WO2018038267A1 - ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子及びポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の製造方法 - Google Patents

ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子及びポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の製造方法 Download PDF

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glycolide copolymer
drug
polylactide glycolide
nanoparticles
ferulic acid
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榎村　眞一
宏太郎 福田
望嘉 尾形
綾乃 金城
英樹 池元
タケル 松尾
敏夫 原
秀孝 森永
晋吾 葛西
和代 ジャークス
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株式会社 先端医療開発
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    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing polylactide glycolide copolymer nanoparticles and polylactide glycolide copolymer nanoparticles.
  • DDS Drug delivery system
  • PLGA polylactide glycolide copolymer
  • Patent Document 1 a mixture of acetone and ethanol as a good solvent solution in which at least a drug and PLGA are dissolved is added to a polyvinyl alcohol aqueous solution as a poor solvent, and the PLGA nanoparticle formulation encapsulating the drug A method of generating is disclosed.
  • Patent Document 2 discusses stabilization of a liquid composition in which PLGA nanoparticles containing a drug are dispersed in a dispersion.
  • the method for producing PLGA nanoparticles disclosed in Patent Document 1 and Patent Document 2 is a batch system employing an underwater emulsion method (ESD method). For this reason, it was difficult to obtain a PLGA nanoparticle formulation having a uniform particle size due to the temperature gradient and concentration gradient in the reaction vessel. Furthermore, in the method disclosed in the above-mentioned Patent Document 1, it is necessary to make the concentration of PLGA containing a good solvent or poor solvent or PLGA containing a drug contained within a predetermined concentration or less.
  • ESD method underwater emulsion method
  • the particle size distribution in the dispersion varies, and it is difficult to increase the drug content in the PLGA nanoparticles. For this reason, there existed inconveniences that the absorption efficiency of the medicine to the living body was low.
  • nanoparticles produced by the conventional batch method often become coarse, coalesced or aggregated when freeze-dried.
  • the dispersibility that is, the uniformity of the nanoparticles is not high, it is difficult to control the absorption efficiency into the living body.
  • Patent Document 3 discloses a method for producing nanoparticles using processing surfaces disposed opposite to each other.
  • a thin film fluid is formed between the processing surfaces by rotating at least one of the processing surfaces with respect to the other.
  • Patent Document 3 Although there is a suggestion regarding the PLGA nanoparticles in the above-mentioned Patent Document 3, there is no indication regarding the point of including the drug in PLGA. Moreover, the above Patent Document 3 does not discuss how to make the particle diameter of the PLGA nanoparticles encapsulating the drug uniform.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a PLGA nanoparticle having a more uniform particle size of the PLGA nanoparticle and increasing the drug content, and a method for producing the PLGA nanoparticle. For the purpose.
  • the polylactide glycolide copolymer nanoparticles according to the first aspect of the present invention are: A polylactide glycolide copolymer nanoparticle encapsulating a drug, The drug content is It is 20 weight% or more with respect to the weight of the said polylactide glycolide copolymer nanoparticle.
  • the value of D 50 of the polylactide glycolide copolymer nanoparticles is: 200 nm or less
  • the span value of the particle size of the polylactide glycolide copolymer nanoparticles is: 2.0 or less, It is good as well.
  • the drug is Brown rice germ extract, ⁇ -oryzanol, ferulic acid, cycloartanol ferulic acid ester, 24-methylenecycloartanol ferulic acid ester, campesterol ferulic acid ester, ⁇ -sitosterol ferulic acid ester, 2-deoxy-D-glucose, Selected from the group consisting of indocyanine green and vitamin C; It is good as well.
  • the dissolution rate of the drug from the polylactide glycolide copolymer nanoparticles in intestinal fluid 20% by weight or more, It is good as well.
  • the amount of the drug absorbed into the blood via the digestive system when administered to a living body 5 times or more compared to the drug substance, It is good as well.
  • a precipitation step of precipitating polylactide glycolide copolymer nanoparticles encapsulating the drug in the thin film fluid including.
  • the concentration of the polylactide glycolide copolymer in the raw material solution is Higher than 0.6% by weight with respect to the weight of the raw material solution, It is good as well.
  • the pH of the thin film fluid is 6-8, It is good as well.
  • the pH of the aqueous emulsifier solution is Adjusted with sodium bicarbonate, It is good as well.
  • the emulsifier is Polyvinyl alcohol, It is good as well.
  • the drug is Brown rice germ extract, ⁇ -oryzanol, ferulic acid, cycloartanol ferulic acid ester, 24-methylenecycloartanol ferulic acid ester, campesterol ferulic acid ester, ⁇ -sitosterol ferulic acid ester, 2-deoxy-D-glucose, Selected from the group consisting of indocyanine green and vitamin C; It is good as well.
  • the particle size of PLGA nanoparticles is more uniform, and the drug content can be increased.
  • FIG. 2 is a graph showing the particle size distribution of PLGA nanoparticles obtained in Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing the appearance of PLGA nanoparticles obtained in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the particle size distribution of PLGA nanoparticles obtained in Example 2.
  • FIG. 6 is a diagram showing the appearance of PLGA nanoparticles obtained in Example 3.
  • FIG. 6 is a graph showing the particle size distribution of PLGA nanoparticles obtained in Example 3.
  • (A) is a graph showing changes over time in blood concentrations of components contained in ⁇ -oryzanol and ferulic acid in mice orally administered with the drug substance.
  • (B) is a graph showing changes over time in blood concentrations of components contained in ⁇ -oryzanol and ferulic acid in mice orally administered with PLGA nanoparticles containing a drug. It is a figure which shows the absorption amount in the blood of ferulic acid from the oral administration to the mouse
  • FIG. 6 is a graph showing the particle size distribution of PLGA nanoparticles obtained in Example 6.
  • FIG. 6 is a graph showing the particle size distribution of PLGA nanoparticles obtained in Example 7.
  • FIG. 6 is a graph showing the particle size distribution of PLGA nanoparticles obtained in Example 8.
  • FIG. (A) is a figure which shows the particle size distribution of the PLGA nanoparticle obtained by the rotation speed of the holder of a thin film rotary dispersion machine being 500 rpm.
  • (B) is a figure which shows the particle size distribution of the PLGA nanoparticle obtained at the said rotation speed of 1000 rpm.
  • (C) is a figure which shows the particle size distribution of the PLGA nanoparticle obtained at the said rotation speed of 3000 rpm.
  • the PLGA nanoparticles according to the present embodiment are particles mainly composed of PLGA.
  • PLGA is a lactic acid / glycolic acid copolymer, and is also called poly (lactic-co-glycolic acid).
  • the PLGA nanoparticles contain a drug.
  • the drug is not particularly limited as long as it is a composition, compound, synthetic product, natural product, peptide, protein, nucleic acid, or the like and has a medicinal effect when administered to a living body.
  • the drug is extracted from brown rice germ extract, ⁇ -oryzanol, ferulic acid, cycloartol FE, 24-methylenecycloartanol FE, campesterol FE, ⁇ -sitosterol FE, 2-deoxy-D-glucose (2 -DG), indocyanine green and vitamin C (VC).
  • Ferulic acid is a decomposition product of ⁇ -oryzanol.
  • Ferulic acid cycloartol FE, 24-methylenecycloartanol FE, campesterol FE and ⁇ -sitosterol FE are components contained in ⁇ -oryzanol.
  • the content of the drug is 20% by weight or more based on the weight of the PLGA nanoparticles.
  • the content is the weight of the drug relative to the weight of the PLGA nanoparticle calculated based on a value obtained by quantifying the concentration of the drug extracted from the PLGA nanoparticle.
  • the upper limit of the content of the drug is not particularly limited, for example, 90.0 wt% or less, 80.0 wt% or less, 70.0 wt% or less, 60.0 wt% or less, based on the weight of the PLGA nanoparticles, 50.0 wt% or less, 40.0 wt% or less, 30.0 wt% or less, 25.0 wt% or less, 23.0 wt% or less, 22.0 wt% or less, or 21.0 wt% or less .
  • the particle size of the PLGA nanoparticles is nano-order, for example, 1 to 1000 nm, 10 to 900 nm, preferably 1 to 500 nm, more preferably 1 to 200 nm.
  • the particle size of the PLGA nanoparticles can be measured by a screening method, a sedimentation method, a microscope method, a light scattering method, a laser diffraction / scattering method, an electrical resistance test, an observation with a transmission electron microscope, an observation with a scanning electron microscope, or the like.
  • the particle size may be measured with a known particle size distribution meter.
  • the particle diameter can be represented by a Stoke equivalent diameter, a circle equivalent diameter, or a sphere equivalent diameter depending on the measurement method.
  • the particle size may be an average particle size, a volume average particle size, an area average particle size, or the like represented by an average with a plurality of particles as a measurement target.
  • the average particle diameter is an average particle diameter calculated from a number distribution or the like based on a measurement such as a laser diffraction / scattering method.
  • a 50% diameter (D 50 ) that is a particle diameter at which the cumulative curve becomes 50% may be used as the particle diameter.
  • the value of D 50 of the PLGA nanoparticles is 1 to 1000 nm, 10 to 900 nm, preferably 20 to 500 nm, more preferably 50 to 300, and preferably 50 to 200 nm.
  • Cumulative curve and D 50 can be determined using a commercially available particle size distribution meter. Examples of the particle size distribution meter include NIKISO Nanotrac Wave-EX150 (manufactured by Nikkiso Co., Ltd.).
  • the span value of the particle size of the PLGA nanoparticles is 2.0 or less.
  • the span value is obtained by (D 90 -D 10 ) / D 50 .
  • D 90 is a 90% diameter which is the particle diameter at which the cumulative curve becomes 90%.
  • D 10 is 10% diameter is the particle size of the point where the cumulative curve becomes 10%.
  • D 90 and D 10 represent respectively the particle diameters can be determined using a commercially available particle size distribution meter.
  • the method for producing the PLGA nanoparticles includes a mixing step and a precipitation step.
  • an aqueous emulsifier solution (hereinafter simply referred to as “liquid A”) and a raw material solution (hereinafter simply referred to as “liquid B”) are mixed in a thin film fluid.
  • liquid A aqueous emulsifier solution
  • liquid B a raw material solution
  • a liquid is demonstrated.
  • the emulsifier dissolved in the liquid A is not particularly limited as long as it improves the dispersion stability of the particles.
  • the emulsifier is surfactant, polyethylene glycol, polyethylene oxide, polyvinyl pyrrolidone, water-soluble resin, lecithin, saponins, sterols, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, polyglycerin. Fatty acid esters and polysorbates.
  • the emulsifier is polyvinyl alcohol (hereinafter simply referred to as “PVA”).
  • PVA polyvinyl alcohol
  • Commercially available PVA can be used as the emulsifier.
  • PVA may be industrial or pharmaceutical, but preferably has little remaining organic solvent or no organic solvent.
  • the concentration of the emulsifier in the aqueous emulsifier solution is, for example, 0.1 to 3.0% by weight, 0.1 to 2.0% by weight, preferably 0.1 to 1.0% by weight, particularly preferably 0.5% by weight. It is.
  • the pH of the thin film fluid in which the liquid A and the liquid B are mixed is preferably 6-8. For this reason, the pH of the solution A is preferably adjusted to 7 to 8, for example.
  • the pH adjuster for adjusting the pH of the liquid A is arbitrary, but for example, alkali species such as sodium carbonate, calcium hydroxide, ammonia, sodium hydroxide and potassium hydroxide may be used. Moreover, citric acid, acetic acid, etc.
  • the pH adjuster is preferably sodium bicarbonate.
  • sodium bicarbonate may be added to the emulsifier aqueous solution so as to be 0.001 to 0.1% by weight, preferably 0.033 to 0.01% by weight.
  • stirring conditions are not specifically limited, For example, it is stirring for 60 minutes at 15000 rpm using the precision emulsification disperser CLEARMIX (M technique company make). If bubbles are generated in the liquid A after stirring, the bubbles may be removed by any method such as standing, reduced pressure, or increased pressure.
  • B liquid contains the organic solvent in which a chemical
  • the organic solvent is not particularly limited, but is preferably a solvent containing acetone and ethanol.
  • the drug and PLGA are dissolved in the solvent.
  • a drug and PLGA are added to acetone, dissolved using ultrasonic waves or CLEARMIX, and further ethanol is added and mixed.
  • the ratio of PLGA: drug is 1.5: 1 to 1: 7, 1.4: 1 to 1: 6, preferably 1.3: 1 to 1: 5.
  • the ratio of acetone: ethanol is 3: 1 to 1: 1, preferably 2: 1 to 1: 1.
  • the concentration of PLGA in the B liquid is arbitrary, but is preferably higher than 0.6% by weight with respect to the weight of the B liquid.
  • the upper limit of the PLGA concentration is not particularly limited, but is, for example, 10.0% by weight or less, 5.0% by weight or less, 1.0% by weight or less, or 0.8% by weight or less.
  • concentration of PLGA may be less than 0.1 weight% with respect to the weight of B liquid.
  • the liquid A and the liquid B are disposed so as to face each other, and at least one of them is introduced between the processing surfaces rotating relative to the other. Thereby, a thin film fluid is formed between the processing surfaces, and the A liquid and the B liquid are mixed.
  • the mixed liquid A and liquid B react in the thin film fluid to form PLGA nanoparticles containing the drug.
  • the PLGA nanoparticles are deposited in a thin film fluid.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of a thin film rotary disperser 100.
  • the thin-film rotary disperser 100 includes a holder 10, a holder 20, an introduction unit 30, a fluid pressure application unit 40, an introduction unit 50, a fluid supply unit 60, and a case 70.
  • the holder 10 is disposed below the holder 20.
  • the holder 10 and the holder 20 hold the processing unit 11 and the processing unit 21, respectively.
  • the processing unit 11 and the processing unit 21 are each annular (ring-shaped).
  • the processing unit 11 has a processing surface 1.
  • the processing unit 21 has a processing surface 2 that faces the processing surface 1.
  • a contact pressure applying unit 22 is disposed between the holder 20 and the processing unit 21, .
  • the contact surface pressure applying unit 22 applies the pressure to the processing unit 21 (hereinafter, simply referred to as “back pressure”) to cause the processing unit 21 to approach the lower processing unit 11. For this reason, the processing surface 1 and the processing surface 2 can be brought close to and away from each other.
  • the holder 10 is rotated relative to the holder 20 about the axis of the holder 10 by a motor.
  • the processing surfaces 1 disposed opposite to each other rotate relative to the processing surface 2.
  • the fluid pressure applying unit 40 is connected to the introduction unit 30.
  • Liquid A is supplied between the processing surface 1 and the processing surface 2 when the fluid pressure applying unit 40 including a compressor pressurizes the A liquid. More specifically, the liquid A is introduced into the space inside the holder 10 and the holder 20 from the introduction unit 30 by pressurization by the fluid pressure applying unit 40. Further, the A liquid passes between the processing surface 1 and the processing surface 2 and tends to escape to the outside of the holder 10 and the holder 20. At this time, the holder 20 that has received the pressure of the A liquid resists the back pressure and moves away from the holder 10. Thereby, a minute space is formed between the processing surface 1 and the processing surface 2.
  • the liquid A may be directly supplied from the introduction unit 30 between the processing surface 1 and the processing surface 2.
  • the introduction unit 50 is a B liquid passage provided inside the processing unit 21.
  • a fluid supply unit 60 including a compressor is connected to one end of the introduction unit 50.
  • the fluid supply unit 60 supplies the B liquid between the processing surface 1 and the processing surface 2 via the introduction unit 50.
  • the B liquid is supplied from the introduction unit 50 between the processing surface 1 and the processing surface 2 and merges with the A liquid.
  • the A liquid and the B liquid merge between the processing surface 1 and the processing surface 2 with a minute interval between them to become a thin film fluid.
  • the thin film fluid mixing and reaction of the A liquid and the B liquid are promoted.
  • the product produced by the reaction between the liquid A and the liquid B encloses the drug and precipitates in the thin film fluid as relatively uniform and fine PLGA nanoparticles.
  • the precipitated PLGA nanoparticles are discharged to the outside of the holder 10 and the holder 20 while being suspended in a liquid.
  • the case 70 is disposed outside the outer peripheral surfaces of the holder 10 and the holder 20.
  • the case 70 accommodates the PLGA nanoparticle dispersion liquid discharged to the outside of the holder 10 and the holder 20.
  • ULEA SS-11 manufactured by M Technique Co., Ltd.
  • M Technique Co., Ltd. which is a forced thin film microreactor
  • the number of rotations of the holder 10 the back pressure, the flow rates and temperatures of the liquid A and the liquid B can be appropriately set.
  • the rotation speed is 1000 to 2500 rpm, preferably 1700 rpm.
  • the back pressure is 0.02 to 0.06 MPa.
  • the PLGA nanoparticles according to the present embodiment are hardly affected by the temperature gradient and concentration gradient in the reaction vessel, as shown in Examples 1 to 3 and 6 to 8 below. Have a more uniform particle size. Further, the content of the drug in the PLGA nanoparticles reaches 20% by weight or more with respect to the weight of the PLGA nanoparticles.
  • the above drugs contained in PLGA nanoparticles include brown rice germ extract, ⁇ -oryzanol, ferulic acid, cycloartanol FE, 24-methylenecycloartanol FE, campesterol FE, ⁇ -sitosterol FE, 2-DG. And may be selected from the group consisting of indocyanine green and VC. Since the PLGA nanoparticles have a uniform particle size and a high drug content, the drug efficacy can be obtained even at a low dose.
  • the elution rate of the drug in the intestinal fluid of the PLGA nanoparticles according to the present embodiment is 20% by weight or more.
  • medical agent through intestinal tracts, such as oral administration can be improved more.
  • the elution rate here is a ratio of the weight of the drug released from the PLGA nanoparticles to the weight of the drug included in the PLGA nanoparticles.
  • the elution rate is, for example, 20% to 100%, 20% to 90%, 20% to 80%, 20% to 70%, 20% to 60% by weight 20 wt% or more and 50 wt% or less, 20 wt% or more and 35 wt% or less, 25 wt% or more and 30 wt% or less, or 27 wt% or more and 29 wt% or less.
  • the PLGA nanoparticles according to the present embodiment have an amount of the drug absorbed into the blood via the digestive system when administered to a living body. 5 times or more. This is because the drug is appropriately dissolved from the PLGA nanoparticles by maintaining the uniformity of the PLGA nanoparticles even after lyophilization. For this reason, for example, when the PLGA nanoparticles are orally or enterally administered, the drug can be efficiently transported into the blood.
  • the absorbed amount may be the total weight of the drug taken into the blood after 1 hour, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 36 hours, or 48 hours after administration.
  • the absorption amount is 5 to 100 times, 5 to 90 times, 5 to 80 times, 5 to 70 times, 5 to 60 times, 5 times to 5 times, compared with the drug substance 50 times or less, 5 times or more and 40 times or less, 5 times or more and 30 times or less, 5 times or more and 20 times or less, 5 times or more and 10 times or less, 6 times or more and 9 times or less, or 7 times or more and 8 times or less.
  • the living body is not particularly limited, and means an animal body, particularly a mammalian animal body including a human.
  • the blood concentration of the drug after a predetermined period of time is 5 to 100 times, 5 times or more compared to the case where the drug substance is administered. 90 times or less, 5 times or more and 80 times or less, 5 times or more and 70 times or less, 5 times or more and 60 times or less, 5 times or more and 50 times or less, 5 times or more and 40 times or less, 5 times or more and 30 times or less, 5 times or more It may be 20 times or less, 5 times or more and 10 times or less, 6 times or more and 9 times or less, or 7 times or more and 8 times or less.
  • liquid A and liquid B may be mixed.
  • the pH of the thin film fluid may be 6-8.
  • the uniformity of the PLGA nanoparticles when the A liquid and the B liquid are in contact with each other to form the PLGA nanoparticles is maintained, and aggregation before and after lyophilization can be suppressed.
  • the pH of the aqueous emulsifier solution may be adjusted with sodium bicarbonate.
  • Sodium bicarbonate can be used for medicines and foods that are ingested by the human body.
  • the pH of the said emulsifier aqueous solution can use arbitrary pH adjusters which can be ingested by a human body besides sodium hydrogencarbonate.
  • the emulsifier may be PVA.
  • PVA can be used for drugs and foods that are ingested by the human body, and is suitable for self-emulsification of PLGA nanoparticles.
  • any emulsifier that can be ingested by the human body can be used as long as it can be made into nanoparticles.
  • the organic solvent may be distilled off from the PLGA nanoparticle suspension, and the suspension may be freeze-dried.
  • the PLGA nanoparticle suspension may be pulverized by a spray drying method or solidified by a hot melt method.
  • the PLGA nanoparticles according to the present embodiment may be a PLGA nanoparticle dispersion liquid dispersed in an aqueous dispersion liquid.
  • the aqueous dispersion may be water alone or may contain water and a water-miscible solvent.
  • miscible solvents include methanol, isopropanol, and alcohols such as ethylene glycol.
  • the upper limit of the concentration of the PLGA nanoparticle is not particularly limited, but for example, 50.0% by weight or less, 40.0% by weight or less, 30. 0 wt% or less, 20.0 wt% or less, 10.0 wt% or less, 5.0 wt% or less, 3.0 wt% or less, 1.0 wt% or less, 0.9 wt% or less, 0.8 % By weight or less, 0.7% by weight or less, or 0.65% by weight or less.
  • Example 1 Using ULREA SS-11, drug-encapsulated PLGA nanoparticles were prepared as follows. First, the liquid A was filled in the liquid A tank, and the tank was pressurized to 0.3 MPa. Thereafter, solution A was fed at 167 mL / min at a set value of 43 ° C. (actual measured value of about 41 ° C.), and then solution B was fed at 100 mL / min at a set value of 40 ° C. (measured value of about 31 ° C.). A solution of 0.5 wt% PVA and 0.0033 wt% NaHCO 3 solution.
  • Liquid B is a solution having a composition of PLGA: ⁇ -oryzanol: acetone: ethanol in a weight ratio of 0.64: 3.2: 65.911: 30.255.
  • the rotation speed was 1700 rpm and the back pressure was 0.02 MPa.
  • the pH of the mixed liquid (discharge liquid) was 7.85. 100 mL of discharge liquid was collect
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, drug-encapsulated PLGA nanoparticles were prepared as follows using ULREA SS-11. Liquid A was filled into ULREA liquid tank A, and the tank was pressurized to 0.3 MPa. Thereafter, solution A was fed at 167 mL / min at 41 ° C., and then solution B was delivered at 30 ° C. at 100 mL / min. A solution of 0.5 wt% PVA and 0.01 wt% NaHCO 3 solution. In addition, the solution B is a solution having a composition of PLGA: brown rice germ extract: acetone: ethanol in a weight ratio of 0.64: 0.49: 65.91: 32.96. The rotation speed was 1700 rpm and the back pressure was 0.02 MPa.
  • the particle size distribution with a single peak, D 50 was at 200nm following 154 nm.
  • the uniformity of PLGA nanoparticles was also relatively high.
  • Example 3 Similarly to Example 2, drug-encapsulated PLGA nanoparticles were produced, and 15 L of discharge liquid was collected in a receiving tank.
  • a ribbon heater was installed on the bottom of the receiving tank and heated at 60 ° C.
  • the PLGA nanoparticle dispersion obtained by evaporating the solvent overnight under vacuum reduced pressure ( ⁇ 0.1 MPa) was frozen at ⁇ 80 ° C., and the shelf was heated to 45 ° C. with a shelf-type freeze dryer and freeze-dried for 3 days.
  • the yield of PLGA nanoparticles at this time was 97.29 g.
  • the particle size distribution of PLGA nanoparticles was measured in the same manner as in Example 1 above.
  • NIKISO Nanotrac Wave-EX150 manufactured by Nikkiso Co., Ltd.
  • a sample for TEM observation was prepared in the same manner as in Example 1 above, and the appearance of the obtained PLGA nanoparticles was imaged with a transmission electron microscope (JEM-ARM200F, manufactured by JEOL Ltd.).
  • the ⁇ -oryzanol content in PLGA nanoparticles was evaluated as follows. First, a standard solution was prepared. 10 mg of brown rice germ extract was weighed into a 100 mL volumetric flask and dissolved by adding 50 mL of acetonitrile. Next, the volume was made up to 100 mL with acetonitrile to obtain a standard stock solution (100 ⁇ g / mL). The standard stock solution was serially diluted with acetonitrile to 50, 25, 12.5, 6.25, and 3.125 ⁇ g / mL to obtain a standard solution.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • HPLC conditions Instrument LC-2000 plus series (manufactured by JASCO) Detection wavelength: UV320nm
  • Mobile phase: n-hexane: 2-propanol: acetic acid 470: 25: 5, preparation of mobile phase using HPLC solvent, acetic acid content 99.5% or more
  • Flow rate 1.0 mL / min
  • Injection volume 10 ⁇ L Measurement time: 10 minutes
  • ethanol and acetone were quantified as follows in the discharge liquid and the powder after freeze-drying in this example.
  • 10 mg of ethanol was weighed and dimethyl sulfoxide (DMSO) was added to make 10 g, which was used as an ethanol standard stock solution (1,000 ppm solution).
  • the ethanol standard stock solution was serially diluted with DMSO to 50, 100, 250, and 500 ppm to obtain an ethanol standard solution.
  • 10 mg of acetone was weighed, DMSO was added to make 10 g, and an acetone standard stock solution (1,000 ppm solution) was obtained.
  • the acetone standard stock solution was serially diluted with DMSO to 50, 100, 250, and 500 ppm to obtain an acetone standard solution.
  • the sample solution was prepared as follows. About 40 mg of a sample composed of the discharged liquid or powder after freeze-drying was weighed, and about 0.4 g of milli-Q water was added. After stirring for 30 seconds with a vortex mixer, the mixture was sonicated for 5 minutes and dispersed. About 1.2 g of DMSO was added to the dispersion and mixed, followed by filtration using a 0.45 ⁇ m membrane filter. The obtained filtrate was used as a sample solution. The standard solution and the sample solution were analyzed by gas chromatography (GCMS) under the following conditions, and the ethanol and acetone concentrations in the sample solution were calculated from the calibration curve of the standard solution.
  • GCMS gas chromatography
  • GCMS measurement conditions Equipment: GCMS-QP2010 (manufactured by Shimadzu Corporation) Column: DB-select 624UI for ⁇ 467>, inner diameter: 0.25 mm, length: 30 m, film thickness: 1.4 ⁇ m Column oven temperature: 40 ° C. (10 minutes) ⁇ 10 ° C./min ⁇ 200° C.
  • Vaporization chamber temperature 250 ° C
  • Injection mode Split Control mode: Linear velocity (32.0 cm / sec) Pressure: 35.0kPa Total flow rate: 14.7 mL / min Column flow rate: 0.79 mL / min, Purge flow rate: 10.0 mL / min Split ratio: 5.0 Ion source temperature: 200 ° C Interface temperature: 240 ° C Injection volume: 1 ⁇ L
  • a PLGA nanoparticle solution of 5 mg / mL was prepared with Milli-Q water, stirred with a vortex mixer for 30 seconds, and treated with ultrasonic waves for 10 minutes.
  • the zeta potential of the obtained sample was measured using Nanotrac Wave-UZ152 (Nikkiso Co., Ltd.).
  • the ethanol concentration of the discharged liquid was 1686 ppm / mL, but the ethanol concentration of the powder after lyophilization was 123 ppm / mL.
  • the acetone concentration of the discharged liquid was 272 ppm / mL, but the acetone concentration of the powder after lyophilization was below the detection limit.
  • the residual ethanol concentration in the powder of PLGA nanoparticles according to this example could be reduced to 1/10 or less of the discharge liquid.
  • acetone was able to be removed from the powder of PLGA nanoparticles.
  • Example 4 Regarding the PLGA nanoparticles prepared in Example 3 above, the elution rate of ⁇ -oryzanol from the PLGA nanoparticles in the intestinal fluid was evaluated as follows. First, an artificial intestinal fluid was prepared to reproduce the fasting intestinal fluid. 2.18 g of artificial intestinal fluid preparation reagent (manufactured by Celeste), 6.19 g of NaCl, 3.44 g of NaH2PO4, and 0.42 g of NaOH were dissolved in 1000 mL of purified water. Subsequently, the pH of the solution was adjusted to 6.5 using 1N NaOH or 1N HCl aqueous solution, and this solution was used as an artificial intestinal fluid.
  • artificial intestinal fluid preparation reagent manufactured by Celeste
  • 6.19 g of NaCl, 3.44 g of NaH2PO4, and 0.42 g of NaOH were dissolved in 1000 mL of purified water. Subsequently, the pH of the solution was adjusted to 6.5 using 1N NaOH or 1N HC
  • FIG. 7 shows the change over time in the amount of ⁇ -oryzanol in artificial intestinal fluid having a PLGA nanoparticle concentration of 1 mg / mL.
  • the amount of ⁇ -oryzanol in the artificial intestinal fluid after 24 hours was 75 ⁇ g / mL (7.5% relative to the concentration of 1 mg / mL of PLGA nanoparticles in the artificial intestinal fluid).
  • the dissolution rate was 28.6% by weight.
  • the collected blood was centrifuged to obtain supernatant plasma.
  • Isopropanol was added to the obtained plasma, stirred with a vortex mixer, further sonicated, and centrifuged to obtain a supernatant.
  • the supernatant was applied to a 0.2 ⁇ m filter to obtain a sample for LCMS measurement.
  • the blood concentrations of cycloartol FE, 24-methylenecycloartanol FE, campesterol FE, ⁇ -sitosterol FE, and ferulic acid were analyzed by liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS) under the following conditions. And measured.
  • Table 1 shows the transitions of substances to be measured in LC / MS.
  • FIG. 8 (A) and FIG. 8 (B) show the blood concentrations of components and ferulic acid contained in ⁇ -oryzanol in mice to which the drug substance and PLGA nanoparticles were orally administered, respectively.
  • the blood concentration of ferulic acid and cycloartol FE was maintained higher than that of the drug substance until 48 hours after administration. More specifically, the blood concentration of ferulic acid 1 hour after administration was 17.6 ng / mL for the drug substance, compared with 119.4 ng / mL for the PLGA nanoparticles.
  • the blood concentration of cycloartol FE 4 hours after administration was 15 ng / mL for PLGA nanoparticles, while it was below the detection limit for the drug substance.
  • the area under the curve (AUC) from 0 to 6 hours after calculation from FIGS. 8 (A) and 8 (B) was calculated.
  • the AUC of the drug substance was 17.6.
  • the AUC of PLGA nanoparticles was 191.7.
  • AUC from 0 to 48 hours was calculated for cycloartol FE, as shown in FIG. 10, the AUC of the original was 0, whereas the AUC of PLGA nanoparticles was 593. 1
  • Example 3 it was shown that the PLGA nanoparticles prepared in Example 3 described above significantly increased the amount of ⁇ -oryzanol encapsulated in the blood when compared to the original when administered orally.
  • ICG Indocyanine green
  • ULREA SS-11 manufactured by M Technique
  • solution A was fed at a set value of 43 ° C.
  • solution B was fed at a set value of 41 ° C. (actual measured value of about 29 ° C.) at 100 mL / min.
  • Liquid A is a 0.5 wt% PVA aqueous solution.
  • Liquid B contains 0.82% by weight of PLGA and 0.05% by weight of ICG in a mixed solvent of acetone and ethanol in a weight ratio of 2: 1.
  • the rotation speed was 1700 rpm and the back pressure was 0.02 MPa.
  • 133.5 mL of the discharge liquid was collected, and the solvent was distilled off from the discharge liquid by an evaporator for 35 minutes.
  • the obtained ICG-containing PLGA nanoparticle aqueous dispersion 46.5 mL was lyophilized to obtain 0.49 g of ICG-containing PLGA nanoparticles.
  • ICG-containing PLGA nanoparticles prepared above were weighed into a tube, and 5.8 mL of milli-Q water was added. After stirring for 30 seconds with a vortex mixer, sonication was performed for 5 minutes. Using Milli-Q water as a control, the particle size distribution of ICG-containing PLGA nanoparticles was measured with NIKKISO Nanotrac Wave-EX150 (manufactured by Nikkiso Co., Ltd.).
  • the particle size distribution with a single peak, D 50 was 250 nm.
  • the span value of the ICG-containing PLGA nanoparticles was 1.7, and the standard deviation SD of the particle diameter was 4.7 nm.
  • 2-DG-containing PLGA nanoparticles were prepared as follows. First, the liquid A was filled in the liquid A tank, and the tank was pressurized to 0.3 MPa. Thereafter, solution A was fed at a set value of 43 ° C., and then solution B was fed at a set value of 41 ° C. (actual measured value of about 29 ° C.) at 100 mL / min. Liquid A is an aqueous solution containing 0.05 wt% PVA and 0.02 wt% mannitol.
  • Liquid B contains 0.083 wt% PLGA and 0.033 wt% 2-DG in a mixed solvent of acetone and methanol in a weight ratio of 2: 1.
  • the rotation speed was 3000 rpm, and the back pressure was 0.02 MPa.
  • the discharge liquid 300 mL was collected, and the solvent was distilled off from the discharge liquid with an evaporator for 60 minutes.
  • 60 mL of the obtained 2-DG-containing PLGA nanoparticle aqueous dispersion was lyophilized to obtain 0.085 g of 2DG-containing PLGA nanoparticles.
  • the particle size distribution of 2DG-containing PLGA nanoparticles, a single peak, D 50 was 52 nm.
  • the span value of the 2DG-containing PLGA nanoparticles was 1.77, and the standard deviation SD of the particle diameter was 4.7 nm.
  • VC nanoparticles were prepared as follows. First, the liquid A was filled in the liquid A tank, and the tank was pressurized to 0.3 MPa. Thereafter, the liquid A was fed at a set value of 40 ° C., and then the liquid B was fed at a set value of 40 ° C. at 100 mL / min.
  • Liquid A is an aqueous solution containing 0.05 wt% PVA and 0.02 wt% mannitol.
  • Liquid B contains 0.08 wt% PLGA and 0.03 wt% VC in a mixed solvent of acetone and methanol in a weight ratio of 2: 1.
  • the rotation speed of the holder was 500, 1000 or 3000 rpm, and the back pressure was 0.02 MPa.
  • the discharge liquid 300 mL was collected, and the solvent was distilled off from the discharge liquid with an evaporator for 60 minutes.
  • 60 mL of the obtained VC nanoparticle aqueous dispersion was freeze-dried, about 0.085 g of VC nanoparticles were obtained at 500 rpm, 1000 rpm, and 3000 rpm, respectively.
  • each VC nanoparticle prepared above was weighed into a tube, and 2.1 mL of milli-Q water was added. After stirring for 30 seconds with a vortex mixer, sonication was performed for 5 minutes. Using Milli-Q water as a control, the particle size distribution of PLGA nanoparticles was measured with NIKKISO Nanotrac Wave-EX150 (Nikkiso Co., Ltd.).
  • FIGS. 13A to 13C show the particle size distribution of VC nanoparticles at the rotation speeds of 500 rpm, 1000 rpm, and 3000 rpm, respectively. If the rotational speed is 500 rpm, the 1000rpm and 3000 rpm, D 50 of VC nanoparticles, respectively 69 nm, at 93nm and 94 nm, span value of each 1.7,1.4 and 2.0.
  • the present invention is suitable for drug DDS.

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Abstract

ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子は、薬剤を内包したポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子である。薬剤の含量が、ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の重量に対して２０重量％以上である。ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の粒径のスパン値は、２．０以下であってもよい。

Description

ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子及びポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の製造方法
　本発明は、ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子及びポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の製造方法に関する。
　ドラッグデリバリーシステム（以下、単に「ＤＤＳ」とする）は、安全で効率の良い薬剤治療を可能にする。このため、ＤＤＳに関する様々な研究が進められている。特に安全性の面からポリラクチドグリコライド共重合体（以下、単に「ＰＬＧＡ」ともいう）がＤＤＳとして好適である。
　ＤＤＳにおいては、薬剤の効果が高まるため、製剤のナノ粒子化が注目を集めている。例えば、特許文献１には、少なくとも薬剤とＰＬＧＡとを溶解させた良溶媒溶液としてのアセトンとエタノールとの混合液を、貧溶媒としてのポリビニルアルコール水溶液に加えて、薬剤を内包したＰＬＧＡナノ粒子製剤を生成する方法が開示されている。さらに、特許文献２では、薬剤を内包したＰＬＧＡナノ粒子を分散液中に分散させた液状組成物の安定化が検討されている。
　上記特許文献１及び上記特許文献２に開示されたＰＬＧＡナノ粒子の製造方法は、水中エマルジョン法（ＥＳＤ法）を採用したバッチ方式である。このため、反応槽内の温度勾配及び濃度勾配により、粒径が均一なＰＬＧＡナノ粒子製剤を得るのが困難であった。さらに、上記特許文献１に開示された方法では、良溶媒又は貧溶媒に対するＰＬＧＡ又は薬剤を内包したＰＬＧＡの濃度を所定の濃度以下とする必要があった。
　そのため、実際には、分散液中での粒度分布がばらつくうえ、ＰＬＧＡナノ粒子中の薬剤の含量を上げることが難しい。このため、生体への薬剤の吸収効率が低いといった不都合があった。
　また、従来のバッチ方式で製造したナノ粒子は、凍結乾燥した場合に粗大化、合一又は凝集が起こることが多かった。経口投与後の薬剤の吸収率の向上には、良く分散された状態のナノ粒子から薬剤が溶解することが重要である。上記バッチ方式では、ナノ粒子の分散性すなわち均一性が高くないため、生体への吸収効率の制御が困難であった。
　一方、特許文献３には、互いに対向して配設された処理用面を使用するナノ粒子の製造方法が開示されている。当該ナノ粒子の製造方法では、処理用面の少なくとも一方が他方に対して回転することで該処理用面の間に薄膜流体が形成される。この薄膜流体中で原料溶液と析出溶媒とを混合することで、上述のバッチ方式の課題を解決し、ナノ粒子の製造効率を極めて高くすることができる。
特開２０１１－１１１４２９号公報 国際公開第２０１２／１６９５１８号 国際公開第２００９／０４１２７５号
　しかしながら、上記特許文献３には、ＰＬＧＡナノ粒子に関して示唆はあるものの、ＰＬＧＡに薬剤を内包する点に関しては一切示されていない。ましてや、薬剤を内包したＰＬＧＡナノ粒子の粒子径を如何に均一化するかに関しては、上記特許文献３において検討されていない。
　本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、ＰＬＧＡナノ粒子の粒径がより均一であって、かつ薬剤の含量を高めることができるＰＬＧＡナノ粒子及びＰＬＧＡナノ粒子の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明の第１の観点に係るポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子は、
　薬剤を内包したポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子であって、
　前記薬剤の含量が、
　前記ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の重量に対して２０重量％以上である。
　この場合、前記ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子のＤ５０の値は、
　２００ｎｍ以下であって、
　前記ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の粒径のスパン値は、
　２．０以下である、
　こととしてもよい。
　また、前記薬剤は、
　玄米胚芽抽出エキス、γ－オリザノール、フェルラ酸、シクロアルテノールフェルラ酸エステル、２４－メチレンシクロアルタノールフェルラ酸エステル、カンペステロールフェルラ酸エステル、β－シトステロールフェルラ酸エステル、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、インドシアニングリーン及びビタミンＣからなる群から選択される、
　こととしてもよい。
　また、腸液中での前記ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子からの前記薬剤の溶出率が、
　２０重量％以上である、
　こととしてもよい。
　また、生体に投与された場合の消化器系を介した血中への前記薬剤の吸収量が、
　前記薬剤の原体と比較して５倍以上である、
　こととしてもよい。
　本発明の第２の観点に係るポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の製造方法は、
　乳化剤水溶液と、アセトン及びエタノールを含む溶媒中に薬剤及びポリラクチドグリコライド共重合体を溶解させた原料溶液とを、互いに対向して配設され、少なくとも一方が他方に対して相対的に回転する処理用面間に導入することにより形成される薄膜流体中で、前記乳化剤水溶液と前記原料溶液とを混合する混合ステップと、
　前記薬剤を内包したポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子を前記薄膜流体中に析出させる析出ステップと、
　を含む。
　この場合、前記原料溶液における前記ポリラクチドグリコライド共重合体の濃度は、
　前記原料溶液の重量に対して０．６重量％より高い、
　こととしてもよい。
　また、前記薄膜流体のｐＨは、
　６～８である、
　こととしてもよい。
　また、前記乳化剤水溶液のｐＨは、
　炭酸水素ナトリウムで調整される、
　こととしてもよい。
　また、前記乳化剤は、
　ポリビニルアルコールである、
　こととしてもよい。
　また、前記薬剤は、
　玄米胚芽抽出エキス、γ－オリザノール、フェルラ酸、シクロアルテノールフェルラ酸エステル、２４－メチレンシクロアルタノールフェルラ酸エステル、カンペステロールフェルラ酸エステル、β－シトステロールフェルラ酸エステル、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、インドシアニングリーン及びビタミンＣからなる群から選択される、
　こととしてもよい。
　本発明によれば、ＰＬＧＡナノ粒子の粒径がより均一であって、かつ薬剤の含量を高めることができる。
実施の形態に係る薄膜回転式分散機の構成を示す図である。 実施例１で得られたＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布を示す図である。 実施例１で得られたＰＬＧＡナノ粒子の外観を示す図である。 実施例２で得られたＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布を示す図である。 実施例３で得られたＰＬＧＡナノ粒子の外観を示す図である。 実施例３で得られたＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布を示す図である。 ＰＬＧＡナノ粒子を含む人工腸液におけるγ－オリザノールの量の経時変化を示す図である。 （Ａ）は薬剤の原体を経口投与したマウスにおけるγ－オリザノールに含まれる成分及びフェルラ酸の血中濃度の経時変化を示す図である。（Ｂ）は薬剤を内包したＰＬＧＡナノ粒子を経口投与したマウスにおけるγ－オリザノールに含まれる成分及びフェルラ酸の血中濃度の経時変化を示す図である。 原体及びＰＬＧＡナノ粒子のマウスへの経口投与から６時間後までのフェルラ酸の血中への吸収量を示す図である。 原体及びＰＬＧＡナノ粒子のマウスへの経口投与から４８時間後までのシクロアルテノールフェルラ酸エステル（以下、「フェルラ酸エステル」を「ＦＥ」とする）の血中への吸収量を示す図である。 実施例６で得られたＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布を示す図である。 実施例７で得られたＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布を示す図である。 実施例８で得られたＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布を示す図である。（Ａ）は、薄膜回転式分散機のホルダの回転数が５００ｒｐｍで得られたＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布を示す図である。（Ｂ）は当該回転数が１０００ｒｐｍで得られたＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布を示す図である。（Ｃ）は当該回転数が３０００ｒｐｍで得られたＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布を示す図である。
　（実施の形態）
　本発明の実施の形態について説明する。本実施の形態に係るＰＬＧＡナノ粒子は、ＰＬＧＡを主成分とする粒子である。ＰＬＧＡは、乳酸・グリコール酸共重合体であって、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）ともいう。
　上記ＰＬＧＡナノ粒子は、薬剤を内包する。薬剤は、組成物、化合物、合成物、天然物、ペプチド、タンパク質及び核酸等で、生体に投与された際に薬効を有するものであれば特に限定されない。好適には、薬剤は、玄米胚芽抽出エキス、γ－オリザノール、フェルラ酸、シクロアルテノールＦＥ、２４－メチレンシクロアルタノールＦＥ、カンペステロールＦＥ、β－シトステロールＦＥ、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）、インドシアニングリーン及びビタミンＣ（ＶＣ）からなる群から選択される。なお、フェルラ酸は、γ－オリザノールの分解物である。フェルラ酸シクロアルテノールＦＥ、２４－メチレンシクロアルタノールＦＥ、カンペステロールＦＥ及びβ－シトステロールＦＥは、γ－オリザノールに含まれる成分である。
　上記薬剤の含量は、ＰＬＧＡナノ粒子の重量に対して２０重量％以上である。ここでの含量とは、ＰＬＧＡナノ粒子から抽出された薬剤の濃度を定量した値に基づいて算出されたＰＬＧＡナノ粒子の重量に対する薬剤の重量である。薬剤の含量の上限は、特に限定されないが、例えば、ＰＬＧＡナノ粒子の重量に対して９０．０重量％以下、８０．０重量％以下、７０．０重量％以下、６０．０重量％以下、５０．０重量％以下、４０．０重量％以下、３０．０重量％以下、２５．０重量％以下、２３．０重量％以下、２２．０重量％以下又は２１．０重量％以下である。
　上記ＰＬＧＡナノ粒子の粒径は、ナノオーダーであって、例えば、１～１０００ｎｍ、１０～９００ｎｍ、好ましくは１～５００ｎｍ、より好ましくは１～２００ｎｍである。ＰＬＧＡナノ粒子の粒径は、ふるい分け法、沈降法、顕微鏡法、光散乱法、レーザー回折・散乱法、電気的抵抗試験、透過型電子顕微鏡による観察、走査型電子顕微鏡による観察等で測定できる。粒径は公知の粒度分布計で測定してもよい。粒径は、測定方法に応じて、ストーク相当径、円相当径、球相当径で表すことができる。また、粒径は、複数の粒子を測定対象として、平均で表した平均粒径、体積平均粒径及び面積平均粒径等であってもよい。
　例えば、平均粒径は、レーザー回折・散乱法等の測定に基づく個数分布等から算出される平均粒径である。具体的には、粒子の集団の全体積を１００％として累積カーブを求めたとき、その累積カーブが５０％となる点の粒径である５０％径（Ｄ５０）を粒径としてもよい。ＰＬＧＡナノ粒子のＤ５０の値は、１～１０００ｎｍ、１０～９００ｎｍ、好ましくは２０～５００ｎｍ、より好ましくは５０～３００、好適には５０～２００ｎｍである。累積カーブ及びＤ５０は、市販の粒度分布計を用いて求めることができる。粒度分布計としては、例えば、ＮＩＫＫＩＳＯ　Ｎａｎｏｔｒａｃ　Ｗａｖｅ－ＥＸ１５０（日機装社製）が挙げられる。
　好ましくは、上記ＰＬＧＡナノ粒子の粒径のスパン値は、２．０以下である。スパン値は、（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０で求められる。ここで、Ｄ９０は上記累積カーブが９０％となる点の粒径である９０％径である。Ｄ１０は上記累積カーブが１０％となる点の粒径である１０％径である。Ｄ９０及びＤ１０は、市販の粒度分布計を用いて求めることができる。
　次に、上記ＰＬＧＡナノ粒子の製造に好適な製造方法の一例について説明する。該ＰＬＧＡナノ粒子の製造方法は、混合ステップと、析出ステップと、を含む。
　混合ステップでは、乳化剤水溶液（以下、単に「Ａ液」とする）と、原料溶液（以下、単に「Ｂ液」とする）とを薄膜流体中で混合する。まず、Ａ液について説明する。Ａ液に溶解された乳化剤は、粒子の分散安定性を高めるものであれば特に限定されない。例えば、乳化剤は、界面活性剤、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルピロリドン、水溶性樹脂、レシチン、サポニン類、ステロール類、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル及びポリソルベート等である。
　好適には、乳化剤は、ポリビニルアルコール（以下、単に「ＰＶＡ」とする）である。乳化剤としてのＰＶＡは市販のものを用いることができる。ＰＶＡは工業用でも医薬用でもよいが、残存した有機溶媒が少ない、又は有機溶媒が含まれないものが好ましい。
　乳化剤水溶液における乳化剤の濃度は、例えば、０．１～３．０重量％、０．１～２．０重量％、好ましくは０．１～１．０重量％、特に好ましくは０．５重量％である。Ａ液とＢ液とが混合された薄膜流体のｐＨが６～８であることが好ましい。このため、Ａ液のｐＨは、例えば７～８に調整されるのが好ましい。Ａ液のｐＨを調整するためのｐＨ調整剤は任意であるが、例えば、炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウム等のアルカリ種を用いればよい。また、Ａ液のｐＨを酸性側に調整するｐＨ調整剤としては、クエン酸及び酢酸等が用いられる。ｐＨ調整剤は、好ましくは炭酸水素ナトリウムである。この場合、乳化剤水溶液に炭酸水素ナトリウムを０．００１～０．１重量％、好ましくは０．０３３～０．０１重量％となるように添加すればよい。
　好ましくは、乳化剤を溶解するために、Ａ液を十分攪拌するのが好ましい。攪拌条件は特に限定されないが、例えば、精密乳化分散機クレアミックス（エム・テクニック社製）を用いた１５０００ｒｐｍで６０分間の攪拌である。攪拌後にＡ液に泡が生じている場合は、静置、減圧又は加圧等の任意の方法で消泡してもよい。
　続いて、Ｂ液について説明する。Ｂ液は、薬剤が溶解する有機溶媒を含む。有機溶媒は特に限定されないが、好ましくは、アセトン及びエタノールを含む溶媒である。該溶媒中には、薬剤及びＰＬＧＡが溶解されている。Ｂ液の調製では、例えば、薬剤とＰＬＧＡとをアセトンに添加し、超音波又はクレアミックスを用いて溶解させ、さらにエタノールを加えて混合する。ここで、ＰＬＧＡ：薬剤の比は、１．５：１～１：７、１．４：１～１：６、好ましくは、１．３：１～１：５が好ましい。アセトン：エタノールの比は、３：１～１：１、好ましくは２：１～１：１である。なお、アセトンとエタノールとをあらかじめ混合して得られた混合液に薬剤とＰＬＧＡとを添加してもよい。必要に応じて、Ｂ液の溶媒には、アセトン及びエタノール以外の溶媒が混合されてもよい。
　Ｂ液におけるＰＬＧＡの濃度は、任意であるが、好ましくはＢ液の重量に対して０．６重量％より高い。ＰＬＧＡの濃度の上限は、特に限定されないが、例えば、１０．０重量％以下、５．０重量％以下、１．０重量％以下又は０．８重量％以下である。あるいは、ＰＬＧＡの濃度は、Ｂ液の重量に対して０．１重量％未満であってもよい。
　混合ステップでは、Ａ液とＢ液とを、互いに対向して配設され、少なくとも一方が他方に対して相対的に回転する処理用面間に導入する。これにより、処理用面間に薄膜流体が形成され、Ａ液とＢ液とが混合される。
　混合されたＡ液及びＢ液は薄膜流体中で反応し、薬剤を内包したＰＬＧＡナノ粒子が形成される。析出ステップでは、該ＰＬＧＡナノ粒子を薄膜流体中に析出させる。
　ここで、上記製造方法に好適な装置の一例について説明する。図１は、薄膜回転式分散機１００の断面の概略図を示す。薄膜回転式分散機１００は、ホルダ１０と、ホルダ２０と、導入部３０と、流体圧付与部４０と、導入部５０と、流体供給部６０と、ケース７０と、を備える。
　ホルダ１０は、ホルダ２０の下方に配設される。ホルダ１０及びホルダ２０は、それぞれ処理部１１及び処理部２１を保持する。処理部１１及び処理部２１は、それぞれ環状（リング状）である。処理部１１は、処理用面１を有する。処理部２１は、処理用面１に対向する処理用面２を有する。ホルダ２０と処理部２１との間には、接面圧付与部２２が配置される。接面圧付与部２２は、処理部２１に圧力（以下、単に「背圧」とする）をかけることで処理部２１を下方の処理部１１に接近させる。このため、処理用面１と処理用面２とは、相互に近接及び離反可能である。
　ホルダ１０は、図１に示すように、モーターによってホルダ１０の軸心を中心としてホルダ２０に対して相対的に回転する。これにより、互いに対向して配設された処理用面１が処理用面２に対して相対的に回転する。
　導入部３０には、流体圧付与部４０が接続されている。コンプレッサを備える流体圧付与部４０がＡ液に加圧することで、処理用面１と処理用面２との間にＡ液が供給される。より詳細には、Ａ液は、流体圧付与部４０による加圧によって導入部３０からホルダ１０及びホルダ２０の内側の空間に導入される。さらにＡ液は、処理用面１と処理用面２との間を通り、ホルダ１０及びホルダ２０の外側に抜けようとする。このとき、Ａ液の送圧を受けたホルダ２０は、背圧に抵抗して、ホルダ１０から遠ざかる。これにより、処理用面１と処理用面２との間に微小な間隔ができる。なお、Ａ液が導入部３０から処理用面１と処理用面２との間に直接供給されるようにしてもよい。
　導入部５０は、処理部２１の内部に設けられたＢ液の通路である。導入部５０の一端には、コンプレッサを備える流体供給部６０が接続されている。流体供給部６０は、導入部５０を介して、処理用面１と処理用面２との間にＢ液を供給する。処理用面１と処理用面２との間に導入部５０からＢ液が供給され、Ａ液と合流する。
　処理用面２に対する処理用面１の相対的な回転により、Ａ液及びＢ液は、微小間隔を保った処理用面１及び処理用面２との間で合流して薄膜流体となる。薄膜流体内では、Ａ液とＢ液との混合及び反応が促進される。Ａ液とＢ液との反応で生成した生成物は、薬剤を内包し、比較的均一で微細なＰＬＧＡナノ粒子として薄膜流体中に析出する。析出したＰＬＧＡナノ粒子は、液体に懸濁された状態でホルダ１０及びホルダ２０の外側に排出される。
　ケース７０は、ホルダ１０及びホルダ２０の外周面の外側に配置される。ケース７０は、ホルダ１０及びホルダ２０の外側に排出されたＰＬＧＡナノ粒子分散液を収容する。
　上記製造方法に好適な装置として、例えば、強制薄膜式マイクロリアクターであるＵＬＲＥＡ　ＳＳ－１１（エム・テクニック社製）が挙げられる。ＵＬＲＥＡ　ＳＳ－１１を用いる場合、ホルダ１０の回転数、背圧、Ａ液及びＢ液の流速及び温度等を適宜設定することができる。例えば、回転数は、１０００～２５００ｒｐｍ、好ましくは１７００ｒｐｍである。背圧は０．０２～０．０６ＭＰａである。
　以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るＰＬＧＡナノ粒子は、反応槽内の温度勾配及び濃度勾配の影響をほとんど受けないため、下記実施例１～３、６～８に示すように、より均一な粒径を有する。また、当該ＰＬＧＡナノ粒子における薬剤の含量は、ＰＬＧＡナノ粒子の重量に対して２０重量％以上に達する。
　また、ＰＬＧＡナノ粒子に内包される上記薬剤は、玄米胚芽抽出エキス、γ－オリザノール、フェルラ酸、シクロアルテノールＦＥ、２４－メチレンシクロアルタノールＦＥ、カンペステロールＦＥ、β－シトステロールＦＥ、２－ＤＧ、インドシアニングリーン及びＶＣからなる群から選択されてもよいこととした。上記ＰＬＧＡナノ粒子は、粒径が均一で、かつ高い薬剤含量を有するため、薬剤の薬効を低用量でも得ることができる。
　なお、下記実施例４に示すように、本実施の形態に係るＰＬＧＡナノ粒子は、腸液中での薬剤の溶出率が２０重量％以上である。このため、当該ＰＬＧＡナノ粒子をＤＤＳに利用すれば、経口投与等の腸管を介した薬剤の輸送効率をより高めることができる。なお、ここでの溶出率は、ＰＬＧＡナノ粒子に内包される薬剤の重量に対するＰＬＧＡナノ粒子から放出された薬剤の重量の割合である。溶出率は、例えば、２０重量％以上１００重量％以下、２０重量％以上９０重量％以下、２０重量％以上８０重量％以下、２０重量％以上７０重量％以下、２０重量％以上６０重量％以下、２０重量％以上５０重量％以下、２０重量％以上３５重量％以下、２５重量％以上３０重量％以下又は２７重量％以上２９重量％以下であってもよい。
　また、下記実施例５に示すように、本実施の形態に係るＰＬＧＡナノ粒子は、生体に投与された場合の消化器系を介した血中への前記薬剤の吸収量が、薬剤の原体と比較して５倍以上である。これは、凍結乾燥後もＰＬＧＡナノ粒子の均一性が保たれることでＰＬＧＡナノ粒子から薬剤が適切に溶解するためである。このため、例えば、当該ＰＬＧＡナノ粒子を経口投与又は経腸投与等した場合、薬剤を効率よく血中へ輸送することができる。なお、吸収量は、投与から１時間後、６時間、１２時間、２４時間、３６時間又は４８時間経過後までに血中に取り込まれた薬剤の総重量であってもよい。上記吸収量は、薬剤の原体と比較して５倍以上１００倍以下、５倍以上９０倍以下、５倍以上８０倍以下、５倍以上７０倍以下、５倍以上６０倍以下、５倍以上５０倍以下、５倍以上４０倍以下、５倍以上３０倍以下、５倍以上２０倍以下、５倍以上１０倍以下、６倍以上９倍以下又は７倍以上８倍以下である。また、上記生体は、特に限定されず、動物、特にはヒトを含むほ乳類の動物の体を意味する。
　なお、当該ＰＬＧＡナノ粒子を経口投与又は経腸投与等した場合、所定時間経過後の薬剤の血中濃度が、薬剤の原体を投与した場合と比較して５倍以上１００倍以下、５倍以上９０倍以下、５倍以上８０倍以下、５倍以上７０倍以下、５倍以上６０倍以下、５倍以上５０倍以下、５倍以上４０倍以下、５倍以上３０倍以下、５倍以上２０倍以下、５倍以上１０倍以下、６倍以上９倍以下又は７倍以上８倍以下であってもよい。
　また、上記混合ステップでは、Ａ液と、Ｂ液とを、互いに対向して配設され、少なくとも一方が他方に対して相対的に回転する処理用面間に導入することにより形成される薄膜流体中で、Ａ液とＢ液とを混合してもよいこととした。これにより、より均一な粒径を有し、薬剤含量の高いＰＬＧＡナノ粒子を製造することができる。
　なお、上記薄膜流体のｐＨは、６～８であってもよいこととした。こうすることで、Ａ液とＢ液とが接してＰＬＧＡナノ粒子が形成される際のＰＬＧＡナノ粒子の均一性が保たれ、凍結乾燥前後での凝集の抑制が可能になる。
　また、上記乳化剤水溶液のｐＨは、炭酸水素ナトリウムで調整してもよいこととした。炭酸水素ナトリウムは、医薬品及び食品等、人体に摂取されるものに対しても利用可能である。なお、上記乳化剤水溶液のｐＨには、炭酸水素ナトリウム以外にも人体に摂取可能な任意のｐＨ調整剤を用いることができる。
　なお、上記乳化剤は、ＰＶＡであってもよいこととした。ＰＶＡは、医薬品及び食品等、人体に摂取されるものに対しても利用可能で、かつＰＬＧＡナノ粒子の自己乳化に好適である。なお、ＰＶＡ以外にもナノ粒子化できるものであれば、人体に摂取可能な乳化剤を用いることができる。
　なお、析出ステップに続いて、ＰＬＧＡナノ粒子懸濁液から有機溶媒を留去し、懸濁液を凍結乾燥してもよい。また、ＰＬＧＡナノ粒子懸濁液をスプレードライ法で粉体化してもよいし、あるいはホットメルト法で固形化してもよい。
　なお、本実施の形態に係るＰＬＧＡナノ粒子は、水性分散液に分散されたＰＬＧＡナノ粒子分散液であってもよい。水性分散液は、水単独でもよいが、水及び水と混和可能な溶剤を含んでもよい。混和可能な溶剤としては、メタノール、イソプロパノール及びエチレングリコール等のアルコール等が挙げられる。
　ＰＬＧＡナノ粒子分散液の場合、ＰＬＧＡナノ粒子の濃度の上限は、特に限定されないが、例えば、ＰＬＧＡナノ粒子分散液の重量に対して５０．０重量％以下、４０．０重量％以下、３０．０重量％以下、２０．０重量％以下、１０．０重量％以下、５．０重量％以下、３．０重量％以下、１．０重量％以下、０．９重量％以下、０．８重量％以下、０．７重量％以下又は０．６５重量％以下である。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　（実施例１）
　ＵＬＲＥＡ　ＳＳ－１１を使用して、以下のように薬剤内包ＰＬＧＡナノ粒子を作製した。まず、Ａ液をＡ液タンクに充填し、タンクを０．３ＭＰａに加圧した。その後、設定値４３℃（実測値約４１℃）でＡ液を１６７ｍＬ／分で送液し、次いで設定値４０℃（実測値約３１℃）でＢ液を１００ｍＬ／分で送液した。Ａ液は０．５重量％ＰＶＡかつ０．００３３重量％ＮａＨＣＯ３水溶液である。また、Ｂ液は組成がＰＬＧＡ：γ－オリザノール：アセトン：エタノールが重量比で０．６４：３．２：６５．９１１：３０．２５５の溶液である。回転数を１７００ｒｐｍとし、背圧を０．０２ＭＰａとした。混合液（吐出液）のｐＨは、７．８５であった。吐出液１００ｍＬを回収し、吐出液からエバポレーターで３０分間、溶媒を留去した。得られたＰＬＧＡナノ粒子水性分散液３０ｍＬを凍結乾燥し、１１７．１ｍｇのナノ粒子を得た。
　上記で調製したＰＬＧＡナノ粒子１０ｍｇをチューブに量りとり、ミリＱ水１０ｍＬを加えた。ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、５分間超音波処理を行った。ミリＱ水を対照とし、ＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布をＵＰＡ－ＵＴ１５１（日機装社製）で測定した。
　また、上記で調製したＰＬＧＡナノ粒子１０ｍｇに５ｍＬの純水を加え、超音波洗浄機で５分間処理した後、超音波分散機で１分間処理した液を、エステル支持膜付グリットに滴下し、大気下にて乾燥したものをＴＥＭ観察用試料とした。ＴＥＭ観察用試料を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＭ－２１００、日本電子社製）で撮像し、ＰＬＧＡナノ粒子の外観を観察した。
　（結果）
　図２に示すように、ＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布はシングルピークで、Ｄ５０が１４９ｎｍで２００ｎｍ以下であった。ＰＬＧＡナノ粒子の均一性も比較的高かった。また、図３に示すように、γ－オリザノールが内包された分散性の良いＰＬＧＡナノ粒子の粒子が観察された。
　（実施例２）
　実施例１と同様に、ＵＬＲＥＡ　ＳＳ－１１を使用して、以下のように薬剤内包ＰＬＧＡナノ粒子を作製した。Ａ液をＵＬＲＥＡのＡ液タンクに充填し、タンクを０．３ＭＰａに加圧した。その後、４１℃でＡ液を１６７ｍＬ／分で送液し、次いで３０℃でＢ液を１００ｍＬ／分で送液した。Ａ液は０．５重量％ＰＶＡかつ０．０１重量％ＮａＨＣＯ３水溶液である。また、Ｂ液は、組成が重量比でＰＬＧＡ：玄米胚芽抽出エキス：アセトン：エタノールで０．６４：０．４９：６５．９１：３２．９６の溶液である。回転数を１７００ｒｐｍとし、背圧を０．０２ＭＰａとした。
　（結果）
　吐出液１００ｍＬを回収し、吐出液からエバポレーターで３０分間、溶媒を留去した。得られたナノ粒子水性分散液２５ｍＬを凍結乾燥し、０．３２ｇのナノ粒子を得た。
　図４に示すように、粒度分布はシングルピークで、Ｄ５０が１５４ｎｍで２００ｎｍ以下であった。ＰＬＧＡナノ粒子の均一性も比較的高かった。
　（実施例３）
　実施例２と同様に薬剤内包ＰＬＧＡナノ粒子を作製し、受けタンクに１５Ｌの吐出液を回収した。本実施例では、アセトン及びエタノールを留去するため、受けタンクの底面にリボンヒーターを設置し、６０℃で加温した。真空減圧（－０．１ＭＰａ）で一晩溶媒留去したＰＬＧＡナノ粒子分散液を、－８０℃で凍結し、棚式凍結乾燥機で棚を４５℃に加温して３日間凍結乾燥した。このときのＰＬＧＡナノ粒子の収量は９７．２９ｇであった。
　上記実施例１と同様にＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布を測定した。粒度分布の測定には、ＮＩＫＫＩＳＯ　Ｎａｎｏｔｒａｃ　Ｗａｖｅ－ＥＸ１５０（日機装社製）を用いた。また、上記実施例１と同様にＴＥＭ観察用試料を調製し、得られたＰＬＧＡナノ粒子の外観を透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ－ＡＲＭ２００Ｆ、日本電子社製）で撮像した。
　ＰＬＧＡナノ粒子におけるγ－オリザノール含量は、以下のように評価した。まず、標準溶液を調製した。玄米胚芽抽出エキス１０ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに量りとり、アセトニトリル５０ｍＬを加えて溶解した。次にアセトニトリルを用いて１００ｍＬにメスアップし、標準原液（１００μｇ／ｍＬ）とした。標準原液を５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５μｇ／ｍＬになるようにアセトニトリルを用いて段階希釈し、標準溶液とした。
　試料溶液の調製では、試料約１０ｍｇを量りとり、ミリＱ水１０ｍＬを加えた。ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、５分間超音波処理し試料原液とした。試料原液１．０ｍＬにアセトニトリルを加え１０ｍＬとした。この液を２０℃、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。遠心後の上澄み液を、０．２μｍメンブレンフィルターを用いてろ過し、得られたろ液を試料溶液とした。試料溶液についてはｎ＝３で試験を実施した。標準溶液及び試料溶液を下記条件にて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、標準溶液の検量線から試料溶液中のγ－オリザノール含量を計算により求めた。
　ＨＰＬＣの条件
　機器：ＬＣ－２０００　ｐｌｕｓ　ｓｅｒｉｅｓ（日本分光社製）
　検出波長：ＵＶ３２０ｎｍ
　カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＳＩＬ－１００Ａ（ＧＬサイエンス社製、１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ、５μｍ）
　カラム温度：３０℃
　移動相：ｎ－ヘキサン：２－プロパノール：酢酸＝４７０：２５：５、移動相の調製はＨＰＬＣ用溶媒を使用、酢酸含量９９．５％以上
　流量：１．０ｍＬ／分
　注入量：１０μＬ
　測定時間：１０分
　さらに、本実施例における吐出液及び凍結乾燥後粉体について、残留したエタノール及びアセトンを次のように定量した。まず、エタノールを１０ｍｇ量りとり、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えて１０ｇとし、エタノール標準原液（１，０００ｐｐｍ溶液）とした。エタノール標準原液を５０、１００、２５０、５００ｐｐｍとなるようにＤＭＳＯを用いて段階希釈し、エタノール標準溶液とした。一方、アセトン１０ｍｇを量りとり、ＤＭＳＯを加えて１０ｇとし、アセトン標準原液（１，０００ｐｐｍ溶液）とした。アセトン標準原液を５０、１００、２５０、５００ｐｐｍとなるようにＤＭＳＯを用いて段階希釈し、アセトン標準溶液とした。
　試料溶液の調製は次のように行った。吐出液又は凍結乾燥後粉体からなる試料約４０ｍｇを量りとり、ミリＱ水約０．４ｇを加えた。ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、５分間超音波処理して分散させた。分散液にＤＭＳＯ約１．２ｇを加え混合し、０．４５μｍメンブレンフィルターを用いてろ過し、得られたろ液を試料溶液とした。標準溶液及び試料溶液を下記条件にてガスクロマトグラフィー（ＧＣＭＳ）で分析し、標準溶液の検量線から試料溶液中のエタノール及びアセトン濃度を算出した。
　ＧＣＭＳの測定条件
　機器：ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０（島津製作所社製）
　カラム：ＤＢ－ｓｅｌｅｃｔ　６２４ＵＩ　ｆｏｒ＜４６７＞、内径：０．２５ｍｍ、長さ：３０ｍ、膜厚：１．４μｍ
　カラムオーブン温度：４０℃（１０分）→１０℃／ｍｉｎ→２００℃（２０分）
　気化室温度：２５０℃
　注入モード：スプリット
　制御モード：線速度（３２．０ｃｍ／秒）
　圧力：３５．０ｋＰａ
　全流量：１４．７ｍＬ／分
　カラム流量：０．７９ｍＬ／分、
　パージ流量：１０．０ｍＬ／分
　スプリット比：５．０
　イオン源温度：２００℃
　インターフェース温度：２４０℃
　注入量：１μＬ
　ＰＬＧＡナノ粒子のゼータ電位を測定するために、ミリＱ水で５ｍｇ／ｍＬのＰＬＧＡナノ粒子溶液を調製し、３０秒間ボルテックスミキサーで撹拌し、１０分間、超音波で処理した。得られた試料のゼータ電位を、Ｎａｎｏｔｒａｃ　Ｗａｖｅ－ＵＺ１５２（日機装社製）を用いて測定した。
　（結果）
　図５に示すように、粒度分布はシングルピークで、Ｄ５０が１５０ｎｍであった。スパン値（（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０）＝１．３で、標準偏差ＳＤ＝６８．１ｎｍであった。図６に示すように、分散性が良いナノ粒子が確認された。ＰＬＧＡナノ粒子に対するγ－オリザノール含量は、２６．２重量％であった。また、ＰＬＧＡナノ粒子のゼータ電位は平均－１２．７ｍＶであった。
　吐出液のエタノール濃度は１６８６ｐｐｍ／ｍＬであったが、凍結乾燥後粉体のエタノール濃度は１２３ｐｐｍ／ｍＬであった。一方、吐出液のアセトン濃度は２７２ｐｐｍ／ｍＬであったが、凍結乾燥後粉体のアセトン濃度は検出限界以下であった。このように、本実施例に係るＰＬＧＡナノ粒子の粉体における残留エタノール濃度を、吐出液の１／１０以下にすることができた。さらに、ＰＬＧＡナノ粒子の粉体からアセトンを除去することができた。
　（実施例４）
　上記実施例３で調製したＰＬＧＡナノ粒子について、腸液内におけるＰＬＧＡナノ粒子からのγ－オリザノールの溶出率を次のように評価した。まず、絶食時の腸液を再現するために人工腸液を調製した。２．１８ｇの人工腸液調製用試薬（セレステ社製）、６．１９ｇのＮａＣｌ、３．４４ｇのＮａＨ２ＰＯ４、及び０．４２ｇのＮａＯＨを、精製水１０００ｍＬに溶解させた。続いて、１Ｎ　ＮａＯＨ又は１Ｎ　ＨＣｌ水溶液を用いて溶液のｐＨを６．５に調整し、該溶液を人工腸液とした。
　玄米胚芽抽出エキス（原体）及びＰＬＧＡナノ粒子それぞれ１０ｍｇを人工腸液１０ｍＬに添加し、３０秒間ボルテックスミキサーで撹拌した。０時間の試料として６００μＬを採取した後、３７℃で振盪し、０．５、１、２、４、６、２４時間後にもそれぞれ６００μＬを採取した。採取した試料を４℃で１５分間、２０，０００ｒｐｍで遠心し、０．２μｍのフィルタでろ過した。上清液１００μＬにアセトニトリル９００μＬを加え、３０秒間撹拌した。試料をさらに４℃で１５分間、２０，０００ｒｐｍで遠心し、０．２μｍのフィルタでろ過した。得られた試料に含まれるγ－オリザノールの量を上述の実施例１と同様にＨＰＬＣ分析で定量した。
　（結果）
　図７は、ＰＬＧＡナノ粒子の濃度が１ｍｇ／ｍＬの人工腸液におけるγ－オリザノールの量の経時変化を示す。ＰＬＧＡナノ粒子の場合、２４時間後の人工腸液中のγ－オリザノールの量は、７５μｇ／ｍＬ（人工腸液中のＰＬＧＡナノ粒子の濃度１ｍｇ／ｍＬに対して７．５％）であった。該ＰＬＧＡナノ粒子におけるγ－オリザノールの含量２６．２重量％を考慮すると、溶出率は２８．６重量％であった。
　（実施例５）
　マウスを用いて上記実施例３で調製したＰＬＧＡナノ粒子におけるγ－オリザノールの吸収性を評価した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、雄、日本チャールス・リバー社製）を取得し、米糠不使用の飼料ＣＲＦ－１（オリエンタル酵母社製）を自由摂取させて１週間飼育した。７週齢にて、３２０μｇ／ｇ（体重）のＰＬＧＡナノ粒子又は玄米胚芽抽出エキス（原体）を経口投与し、所定の時間経過ごとに眼窩静脈より血液を採取した（ｎ＝３）。
　採取した血液を遠心分離し、上清の血漿を得た。得られた血漿にイソプロパノールを加え、ボルテックスミキサーで撹拌し、さらに超音波処理を行い、遠心分離後、上清を得た。上清を０．２μｍフィルタにかけ、ＬＣＭＳ測定用試料とした。ＬＣＭＳ測定用試料について、シクロアルテノールＦＥ、２４－メチレンシクロアルタノールＦＥ、カンペステロールＦＥ及びβ－シトステロールＦＥ及びフェルラ酸の血中濃度を、下記条件で液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を用いて測定した。
　ＬＣ／ＭＳの測定条件
　装置：１２６０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ，６４３０　Ｔｒｉｐｌｅ　Ｑｕａｄ　ＬＣ／ＭＳ（アジレント・テクノロジーズ社製）
　分析カラム：Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ２　ＯＤＳ　１５０ｍｍ×２．１ｍｍ　Ｉ．Ｄ３．０μｍ
　カラムオーブン温度：４０℃
　移動相：アセトニトリル：メタノール：酢酸アンモニウム＝５０：５０：０．３（ｖ：ｖ：ｗ）
　イオン源：ＡＰＣＩ
　極性：Ｎｅｇａｔｉｖｅ
　Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ：６０ｐｓｉ
　Ｄｒｙｉｎｇ　Ｇａｓの流速：５Ｌ／分
　Ｄｒｙｉｎｇ　Ｇａｓの温度：３５０℃
　ＡＰＣＩ　Ｖａｐの温度：３５０℃
　Ｃｏｒｏｎａ　Ｃｕｒｒｅｎｔ：２０μＡ
　Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｖｏｌｔａｇｅ：３，５００Ｖ
　ＬＣ／ＭＳにおける測定対象物質のトランジション等を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（結果）
　図８（Ａ）及び図８（Ｂ）は、それぞれ原体及びＰＬＧＡナノ粒子を経口投与したマウスにおけるγ－オリザノールに含まれる成分並びにフェルラ酸の血中濃度を示す。ＰＬＧＡナノ粒子の場合、投与後４８時間後までのフェルラ酸及びシクロアルテノールＦＥの血中濃度が原体よりも高く維持された。より詳細には、投与１時間後のフェルラ酸の血中濃度は、原体では１７．６ｎｇ／ｍＬであったのに対し、ＰＬＧＡナノ粒子では１１９．４ｎｇ／ｍＬであった。また、投与４時間後のシクロアルテノールＦＥの血中濃度は、原体では検出限界以下であったのに対し、ＰＬＧＡナノ粒子では１５ｎｇ／ｍＬであった。
　フェルラ酸に関して、図８（Ａ）及び図８（Ｂ）より０～６時間後までの曲線下面積（ＡＵＣ）を算出すると、図９に示すように、原体のＡＵＣが１７．６であったのに対し、ＰＬＧＡナノ粒子のＡＵＣは、１９１．７であった。同様に、シクロアルテノールＦＥに関して、０～４８時間後までのＡＵＣを算出すると、図１０に示すように、原体のＡＵＣは０であったのに対し、ＰＬＧＡナノ粒子のＡＵＣは、５９３．１であった。
　本実施例により上記実施例３で調製したＰＬＧＡナノ粒子は、経口投与された場合、内包するγ－オリザノールの血中への吸収量を原体よりも大幅に上昇させることが示された。
　（実施例６）
　ＵＬＲＥＡ　ＳＳ－１１（エム・テクニック社製）を使用して、以下のようにインドシアニングリーン（ＩＣＧ）含有ＰＬＧＡナノ粒子を作製した。まず、Ａ液をＡ液タンクに充填し、タンクを０．３ＭＰａに加圧した。その後、設定値４３℃でＡ液を送液し、次いで設定値４１℃（実測値約２９℃）でＢ液を１００ｍＬ／分で送液した。Ａ液は０．５重量％ＰＶＡ水溶液である。また、Ｂ液は、アセトンとエタノールとが重量比で２：１の混合溶媒に、０．８２重量％のＰＬＧＡ及び０．０５重量％のＩＣＧを含む。回転数を１７００ｒｐｍとし、背圧を０．０２ＭＰａとした。吐出液１３３．５ｍＬを回収し、吐出液からエバポレーターで３５分間、溶媒を留去した。得られたＩＣＧ含有ＰＬＧＡナノ粒子水性分散液４６．５ｍＬを凍結乾燥し、０．４９ｇのＩＣＧ含有ＰＬＧＡナノ粒子を得た。
　上記で調製したＩＣＧ含有ＰＬＧＡナノ粒子５．８ｍｇをチューブに量りとり、ミリＱ水５．８ｍＬを加えた。ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、５分間超音波処理を行った。ミリＱ水を対照とし、ＩＣＧ含有ＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布をＮＩＫＫＩＳＯ　Ｎａｎｏｔｒａｃ　Ｗａｖｅ－ＥＸ１５０（日機装社製）で測定した。
　（結果）
　図１１に示すように、粒度分布はシングルピークで、Ｄ５０が２５０ｎｍであった。ＩＣＧ含有ＰＬＧＡナノ粒子のスパン値は１．７で、粒径の標準偏差ＳＤ＝４．７ｎｍであった。
　（実施例７）
　ＵＬＲＥＡ　ＳＳ－１１（エム・テクニック社製）を使用して、以下のように２－ＤＧ含有ＰＬＧＡナノ粒子を作製した。まず、Ａ液をＡ液タンクに充填し、タンクを０．３ＭＰａに加圧した。その後、設定値４３℃でＡ液を送液し、次いで設定値４１℃（実測値約２９℃）でＢ液を１００ｍＬ／分で送液した。Ａ液は０．０５重量％ＰＶＡ及び０．０２重量％マンニトールを含む水溶液である。また、Ｂ液は、アセトンとメタノールとが重量比で２：１の混合溶媒に、０．０８３重量％のＰＬＧＡ及び０．０３３重量％の２－ＤＧを含む。回転数を３０００ｒｐｍとし、背圧を０．０２ＭＰａとした。吐出液３００ｍＬを回収し、吐出液からエバポレーターで６０分間、溶媒を留去した。得られた２－ＤＧ含有ＰＬＧＡナノ粒子水性分散液６０ｍＬを凍結乾燥し、０．０８５ｇの２ＤＧ含有ＰＬＧＡナノ粒子を得た。
　上記で調製した２ＤＧ含有ＰＬＧＡナノ粒子８．４ｍｇをチューブに量りとり、ミリＱ水２．１ｍＬを加えた。ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、５分間超音波処理を行った。ミリＱ水を対照とし、ＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布をＮＩＫＫＩＳＯ　Ｎａｎｏｔｒａｃ　Ｗａｖｅ－ＥＸ１５０（日機装社製）で測定した。
　（結果）
　図１２に示すように、２ＤＧ含有ＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布は、シングルピークで、Ｄ５０が５２ｎｍであった。２ＤＧ含有ＰＬＧＡナノ粒子のスパン値は１．７７で、粒径の標準偏差ＳＤ＝４．７ｎｍであった。
　（実施例８）
　ＵＬＲＥＡ　ＳＳ－１１（エム・テクニック社製）を使用して、以下のようにＶＣナノ粒子を作製した。まず、Ａ液をＡ液タンクに充填し、タンクを０．３ＭＰａに加圧した。その後、設定値４０℃でＡ液を送液し、次いで設定値４０℃でＢ液を１００ｍＬ／分で送液した。Ａ液は０．０５重量％ＰＶＡ及び０．０２重量％マンニトールを含む水溶液である。また、Ｂ液は、アセトンとメタノールとが重量比で２：１の混合溶媒に、０．０８重量％のＰＬＧＡ及び０．０３重量％のＶＣを含む。ホルダの回転数を５００、１０００又は３０００ｒｐｍとし、背圧を０．０２ＭＰａとした。吐出液３００ｍＬを回収し、吐出液からエバポレーターで６０分間、溶媒を留去した。得られたＶＣナノ粒子水性分散液６０ｍＬを凍結乾燥したところ、回転数が５００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ及び３０００ｒｐｍにおいて、それぞれ約０．０８５ｇのＶＣナノ粒子を得た。
　上記で調製した各ＶＣナノ粒子８．４ｍｇをチューブに量りとり、ミリＱ水２．１ｍＬを加えた。ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、５分間超音波処理を行った。ミリＱ水を対照とし、ＰＬＧＡナノ粒子の粒度分布をＮＩＫＫＩＳＯ　Ｎａｎｏｔｒａｃ　Ｗａｖｅ－ＥＸ１５０（日機装社製）で測定した。
　（結果）
　図１３（Ａ）～（Ｃ）は、それぞれ回転数が５００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ及び３０００ｒｐｍでのＶＣナノ粒子の粒度分布を示す。回転数が５００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ及び３０００ｒｐｍの場合、ＶＣナノ粒子のＤ５０は、それぞれ６９ｎｍ、９３ｎｍ及び９４ｎｍで、スパン値はそれぞれ１．７、１．４及び２．０であった。
　本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　本出願は、２０１６年８月２６日に出願された、日本国特許出願２０１６－１６５７８５号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１６－１６５７８５号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明は、薬剤のＤＤＳに好適である。
　　１、２　処理用面
　　１０、２０　ホルダ
　　１１、２１　処理部
　　２２　接面圧付与部
　　３０、５０　導入部
　　４０　流体圧付与部
　　６０　流体供給部
　　７０　ケース
　　１００　薄膜回転式分散機

Claims (11)

  1. 　薬剤を内包したポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子であって、
    　前記薬剤の含量が、
    　前記ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の重量に対して２０重量％以上である、
    　ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子。
  2. 　前記ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子のＤ５０の値は、
    　２００ｎｍ以下であって、
    　前記ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の粒径のスパン値は、
    　２．０以下である、
    　請求項１に記載のポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子。
  3. 　前記薬剤は、
    　玄米胚芽抽出エキス、γ－オリザノール、フェルラ酸、シクロアルテノールフェルラ酸エステル、２４－メチレンシクロアルタノールフェルラ酸エステル、カンペステロールフェルラ酸エステル、β－シトステロールフェルラ酸エステル、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、インドシアニングリーン及びビタミンＣからなる群から選択される、
    　請求項１又は２に記載のポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子。
  4. 　腸液中での前記ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子からの前記薬剤の溶出率が、
    　２０重量％以上である、
    　請求項１から３のいずれか一項に記載のポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子。
  5. 　生体に投与された場合の消化器系を介した血中への前記薬剤の吸収量が、
    　前記薬剤の原体と比較して５倍以上である、
    　請求項１から４のいずれか一項に記載のポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子。
  6. 　乳化剤水溶液と、アセトン及びエタノールを含む溶媒中に薬剤及びポリラクチドグリコライド共重合体を溶解させた原料溶液とを、互いに対向して配設され、少なくとも一方が他方に対して相対的に回転する処理用面間に導入することにより形成される薄膜流体中で、前記乳化剤水溶液と前記原料溶液とを混合する混合ステップと、
    　前記薬剤を内包したポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子を前記薄膜流体中に析出させる析出ステップと、
    　を含む、
    　ポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の製造方法。
  7. 　前記原料溶液における前記ポリラクチドグリコライド共重合体の濃度は、
    　前記原料溶液の重量に対して０．６重量％より高い、
    　請求項６に記載のポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の製造方法。
  8. 　前記薄膜流体のｐＨは、
    　６～８である、
    　請求項６又は７に記載のポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の製造方法。
  9. 　前記乳化剤水溶液のｐＨは、
    　炭酸水素ナトリウムで調整される、
    　請求項６から８のいずれか一項に記載のポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の製造方法。
  10. 　前記乳化剤は、
    　ポリビニルアルコールである、
    　請求項６から９のいずれか一項に記載のポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の製造方法。
  11. 　前記薬剤は、
    　玄米胚芽抽出エキス、γ－オリザノール、フェルラ酸、シクロアルテノールフェルラ酸エステル、２４－メチレンシクロアルタノールフェルラ酸エステル、カンペステロールフェルラ酸エステル、β－シトステロールフェルラ酸エステル、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、インドシアニングリーン及びビタミンＣからなる群から選択される、
    　請求項６から１０のいずれか一項に記載のポリラクチドグリコライド共重合体ナノ粒子の製造方法。
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