WO2017159380A1 - 上位運動ニューロンの誘導方法 - Google Patents

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WO2017159380A1
WO2017159380A1 PCT/JP2017/008276 JP2017008276W WO2017159380A1 WO 2017159380 A1 WO2017159380 A1 WO 2017159380A1 JP 2017008276 W JP2017008276 W JP 2017008276W WO 2017159380 A1 WO2017159380 A1 WO 2017159380A1
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WO
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pluripotent stem
cells
cell
ngn2
fezl
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PCT/JP2017/008276
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治久 井上
恵子 今村
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国立大学法人京都大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing upper motor neurons from pluripotent stem cells.
  • the present invention also relates to pluripotent stem cells that can be converted into upper motor neurons.
  • a cell causing a disease is a cell that cannot be collected from the body by a noninvasive method and / or a cell that does not have division ability, it is very significant to obtain a cell model of the disease.
  • Neurons are representative of such cells, and neurodegenerative diseases that develop when certain neurons degenerate are considered to be particularly advantageous for cell models.
  • Alzheimer-type dementia, Parkinsonism, and amyotrophic lateral sclerosis (ALS) are rapidly increasing in number with the aging of society, and the research is eagerly accelerated. .
  • the directed differentiation method that induces differentiation of pluripotent stem cells or somatic cells into target cells has greatly contributed to the creation of cell models of these diseases.
  • pluripotent stem cells are exposed to external signals such as morphogen to induce differentiation into neurons, and specific genes are introduced into pluripotent stem cells or somatic cells.
  • a method of inducing differentiation into neurons by expressing them is known (Non-patent Document 1).
  • the method of inducing differentiation by an external signal is a method of inducing expression of genes responsible for neural differentiation by placing pluripotent stem cells in an environment similar to embryonic neurogenesis.
  • embryonic neurogenesis various transcription factors are continuously expressed while receiving feedback (external signals) from the external environment, which continues to change with the progress of development. Cells are produced. Therefore, in this method, it is difficult to induce differentiation of only a specific type of neuron, and a heterogeneous cell population including neurons of various subtypes is usually obtained.
  • obtaining a functionally mature neuron takes a long time of several months as in the developmental period (for example, Non-Patent Document 2).
  • the method of inducing differentiation by specific gene expression (sometimes called the Neuronal induction method in order to distinguish it from the method using the external signal) mainly expresses a specific transcription factor to This is a method for forcibly executing a part of a gene expression program responsible for differentiation. For this reason, there is a possibility that the direction of differentiation can be controlled by this method, but there are very few examples in which differentiation of a target type of neurons can be preferentially induced using this method. This is because the effect of gene expression in pluripotent stem cells is difficult to predict from the knowledge obtained by conventional methods. In this method, the time required for differentiation is generally shortened, and mature neurons can be obtained in several days to several weeks.
  • Dopaminergic neurons in the midbrain substantia nigra are differentiated in about 2-3 weeks (for example, Non-Patent Documents 4 and 5).
  • Dopaminergic neurons in the midbrain substantia nigra are neurons that are selectively impaired by Parkinsonism, and it is expected that a cell model of Parkinsonism can be obtained using this method.
  • Ngn2 gene when Ngn2 gene is introduced and expressed in human and mouse pluripotent stem cells, more than 90% of cells are cerebral cortical glutamatergic neurons (more specifically, cortical 2nd and 3rd layer pyramidal cells) Have been reported to differentiate in about 1-2 weeks (Non-patent Document 3, Patent Document 1). Glutamatergic neurons in the cerebral cortex are neurons that are extensively impaired in Alzheimer-type dementia. Neurons produced from familial patient-derived induced pluripotent stem cells using this method can reproduce the A ⁇ processing abnormality of the patient (Patent Document 1), and are expected as a cell model of Alzheimer-type dementia Yes.
  • ALS is a disease in which upper motor neurons in the fifth layer of the cortical motor area and lower motor neurons in the spinal cord are selectively degenerated.
  • the upper motor neuron projects to the lower motor neuron or the nucleus of the pons and medulla, and the path (cortical spinal tract) projecting to the lower motor neuron controls the voluntary movement of the limbs and projects to the pons and medulla
  • the path cortical medullary canal
  • Non-patent Document 7 a method for inducing differentiation of upper motor neurons is not yet known. Not only the neuronal induction method but also the differentiation induction method using an external signal, no example has been reported in which mature upper motor neurons were able to induce differentiation.
  • the present invention has been made in view of the circumstances of the prior art described above, and an object thereof is to provide a method for producing upper motor neurons from pluripotent stem cells. Furthermore, an object of the present invention is to provide pluripotent stem cells that can be converted into upper motor neurons.
  • the present inventors have introduced Ngn2 and Fezl genes into human-derived induced pluripotent stem cells and expressed them, and about 80% of the cells are functional after 3 weeks. Have been found to differentiate into various pyramidal cells. And about 20% of the pyramidal cells express marker genes of the cerebral cortex 5th layer and motor cortex and can project to lower motor neurons in culture to form synapses, that is, functional upper layer It was revealed that it is a motor neuron. Furthermore, it was found that upper motor neurons produced by the above method from artificial pluripotent stem cells derived from familial ALS patients spontaneously develop pathological properties (such as intracellular aggregation of TDP-43 protein) characteristic of ALS. It was issued. Based on these findings, the present invention has been completed.
  • the present invention includes the following.
  • a method for producing pyramidal cells from pluripotent stem cells comprising a step of expressing exogenous Ngn2 and Fezl in pluripotent stem cells and culturing.
  • the exogenous nucleic acid encoding Ngn2 and the exogenous nucleic acid encoding Fezl are nucleic acids functionally joined to a drug-responsive promoter.
  • a screening method for a prophylactic or therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis comprising the following steps: (1) A step of producing exogenous Ngn2 and Fezl in an artificial pluripotent stem cell derived from familial ALS patient and culturing to produce upper motor neurons from the pluripotent stem cell, (2) contacting the upper motor neuron obtained in (1) with a test substance; (3) Upper motor neurons that have been contacted with the test substance in (2) and upper motor neurons that have not been contacted (ie, control cells) are cultured, neurite length, aggregated TDP-43 protein amount, or GPR50 Measuring the expression level of (4) A test substance in which the neurite length or GPR50 expression level of the upper motor neuron contacted with the test substance is higher than the value of the control cell, or aggregation in the upper motor neuron contacted with the test substance A step of selecting a test substance having a reduced TDP-43 protein amount lower than that of the control cell as a preventive or therapeutic agent for amy
  • the present invention provides a method for producing upper motor neurons from pluripotent stem cells and pluripotent stem cells that can be converted into upper motor neurons. Furthermore, the present invention provides an upper motor neuron model and a corticospinal tract model of ALS.
  • DOX + represents cells cultured in a DOX-containing medium, which will be described later
  • DOX ⁇ represents cells cultured in a DOX-free medium.
  • Tuj1 in the figure represents immunostaining using Tuj1 antibody, which is an anti- ⁇ -III tubulin antibody.
  • FIG. 2A For 201B7 (NF stably introduced strain) having exogenous Ngn2 and Fezl genes controlled by a tetracycline-responsive promoter in the chromosome, 7 days after culturing in a medium containing DOX, against ⁇ -III tubulin and hNuc It is the fluorescence-microscope image which performed double immunostaining.
  • FIG. 2B is a process chart illustrating an analysis method.
  • Fig. 2C ⁇ -III tubulin / CaMKII double immunostaining and DAPI staining (Fig. 2C) were performed on the NF stably-introduced strain 7 days after culture in DOX-containing medium.
  • DAPI staining signal left panel
  • CaMKII immunostaining and DAPI staining signal Fig. 2C, middle panel
  • ⁇ -III tubulin / CaMKII double immunostaining and DAPI staining signal Fig. 2C, right panel
  • DAPI staining blue was performed on day 7 after culturing in DOX-containing medium. It is the fluorescence microscope image merged with fluorescence (red).
  • the higher motor neurons differentiated from the NF stably-introduced strains were measured on the 7th day (FIG. 3A) and 21st day (FIG. 3B) after induction of Na / K current (Na / K currents), action potential (Action potentials), and post-synaptic current (Postsynaptic currents).
  • cerebral cortex layer 5 marker genes Ctip2, TLE4, ER81, Sox5
  • motor cortex marker genes Crim1, Diap3, Igfbp4
  • frontal marker genes Robot1, PCDH17
  • cone cell marker genes OX1, CaMKII
  • FIG. 6A is a schematic diagram of a synaptic structure formed by projecting upper motor neurons (green) onto lower motor neurons (red).
  • FIG. 6B, C Shows that upper motor neurons (expressing GFP) differentiated from NF stably introduced strain project to lower motor neurons (expressing TdTOMATO) differentiated from LNI stably introduced strain to form synapses. It is a fluorescence microscope image.
  • FIG. 6C On day 14 after differentiation induction, immunostaining for vGLT1 was performed, and TOMATO / EGFP / vGLT1 triple images (FIG. 6B, left panel) and TOMATO / vGLT1 double image (right panel and FIG. 6B). 6C center panel).
  • the right panel of FIG. 6C is an enlarged view of a region surrounded by a square in the left panel of FIG. 6C.
  • the bar in the figure represents 10 ⁇ m.
  • Double immunostaining with TDP-43 / SMI-32 ( Figure 7A) and TDP-43 / SMI-32 double immunization of neurons differentiated by exogenous Ngn2 and Fezl expression from iPS cell lines derived from familial ALS patients
  • staining (FIG. 7B) is represented. It is the fluorescence microscope image which observed the extension of the neurite of the upper motor neuron differentiated from the iPS cell line derived from a familial ALS patient. Arrows in the right panel represent neurites that have stopped stretching.
  • ALS-UMN red circle
  • Control-UMN light blue circles
  • the reference sequence (Reference Sequence) registered in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database is used as information on the nucleotide sequence (NM_ ⁇ ) of transcripts generated from genes and amino acid sequences (NP_ ⁇ ) of proteins. ) ID.
  • NM_ ⁇ nucleotide sequence
  • NP_ ⁇ amino acid sequences
  • ID amino acid sequences
  • exogenous Ngn2 and Fezl are expressed in pluripotent stem cells and cultured to produce pyramidal cells containing upper motor neurons from pluripotent stem cells.
  • a method is provided. In this method, pluripotent stem cells can be differentiated into cone cells with a high efficiency of about 80%, of which about 20% are upper motor neurons.
  • Ngn2 refers to Ngn2 (Official symbol: NEUROG2, Official full name: neurogenin 2) gene and Ngn2 protein.
  • Ngn2 protein eg human: NP_076924, mouse: NP_033848
  • bHLH factor basic helix-loop-helix transcription factor
  • Fezl refers to Fezl (Official symbol: FEZF2, Official full name: FEZ family zinc finger 2) gene and Fezl protein.
  • Fezl protein (for example, human: NP_060478, mouse: NP_536681) is a zinc finger type transcription factor that has cell bodies in the 5th and 6th layers of the cerebral cortex and projects outside the cortex (subcerebral projection). It is known that it is specifically expressed in the detailed lineage of neuron) (Non-Patent Documents 9 and 10).
  • exogenous Ngn2 and Fezl mean that they are not endogenous Ngn2 and Fezl. Therefore, exogenous expression of Ngn2 and Fezl means that Ngn2 and Fezl are expressed from a nucleic acid (specifically, a nucleic acid encoding Ngn2 and a nucleic acid encoding Fezl) introduced into the cell from the outside, or It means that Ngn2 protein and Fezl protein are introduced into cells from the outside.
  • nucleic acid encoding Ngn2 examples include a nucleic acid having a nucleotide sequence of NM_009718 (mouse), NM_024019 (human), or a transcript variant thereof registered as a standard sequence. Further, the nucleic acid may have a complementarity to such an extent that it can be hybridized to the nucleic acid having the standard sequence and the transcription derivative sequence under stringent conditions.
  • the nucleic acid encoding Fezl includes, for example, DNA having a nucleotide sequence of NM_080433 (mouse), NM_018008 (human), or a transcript derivative thereof registered as a standard sequence. Further, the nucleic acid may have a complementarity to such an extent that it can be hybridized to the nucleic acid having the standard sequence and the transcription derivative sequence under stringent conditions.
  • the stringent conditions are the melting of nucleic acids that bind complexes or probes as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Technologies Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). It can be determined based on temperature (Tm). For example, as washing conditions after hybridization, the conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned.
  • the complementary strand is preferably one that maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions.
  • washing is performed under more severe hybridization conditions such as “0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, more strictly “0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”
  • the conditions for maintaining the hybridized state between the positive strand and the complementary strand can be mentioned.
  • a complementary strand a strand comprising a base sequence that is completely complementary to the target positive strand base sequence, and at least 90%, preferably 95% or more, more preferably, the strand.
  • a chain composed of a base sequence having 97% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl may be either single-stranded or double-stranded, and may be either DNA or RNA. Further, it may be a DNA / RNA chimera or a DNA-RNA hybrid. Of these, double-stranded DNA or single-stranded RNA is preferred.
  • the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl can include a control sequence for expressing Ngn2 and Fezl.
  • control sequence include a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, and polyadenylation. Examples include sequences such as sites.
  • selectable marker sequences such as drug resistance genes (for example, kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, etc.), thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, fluorescent protein, ⁇ -glucuronidase (GUS ), Or a reporter gene sequence such as FLAG.
  • the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl are operably linked via an IRES or 2A coding sequence (hereinafter abbreviated as 2A sequence) so that Ngn2 and Fezl are expressed polycistronically. May be.
  • 2A sequence 2A coding sequence
  • the two proteins can be expressed simultaneously and equimolarly (Nat. Biotech., 5, 589-594, 2004), which is particularly preferable in the present invention.
  • the 2A sequence may be derived from any virus, but is preferably the 2A sequence of foot-and-mouth disease virus (FMDV) (J. General Virology, 89, 1036-1042, 2008).
  • modified nucleotides can be preferably included for the purpose of improving stability.
  • modified nucleotides include sugar-modified ribonucleotides (eg, 2′-fluoro, 2′-O-methyl, or 2′-O-methoxyethyl modified ribonucleotides), backbone modified ribonucleotides (Eg, S-nucleotide (Phosphorothioate), etc.), base-modified ribonucleotides (eg, 5- (2-amino) propyluridine, 5-bromouridine, etc.), and nucleotide analogues (2 ′, 4 ′ -BNA (bridge nucleic acid) / LNA (Locked Nucleic Acid) (Koshkin et al., J.
  • the method for introducing a nucleic acid encoding Ngn2 and a nucleic acid encoding Fezl into a pluripotent stem cell is not particularly limited.
  • lipofection, liposome, microinjection, etc. in the form of introduction into a vector such as a virus, plasmid, artificial chromosome, etc. This can be introduced into pluripotent stem cells.
  • virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors, and the like.
  • the artificial chromosome vector examples include human artificial chromosome (HAC), yeast artificial chromosome (YAC), and bacterial artificial chromosome (BAC, PAC).
  • HAC human artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosome
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • PAC bacterial artificial chromosome
  • any plasmid for mammals can be used.
  • the control sequence for expressing Ngn2 and Fezl, the selection marker sequence, the reporter gene sequence, and the like may be supplied by a vector.
  • the vector preferably has a transposon sequence for efficiently inserting the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl into the chromosome of a pluripotent stem cell.
  • the transposon sequence that can be used in the present invention is not particularly limited, and preferred examples include the transposon sequence of piggyBac transposon (Yusa M., et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 108: 1531). -1536, 2011).
  • nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl are single-stranded, they may be introduced into pluripotent stem cells by techniques such as electroporation, lipofection, and microinjection. In order to maintain the expression level in the cell, introduction may be performed a plurality of times, for example, 2, 3, 4, or 5 times.
  • exogenous Ngn2 and Fezl when introducing exogenous Ngn2 and Fezl in the form of protein, they can be introduced by techniques such as lipofection and microinjection, for example. In that case, you may introduce
  • Ngn2 and Fezl are preferably controlled by an inducible promoter.
  • inducible promoters include drug-responsive promoters, and preferred examples include tetracycline-responsive promoters (CMV minimal promoter having a tetracycline response element (TRE) in which tetO sequences are 7 consecutive times).
  • CMV minimal promoter having a tetracycline response element (TRE) in which tetO sequences are 7 consecutive times.
  • the promoter is a promoter that is activated by supplying tetracycline or a derivative thereof under the expression of a reverse tetracycline-regulated transactivator (rtTA; a fusion protein composed of reverse tetR (rTetR) and VP16AD). is there. Therefore, when expression induction is performed using a tetracycline-responsive promoter, it is preferable to use a vector having a mode for expressing the activator.
  • rtTA reverse tetracycline-regulated transactivator
  • rTetR reverse tetR
  • VP16AD reverse tetR
  • DOX doxycycline
  • Expression induction systems using drug responsive promoters other than the above include expression induction systems using estrogen responsive promoters (eg, WO2006 / 129735), RheoSwitch mammalian inducible expression systems using promoters induced by RSL1 (New England Biolabs), Q-mate system (Krackeler Scientific) or Cumate inducible expression system (National Research Council (NRC)) using a promoter induced by cumate, and a promoter having an ecdysone responsive sequence. Examples include the used GenoStat inducible expression system (Upstate cell signaling solutions).
  • a drug-responsive promoter as described above is used, a drug capable of inducing the activation of the promoter (for example, tetracycline or DOX in the case of a vector containing the tetracycline-responsive promoter) is added to the medium for a desired period. By continuing to add, the expression of exogenous Ngn2 and Fezl can be maintained. Then, it is possible to stop the expression of the gene by removing the drug from the medium (for example, replacing the medium with a medium not containing the drug).
  • a drug capable of inducing the activation of the promoter for example, tetracycline or DOX in the case of a vector containing the tetracycline-responsive promoter
  • the nucleic acid encoding Ngn2 and the nucleic acid encoding Fezl are joined to a constitutive promoter in a non-functional form, and the joining state is functionally joined at a desired time.
  • a specific sequence sandwiched between LoxP sequences between the constitutive promoter and the sequence encoding the gene for example, a sequence encoding a drug resistance gene or a sequence inducing transcription termination
  • a method of converting the joined state into a functional joined state by removing Cre and interposing the LoxP sequence at a desired time can be used.
  • an FRT sequence or a transposon sequence may be used instead of the LoxP sequence
  • FLP flipase
  • the transposon eg, piggyBac transposon
  • Constitutive promoters include SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Moloney mouse leukemia virus) LTR, HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter, EF- ⁇ promoter, CAG promoter and the like.
  • Cre, FLP, and transposon are allowed to act again after a desired period of time to cause the sequence (LoxP sequence, FRT).
  • the expression of the gene can also be stopped by removing a sequence sandwiched between sequences or transposon sequences).
  • the expression period of the gene is controlled by using a vector that can be easily eliminated from the cell, such as an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a Sendai virus vector, a plasmid, or an episomal vector. Is also possible.
  • the expression of exogenous Ngn2 and Fezl is preferably maintained for 3 days or more, and the effects of the present invention can be achieved in any of 4, 5, 6, and 7 days. Particularly preferred is 7 days.
  • the period for maintaining the expression is not disadvantageous for the production of upper motor neurons and cone cells, but preferably 3 days or more and 14 days or less, particularly preferably 7 days or more and 14 days or less. is there.
  • the pluripotent stem cell is a stem cell that has pluripotency capable of differentiating into all cells present in a living body and also has proliferative ability.
  • Examples include, but are not limited to, embryonic stem cells (embryonic stem cells; ES cells), embryonic stem cells derived from nuclear transfer by nuclear transfer (nuclear transfer embryonic stem cells; ntES cells), sperm stem cells ( spermatogonial stem cells (GS cells), embryonic germ cells (EG cells), induced pluripotent stem cells (plspotent stem cells; iPS cells), cultured fibroblasts and bone marrow stem cell-derived pluripotent cells (Muse) Cell) and the like.
  • the pluripotent stem cells suitable for the present invention are ES cells and iPS cells, particularly preferably iPS cells.
  • iPS cells have characteristics similar to those of ES cells (for example, pluripotency and proliferation ability by self-replication) that can be generated by introducing a specific reprogramming factor into somatic cells in the form of DNA or protein.
  • Artificial stem cells derived from somatic cells K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); International Publication WO 2007/069666).
  • the reprogramming factor is a gene that is specifically expressed in ES cells, its gene product or non-cording RNA, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non-cording RNA, or It may be constituted by a low molecular compound.
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1 etc. are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • pluripotent stem cell lines can be preferably used, and commercially available mouse and human ES cell lines and iPS cell lines may be used.
  • human ES cell lines for example, KhES-1 (HES0001), KhES-2 (HES0002), and KhES-3 (HES0003) strains are available from the RIKEN BioResource Center (Cell Development Materials Laboratory; http://cell.brc.riken.jp/en/).
  • iPS cell lines established from healthy individuals include, for example, 201B7 (HPS0063), 253G1 (HPS0002), 409B2 (HPS0076), and 454E2 (HPS0077) strains.
  • CiRA0021 (HPS0327), CiRA0022 (HPS0290), CiRA0023 (HPS0291), CiRA0024 (HPS0292), CiRA0025 (HPS0293), and CiRA0026 (HPS0294) established by the present inventor are all available from the center. .
  • the alphanumeric characters in parentheses after the above stock name indicate the deposit number.
  • Various pluripotent cell lines are also available from Coriell Institute (https://catalog.coriell.org).
  • the pluripotent stem cells that can be used for the production of pyramidal cells including the upper motor neurons according to the present invention are iPS cells established from disease patients and disease causative genes have been introduced from the viewpoint of producing disease models. It may be a pluripotent stem cell derived from a healthy person or a pluripotent stem cell derived from a healthy person functionally deleted from a disease causative gene.
  • the pluripotent stem cells suitable for preparation of the disease model will be described in detail in “3. Provision of disease model”.
  • ⁇ Culture method> Exogenous Ngn2 and Fezl are introduced, and the pluripotent stem cells expressing Ngn2 and Fezl are cultured in a medium suitable for inducing differentiation into neurons (hereinafter referred to as a neuronal differentiation medium). It is preferable.
  • a neuronal differentiation medium a basal medium alone or a basal medium supplemented with a neurotrophic factor can be used.
  • the neurotrophic factor in the present invention is a ligand of a membrane receptor that plays an important role in the survival and function maintenance of nerve cells.
  • Nerve Growth Factor NGF
  • Brain-derived Neurotrophic Factor BDNF
  • Neurotrophin 3 NT-3
  • Neurotrophin 4/5 NT-4 / 5
  • Neurotrophin 6 NT-6
  • basic FGF acidic FGF
  • FGF-5 Epidermal Growth Factor
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • Insulin Insulin Like Growth Factor 1 (IGF 1), Insulin Like Growth Factor 2 (IGF 2), Glia cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF), TGF-b2, TGF-b3, Interleukin 6 (IL-6)
  • Examples include Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) and LIF.
  • preferred neurotrophic factors in the present invention are GDNF, BDNF, and NT-3.
  • the basic medium include, for example, Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 (F12) Medium, Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12) medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal Medium medium (Lifetechnologies), and mixed media thereof. Serum may or may not be contained in the basic medium (ie serum-free).
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • albumin transferrin
  • apotransferrin fatty acid
  • serum replacements such as insulin, collagen precursor, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol
  • lipids amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen)
  • substances such as non-essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, selenate, progesterone and putrescine may be added.
  • a medium obtained by adding N2 supplement, B27 supplement, BDNF, GDNF, and NT3 to a mixed medium in which DMEM / F12 medium and Neurobasal Medium medium are mixed at a volume ratio of 1: 1 is suitably used as a neuronal differentiation medium.
  • a medium obtained by adding N2 supplement, B27 supplement, BDNF, GDNF, and NT3 to a mixed medium in which DMEM / F12 medium and Neurobasal Medium medium are mixed at a volume ratio of 1: 1 is suitably used as a neuronal differentiation medium. Can be used.
  • glial cells refer to non-neuronal cells constituting the nervous system, and examples include microglia, astrocytes, oligodendrocytes, ependymocytes, and Schwann cells. Of these, the most preferred glial cells in the present invention are astrocytes.
  • pluripotent stem cells introduced with exogenous Ngn2 and Fezl are seeded / cultured on a feeder layer of glial cells (particularly preferably astrocytes) to induce expression of the exogenous gene.
  • glial cells particularly preferably astrocytes
  • the glial cells used in the present invention may be human or mouse, and mouse glial cells are preferred from the viewpoint of availability.
  • Glial cells can be readily prepared from mouse fetal or neonatal brain according to methods well known to those skilled in the art (for example, Jacquier A., et al, Hum. Mol. Genet., 18: 2127-2139, 2009).
  • the culture temperature for culturing the pluripotent stem cells expressing exogenous Ngn2 and Fezl to induce differentiation into upper motor neurons is not particularly limited, but is about 30-40 ° C, preferably about 37 ° C. Cultivation in an atmosphere of CO 2 containing air is preferred, and the CO 2 concentration is preferably about 2-5%.
  • Cone cells are glutamatergic excitatory neurons present in the cerebral cortex and hippocampus. Cone cells are classified into various subtypes based on their morphological and physiological characteristics, and each is thought to play a different role in terms of function.
  • a “cell having at least one ⁇ -III tubulin or MAP2 (microtubule-associated protein 2) -positive process (sometimes referred to as a neurite)” is defined as a “neuron”.
  • the “cone cell” in the present invention is defined as “a cell that satisfies the definition of neuron and expresses one or more cone cell marker genes”.
  • cone cell marker gene examples include CaMKII (calcium / calmodulin-dependent protein kinase II; human: NM_015981, NP_057065, mouse: NM_177407, NP_803126), OTX1 (orthodenticle homeobox 1; NM_014562, NP_055377) and the like.
  • CaMKII calcium / calmodulin-dependent protein kinase II
  • human NM_015981, NP_057065, mouse: NM_177407, NP_803126
  • OTX1 orthodenticle homeobox 1; NM_014562, NP_055377
  • the upper motoneurons of the cerebrum have cell bodies in the fifth layer of the cerebral cortical motor area, and are represented by lower motoneurons of the entire spinal cord or large pyramidal cells that project to the nucleus of the bridge and medulla.
  • a cell satisfying the definition of the neuron A cell that expresses one or more marker genes of the fifth layer of the cerebral cortex and one or more marker genes of the motor cortex, or A cell that expresses one or more marker genes of the cerebral cortex layer 5 or motor cortex and has a cell body diameter of 15 ⁇ m or more (more preferably 20 ⁇ m or more) ”, Is defined as “upper motor neuron”.
  • cerebral cortex layer 5 marker gene examples include Ctip2 (Couptf-interacting protein 2, also known as B-cell CLL / lymphoma 11B; NM_138576, NP_612808), TLE4 (transducin like enhancer of split 4; NM_001282748, NP_001269677) , ER81 (ets variant 1; NM_004956, NP_004947), Sox5 (SRY-box 5; NM_006940, NP_008871), and the like.
  • Ctip2 Couptf-interacting protein 2, also known as B-cell CLL / lymphoma 11B; NM_138576, NP_612808)
  • TLE4 transducin like enhancer of split 4; NM_001282748, NP_001269677
  • ER81 ets variant 1; NM_004956, NP_004947
  • Sox5 SRY-box 5; NM_006940, NP_0088
  • motor area marker gene examples include Crim1 (cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 (chordin-like); NM_016441, NP_057525), Diap3 (diaphanous related formin 3; NM_001042517, NP_001035982), Igfbp4 (insulin like growth factor) binding protein 4; NM_001552, NP_001543) and the like.
  • functional differentiation is completed for “a cell that satisfies the definition of the upper motor neuron and can form a synaptic connection with a lower motor neuron as a presynaptic cell”. It is called “mature upper motor neuron” in the sense of the upper motor neuron.
  • producing a pyramidal cell means obtaining a cell population containing 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more of the cells satisfying the definition of the pyramidal cell.
  • producing upper motor neurons means obtaining a cell population containing 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 15% or more of cells that satisfy the definition of the upper motor neuron.
  • a method for producing a pyramidal cell including upper motor neurons is synonymous with “a method for manufacturing upper motor neurons”.
  • pluripotent stem cells that can be converted into upper motor neurons are provided.
  • the pluripotent stem cell introduced with the exogenous Ngn2 and Fezl is converted to a pyramidal cell with a high efficiency of about 80% by expressing the Ngn2 and Fezl, and further about 16% (that is, the cone) It is a cell that can be converted into upper motor neurons with an efficiency of about 20% of somatic cells).
  • pluripotent stem cells that can be converted into pyramidal cells
  • pluripotent stem cells into which only Ascl1 (Non-patent Document 11) or Ngn2 only (Non-patent Document 3 and Patent Document 1) are introduced as foreign genes have been introduced. Although reported, none have been shown to produce upper motor neurons. Therefore, the pluripotent stem cell introduced with exogenous Ngn2 and Fezl according to the present invention is the first pluripotent stem cell that has been confirmed to be convertible into upper motor neurons.
  • the pluripotent stem cell that can be converted into the upper motor neuron according to the present invention is preferably retained in the chromosome in a manner capable of inducing expression of the exogenous Ngn2 and Fezl.
  • upper motor neurons can be produced from the pluripotent stem cells at a desired time, and the pluripotent stem cells can be stably maintained as a cell line.
  • the mode in which the expression can be induced for example, the various modes described in the section ⁇ Control of expression of exogenous Ngn2 and Fezl> can be used.
  • a mode in which the nucleic acids encoding the exogenous Ngn2 and Fezl are functionally joined to a promoter capable of inducing expression is preferred, and the promoter is preferably a drug-responsive promoter.
  • the pluripotent stem cell that can be converted into a higher motor neuron according to the present invention is administered to an animal including a human in the state of a pluripotent stem cell, and then induced to differentiate, thereby being converted into a higher motor neuron at the administration site.
  • the administration site is preferably the cerebral cortex, more preferably the fifth layer of the cerebral cortex.
  • the pluripotent stem cell which can be converted into the upper motor neuron according to the present invention may be used as a cell preparation for replenishing the upper motor neuron lost due to a disease or the like.
  • a cell model of the corticospinal tract in which upper motor neurons project onto lower motor neurons is provided.
  • the slice culture method has been known as a technique to transfer neurons from animal tissue while maintaining nerve communication, but in this method, nerve connection across different tissues such as the brain and spinal cord is preserved. Is impossible (at least for now).
  • it is possible to collect upper and lower motor neurons from the brain and spinal cord of experimental animals and co-culture them no examples have been reported in mammals that could reconstruct neural communication between both motor neurons in culture. .
  • the upper motor neuron produced using the method according to the present invention can form a synaptic connection in which the upper motor neuron is a presynaptic cell and the lower motor neuron is a post-synaptic cell by co-culture with the lower motor neuron. It can be a cell. Therefore, the culture containing the synaptic connection is the first cortical spinal tract cell model in mammals.
  • a method of inducing differentiation of the lower motor neurons from pluripotent stem cells by an external signal for example, Non-Patent Document 12
  • a method of inducing differentiation by expressing exogenous Lhx3, Ngn2, and Isl1 in pluripotent stem cells Patent Document 1
  • a method of inducing differentiation by expressing Ascl1, Brn2, Myt11, Lhx3, Hb9, Isl1, Ngn2, and NeuroD1 in somatic cells (Non-patent Document 7).
  • the method of inducing differentiation by expressing exogenous Lhx3, Ngn2, and Isl1 in pluripotent stem cells is preferable because lower motor neurons can be stably produced in a short period of time.
  • the corticospinal tract model according to the present invention can be used as an analysis system for projection mechanisms and information transmission mechanisms of upper motor neurons to lower motor neurons, which has heretofore been difficult to analyze at the molecular level.
  • a cell model of a disease accompanied by abnormalities in upper motor neurons is provided.
  • the cell model is obtained by applying the method for producing upper motor neurons according to the present invention to a patient-derived iPS cell having a disorder in which the upper motor neuron is impaired, or a pluripotent stem cell into which a gene mutation derived from the patient is introduced. It can be obtained by application.
  • the disease include amyotrophic lateral sclerosis (ALS), primary lateral sclerosis (PLS), and the like.
  • ALSOD The Amyotrophic
  • iPS cells established from familial patients are preferable.
  • familial ALS patients include SOD1 (superoxide dismutase 1, soluble; NM_000454), TDP-43 (NM_007375, NP_031401), FUS (FUS RNA binding protein; NM_004960), ALS2 (NM_020919), ADAR2 (adenosine deaminase, RNA -specific, B1; NM_001112), C9orf72 (chromosome 9 open reading frame 72; NM_14500), GRN (granulin; NM_002087), PFN1 (profilin 1; NM_005022), EPHA4 (EPH receptor A4; NM_001304537), ERBB4 (erb-reb-b) tyrosine kinase 4, NM_005235), ANG (Homo sapiens angiogenin, ribonucle
  • the pluripotent stem cell introduced with the gene mutation derived from the patient is a pluripotent stem cell into which the mutant gene identified in the patient with the disease is introduced or the endogenous gene is functionally deleted. Good.
  • the pluripotent stem cell used for this purpose is a pluripotent stem cell derived from a healthy person. For example, since many of the SOD1, TDP-43, and FUS gene mutations that are known to cause ALS are gain-of-function mutations, the introduction of such gene mutations into pluripotent stem cells derived from healthy subjects It may be introduced.
  • the method for introducing the mutant gene into pluripotent stem cells is not particularly limited, and for example, the method described in the section ⁇ Introduction of exogenous Ngn2 and Fezl> may be used.
  • loss-of-function mutations are also known as gene mutations that cause ALS (for example, ALS2 and ADAR2 gene mutations), and the introduction of these gene mutations resulted in functional disruption of endogenous genes (ie, knockout). It's okay.
  • Functional disruption of the gene can be performed using methods well known to those skilled in the art, for example, the CRISPR-Cas9 system (Gaj T., et al, Trends Biotechnol., 31: 397-405, 2013; Doudna JA, et al, Science, 346, no. 6213, 2014), and TAL effector-Like Effector Nuclease (TALEN) system (Miller JC, et al, Nat. Biotechnol., 29: 143-148, 2011) etc. May be used.
  • CRISPR-Cas9 system Gaj T., et al, Trends Biotechnol., 31: 397-405, 2013; Doudna JA, et al, Science, 346, no. 6213, 2014
  • TALEN TAL effector-Like Effector Nuclease
  • Exogenous Ngn2 and Fezl are introduced into iPS cells derived from the diseased patient, or a pluripotent stem cell derived from a healthy person into which a mutant type gene identified in the diseased patient has been introduced or the corresponding wild type gene is functionally disrupted.
  • iPS cells derived from the diseased patient
  • a pluripotent stem cell derived from a healthy person into which a mutant type gene identified in the diseased patient has been introduced or the corresponding wild type gene is functionally disrupted.
  • the upper motor neuron produced by the above method may be used as a higher motor neuron model of the disease as it is, or co-cultured with the lower motor neuron to synapse (the upper motor neuron is a presynaptic cell, the lower motor It may be used in a state in which a synaptic connection in which a neuron is a post-synaptic cell is formed.
  • a method for screening a preventive or therapeutic agent for a disease associated with abnormalities in upper motor neurons includes a step of analyzing the effect of a test substance on the above-described disease model (upper motor neuron model, corticospinal tract model, etc.).
  • the screening method may be, for example, a method including the following steps (1) to (4).
  • (1) A step of producing exogenous Ngn2 and Fezl in an artificial pluripotent stem cell derived from familial ALS patient and culturing to produce upper motor neurons from the pluripotent stem cell, (2) contacting the upper motor neuron obtained in (1) with a test substance; (3) Upper motor neurons that have been contacted with the test substance in (2) and upper motor neurons that have not been contacted (ie, control cells) are cultured, neurite length, aggregated TDP-43 protein amount, or GPR50 Measuring the expression level of (4) A neurite length of a higher motor neuron contacted with the test substance, or a test substance whose GPR50 expression level is higher than that of a control cell, or a higher motor neuron contacted with the test substance A step of selecting a test substance in which the amount of aggregated TDP-43 protein is lower than that of control cells as a preventive or therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis
  • test substance used in the screening method of the present invention examples include proteins, peptides, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, synthetic low molecular compounds, natural compounds, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts. , Plasma, extracts derived from marine organisms, cell culture supernatants, microbial fermentation products, and the like. These substances may be either novel or known.
  • the contact between the upper motor neuron and the test substance can be performed by adding the test substance to a culture medium containing the upper motor neuron.
  • the contact period is not particularly limited as long as the change in the index can be confirmed, but for example, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days It may be above, More preferably, it is 2 days.
  • the termination of the contact period can be performed, for example, by exchanging the medium with a medium not containing the test substance.
  • the concentration of the test substance to be added can be appropriately adjusted depending on the type of compound (solubility, toxicity, etc.).
  • the test substance may be selected using as an index one or more values selected from the neurite length of the upper motor neuron, the aggregated amount of TDP-43 protein, and the expression level of GPR50. Specifically, when the value of the neurite length or GPR50 expression level in the upper motor neuron contacted with the test substance is higher than the value of the upper motor neuron (control cell) not contacted with the test substance, or When the value of the aggregated TDP-43 protein amount in the upper motor neurons in contact with the test substance is lower than that of the control cells, the test substance can be selected as a preventive or therapeutic agent for ALS.
  • the preventive and / or therapeutic agent in the present invention includes those that become seed compounds.
  • TDP-43 protein is mainly localized in the nucleus in healthy individuals, but is known to migrate from the nucleus to the cytoplasm (in the cytoplasm) and aggregate in ALS patients. It is thought to be deeply involved in the development of ALS. It has been clarified for the first time in this application that the expression level of GPR50 is significantly reduced in ALS patients.
  • the measurement of the neurite length can be performed using a method well known to those skilled in the art.
  • the neurite length may be automatically measured using a cell image analyzer (in-cell analyzer).
  • the amount of the aggregated TDP-43 protein can also be measured using a method well known to those skilled in the art.
  • DAPI nuclear staining and immunostaining for TDP-43 are performed, and do not merge with the DAPI nuclear staining signal.
  • the amount of TDP-43 signal may be automatically measured using a cell image analyzer.
  • the GPR50 expression level can also be measured using methods well known to those skilled in the art. For example, in situ hybridization is performed using a fluorescently labeled probe, and the signal is automatically detected using a cell image analyzer. The method of measuring is mentioned.
  • the index value of the upper motor neuron contacted with the test substance is 1.5 times or more, 1.6 times or more, 1.7 times or more, 1.8 times or more, 1.8 times or more, 1.9 times or more, compared to the value of the control cells. You may judge “high value” when it is 2 times or more, 2.5 times or more, or 3 times or more. In addition, when the value of the index of the upper motor neuron contacted with the test substance is 80%, 70%, 60%, 50%, or 40% or less compared to the value of the control cell, the “low value” It may be judged.
  • the control cells in the present invention include upper motor neurons that have been brought into contact with drugs that have been confirmed to be ineffective.
  • 201B7 strain distributed by Dr. Shinya Yamanaka of Kyoto University iPS Cell Laboratory was used as human iPS cells unless otherwise specified (Takahashi K, et al, Cell, 131: 861- 72, 2007).
  • the 201B7 strain is an iPS cell line established by healthy individuals and can also be obtained from the RIKEN BioResource Center Cell Development Materials Room (deposit number HPS0063).
  • the ND32947E18 strain obtained from the US Collier Institute was used as the iPS cell line (used in Example 3) established from a familial ALS patient having the G298S mutation in the TDP-43 gene.
  • mice cDNA was used as an exogenous gene; Ngn2 (NM_009718), Fezl (NM_080433), Brn2 (NM_008899), Ascl1 (NM_008553), Myt1l (NM_001093775), Lhx3 (NM_001039653), Isl1 (NM_021459AC).
  • ⁇ Method 1 Culture of pluripotent stem cells and induction of foreign gene expression> A human-derived NF stable-introduced strain is dissociated into single cells by treatment with Accutase (Innovative Cell Technologies), and then coated with matrigel (BD Biosciences) or a plastic plate with astrocytes cultured Inoculated at a cell density of about 2 ⁇ 10 5 cells / well.
  • the media used were neural differentiation media (1% N2 supplement (Invitrogen), 2% B27 supplement (Invitrogen), 10 ng / ml BDNF (R & D Systems), 10 ng / ml GDNF (R & D Systems), and 10 ng.
  • / ml NT3 (R & D Systems) is a mixed medium of DMEM / F12 medium and Neurobasal Medium medium (mixing volume ratio is 1: 1, both are Life Technologies).
  • the medium was replaced with a medium for neural differentiation (hereinafter referred to as DOX-containing medium) supplemented with 1 ⁇ g / ml DOX (Clontech) to induce the expression of the exogenous gene. Thereafter, the medium was changed by half every two days.
  • DOX-containing medium a medium for neural differentiation
  • Non-patent Document 11 It has been reported that introduction and expression of a single gene produces not only glutamatergic neurons but also various subtypes of neurons including GABAergic neurons (Non-patent Document 11). Therefore, expecting that upper cell neurons are included in the cell population obtained by single expression of Ascl1, introduced and expressed nucleic acid encoding Ascl1 into KH2 strain (normal mouse ES cell strain) and 201B7 strain. The obtained cells were analyzed using an immunostaining method. However, analysis of about 200,000 cells for each cell line did not find cells that met the definition of upper motor neurons (data not disclosed).
  • the Neuronal induction method is a new method whose first successful example was reported in 2009, and its results are still very limited.
  • examples of differentiation induction of neurons constituting the cerebral cortex by the Neuronal induction method include the three genes of Brn2, Ascl1, and Myt1l (in addition to “BAM” in addition to Non-Patent Documents 3 and 12 and Patent Document 1 described above).
  • An example of introducing and expressing a factor referred to as non-patent document 13
  • BAM expression vector Based on the pDEST31 expression vector (manufactured by Invitrogen Life Technologies), nucleic acids encoding Brn2, Ascl1, and Myt1l were linked via a 2A sequence, and downstream of them, a nucleic acid encoding mCherry was linked via an IRES sequence.
  • a vector hereinafter referred to as a BAM expression vector
  • a BAM expression cassette an expression cassette in which the nucleic acid was operably joined to a tetracycline responsive promoter was prepared.
  • Brn2, Ascl1, Myt1l, and mCherry are polycistronically expressed from the expression cassette in response to tetracycline or a derivative thereof.
  • the BAM expression cassette is inserted between two Frt sequences.
  • the BAM expression vector was introduced into the KH2 strain together with a nucleic acid encoding flipase using the electroporation method.
  • the KH2 strain is a mouse ES cell line that has a Frt sequence downstream of the ColA1 locus and expresses the reverse tetracycline-regulated transactivator M2rtTA under the control of the endogenous R26 promoter (Beard C, et al ., Genesis 2006; 44: 23-28).
  • Drug selection was performed on the introduced cells, and cells in which the BAM expression cassette was inserted into the chromosome were selected and established.
  • the cell line was immunostained, and cell lines maintaining the expression of marker genes (NANOG and SSEA1) of undifferentiated cells were further selected to obtain clone 1 and clone 8.
  • FIG. 1 shows the result of immunostaining for ⁇ -III tubulin 72 hours after the start of induction. Cells satisfying the definition of the neuron were observed, but no cell satisfying the definition of the upper motor neuron was found (analysis result of about 20,000 cells).
  • encephalopsin, csmn1, cadherin22, pcp4, netrin-G1 in the later stage Have been reported to be significantly upregulated in the cell lineage of upper motor neurons.
  • fezl, cadherin13, etc. are reported as genes that are expressed in upper motor neurons throughout the development phase
  • lgfbp4, diap3, S100a10, etc. are genes that are specific to the cell lineage of upper motor neurons in comparison with Callosal projection neuron. is doing.
  • fezl and cadherin13 are expressed not only in upper motor neurons but also in other subcortical projection neurons (for example, Corticotectal projection neuron) existing in the cortical layer 5 (Non-patent Document 10). .
  • the present inventor examined the above-mentioned gene that was reported to be expressed in upper motor neurons in the subtype determination stage. Surprisingly, it was found that when Ngn2 and Fezl are combined, pluripotent stem cells can be induced to differentiate into pyramidal cells with high efficiency. The analysis method used will be described below.
  • NF expression vector a vector comprising an expression cassette (hereinafter referred to as an NF expression cassette) in which a nucleic acid encoding a mCherry linked via an IRES sequence is operably linked to a tetracycline responsive promoter.
  • F expression vector a vector from which the nucleic acid encoding Ngn2 was deleted from the NF expression cassette
  • NF stable introduction strain The NF expression vector was introduced into the 201B7 strain using an electroporation method together with a nucleic acid encoding piggyBac transposase. Thereafter, the cells were cultured in a medium containing neomycin (50 ⁇ g / ml), and the cells in which the two expression cassettes were inserted into the chromosome were selected and established. Furthermore, immunostaining was performed on the established cell line, and a cell line maintaining the expression of marker genes (NANOG and SSEA1) of undifferentiated cells (hereinafter referred to as NF stable introduction strain) was selected.
  • NF stable introduction strain a stable introduced strain (hereinafter referred to as F stable introduced strain) was prepared using the same technique.
  • FIG. 2A shows the results of double immunostaining of cells 7 days after expression induction with Tuji antibody against ⁇ -III tubulin and human-specific Nuc antibody ( ⁇ what is hNuc antibody?). Expression of ⁇ -III tubulin was observed in almost all hNuc positive cells (that is, human cells).
  • FIG. 2C The right panel of FIG. 2C is an image obtained by merging the ⁇ -III tubulin signal (red), the CaMKIIA signal (green), and the DAPI nuclear staining signal (blue). About 80% of ⁇ -III tubulin positive cells were CaMKII positive. Therefore, it was revealed that about 80% of the neurons differentiated by the expression of exogenous Ngn2 and Fezl from the stably introduced NF strain were pyramidal cells.
  • the F stable-introduced strain was also induced for exogenous Fezl expression, and the same analysis was performed 7 days later.
  • the F stably-introduced strain neither ⁇ -III tubulin nor CaMKII expression was confirmed, the cell body remained flat, and no protrusion extension was observed (right panel in FIG. 2D).
  • Example 2 Subtype analysis of differentiation-induced neurons Subtypes of neurons induced to differentiate from pluripotent stem cells by expression of exogenous Ngn2 and Fezl were analyzed.
  • Differentiated cells were compared to control cells that were not induced to differentiate (cells cultured for 7 days in DOX-free medium; DOX-), but they had pyramidal marker genes (OTX1 and CaMKII), cerebral cortex
  • the expression of the five-layer marker genes (Ctip2, TLE4, ER81, and Sox5) and the frontal marker genes (SPGAP1, Robo1, and PCDH17) were all significantly increased.
  • the motor area marker genes Crim1, Diap3, Igfbp4
  • the expression of Crim1 and Diap3 was significantly increased, and the expression of Igfbp4 was also slightly increased (FIG. 3).
  • the cell population includes cells differentiated into upper motor neurons.
  • the expression of Sox5 and Ctip2 which are known to be expressed in the early stage of subtype determination to upper motor neurons, is very high, so there are many cells that are in the process of differentiation and maturation into upper motor neurons. It was strongly suggested.
  • Crim1 motor area marker
  • CaMKII calcium metal marker
  • double immunostaining for Crim1 and ⁇ -III tubulin (FIG. 5B) and CaMKII and ⁇ -III tubulin (FIG. 5C) was performed on the cells 21 days after the expression induction.
  • ⁇ -III tubulin positive cells both have thickened cell bodies and long neurites and have differentiated into neurons.
  • FIG. 5C almost all ⁇ -III tubulin positive cells were CaMKII positive, and it was confirmed that almost all cells differentiated into neurons were pyramidal cells.
  • FIG. 5B some of the ⁇ -III tubulin positive cells (about 20%) were Crim1 positive, and the cell diameters of the double positive cells were all 15 ⁇ m or more (FIG. 5B). .
  • the Crim1-positive cells were all positive when immunostained with Ctip2 (5th layer marker) (data not disclosed).
  • LNI stable expression strain As a resource of lower motor neurons, a cell line of “MN factor introduction-human normal control-derived iPS cells” prepared by the present inventor in Patent Document 1 was used.
  • the cell line (hereinafter referred to as LNI stable expression strain) is expressed polycistronically in response to tetracycline or a derivative thereof in the same manner as the NF stable expression strain preparation.
  • the 201B7 strain has an expression cassette inserted into the chromosome.
  • the LNI stably-introduced strain can generate functionally mature lower motor neurons in about 14 days by DOX treatment (Patent Document 1).
  • This LNI stably-introduced strain was infected with a lentivirus encoding TdTOMATO whose expression is controlled by the HB9 promoter, and modified so as to emit TdTOMATO fluorescence (red) when differentiated into lower motor neurons.
  • NF stable introduction strain prepared in Example 1 was infected with a lentivirus encoding EGFP expression-controlled by the CaMKII promoter, and modified to emit EGFP fluorescence (green) when differentiated into pyramidal cells.
  • vGLT1 vesicular glutamate transporter 1
  • vGLT1 is a transporter that localizes on the membranes of synaptic vesicles of glutamatergic neurons and carries glutamate into the vesicles.
  • FIGS. 6B and 6C show images of a site where the neurite of the upper motor neuron is in contact with the cell body of the lower motor neuron and / or its neurite.
  • the cell body of the lower motor neuron and the neurite are in contact with a long green neurite (a neurite derived from a different upper motor neuron) extending from different directions.
  • a plurality of dot signals (blue) of vGLT1 are observed at and near the contact site.
  • the right panel in FIG. 6B shows an image in which only the TdTOMATO signal (red) and the vGLT1 signal (blue) are superimposed.
  • more blue dots (vGLT1 signal) than in the left panel were observed at and near the site where the upper motor neuron neurites and lower motor neurons were in contact.
  • FIG. 6C shows a TdTOMATO / EGFP / vGLT1 triple image (left panel) of a region where the neurite of the upper motor neuron extending from the left side of the visual field contacts the neurite of the lower motor neuron in a visual field different from FIG. 6B.
  • TdTOMATO / vGLT1 double image (middle panel).
  • the right panel is a triple image in which the area surrounded by a square (contact part) in the left panel is enlarged.
  • vTLT1 dot-like is formed at the tip that contacts the lower motor neuron. It can be seen that the signal (blue) is accumulated.
  • pluripotent stem cells introduced with exogenous Ngn2 and Fezl and pluripotent stem cells introduced with exogenous Lhx3, Ngn2, and Isl1 were co-cultured to express the expression of all exogenous genes. It was shown that by induction, a culture system (ie, a corticospinal tract model) including a synaptic connection in which a higher motor neuron is a presynaptic cell and a lower motor neuron is a postsynaptic cell is obtained.
  • a culture system ie, a corticospinal tract model
  • ALS-iPSC NF stably introduced strain a stably introduced strain in which the NF expression cassette was inserted into the chromosome (hereinafter referred to as ALS-iPSC NF stably introduced strain) was prepared.
  • the ALS-iPSC NF stable expression strain was seeded on the feeder layer of astrocytes according to the procedure 1, and the expression of exogenous Ngn2 and Fezl was induced the next day.
  • the NF stable expression strain prepared from the 201B7 strain in Example 1 was used.
  • TDP-43 protein spontaneously moves to the cytoplasm and aggregates in higher motor neurons differentiated from exogenous Ngn2 and Fezl expression from iPSCs derived from familial ALS patients.
  • Example 2 Presence or absence of neurite outgrowth lentivirus encoding EGFP expression-controlled by the CaMKII promoter in the ALS-iPSC NF stable expression strain so that the progress of the process can be observed alive (Example 2) (Same as that used in the above) and modified to emit EGFP fluorescence (green) when differentiated into pyramidal cells.
  • the seeds were seeded on the feeder layer of astrocytes according to the method 1, and the expression of exogenous Ngn2 and Fezl was induced on the next day and observed with a fluorescence microscope.
  • Example 4 Identification of novel ALS marker
  • upper motor neuron prepared in Example 3 a gene whose expression level specifically changes was searched.
  • the ALS-iPSC NF stable introduction strain and the control NF stable introduction strain were induced to differentiate using the same method as in Example 3, and after 28 days, cells differentiated into upper motor neurons were selected and subjected to single cell RNA-sequencing. (Analysis with 100-cycle Single-Read mode using Illimina HiSeq 2500 Sequencing System).
  • GPR50 (Official symbol: G protein-coupled receptor 50, NM_004224) was found as a gene whose expression was not detected in ALS-UMN (Fig. 8).
  • GPR50 is a kind of G protein-coupled receptor and has been reported to have a genetic correlation with mental disorders such as major depressive disorder and bipolar disorder (Thomson PA., Et al, Mol. Psychiatry, 10: 470-478, 2005), there is no finding that suggests an association with motor neuron disease. As shown in FIG.
  • mice have been created by introducing genetic mutations identified from familial ALS patients, and various findings regarding lower motor neuron degeneration have been obtained (see McGoldrick P., et al). Biochim. Biophys. Acta. Sci., USA, 1832: 1421-1436, 2013).
  • mice do not have corticospinal tracts like humans, so it is not possible to study the degeneration mechanism of upper motor neurons or the mechanism of degeneration propagation between upper and lower motor neurons using model mice. could not.
  • the pluripotent stem cell according to the present invention is a cell that can be converted into a functional upper motor neuron simply by inducing the expression of the exogenous gene and can form a neural connection with the lower motor neuron. Therefore, it is expected that research on therapeutic methods and therapeutic agents for upper motor neuron diseases including ALS will be greatly accelerated by the spread of the upper motor neuron model and the corticospinal tract model according to the present invention.

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Abstract

多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する方法、及び、上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞の提供を目的とする。　多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養する工程を含む方法、並びに、Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸を染色体内に含む多能性幹細胞。

Description

上位運動ニューロンの誘導方法 関連出願
　本出願は、２０１６年３月１５日付け出願の日本国特許出願２０１６－５０４７７号の優先権を主張しており、ここに折り込まれるものである。
　本発明は、多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する方法に関する。本発明はまた、上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞に関する。
　一般に、疾患研究は細胞モデルが確立すると加速される。適用できる解析手法が大幅に増え、治療薬のスクリーニング速度も飛躍的に上昇するからである。特に、疾患の原因となる細胞が体内から非侵襲的な方法では採取できない細胞、及び／又は***能のない細胞である場合には、疾患の細胞モデルを得ることの意義は非常に大きい。
　ニューロンはそのような細胞の代表であり、特定のニューロンが変性することで発症する神経変性疾患は、細胞モデルの恩恵が特に大きい疾患と考えられている。なかでも、アルツハイマー型認知症、パーキンソン症、及び筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic　lateral　sclerosis;ALS）は、社会の高齢化とともに患者数が急増しており、研究の加速化が切望されている。
　これらの疾患の細胞モデル作製に近年大きく貢献しているのが、多能性幹細胞又は体細胞を目的の細胞に分化誘導するDirected　differentiation法である。ニューロンを生じるDirected　differentiation法には、多能性幹細胞をモルフォゲン（morphogen）等の外的シグナルに晒すことでニューロンへ分化誘導する方法と、多能性幹細胞又は体細胞に特定の遺伝子を導入して発現させることでニューロンへ分化誘導する方法が知られている（非特許文献１）。
　外的シグナルによって分化誘導する方法は、多能性幹細胞を胎生期の神経発生と似た環境に置くことで、神経分化を担う遺伝子発現を誘導する方法である。胎生期の神経発生では、発生の進行と伴に変化し続ける外的環境からのフィードバック（外的シグナル）を受けながら様々な転写因子が連続的に発現することで、神経系を構成する多種多様な細胞が産生される。そのため、この方法では特定の種類のニューロンのみを分化誘導することは難しく、通常さまざまなサブタイプのニューロンを含むヘテロな細胞集団が得られる。また、機能的に成熟したニューロンを得るには、発生期と同様に数カ月という長い時間を要する（例として、非特許文献２）。
　これに対し、特定の遺伝子発現によって分化誘導する方法（前記外的シグナルによる方法と区別するために、Neuronal　induction法と呼ばれる場合がある）は、主に特定の転写因子を発現させることで、神経分化を担う遺伝子発現プログラムの一部を強制的に実行させる方法である。そのため、この方法では分化の方向性を制御できる可能性が考えられるが、該方法を用いて目的の種類のニューロンを優先的に分化誘導できた例は非常に少ない。多能性幹細胞における遺伝子発現の効果は、従来法で得られた知見から予測することが困難だからである。なお、この方法では一般に分化に要する時間が短縮されて、数日から数週間で成熟したニューロンが得られる。
　Neuronal　induction法によって目的のニューロンを分化誘導した貴重な成功例として、ヒト多能性幹細胞、ヒト及びマウスの線維芽細胞、及びマウスのアストロサイトにAscl1、Lmx1A、及びNurr1遺伝子を導入し発現させることで、約2-3週間で中脳黒質のドーパミン作動性ニューロンを分化誘導した例が報告されている（例として、非特許文献４、５）。中脳黒質のドーパミン作動性ニューロンはパーキンソン症で選択的に障害されるニューロンであり、当該方法を用いてパーキンソン症の細胞モデルが得られることが期待されている。
　また、ヒト及びマウスの多能性幹細胞にNgn2遺伝子を導入し発現させると、90％以上の細胞が大脳皮質のグルタミン酸作動性ニューロン（さらに詳しくは、皮質第2層及び3層の錐体細胞）に約1-2週間で分化することが報告されている（非特許文献３、特許文献１）。大脳皮質のグルタミン酸作動性ニューロンは、アルツハイマー型認知症において広域に障害されるニューロンである。当該方法を用いて家族性患者由来人工多能性幹細胞から作製されたニューロンは、該患者のAβプロセシング異常を再現し得ることから（特許文献１）、アルツハイマー型認知症の細胞モデルとして期待されている。
　そして、ALSについても、Neuronal　induction法を用いて細胞モデルを作製する試みが行われている。ALSは、大脳皮質運動野の第5層に存在する上位運動ニューロンと、脊髄に存在する下位運動ニューロンが選択的に変性する疾患である。前記上位運動ニューロンは、下位運動ニューロン、又は、橋及び延髄の神経核に投射しており、下位運動ニューロンに投射する経路（皮質脊髄路）が四肢の随意運動を制御し、橋及び延髄に投射する経路（皮質延髄路）が嚥下と舌の動き等を制御している。上位・下位いずれの運動ニューロンが先に変性するかは患者によって異なるが、一方から始まった変性は他方へと伝播するため、最終的に両経路が侵されて患者は死に至る（非特許文献６）。
　これまで、下位運動ニューロンについては、マウス及びヒト多能性幹細胞にLhx3、Ngn2、及びIsl1の3遺伝子を（特許文献１）、マウスの線維芽細胞にAscl1、Brn2、Myt1l、Lhx3、Hb9、Isl1、Ngn2の7遺伝子を、ヒト線維芽細胞に前記7遺伝子にNeuroD1を加えた8遺伝子を導入して発現させることで（非特許文献７）、約1-3週間で作製できることが報告されている。
　しかしながら、上位運動ニューロンを分化誘導する方法はまだ知られていない。Neuronal　induction法に限らず、外的シグナルを用いた分化誘導法においても、成熟した上位運動ニューロンが分化誘導できた例は報告されていない。
　よって、ALSの病態を真に理解し有効な治療法を開発するために、in　vitroで上位運動ニューロンを分化誘導する方法が求められていた。
WO2014/148646
Ho　S.-M.,　et　al,　Biomarker　Insight,　10(S1):31-41,　2015 Mariani　J.,　et　al,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.,　USA,　109:12770-12775,　2012 Zhang　Y.,　et　al,　Neuron,　78:785-798,　2013 Caiazzo　M.,　et　al,　Nature,　476:224-227,　2011 Theka　I.,　et　al,　Stem　Cell　Trans.　Med.,　2:473-479,　2013 Gordon　P.H.,　Aging　Dis.,　4:295-310,　2013 Son　E.Y.,　et　al,　Cell　Stem　Cell,　9:205-218,　2011 Bertrand　N.,　et　al,　Nature Rev. Neurosci.,　3:517-530,　2002 Arlotta　P.,　et　al,　Neuron,　45:207-221,　2005 Woodworth　M.B.,　et　al,　Cell,　151:918-918.e1,　2012 Chanda　S.,　et　al,　Stem　Cell　Reports,　3:282-296,　2014 Egawa　N.,　et　al,　Science　Translational　Medicine,　4:145ra104,　2012 Vierbuchen　T.,　et　al,　Nature,　463:1035-1041,　2010 Pang　Z.P.,　et　al,　Nature,　476:220-223,　2011 Yoo　A.S.,　et　al,　Nature,　476:228-231,　2011
　本発明は、上記従来技術が抱える事情を鑑みてなされたものであり、多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する方法の提供を目的とする。さらに、本発明は、上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞の提供を目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ヒト由来人工多能性幹細胞にNgn2及びFezl遺伝子を導入して発現させると、約80%の細胞が3週間後には機能的な錐体細胞に分化することを見出した。そして、当該錐体細胞の約20％の細胞は、大脳皮質第5層と運動野のマーカー遺伝子を発現し、培養下で下位運動ニューロンに投射してシナプスを形成できること、すなわち、機能的な上位運動ニューロンであることを明らかにした。
　さらに、家族性ALS患者由来人工多能性幹細胞から上記方法により製造した上位運動ニューロンは、ALSに特徴的な病的性質（TDP-43タンパクの細胞内凝集等）を自発的に生じることが見出された。
　これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下を包含する。
[１]　多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養する工程を含む、多能性幹細胞から錐体細胞を製造する方法。
[２]　前記外来性のNgn2及びFezlを薬剤応答性プロモーターで発現させる、前記[１]に記載の方法。
[３]　前記外来性のNgn2及びFezlを2A配列を用いてポリシストロニックに発現させる、前記[１]又は[２]に記載の方法。
[４]　前記培養期間が21日間以上である、前記[１]－[３]のいずれかに記載の方法。
[５]　前記錐体細胞が上位運動ニューロンである、前記[１]－[４]のいずれかに記載の方法。
[６]　Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸を染色体内に含む多能性幹細胞。
[７]　前記Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸が、薬剤応答性プロモーターに機能的に接合された核酸である、前記[６]に記載の多能性幹細胞。
[８]　前記Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸が、2A配列を介して連結されている、前記[６]又は[７]に記載の多能性幹細胞。
[９]　前記多能性幹細胞が、ヒト由来人工多能性幹細胞である、前記[６]－[８]のいずれかに記載の多能性幹細胞。
[１０]　前記ヒトが、筋萎縮性側索硬化症患者である、前記[９]に記載のヒト由来人工多能性幹細胞。
[１１]　前記[５]に記載された方法で製造された上位運動ニューロンをシナプス前細胞、下位運動ニューロンをシナプス後細胞とするシナプス結合を含む培養物。
[１２]　前記下位運動ニューロンが、多能性幹細胞から製造された下位運動ニューロンである、前記[１１]に記載の培養物。
[１３]　前記下位運動ニューロンが、多能性幹細胞に外来性のLhx3、Ngn2、及びIsl1を発現させて製造された下位運動ニューロンである、前記[１２]に記載の培養物。
[１４]　下記工程を含む、筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療薬のスクリーニング方法；
（１）家族性ALS患者由来人工多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養して、該多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する工程、
（２）（１）で得られた上位運動ニューロンを、被験物質と接触させる工程、
（３）（２）で被験物質と接触させた上位運動ニューロン、及び接触させなかった上位運動ニューロン（すなわち、対照細胞）を培養し、神経突起長、凝集化したTDP-43タンパク量、又はGPR50の発現量を測定する工程、
（４）前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンの神経突起長もしくはGPR50の発現量が対照細胞の該値よりも高値である被験物質、又は、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンにおける凝集化したTDP-43タンパク量が対照細胞の該値よりも低値である被験物質を、筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療薬として選択する工程。
　本発明により、多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する方法と、上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞が提供される。さらに、本発明により、ALSの上位運動ニューロンモデルと皮質脊髄路モデルが提供される。
　下記図面において、“DOX＋”は後述するDOX含有培地で培養された細胞、“DOX－”はDOX不含培地で培養された細胞を表す。また、図中の“Tuj1”は、抗β-III　tubulin抗体であるTuj1抗体を用いて免疫染色したことを表す。
マウスES細胞株（KH2株）、及び、テトラサイクリン応答性プロモーターに制御される外来性Brn2、Ascl1、及びMyt1l遺伝子を染色体内に有するKH2株（BAM安定導入株；Clone　1、2）に対し、DOX含有／不含培地で培養して72時間後に、β-III　tubulin免疫染色とDAPI染色を行った蛍光顕微鏡イメージである。 図２A:テトラサイクリン応答性プロモーターに制御される外来性Ngn2及びFezl遺伝子を染色体内に有する201B7（NF安定導入株）に対し、DOX含有培地で培養後7日目に、β-III　tubulinとhNucに対する二重免疫染色を行った蛍光顕微鏡イメージである。図２B：解析方法を説明する工程表である。図２C：DOX含有培地で培養後7日目のNF安定導入株に対してβ-III　tubulin・CaMKII二重免疫染色とDAPI染色（図２C）を行い、同視野において、β-III　tubulin免疫染色とDAPI染色のシグナル（左パネル）、CaMKII免疫染色とDAPI染色のシグナル（図２C、中央パネル）、β-III　tubulin・CaMKII二重免疫染色とDAPI染色のシグナル（図２C、右パネル）をそれぞれマージした蛍光顕微鏡イメージである。図２D：テトラサイクリン応答性プロモーターに制御される外来性Fezl遺伝子を染色体に有する201B7株（F安定導入株）に対し、DOX含有培地で培養後7日目にDAPI染色（青色）を行い、mCherryの蛍光（赤色）とマージさせた蛍光顕微鏡イメージである。 NF安定導入株から分化した上位運動ニューロンに対し、分化誘導から7日目（図３A）、及び21日目（図３B）に、全細胞パッチクランプ法を用いてカレントインジェクション後に測定されたNa／K電流（Na／K　currents）、活動電位（Action　potentials）、及び、シナプス後電流（Postsynaptic　currents）を示す。 NF安定導入株から分化誘導後7日目のニューロン（DOX＋）に対し、大脳皮質第5層のマーカー遺伝子（Ctip2、TLE4、ER81、Sox5）、運動野のマーカー遺伝子（Crim1、Diap3、Igfbp4）、前頭葉のマーカー遺伝子（Robo1、PCDH17）、及び錐体細胞のマーカー遺伝子（OTX1、CaMKII）の発現をreal-time　PCR法を用いて解析した結果を表す。 NF安定導入株から分化誘導後21日目のニューロン（DOX＋）に対し、Crim1及びCaMKIIの発現量をreal-time　PCR法を用いて解析した結果（図５A）、Crim1・β-III　tubulin二重免疫染色とDAPI染色（図５B、左パネル）、及び、CaMKII・β-III　tubulin二重免疫染色とDAPI染色（図５B、右パネル）を行った結果を表す。 図６A：上位運動ニューロン（緑色）が下位運動ニューロン（赤色）に投射して形成されるシナプス構造の模式図である。図６B、C：NF安定導入株から分化した上位運動ニューロン（GFPを発現）が、LNI安定導入株から分化した下位運動ニューロン（TdTOMATOを発現）に投射し、シナプスを形成していることを示す蛍光顕微鏡イメージである。分化誘導から14日目にvGLT1に対する免疫染色を行い、同視野についてのTOMATO／EGFP／vGLT1の三重イメージ（図６B、Cの左パネル）、TOMATO／vGLT1二重イメージ（図６Bの右パネル及び図６Cの中央パネル）を表す。図６Cの右パネルは図６C左パネル中で四角で囲んだ領域の拡大図である。図中のバーは10μmを表す。 家族性ALS患者由来iPS細胞株から外来性Ngn2及びFezlの発現により分化したニューロンに対し、TDP-43・SMI-32で二重免疫染色（図７A）、TDP-43・SMI-32二重免疫染色とDAPI染色（図７B）を行った蛍光顕微鏡イメージを表す。 家族性ALS患者由来iPS細胞株から分化した上位運動ニューロンの神経突起の伸展を観察した蛍光顕微鏡イメージである。右パネル中の矢印は、伸長停止した神経突起を表す。 家族性ALS患者由来iPS細胞株から分化した上位運動ニューロン（ALS-UMN：赤丸）、及び201B7　NF安定発現株から分化した上位運動ニューロン（Control-UMN：水色丸）に対し、シングルセルRNA-sequencing法を行いてGPR50の発現量を解析した結果を表す。
　以下に、本発明の好適な実施形態について詳述する。
　本明細書では、遺伝子から生じる転写物のヌクレオチド配列（NM_～）、及びタンパクのアミノ酸配列（NP_～）の情報として、NCBI(National　Center　for　Biotechnology　Information)データベースに登録されている標準配列（Reference　Sequence）のIDを記載する。複数の標準配列が登録されているものについても一配列のみを記載するが、当該記載は例示であり、記載された配列への限定を意味するものではない。なお、本明細書では特に断りがない限り、遺伝子のOfficial　symbol及びIDはヒト遺伝子のものを表す。
１．上位運動ニューロンを含む錐体細胞の製造方法
　本発明により、多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養することで、多能性幹細胞から上位運動ニューロンを含む錐体細胞を製造する方法が提供される。当該方法では、約80%という高効率で多能性幹細胞を錐体細胞へと分化させることができ、そのうちの約20％が上位運動ニューロンである。
＜外来性のNgn2及びFezl＞
　本発明においてNgn2とは、Ngn2（Official　symbol:NEUROG2、Official　full　name:neurogenin　2）遺伝子及びNgn2タンパクのことである。Ngn2タンパク（例として、ヒト：NP_076924、マウス：NP_033848）は、Activator-typeの塩基性helix-loop-helix型転写因子（bHLH因子）であり、神経幹細胞を神経細胞へと分化誘導するプロニューラル因子の一つである（非特許文献８）。
　本発明においてFezlとは、Fezl（Official　symbol:FEZF2、Official　full　name:FEZ　family　zinc　finger　2）遺伝子及びFezlタンパクのことである。Fezlタンパク（例として、ヒト：NP_060478、マウス：NP_536681）は、zinc　finger型転写因子であり、大脳皮質第5層及び6層に細胞体が存在し、皮質外に投射する錐体細胞（subcerebral　projection　neuron）の細部系譜で特異的に発現することが知られている（非特許文献９、１０）。
　本発明において外来性のNgn2及びFezlとは、内在性のNgn2及びFezlではないことを意味する。よって、外来性のNgn2及びFezlの発現とは、外部から細胞内に導入された核酸（具体的には、Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸）からNgn2及びFezlが発現すること、又は、外部から細胞内にNgn2タンパク及びFezlタンパクが導入されることを指す。
　前記Ngn2をコードする核酸としては、例えば、標準配列として登録されているNM_009718（マウス）、NM_024019（ヒト）、又はこれらの転写派生体（transcript　variant）のヌクレオチド配列を有する核酸が挙げられる。また、前記標準配列及び転写派生体の配列を有する核酸に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補性を有する核酸であってもよい。そして、Fezlをコードする核酸としては、例えば、標準配列として登録されているNM_080433（マウス）、NM_018008（ヒト）、又はこれらの転写派生体（transcript　variant）のヌクレオチド配列を有するDNA等が挙げられる。また、前記標準配列及び転写派生体の配列を有する核酸に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補性を有する核酸であってもよい。
　前記ストリンジェントな条件は、Berger　and　Kimmel（1987,　Guide　to　Molecular　Cloning　Techniques　Methods　in　Enzymology,　Vol.152,　Academic　Press,　San　Diego　CA）に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Tm）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度の洗浄条件、さらに厳しくは「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」程度の洗浄条件で洗浄しても正鎖と相補鎖とがハイブリダイズ状態を維持する条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、いっそう好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
　前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸は、一本鎖及び二本鎖のいずれでもよく、DNA及びRNAのいずれでも良い。また、DNA/RNAキメラ、DNA-RNAハイブリットであってもよい。このうち、好ましくは二本鎖DNA、又は一本鎖RNAである。
　前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸は、Ngn2及びFezlを発現させるための制御配列を含むことができ、当該制御配列としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイト等の配列が挙げられる。また、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、及び、蛍光タンパク質、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列等を含んでいてもよい。
　前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸は、Ngn2及びFezlがポリシストロニックに発現するように、IRES又は2Aコード配列（以降、2A配列と略記する）を介して機能的に連結されていてもよい。特に、2A配列を用いて連結された場合には、当該2種類のタンパクの同時且つ等モル発現が可能となるため（Nat.　Biotech.,　5,　589-594,　2004）、本発明において特に好ましい。当該2A配列はいずれのウイルス由来のものを用いてもよいが、好適には口蹄病ウイルス（FMDV）の2A配列である（J.　General　Virology,　89,　1036-1042,　2008）。
　前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸が一本鎖の場合には、安定性の向上を目的として、修飾ヌクレオチド（ヌクレオチド類似体を含む）を好適に含むことができる。そのような修飾ヌクレオチドの例としては、糖修飾リボヌクレオチド（例として、2’-フルオロ、2’-O-メチル、又は2’-O-メトキシエチル修飾されたリボヌクレオチド等）、骨格修飾リボヌクレオチド（例として、S化ヌクレオチド（Phosphorothioate）等）、及び塩基修飾リボヌクレオチド（例として、5-（2-アミノ）プロピルウリジン、5-ブロモウリジン等）、及び、ヌクレオチド類似体（2’,4’-BNA(bridge　nucleic　acid)/LNA(Locked　Nucleic　Acid)（Koshkin　et　al.,　J.　American　Chemical　Society,　120:13252-13253,　1998）、ENA(2’-O,4’-C-Ethylene-bridged　Nucleic　Acids）（WO2000/047599）等)等が挙げられる。これらの修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体はいずれも公知技術であり、オリゴ核酸の生体内安定性を向上させる方法として汎用されている（Summerton　and　Weller,　Antisense　Nuc.　Acid　Drug　Dev.,　7:187-195(1997)；Hyrup　et　al.,　Bioorgan.Med.Chem.,4:5-23(1996)、参照）。
＜外来性Ngn2及びFezlの導入＞
　Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸を多能性幹細胞に導入する方法は特に限定されないが、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクターに導入した形態で、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって多能性幹細胞内に導入することができる。
　ウィルスベクターとしては、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、センダイウィルスベクター等が例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC、PAC）等が挙げられる。プラスミドとしては、哺乳動物用プラスミド全般を使用することができる。なお、前記Ngn2及びFezlを発現させるための制御配列、選択マーカー配列、及び、レポーター遺伝子配列等は、ベクターによって供給されてもよい。
　前記ベクターは、前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸を多能性幹細胞の染色体に効率良く挿入するためのトランスポゾン配列を有していることが好ましい。本発明に用いることができるトランスポゾン配列は特に限定されないが、好適なものとして、piggyBacトランスポゾンのトランスポゾン配列が挙げられる（Yusa　M.,　et　al,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.,　USA,　108:1531-1536,　2011）。前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸が２つのトランスポゾン配列の間に挿入されたベクターを、該トランスポゾン配列に対応するトランスポゼース（piggyBacトランスポゾン配列に対しては、piggyBacトランスポゼース）を前記細胞内で発現し得る態様でコードする核酸とともに細胞に導入することで、該トランスポゾン配列に挟まれた領域（前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸を含む領域）が染色体内に挿入された細胞を効率よく得ることができる。
　前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸が1本鎖の場合には、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって多能性幹細胞に導入してもよい。細胞内における当該発現レベルを維持するために、複数回、例えば、２回、３回、４回、又は５回等導入を行っても良い。
　外来性Ngn2及びFezlをタンパクの形態で導入する場合には、例えば、リポフェクション、及びマイクロインジェクションなどの手法によって導入することができる。その際、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTAT及びポリアルギニン）との融合タンパクの状態で導入してもよい。細胞内における前記外来性のNgn2及びFezlタンパク量を維持するために、複数回、例えば、２回、３回、４回、又は５回等導入を行っても良い。
＜外来性Ngn2及びFezlの発現＞
　前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸からの当該Ngn2及びFezlの発現は、誘導可能なプロモーターに制御されることが好ましい。誘導可能なプロモーターの例としては、薬剤応答性プロモーターが挙げられ、その好適な例として、テトラサイクリン応答性プロモーター（tetO配列が7回連続したテトラサイクリン応答配列（TRE）を有するCMV最小プロモーター）が挙げられる。該プロモーターは、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（rtTA；reverse　tetR（rTetR）とVP16ADから構成される融合タンパク質)の発現下において、テトラサイクリン又はその誘導体が供給されることにより活性化されるプロモーターである。よって、テトラサイクリン応答性プロモーターを用いて発現誘導を行う場合には、前記活性化因子を発現する様式を併せ持つベクターを用いることが好ましい。前記テトラサイクリンの誘導体としては、ドキシサイクリン（doxycycline、本願では以降、DOXと略記する）を好適に用いることができる。
　上記以外の薬剤応答性プロモーターを用いた発現誘導系としては、エストロゲン応答性プロモーターを用いた発現誘導システム（例として、WO2006/129735）、RSL1によって誘導されるプロモーターを用いたRheoSwitch哺乳類誘導性発現システム（New　England　Biolabs社）、cumateによって誘導されるプロモーターを用いたQ-mateシステム（Krackeler　Scientific社）又はCumate誘導性発現システム（National　Research　Council(NRC)社）、及びエクジソン応答性配列を有するプロモーターを用いたGenoStat誘導性発現システム(Upstate　cell　signaling　solutions社）等が挙げられる。
　上述したような薬剤応答性プロモーターを用いる場合には、当該プロモーターの活性化を誘導し得る薬剤（例えば、前記テトラサイクリン応答性プロモーターを含むベクターの場合には、テトラサイクリン又はDOX）を培地に所望の期間添加し続けることで、外来性Ngn2及びFezlの発現を維持することができる。そして、培地から当該薬剤を除去する（例えば、該薬剤を含まない培地に置換する）ことで、前記遺伝子の発現を停止させることが可能である。
　さらに、前記Ngn2及びFezlの発現誘導は、前記Ngn2をコードする核酸及びFezlをコードする核酸を構成的プロモーターに機能的でない形で接合させておき、所望の時期に当該接合状態を機能的な接合状態に変換することで行ってもよい。このような例としては、前記構成的プロモーターと前記遺伝子をコードする配列の間に、LoxP配列で挟まれた特定の配列（例えば、薬剤耐性遺伝子をコードする配列や転写終結を誘導する配列）を配しておき、所望の時期にCreを作用させて前記LoxP配列で挟まれた配列を除去することで、前記接合状態を機能的な接合状態に変換する方法等が挙げられる。さらに、前記LoxP配列の代わりにFRT配列又はトランスポゾン配列（例として、piggyBacトランスポゾン配列）を、前記Creの代わりにFLP(flipase)又は当該トランスポゾン（例として、piggyBacトランスポゾン）を用いてもよい。
　上記目的で用いることができる構成的プロモーターとしては、SV40プロモーター、　LTRプロモーター、CMV（cytomegalovirus)プロモーター、RSV（Rous　sarcoma　virus)プロモーター、MoMuLV（Moloney　mouse　leukemia　virus）　LTR、HSV-TK（herpes　simplex　virus　thymidine　kinase）プロモーター、EF-αプロモーター、及びCAGプロモーター等が挙げられる。
　上記のようにCre、FLP、トランスポゾンを用いて接合状態を変換することで発現誘導を行った場合には、所望の期間経過後に再度Cre、FLP、トランスポゾンを作用させて前記配列（LoxP配列、FRT配列、又はトランスポゾン配列）で挟まれた配列を除去することで、前記遺伝子の発現を停止させることもできる。
　また、別の態様として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、センダイウイルスベクターやプラスミド、エピソーマルベクター等の容易に細胞内から消失させ得るベクターを用いることで、前記遺伝子の発現期間を制御することも可能である。
　上位運動ニューロンを含む錐体細胞の製造において、外来性Ngn2及びFezlの発現は3日間以上維持されることが好ましく、4日間、5日間、6日間、7日間のいずれにおいても本発明の効果を奏することができ、特に好ましくは7日間である。前記発現を維持する期間が長期になることで上位運動ニューロン及び錐体細胞の製造に不利益を生じることはないが、好ましくは3日以上14日以下、特に好ましくは7日以上14日以下である。
＜多能性幹細胞＞
　本発明において、多能性幹細胞とは、生体に存在するすべての細胞に分化可能な多能性を有し、かつ、増殖能を併せもつ幹細胞のことである。例として、以下に限定するものではないが、胚性幹細胞（embryonic　stem　cell；ES細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（nuclear　transfer　embryonic　stem　cell；ntES細胞）、***幹細胞（spermatogonial　stem　cell；GS細胞）、胚性生殖細胞（embryonic　germ　cell；EG細胞）、人工多能性幹細胞（pluripotent　stem　cell；iPS細胞）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）等が挙げられる。これらのうち、本発明に好適な多能性幹細胞は、ES細胞及びiPS細胞であり、特に好ましくはiPS細胞である。
　iPS細胞は、特定の初期化因子をDNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することで作製され得る、ES細胞とほぼ同等の特性（例えば、分化多能性と自己複製による増殖能）を有する体細胞由来の人工幹細胞である（K.　Takahashi　and　S.　Yamanaka（2006）　Cell,　126:663-676;　K.　Takahashi　et　al.（2007),　Cell,　131:861-872;　J.　Yu　et　al.（2007),　Science,　318:1917-1920;　Nakagawa,　M.ら,Nat.　Biotechnol.　26:101-106（2008)；国際公開WO　2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording　RNA又はES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording　RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3又はGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO　2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO　2010/111409、WO　2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu　D,　et　al.（2008),　Nat.　Biotechnol.,　26:　795-797、Shi　Y,　et　al.（2008),　Cell　Stem　Cell,　2:　525-528、Eminli　S,　et　al.（2008),　Stem　Cells.　26:2467-2474、Huangfu　D,　et　al.（2008),　Nat　Biotechnol.　26:1269-1275、Shi　Y,　et　al.（2008),　Cell　Stem　Cell,　3,　568-574、Zhao　Y,　et　al.（2008),　Cell　Stem　Cell,　3:475-479、Marson　A,（2008),　Cell　Stem　Cell,　3,　132-135、Feng　B,　et　al.（2009),　Nat　Cell　Biol.　11:197-203、R.L.　Judson　et　al.,（2009),　Nat.　Biotech.,　27:459-461、Lyssiotis　CA,　et　al.（2009),　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A.　106:8912-8917、Kim　JB,　et　al.（2009),　Nature.　461:649-643、Ichida　JK,　et　al.（2009),　Cell　Stem　Cell.　5:491-503、Heng　JC,　et　al.（2010),　Cell　Stem　Cell.　6:167-74、Han　J,　et　al.（2010),　Nature.　463:1096-100、Mali　P,　et　al.（2010),　Stem　Cells.　28:713-720、Maekawa　M,　et　al.（2011),　Nature.　474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
　当業者は上記刊行物を参照することにより、本発明に好適に使用できる遺伝子を適宜選択し、周知の方法に従ってiPS細胞を製造することができる。
　また、本発明には、既に樹立された多能性幹細胞株を好適に用いることができ、市販のマウス及びヒトのES細胞株及びiPS細胞株を用いてもよい。ヒトES細胞株としては、例えば、KhES-1(HES0001)、KhES-2(HES0002)、及びKhES-3(HES0003)株等が、理化学研究所バイオリソースセンターから入手可能である（細胞開発材料室；http://cell.brc.riken.jp/ja/）。健常者から樹立されたiPS細胞株としては、例えば、201B7（HPS0063）、253G1（HPS0002）、409B2（HPS0076）、及び454E2（HPS0077）株等、ALS患者から樹立されたiPS細胞株としては、例えば、本発明者によって樹立されたCiRA0021（HPS0327）、CiRA0022（HPS0290）、CiRA0023（HPS0291）、CiRA0024（HPS0292）、CiRA0025（HPS0293）、及びCiRA0026（HPS0294）等が、いずれも前記センターから入手可能である。上記株名の後ろのカッコ内の英数字は寄託番号を表す。また、米国コリエル　インスティチュート（Coriell　Institute；https://catalog.coriell.org）からも、各種多能性細胞株が入手可能である。
　本発明に係る上位運動ニューロンを含む錐体細胞の製造に用いることができる多能性幹細胞は、疾患モデルの作製という観点から、疾患患者から樹立されたiPS細胞、疾患の原因遺伝子が導入された健常者由来多能性幹細胞、又は、疾患の原因遺伝子を機能的に欠失した健常者由来多能性幹細胞等であってよい。当該疾患モデルの作製に好適な多能性幹細胞については、「３．疾患モデル提供」で詳しく説明する。
＜培養方法＞
　外来性のNgn2及びFezlが導入され、且つ、該Ngn2及びFezlを発現する多能性幹細胞は、ニューロンへの分化誘導に適した培地（本書では以降、神経分化用培地と呼ぶ）中で培養されることが好ましい。そのような培地としては、基本培地のみ、又は、神経栄養因子を添加した基本培地を用いることができる。本発明における神経栄養因子とは、神経細胞の生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体のリガンドであり、例えば、Nerve　Growth　Factor（NGF）、Brain-derived　Neurotrophic　Factor（BDNF）、Neurotrophin　3（NT-3）、Neurotrophin　4/5（NT-4/5）、Neurotrophin　6（NT-6）、basic　FGF、acidic　FGF、FGF-5、Epidermal　Growth　Factor（EGF）、Hepatocyte　Growth　Factor（HGF）、Insulin、Insulin　Like　Growth　Factor　1（IGF　1）、Insulin　Like　Growth　Factor　2（IGF　2）、Glia　cell　line-derived　Neurotrophic　Factor（GDNF）、TGF-b2、TGF-b3、Interleukin　6（IL-6）、Ciliary　Neurotrophic　Factor（CNTF）及びLIF等が挙げられる。このうち、本発明において好ましい神経栄養因子は、GDNF、BDNF、及びNT-3である。前記基本培地としては、例えば、Glasgow's　Minimal　Essential　Medium(GMEM)培地、IMDM培地、Medium　199培地、Eagle's　Minimum　Essential　Medium（EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's　modified　Eagle's　Medium(DMEM)培地、Ham's　F12(F12)培地、Dulbecco's　Modified　Eagle　Medium:Nutrient　Mixture　F-12(DMEM/F-12)培地、RPMI　1640培地、Fischer's培地、Neurobasal　Medium培地（Lifetechnologies社）、及びこれらの混合培地等が挙げられる。基本培地には血清が含まれていてもよく、含まれていなくても（すなわち、無血清）良い。培地には、必要に応じて、例えば、Knockout　Serum　Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2　supplement（Invitrogen）、B27　supplement（Invitrogen）、アルブミン、トランスフェリン、アポトランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロール等の1以上の血清代替物を添加することができ、また、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、セレン酸、プロゲステロン及びプトレシン等の1以上の物質を添加してもよい。
　本発明では、神経分化用培地として、DMEM/F12培地とNeurobasal　Medium培地を体積比１：１で混合した混合培地に、N2　supplement、B27　supplement、BDNF、GDNF、及びNT3を添加した培地を好適に用いることができる。
　前記外来性Ngn2及びFezlを発現する多能性幹細胞の培養は、単独で（すなわち、他種細胞の非存在下で）行うことができるが、上位運動ニューロンへの分化効率を向上させるために、グリア細胞の共存下で行ってもよい。本発明においてグリア細胞とは、神経系を構成する非神経細胞を指し、マイクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、およびシュワン細胞等が例示される。このうち、本発明において最も好ましいグリア細胞はアストロサイトである。
　本発明では、前記外来性Ngn2及びFezlが導入された多能性幹細胞をグリア細胞（特に好ましくは、アストロサイト）のフィーダー層上に播種／培養し、前記外来性遺伝子の発現誘導を行うことが好ましい。本発明に用いるグリア細胞は、ヒト、マウスいずれのものでもよく、入手し易さの点からはマウスのグリア細胞が好適である。
　グリア細胞は、当業者に周知の方法に従い、マウス胎児又は新生児の脳から容易に調製することができる（例として、Jacquier　A.,　et　al,　Hum.　Mol.　Genet.,　18:2127-2139,　2009参照）。各社から市販されている製品を用いてもよく、また、細胞バンクからも入手可能である（例として、国立研究開発法人　医薬基盤・健康・栄養研究所のJCRB細胞バンク（http://cellbank.nibiohn.go.jp/）のMA-89（寄託番号：IFO50293））。
　前記外来性Ngn2及びFezlを発現する多能性幹細胞を培養して上位運動ニューロンに分化誘導する際の培養温度は特に限定されないが、約30-40℃、好ましくは約37℃である。CO2含有空気の雰囲気下での培養が好ましく、CO2濃度は好ましくは約2-5％である。
＜錐体細胞及び上位運動ニューロン＞
　錐体細胞は、大脳皮質と海馬に存在するグルタミン酸作動性の興奮性ニューロンである。錐体細胞は、形態的及び生理学的な特徴からさまざまなサブタイプに分類されており、それぞれが機能的にも異なる役割を果たしていると考えられている。
　本発明では、“β-III　tubulin又はMAP2（microtubule-associated　protein　2）陽性の突起（神経突起と呼ぶ場合がある）を少なくとも１以上有する細胞”を“ニューロン”と定義する。そして、本発明における“錐体細胞”とは、“前記ニューロンの定義を満たし、さらに錐体細胞のマーカー遺伝子を１以上発現する細胞”と定義される。前記錐体細胞のマーカー遺伝子としては、例えば、CaMKII(calcium/calmodulin-dependent　protein　kinase　II；ヒト：NM_015981、NP_057065、マウス：NM_177407、NP_803126)、OTX1（orthodenticle　homeobox　1；NM_014562、NP_055377）等が挙げられる。
　本明細書では、“前記錐体細胞の定義を満たす細胞であって、さらにシナプス形成能を獲得した細胞”を、機能的な分化が完了した錐体細胞という意味で、“成熟した錐体細胞”と呼ぶ。
　大脳の上位運動ニューロンは、大脳皮質運動野の第5層に細胞体が存在し、脊髄全角の下位運動ニューロン、又は、橋及び延髄の神経核に投射する大型の錐体細胞に代表される。本発明では、“前記ニューロンの定義を満たす細胞であって、さらに、
大脳皮質第5層のマーカー遺伝子を１以上発現し、且つ、運動野のマーカー遺伝子を1以上発現する細胞、又は、
大脳皮質第5層のマーカー遺伝子もしくは運動野のマーカー遺伝子を1以上発現し、且つ、細胞体の直径が15μm以上（さらに好ましくは、20μm以上）の細胞”、
を“上位運動ニューロン”と定義する。
　前記大脳皮質第5層のマーカー遺伝子としては、例えば、Ctip2（Couptf-interacting　protein　2、別名としてB-cell　CLL/lymphoma　11B；NM_138576、NP_612808）、TLE4（transducin　like　enhancer　of　split　4；NM_001282748、NP_001269677）、ER81（ets　variant　1；NM_004956、NP_004947）、Sox5（SRY-box　5；NM_006940、NP_008871）等が挙げられる。また、前記運動野のマーカー遺伝子としては、例えば、Crim1（cysteine　rich　transmembrane　BMP　regulator　1　(chordin-like)；NM_016441、NP_057525）、Diap3（diaphanous　related　formin　3；NM_001042517、NP_001035982）、Igfbp4（insulin　like　growth　factor　binding　protein　4；NM_001552、NP_001543）等が挙げられる。
　本明細書では、“前記上位運動ニューロンの定義を満たす細胞であって、さらに、下位運動ニューロンに対して自身をシナプス前細胞とするシナプス結合を形成し得る細胞”を、機能的な分化が完了した上位運動ニューロンという意味で“成熟した上位運動ニューロン”と呼ぶ。
　本発明において錐体細胞を製造するとは、前記錐体細胞の定義を満たす細胞を50%以上、好ましくは60%以上、さらに好ましくは70％以上含有する細胞集団を得ることを意味する。また、上位運動ニューロンを製造するとは、前記上位運動ニューロンの定義を満たす細胞を5%以上、好ましくは10%以上、さらに好ましくは15%以上含有する細胞集団を得ることを意味する。なお、本発明において、“上位運動ニューロンを含む錐体細胞を製造する方法”は、“上位運動ニューロンを製造する方法”と同義である。
２．上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞
　本発明の第2の態様として、上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞が提供される。前記外来性Ngn2及びFezlが導入された多能性幹細胞は、該Ngn2及びFezlを発現することで、約80％という高効率で錐体細胞に変換され、さらに、約16％（すなわち、前記錐体細胞の約20％）という効率で上位運動ニューロンに変換され得る細胞である。これまで、錐体細胞に変換可能な多能性幹細胞として、外来性遺伝子としてAscl1のみ（非特許文献１１）又はNgn2のみ（非特許文献３、特許文献１）が導入された多能性幹細胞が報告されているが、いずれも上位運動ニューロンを生じ得ることは示されていない。
　よって、本発明に係る外来性Ngn2及びFezlが導入された多能性幹細胞は、上位運動ニューロンに変換可能であることが確認された初めての多能性幹細胞である。
　本発明に係る上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞は、前記外来性Ngn2及びFezlを発現誘導可能な様式で染色体内に保持していることが好ましい。これにより、所望の時期に前記多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造することができ、さらに、当該多能性幹細胞を細胞株として安定に維持できるようになる。当該発現誘導可能な様式としては、例えば、前記＜外来性Ngn2及びFezlの発現制御＞の項で説明した種々の様式を用いることができる。本発明においては、前記外来性Ngn2及びFezlをコードする核酸が発現誘導可能なプロモーターに機能的に接合された様式が好ましく、当該プロモーターとしては、薬剤応答性プロモーターが好ましい。
　本発明に係る上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞は、ヒトを含む動物に多能性幹細胞の状態で投与し、その後分化誘導することで、該投与部位において上位運動ニューロンに変換させることが可能である（特許文献１参照）。当該投与部位としては、大脳皮質が好ましく、さらに好ましくは大脳皮質第5層である。このように、本発明に係る上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞は、疾患等で失われた上位運動ニューロンを補充するための細胞製剤として用いてもよい。
３．皮質脊髄路モデルの提供
　本発明の第3の態様として、上位運動ニューロンが下位運動ニューロンに投射した皮質脊髄路の細胞モデルが提供される。
　これまで、動物組織から神経連絡を保ったままのニューロンを培養下に移す技術としてスライスカルチャー法が知られているが、該方法では脳と脊髄のような異なる組織にまたがる神経結合を温存することは（少なくとも現時点では）不可能である。また、実験動物の脳及び脊髄から上位・下位運動ニューロンを採取して共培養することは可能だが、培養下で両運動ニューロン間の神経連絡を再構築できた例は、哺乳類では報告されていない。
　このように、ヒトを含む哺乳類では、皮質脊髄路の培養モデル（細胞モデル）を作製することは極めて困難であった。
　本発明に係る方法を用いて製造された上位運動ニューロンは、下位運動ニューロンと共培養することで、上位運動ニューロンをシナプス前細胞、下位運動ニューロンをシナプス後細胞とするシナプス結合を形成することができる細胞である。よって、当該シナプス結合を含む培養物は、哺乳類における初めての皮質脊髄路細胞モデルである。
　前記下位運動ニューロンは、多能性幹細胞から外的シグナルによって分化誘導する方法（例として、非特許文献１２）、多能性幹細胞に外来性Lhx3、Ngn2、及びIsl1を発現させて分化誘導する方法（特許文献１）、体細胞にAscl1、Brn2、Myt1l、Lhx3、Hb9、Isl1、Ngn2、NeuroD1を発現させて分化誘導する方法（非特許文献７）等によって製造することができる。このうち、短期間で下位運動ニューロンを安定して製造できることから、多能性幹細胞に外来性Lhx3、Ngn2、及びIsl1を発現させて分化誘導する方法が好ましい。例えば、外来性Lhx3、Ngn2、及びIsl1を発現誘導可能な態様で染色体に含む多能性幹細胞と、本発明に係る上位運動ニューロンに変換可能な多能性幹細胞とを共培養し、各々を分化誘導することで、上位運動ニューロンが下位運動ニューロンに投射したシナプス結合を含む培養物を短期間（目安として、前記分化誘導から2－3週間程度）で容易に得ることが可能である。さらに、前記2種類の多能性幹細胞における外来性遺伝子が同じシステムによって発現制御されていると、両多能性幹細胞の分化誘導を一括して制御できるため、一段と好適である。当該目的に好適に用いることができる発現制御システムとしては、前述した薬剤プロモーターによる発現制御システムが挙げられる。
　本発明に係る皮質脊髄路モデルは、これまで分子レベルでの解析が困難であった、上位運動ニューロンの下位運動ニューロンへの投射機構や情報伝達機構の解析系として用いることができる。
４．疾患モデルの提供
　本発明の第4の態様として、上位運動ニューロンの異常を伴う疾患の細胞モデルが提供される。当該細胞モデルは、本発明に係る上位運動ニューロンを製造する方法を、上位運動ニューロンが障害される疾患の患者由来iPS細胞、又は、該患者に由来する遺伝子変異を導入された多能性幹細胞に適用することで得ることが可能である。
　前記疾患としては、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic　lateral　sclerosis;ALS）、原発性側索硬化症（Primary　lateral　sclerosis;PLS）等が挙げられる。このうち、ALSについては、これまでに多数の家族性患者／家系が報告されており、当該患者／家系において見出された遺伝子変異の情報が英国King’s　College　London大学の公開データベース“ALSOD:The　Amyotrophic　Lateral　Sclerosis　Online　Database”（http://alsod.iop.kcl.ac.uk）から入手可能である。
　なお、本発明における“健常者”とは、上位運動ニューロンが障害される疾患に罹患していない者の意である。
　前記疾患患者由来iPS細胞としては、家族性患者から樹立されたiPS細胞が好ましい。家族性ALS患者の例としては、SOD1（superoxide　dismutase　1,　soluble；NM_000454）、TDP-43（NM_007375、NP_031401）、FUS（FUS RNA binding protein；NM_004960）、ALS2（NM_020919）、ADAR2（adenosine　deaminase,　RNA-specific,　B1；NM_001112）、C9orf72（chromosome　9　open　reading　frame　72；NM_14500）、GRN（granulin；NM_002087）、PFN1（profilin　1；NM_005022）、EPHA4（EPH　receptor　A4；NM_001304537）、ERBB4（erb-b2　receptor　tyrosine　kinase　4、NM_005235）、ANG（Homo　sapiens　angiogenin,　ribonuclease,　RNase　A　family,　5；NM_001145）、UBQLN2（ubiquilin　2；NM_013444）、HNRNPA2B1（heterogeneous　nuclear　ribonucleoprotein　A2/B1、NM_031243）、又はOPTN（optineurin　1、NM_001008211）遺伝子に変異を有する患者が挙げられる。このうち、SOD1、TDP-43、及びFUS遺伝子変異は患者数が多いことから、本発明に好適に用いることができる。
　前記患者に由来する遺伝子変異を導入された多能性幹細胞は、前記疾患患者で同定された変異型遺伝子を導入、又は、当該内在性遺伝子を機能的に欠失した多能性幹細胞であってよい。また、この目的に用いる多能性幹細胞は、健常人に由来する多能性幹細胞であることが好ましい。
　例えば、ALSを引き起こすことが知られるSOD1、TDP-43、及びFUS遺伝子変異の多くは機能獲得型変異であるため、当該遺伝子変異の導入は、該変異型遺伝子を健常者由来多能性幹細胞に導入して行ってもよい。前記変異型遺伝子を多能性幹細胞に導入する方法は特に限定されず、例えば、＜外来性Ngn2及びFezlの導入＞の項で説明した方法を用いてもよい。
　一方でALSを引き起こす遺伝子変異には機能喪失型変異も知られており（例として、ALS2及びADAR2遺伝子変異）、これらの遺伝子変異の導入は、内在性遺伝子の機能破壊（すなわち、knockout）であってよい。前記遺伝子の機能破壊は当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば、CRISPR-Cas9システム（Gaj　T.,　et　al,　Trends　Biotechnol.,　31:397-405,　2013;　Doudna　J.A.,　et　al,　Science,　346,　no.6213,　2014）、及び、TALエフェクターヌクレアーゼ（Transcription Activator-Like Effector Nuclease;TALEN）システム（Miller　J.C.,　et　al,　Nat.　Biotechnol.,　29:143-148,　2011）等を用いてもよい。
　前記疾患患者に由来するiPS細胞、又は、前記疾患患者で同定された変異型遺伝子を導入もしくは対応する野生型遺伝子を機能的に破壊した健常者由来多能性幹細胞に、外来性Ngn2及びFezlを導入し発現させることで、該疾患に特徴的な病的性質を備えた上位運動ニューロンを得ることが可能である。
　前記方法を用いて作製された上位運動ニューロンは、そのまま該疾患の上位運動ニューロンモデルとして用いてもよく、また、下位運動ニューロンと共培養してシナプス結合（上位運動ニューロンをシナプス前細胞、下位運動ニューロンをシナプス後細胞とするシナプス結合）を形成させた状態で用いてもよい。
５．薬剤スクリーニング方法の提供
　本発明の第5の態様として、上位運動ニューロンの異常を伴う疾患に対する予防又は治療薬をスクリーニングする方法が提供される。当該方法は、前述した疾患モデル（上位運動ニューロンモデル、皮質脊髄路モデル等）に対し、被験物質の効果を解析する工程を含むことを特徴とする。
　前記スクリーニング方法は、例えば、下記工程（１）－（４）を含む方法であってよい。
（１）家族性ALS患者由来人工多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養して、該多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する工程、
（２）（１）で得られた上位運動ニューロンを、被験物質と接触させる工程、
（３）（２）で被験物質と接触させた上位運動ニューロン、及び接触させなかった上位運動ニューロン（すなわち、対照細胞）を培養し、神経突起長、凝集化したTDP-43タンパク量、又はGPR50の発現量を測定する工程、
（４）前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンの神経突起長、もしくはGPR50の発現量が対照細胞の該値よりも高値である被験物質、又は、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンにおける凝集化したTDP-43タンパク量が対照細胞の該値よりも低値である被験物質を、筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療薬として選択する工程。
＜被験物質＞
　本発明のスクリーニング方法に供される被験物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、合成低分子化合物、天然化合物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物、血漿、海洋生物由来の抽出物、細胞培養上清、及び微生物発酵産物等が挙げられる。これらの物質は新規なもの、公知なもののいずれでもよい。
　本発明において、上位運動ニューロンと被験物質との接触は、上位運動ニューロンを含む培養系の培養液に被験物質を添加して行うことができる。当該接触させる期間は、前記指標の変化が確認できる期間であれば特に限定されないが、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上であってよく、より好ましくは２日間である。接触期間の終了は、例えば、当該培地を被験物質を含まない培地に交換することで行うことができる。添加する被験物質の濃度は、化合物の種類（溶解性、毒性等）によって適宜調節可能である。
＜予防及又は治療薬の選択＞
　本発明に係るスクリーニング方法では、上位運動ニューロンの神経突起長、凝集化したTDP-43タンパク量、及びGPR50の発現量から選ばれる１以上の値を指標として、被験物質を選別してもよい。具体的には、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンにおける神経突起長又はGPR50発現量の値が被験物質と接触させなかった上位運動ニューロン（対照細胞）の該値よりも高い場合、又は、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンにおける凝集化したTDP-43タンパク量の値が対照細胞の該値よりも低い場合に、当該被験物質をALSの予防又は治療薬として選択することができる。なお、本発明における予防及び／又は治療薬は、シード化合物となるものも含めた意である。
　神経突起の伸展不良は、これまで作製された多くの神経変性疾患モデルにおいて、障害されるニューロンに共通してみられる性質である。そのため、神経突起の伸展不良は、ニューロンの脆弱性の指標として広く用いられている。
　TDP-43タンパクは、健常人では主に核内に局在するが、ALS患者では核から細胞質に移行して（細胞質で）凝集することが知られており、当該移行と凝集体の形成がALS発症に深く関わると考えられている。
　GPR50の発現量がALS患者で有意に低下することは、本願において初めて明らかにされたことである。
　前記神経突起長の計測は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば、細胞画像解析装置（インセルアナライザー）を用いて自動的に計測してもよい。また、前記凝集化したTDP-43タンパク量も当業者に周知の方法を用いて測定することができ、例えば、DAPI核染色とTDP-43に対する免疫染色を行い、DAPI核染色のシグナルとマージしないTDP-43シグナル量として、細胞画像解析装置を用いて自動的に計測してもよい。さらに、前記GPR50発現量も当業者に周知の方法を用いて測定することができ、例えば、蛍光標識されたプローブを用いたin　situ　hybridizationを行い、該シグナルを細胞画像解析装置を用いて自動的に計測する方法等が挙げられる。
　本発明においては、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンの指標の値が、対照細胞の該値と比べて、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上、2倍以上、2.5倍以上又は3倍以上である場合に“高値”と判断してもよい。また、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンの指標の値が、対照細胞の該値と比べて、80％、70％、60％、50％、又は40％以下である場合に“低値”と判断してもよい。なお、本発明における前記対照細胞には、有効性がないことが確認されている薬剤と接触させた上位運動神経細胞も含まれる。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。最初に、下記実施例で用いた材料及び基本的な実験手法について説明する。
＜ヒトiPS細胞株＞
　以下の実施例では、特に断りがない限り、ヒトiPS細胞として、京都大学iPS細胞研究所の山中伸弥博士より分与された201B7株を用いた（Takahashi　K,　et　al,　Cell,　131:861-72,　2007）。201B7株は健常者より樹立されたiPS細胞株で、理化学研究所バイオリソースセンター細胞開発材料室からも入手可能である（寄託番号HPS0063）。また、TDP-43遺伝子にG298S変異を有する家族性ALS患者より樹立したiPS細胞株（実施例３で使用）は、米国コリエル　インスティチュートから入手したND32947E18株を用いた。
＜外来性核酸＞
　以下の実施例では、外来性遺伝子として下記のマウスcDNAを用いた；
Ngn2（NM_009718）、Fezl（NM_080433）、Brn2（NM_008899）、Ascl1（NM_008553）、Myt1l（NM_001093775）、Lhx3（NM_001039653）、Isl1（NM_021459AC）。
＜手法１：多能性幹細胞の培養と外来遺伝子の発現誘導＞
　ヒト由来NF安定導入株は、Accutase（Innovative　Cell　Technologies社）処理によって単一細胞に解離させた後、matrigel（BD　Biosciences社製）でコートされたプラスチックプレート、又は、アストロサイトが培養されたプラスチックプレートに、約2×105　cell/wellの細胞密度で播種した。使用した培地は、神経分化用培地（1%　N2　supplement（Invitrogen社）、2%　B27　supplement（Invitrogen社）、10ng/ml　BDNF（R&D　Systems社）、10ng/ml　GDNF（R&D　Systems社）、及び10ng/ml　NT3（R&D　Systems社）が添加された、DMEM/F12培地とNeurobasal　Medium培地の混合培地（混合体積比は１：１、いずれもLife　Technologies社）である。なお、前記アストロサイトは生後1日目の野生型マウス（C57BL/6J）の大脳皮質より文献（Jacquier　A.,　et　al,　Hum.　Mol.　Genet.,　18:2127-2139,　2009）に記載の方法で調製し、10日間培養して単層（フィーダー層）にした。
　翌日、培地を1μg/ml　DOX（Clontech社）を添加した神経分化用培地（以降、DOX含有培地と呼ぶ）に置換して、当該外来性遺伝子の発現を誘導した。その後は、2日置きに培地を半量ずつ交換した。
［比較例１］多能性幹細胞に導入する遺伝子の検討（１）
　胎生期の大脳皮質の神経発生では、脳室帯で神経幹細胞が***と分化を繰り返してニューロン（厳密には、ニューロンへと分化が方向付けられた細胞）を生じ、該ニューロンは将来の定住場所に向かって移動しながら特定のサブタイプのニューロンへと分化する。前記ニューロンへの分化の方向付けにはNgn2又はAscl1の発現が重要であり、その後様々な転写因子が連続して協調的に働くことでサブタイプが決定すると考えられている（非特許文献１０）。
　これまでの研究により、Ngn2を多能性幹細胞に単独で導入・発現させると、ほぼすべての細胞が大脳皮質第2及び3層のグルタミン酸作動性ニューロンへと分化し（非特許文献３）、Ascl1を単独で導入・発現させると、グルタミン酸作動性ニューロンだけでなく、GABA作動性ニューロンを含むさまざまなサブタイプのニューロンを生じることが報告されている（非特許文献１１）。そこで、Ascl1の単独発現によって得られる細胞集団の中に上位運動ニューロンが含まれていることを期待して、KH2株（正常マウスES細胞株）及び201B7株にAscl1をコードする核酸を導入・発現させて、得られた細胞を免疫染色法を用いて解析した。しかしながら、各々の細胞株について約200,000個の細胞を解析しても、前記上位運動ニューロンの定義を満たす細胞は見出されなかった（データは非開示）。
　Neuronal　induction法は2009年に最初の成功例が報告された新しい手法であり、その実績はまだ非常に少ない。現時点において、Neuronal　induction法によって大脳皮質を構成するニューロンを分化誘導した例は、前述した非特許文献３、１２、特許文献１の他には、Brn2、Ascl1、Myt1lの3遺伝子（合わせて“BAM因子”と呼ばれている）を導入・発現させた例（例として、非特許文献１３）、前記BAM因子にNueroD1を追加して導入・発現させた例（非特許文献１４）、Ascl1、Myt1l、NeuroD、miR-9/9、及びmiR-124を導入・発現させた例（非特許文献１５）に代表される。
　そこで、多能性幹細胞にBAM因子を導入・発現させて得られるニューロンのなかに、上位運動ニューロンが含まれるかどうかを解析した。
＜BAM発現ベクターの作製＞
　pDEST31発現ベクター（Invitrogen　Life　Technologies社製）をベースとして、Brn2、Ascl1、及びMyt1lをコードする核酸が2A配列を介して連結され、その下流にIRES配列を介してmCherryをコードする核酸が連結された核酸が、テトラサイクリン応答性プロモーターに機能的に接合された発現カセット（以降、BAM発現カセットと呼ぶ）を含むベクター（以降、BAM発現ベクターと呼ぶ）を作製した。よって、当該発現カセットからは、テトラサイクリン又はその誘導体に応答して、Brn2、Ascl1、Myt1l、及びmCherryがポリシストロニックに発現する。なお、前記BAM発現ベクターにおいて、前記BAM発現カセットは2つのFrt配列の間に挿入されている。
＜BAM安定導入株の作製と解析＞
　前記BAM発現ベクターをflipaseをコードする核酸とともに、エレクトロポレーション法を用いてKH2株に導入した。KH2株は、ColA1座の下流にFrt配列を有し、内在性のR26プロモーターの制御下でリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるM2rtTAを発現するマウスES細胞株である（Beard　C,　et　al.,　Genesis　2006;44:23-28）。前記導入細胞に対して薬剤セレクションを行い、前記BAM発現カセットが染色体に挿入された細胞を選別して株化した。当該株化細胞に対して免疫染色を行い、未分化細胞のマーカー遺伝子（NANOG及びSSEA1）の発現を維持している細胞株をさらに選別して、クローン１及びクローン８を得た。
　前記クローン１及び８を0.25%　trypsinを用いて単一細胞に解離させた後、matrigel-coatedプラスチックプレート上に播種した。翌日、培地をDOX含有培地に置換して、BAM因子の発現を誘導した。誘導開始から72時後に、β-III　tubulinに対する免疫染色を行った結果を図１に示す。前記ニューロンの定義を満たす細胞は観察されたが、前記上位運動ニューロンの定義を満たす細胞は見出されなかった（約20,000細胞の解析結果）。
　よって、BAM因子を多能性幹細胞に導入し発現させても、上位運動ニューロンはほとんど生じないことが確認された。すなわち、これまで知られているNeuronal　induction法では、上位運動ニューロンは実質的に分化誘導されないことが明らかとなった。
［実施例１］多能性幹細胞に導入する遺伝子の検討（２）
　これまで、主にマウスを用いた解析により、サブタイプ決定期に上位運動ニューロンの細胞系譜（将来上位運動ニューロンになる細胞）で発現する遺伝子が多数同定されている。なかでも、非特許文献９では、2種類の錐体細胞（皮質第5層に存在し、右脳に投射するCallosal　projection　neuron、及び、視覚野に存在し、視蓋前域に投射するCorticotectal　projection　neuron）をコントロールとした詳細な解析を行い、サブタイプ決定期の初期にはSox5、Ctip2、Clim1等、中期にはCrim1、mu-crystallin等、後期にはencephalopsin、csmn1、cadherin22、pcp4、netrin-G1等の遺伝子が上位運動ニューロンの細胞系譜で有意に発現上昇することを報告している。さらに、発生期を通して上位運動ニューロンで発現する遺伝子として、fezl、cadherin13等を、また、Callosal　projection　neuronとの比較において上位運動ニューロンの細胞系譜に特異的な遺伝子として、lgfbp4、diap3、S100a10等を報告している。なお、fezl及びcadherin13は、上位運動ニューロンに限らず、皮質第5層に存在する他の皮質下投射ニューロン（例として、Corticotectal　projection　neuron）でも発現することが知られている（非特許文献１０）。
　本発明者は、サブタイプ決定期の上位運動ニューロンで発現することが報告された上記遺伝子について検討を行った。そして、意外にも、Ngn2とFezlを組み合わせた場合に、多能性幹細胞を錐体細胞に高効率で分化誘導できることを見出した。以下に、用いた解析手法を説明する。
＜NF発現ベクターの作製＞
　PB-TAC-ERNベクター（Tanaka　A.,　et　al,　PLoS　One,　8:e61540,　2013参照）をベースとして、Ngn2をコードする核酸とFezlをコードする核酸が2A配列を介して連結され、下流にIRES配列を介してmCherryをコードする核酸が連結された核酸が、テトラサイクリン応答性プロモーターに機能的に接合された発現カセット（以降、NF発現カセットと呼ぶ）を含むベクター（以降、NF発現ベクターと呼ぶ）を作製した（特許文献１参照）。前記NF発現カセットからは、テトラサイクリン又はその誘導体に応答して、Ngn2、Fezl、及びmCherryがポリシストロニックに発現する。さらに、前記NF発現ベクターはrtTA-NeoR発現カセット（＝EF1αプロモーターの制御下にrtTAとneomycin耐性遺伝子をポリシストロニックに発現する発現カセット）を有し、前記NF発現カセットとrtTA－NeoR発現カセットからなる2つの発現カセットの前後にpiggyBacトランスポゾンの逆向き反復配列を有している。
　コントロールとして、前記NF発現カセットからNgn2をコードする核酸が欠失したベクター（以降、F発現ベクターと呼ぶ）も作製した。当該F発現ベクターからは、テトラサイクリン又はその誘導体に応答して、Fezl及びmCherryがポリシストロニックに発現する。
＜NF安定導入株の作製＞
　前記NF発現ベクターを、piggyBacトランスポゼースをコードする核酸とともに、エレクトロポレーション法を用いて201B7株に導入した。その後、neomycin（50μg/ml）を含む培地で培養して、前記２つの発現カセットが染色体に挿入された細胞を選別し、株化した。さらに、前記株化細胞に対して免疫染色を行い、未分化細胞のマーカー遺伝子（NANOG及びSSEA1）の発現を維持している細胞株（以降、NF安定導入株と呼ぶ）を選別した。
　また、前記F発現ベクターについても、同じ手法を用いて安定導入株（以降、F安定導入株と呼ぶ）を作製した。
＜NF安定導入株の解析＞
（１）免疫学的解析
　前記NF安定導入株を前記手法１に従ってアストロサイトのフィーダー層上に播種し、翌日、外来性Ngn2及びFezlの発現を誘導した（図２B）。発現誘導から7日後の細胞に対し、β-III　tubulinに対するTuji抗体と、ヒト特異的Nuc抗体（←hNuc抗体とは何でしょうか？）で二重免疫染色した結果を図２Aに示す。ほぼ全てのhNuc陽性細胞（すなわち、ヒト細胞）において、β-III　tubulinの発現が認められた。当該β-III　tubulin陽性細胞では細胞体が肥厚して神経突起が長く伸展しており、典型的なニューロンの形態を呈していた。
　よって、NF安定導入株において外来性Ngn2及びFezlの発現を誘導すると、約7日後にはほぼすべての細胞がニューロンに分化することが明らかとなった。
　次に、β-III　tubulinとCaMKIIに対する免疫染色、及び、DAPIによる核染色を行った（図２C）。図２Cの右パネルは、β-III　tubulinのシグナル（赤色）、CaMKIIAのシグナル（緑色）、及びのDAPI核染色のシグナル（青色）をマージさせたイメージである。β-III　tubulin陽性細胞の約80％は、CaMKII陽性であった。
　よって、NF安定導入株から外来性Ngn2及びFezlの発現により分化したニューロンの約80％は、錐体細胞であることが明らかとなった。
　さらに、前記F安定導入株についても、外来性Fezlの発現を誘導し、7日後に同様の解析を行った。しかしながら、F安定導入株では、β-III　tubulin、CaMKIIいずれの発現も確認されず、細胞体は扁平なままで、突起伸展も観察されなかった（図2Dの右パネル）。
　以上より、多能性幹細胞にNgn2とFezlを導入して発現させると、7日後には約80％の細胞が錐体細胞に分化するが、Fezlのみを発現させてもニューロンに分化誘導されないことが示された。
（２）電気生理学的解析
　発現誘導から7日後のNF安定導入株に対し、全細胞パッチクランプ法を用いてニューロンとしての機能的な成熟度を解析した。典型的な測定結果を図３Aに示す。測定した全ての細胞において、Na/K電流及び活動電位が観察されたが、シナプス電流は観察されなかった。よって、発現誘導から7日後のNF安定導入株では、電位依存性Naチャネル及びKチャネルが発現して活動電位を生じることができるが、シナプスはまだ形成していないことがわかった。
　次に、発現誘導から21日後のNF安定導入株に対して同じ解析を行った。その結果、測定したすべての細胞において、活動電位とシナプス電流が記録された（図３B）。
　以上の結果より、多能性幹細胞にNgn2とFezlを導入して発現させると、約80％の細胞が錐体細胞へと分化誘導され、21日後には機能的に成熟した錐体細胞になることが示された。
［実施例２］分化誘導されたニューロンのサブタイプ解析
　外来性Ngn2とFezlの発現によって多能性幹細胞から分化誘導されるニューロンのサブタイプを解析した。
（１）大脳皮質第5層及び運動野のマーカー遺伝子の発現解析
　前記NF安定導入株を前記手法１に従ってmatrigel-coatedプラスチックプレート上に播種し、翌日外来性Ngn2及びFezlの発現を誘導した。発現誘導から7日後の細胞を回収してRNAを抽出し、real-time　PCR法を用いて種々の遺伝子の発現量を解析した。結果を図４に示す。分化誘導した細胞（DOX＋）では、分化誘導しなかったコントロール細胞（DOX不含培地で７日間培養した細胞；DOX－）と比べて、錐体細胞のマーカー遺伝子（OTX1及びCaMKII）、大脳皮質第5層のマーカー遺伝子（Ctip2、TLE4、ER81、及びSox5）、及び前頭野のマーカー遺伝子（SPGAP1、Robo1、及びPCDH17）の発現がいずれも大幅に増加していた。さらに、運動野のマーカー遺伝子（Crim1、Diap3、Igfbp4）のうち、Crim1とDiap3の発現が大幅に増加し、Igfbp4の発現も僅かながら増加していた（図３）。
　よって、当該細胞集団には、上位運動ニューロンに分化した細胞が含まれていることが示唆された。特に、上位運動ニューロンへのサブタイプ決定期の初期に発現することが知られるSox5、及びCtip2の発現が非常に高いことから、上位運動ニューロンへの分化成熟途上にある細胞が多く含まれることが強く示唆された。
　続いて、発現誘導から21日後のNF安定導入株からRNAを抽出して、Crim1（運動野マーカー）とCaMKII（錐体細胞マーカー）の発現量を解析した。分化誘導しなかった細胞（DOX－）と比べて、分化誘導した細胞（DOX＋）では、Crim1のmRNA量が約2.8倍、CaMKIIのmRNA量は約149倍に増加していた（図５A）。
　さらに、発現誘導から21日後の細胞に対し、Crim1とβ-III　tubulin（図５B）、及びCaMKIIとβ-III　tubulin（図５C）に対する二重免疫染色を行った。図５B及び図５Cにおいて、β-III　tubulin陽性細胞はいずれも肥厚した細胞体と長い神経突起を有しており、ニューロンに分化したことがわかる。そして、図５Cではβ-III　tubulin陽性細胞のほぼすべてがCaMKII陽性であることから、ニューロンに分化した細胞のほぼすべてが錐体細胞であることが確認された。これに対し、図５Bでは、β-III　tubulin陽性細胞の一部（約20％）がCrim1陽性であり、該二重陽性細胞の細胞体の直径はいずれも15μm以上であった（図５B）。さらに、前記Crim1陽性細胞は、Ctip2（第5層マーカー）で免疫染色した場合にもすべて陽性であった（データは非開示）。
　よって、NF安定導入株からNgn2及びFezlの発現によって分化した錐体細胞の一部（約20％）は、上位運動ニューロンであることが明らかとなった。
（２）下位運動ニューロンとのシナプス形成能の解析
　前記上位運動ニューロンの機能的な成熟度を調べるために、下位運動ニューロンとのシナプス形成能を解析した。
＜LNI安定導入株の改変＞
　下位運動ニューロンのリソースとして、本発明者が特許文献１において作製した“MN化因子導入－ヒト正常対照由来iPS細胞”の株化細胞を用いた。当該細胞株（本明細書では以降、LNI安定導入株と呼ぶ）は、前記NF安定発現株作製と同じ手法により、テトラサイクリン又はその誘導体に応答してLhx3、Ngn2、及びIsl1をポリシストロニックに発現する発現カセットが染色体に挿入された201B7株である。当該LNI安定導入株は、DOX処理により、約14日で機能的に成熟した下位運動ニューロンを生じることができる（特許文献１）。
　このLNI安定導入株に、HB9プロモーターによって発現制御されるTdTOMATOをコードするレンチウイルスを感染させて、下位運動ニューロンに分化するとTdTOMATOの蛍光（赤色）を発するように改変した。
＜NF安定導入株の改変＞
　実施例１で作製したNF安定導入株に、CaMKIIプロモーターによって発現制御されるEGFPをコードするレンチウイルスを感染させて、錐体細胞に分化するとEGFPの蛍光（緑色）を発するように改変した。
＜上位・下位運動ニューロンの共培養系の作製と解析＞
　前記レンチウイルス感染から4時間後の改変LNI安定導入株及び改変NF安定導入株を、前記手法１に従ってアストロサイトのフィーダー層上に播種した。翌日、培地をDOX含有培地に置換して、それぞれの外来遺伝子の発現を誘導した。発現誘導から2週間後に細胞を固定し（４％PFA使用）、グルタミン酸作動性ニューロンのマーカーであるvGLT1（vesicular　glutamate　transporter　1）に対する免疫染色を行った。vGLT1は、グルタミン酸作動性ニューロンのシナプス小胞の膜上に局在し、グルタミン酸を該小胞内に運び入れるトランスポーターである。通常、成熟したグルタミン酸作動性ニューロンの神経終末には多数のシナプス小胞が集積するため、vGLT1はシナプス部位を検出するマーカーとして汎用されている。
　前記共培養系に対して蛍光顕微鏡観察を行い、赤色で視覚化された下位運動ニューロンと、緑色で視覚化され且つ細胞体の直径が15μm以上である上位運動ニューロンが接触している部位を探索した（図６A参照）。図６B及びCに、下位運動ニューロンの細胞体及び／又はその神経突起に、上位運動ニューロンの神経突起が接触している部位のイメージを示す。
　図６Bの左パネルでは、下位運動ニューロンの細胞体と神経突起（赤色）に、上下異なる方向から伸展してきた緑色の長い神経突起（異なる上位運動ニューロンに由来する神経突起）が接触しており、当該接触部位及びその近傍にはvGLT1のドット状シグナル（青色）が複数認められる。青色のシグナルを見やすくするために、TdTOMATOシグナル（赤色）とvGLT1シグナル（青色）だけを重ね合わせたイメージが図６Bの右パネルである。当該右パネルでは、前記上位運動ニューロンの神経突起と下位運動ニューロンが接触していた部位及びその近傍に、前記左パネルよりも多くの青色ドット（vGLT1のシグナル）が認められた。
　図６Cは、図６Bとは別の視野において、下位運動ニューロンの神経突起に、視野の左側から伸展してきた上位運動ニューロンの神経突起が接触した部位のTdTOMATO／EGFP／vGLT1三重イメージ（左パネル）、及びTdTOMATO／vGLT1二重イメージ（中央パネル）である。右パネルは、左パネルにおいて四角で囲んだ領域（接触部）を拡大した三重イメージで、上位運動ニューロンの神経突起（緑色）のうち、下位運動ニューロンと接触している先端部分にvGLT1のドット状シグナル（青色）が集積していることがわかる。
　よって、NF安定導入株から、外来性Ngn2及びFezlの発現により、下位運動ニューロンを標的としてシナプス結合を形成できるニューロン、すなわち、上位運動ニューロンとして機能的に成熟したニューロンが分化誘導されることが示された。
　以上の結果より、多能性幹細胞にNgn2及びFezlを導入して発現させることで、約3週間後には機能的な上位運動ニューロンが製造できることが示された。
　さらに、上記結果より、外来性Ngn2及びFezlが導入された多能性幹細胞と、外来性Lhx3、Ngn2、及びIsl1が導入された多能性幹細胞を共培養し、前記全外来性遺伝子の発現を誘導することで、上位運動ニューロンをシナプス前細胞、下位運動ニューロンをシナプス後細胞とするシナプス結合を含む培養系（すなわち、皮質脊髄路モデル）が得られることが示された。
［実施例３］ALSモデル上位運動ニューロンの作製
　ALS患者由来iPS細胞から本発明に係る方法で上位運動ニューロンを製造して、当該ニューロンの性質を解析した。
＜ALS-iPSC　NF安定導入株の作製と分化誘導＞
　TDP-43遺伝子にG298S変異を有する家族性ALS患者の体細胞から本発明者が樹立したiPS細胞株（非特許文献１２参照、本明細書では以降、“ALS-iPSC”と呼ぶ）に、実施例１と同じ手法を用いて、前記NF発現カセットが染色体に挿入された安定導入株（以降、ALS-iPSC　NF安定導入株と呼ぶ）を作製した。
　前記ALS-iPSC　NF安定発現株を前記手法１に従ってアストロサイトのフィーダー層上に播種し、翌日外来性Ngn2及びFezlの発現を誘導した。なお、コントロールとして、実施例１で201B7株から作製したNF安定発現株を用いた。
＜ALS-iPSC　NF安定導入株の解析＞
　これまで、ALSモデル動物及び家族性ALS患者由来iPS細胞から分化誘導された下位運動ニューロンを用いた解析により、ALSを発症する下位運動ニューロンに特徴的な異常（病態）が複数報告されている。そのうち、本来核タンパクであるTDP-43タンパクの細胞質への移行と凝集化は、孤発性ALS患者の剖検組織でも頻繁に観察されることから、家族性・孤発性を問わずALSの発症機序に深く関わると考えられている（参照：Scotter　E.L.,　et　al,　Neurotherapeutics,　12:352-363,　2015）。また、神経突起の伸展不良は、変性し易い（脆弱な）ニューロンに広く認められる特徴である。
　そこで、前記ALS-iPSC　NF安定発現株から得られる上位運動ニューロンについて、これらの病的性質の有無を解析した。
（１）TDP-43タンパクの細胞質移行と凝集化の有無
　発現誘導から28日後の細胞に対し、TDP-43に対する抗体及びSMI-32抗体を用いた二重免疫染色を行った（図７A）。コントロールから分化誘導された上位運動ニューロン（以降、Control-UMNと呼ぶ）では、TDP-43（緑色）とSMI-32（赤色）のシグナルがマージした領域（黄色）はほとんど観察されないが（図７Aの左パネル）、ALS-iPSC　NF安定発現株から分化誘導された上位運動ニューロン（以降、ALS-UMNと呼ぶ）では、黄色の領域を有する細胞が多数観察された（図７Aの右パネル）。さらに、DAPI核染色との三重イメージでは（図７B）、Control-UMNでは核内にのみTDP-43のドット状シグナルが観察されたのに対し（図７B、左パネル）、ALS-UMNでは核内だけでなく細胞質にも複数のTDP-43ドット状シグナルが観察された（図７B、右パネル）。
　よって、前記家族性ALS患者由来iPSCから外来性Ngn2及びFezlの発現によって分化した上位運動ニューロンでは、自発的にTDP-43タンパクが細胞質に移行して凝集化することが示された。
（２）神経突起の伸展不良の有無
　突起進展の様子を生きたまま観察できるように、前記ALS-iPSC　NF安定発現株に、CaMKIIプロモーターによって発現制御されるEGFPをコードするレンチウイルス（実施例２で使用したものと同じ）を感染させて、錐体細胞に分化するとEGFPの蛍光（緑色）を発するように改変した。
　前記手法１に従ってアストロサイトのフィーダー層上に播種し、翌日に外来性Ngn2及びFezlの発現を誘導して蛍光顕微鏡観察を行った。すると、発現誘導から14日目以降に、細胞体の直径が15μm以上の錐体細胞において、神経突起の先端（すなわち、成長円錐）が縮小して突起伸展が停止する現象が頻繁に観察された（図８、右パネル中の矢印）。これに対し、前記コントロールから分化誘導されたニューロンでは、28日後まで解析しても突起の伸展停止は観察されなかった（図８、左パネル）。さらに、上記異常が認められた錐体細胞では、大脳皮質第5層のマーカー遺伝子の発現が確認された。
　よって、前記家族性ALS患者由来iPSCから外来性Ngn2及びFezlの発現によって分化した上位運動ニューロンは、神経突起を伸展させる能力が低いことがわかった。
　以上の結果より、ALS患者由来iPSCに外来性Ngn2及びFezlを発現させて得られる上位運動ニューロンは、ALSに特徴的な病的性質を備えた脆弱なニューロンであることが明らかとなった。よって、当該上位運動ニューロンは、ALSのモデル上位運動ニューロンになり得ることが示された。
［実施例４］新規ALSマーカーの同定
　実施例３で作製したALSモデル上位運動ニューロンにおいて、特異的に発現量が変化する遺伝子を探索した。
　前記ALS-iPSC　NF安定導入株及びコントロールNF安定導入株を実施例３と同じ方法を用いて分化誘導し、28日後に上位運動ニューロンに分化した細胞を選んでシングルセルRNA-sequencing法を行った（Illimina社のHiSeq　2500　Sequencing　Systemを用いて、100-cycle　Single-Read　modeで解析）。当該ALS-UMN及びControl-UMN間で遺伝子発現パターンを比較した結果、ALS-UMNでは発現が検出されない遺伝子として、GPR50（Official　symbol:G　protein-coupled　receptor　50、NM_004224）が見出された（図８）。GPR50は、Gタンパク質共役受容体の一種で、これまで大鬱病性障害や双極性障害等の精神疾患と遺伝的相関が報告されているが（Thomson　PA.,　et　al,　Mol.　Psychiatry,　10:470-478,　2005）、運動ニューロン疾患との関わりを示唆する知見はない。図８に示されるように、Control-UMNでは解析した細胞の約80%においてGPR50の強いシグナルが検出されたのに対し、ALS-UMNでは解析した細胞すべてにおいてGPR50のシグナルは検出されなかった。
　よって、GPR50の発現消失は、ALSのマーカーとなり得ることが示された。
　これまで、家族性ALS患者から同定された遺伝子変異を導入することで様々なALSモデルマウスが作製され、下位運動ニューロンの変性に関する様々な知見が得られている（参照：McGoldrick　P.,　et　al,　Biochim.　Biophys.　Acta.　Sci.,　USA,　1832:1421-1436,　2013）。しかしながら、解剖学的な差異によりマウスにはヒトのような皮質脊髄路が存在しないため、モデルマウスを用いて上位運動ニューロンの変性機構や上位・下位運動ニューロン間の変性伝播機構を研究することはできなかった。ましてや、上位運動ニューロンに対して生存促進や変性阻止作用を直接奏し得る薬剤をスクリーニングする手段は存在しなかった。
　本発明に係る多能性幹細胞は、当該外来性遺伝子の発現を誘導するだけで機能的な上位運動ニューロンへと変換され、下位運動ニューロンと神経結合を形成し得る細胞である。よって、本発明に係る上位運動ニューロンモデルと皮質脊髄路モデルの普及により、ALSを含む上位運動ニューロン疾患の治療方法と治療薬の研究が大幅に加速されることが期待される。

Claims (14)

  1. 　多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養する工程を含む、多能性幹細胞から錐体細胞を製造する方法。
  2. 　前記外来性のNgn2及びFezlを薬剤応答性プロモーターで発現させる、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記外来性のNgn2及びFezlを2A配列を用いてポリシストロニックに発現させる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記培養期間が21日間以上である、請求項１－３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記錐体細胞が上位運動ニューロンである、請求項１－４のいずれかに記載の方法。
  6. 　Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸を染色体内に含む多能性幹細胞。
  7. 　前記Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸が、薬剤応答性プロモーターに機能的に接合された核酸である、請求項６に記載の多能性幹細胞。
  8. 　前記Ngn2をコードする外来性核酸及びFezlをコードする外来性核酸が、2A配列を介して連結されている、請求項６又は７に記載の多能性幹細胞。
  9. 　前記多能性幹細胞が、ヒト由来人工多能性幹細胞である、請求項６－８のいずれかに記載の多能性幹細胞。
  10. 　前記ヒトが、筋萎縮性側索硬化症患者である、請求項９に記載のヒト由来人工多能性幹細胞。
  11. 　請求項５に記載された方法で製造された上位運動ニューロンをシナプス前細胞、下位運動ニューロンをシナプス後細胞とするシナプス結合を含む培養物。
  12. 　前記下位運動ニューロンが、多能性幹細胞から製造された下位運動ニューロンである、請求項１１に記載の培養物。
  13. 　前記下位運動ニューロンが、多能性幹細胞に外来性のLhx3、Ngn2、及びIsl1を発現させて製造された下位運動ニューロンである、請求項１２に記載の培養物。
  14. 　下記工程を含む、筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療薬のスクリーニング方法；
    （１）家族性ALS患者由来人工多能性幹細胞に外来性のNgn2及びFezlを発現させて培養して、該多能性幹細胞から上位運動ニューロンを製造する工程、
    （２）（１）で得られた上位運動ニューロンを、被験物質と接触させる工程、
    （３）（２）で被験物質と接触させた上位運動ニューロン、及び接触させなかった上位運動ニューロン（すなわち、対照細胞）を培養し、神経突起長、凝集化したTDP-43タンパク量、又はGPR50の発現量を測定する工程、
    （４）前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンの神経突起長もしくはGPR50の発現量が対照細胞の該値よりも高値である被験物質、又は、前記被験物質と接触させた上位運動ニューロンにおける凝集化したTDP-43タンパク量が対照細胞の該値よりも低値である被験物質を、筋萎縮性側索硬化症の予防又は治療薬として選択する工程。
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