JP6927993B2 - リムルス属由来の組換え蛋白質及びこれをコードするdna - Google Patents
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Description
[1]
以下のいずれかである組換え蛋白質等の組換え第1蛋白質。
(A)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
[2]
以下のいずれかである組換え蛋白質等の組換え第2蛋白質。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
[3]
以下のいずれかである組換え蛋白質等の組換え第3蛋白質。
(A)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
[1−1]
B因子活性を有する蛋白質(例えば以下の蛋白質等の第2蛋白質)を活性化するための、組換え第1蛋白質の使用。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
[1−1−1]
第2蛋白質が、組換え第2蛋白質である、[1−1]記載の使用。
[2−1]
プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質(例えば以下の蛋白質等の第3蛋白質)を活性化するための、組換え第2蛋白質の使用。
(A)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(D)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
[2−1−1]
第3蛋白質が、組換え第3蛋白質である、[2−1]記載の使用。
[3−1]
基質を切断するための、組換え第3蛋白質の使用。
[3−1−1]
基質が、合成基質である、[3−1]記載の使用。
[1−2]
組換え第1蛋白質を検体と接触させるステップを含む、検体中のエンドトキシンの検出方法。
[1−2−1]
検体と接触した組換え第1蛋白質を、第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質と接触させるステップを更に含む、[1−2]記載の方法。
[1−2−1−1]
第2蛋白質が、組換え第2蛋白質である、[1−2−1]記載の方法。
[1−2−2]
「検体と接触した組換え第1蛋白質」と接触したB因子活性を有する蛋白質を、第3蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質と接触させるステップを更に含む、[1−2−1]又は[1−2−1−1]記載の方法。
[1−2−2−1]
第3蛋白質が、組換え第3蛋白質である、[1−2−2]記載の方法。
[1−2−3]
「検体と接触した組換え第1蛋白質と接触したB因子活性を有する蛋白質」と接触したプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を、検出用基質と接触させるステップを更に含む、[1−2−2]又は[1−2−2−1]記載の方法。
[1−3]
組換え第1蛋白質を含む、エンドトキシン検出剤。
[1−3−1]
第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質を更に含む、[1−3]記載の剤。
[1−3−1−1]
第2蛋白質が、組換え第2蛋白質である、[1−3−1]記載の剤。
[1−3−2]
第3蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を更に含む、[1−3−1]又は[1−3−1−1]記載の剤。
[1−3−2−1]
第3蛋白質が、組換え第3蛋白質である、[1−3−2]記載の剤。
[1−4]
以下のいずれかであるcDNA(以下「第1cDNA」ともいう)。
(A)配列番号1または3で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
[1−4−1]
第1cDNAを含むDNA構築物。
[1−4−2]
[1−4−1]記載のDNA構築物で形質転換されて組換え第1蛋白質を発現する細胞。
[1−4−3]
[1−4−2]記載の細胞を培養するステップを含む、組換え第1蛋白質の生産方法。
[2−4]
以下のいずれかであるcDNA(以下「第2cDNA」ともいう)。
(A)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
[2−4−1]
第2cDNAを含むDNA構築物。
[2−4−2]
[2−4−1]記載のDNA構築物で形質転換されて組換え第2蛋白質を発現する細胞。
[2−4−3]
[2−4−2]記載の細胞を培養するステップを含む、組換え第2蛋白質の生産方法。
[3−4]
以下のいずれかであるcDNA(以下「第3cDNA」ともいう)。
(A)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
[3−4−1]
第3cDNAを含むDNA構築物。
[3−4−2]
[3−4−1]記載のDNA構築物で形質転換されて組換え第3蛋白質を発現する細胞。
[3−4−3]
[3−4−2]記載の細胞を培養するステップを含む、組換え第3蛋白質の生産方法。
[1−5]
第1cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを含む、エンドトキシン検出剤の製造方法。
[1−5−1]
第2cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを更に含む、[1−5]記載の製造方法。
[1−5−2]
第3cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを更に含む、[1−5−1]記載の製造方法。
(1)組換え第1蛋白質
組換え第1蛋白質は、C因子活性を有する組換え蛋白質である。
(I)リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(A)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する組換え蛋白質。
組換え第1蛋白質は、その完全なアミノ酸配列が本発明によって初めて開示されたので、例えば、この配列をコードするDNAを用いて、遺伝子工学的手法により製造することができる。組換え第1蛋白質を遺伝子工学的手法により製造する方法は特に制限されず、例えば、蛋白質を遺伝子工学的手法により製造する通常の方法を採用できる。組換え第1蛋白質は、例えば、異種発現系や無細胞蛋白質合成系を利用して製造することができる。
組換え第2蛋白質は、B因子活性を有する組換え蛋白質である。
(I)リムルス・ポリフェムスのB因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する組換え蛋白質。
組換え第3蛋白質は、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質である。
(I)リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(A)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む組換え蛋白質。
(B)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
(D)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する組換え蛋白質。
組換え第1蛋白質は、第2蛋白質等のB因子活性を有する蛋白質を活性化するために使用することができる。換言すれば、本発明は、組換え第1蛋白質をB因子活性を有する蛋白質と接触させるステップを含む、B因子活性を有する蛋白質の活性化方法を包含する。
(I)リムルス・ポリフェムスのB因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、B因子活性を有する蛋白質。
(A)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(D)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、B因子活性を有する蛋白質。
(III)リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニのB因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(IV)前記(III)のバリアントであって、B因子活性を有する蛋白質。
組換え第2蛋白質は、第3蛋白質等のプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質を活性化するために使用することができる。換言すれば、本発明は、組換え第2蛋白質をプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質と接触させるステップを含む、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質の活性化方法を包含する。
(I)リムルス・ポリフェムスのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(A)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(D)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(III)リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニのプロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(IV)前記(III)のバリアントであって、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質。
(I)リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(II)前記(I)のバリアントであって、C因子活性を有する蛋白質。
(A)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
(B)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含むDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する蛋白質。
(D)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、C因子活性を有する蛋白質。
(III)リムルス・ポリフェムス以外のカブトガニのC因子活性を有する蛋白質のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(IV)前記(III)のバリアントであって、C因子活性を有する蛋白質。
組換え第3蛋白質は、基質を切断するために使用することができる。換言すれば、本発明は、組換え第3蛋白質を基質と接触させるステップを含む、基質の切断方法を包含する。
本発明のエンドトキシンンの検出方法は、組換え第1蛋白質を検体と接触させるステップを含む、検体中のエンドトキシンの検出方法である。
本発明のエンドトキシン検出剤は、組換え第1蛋白質を含む、エンドトキシン検出剤である。
(1)第1cDNA
第1cDNAは、以下のいずれかであるcDNAである。
(A)配列番号1または3で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号1または3で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
本発明は、第1cDNAを含むDNA構築物を提供する。このような人工のDNA構築物としては、例えば、ベクターを例示することができる。ベクターとしては、組換えDNAの増幅、維持、導入、ライブラリー作製、クローニング、蛋白質翻訳(蛋白質発現)などの目的に応じて、プラスミド、ウイルス、その他の公知のベクターを適宜選択することができる。このようなベクター等に第1cDNAを導入することにより、第1cDNAを含むDNA構築物を製造することができる。
(1)第2cDNA
第2cDNAは、以下のいずれかであるcDNAである。
(A)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号5、7、9、または11で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号6、8、10、または12で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、B因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
本発明は、第2cDNAを含むDNA構築物を提供する。また本発明は、このようなDNA構築物で形質転換されて組換え第2蛋白質を発現する細胞等の第2cDNAを含む細胞を提供する。また本発明は、このような細胞を培養するステップを含む、組換え第2蛋白質の生産方法を提供する。
(1)第3cDNA
第3cDNAは、以下のいずれかである第3cDNAである。
(A)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列を含むcDNA。
(B)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(C)配列番号13、15、17、19、または21で表される塩基配列の相補配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
(D)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするcDNA。
(E)配列番号14、16、18、20、または22で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイム活性を有する蛋白質をコードするcDNA。
本発明は、第3cDNAを含むDNA構築物を提供する。また本発明は、このようなDNA構築物で形質転換されて組換え第3蛋白質を発現する細胞等の第3cDNAを含む細胞を提供する。また本発明は、このような細胞を培養するステップを含む、組換え第3蛋白質の生産方法を提供する。
本発明は、第1cDNAを用いて人工的に蛋白質を発現させるステップを含む、エンドトキシン検出剤の製造方法も提供する。
リムルス・ポリフェムスにおけるC因子活性を有する蛋白質のクローニングを試みるため、下記の各プライマーを合成した。
SK15-dT20: CTGCAGGAATTCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(配列番号24)
SK15-FC-S: ATCGATAAGCTTGATGATCTGGGCTTGTGTGATGA(配列番号25)
SK15-As: CTGCAGGAATTCGAT(配列番号26)
LFC-5race: CTACACCAAGTTCCA(配列番号27)
LFC-1st-S: GTAAACCATGTGACAAACTGGAGGC(配列番号28)
LFC-1st-As: AATAAGGCCTCCATCGATAGAAGTA(配列番号29)
LFC-EcoRI-kozak-S: GGGGAATTCAAGCTTGCCACCATGGTACTAGCGTCGTTC(配列番号30)
LFC-XhoI-stop-As: GGGCTCGAGTCAAATGAACTGCCGAATCCACGATA(配列番号31)
SK15-FB-S: ATCGATAAGCTTGATCACATGCAAGGAAAAGTTCT(配列番号32)
SK15-FB-As: CTGCAGGAATTCGATCACTGTTTAAACAAACTGAA(配列番号33)
SK15-PCE-S: ATCGATAAGCTTGATAGACCAGAGTGGTCTTTCTG(配列番号34)
SK15-As: CTGCAGGAATTCGAT(配列番号26)
トータルRNAの調製は、PureLink(登録商標) RNA Mini KitとPureLink(登録商標) DNase kit (Thermo Fisher Scientific)を使用し、基本的操作は添付の説明書に従った。リムルス・ポリフェムスの血球細胞プール2.23gにTRIzol溶液を添加して細胞を破砕した。その後、これにクロロホルムを添加して遠心分離し、水層を得た。得られた水層にエタノールを添加した後、これをキットに添付のシリカ膜カートリッジに通すことで、核酸成分をシリカ膜に結合させた。このシリカ膜にキット添付のDNase Iを加えてDNAを分解し、カートリッジを洗浄後、溶出バッファーを添加して、トータルRNA(1.3mg)を回収した。
(3−1)第1ステップ
前記(2)で回収したトータルRNAを鋳型として、SK15-d20(配列番号24)をプライマーとして用いた逆転写反応を行い、cDNAを得た。本プライマーはmRNAのポリA配列に選択的に結合するように設計され、更にその外側にポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR)に利用可能な付加配列を有している。本反応では逆転写酵素としてSuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) を用い、反応条件は添付の説明書に従った。
得られたcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてSK15-FC-S(配列番号25)、アンチセンスプライマーとしてSK15-As(配列番号26)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。
LpFC1の存在が予想された部分をゲルから切り出して、DNAを抽出、精製した。これを鋳型として、センスプライマーとしてSK15-FC-S(配列番号25)、アンチセンスプライマーとしてSK15-As(配列番号26)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。
LpFC1をEcoRV酵素処理したpBluescript II SK (+) と混合し、In-Fusion HD Enzyme premix(タカラバイオ)を用いて組換え反応によりベクターへの導入を行った。反応物をE. coli DH5α competent cellに形質転換し、X-Gal、IPTGを含むアンピシリンLB培地プレートに塗布して、ブルーホワイトスクリーニングによるコロニーの選定を行った。
LpFC1の配列情報を参考に作製した合成DNA LFC-5race(配列番号27)の5’末端を、ATP存在下でT4 Polynucleotide Kinase(タカラバイオ)によりリン酸化した。前記のトータルRNAを鋳型とし、得られたリン酸化プライマーと逆転写酵素SuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) を用いた逆転写反応により、目的とするDNA(LpFC2)を得た。これにより、リムルス・ポリフェムスのC因子活性を有する蛋白質の一部分を含むアミノ酸配列をコードしている可能性があるDNAの部分断片(LpFC2)を得た。
LpFC4の存在が予想される部分をゲルから切り出して、DNAを抽出、精製した。これを鋳型として、センスプライマーとしてLFC-1st-S(配列番号28)、アンチセンスプライマーとしてLFC-1st-As(配列番号29)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。
前記(3−1)で得たcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてLFC-EcoRI-kozak-S(配列番号30)、アンチセンスプライマーとしてLFC-XhoI-stop-As(配列番号31)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。
前記(3−1)で得たcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてSK15-FB-S(配列番号32)、アンチセンスプライマーとしてSK15-FB-As(配列番号33)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。増幅した断片を前記(3−4)と同じ手順でクローニングし、得られた4種のクローンについて各々の塩基配列を解析した。
前記(3−1)で得たcDNAを鋳型とし、センスプライマーとしてSK15-PCE-S(配列番号34)、アンチセンスプライマーとしてSK15-As(配列番号26)、ポリメラーゼとしてTks Gflex DNA polymerase(タカラバイオ)を用いてPCRを行った。増幅した断片を前記(3−4)と同じ手順でクローニングし、得られた5種のクローンについて各々の塩基配列を解析した。
前記(5)で得たcDNA(配列番号13)を、哺乳類細胞での蛋白質発現用ベクターpCA7につなぎ、発現プラスミドを得た。前記(4)で得たcDNA(配列番号5)は、文献(Kobayashi et al., 2015, J Biol Chem, 290:19379-19386)に従い、蛋白質発現用ベクターpCA7につなぎ、発現プラスミドを得た。これらの発現プラスミドおよび前記(3−7)で得られた発現プラスミド(配列番号1のcDNAが組み込まれたもの)と、ExpiCHOTM Expression System(Thermo Fisher Scientific)を使い、培養上清画分として各々の組換え蛋白質を得た。
50mMトリス緩衝液(pH8.0)、合成基質(Boc-LGR-pNA)の存在下で、前記(6)で得た3種類の組換え蛋白質の種々の組合せについて、米国薬局方標準エンドトキシン(USP-RSE。生化学工業株式会社)(0EU/mL、0.05EU/mL。EUはエンドトキシン単位)を検体として、エンドトキシンに依存した3種の組換え蛋白質の活性化を調べた。この反応は37℃で30分間行った。
リムルス・ポリフェムス由来の組換えC因子(以下「LFC」)と、タキプレウス属由来の組換えC因子(以下「TFC」)との活性を比較した。
配列番号1:第1cDNAの塩基配列
配列番号2:第1蛋白質のアミノ酸配列
配列番号3:第1cDNA−バリアント1の塩基配列
配列番号4:第1蛋白質−バリアント1のアミノ酸配列
配列番号5:第2cDNAの塩基配列
配列番号6:第2蛋白質のアミノ酸配列
配列番号7:第2cDNA−バリアント1の塩基配列
配列番号8:第2蛋白質−バリアント1のアミノ酸配列
配列番号9:第2cDNA−バリアント2の塩基配列
配列番号10:第2蛋白質−バリアント2のアミノ酸配列
配列番号11:第2cDNA−バリアント3の塩基配列
配列番号12:第2蛋白質−バリアント3のアミノ酸配列
配列番号13:第3cDNAの塩基配列
配列番号14:第3蛋白質のアミノ酸配列
配列番号15:第3cDNA−バリアント1の塩基配列
配列番号16:第3蛋白質−バリアント1のアミノ酸配列
配列番号17:第3cDNA−バリアント2の塩基配列
配列番号18:第3蛋白質−バリアント2のアミノ酸配列
配列番号19:第3cDNA−バリアント3の塩基配列
配列番号20:第3蛋白質−バリアント3のアミノ酸配列
配列番号21:第3cDNA−バリアント4の塩基配列
配列番号22:第3蛋白質−バリアント4のアミノ酸配列
配列番号23:合成基質ペプチドIEGR
配列番号24〜34:プライマー
Claims (4)
- エンドトキシン検出剤の製造方法であって、
以下(A)または(B)のいずれかであるcDNAを含むDNA構築物を用いて細胞を形質転換すること、および
形質転換された前記細胞を培養することで、当該cDNAにコードされる蛋白質を人工的に細胞に発現させることを含み:
(A)配列番号1または3で表される塩基配列を含むcDNA;
(B)配列番号1または3で表される塩基配列に対して95%以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA;
前記蛋白質が以下(1)または(2)のいずれかである、製造方法:
(1)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(2)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、C因子活性を有する蛋白質。 - エンドトキシン検出剤の製造方法であって、
以下(D)または(E)のいずれかであるcDNAを含むDNA構築物を用いて細胞を形質転換すること、および
形質転換された前記細胞を培養することで、当該cDNAにコードされる蛋白質を人工的に細胞に発現させることを含む、製造方法:
(D)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするcDNA;
(E)配列番号2または4で表されるアミノ酸配列に対して95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、C因子活性を有する蛋白質をコードするcDNA。 - 前記細胞が、哺乳類細胞または昆虫細胞である、請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記細胞の培養液、培養上清、細胞破砕抽出物、またはそれらの混合物を回収することを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
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