）に記載の融合タンパク質、又はその改変体。
（5）　SEQ ID NO: 14に示すアミノ酸配列を含む、上記（1）に記載の融合タンパク質、又はその改変体。
（6）　前記融合タンパク質又はその改変体が、天然又は遺伝子組換え型ラクトフェリンの50％以上の鉄キレート能を保持している、前記（1）～（5）のいずれかに記載の融合タンパク質、又はその改変体。
（7）　前記融合タンパク質又はその改変体は、ラクトフェリン受容体及びアルブミン受容体からなる群より選択される少なくとも1つの受容体を介して取り込まれるものである、前記（1）～（6）のいずれかに記載の融合タンパク質、又はその改変体。
（8）　前記融合タンパク質又はその改変体が、天然又は遺伝子組換え型ラクトフェリンと比べてペプシン耐性が向上したものである、前記（1）～（7）のいずれかに記載の融合タンパク質、又はその改変体。
（9）　前記（1）～（8）のいずれかに記載の融合タンパク質又はその改変体をコードする核酸分子。
（10）　前記（9）に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（11）　前記（10）に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（12）　前記（9）に記載の核酸分子を含む非ヒト遺伝子組換え動物。
（13）　前記（1）～（8）のいずれかに記載の融合タンパク質又はその改変体によって改善される疾患の治療剤。
（14）　前記（1）～（8）のいずれかに記載の融合タンパク質又はその改変体及び担体を含む、医薬品組成物。
（15）
　腫瘍の治療のための、前記（15）に記載の医薬組成物。
（16）
　前記腫瘍が肺癌である、前記（16）に記載の医薬組成物。
（17）　前記（1）～（8）のいずれかに記載の融合タンパク質又はその改変体の製造方法であって、この融合タンパク質又はその改変体をコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養して融合タンパク質を発現させ、この宿主細胞又はその培地から融合タンパク質又はその改変体を回収することを含む方法。
（18）治療有効量の（１）に記載の融合タンパク質又はその改変体を患者に投与することを含む、腫瘍の治療方法。
（19）前記腫瘍が肺癌である、（18）に記載の方法。
（20）腫瘍の治療に用いるための（１）に記載の融合タンパク質又はその改変体。
（21）前記腫瘍が肺癌である、（20）に記載の融合タンパク質又はその改変体。
（22）腫瘍の治療のための医薬組成物の製造における、（１）に記載の融合タンパク質又はその改変体の使用。
（23）前記腫瘍が肺癌である、（22）に記載の使用。
　本発明の融合タンパク質又はその改変体（以下、「融合タンパク質等」と表記することがある）は、ラクトフェリンが有する鉄の結合能が保持されており、少なくとも鉄結合能に基づくラクトフェリンの重要な生物活性が保持されている。また、生体学的利用能（bioavailability）、プロテアーゼに対する抵抗性を有しているため、体内で長時間にわたって生物活性を発揮することができる。さらに、本発明の融合タンパク質は、胃でのペプシンによる消化分解を受けにくくなるという特徴を有する。そのため、さらなる腸溶化のための製剤的な処理、例えば、低pHで溶けず、中性付近で溶解する成分を含有する腸溶層によるコーティング等を行わなくても、充分に腸内に到達しうる。
　ラクトフェリンは、安全性が非常に高く、多様な生物活性を有する。そのため、本発明により、有効な治療薬がない疾患又は症状の治療薬又は予防薬として、さらに有利に適用が可能となる。例えば、本発明の融合タンパク質は、生活習慣病（動脈硬化、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧、糖尿病、脂肪肝など）、がん（発がん予防、がんの二次予防、転移抑制、制癌剤の作用増強など）、自己免疫疾患（シェーグレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎、悪性関節リウマチ、膠原病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、全身性紅斑性狼蒼など）、精神神経疾患（痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、テンカン、うつ病、ヒキコモリ、統合失調症、各種ストレス性疾患、更年期障害など）、肝炎（各種ウイルス性肝炎、非アルコール性肝炎、肝硬変など）、炎症性腸疾患（潰蕩性大腸炎、クローン病など）、過敏性腸症候群、前立腺肥大、頻尿、不眠症、便秘などへ適応を拡大できる。さらに、ラクトフェリンは、抗菌・抗ウイルス作用及び免疫能賦活作用があるので、本発明の融合タンパク質又はそれを含む医薬品組成物は、各種感染症及びそれに基づく炎症、例えば、ヘリコパクター・ピロリ菌の胃粘膜感染、歯周病、歯槽膿漏、口臭、口腔カンジダ症、口内炎、口角炎、鼻炎、食道炎、胆嚢炎、***症、臆感染症、水虫、ニキビ、ヘルペス属ウイルスの感染症、老人性肺炎、術後感染症などへの適用も可能であり、また、抗生物質の作用を増強する作用がある。一方、ラクトフェリンは免疫的な寛容をもたらす作用もあり、本発明の融合タンパク質又はそれを含む医薬品組成物は、花粉症、アトピー性皮膚炎、脂漏症、蕁麻疹等のアレルギー性疾患にも適用可能である。注目すべきことは、ラクトフェリンには鉄キレート作用に基づく強い抗酸化ストレス作用があり、本発明の融合タンパク質又はそれを含む医薬品組成物は、ウィルソン病、劇症肝炎などや、肌や眼の抗加齢・若返り作用、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、粘膜上皮細胞の角化抑制・若返り作用などへの適用も可能である。
シグナル配列を含むヒトラクトフェリン（hLF）cDNAと、PCR法で作製したヒト血清アルブミン（HSA）cDNAを融合させたhLF-HSA融合タンパク質発現ベクター（pOptiVEC／hLF-HSA）の作製概略図である。 シグナル配列を含むヒト血清アルブミン（HSA）cDNAと、PCR法で作製したヒトラクトフェリン　（hLF）cDNAを融合させたHSA-hLF融合タンパク質発現ベクター（pOptiVEC／HSA-hLF）の作製概略図である。 ヘパリンセファロース6FFによるhLF-HSA融合タンパク質の精製を示す図である。 ヘパリンセファロース6FFによるHSA-hLF融合タンパク質の精製を示す図である。 Aspergillus由来の組換え型hLF（rhLF）、ヒト血清アルブミン（HSA）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質のCDスペクトルを示す。 Aspergillus由来の組換え型hLF（rhLF）、ヒト血清アルブミン（HSA）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質の熱安定性をCDスペクトルで解析した図である。 Aspergillus由来の組換え型hLF（rhLF）、ヒト血清アルブミン（HSA）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質のペプシン耐性を、SDS-PAGEで解析した図である。 Aspergillus由来の組換え型hLF（rhLF）、ヒト血清アルブミン（HSA）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質のペプシン耐性をSDS-PAGEで解析したのち［図7］、バンド濃度をデンシトメーターで解析後、グラフ化したものである。 蛍光標識したAspergillus由来の組換え型hLF（rhLF）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質のヒト小腸上皮様細胞Caco-2への細胞内取り込みを、共焦点レーザースキャン顕微鏡で解析した図である。 Aspergillus由来の組換え型hLF（rhLF）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質のヒト小腸上皮様細胞Caco-2への細胞内取り込みを、hLFに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法で解析した図である。 Aspergillus由来の組換え型hLF（rhLF）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質をヒト小腸上皮様細胞Caco-2へ取り込ませ、その後の細胞外放出をhLFに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法で解析した図である。 hLF-HSA、HSA-hLF両融合タンパク質のラットにおける血中安定性を示す図である（rhLFはShiga, Yら Eur J Pharm Sci. Vol.67, 136-143, 2015より引用）。 hLF-HSA、HSA-hLF両融合タンパク質のラットにおける半減期、AUC値を示す図である。グラフ中の数値は、hLFの値を基準として、hLF-HSA、HSA-hLF両融合タンパク質の相対値を示している。 hLF-HSA、HSA-hLFの低分化型ヒト肺腺ガン細胞に対する抗腫瘍活性を示す図である。 融合タンパク質の共有結合による抗腫瘍効果への影響を示す図である。 hLF-HSA、HSA-hLFの分化型ヒト肺腺ガン細胞に対する抗腫瘍活性を示す図である。 hLF-HSA、HSA-hLFのヒト肺正常細胞に対する活性を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2016年10月28日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2016-212077号）及び2017年3月9日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2017-044893号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。なお、特に断りがない限り、本願明細書において、アミノ酸配列は、N末端からC末端の方向で表記し、ヌクレオチド配列は5’末端から3’末端方向に表記する。
　また、本願において、「約」とは、当該用語に続く数値の±10％、±5％、±3％、±2％、±1％の範囲を意味するものとする。
　本発明のラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとの融合タンパク質は以下の一般式で表される。
 
（LF-s-Y）n　又は　（Y-s-LF）n　　　式I
 
　式I中において、LFはラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチド、Yはヒト血清アルブミンもしくはヒト血清アルブミンの断片を含むタンパク質又はペプチドを表し、sは0～10個の任意のアミノ酸の配列表し、ここでnは1～10の整数を表す。また（LF-s-Y）はhLFをN末端側にHSAをC末端側に位置するように融合させたタンパク質を表し、（Y-s-LF）はHSAをN末端側にhLFをC末端側に位置するように融合させたタンパク質を表す。
　（LF-s-Y）n　型の融合タンパク質は、SEQ ID NO: 7に示すアミノ酸配列か、或いはSEQ ID NO: 7のアミノ酸配列と90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、または99.9％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなるタンパク質が挙げられる。ある実施形態では、（LF-s-Y）n　型の融合タンパク質は、SEQ ID NO: 7に示すアミノ酸配列からなるタンパク質である。
　（Y-s-LF）n　型の融合タンパク質は、SEQ ID NO: 14に示すアミノ酸配列か、或いはSEQ ID NO: 14のアミノ酸配列と90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、または99.9％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなるタンパク質が挙げられる。ある実施形態では、（Y-s-LF）n　型の融合タンパク質は、SEQ ID NO: 14に示すアミノ酸配列からなるタンパク質である。
　本発明の融合タンパク質は、ヒト血清アルブミン（HSA）もしくはヒト血清アルブミンの断片と、ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとを含む、生物学的に活性な融合タンパク質である。
　ヒト血清アルブミン（HSA）
　本発明の融合タンパク質において、アルブミンは、アルブミン全長、あるいはアルブミンの部分ペプチドを使用し、生体に対して適合可能又は薬理学的に不活性であればよい。アルブミンは、ヒト及び種々の動物（ウシ、ウマ、ブ夕、ヒツジ、ヤギ、ラクダ等）由来のものや、鶏卵由来由来のものを用いることができるが、好ましくはヒト血清アルブミン（HSA）が好ましい。ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列（GenBank: AAA98797.1、SEQ ID NO: 2）及びCDS配列（GenBank: M12523.1、SEQ ID NO: 1）は公知である。
　本発明において使用される場合、ヒト血清アルブミンは天然の配列（SEQ ID NO: 2）と同一であってもよく、また、変異を有していてもよい。また、変異を有するヒト血清アルブミンとしては、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列と90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、または99.9％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。ヒト血清アルブミンの断片もしくはペプチドとしては、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列の10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、または90％以上を占める配列からなるものを用いることができる。
　ラクトフェリン
　本発明で用いるラクトフェリンは、ヒト及び種々の動物（ウシ、ウマ、ブ夕、ヒツジ、ヤギ、ラクダ等）から得られる天然のラクトフェリンと同一のアミノ酸配列を有していてもよいし、目的とするラクトフェリンの生理活性を有する限りにおいて、一部のアミノ酸が欠失、付加、置換した変異を有していてもよい。ヒトのラクトフェリンの（GenBank: AAN75578.2、SEQ ID NO: 4）及びCDS配列（GenBank: AY178998.2、SEQ ID NO: 3）は公知である。ラクトフェリンの機能的（生物活性を有する）断片、ペプチドは、種々のものが公知であり（例えば、「プログラム・抄録集第2回臨床ラクトフェリンシンポジウム2009」、21～ 27頁（島崎敬一））などの文献の記載をもとに、必要に応じて設計することができる。変異を有するラクトフェリンを用いる場合、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列と90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、または99.9％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
　本発明の融合タンパク質等に関して、ラクトフェリンの生理活性とは、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用充進作用、抗ウイルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用、脂質代謝改善作用、鎮痛作用、抗ストレス作用などを含む広範な生理活性を意味する。これらの作用によって、生活習慣病（例えば、高コレステロール血症、高脂血症など）、疼痛管理（がん性疼痛、神経因性疼痛など）、膠原病（シェーグレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎など）、歯周病、C型肝炎などを含む、多くの疾患又は症状の治療（改善を含む）及び予防が可能である。ラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとしては、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列の10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、または90％以上を占める配列からなるものを用いることができる。ラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとしては、より好ましくはSEQ ID NO: 4のアミノ酸配列の10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、または90％以上を占める連続するアミノ酸配列からなるものを用いることができる。
　特に、本発明の融合タンパク質は、天然ラクトフェリン（又は天然と同等の配列を有する組換え型ラクトフェリン）と同等の鉄キレート（結合）能を有している。具体的には、後述する実施例の方法で測定して天然ラクトフェリン（又は天然と同等の配列を有する組換え型ラクトフェリン）の鉄結合能を100％とした場合に、本発明の融合タンパク質等は、少なくとも50％以上（例えば約50％～約150％又は約50％～約120％）の鉄結合能を保持しており、好ましい態様においては、本発明の融合タンパク質等は、天然ラクトフェリン（又は天然と同等の配列を有する組換え型ラクトフェリン）の約70％～約100％又はそれ以上（例えば約70％～約150％又は約70％～約120％）、さらには約90％以上に相当する鉄結合能を有する。なお、鉄結合能は、実施例に記載した方法又はそれと同等の方法によって測定する場合、土2％、土5％、土10％、または、土20％程度の誤差がありうる。
　本発明において使用されるヒト血清アルブミンは、ヒトラクトフェリンと融合させた状態から分解しにくいものが良い。また、ヒトラクトフェリンをN末端側にヒト血清アルブミンをC末端側に位置するように融合させたタンパク質であるhLF-HSAの方であっても、ヒト血清アルブミンをN末端側にヒトラクトフェリンをC末端側に位置するように融合させたタンパク質であるHSA-hLFでもよい。少なくとも、hLF-HSAは熱安定性やペプシン消化耐性に優れる特性を有する。
　スペーサー配列
　本発明の融合タンパク質は、さらに、付加的なアミノ酸配列を含んでいてもよい。ヒト血清アルブミンと、ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとの聞に、スペーサー配列として適切な長さの任意のアミノ酸配列を有することができる。スペーサー配列（ s ）は、例えば0～10個、又は0～5個の任意のアミノ酸の配列であることができる。その他の付加的な配列は、スペーサー配列のような立体構造上の利点を提供するものであってもよく、また、例えばシグナルペプチドや精製に利用されるタグ配列のように、何らかの機能を融合タンパク質に与えるものであってもよい。
　本発明の融合タンパク質は、小腸において、ラクトフェリン受容体、及びアルブミン受容体からなる群より選択される少なくとも1つの公知の受容体を介して取り込まれると考えられる（Malin Bern , Kine Marita Knudsen Sand , Jeannette Nilsen, Inger Sandlie, Jan Terje Andersen, Journal of Controlled Release 211 (2015) 144-162）。
　本発明の融合タンパク質等は、遺伝子組換えにより製造することができる。所望のアミノ酸配列を有するラクトフェリン遺伝子とヒト血清ラクトフェリンの遺伝子とを、常法により連結し、所望の宿主細胞において発現させるのに必要なその他の要素を含む発現ベクターを構築し、このベクターを宿主細胞に導入して融合タンパク質を発現させ、発現された融合タンパク質を細胞又は培地から回収することができる（文献：Shiga, Yら Eur J Pharm Sci. Vol.67, 136-143, 2015）。
　本発明の融合タンパク質等をコードする核酸分子は、公知の配列及び標準的な遺伝子操作技術によって設計し、作製することができる（文献：Ikuta, SらJ Control Release vol.147, 17-23, 2010）。ラクトフェリン及びヒト血清アルブミンをコードする遺伝子は、公知の核酸又はアミノ酸配列に基づくプローブを用いて、一般に利用可能な種々のゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーからクローニングしたり、ボリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によって合成することにより、得ることができる。これらの遺伝子に所望の改変を加えたり変異を導入してもよい。
　核酸分子を複製するために使用する宿主細胞及びベクター系、及び融合タンパク質を発現させるために使用する宿主及びベクター系は、公知の多数の真核細胞（哺乳乳動物細胞、植物細胞、酵母、昆虫細胞など）及び原核細胞（細菌など）の系から適宜選択して使用することができる。本発明の融合タンパク質を発現させるためのベクターは、ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドをコードする配列及びヒト血清アルブミンをコードする配列（又は、ヒト血清アルブミンをコードする配列及びラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドをコードする配列）に加えて、一般に、作動可能に連結された状態で、転写プロモーター、分泌シグナルペプチド配列、転写ターミネータ一、ポリAシグナルなどの要素を含み、さらに通常、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを含む。
これらのベクターを用いて、公知の種々の技術にしたがって宿主細胞を形質転換することができる。
　本発明の融合タンパク質は、遺伝子組換え植物及び遺伝子組換え動物を製造することによって、これらの動物及び植物に産生させることができる。例えば、ヒツジ、ヤギなどの非ヒト動物のゲノムに本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を組み込むことにより、本発明の融合タンパク質を乳汁中に分泌させるようにすることができる。また、植物に組み込むことによって本発明の融合タンパク質等を産生する有用植物を製造することもできる（例えば特表2004-528022号公報）。
　本発明の融合タンパク質は、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞の培地などから、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフィー技術を適宜用いて単離精製することができる。特に好ましい精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。
　本発明の融合タンパク質は、ラクトフェリンの生物活性を充分に保持しているので、単独で、又は他の薬剤と組合せて、ラクトフェリンが有効である疾患の予防又は治療剤として、投与することができる。また、本発明の融合タンパク質は、製剤学の分野で公知の各種の担体、治療上不活性な基剤及び／又は添加物を配合することによって、所望の剤型の医薬品組成物とすることができる。便宜上、本発明に関して医薬品又は医薬品組成物というときは、投与対象が人の場合のほか、動物である場合（即ち、獣医薬等）も含む。このような医薬品組成物に含有させることができる各種成分及び剤型は当業者には充分に公知である。
　ペプシン耐性
　本発明の融合タンパク質は、ペプシン耐性の向上したものである。ペプシンは、胃液の主要なタンパク質分解酵素であるので、ペプシン耐性を向上させることにより、胃において消化されにくい融合タンパク質を提供することができる。ペプシン耐性は、公知の手法により測定することができる。例えば、適宜濃度を調整したタンパク質溶液にペプシン溶液を添加して、消化させた後、SDS-PAGE法などのゲル電気泳動法などにより、消化されたタンパク質を検出または、計量することにより、ペプシン耐性を測定することができる（Yasuhiro Nojima, Yosuke Suzuki, Kazuhiro Yoshida, Fumiko Abe, Tuneo Shiga, Takashi Takeuchi, Akihiko Sugiyama, Hirohiko Shimizu, and Atsushi Sato, Pharmaceutical Research, Vol. 26, No. 9, September 2009 2125-2132）。例えば、上記ペプシン処理をした後に、ゲル電気泳動法により、顕著な分解産物が観察されなかった場合を、ペプシン耐性があるとすることができる。また、融合タンパク質が、天然又は遺伝子組み換え型ラクトフェリンと比べ、ペプシン処理による、タンパク質分解産物が減少した場合を、ペプシン耐性が向上したとすることができる。
　抗腫瘍活性
　本発明の融合タンパク質は、抗腫瘍活性を有する。ここで抗腫瘍活性とは、腫瘍細胞の増殖を阻害する活性を言う。抗腫瘍活性は、本明細書において抗腫瘍効果と称する場合もある。
　本発明の融合タンパク質の抗腫瘍活性は、本発明の融合タンパク質の存在下（サンプル群）及び非存在下（対照群）で同数の腫瘍細胞の培養を開始し、一定期間後（例えば24時間後、48時間後、72時間後）にサンプル群の腫瘍細胞数が対照群の腫瘍細胞数よりも少なくなっていることにより確認することができる。
　ここで腫瘍とは、良性腫瘍又は悪性腫瘍のいずれでもよい。このような腫瘍の例としては、（1）骨肉腫や軟部組織肉腫等の肉腫、（2）乳癌腫、肺癌腫、膀胱癌腫、甲状腺癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、結腸直腸癌腫、膵臓癌腫、胃癌腫、肝臓癌腫、子宮癌腫、子宮頸癌腫、卵巣癌腫等の癌腫、（3）ホジキンや非ホジキンリンパ腫等のリンパ腫、（4）神経芽細胞腫、（5）メラノーマ、（6）ミエローマ、（7）ウィルムス腫瘍、（8）急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性リンパ性白血病（ALL）及び慢性リンパ性白血病（CLL）等の白血病、（9）グリオーマ、（10）網膜芽細胞腫等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある実施態様では、腫瘍は肺癌種であり、さらには肺腺癌である。また、腫瘍細胞は分化型、低分化型、未分化型のいずれであってもよいが、ある実施形態では分化型及び低分化型に対して特に強い抗腫瘍効果を示す。
　興味深いことに、本発明の融合タンパク質は、HSA又はrhLFを単独投与した場合よりも顕著な抗腫瘍活性を有する。また、HSAとrhLFを共有結合させずに併用した場合と比べ、HSAとrhLFが共有結合した本発明の融合タンパク質はより高い抗腫瘍活性を示す。さらに、本発明の融合タンパク質は、腫瘍細胞に選択的に細胞増殖作用を示し、正常細胞には細胞増殖作用を示さない。このため、本発明の融合タンパク質は、副作用を生じない、あるいは生じたとしても低い副作用で抗腫瘍活性を生じることが分かる。
　本発明は、さらに、治療有効量の本発明の融合タンパク質又はその改変体を患者に投与することを含む、腫瘍の治療方法を提供する。また、本発明は、腫瘍の治療に用いるための本発明の融合タンパク質又はその改変体を提供する。また、本発明は、腫瘍の治療のための医薬組成物の製造における、本発明の融合タンパク質又はその改変体の使用を提供する。ここで、「治療有効量」、「患者」及び「投与」
　医薬組成物
　本発明は、本発明の融合タンパク質を含む、ラクトフェリン関連疾患を治療するための医薬組成物を提供する。
　ここでラクトフェリン関連疾患には、生活習慣病（動脈硬化、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧、糖尿病、脂肪肝など）、がん（発がん予防、がんの二次予防、転移抑制、制癌剤の作用増強など）、自己免疫疾患（シェーグレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎、悪性関節リウマチ、膠原病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、全身性紅斑性狼蒼など）、精神神経疾患（痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、テンカン、うつ病、ヒキコモリ、統合失調症、各種ストレス性疾患、更年期障害など）、疼痛緩和（モルヒネ等のオピオイド増強作用、がん性疼痛、神経因性疼痛、ヘルペス後疼痛、線維筋痛症、術後疼痛、舌痛症、生理痛、歯痛、関節痛、更年期障害など）、肝炎（各種ウイルス性肝炎、非アルコール性肝炎、肝硬変など）、炎症性腸疾患（大腸性潰瘍炎、クローン病など）、過敏性腸症候群、前立腺肥大、頻尿、不眠症、便秘等が挙げられ、さらに、ラクトフェリンのウイルス作用及び免疫能賦活作用に基づいて治療され得る、ヘリコバクター・ピロリ菌の胃粘膜感染、歯周病、歯槽膿漏、口臭、口腔カンジダ症、口内炎、口角炎、鼻炎、食道炎、胆嚢炎、***症、膣感染症、水虫、ニキビ、ヘルペス属ウイルスの感染症、老人性肺炎、術後感染症、さらにはラクトフェリンの免疫寛容作用に基づいて治療可能な花粉症、アトピー性皮膚炎、脂漏症、蕁麻疹等のアレルギー性疾患が挙げられる。ラクトフェリン関連疾患のさらなる例としては、ラクトフェリンの抗酸化ストレス作用に基づいて治療可能な、ウィルソン病、劇症肝炎などや、肌や眼の抗加齢・若返り作用、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症が含まれる。
　また、本発明は、本発明の融合タンパク質を含む、腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。腫瘍については上で述べたとおりである。
　患者は、哺乳動物であれば特に限定されないが、好ましくはヒトである。ここで、患者には胎児が含まれる。
　「投与」は、本発明の融合タンパク質が患者の体内に送達されることを意味する。投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよく、非経口投与であれば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉注射、経皮投与、点鼻投与、舌下投与、局所投与のいずれであってもよい。
　本発明の組成物は、有効成分である本発明の融合タンパク質を治療上有効量で含み得る。ここで、「治療上有効量」とは、その量の有効成分を対象に投与することにより、治療対象となる疾患の症状が、当該有効成分を投与しない場合と比較して、軽減する場合及び悪化しない量を指し、予防において有効な量という意味をも包含する。
　例えば、経口投与の場合、治療上有効量は、ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドの量として0.001～10 g/kg/日、0.005～10 g/kg/日、0.01～10 g/kg/日、0.01～5 g/kg/日とすることができる。ヒトに投与する場合、一般的には、治療上有効量として、一日あたりラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドの量として10 mg～15,000 mg、10 mg～12,000 mg、10 mg～10,000 mg、20 mg～10,000 mg、20 mg～8,000 mg、30 mg～8,000 mg、30 mg～6,000 mgの量である。また、経皮投与の場合、治療上有効量は、ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドの量として0.001～10 g/kg/日、0.005～10 g/kg/日、0.01～10 g/kg/日、0.01～5 g/kg/日とすることができる。ヒトに投与する場合、一般的には、治療上有効量として、一日あたりラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドの量として10 mg～15,000 mg、10 mg～12,000 mg、10 mg～10,000 mg、20 mg～10,000 mg、20 mg～8,000 mg、30 mg～8,000 mg、30 mg～6,000 mgの量である。このような一日あたりの用量を一度にまたは分割して、治療を必要とする患者に投与することができる。
　なお、本発明の組成物の投与量及び投与頻度は、対象の種、体重、性別、年齢、疾患の進行度、投与経路といった種々の要因に依存して変化するが、医師、獣医師、歯科医師又は薬剤師等の当業者であれば、それぞれの要因を考慮して投与量を決定することができる。
　上記の治療上有効量、投与量及び投与頻度は、典型的な数値を列挙したものであり、これを超える数値又は下回る数値であっても治療効果を奏する場合も十分に考えられる。従って、上記の治療上有効量、投与量及び投与頻度を超える数値又は下回る数値であっても、本発明の組成物の治療上有効量、投与量及び投与頻度として包含される。
　本発明の融合タンパク質等を含む治療剤又は医薬品組成物の有効投与量は、治療又は予防すべき疾患又は症状の種類や程度、投与対象の状態、剤型、投与経路などによって異なり、公知の有効ラクトフェリン量やアルブミン量を目安に適宜選択することができる。
実施例1：ヒトラクトフェリン（hLF）とヒト血清アルブミン（HSA）との融合タンパク質の作製
　ヒトラクトフェリン（hLF）とヒト血清アルブミン（HSA）との融合タンパク質については、hLFをN末端側にHSAをC末端側に位置するように融合させたタンパク質をhLF-HSA、逆にHSAをN末端側にhLFをC末端側に位置するように融合させたタンパク質をHSA-hLF、と命名した。また、本明細書中で、rhLFとは、Aspergillus由来の組換え型hLFを意味する。
1. hLF-HSA発現ベクターの構築
　シグナル配列を含むhLF cDNA断片は、公知のDHFR欠損チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（CHO［DG44］）用発現ベクターpOptiVEC／hLF-dFc(Shiga, Yら Eur J Pharm Sci. Vol.67, 136-143, 2015)をXho IとBamH Iで消化することで調製した。
　一方、ヒトHSA cDNAは、ベクターpPIC9-HSA-trx (Ikuta, SらJ Control Release vol.147, 17-23, 2010)を鋳型として、フォーワード側プライマーとして、BamHI-c-HSA(73-92)（5’-CGCGGATCCCGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’： SEQ ID NO: 5） [上流に下線部BamH Iサイトを導入]）、リバース側プライマーとして、NotI-HSA(1830-1811（5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3’： SEQ ID NO: 6）［3’末端側に下線部Not Iサイトを導入]を用い、DNA合成酵素は「PrimeStar（登録商標） HS（premix）」（商品名、タカラバイオ社製）を使用して、HSA cDNAをPCR法で取得した。得られたDNA断片は、BamH IとNot Iで消化することにより、ヒトHSAのDNA断片を切り出した。
　以前に報告しているDHFR欠損チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（CHO［DG44］）用発現ベクターpOptiVEC-MCS(Shiga, Yら Eur J Pharm Sci. Vol.67, 136-143, 2015)をXho IとNot Iで消化し、上記Xho I／BamH I消化ヒトhLF cDNA断片と、BamH I／Not I消化ヒトHSA cDNA断片をT4 DNA ligase（ニッポンジーン社製）を用いて3点ライゲーションすることで、CHO（DG44）安定発現株用ベクターpOptiVEC／hLF-HSAを作製した（図1）。得られたhLF-HSA融合領域の塩基配列は、ジデオキシ法シークエンシングで確認した。融合タンパク質HSA-hLF発現ベクターであるp　OptiVEC／hLF-HSAがコードするヒト血清アルブミン（HSA）／ヒトラクトフェリン（hLF）融合タンパク質のアミノ酸配列を、hLF-HSA配列（SEQ ID NO: 7）として示す。このhLF-HSA配列において、それぞれ、アミノ酸番号1～711（SEQ ID NO: 8）はシグナル配列を含むヒトラクトフェリン（hLF）、アミノ酸番号712～713（配列 Asp-Pro）はスペーサー、アミノ酸番号714～1298（SEQ ID NO: 9）はヒト血清アルブミン（HSA）のアミノ酸配列である。
2.HSA-hLF発現ベクターの構築
　シグナル配列を含むHSA cDNAは、ヒト肝癌由来細胞株であるHepG2からTotal RNAを抽出し、そのTotal RNAを鋳型としたRT-PCR法で取得した。HepG2は10％ ウシ胎児血清（FBS）を含むD-MEM（low glucose）培地（和光純薬社製）で培養した。1x106cells分のHepG2細胞から、RNA 抽出用試薬ISOGEN（商品名、ニッポンジーン社製）を用いて、Total RNAを抽出した。その方法は試薬に添付されているプロトコールに従った。得られた2μg分のTotal RNAを鋳型として、オリゴdTプライマー （oligo （dT）15、プロメガ社製）、逆転写酵素 （ReverTra Ace、商品名、東洋紡社製）を用いてTotal cDNAを合成した。その方法は試薬に添付されているプロトコールに従った。HSA cDNA断片は、得られたTotal cDNAを鋳型としたPCR法により取得した。フォーワード側プライマーとして、N-EcoRI-HSA（5’-CGGAATTCATGAAGTGGGTAACCTTTAT-3’： SEQ ID NO: 10；[開始コドンであるATGの上流に下線部EcoR Iサイトを導入］）、リバース側プライマーとして、HSA-XhoI-C（5’-CCGCTCGAGTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’： SEQ ID NO: 11）[3’末端側に下線部Xho Iサイトを導入］を用い、DNA合成酵素は「PrimeStar（登録商標） HS（premix）」（商品名、タカラバイオ社製）を使用して、HSA cDNAを増幅した。得られたDNA断片に、rTaq DNA polymerase （商品名、東洋紡社製）でAを付加し、「pGEM-T（登録商標） Easyベクター」（商品名、プロメガ社製）にTAクローニングした。HSA cDNAの塩基配列は、ジデオキシ法シークエンシングで確認した。その後、このベクターをEcoR IとXho Iで消化することにより、シグナル配列を含むヒトHSAのDNA断片を切り出した。
　一方、hLF cDNA断片は、公知のhLF cDNA全長配列含むベクター「pBSIILfAL」 (Shiga, Yら Eur J Pharm Sci. Vol.67, 136-143, 2015) を鋳型として、フォーワード側プライマーとして、S_LFex_XhoI_ATG（5’-CTCGAGATGGGCCGTAGGA-3’ ：SEQ ID NO: 12）［上流に下線部Xho Iサイトを導入］）、リバース側プライマーとして、hLF reverse (Not-hLF-2136R)（5’-GCGGCCGCTTACTTCCTGAGGAACTCAC-3’ ：SEQ ID NO: 13）[3’末端側に下線部Not Iサイトを導入］を用い、DNA合成酵素は「PrimeStar HS（premix）」（商品名、タカラバイオ社製）を使用して、hLF cDNAを増幅した。得られたDNA断片に、rTaq DNA polymerase （商品名、東洋紡社製）でAを付加し、「pGEM（登録商標）-T Easyベクター」（商品名、プロメガ社製）にTAクローニングした。hLF cDNAの塩基配列は、ジデオキシ法シークエンシングで確認した。その後、このベクターをXho IとNot Iで消化することにより、ヒトhLF cDNA断片を切り出した。
　以前に報告しているDHFR欠損チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（CHO［DG44］）用発現ベクターpOptiVEC-MCS(Shiga, Yら Eur J Pharm Sci. Vol.67, 136-143, 2015)をEcoR IとNot Iで消化し、上記EcoR I／Xho I消化ヒトHSA cDNA断片と、Xho I／Not I消化ヒトhLF cDNA断片を、T4 DNA ligase （ニッポンジーン社製）を用いて3点ライゲーションすることで、CHO（DG44）安定発現株用ベクターpOptiVEC／HSA-hLFを作製した（図2）。
　融合タンパク質HSA-hLF発現ベクターであるpOptiVEC／HSA-hLFがコードするヒト血清アルブミン（HSA）／ヒトラクトフェリン（hLF）融合タンパク質のアミノ酸配列を、HSA-hLF配列（SEQ ID NO: 14）として示す。このHSA-hLF配列において、アミノ酸番号1～609（SEQ ID NO: 15）はシグナル配列を含むヒト血清アルブミン（HSA）、アミノ酸番号610～612（配列Leu-Glu-Met）はスペーサー、アミノ酸番号613～1304（SEQ ID NO: 16）はヒトラクトフェリン（hLF）のアミノ酸配列である。
3. hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質安定発現細胞株の樹立
　hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質の安定発現細胞株構築のために、CHO細胞の一種であるDHFR欠損チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（DG44）を用いた。DHFRとは、ジヒドロ葉酸還元酵素であり、核酸の生合成には必須である。DHFRのアンタゴニストであるメトトレキサート（MTX）の存在下で細胞を培養すると、DHFRの産生が阻害される。その際、細胞は生き残るためにDHFR遺伝子を増幅し、DHFR遺伝子の近傍に存在する遺伝子も増幅されるために、その遺伝子のタンパク質発現が増幅することが知られている。このようにして、目的とするタンパク質を高発現させることが可能である。
　1、2で作製した発現ベクターpOptiVEC／hLF-HSA、およびpOptiVEC／HSA-hLF、は効率的に細胞へ導入するために、制限酵素PvuIで消化して直鎖状にした。エレクトロポレーションは、Bio-Rad社製Gene Pulser Xcell（登録商標）で行った。CHO（DG44）細胞は、10％ FBSを含むリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド含有α-MEM培地（製品番号21444、ナカライテスク社製）にて培養した。細胞4.0×105cells分を遠心し、上清除去後、50μlのPBSに懸濁した。この細胞懸濁液をエレクトロポレーション用2mmギャップキュベット（ネッパジーン社製）に移し、直鎖状にしたpOptiVEC／hLF-HSA、およびpOptiVEC／HSA-hLFを約13μg 分（PBS 50μlに懸濁）添加した。この混合液を、『電圧160V、液量100μl、パルス幅15msec、間隔0s、波形square wave』の条件で電気パルスをかけ、その後2分間静置した。即座に混合液100μl全量を、10％ FBSを含むリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド含有α-MEM培地5mlに添加した。遠心分離（200×g、2分間）して、ペレットを再び1mlの10％ FBSを含むリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド含有α-MEM培地に懸濁後、細胞培養用12wellプレートに移した。5％ CO2、37℃で2日間培養した後、培地を10％ FBSを含むリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド不含MEMα培地（製品番号135-15175、和光純薬社製）に交換して培養を続けた。生育した細胞は、12wellプレートからT75cm2フラスコにスケールアップして培養した。次にメトトレキサート（MTX、和光純薬社製）による遺伝子増幅を行った。T75cm2フラスコで培養している細胞が、フラスコ面積の80％以上になるまで培養した後、細胞をトリプシン／EDTAで剥がし、最終的に10 mlの50 nM MTXと10％ FBSを含むリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド不含MEMα培地に懸濁した。T75cm2フラスコに、この細胞懸濁液1mlと、新しい9mlの50nM MTXと10％ FBSを含むリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド不含MEMα培地を加えて、80％ confluentまで培養した。MTXの濃度を500nM、1μM、2μM、3μM、4μMと段階的に上げて、同様の培養を行い、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質高発現細胞株を樹立した。hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質高発現細胞株は、それぞれDG44（hLF-HSA）細胞、DG44（HSA-hLF）細胞と命名した。
4. hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質の大量発現
　大量発現は、175cm2のTフラスコ（グライナー社製）を用いた静置培養で行った。DG44（hLF-HSA）細胞、およびDG44（HSA-hLF）は、10％FBSを含むリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド不含MEMα培地（和光純薬社製）で70％confluentになるまで培養した。培地上清を除去し、付着している細胞をPBSで洗浄した後、「Hybridoma Serum Free Medium」（商品名、Invitrogen社）を30ml加えて37℃、5％CO2で4日間培養した。4日後、培養上清液を50 ml遠沈菅に移し、10，000×gで10分間遠心して上清を保存容器に移した。細胞には新しい「Hybridoma Serum Free Medium」（商品名、Invitrogen社）を30ml加えて、37℃、5％CO2で更に4日間培養して、培養上清を調製した。培養後、細胞を遠心分離で取り除き、得られた培養上清には最終濃度0.02％のアジ化ナトリウムを加え、4℃にて保存した。
5. hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質の精製
　精製には、大量発現で得られたhLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質を含む培地上清（最終濃度0.02％アジ化ナトリウムを含む）をそのまま使用した。ヒトラクトフェリン（hLF）は、ヘパリンに強く結合する性質が知られているため、Heparin Sepharose 6 Fast Flow（商品名、GEヘルスケア社）を用いるアフィニティー精製で、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質の精製を行った。「Heparin Sepharose 6 Fast Flow」（商品名、GEヘルスケア社）2 ml分を「Poly-Prep Chromatography Columns」（商品名、バイオラッド社）に充填して、5カラム容量（CV）分の10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）で平衡化した。10℃にて、培養上清500mL分を還流させる形で、Heparin Sepharose 6 Fast Flowと接触させて、融合タンパク質を「Heparin Sepharose 6 Fast Flow」に吸着させた。還流後、還流させていた培養上清は素通り画分として回収した。融合タンパク質を吸着させたヘパリン担体を含む「Poly-Prep Chromatography Columns」を、「UV DETECTOR」（東京理化器械社、280nmの吸光度を測定）、マイクロチューブポンプ（東京理化器械社）と接続し、ポンプの流速を1ml／minに設定し、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）を流して担体を洗浄した。「UV DETECTOR」の280nmの吸光度が上昇し始めた時点から、排出液を回収した（洗浄画分）。この回収は280nmの吸光度が0になるまで続けた。その後、溶液を0.5M NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に換えて同様の操作を行った（0.5M NaCl溶出画分）。さらに、溶液を2M NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に換えて同様の操作を行った（2M NaCl溶出画分）。回収した各溶出液は、4℃にて保存した。各画分溶液12μlに非還元の4×サンプル緩衝液を4μl混合し、95℃で5分間熱処理を行い、7.5％SDS-PAGEで解析した。バンドの染色にはCBBを用いた。hLF-HSA融合タンパク質の精製結果を図3、HSA-hLF融合タンパク質の精製結果を図4に示す。両融合タンパク質とも、素通り画分、および洗浄画分にはバンドは見られず、0.5M NaCl溶出画分に、約140kDaの融合タンパク質のバンドが認められる。2M NaCl溶出画分にはバンドが認められないことから、Heparin Sepharose 6 Fast Flowに吸着した両融合タンパク質は、0.5M NaClで完全に溶出されることがわかった。4.に記載の方法で発現させた場合、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質はともに、1Lの培養上清から精製タンパク質として約10～15mg分得られることがわかった。
実施例2：hLF-HSA融合タンパク質の鉄結合能の測定
　ラクトフェリン（LF）は分子量8万の非ヘム性の鉄結合性糖タンパク質で、Nローブ、Cローブと呼ばれる二つの領域からなり、炭酸イオン（CO3 2-）存在下でタンパク質1分子当たり2個の鉄イオン（Fe3＋）を可逆的にキレート結合する能力を有する（Andersonら., Nature, 344, 784-78 (1990)）。まず、4.、5.で調製したhLF-HSA、HSA-hLF両融合タンパク質に結合している脱鉄操作前の鉄イオン（Fe3＋）量を、和光純薬社製「Fe C-テストワコー」で測定した。その結果、hLF換算タンパク質1mgあたりhLF-HSAは1302ng、HSA-hLFは1161ngのFe3＋が結合しており、これはタンパク質1分子当たり2個の鉄イオン（Fe3＋）が結合した場合の理論値（hLF 1mgあたりFe3＋が約1400ng結合する)にほぼ近い値であった。したがって、両hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質は鉄イオンと結合する能力を有していることが示された。さらに以下の方法で、hLF-HSA融合タンパク質の鉄結合能を測定した。調製した各融合タンパク質から、10mM HCl（pH 2.0）と0.1％ EDTAを含むリン酸バッファー（pH7.5）を用いて鉄イオン（Fe3＋）を遊離させ、アポ（apo）型ラクトフェリン（鉄除去型ラクトフェリン）を調製した。次いで炭酸イオン（CO3 2-）存在下で鉄イオン（Fe3＋）を付加させた鉄再結合ラクトフェリンを調製した。鉄除去型ラクトフェリン及び鉄再結合ラクトフェリンの鉄含量及びタンパク質濃度を測定し、hLFタンパク質1mg（HSA融合タンパク質の場合は、分子量を用いて算出したhLF換算で1mg）あたりに結合している鉄の結合量を算出した。
　具体的には、Aspergillus由来の組換え型hLF（rhLF）、ヒト血清アルブミン（HSA、和光純薬社製）、hLF-HSA融合タンパク質を10mM HCl（pH 2.0）に対して24時間透析、さらに0.1％EDTAと150mM NaClを含む100mMリン酸バッファー（pH7.5） に対して24時間透析することで脱鉄を行った。脱鉄して得られたサンプルは鉄除去型ラクトフェリンとした。鉄の再結合は、上記、塩酸とEDTAによる脱鉄後、0.001％クエン酸鉄アンモニウム、50mM炭酸水素ナトリウム及び150mM NaClを含むリン酸バッファー（pH 7.5）に対して24時間透析、150mM NaClを含む50mMリン酸バッファー（pH 6.6） に対して24時間の透析を1回行うことで、鉄再結合ラクトフェリンとした。タンパク質に結合している鉄イオンは、血清鉄測定キット「Fe C-テストワコー」（商品名、和光純薬社製）を用いて測定した。鉄の結合能は、ブラッドフォード法で定量したhLFタンパク質1mg（HSA融合タンパク質の場合は、分子量を用いて算出したhLF換算で1mg）あたりに結合する鉄の結合量として算出した。hLF-HSA融合タンパク質は、rhLFと比較して100％の鉄結合能を保持していた。
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実施例3：CDスペクトルを用いたhLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質の熱安定性の検討
　HSA-hLF、hLF-HSA融合タンパク質の熱安定性を、円偏光二色性（CD）スペクトルで解析した。円偏光二色性（CD）スペクトルとは、物質にある波長をあてた場合の右円偏光と左円偏光の吸収の差を測定する方法で、タンパク質の二次構造の有無や種類、含量を推定することが可能である。
　まず、PBS（-）に0.1mg／mlで懸濁したAspergillus由来の組換え型hLF（rhLF）、ヒト血清アルブミン（HSA、和光純薬社製）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質を用意して、25℃で、波長200nm～250nmのCDスペクトルを測定した（円二色性分散計J-1500使用、日本分光社製）。その結果を、図5に示す。HSA-hLF、hLF-HSA両融合タンパク質の二次構造が確認され、hLF とHSAとの融合により、hLFの二次構造に大きな変化は起こっていないことが確認された。次に、各タンパク質の熱安定性を調べた。タンパク質溶液の温度を低温から高温へ変化させながらCDスペクトルを測定すると、ある温度で［θ］が上昇し一定の値を取る。この現象は、熱によりタンパク質の変性が起きて、二次構造が変化することに起因している。熱安定性を観察する場合は、一般に測定する波長は225nm付近を用いる。PBS（-）に0.1mg／mlで懸濁したAspergillus由来の組換え型hLF（rhLF）、ヒト血清アルブミン（HSA、和光純薬社製）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質を用意して、30～90℃まで1℃ずつ上昇させながら、波長225nmのCDスペクトルを測定した（円二色性分散計J-1500使用、日本分光社製）。二次構造が変化した際の変性温度 （Tm値）は、日本分光社の熱変性解析プログラムSpectra Manager Ver.2を用いて算出した。なお、hLFに結合する鉄量が多いほど、高い熱安定性を示すことが報告されているため (Spreedhara, A. et al., Biometals 23, 1159-1170, 2010)、測定に使用したサンプルの鉄含有量を「Fe C-テストワコー」（商品名、和光純薬社製）を用いて測定した。その結果、各サンプルは、rhLF：1222ng／mg、hLF-HSA：1302ng／mg、HSA-hLF 1161ng／mgとほぼ同じ量の鉄を結合していた。各タンパク質の熱安定性の結果を図6に示す。各タンパク質の変性温度（Tm値）は、rhLF：90℃以上、HSA：61.6℃、hLF-HSA：82.2℃、HSA-hLF：64.5℃であり、両融合タンパク質のTm値はrhLFより低下したが、hLF-HSA融合タンパク質はHSA-hLFと比較して、高い熱安定性を保持していた。
実施例4：HSA-hLF、hLF-HSA融合タンパク質のペプシンに対する消化耐性
　1.2mg／mlの濃度に調整した各タンパク質溶液（Aspergillus由来の組換え型hLF（rhLF）、ヒト血清アルブミン（HSA、和光純薬社製）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質）35μl、10mM HCl（pH 2.0）40.6μlを混合して、37℃で5分間静置した。その後、8.4μlの200ng／mlペプシン溶液（和光純薬社製のブタ胃由来のペプシンを10mM HCl（pH 2.0）に溶解）を添加して、消化反応を開始した。経時的に反応サンプル12μlを回収し、あらかじめ用意しておいた還元4xSample Buffer （0.1 M Tris-HCl（pH6.8）、8％ SDS、40％ Glycerol、20％2-Mercaptoethanol、0.1％BPB）4μlに加え、消化反応を停止させた。その後、サンプルは95℃で5分間熱処理を行い、そのうちの4 μlを7.5％ SDS-PAGEで泳動した。ゲルはCBBで染色した。図7は、左から順に、各タンパク質にペプシンを加えずに37℃で0、5、10、20、40、80分間静置反応させたサンプル (Pepsin(-)と表記)、各タンパク質にペプシンを加えて37℃で0、5、10、20、40、80分間静置反応させたサンプル(Pepsin(+)と表記)の泳動結果である。染色したバンドの濃さを数値化するためのソフトウエアであるCS Analyzer（ATTO社製）を用いて、各バンドの濃さを解析した。各タンパク質の消化時間0分におけるバンドの濃さを100％として、相対濃度をグラフ化した（図8）。コントロールであるhLFは5分間以内で完全に分解されたのに対して、hLF-HSAとHSA-hLFの両融合タンパク質は消化耐性を示した。ペプシンによる各タンパク質の消化分解半減期は、hLFは5分以内、HSAは3.1分、hLF-HSAは80分以上、HSA-hLFは9.3分と算出され、特にhLF-HSAはペプシンに対して顕著な消化耐性を示した。
実施例5：ヒト小腸上皮様細胞Caco-2への細胞内取り込み、細胞外放出
　LFは完全な分子の形で腸管から取り込まれ、完全な分子の形で胸管リンパ液へ移行し、その後大静脈から全身へ移行することが知られている（Takeuchiら, Exp Physiol., Vol.89, 263-270, 2004）。またヒト小腸上皮様細胞Caco-2へのLFの細胞内取り込み、および細胞外放出は、LFの腸管吸収を模倣する現象であると考えられている。そこで、Aspergillus由来の組換え型hLF（rhLF）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質を蛍光プローブで標識して、Caco-2細胞と反応させ、細胞内に取り込まれた様子を共焦点レーザースキャン顕微鏡で観察した。また、各非標識タンパク質をCaco-2細胞へ取り込ませて、その後Caco-2細胞のcell lysateを調製し、各タンパク質の細胞内での状態をLFに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法で解析した。さらに、各非標識タンパク質をCaco-2細胞へ取り込ませた後、細胞から放出される各タンパク質をhLFに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法で解析した。
1.共焦点レーザースキャン顕微鏡による細胞内とり込み観察
　各タンパク質は蛍光プローブであるAlexa Fluor（登録商標）488 （Thermo Fisher Scientific社製）で標識した。1mg のAlexa Fluor（登録商標）488にDMSO 100μlを加え、その後、1M NaHCO3を加えた各タンパク質とAlexa Fluor（登録商標）488をモル比1：10で混合して、室温で、1 時間反応させた。反応後、反応液を1×PBS（-）に対して24時間透析を行い、タンパク質に結合しなかったフリーのAlexa Fluor（登録商標） 488を除去して、Alexa Fluor（登録商標）488標識タンパク質とした。
　Caco-2細胞を12well plateに細胞濃度5×104cells／mlになるように撒き込み、37℃，5％ CO2で2日おきに培地交換しながら1週間培養した。Caco-2細胞にPBS（-）を500μl／well加えて、3回洗浄を行い、培地成分を完全に取り除いた。次に、PBS（-）に懸濁したAlexa標識済みの各タンパク質を15μg／well加えて、4℃と37℃で1時間反応させた。37℃反応では、ATP合成阻害剤であるNaN3を終濃度0.2％で添加した場合と、非標識ウシラクトフェリン（bLF）を150μg添加した場合も合わせて行った。1時間後、Alexa標識済みの各タンパク質を取り除き、冷却したPBS（-）を500μl／well加えて、1回洗浄を行った。洗浄後、0.25％ Trypsin／EDTAを200 μl／well加えて、室温で3分間反応させ、細胞をプレートから剥がした。細胞を遠心チューブに全量回収して、冷却したPBS（-）で洗浄後、4％ PFA／PBS（-）で15分間処理することで、細胞を固定した。再び冷却したPBS（-）で洗浄し、PBS（-）に懸濁させた1μg／mlビスベンズイミド(Bisbenzimide H33258 Trihydrochloride、和光純薬社製)溶液を200μl／tube加えて、室温で30分間反応させ、核を染色した。細胞を冷却したPBS（-）で洗浄後、全量を8well chamber plateに移し、共焦点レーザースキャン顕微鏡LSM510(Carl Zeiss社製)で取り込みの蛍光を観察した。その結果、rhLF及びhLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質は4℃条件下ではCaco2細胞へ取り込まれないが（図9の4℃）、37℃条件下ではCaco2細胞へ取り込まれていることが確認された（図9の37℃）。また37℃における取り込みは、ATP合成阻害剤であるNaN3（図9のNaN3）、および標識タンパク質の100倍量の未標識bLFの添加により完全に阻害されたことから（図9の100倍量bLF）、この細胞内取り込みはレセプター介在性であり、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質は、LFの取り込みルートで細胞内に取り込まれることが示唆された。すなわち、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質は、Caco2細胞で発現しているラクトフェリン受容体、又はアルブミン受容体のいずれか1つ以上の受容体を介して取り込まれたものと考えられる。
2.ポリクローナル抗hLF抗体を用いたウエスタンブロット法による細胞内とり込み解析
　Caco-2細胞を12well plateに細胞濃度5×104cells／mlになるように撒き込み、37℃，5％ CO2で2日おきに培地交換しながら1週間培養した。Caco-2細胞にPBS（-）を500μl／well加えて、3回洗浄を行い、培地成分を完全に取り除いた。次に、PBS（-）に懸濁した各タンパク質を15μg／well加えて、4℃と37℃で1時間反応させた。反応後、冷却したPBS（-）を500μl／well加えて、3回洗浄を行った。洗浄後、0.25％Trypsin／1mM EDTAを用いてplateから細胞を剥がして、細胞を1.5ml遠心チューブに回収した。冷却したPBS（-）を 500μl／ml加えて細胞を洗浄し、その後、200×g，2分間，4℃で遠心を行うことで細胞を回収した。この洗浄操作を3回行い、最終的に、細胞には100 μlの冷却したLysis buffer（1％ Triton X-100とプロテインインヒビターを含むPBS（-）溶液）を添加して、4℃で30分間反応させることで、細胞を破壊した。その後、18，700×g，15分間，4℃で遠心を行い、上清をcell lysateとして回収した。10％SDS-PAGEに、1レーンあたり36μg 分の各cell lysateを非還元状態で泳動した。泳動後、常法に従い、各レーンのタンパク質をニトロセルロース ブロッテイングメンブレン（Protran（登録商標） Premium 0.45μm NC、GEヘルスケア社製）へ転写し、1次抗体としてHuman Lactoferrin antibody（Rabbit polyclonal、A80-144A、Betheyl社製）、2次抗体としてAnti Rabbit IgG（Fc），Monoclonal Antibody， Peroxidase Conjugated，016-23943、和光純薬社製）を反応させた。バンドの検出は化学発光法（イムノゼータ、和光純薬社製）で行った。その結果、37℃で細胞内に取り込まれたrhLFは、コントロールであるrhLFと同じ位置に、完全な分子として検出された。一方、4℃で細胞と反応させたrhLFは、37℃で細胞と反応させた場合より検出されるバンドが薄かった（図10左、rhLF）。rhLFと同様に、37℃で細胞内に取り込まれたhLF-HSAは、コントロールであるhLF-HSAと同じ位置に、完全な分子として検出された。一方、4℃で細胞と反応させたhLF-HSAは、37℃で細胞と反応させた場合より検出されるバンドが薄かった（図10中央、hLF-HSA）。以上の結果からhLF-HSAは、rhLFと同様に完全な形でCaco2細胞へ取り込まれることが確認された。一方、約140kDaの分子量であるHSA-hLFは、37℃で細胞と反応させた場合、主に約80kDaの位置にバンドが検出された（図10右、HSA-hLF）。これは、HSA-hLFが細胞内に取り込まれる際、HSAとhLFとの結合部位が分解され、80kDaであるhLFが抗hLF抗体により検出されたものと推察される。したがって、HSA-hLFは、Caco2細胞へ取り込まれると分解することが判明した。
3.ポリクローナル抗hLF抗体を用いたウエスタンブロット法による細胞外放出解析
　Caco-2細胞を12well plateに細胞濃度5×104 cells／mlになるように撒き込み、37℃，5％CO2で2日おきに培地交換しながら1週間培養した。Caco-2細胞にPBS（-）を500μl／well加えて、3回洗浄を行い、培地成分を完全に取り除いた。次に、PBS（-）に懸濁した各タンパク質を15 μg／well加えて、37℃で1時間反応させた。反応後、冷却したPBS（-）を 500 μl／well加えて、3回洗浄を行った。洗浄後、0.25％ Trypsin／1mM EDTAを用いてplateから細胞を剥がして、細胞を1.5ml遠心チューブに回収した。冷却したPBS（-）を1ml加えて細胞を3回洗浄し、その後、200×g，2分間，4℃で遠心を行うことで細胞を回収した（3回目の洗浄液は、ウエスタンブロット法で解析した）。D-MEM培地（和光純薬社製）を200μl加えて、37℃で30、60、120分間反応させ、培地中に各タンパク質を放出させた。培地は6000rpmで10分間遠心を行い、上清をhLFに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法で解析した。ウエスタンブロット法は上記細胞内取り込みに記載した方法で行った。結果を図11に示す。rhLFは80kDaの完全な形で培地中に放出された。またhLF-HSAは、rhLFと同様に完全な形で培地中に放出された。一方、細胞内取り込みにおいて、HSAとhLFとの結合部位の分解が示唆されたHSA-hLFは、分解したhLFのみが培地中に放出された。
実施例6：hLF-HSAとHSA-hLF両融合タンパク質のラットを用いた血中安定性の検討
　8週齢のWistar系ラット（雄）5頭に、ペントバルビタールナトリウムによる麻酔下にて、外頸静脈に採血用カニューレを留置した。大腿静脈内注射により、hLF換算で1mg／kg体重となるようhLF-HSAとHSA-hLF両融合タンパク質を投与した。投与前及び投与後1、5、10、15、30、60、120、180、240分後に外頸静脈に留置したカニューレから採血し、血漿中のhLF濃度はELISA（「AssayMax Human Lactoferrin ELISA kit」、Assaypro社製）により測定した。なお、予備検討により、採血時に使用した抗凝固剤であるEDTA、及び血漿は、このELISA測定に影響を及ぼさないことを確認している。
　まず、ブラッドフォード法により濃度既知であるhLF-HSAとHSA-hLF両融合タンパク質を用いて、各検量線を作成した。hLF-HSAとHSA-hLF両融合タンパク質は、0.24～15.0ng／mlで直線性が得られたので、この範囲に測定値が入るように各血漿サンプルを希釈してタンパク質濃度を測定した。
　得られた結果を、以前に同じ方法で測定したrhLFの血中濃度プロファイルと合わせて図12に示す。投与前はhLF-HSA、HSA-hLF両融合タンパク質投与群ともに血中からLFは検出されなかった。投与後15分までは、rhLFの血中濃度が高かったが、その後は急速に濃度が低下して、融合タンパク質の血中濃度が高くなった。特にHSA-hLFの血中濃度が高かった。
　統計解析ソフトウエア「GraphPad Prism（登録商標） 4」（GraphPad Software社）を用いて、血中半減期と時間曲線下面積（area under the curve、AUC）を算出した。Aspergillus由来の組換え型hLF投与群の半減期は12.6分であるのに対し、hLF-HSA、HSA-hLF両融合タンパク質投与群の半減期はそれぞれ64分、404分とhLF投与群の約5.1倍、32.1倍に延長した（図13）。AUCについては、hLF-HSA、HSA-hLF両融合タンパク質投与群では、hLF投与群の約1.8倍、4.2倍に増加という血中安定性の著しい向上を示した。
　In vitroでのペプシン消化耐性、およびCDスペクトルによる熱安定性解析の結果、hLF-HSA、HSA-hLF両融合タンパク質はrhLFと比較して、分子の安定性向上を示した。特にHSA-hLFに比べて、hLF-HSAは大幅な分子の安定性向上を示した。一方、In vivoでは、hLF-HSA、HSA-hLF両融合タンパク質はrhLFと比較して、血中安定性向上を示した。特にhLF-HSA に比べて、HSA-hLF融合タンパク質の大幅な血中安定性向上が示された。以上の結果は、HSAの融合させる位置、すなわち、hLFのN末端側かC末端側に融合させることによるその効果は、予測が難しいことを示している。
実施例7：hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質の鉄結合能の測定（チオシアン酸ナトリウムとEDTAによる脱鉄と鉄再結合）
　4.、5.で示した方法で調製したhLF-HSA、HSA-hLF両融合タンパク質、さらにrhLFに結合している脱鉄操作前の鉄イオン（Fe3＋）量を、和光純薬社製「Fe C-テストワコー」で測定すると、hLF換算タンパク質1mgあたりhLF-HSAは1207ng、HSA-hLFは819ng、rhLFは1966ngのFe3＋が結合していた。HSA-hLFは酸性状態では沈殿してしまうために、6.で示した塩酸を用いる脱鉄方法は適さない。そこで、中性条件下で脱鉄する方法として、カオトロピック塩であるチオシアン酸ナトリウムを用いる方法を試みた。 rhLF、hLF-HSA、HSA-hLF両融合タンパク質溶液に最終濃度で5 Mになるようにチオシアン酸ナトリウム、最終濃度で0.1% になるようにEDTAを添加して、室温で16時間インキュベートした。その後、150mM NaClを含む50 mMリン酸バッファー（pH 6.6） に対して24時間透析することで脱鉄を行った。鉄の再結合は脱鉄後、0.001％クエン酸鉄アンモニウム、50mM炭酸水素ナトリウム及び150mM NaClを含むリン酸バッファー（pH 7.5）に対して24時間透析、150mM NaClを含む50mMリン酸バッファー（pH 6.6） に対して24時間の透析を1回行うことで、鉄再結合ラクトフェリンとした。タンパク質に結合している鉄イオンは、血清鉄測定キット「Fe C-テストワコー」（商品名、和光純薬社製）を用いて測定した。鉄の結合能は、ブラッドフォード法で定量したhLFタンパク質1mg（HSA融合タンパク質の場合は、分子量を用いて算出したhLF換算で1mg）あたりに結合する鉄の結合量として算出した。その結果を表に示す。rhLFの結合活性を100%とすると、rhLF-HSA、rHSA-hLF融合タンパク質は147%、69.5%の鉄結合能を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例8：低分化型ヒト肺腺ガン細胞に対するHSA融合タンパク質の抗腫瘍作用
　低分化型ヒト肺腺ガン細胞株PC-14 は(株)免疫生物研究所（IBL）より購入して、10% FBSを含むRPMI-1640（和光純薬社製）で培養した。細胞培養用96 well plateに0.1% ブタゼラチン（岩城硝子社製）溶液を100 μl/well加えて1時間静置し、plateをゼラチンコートした。PC-14を10% FBSを含むRPMI-1640培地に2.5×104 cells/mlになるように懸濁して、200 μl/wellで細胞を撒き、37℃、5% CO2で一晩培養した。rhLF、ヒト血清アルブミン（HSA、和光純薬社製）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質を10% FBSを含むRPMI-1640（和光純薬社製）を用いて0、5、10 μM (HSA-hLFは0、5 μM)となるように調製した。Plateに接着した細胞の培地を捨てて、調製した各タンパク質溶液を100 μl/wellで加え、37℃、5% CO2で96時間培養した。その後、Cell Counting Kit-8 （同仁化学社製）を加え37℃、5% CO2で2時間発色させた。発色後、450 nmにおける吸光度により細胞増殖を評価した。細胞増殖は、培地にタンパク質を加えない場合の吸光度を100%とした場合の相対値（n=2の平均値）で示した（図14）。10 μM HSAで多少の細胞増殖阻害が観察されたが、rhLFでは細胞増殖阻害は観察されなかった。一方、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質では顕著な細胞増殖阻害が認められ、特にHSA-hLFはhLF-HSA と比較して強い細胞増殖阻害を示した。以上のことから、HSA融合によるhLFの抗腫瘍作用の増強が示された。
実施例9：融合タンパク質の共有結合による抗腫瘍効果への影響
　次にこの抗腫瘍作用の増強には、HSAとrhLFの共存が必要なのか、それとも両分子が共有結合により融合されていることが必要であるのかを明らかとするために、HSAとrhLFの両方を各成分が10 μMの濃度となるように同じウエルに加えて、実施例8と同様の方法でPC-14細胞の増殖を評価した。ただし、今回は各タンパク質を細胞に加え72時間培養し、その後、Cell Counting Kit-8 （同仁化学社製）で2時間発色させた。細胞増殖は、培地にタンパク質を加えない場合の吸光度を100%とした場合の相対値（n=3,平均値±標準偏差 SD）で示した（図15）。10 μM HSA単体、10 μM rhLF単体を加えた場合に多少の細胞増殖阻害が観察されたが、HSAとrhLFの両者を各成分が10 μMの濃度で同じウエルに加えた場合では、10 μM HSA単体、10 μM rhLF単体の場合と同様に増殖阻害をほとんど示さなかった。一方、融合タンパク質ではhLF-HSA及びHSA-hLFのいずれにも顕著な細胞増殖阻害が認められ、特にHSA-hLFはhLF-HSA と比べても強い細胞増殖阻害を示した。このことから、hLFの抗腫瘍作用の増強には、hLFにHSAを共有結合で融合させることが必要であることが示された。
実施例10：分化型ヒト肺腺ガン細胞に対するHSA融合タンパク質の抗腫瘍作用
　分化型ヒト肺腺ガン細胞株PC-9は(株)免疫生物研究所 (IBL)より購入して、10% FBSを含むRPMI-1640（和光純薬社製）で培養した。細胞培養用96 well plateに0.1% ブタゼラチン（岩城硝子社製）溶液を100 μl/well加えて1時間静置し、plateをゼラチンコートした。PC-9を10% FBSを含むRPMI-1640培地に2.5×104 cells/mlになるように懸濁して、200 μl/wellで細胞を撒き、37℃、5% CO2で一晩培養した。rhLF、ヒト血清アルブミン（HSA、和光純薬社製）、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質を10% FBSを含むRPMI-1640（和光純薬社製）を用いて0、5、10 μM (HSA-hLFは0、5 μM)となるように調製した。Plateに接着した細胞の培地を捨てて、調製した各タンパク質溶液を100 μl/wellで加え、37℃、5% CO2で72時間培養した。その後、Cell Counting Kit-8 （同仁化学社製）を加え37℃、5% CO2で2時間発色させた。発色後、450 nmにおける吸光度により細胞増殖を評価した。細胞増殖は、培地にタンパク質を加えない場合の吸光度を100%とした場合の相対値（n=3,平均値±標準偏差 SD）で示した（図16）。10 μM HSA、10 μM rhLFでは細胞増殖阻害は観察されなかったが、hLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質では顕著な細胞増殖阻害が認められ、特にHSA-hLFはhLF-HSA と比較して強い細胞増殖阻害を示した。以上のことから、本発明の融合タンパク質は分化型のヒト肺腺ガン細胞に対しても抗腫瘍作用を有することが確認された。
実施例11：ヒト肺正常細胞に対するHSA融合タンパク質の作用
　次にhLF-HSA、HSA-hLF融合タンパク質のヒト肺正常細胞株WI-38への影響を調べた。WI-38 はJCRB細胞バンクより購入して、10% FBSを含むD-MEM low glucose（和光純薬社製）で培養した。細胞培養用96 well plateに0.1% ブタゼラチン（岩城硝子社製）溶液を100 μl/well加えて1時間静置し、plateをゼラチンコートした。WI-38を10% FBSを含むD-MEM low glucose培地に2.5×104 cells/mlとなるように懸濁して、200 μl/wellで細胞を撒き、37℃、5% CO2で一晩培養した。10% FBSを含むD-MEM low glucose（和光純薬社製）を用いてrhLF、HSA、hLF-HSA融合タンパク質は10 μM 、HSA-hLFは5 μMとなるようにタンパク質溶液を調製した。Plateに接着した細胞の培地を捨てて、調製した各タンパク質溶液を100 μl/wellで加え、37℃、5% CO2で72時間培養した。その後、Cell Counting Kit-8（同仁化学社製）を加え37℃、5% CO2で2時間発色させた。発色後、450 nmにおける吸光度により細胞増殖を評価した。細胞増殖は、培地にタンパク質を加えない場合の吸光度を100%とした場合の相対値（n=3の平均値 ± 標準偏差）で示した（図17）。10 μM hLF-HSAで細胞の増殖促進が観察されたが、10 μM rhLF、HSA、5 μM HSA-hLFでは細胞増殖阻害はまったく観察されなかった。以上のことから、HSA融合によりhLFの抗腫瘍作用が増強されること、さらにその抗腫瘍作用は正常細胞では示されないことが明らかとなった。
　したがって、本発明の融合タンパク質は抗腫瘍活性を示しながらも、副作用を生じない、あるいは生じたとしても低い副作用に留まることが分かる。
　本発明は、大幅に分子安定性が向上したヒトラクトフェリン（hLF）-ヒト血清アルブミン（HSA）融合タンパク質を提供する。本発明は、さらに正常細胞ではなく腫瘍細胞に対して特異的に抗腫瘍作用を示すヒトラクトフェリン（hLF）-ヒト血清アルブミン（HSA）融合タンパク質を提供する。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  NRL Pharma Inc
 
<120>  lactorerrin/albumin fusion protein and method of producing them
 
<130>  G1649WO
 
<150>  JP 2016-212077
<151>  2016-10-28
 
<150>  JP 2017-044893
<151>  2017-03-09
 
<160>  16    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  1830
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
 
 
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1830)
 
<400>  1
atg aag tgg gta acc ttt att tcc ctt ctt ttt ctc ttt agc tcg gct         48
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala           
1               5                   10                  15                
 
tat tcc agg ggt gtg ttt cgt cga gat gca cac aag agt gag gtt gct         96
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala           
            20                  25                  30                    
 
cat cgg ttt aaa gat ttg gga gaa gaa aat ttc aaa gcc ttg gtg ttg        144
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu           
        35                  40                  45                        
 
att gcc ttt gct cag tat ctt cag cag tgt cca ttt gaa gat cat gta        192
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val           
    50                  55                  60                            
 
aaa tta gtg aat gaa gta act gaa ttt gca aaa aca tgt gtt gct gat        240
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp           
65                  70                  75                  80            
 
gag tca gct gaa aat tgt gac aaa tca ctt cat acc ctt ttt gga gac        288
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp           
                85                  90                  95                
 
aaa tta tgc aca gtt gca act ctt cgt gaa acc tat ggt gaa atg gct        336
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala           
            100                 105                 110                   
 
gac tgc tgt gca aaa caa gaa cct gag aga aat gaa tgc ttc ttg caa        384
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln           
        115                 120                 125                       
 
cac aaa gat gac aac cca aac ctc ccc cga ttg gtg aga cca gag gtt        432
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val           
    130                 135                 140                           
 
gat gtg atg tgc act gct ttt cat gac aat gaa gag aca ttt ttg aaa        480
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys           
145                 150                 155                 160           
 
aaa tac tta tat gaa att gcc aga aga cat cct tac ttt tat gcc ccg        528
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro           
                165                 170                 175               
 
gaa ctc ctt ttc ttt gct aaa agg tat aaa gct gct ttt aca gaa tgt        576
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys           
            180                 185                 190                   
 
tgc caa gct gct gat aaa gct gcc tgc ctg ttg cca aag ctc gat gaa        624
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu           
        195                 200                 205                       
 
ctt cgg gat gaa ggg aag gct tcg tct gcc aaa cag aga ctc aag tgt        672
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys           
    210                 215                 220                           
 
gcc agt ctc caa aaa ttt gga gaa aga gct ttc aaa gca tgg gca gta        720
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val           
225                 230                 235                 240           
 
gct cgc ctg agc cag aga ttt ccc aaa gct gag ttt gca gaa gtt tcc        768
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser           
                245                 250                 255               
 
aag tta gtg aca gat ctt acc aaa gtc cac acg gaa tgc tgc cat gga        816
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly           
            260                 265                 270                   
 
gat ctg ctt gaa tgt gct gat gac agg gcg gac ctt gcc aag tat atc        864
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile           
        275                 280                 285                       
 
tgt gaa aat caa gat tcg atc tcc agt aaa ctg aag gaa tgc tgt gaa        912
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu           
    290                 295                 300                           
 
aaa cct ctg ttg gaa aaa tcc cac tgc att gcc gaa gtg gaa aat gat        960
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp           
305                 310                 315                 320           
 
gag atg cct gct gac ttg cct tca tta gct gct gat ttt gtt gaa agt       1008
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser           
                325                 330                 335               
 
aag gat gtt tgc aaa aac tat gct gag gca aag gat gtc ttc ctg ggc       1056
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly           
            340                 345                 350                   
 
atg ttt ttg tat gaa tat gca aga agg cat cct gat tac tct gtc gtg       1104
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val           
        355                 360                 365                       
 
ctg ctg ctg aga ctt gcc aag aca tat gaa acc act cta gag aag tgc       1152
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys           
    370                 375                 380                           
 
tgt gcc gct gca gat cct cat gaa tgc tat gcc aaa gtg ttc gat gaa       1200
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu           
385                 390                 395                 400           
 
ttt aaa cct ctt gtg gaa gag cct cag aat tta atc aaa caa aat tgt       1248
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys           
                405                 410                 415               
 
gag ctt ttt gag cag ctt gga gag tac aaa ttc cag aat gcg cta tta       1296
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu           
            420                 425                 430                   
 
gtt cgt tac acc aag aaa gta ccc caa gtg tca act cca act ctt gta       1344
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val           
        435                 440                 445                       
 
gag gtc tca aga aac cta gga aaa gtg ggc agc aaa tgt tgt aaa cat       1392
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His           
    450                 455                 460                           
 
cct gaa gca aaa aga atg ccc tgt gca gaa gac tat cta tcc gtg gtc       1440
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val           
465                 470                 475                 480           
 
ctg aac cag tta tgt gtg ttg cat gag aaa acg cca gta agt gac aga       1488
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg           
                485                 490                 495               
 
gtc acc aaa tgc tgc aca gaa tcc ttg gtg aac agg cga cca tgc ttt       1536
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe           
            500                 505                 510                   
 
tca gct ctg gaa gtc gat gaa aca tac gtt ccc aaa gag ttt aat gct       1584
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala           
        515                 520                 525                       
 
gaa aca ttc acc ttc cat gca gat ata tgc aca ctt tct gag aag gag       1632
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu           
    530                 535                 540                           
 
aga caa atc aag aaa caa act gca ctt gtt gag ctc gtg aaa cac aag       1680
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys           
545                 550                 555                 560           
 
ccc aag gca aca aaa gag caa ctg aaa gct gtt atg gat gat ttc gca       1728
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala           
                565                 570                 575               
 
gct ttt gta gag aag tgc tgc aag gct gac gat aag gag acc tgc ttt       1776
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe           
            580                 585                 590                   
 
gcc gag gag ggt aaa aaa ctt gtt gct gca agt caa gct gcc tta ggc       1824
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly           
        595                 600                 605                       
 
tta taa                                                               1830
Leu                                                                       
                                                                          
 
 
<210>  2
<211>  609
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
 
<400>  2
 
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 
1               5                   10                  15      
 
 
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 
            20                  25                  30          
 
 
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 
        35                  40                  45              
 
 
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 
    50                  55                  60                  
 
 
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 
65                  70                  75                  80  
 
 
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 
                85                  90                  95      
 
 
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 
            100                 105                 110         
 
 
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 
        115                 120                 125             
 
 
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 
    130                 135                 140                 
 
 
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 
145                 150                 155                 160 
 
 
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 
                165                 170                 175     
 
 
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 
            180                 185                 190         
 
 
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 
        195                 200                 205             
 
 
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 
    210                 215                 220                 
 
 
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 
225                 230                 235                 240 
 
 
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 
                245                 250                 255     
 
 
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 
            260                 265                 270         
 
 
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 
        275                 280                 285             
 
 
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 
    290                 295                 300                 
 
 
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 
305                 310                 315                 320 
 
 
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser 
                325                 330                 335     
 
 
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 
            340                 345                 350         
 
 
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 
        355                 360                 365             
 
 
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 
    370                 375                 380                 
 
 
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 
385                 390                 395                 400 
 
 
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 
                405                 410                 415     
 
 
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 
            420                 425                 430         
 
 
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 
        435                 440                 445             
 
 
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 
    450                 455                 460                 
 
 
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 
465                 470                 475                 480 
 
 
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 
                485                 490                 495     
 
 
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 
            500                 505                 510         
 
 
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 
        515                 520                 525             
 
 
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 
    530                 535                 540                 
 
 
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 
545                 550                 555                 560 
 
 
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 
                565                 570                 575     
 
 
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 
            580                 585                 590         
 
 
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 
        595                 600                 605             
 
 
Leu 
    
 
 
<210>  3
<211>  2136
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
 
 
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(2136)
 
<400>  3
atg aaa ctt gtc ttc ctc gtc ctg ctg ttc ctc ggg gcc ctc gga ctg         48
Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu           
1               5                   10                  15                
 
tgt ctg gct ggc cgt agg aga agg agt gtt cag tgg tgc acc gta tcc         96
Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Thr Val Ser           
            20                  25                  30                    
 
caa ccc gag gcc aca aaa tgc ttc caa tgg caa agg aat atg aga aga        144
Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Arg           
        35                  40                  45                        
 
gtg cgt ggc cct cct gtc agc tgc ata aag aga gac tcc ccc atc cag        192
Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln           
    50                  55                  60                            
 
tgt atc cag gcc att gcg gaa aac agg gcc gat gct gtg acc ctt gat        240
Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp           
65                  70                  75                  80            
 
ggt ggt ttc ata tac gag gca ggc ctg gcc ccc tac aaa ctg cga cct        288
Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro           
                85                  90                  95                
 
gta gcg gcg gaa gtc tac ggg acc gaa aga cag cca cga act cac tat        336
Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr           
            100                 105                 110                   
 
tat gcc gtg gct gtg gtg aag aag ggc ggc agc ttt cag ctg aac gaa        384
Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu           
        115                 120                 125                       
 
ctg caa ggt ctg aag tcc tgc cac aca ggc ctt cgc agg acc gct gga        432
Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly           
    130                 135                 140                           
 
tgg aat gtc cct ata ggg aca ctt cgt cca ttc ttg aat tgg acg ggt        480
Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly           
145                 150                 155                 160           
 
cca cct gag ccc att gag gca gct gtg gcc agg ttc ttc tca gcc agc        528
Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser           
                165                 170                 175               
 
tgt gtt ccc ggt gca gat aaa gga cag ttc ccc aac ctg tgt cgc ctg        576
Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu           
            180                 185                 190                   
 
tgt gcg ggg aca ggg gaa aac aaa tgt gcc ttc tcc tcc cag gaa ccg        624
Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro           
        195                 200                 205                       
 
tac ttc agc tac tct ggt gcc ttc aag tgt ctg aga gac ggg gct gga        672
Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly           
    210                 215                 220                           
 
gac gtg gct ttt atc aga gag agc aca gtg ttt gag gac ctg tca gac        720
Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp           
225                 230                 235                 240           
 
gag gct gaa agg gac gag tat gag tta ctc tgc cca gac aac act cgg        768
Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg           
                245                 250                 255               
 
aag cca gtg gac aag ttc aaa gac tgc cat ctg gcc cgg gtc cct tct        816
Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser           
            260                 265                 270                   
 
cat gcc gtt gtg gca cga agt gtg aat ggc aag gag gat gcc atc tgg        864
His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp           
        275                 280                 285                       
 
aat ctt ctc cgc cag gca cag gaa aag ttt gga aag gac aag tca ccg        912
Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro           
    290                 295                 300                           
 
aaa ttc cag ctc ttt ggc tcc cct agt ggg cag aaa gat ctg ctg ttc        960
Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe           
305                 310                 315                 320           
 
aag gac tct gcc att ggg ttt tcg agg gtg ccc ccg agg ata gat tct       1008
Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser           
                325                 330                 335               
 
ggg ctg tac ctt ggc tcc ggc tac ttc act gcc atc cag aac ttg agg       1056
Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg           
            340                 345                 350                   
 
aaa agt gag gag gaa gtg gct gcc cgg cgt gcg cgg gtc gtg tgg tgt       1104
Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys           
        355                 360                 365                       
 
gcg gtg ggc gag cag gag ctg cgc aag tgt aac cag tgg agt ggc ttg       1152
Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu           
    370                 375                 380                           
 
agc gaa ggc agc gtg acc tgc tcc tcg gcc tcc acc aca gag gac tgc       1200
Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys           
385                 390                 395                 400           
 
atc gcc ctg gtg ctg aaa gga gaa gct gat gcc atg agt ttg gat gga       1248
Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly           
                405                 410                 415               
 
gga tat gtg tac act gca ggc aaa tgt ggt ttg gtg cct gtc ctg gca       1296
Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala           
            420                 425                 430                   
 
gag aac tac aaa tcc caa caa agc agt gac cct gat cct aac tgt gtg       1344
Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val           
        435                 440                 445                       
 
gat aga cct gtg gaa gga tat ctt gct gtg gcg gtg gtt agg aga tca       1392
Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser           
    450                 455                 460                           
 
gac act agc ctt acc tgg aac tct gtg aaa ggc aag aag tcc tgc cac       1440
Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His           
465                 470                 475                 480           
 
acc gcc gtg gac agg act gca ggc tgg aat atc ccc atg ggc ctg ctc       1488
Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu           
                485                 490                 495               
 
ttc aac cag acg ggc tcc tgc aaa ttt gat gaa tat ttc agt caa agc       1536
Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser           
            500                 505                 510                   
 
tgt gcc cct ggg tct gac ccg aga tct aat ctc tgt gct ctg tgt att       1584
Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile           
        515                 520                 525                       
 
ggc gac gag cag ggt gag aat aag tgc gtg ccc aac agc aat gag aga       1632
Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg           
    530                 535                 540                           
 
tac tac ggc tac act ggg gct ttc cgg tgc ctg gct gag aat gct gga       1680
Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly           
545                 550                 555                 560           
 
gac gtt gca ttt gtg aaa gat gtc act gtc ttg cag aac act gat gga       1728
Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly           
                565                 570                 575               
 
aat aac aat gac gca tgg gct aag gat ttg aag ctg gca gac ttt gcg       1776
Asn Asn Asn Asp Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala           
            580                 585                 590                   
 
ctg ctg tgc ctc gat ggc aaa cgg aag cct gtg act gag gct aga agc       1824
Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser           
        595                 600                 605                       
 
tgc cat ctt gcc atg gcc ccg aat cat gcc gtg gtg tct cgg atg gat       1872
Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp           
    610                 615                 620                           
 
aag gtg gaa cgc ctg aaa cag gtg ttg ctc cac caa cag gct aaa ttt       1920
Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe           
625                 630                 635                 640           
 
ggg aga aat gga tct gac tgc ccg gac aag ttt tgc tta ttc cag tct       1968
Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser           
                645                 650                 655               
 
gaa acc aaa aac ctt ctg ttc aat gac aac act gag tgt ctg gcc aga       2016
Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg           
            660                 665                 670                   
 
ctc cat ggc aaa aca aca tat gaa aaa tat ttg gga cca cag tat gtc       2064
Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val           
        675                 680                 685                       
 
gca ggc att act aat ctg aaa aag tgc tca acc tcc ccc ctc ctg gaa       2112
Ala Gly Ile Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu           
    690                 695                 700                           
 
gcc tgt gaa ttc ctc agg aag taa                                       2136
Ala Cys Glu Phe Leu Arg Lys                                               
705                 710                                                   
 
 
<210>  4
<211>  711
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
 
<400>  4
 
Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu 
1               5                   10                  15      
 
 
Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Thr Val Ser 
            20                  25                  30          
 
 
Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Arg 
        35                  40                  45              
 
 
Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln 
    50                  55                  60                  
 
 
Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp 
65                  70                  75                  80  
 
 
Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro 
                85                  90                  95      
 
 
Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr 
            100                 105                 110         
 
 
Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu 
        115                 120                 125             
 
 
Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly 
    130                 135                 140                 
 
 
Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly 
145                 150                 155                 160 
 
 
Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser 
                165                 170                 175     
 
 
Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu 
            180                 185                 190         
 
 
Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro 
        195                 200                 205             
 
 
Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly 
    210                 215                 220                 
 
 
Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp 
225                 230                 235                 240 
 
 
Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg 
                245                 250                 255     
 
 
Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser 
            260                 265                 270         
 
 
His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp 
        275                 280                 285             
 
 
Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro 
    290                 295                 300                 
 
 
Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe 
305                 310                 315                 320 
 
 
Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser 
                325                 330                 335     
 
 
Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg 
            340                 345                 350         
 
 
Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys 
        355                 360                 365             
 
 
Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu 
    370                 375                 380                 
 
 
Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys 
385                 390                 395                 400 
 
 
Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly 
                405                 410                 415     
 
 
Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala 
            420                 425                 430         
 
 
Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val 
        435                 440                 445             
 
 
Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser 
    450                 455                 460                 
 
 
Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His 
465                 470                 475                 480 
 
 
Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu 
                485                 490                 495     
 
 
Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser 
            500                 505                 510         
 
 
Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile 
        515                 520                 525             
 
 
Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg 
    530                 535                 540                 
 
 
Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly 
545                 550                 555                 560 
 
 
Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly 
                565                 570                 575     
 
 
Asn Asn Asn Asp Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala 
            580                 585                 590         
 
 
Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser 
        595                 600                 605             
 
 
Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp 
    610                 615                 620                 
 
 
Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe 
625                 630                 635                 640 
 
 
Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser 
                645                 650                 655     
 
 
Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg 
            660                 665                 670         
 
 
Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val 
        675                 680                 685             
 
 
Ala Gly Ile Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu 
    690                 695                 700                 
 
 
Ala Cys Glu Phe Leu Arg Lys 
705                 710     
 
 
<210>  5
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  primer
 
<400>  5
cgcggatccc gatgcacaca agagtgaggt                                        30
 
 
<210>  6
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  primer
 
<400>  6
aaggaaaaaa gcggccgctt ataagcctaa ggcagctt                               38
 
 
<210>  7
<211>  1298
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  hLF-HSA fusion protein
 
<400>  7
 
Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu 
1               5                   10                  15      
 
 
Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser 
            20                  25                  30          
 
 
Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys 
        35                  40                  45              
 
 
Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln 
    50                  55                  60                  
 
 
Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp 
65                  70                  75                  80  
 
 
Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro 
                85                  90                  95      
 
 
Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr 
            100                 105                 110         
 
 
Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu 
        115                 120                 125             
 
 
Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly 
    130                 135                 140                 
 
 
Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly 
145                 150                 155                 160 
 
 
Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser 
                165                 170                 175     
 
 
Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu 
            180                 185                 190         
 
 
Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro 
        195                 200                 205             
 
 
Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly 
    210                 215                 220                 
 
 
Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp 
225                 230                 235                 240 
 
 
Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg 
                245                 250                 255     
 
 
Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser 
            260                 265                 270         
 
 
His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp 
        275                 280                 285             
 
 
Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro 
    290                 295                 300                 
 
 
Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe 
305                 310                 315                 320 
 
 
Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser 
                325                 330                 335     
 
 
Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg 
            340                 345                 350         
 
 
Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys 
        355                 360                 365             
 
 
Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu 
    370                 375                 380                 
 
 
Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys 
385                 390                 395                 400 
 
 
Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly 
                405                 410                 415     
 
 
Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala 
            420                 425                 430         
 
 
Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val 
        435                 440                 445             
 
 
Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser 
    450                 455                 460                 
 
 
Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His 
465                 470                 475                 480 
 
 
Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu 
                485                 490                 495     
 
 
Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser 
            500                 505                 510         
 
 
Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile 
        515                 520                 525             
 
 
Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg 
    530                 535                 540                 
 
 
Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly 
545                 550                 555                 560 
 
 
Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly 
                565                 570                 575     
 
 
Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala 
            580                 585                 590         
 
 
Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser 
        595                 600                 605             
 
 
Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp 
    610                 615                 620                 
 
 
Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe 
625                 630                 635                 640 
 
 
Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser 
                645                 650                 655     
 
 
Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg 
            660                 665                 670         
 
 
Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val 
        675                 680                 685             
 
 
Ala Gly Ile Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu 
    690                 695                 700                 
 
 
Ala Cys Glu Phe Leu Arg Lys Asp Pro Asp Ala His Lys Ser Glu Val 
705                 710                 715                 720 
 
 
Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val 
                725                 730                 735     
 
 
Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His 
            740                 745                 750         
 
 
Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala 
        755                 760                 765             
 
 
Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly 
    770                 775                 780                 
 
 
Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met 
785                 790                 795                 800 
 
 
Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu 
                805                 810                 815     
 
 
Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu 
            820                 825                 830         
 
 
Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu 
        835                 840                 845             
 
 
Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala 
    850                 855                 860                 
 
 
Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu 
865                 870                 875                 880 
 
 
Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp 
                885                 890                 895     
 
 
Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys 
            900                 905                 910         
 
 
Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala 
        915                 920                 925             
 
 
Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val 
    930                 935                 940                 
 
 
Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His 
945                 950                 955                 960 
 
 
Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr 
                965                 970                 975     
 
 
Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys 
            980                 985                 990         
 
 
Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser  His Cys Ile Ala Glu  Val Glu Asn 
        995                 1000                 1005             
 
 
Asp Glu  Met Pro Ala Asp Leu  Pro Ser Leu Ala Ala  Asp Phe Val 
    1010                 1015                 1020             
 
 
Glu Ser  Lys Asp Val Cys Lys  Asn Tyr Ala Glu Ala  Lys Asp Val 
    1025                 1030                 1035             
 
 
Phe Leu  Gly Met Phe Leu Tyr  Glu Tyr Ala Arg Arg  His Pro Asp 
    1040                 1045                 1050             
 
 
Tyr Ser  Val Val Leu Leu Leu  Arg Leu Ala Lys Thr  Tyr Glu Thr 
    1055                 1060                 1065             
 
 
Thr Leu  Glu Lys Cys Cys Ala  Ala Ala Asp Pro His  Glu Cys Tyr 
    1070                 1075                 1080             
 
 
Ala Lys  Val Phe Asp Glu Phe  Lys Pro Leu Val Glu  Glu Pro Gln 
    1085                 1090                 1095             
 
 
Asn Leu  Ile Lys Gln Asn Cys  Glu Leu Phe Glu Gln  Leu Gly Glu 
    1100                 1105                 1110             
 
 
Tyr Lys  Phe Gln Asn Ala Leu  Leu Val Arg Tyr Thr  Lys Lys Val 
    1115                 1120                 1125             
 
 
Pro Gln  Val Ser Thr Pro Thr  Leu Val Glu Val Ser  Arg Asn Leu 
    1130                 1135                 1140             
 
 
Gly Lys  Val Gly Ser Lys Cys  Cys Lys His Pro Glu  Ala Lys Arg 
    1145                 1150                 1155             
 
 
Met Pro  Cys Ala Glu Asp Tyr  Leu Ser Val Val Leu  Asn Gln Leu 
    1160                 1165                 1170             
 
 
Cys Val  Leu His Glu Lys Thr  Pro Val Ser Asp Arg  Val Thr Lys 
    1175                 1180                 1185             
 
 
Cys Cys  Thr Glu Ser Leu Val  Asn Arg Arg Pro Cys  Phe Ser Ala 
    1190                 1195                 1200             
 
 
Leu Glu  Val Asp Glu Thr Tyr  Val Pro Lys Glu Phe  Asn Ala Glu 
    1205                 1210                 1215             
 
 
Thr Phe  Thr Phe His Ala Asp  Ile Cys Thr Leu Ser  Glu Lys Glu 
    1220                 1225                 1230             
 
 
Arg Gln  Ile Lys Lys Gln Thr  Ala Leu Val Glu Leu  Val Lys His 
    1235                 1240                 1245             
 
 
Lys Pro  Lys Ala Thr Lys Glu  Gln Leu Lys Ala Val  Met Asp Asp 
    1250                 1255                 1260             
 
 
Phe Ala  Ala Phe Val Glu Lys  Cys Cys Lys Ala Asp  Asp Lys Glu 
    1265                 1270                 1275             
 
 
Thr Cys  Phe Ala Glu Glu Gly  Lys Lys Leu Val Ala  Ala Ser Gln 
    1280                 1285                 1290             
 
 
Ala Ala  Leu Gly Leu 
    1295             
 
 
<210>  8
<211>  711
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  hLF plus signal sequence
 
<400>  8
 
Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu 
1               5                   10                  15      
 
 
Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser 
            20                  25                  30          
 
 
Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys 
        35                  40                  45              
 
 
Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln 
    50                  55                  60                  
 
 
Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp 
65                  70                  75                  80  
 
 
Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro 
                85                  90                  95      
 
 
Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr 
            100                 105                 110         
 
 
Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu 
        115                 120                 125             
 
 
Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly 
    130                 135                 140                 
 
 
Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly 
145                 150                 155                 160 
 
 
Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser 
                165                 170                 175     
 
 
Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu 
            180                 185                 190         
 
 
Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro 
        195                 200                 205             
 
 
Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly 
    210                 215                 220                 
 
 
Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp 
225                 230                 235                 240 
 
 
Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg 
                245                 250                 255     
 
 
Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser 
            260                 265                 270         
 
 
His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp 
        275                 280                 285             
 
 
Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro 
    290                 295                 300                 
 
 
Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe 
305                 310                 315                 320 
 
 
Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser 
                325                 330                 335     
 
 
Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg 
            340                 345                 350         
 
 
Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys 
        355                 360                 365             
 
 
Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu 
    370                 375                 380                 
 
 
Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys 
385                 390                 395                 400 
 
 
Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly 
                405                 410                 415     
 
 
Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala 
            420                 425                 430         
 
 
Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val 
        435                 440                 445             
 
 
Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser 
    450                 455                 460                 
 
 
Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His 
465                 470                 475                 480 
 
 
Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu 
                485                 490                 495     
 
 
Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser 
            500                 505                 510         
 
 
Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile 
        515                 520                 525             
 
 
Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg 
    530                 535                 540                 
 
 
Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly 
545                 550                 555                 560 
 
 
Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly 
                565                 570                 575     
 
 
Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala 
            580                 585                 590         
 
 
Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser 
        595                 600                 605             
 
 
Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp 
    610                 615                 620                 
 
 
Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe 
625                 630                 635                 640 
 
 
Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser 
                645                 650                 655     
 
 
Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg 
            660                 665                 670         
 
 
Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val 
        675                 680                 685             
 
 
Ala Gly Ile Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu 
    690                 695                 700                 
 
 
Ala Cys Glu Phe Leu Arg Lys 
705                 710     
 
 
<210>  9
<211>  585
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  HSA
 
<400>  9
 
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 
1               5                   10                  15      
 
 
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 
            20                  25                  30          
 
 
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 
        35                  40                  45              
 
 
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 
    50                  55                  60                  
 
 
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 
65                  70                  75                  80  
 
 
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 
                85                  90                  95      
 
 
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 
            100                 105                 110         
 
 
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 
        115                 120                 125             
 
 
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 
    130                 135                 140                 
 
 
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 
145                 150                 155                 160 
 
 
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 
                165                 170                 175     
 
 
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 
            180                 185                 190         
 
 
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 
        195                 200                 205             
 
 
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 
    210                 215                 220                 
 
 
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 
225                 230                 235                 240 
 
 
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 
                245                 250                 255     
 
 
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 
            260                 265                 270         
 
 
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 
        275                 280                 285             
 
 
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 
    290                 295                 300                 
 
 
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 
305                 310                 315                 320 
 
 
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 
                325                 330                 335     
 
 
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 
            340                 345                 350         
 
 
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 
        355                 360                 365             
 
 
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 
    370                 375                 380                 
 
 
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 
385                 390                 395                 400 
 
 
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 
                405                 410                 415     
 
 
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 
            420                 425                 430         
 
 
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 
        435                 440                 445             
 
 
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 
    450                 455                 460                 
 
 
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 
465                 470                 475                 480 
 
 
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 
                485                 490                 495     
 
 
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 
            500                 505                 510         
 
 
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 
        515                 520                 525             
 
 
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 
    530                 535                 540                 
 
 
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 
545                 550                 555                 560 
 
 
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 
                565                 570                 575     
 
 
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 
            580                 585 
 
 
<210>  10
<211>  28
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  primer
 
<400>  10
cggaattcat gaagtgggta acctttat                                          28
 
 
<210>  11
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  primer
 
<400>  11
ccgctcgagt aagcctaagg cagcttgac                                         29
 
 
<210>  12
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  primer
 
<400>  12
ctcgagatgg gccgtagga                                                    19
 
 
<210>  13
<211>  28
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  primer
 
<400>  13
gcggccgctt acttcctgag gaactcac                                          28
 
 
<210>  14
<211>  1304
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  HSA-hLF fusion protein
 
<400>  14
 
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 
1               5                   10                  15      
 
 
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 
            20                  25                  30          
 
 
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 
        35                  40                  45              
 
 
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 
    50                  55                  60                  
 
 
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 
65                  70                  75                  80  
 
 
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 
                85                  90                  95      
 
 
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 
            100                 105                 110         
 
 
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 
        115                 120                 125             
 
 
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 
    130                 135                 140                 
 
 
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 
145                 150                 155                 160 
 
 
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 
                165                 170                 175     
 
 
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 
            180                 185                 190         
 
 
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 
        195                 200                 205             
 
 
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 
    210                 215                 220                 
 
 
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 
225                 230                 235                 240 
 
 
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 
                245                 250                 255     
 
 
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 
            260                 265                 270         
 
 
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 
        275                 280                 285             
 
 
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 
    290                 295                 300                 
 
 
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 
305                 310                 315                 320 
 
 
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser 
                325                 330                 335     
 
 
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 
            340                 345                 350         
 
 
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 
        355                 360                 365             
 
 
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 
    370                 375                 380                 
 
 
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 
385                 390                 395                 400 
 
 
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 
                405                 410                 415     
 
 
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 
            420                 425                 430         
 
 
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 
        435                 440                 445             
 
 
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 
    450                 455                 460                 
 
 
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 
465                 470                 475                 480 
 
 
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 
                485                 490                 495     
 
 
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 
            500                 505                 510         
 
 
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 
        515                 520                 525             
 
 
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 
    530                 535                 540                 
 
 
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 
545                 550                 555                 560 
 
 
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 
                565                 570                 575     
 
 
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 
            580                 585                 590         
 
 
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 
        595                 600                 605             
 
 
Leu Leu Glu Met Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val 
    610                 615                 620                 
 
 
Ser Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg 
625                 630                 635                 640 
 
 
Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile 
                645                 650                 655     
 
 
Gln Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu 
            660                 665                 670         
 
 
Asp Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg 
        675                 680                 685             
 
 
Pro Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His 
    690                 695                 700                 
 
 
Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn 
705                 710                 715                 720 
 
 
Glu Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala 
                725                 730                 735     
 
 
Gly Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr 
            740                 745                 750         
 
 
Gly Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala 
        755                 760                 765             
 
 
Ser Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg 
    770                 775                 780                 
 
 
Leu Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu 
785                 790                 795                 800 
 
 
Pro Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala 
                805                 810                 815     
 
 
Gly Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser 
            820                 825                 830         
 
 
Asp Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr 
        835                 840                 845             
 
 
Arg Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro 
    850                 855                 860                 
 
 
Ser His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile 
865                 870                 875                 880 
 
 
Trp Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser 
                885                 890                 895     
 
 
Pro Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu 
            900                 905                 910         
 
 
Phe Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp 
        915                 920                 925             
 
 
Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu 
    930                 935                 940                 
 
 
Arg Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp 
945                 950                 955                 960 
 
 
Cys Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly 
                965                 970                 975     
 
 
Leu Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp 
            980                 985                 990         
 
 
Cys Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly  Glu Ala Asp Ala Met  Ser Leu Asp 
        995                 1000                 1005             
 
 
Gly Gly  Tyr Val Tyr Thr Ala  Gly Lys Cys Gly Leu  Val Pro Val 
    1010                 1015                 1020             
 
 
Leu Ala  Glu Asn Tyr Lys Ser  Gln Gln Ser Ser Asp  Pro Asp Pro 
    1025                 1030                 1035             
 
 
Asn Cys  Val Asp Arg Pro Val  Glu Gly Tyr Leu Ala  Val Ala Val 
    1040                 1045                 1050             
 
 
Val Arg  Arg Ser Asp Thr Ser  Leu Thr Trp Asn Ser  Val Lys Gly 
    1055                 1060                 1065             
 
 
Lys Lys  Ser Cys His Thr Ala  Val Asp Arg Thr Ala  Gly Trp Asn 
    1070                 1075                 1080             
 
 
Ile Pro  Met Gly Leu Leu Phe  Asn Gln Thr Gly Ser  Cys Lys Phe 
    1085                 1090                 1095             
 
 
Asp Glu  Tyr Phe Ser Gln Ser  Cys Ala Pro Gly Ser  Asp Pro Arg 
    1100                 1105                 1110             
 
 
Ser Asn  Leu Cys Ala Leu Cys  Ile Gly Asp Glu Gln  Gly Glu Asn 
    1115                 1120                 1125             
 
 
Lys Cys  Val Pro Asn Ser Asn  Glu Arg Tyr Tyr Gly  Tyr Thr Gly 
    1130                 1135                 1140             
 
 
Ala Phe  Arg Cys Leu Ala Glu  Asn Ala Gly Asp Val  Ala Phe Val 
    1145                 1150                 1155             
 
 
Lys Asp  Val Thr Val Leu Gln  Asn Thr Asp Gly Asn  Asn Asn Glu 
    1160                 1165                 1170             
 
 
Ala Trp  Ala Lys Asp Leu Lys  Leu Ala Asp Phe Ala  Leu Leu Cys 
    1175                 1180                 1185             
 
 
Leu Asp  Gly Lys Arg Lys Pro  Val Thr Glu Ala Arg  Ser Cys His 
    1190                 1195                 1200             
 
 
Leu Ala  Met Ala Pro Asn His  Ala Val Val Ser Arg  Met Asp Lys 
    1205                 1210                 1215             
 
 
Val Glu  Arg Leu Lys Gln Val  Leu Leu His Gln Gln  Ala Lys Phe 
    1220                 1225                 1230             
 
 
Gly Arg  Asn Gly Ser Asp Cys  Pro Asp Lys Phe Cys  Leu Phe Gln 
    1235                 1240                 1245             
 
 
Ser Glu  Thr Lys Asn Leu Leu  Phe Asn Asp Asn Thr  Glu Cys Leu 
    1250                 1255                 1260             
 
 
Ala Arg  Leu His Gly Lys Thr  Thr Tyr Glu Lys Tyr  Leu Gly Pro 
    1265                 1270                 1275             
 
 
Gln Tyr  Val Ala Gly Ile Thr  Asn Leu Lys Lys Cys  Ser Thr Ser 
    1280                 1285                 1290             
 
 
Pro Leu  Leu Glu Ala Cys Glu  Phe Leu Arg Lys 
    1295                 1300                 
 
 
<210>  15
<211>  609
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  HSA plus signal sequence
 
<400>  15
 
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 
1               5                   10                  15      
 
 
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 
            20                  25                  30          
 
 
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 
        35                  40                  45              
 
 
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 
    50                  55                  60                  
 
 
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 
65                  70                  75                  80  
 
 
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 
                85                  90                  95      
 
 
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 
            100                 105                 110         
 
 
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 
        115                 120                 125             
 
 
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 
    130                 135                 140                 
 
 
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 
145                 150                 155                 160 
 
 
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 
                165                 170                 175     
 
 
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 
            180                 185                 190         
 
 
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 
        195                 200                 205             
 
 
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 
    210                 215                 220                 
 
 
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 
225                 230                 235                 240 
 
 
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 
                245                 250                 255     
 
 
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 
            260                 265                 270         
 
 
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 
        275                 280                 285             
 
 
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 
    290                 295                 300                 
 
 
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 
305                 310                 315                 320 
 
 
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser 
                325                 330                 335     
 
 
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 
            340                 345                 350         
 
 
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 
        355                 360                 365             
 
 
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 
    370                 375                 380                 
 
 
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 
385                 390                 395                 400 
 
 
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 
                405                 410                 415     
 
 
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 
            420                 425                 430         
 
 
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 
        435                 440                 445             
 
 
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 
    450                 455                 460                 
 
 
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 
465                 470                 475                 480 
 
 
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 
                485                 490                 495     
 
 
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 
            500                 505                 510         
 
 
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 
        515                 520                 525             
 
 
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 
    530                 535                 540                 
 
 
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 
545                 550                 555                 560 
 
 
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 
                565                 570                 575     
 
 
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 
            580                 585                 590         
 
 
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 
        595                 600                 605             
 
 
Leu 
    
 
 
<210>  16
<211>  692
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  hLF
 
<400>  16
 
Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser Gln Pro Glu 
1               5                   10                  15      
 
 
Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly 
            20                  25                  30          
 
 
Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln Cys Ile Gln 
        35                  40                  45              
 
 
Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Gly Gly Phe 
    50                  55                  60                  
 
 
Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro Val Ala Ala 
65                  70                  75                  80  
 
 
Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr Tyr Ala Val 
                85                  90                  95      
 
 
Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu Leu Gln Gly 
            100                 105                 110         
 
 
Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly Trp Asn Val 
        115                 120                 125             
 
 
Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly Pro Pro Glu 
    130                 135                 140                 
 
 
Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser Cys Val Pro 
145                 150                 155                 160 
 
 
Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu Cys Ala Gly 
                165                 170                 175     
 
 
Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro Tyr Phe Ser 
            180                 185                 190         
 
 
Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala 
        195                 200                 205             
 
 
Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp Glu Ala Glu 
    210                 215                 220                 
 
 
Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val 
225                 230                 235                 240 
 
 
Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser His Ala Val 
                245                 250                 255     
 
 
Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp Asn Leu Leu 
            260                 265                 270         
 
 
Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro Lys Phe Gln 
        275                 280                 285             
 
 
Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser 
    290                 295                 300                 
 
 
Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser Gly Leu Tyr 
305                 310                 315                 320 
 
 
Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg Lys Ser Glu 
                325                 330                 335     
 
 
Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys Ala Val Gly 
            340                 345                 350         
 
 
Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu Ser Glu Gly 
        355                 360                 365             
 
 
Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Leu 
    370                 375                 380                 
 
 
Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Val 
385                 390                 395                 400 
 
 
Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr 
                405                 410                 415     
 
 
Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val Asp Arg Pro 
            420                 425                 430         
 
 
Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser Asp Thr Ser 
        435                 440                 445             
 
 
Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val 
    450                 455                 460                 
 
 
Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu Phe Asn Gln 
465                 470                 475                 480 
 
 
Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser Cys Ala Pro 
                485                 490                 495     
 
 
Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile Gly Asp Glu 
            500                 505                 510         
 
 
Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg Tyr Tyr Gly 
        515                 520                 525             
 
 
Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala 
    530                 535                 540                 
 
 
Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly Asn Asn Asn 
545                 550                 555                 560 
 
 
Glu Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala Leu Leu Cys 
                565                 570                 575     
 
 
Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser Cys His Leu 
            580                 585                 590         
 
 
Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp Lys Val Glu 
        595                 600                 605             
 
 
Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe Gly Arg Asn 
    610                 615                 620                 
 
 
Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser Glu Thr Lys 
625                 630                 635                 640 
 
 
Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg Leu His Gly 
                645                 650                 655     
 
 
Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val Ala Gly Ile 
            660                 665                 670         
 
 
Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu Ala Cys Glu 
        675                 680                 685             
 
 
Phe Leu Arg Lys 
    690         

Claims (17)

  1. 　（1）ヒト血清アルブミン（HSA）又はヒト血清アルブミンの断片もしくはペプチドと、
    　（2）ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとの融合タンパク質であって、
    　（LF-s-Y）n　又は　（Y-s-LF）n
    　〔式中、LFはラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチド、Yはヒト血清アルブミンもしくはヒト血清アルブミンの断片を含むタンパク質又はペプチド、sは0～10個の任意のアミノ酸の配列、nは1～10の整数を表す〕
    で表される融合タンパク質、又はその改変体。
  2. 　（LF-s-Y）n
    で表される請求項1に記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  3. （Y-s-LF）n
    で表される請求項1に記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  4. 　SEQ ID NO: 7に示すアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  5. 　SEQ ID NO: 14に示すアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  6. 　前記融合タンパク質又はその改変体が、天然又は遺伝子組換え型ラクトフェリンの50％以上の鉄キレート能を保持している、請求項1～5のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  7. 　前記融合タンパク質又はその改変体は、ラクトフェリン受容体及びアルブミン受容体からなる群より選択される少なくとも1つの受容体を介して細胞に取り込まれるものである、請求項1～6のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  8. 　前記融合タンパク質又はその改変体が、天然又は遺伝子組換え型ラクトフェリンと比べてペプシン耐性が向上したものである、請求項1～7のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  9. 　請求項1～8のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はその改変体をコードする核酸分子。
  10. 　請求項9記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  11. 　請求項10記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  12. 　請求項9記載の核酸分子を含む非ヒト遺伝子組換え動物。
  13. 　請求項1～8のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はその改変体によって改善される疾患の治療剤。
  14. 　請求項1～8のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はその改変体及び担体を含む、医薬組成物。
  15. 　腫瘍の治療のための、請求項14に記載の医薬組成物。
  16. 　前記腫瘍が肺癌である、請求項15に記載の医薬組成物。
  17. 　請求項1～8のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はその改変体の製造方法であって、この融合タンパク質又はその改変体をコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養して融合タンパク質を発現させ、この宿主細胞又はその培地から融合タンパク質又はその改変体を回収することを含む方法。
     
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