WO2017115816A1 - がんの判定方法、がんの判定のための装置及びコンピュータプログラム - Google Patents

がんの判定方法、がんの判定のための装置及びコンピュータプログラム Download PDF

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健司 茶本
恵 後藤
均 宇賀
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Definitions

  • the present invention relates to a method for determining cancer. Furthermore, the present invention relates to an apparatus and a computer program for determining cancer.
  • PD-1 On the surface of activated T cells, a receptor molecule called PD-1 (Programmed cell death-1) is expressed (see Non-Patent Document 1).
  • PD-1 is known as a molecule that suppresses excessive activation of T cells and negatively regulates the immune response of the living body.
  • CTLA-4 Cytotoxic T lymphocyte antigen-4
  • CTLA-4 also has a function of suppressing the activation of T cells, like PD-1.
  • some cancer local cells express PD-L1L (Programmed cell death-ligand 1), which is a ligand of PD-1, on the cell surface.
  • Such cancer local cells are known to suppress the activation of T cells through the binding of their own PD-L1 and PD-1 of T cells, and avoid T cell attack. .
  • cancer increases in vivo.
  • PD-L1, PD-1 and CTLA-4 are also called immune checkpoint molecules because they are involved in immune suppression.
  • PD-L1 is a molecule present in the cell membrane
  • tissue collected from the subject For example, a method is known in which tumor tissue is collected from a cancer patient, a pathological tissue specimen is prepared, and immunostaining of PD-L1 is performed.
  • a method of determining immunogenicity by confirming gene mutation in cancer cells is also employed.
  • Tissue collection is a heavy burden on the subject.
  • the determination method based on detection of PD-L1 cannot obtain a result.
  • Tissue specimens vary greatly depending on the collection location, and the expression level of immune checkpoint-related molecules in the entire cancer tissue or in the whole body cannot be quantified. Therefore, there is a demand for a method for determining cancer, in which the burden on the subject is small and the systemic immune checkpoint-related molecular weight of cancer cells and T cells is quantified.
  • PD-L1, PD-1 and CTLA-4 are molecules involved in suppression of the immune activation state, and when the immune state of the living body is activated, the expression of these molecules may be enhanced on the cell surface.
  • T cells are activated in this living body to eliminate the cancer, and CTLA-4 and PD-1 expression is enhanced on the surface of the T cells. Conceivable.
  • PD-L1 expression is increased on the cell surface in cancer to avoid attack of activated T cells.
  • the inventors thought that as the expression of these molecules increases on the cell surface, the amount of molecules released from the cell surface also increases. That is, the present inventors thought that PD-L1, PD-1 and CTLA-4 released from the cell surface increased in the body of cancer patients.
  • the present inventors measured free PD-L1 and free PD-1 as free protein markers in a liquid sample such as a blood sample, and the sample was collected from a subject suffering from cancer.
  • the present invention has been completed by finding that it can be determined whether or not.
  • the present invention provides a step of measuring free PD-L1 and free PD-1 as free protein markers in a liquid sample collected from a subject, and based on the measurement result, the liquid sample described above has cancer.
  • a method for determining cancer comprising a step of determining whether or not the sample has been collected from an affected subject.
  • the present invention also includes a computer including a processor and a memory under the control of the processor, and the memory includes free PD-L1 and free PD- as free protein markers in a liquid sample collected from a subject. Obtaining the measurement value of 1, and determining whether the liquid sample is collected from a subject suffering from cancer based on the measurement value of the marker Provided is a cancer determination apparatus in which a computer program to be executed by the computer is recorded.
  • the present invention relates to a computer program recorded on a computer-readable medium, which is a free PD-L1 and free PD-- as a free protein marker in a liquid sample collected from a subject. Obtaining the measurement value of 1, and determining whether the liquid sample is collected from a subject suffering from cancer based on the measurement value of the marker A computer program for determining cancer, which is a computer program for causing the above computer to execute, is provided.
  • the present invention since the liquid sample collected from the subject is used, the burden on the subject in collecting the sample is small.
  • the present invention makes it possible to objectively evaluate whether or not a liquid sample is collected from a subject suffering from cancer.
  • cancer determination method In the cancer determination method of the present invention (hereinafter also simply referred to as “determination method”), first, free PD-L1 and free PD-1 are measured as free protein markers in a liquid sample collected from a subject. In this embodiment, free CTLA-4 may be further measured in addition to free PD-L1 and free PD-1.
  • the subject from whom the liquid sample is collected is not particularly limited, and may be, for example, a person suspected of having cancer.
  • the kind of cancer is not specifically limited,
  • various cancers, such as solid cancer and blood cancer can be made into the object of determination.
  • solid cancer include lung cancer, kidney cancer, ovarian cancer, and melanoma.
  • Hematological cancers include leukemia, malignant lymphoma, multiple myeloma and the like.
  • the liquid sample is not particularly limited as long as it is a liquid sample collected from the subject and can contain free protein.
  • a liquid sample examples include a blood sample, cerebrospinal fluid, pleural effusion, ascites, lymph and urine.
  • a blood sample is preferable as the liquid sample.
  • blood samples include whole blood, plasma and serum, with plasma and serum being particularly preferred.
  • the impurities may be removed from the liquid sample by known means such as centrifugation or filtration. Further, the liquid sample may be diluted with an appropriate aqueous medium as necessary.
  • an aqueous medium is not particularly limited as long as the measurement described later is not hindered, and examples thereof include water, physiological saline, and buffer solution.
  • the buffer solution is not particularly limited as long as it has a buffering action at a neutral pH (for example, a pH of 6 or more and 8 or less). Examples of such a buffer include Good buffers such as HEPES, MES, Tris, and PIPES, and phosphate buffered saline (PBS).
  • free PD-L1, free PD-1 and free CTLA-4 measured as markers are all free proteins.
  • free protein refers to a protein that is detached from the surface of a cell in a liquid sample and is present outside the cell.
  • Such free protein may be any of a protein solubilized in a liquid component (liquid phase) of a liquid sample, a protein encapsulated in a vesicle, and a protein present on the surface of the vesicle.
  • the vesicle is not particularly limited as long as it is a vesicle composed of a membrane.
  • the vesicle may contain a liquid phase inside.
  • Preferred vesicles are extracellular vesicles such as exosomes, microvesicles, apoptotic bodies and the like.
  • the means for measuring the free protein marker is not particularly limited as long as a value reflecting the amount or concentration of the free protein marker contained in the liquid sample (hereinafter also referred to as “marker measurement value”) can be obtained.
  • a method of capturing the marker using a substance that can specifically bind to the free protein marker is preferable.
  • the free protein marker contained in the liquid sample can be measured by detecting the free protein marker captured by such a substance by a method known in the art.
  • Examples of substances that can specifically bind to a free protein marker include antibodies and aptamers, among which antibodies are particularly preferable.
  • Antibodies against the PD-L1, PD-1 and CTLA-4 proteins themselves are known in the art and are generally available.
  • the antibody against the free protein marker is not particularly limited as long as the antibody can specifically bind to the free protein marker.
  • Such an antibody may be any of a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, and a fragment thereof (for example, Fab, F (ab ′) 2, etc.). Commercially available antibodies may also be used.
  • the method for measuring a free protein marker using an antibody is not particularly limited, and can be appropriately selected from known immunological measurement methods.
  • the enzyme-linked immunosorbent method (ELISA method) is preferable, and the sandwich ELISA method is particularly preferable.
  • ELISA method enzyme-linked immunosorbent method
  • sandwich ELISA method is particularly preferable.
  • a free protein marker, an antibody for capturing the free protein marker (hereinafter also referred to as “capture antibody”), and an antibody for detecting the free protein marker (hereinafter also referred to as “detection antibody”) Is formed on the solid phase.
  • the complex can be formed by mixing a liquid sample that may contain a free protein marker, a capture antibody, and a detection antibody. Then, the above complex can be formed on the solid phase by bringing the solution containing the complex into contact with a solid phase capable of capturing the capture antibody. Alternatively, a solid phase on which a capture antibody is immobilized in advance may be used.
  • the above complex can be formed on the solid phase by contacting the solid phase on which the capture antibody is immobilized, the liquid sample, and the detection antibody.
  • both the capture antibody and the detection antibody are monoclonal antibodies, it is preferable that the epitopes are different from each other.
  • the mode of immobilizing the capture antibody on the solid phase is not particularly limited.
  • the capture antibody and the solid phase may be directly bound, or the capture antibody and the solid phase may be indirectly bound via another substance.
  • Examples of the direct bond include physical adsorption.
  • Examples of indirect binding include binding through a combination of biotin and avidin or streptavidin (hereinafter also referred to as “avidins”).
  • the capture antibody is modified with biotin in advance, and avidin is bound to the solid phase in advance, so that the capture antibody and the solid phase are indirectly bound via the binding between biotin and avidin. Can be made.
  • the material for the solid phase is not particularly limited, and can be selected from, for example, organic polymer compounds, inorganic compounds, biopolymers, and the like.
  • organic polymer compound include latex, polystyrene, and polypropylene.
  • inorganic compounds include magnetic materials (such as iron oxide, chromium oxide, and ferrite), silica, alumina, and glass.
  • examples of the biopolymer include insoluble agarose, insoluble dextran, gelatin, and cellulose. Two or more of these may be used in combination.
  • the shape of the solid phase is not particularly limited, and examples thereof include particles, membranes, microplates, microtubes, test tubes and the like. Among these, particles are preferable, and magnetic particles are particularly preferable.
  • B / F (Bound / Free) separation that removes unreacted free components that have not formed a complex may be performed between the complex formation step and the complex detection step.
  • An unreacted free component refers to a component that does not constitute a complex. Examples thereof include a capture antibody and a detection antibody that have not been bound to a free protein marker.
  • the means for B / F separation is not particularly limited. If the solid phase is a particle, B / F separation can be performed by collecting only the solid phase capturing the complex by centrifugation. If the solid phase is a container such as a microplate or microtube, B / F separation can be performed by removing the liquid containing unreacted free components.
  • B / F separation can be performed by sucking and removing the liquid containing unreacted free components with a nozzle while the magnetic particles are magnetically constrained by a magnet. preferable.
  • the solid phase on which the complex has been captured may be washed with a suitable aqueous medium such as PBS.
  • Measured values of the free protein marker contained in the liquid sample can be obtained by detecting the complex formed on the solid phase by a method known in the art.
  • the detection antibody when an antibody labeled with a labeling substance is used as the detection antibody, the measurement value of the marker in the liquid sample can be obtained by detecting a signal generated by the labeling substance.
  • the measurement value of the marker in the liquid sample can be obtained in the same manner.
  • the immune complex transfer method described in JP-A-1-254868 can also be used.
  • detecting a signal includes qualitatively detecting the presence or absence of a signal, quantifying the signal intensity, and semi-quantitatively detecting the intensity of the signal.
  • Semi-quantitative detection refers to showing the intensity of a signal in stages, such as “no signal generated”, “weak”, “medium”, “strong”, and the like. In this embodiment, it is preferable to detect the intensity of the signal quantitatively or semi-quantitatively.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as a detectable signal is generated.
  • the substance itself may generate a signal (hereinafter also referred to as “signal generating substance”), or may be a substance that generates a signal by catalyzing the reaction of another substance.
  • signal generating substances include fluorescent substances and radioisotopes.
  • the substance that generates a detectable signal by catalyzing the reaction of another substance include an enzyme. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase, peroxidase, ⁇ -galactosidase, luciferase and the like.
  • fluorescent substance examples include fluorescent dyes such as fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine, Alexa Fluor (registered trademark), and fluorescent proteins such as GFP.
  • fluorescent dyes such as fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine, Alexa Fluor (registered trademark), and fluorescent proteins such as GFP.
  • radioisotope examples include 125 I, 14 C, and 32 P.
  • an enzyme is preferable, and alkaline phosphatase and peroxidase are particularly preferable.
  • the method for detecting the signal itself is known in the art.
  • a measurement method corresponding to the type of signal derived from the labeling substance may be selected as appropriate.
  • the labeling substance is an enzyme
  • it can be performed by measuring signals such as light and color generated by reacting a substrate for the enzyme with a known device such as a spectrophotometer.
  • the enzyme substrate can be appropriately selected from known substrates according to the type of the enzyme.
  • the substrate is CDP-Star® (4-chloro-3- (methoxyspiro [1, 2-dioxetane-3, 2 ′-(5′-chloro) trixiro [ 3. 3. 1. 13, 7] decan] -4-yl) phenyl phosphate disodium), CSPD (registered trademark) (3- (4-methoxyspiro [1, 2-dioxetane-3, 2- (5 Chemiluminescent substrates such as' -chloro) tricyclo [3. 3. 1.
  • the substrate may be a chemiluminescent substrate such as luminol and its derivatives, 2, 2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate ammonium) (ABTS), 1, 2- Examples include chromogenic substrates such as phenylenediamine (OPD) and 3,, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB).
  • chemiluminescent substrate such as luminol and its derivatives, 2, 2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate ammonium) (ABTS), 1, 2- Examples include chromogenic substrates such as phenylenediamine (OPD) and 3,, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB).
  • OPD phenylenediamine
  • TMB 5'-tetramethylbenzidine
  • the labeling substance is a radioisotope
  • radiation as a signal can be measured using a known device such as a scintillation counter.
  • fluorescence as a signal can be measured using a known device such as a fluorescent microplate reader.
  • an excitation wavelength and a fluorescence wavelength can be suitably determined according to the kind of used fluorescent substance.
  • the signal detection result can be used as a marker measurement value.
  • the measured value of the signal intensity itself or a value obtained from the measured value can be used as the measured value of the marker.
  • the value obtained from the measured value of the signal intensity include a value obtained by subtracting the measured value or background value of the negative control sample from the measured value, a value obtained by applying the measured value to a calibration curve, and the like. It is done.
  • the negative control sample can be appropriately selected, and examples thereof include a liquid sample obtained from a healthy person.
  • a free protein marker contained in a liquid sample by a sandwich ELISA method using a capture antibody immobilized on magnetic particles and a detection antibody labeled with a labeling substance.
  • the measurement may be performed using a commercially available fully automatic immunoassay device such as HISCL series (manufactured by Sysmex Corporation).
  • the sample discrimination method based on the measurement result, it is determined whether or not the liquid sample is collected from a subject suffering from cancer.
  • the measured value of the free protein marker obtained by the above measurement is compared with a predetermined threshold corresponding to each marker, and based on the comparison result, the liquid sample is subject to cancer. It is preferable to determine whether or not it is collected from a person.
  • the measured value of free PD-L1 and free PD-1 are obtained, the measured value of free PD-L1 is compared with the first threshold value, and the measured value of free PD-1 and the second threshold value are compared. And make a determination based on the comparison result.
  • An example of the determination is that the measured value of free PD-L1 is higher than or equal to the first threshold value, and the measured value of free PD-1 is higher than the second threshold value, or When the same as the second threshold value, the liquid sample may be determined to be collected from a subject suffering from cancer.
  • the measured value of free PD-L1 is lower than the first threshold value or the measured value of free PD-1 is lower than the second threshold value, the liquid sample is collected from a subject suffering from cancer. It may be determined that it has not been done.
  • the measured value of free PD-1 is compared with the measured value of free PD-L1 and the first threshold value. Is compared with the second threshold value, the measured value of free CTLA-4 is compared with the third threshold value, and the determination is performed based on the comparison result.
  • An example of the determination is that the measured value of free PD-L1 is higher than or equal to the first threshold value, and the measured value of free PD-1 is higher than the second threshold value, or
  • the second threshold is the same and the measured free CTLA-4 is greater than or equal to the third threshold, a liquid sample is obtained from a subject suffering from cancer. You may determine with having been collected.
  • the measurement value of free PD-L1 is lower than the first threshold value
  • the measurement value of free PD-1 is lower than the second threshold value
  • the measurement value of free CTLA-4 is lower than the third threshold value
  • the liquid sample may be determined not to have been collected from a subject suffering from cancer.
  • the predicted value obtained by multivariate analysis from the measured value of the free protein marker obtained by the above measurement is compared with a predetermined threshold corresponding to the predicted value, and based on the comparison result, the liquid sample It may be determined whether or not is collected from a subject suffering from cancer.
  • Multivariate analysis can be appropriately selected from known analysis methods such as logistic regression analysis, multiple regression analysis, and discriminant analysis. Among them, logistic regression analysis is preferable.
  • the measured values of free PD-L1 and free PD-1 are acquired, these measured values are substituted into discriminants created by multivariate analysis (for example, logistic regression analysis) to obtain predicted values To do. Even if you have acquired additional measurements of free CTLA-4, in the same way as above, substitute all of the acquired measurement values of the markers into the discriminant created by multivariate analysis (for example, logistic regression analysis). Get the predicted value. Then, the obtained predicted value is compared with a predetermined threshold value, and a determination is made based on the comparison result. As an example of determination, when the obtained predicted value is higher than or equal to the predetermined threshold, the liquid sample is determined to be collected from a subject suffering from cancer. May be. Further, when the obtained predicted value is lower than a predetermined threshold value, the liquid sample may be determined not to be collected from a subject suffering from cancer.
  • multivariate analysis for example, logistic regression analysis
  • the predicted value when the measured values of free PD-L1 and free PD-1 are acquired, the predicted value may be calculated using a regression equation of the following formula (I). Moreover, when the measured values of free PD-L1, free PD-1 and free CTLA-4 are obtained, the predicted value may be calculated using the regression equation of the following formula (II).
  • These regression equations are equations constructed based on a multiple logistic model.
  • [PD-L1], [PD-1] and [CTLA-4] are measured values of free PD-L1, free PD-1 and free CTLA-4, respectively.
  • b 0 is an intercept coefficient
  • b 1 to b 3 are coefficients of each free protein marker. The coefficient can be determined by a known method such as a maximum likelihood method.
  • the predetermined threshold value corresponding to each of the above markers and the threshold value corresponding to the predicted value are not particularly limited. For example, it is empirical by accumulating data of free protein markers in liquid samples collected from various cancer patients. Can be set. Alternatively, a predetermined cut-off value may be set as follows. Liquid samples are collected from healthy people and various cancer patients, and free protein marker measurements are obtained. And the value which can distinguish a healthy person and a cancer patient about each marker from the acquired measured value is calculated
  • the measured values of markers obtained from liquid samples from healthy individuals and various cancer patients are substituted into discriminants created by multivariate analysis, and the predicted values of healthy persons and the predicted values of cancer patients are obtained. . And the value which can distinguish a healthy person and a cancer patient from the acquired predicted value is calculated
  • the determination method of the present embodiment makes it possible to provide information that assists diagnosis of cancer to a doctor or the like. That is, the determination method of this embodiment can also be interpreted as a method for assisting the determination or diagnosis of cancer.
  • the scope of the present invention includes an apparatus for carrying out the cancer determination method according to the present embodiment.
  • Such an apparatus is a cancer determination apparatus (hereinafter also simply referred to as “determination apparatus”).
  • the scope of the present invention also includes a computer program for causing a computer to execute the cancer determination method according to the present embodiment.
  • Such a computer program is a computer program for determining cancer.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a cancer determination apparatus.
  • the determination device 10 shown in FIG. 1 includes an immunoassay device 20 and a computer system 30 connected to the immunoassay device 20.
  • the type of immunoassay device is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the method for measuring the free protein marker.
  • the immunoassay device 20 is a commercially available automatic immunoassay device capable of detecting a chemiluminescent signal generated by a sandwich ELISA method using magnetic particles to which a capture antibody is immobilized and an enzyme-labeled detection antibody. It is.
  • the immunoassay device 20 is not particularly limited as long as it can detect a signal based on the labeling substance used, and can be appropriately selected according to the type of labeling substance.
  • a reagent containing magnetic particles to which a capture antibody is immobilized When a reagent containing magnetic particles to which a capture antibody is immobilized, a reagent containing an enzyme-labeled detection antibody, and a liquid sample collected from a subject are set in the immunoassay device 20, the immunoassay device 20 The antigen-antibody reaction is performed, a chemiluminescence signal is acquired as optical information based on the enzyme-labeled antibody specifically bound to the free protein marker, and the obtained optical information is transmitted to the computer system 30.
  • the computer system 30 includes a computer main body 300, an input unit 301, and a display unit 302 that displays sample information and determination results.
  • the computer system 30 receives optical information from the immunoassay device 20.
  • the processor of the computer system 30 executes a computer program for determining cancer that is installed in the hard disk 313 based on the optical information.
  • the computer system 30 may be a device separate from the immunoassay device 20 or may be a device that includes the immunoassay device 20. In the latter case, the computer system 30 may itself become the determination device 10.
  • a computer program for determining the above cancer may be mounted on a commercially available automatic immunoassay device.
  • a computer main body 300 includes a CPU (Central Processing Unit) 310, a ROM (Read Only Memory) 311, a RAM (Random Access Memory) 312, a hard disk 313, an input / output interface 314, and a reading unit.
  • a device 315, a communication interface 316, and an image output interface 317 are provided.
  • the CPU 310, the ROM 311, the RAM 312, the hard disk 313, the input / output interface 314, the reading device 315, the communication interface 316, and the image output interface 317 are connected via a bus 318 so that data communication is possible.
  • the immunoassay device 20 is connected to the computer system 30 through a communication interface 316 so as to be communicable.
  • the CPU 310 can execute a program stored in the ROM 311 or the hard disk 313 and a program loaded in the RAM 312.
  • the CPU 310 calculates a measurement value of the free protein marker, reads a predetermined threshold value corresponding to each marker stored in the ROM 311 or the hard disk 313, and a liquid sample is collected from a subject suffering from cancer. It is determined whether or not there is.
  • CPU310 may read the discriminant of the multivariate analysis memorize
  • the CPU 310 reads a predetermined threshold value corresponding to the predicted value stored in the ROM 311 or the hard disk 313, and determines whether or not the liquid sample is collected from a subject suffering from cancer. Also good.
  • the CPU 310 outputs the determination result and causes the display unit 302 to display the determination result.
  • the ROM 311 is configured by a mask ROM, PROM, EPROM, EEPROM, or the like.
  • the ROM 311 stores a computer program executed by the CPU 310 and data used for executing the computer program as described above.
  • the ROM 311 may store data used in a determination flow described later, such as a predetermined threshold and a discriminant for multivariate analysis.
  • the RAM 312 is configured by SRAM, DRAM, or the like.
  • the RAM 312 is used for reading programs recorded in the ROM 311 and the hard disk 313.
  • the RAM 312 is also used as a work area for the CPU 310 when executing these programs.
  • the hard disk 313 is installed with an operating system to be executed by the CPU 310, a computer program such as an application program (the above-described computer program for cancer determination), and data used for executing the computer program.
  • the hard disk 313 may store data used in a determination flow described later, such as a predetermined threshold and a discriminant for multivariate analysis.
  • the reading device 315 includes a flexible disk drive, a CD-ROM drive, a DVD-ROM drive, and the like.
  • the reading device 315 can read a program or data recorded on the portable recording medium 40.
  • the input / output interface 314 includes, for example, a serial interface such as USB, IEEE 1394, RS-232C, a parallel interface such as SCSI, IDE, IEEE 1284, and an analog interface including a D / A converter, an A / D converter, and the like. It is configured.
  • An input unit 301 such as a keyboard and a mouse is connected to the input / output interface 314. An operator can input various commands to the computer main body 300 through the input unit 301.
  • the communication interface 316 is, for example, an Ethernet (registered trademark) interface.
  • the computer main body 300 can also transmit print data to a printer or the like via the communication interface 316.
  • the image output interface 317 is connected to a display unit 302 configured with an LCD, a CRT, or the like. Accordingly, the display unit 302 can output a video signal corresponding to the image data given from the CPU 310.
  • the display unit 302 displays an image (screen) according to the input video signal.
  • a cancer determination flow executed by the determination apparatus 10 will be described.
  • measurements of free PD-L1 and free PD-1 were obtained from chemiluminescence signals generated by sandwich ELISA using magnetic particles with immobilized capture antibodies and enzyme-labeled detection antibodies.
  • a case where determination is performed using values will be described as an example. However, the present embodiment is not limited to this example.
  • step S 101 the CPU 310 acquires optical information (chemiluminescence signal) from the immunoassay device 20, calculates measured values of free PD-L 1 and free PD-1 from the acquired optical information, and stores them in the hard disk 313. To do.
  • step S102 the CPU 310 compares the calculated measured value of the free PD-L1 with the first threshold value stored in the hard disk 313. When the measured value of free PD-L1 is higher than or equal to the first threshold value, the process proceeds to step S103.
  • step S ⁇ b> 103 the CPU 310 compares the calculated measurement value of the free PD-1 with the second threshold value stored in the hard disk 313. When the measured value of free PD-1 is higher than or equal to the second threshold value, the process proceeds to step S104.
  • step S104 the CPU 310 stores in the hard disk 313 a determination result that the liquid sample is collected from a subject suffering from cancer.
  • step S105 when the measured value of free PD-L1 is lower than the first threshold value in step S102, the process proceeds to step S105.
  • step 103 when the measured value of free PD-1 is lower than the second threshold value, the process proceeds to step S105.
  • step S105 the CPU 310 stores in the hard disk 313 a determination result that the liquid sample is not collected from a subject suffering from cancer.
  • step S ⁇ b> 106 the CPU 310 outputs the determination result, and displays it on the display unit 302 or causes the printer to print it. Thereby, information for assisting diagnosis of cancer of the subject can be provided to a doctor or the like. In this example, the order of steps S102 and S103 can be changed.
  • the cancer determination flow executed by the determination apparatus 10 will be described.
  • a case where a measurement value of free CTLA-4 is further acquired and the determination is performed using the acquired measurement value will be described as an example.
  • the present embodiment is not limited to this example.
  • step S201 the CPU 310 obtains optical information (chemiluminescence signal) from the immunoassay device 20, and calculates measured values of free PD-L1, free PD-1 and free CTLA-4 from the obtained optical information. And stored in the hard disk 313.
  • step S ⁇ b> 202 the CPU 310 compares the calculated measurement value of the free PD-L ⁇ b> 1 with the first threshold value stored in the hard disk 313. When the measured value of free PD-L1 is higher than or equal to the first threshold value, the process proceeds to step S203.
  • step S ⁇ b> 203 the CPU 310 compares the calculated measured value of the free PD-1 with the second threshold value stored in the hard disk 313.
  • step S204 the CPU 310 compares the calculated measured value of free CTLA-4 with the third threshold value stored in the hard disk 313.
  • step S205 the CPU 310 stores a determination result that the liquid sample is collected from a subject suffering from cancer in the hard disk 313.
  • step S206 when the measured value of free PD-L1 is lower than the first threshold value in step S202, the process proceeds to step S206.
  • step 203 when the measured value of free PD-1 is lower than the second threshold value, the process proceeds to step S206.
  • step 204 when the measured value of free CTLA-4 is lower than the third threshold value, the process proceeds to step S206.
  • step S206 the CPU 310 stores in the hard disk 313 a determination result that the liquid sample is not collected from a subject suffering from cancer.
  • step S207 the CPU 310 outputs the determination result and causes the display unit 302 to display the print result, or causes the printer to print. Thereby, information for assisting diagnosis of cancer of the subject can be provided to a doctor or the like. In this example, the order of steps S202, S203, and S204 can be changed.
  • the cancer determination flow executed by the determination apparatus 10 will be described.
  • a case where a predicted value is acquired from the acquired measured values of free PD-L1 and free PD-1 using a multiple logistic model and determination is performed using the obtained predicted value will be described as an example.
  • the present embodiment is not limited to this example.
  • step S301 the CPU 310 acquires optical information (chemiluminescence signal) from the immunoassay device 20, calculates the measured values of free PD-L1 and free PD-1 from the acquired optical information, and stores them in the hard disk 313. To do.
  • step S302 the CPU 310 calculates a predicted value P based on the multiple logistic model from the measured values of free PD-L1 and free PD-1 according to the discriminant stored in the ROM 311 or the hard disk 313.
  • step S ⁇ b> 303 the CPU 310 compares the calculated predicted value P with a predetermined threshold corresponding to the predicted value stored in the hard disk 313.
  • step S304 When the predicted value P is higher than or equal to the predetermined threshold, the process proceeds to step S304, and the CPU 310 indicates that the liquid sample is collected from a subject suffering from cancer.
  • the determination result is stored in the hard disk 313.
  • step S305 when the predicted value P is lower than the predetermined threshold value in step S303, the process proceeds to step S305, and the CPU 310 gives a determination result that the liquid sample is not collected from a subject suffering from cancer.
  • step S ⁇ b> 306 the CPU 310 outputs a determination result and displays the determination result on the display unit 302 or causes the printer to print. Thereby, information for assisting diagnosis of cancer of the subject can be provided to a doctor or the like.
  • step S302 the CPU 310 calculates the predicted value P from the measured values of free PD-L1, free PD-1 and free CTLA-4. May be.
  • Example 1 In Example 1, a liquid sample derived from a healthy person and a liquid sample derived from a cancer patient were discriminated based on the concentration value of the free protein marker.
  • Liquid sample As a liquid sample, human plasma (containing EDTA) obtained from a healthy person and a cancer patient was used. Plasma of healthy individuals (50 samples) was obtained from BioreclamationIVT, and plasma of cancer patients (60 samples) was obtained from Proteogenentec and BioreclamationIVT. The breakdown of cancer patients is lung cancer patients (21 samples), kidney cancer patients (18 samples), melanoma patients (15 samples), and ovarian cancer patients (6 samples).
  • Anti-PD-1 antibody (clone No. MIH4) was used as the capturing antibody. This antibody was labeled with biotin as described above. The obtained biotin-labeled anti-PD-1 antibody was added to 100 mM HEPES (pH 7.5) to prepare a first reagent for capturing PD-1 (antibody concentration 5 ⁇ g / ml).
  • Second reagent liquid containing streptavidin-binding particles
  • Magnetic particles (average particle size 2 ⁇ m. Streptavidin amount per gram of magnetic particles is 2.9-3.5 mg, hereinafter also referred to as “STA-coupled magnetic particles”) in 10 mM HEPES buffer ( Washed 3 times with pH 7.5). After washing, add the STA-bound magnetic particles to 10 mM HEPES (pH 7.5) so that the streptavidin concentration is 18-22 ⁇ g / ml (STA-bound magnetic particle concentration is 0.48-0.52 mg / ml). A binding particle-containing liquid was obtained.
  • Anti-PD-1 antibody (clone No. PD1.3.1.3) was used as an antibody for detection. This antibody was labeled with alkaline phosphatase and purified as described above. The obtained alkaline phosphatase-labeled anti-PD-1 antibody was added to 100 mM HEPES (pH 7.5) at a 75-fold dilution to prepare a third reagent for PD-1 detection.
  • Anti-CTLA-4 antibody (clone No. 14D3) was used as a detection antibody. This antibody was labeled with alkaline phosphatase and purified as described above. The obtained alkaline phosphatase-labeled anti-CTLA-4 antibody was added to 100 mM MES (pH 6.5) at a 75-fold dilution to prepare a third reagent for CTLA-4 detection.
  • each free protein marker was performed with the fully automated immunoassay device HISCL-800 (manufactured by Sysmex Corporation) using the above first to fifth reagents. This measurement is based on a sandwich ELISA on magnetic particles. Specifically, plasma (20 ⁇ L) was added to and mixed with the first reagent (50 ⁇ L), and then the second reagent (30 ⁇ L) was added and mixed. The magnetic particles in the obtained mixture were collected to remove the supernatant, and the HISCL cleaning solution (300 ⁇ L) was added to wash the magnetic particles. The supernatant was removed, and a third reagent (80 ⁇ L) was added to the magnetic particles and mixed.
  • HISCL-800 manufactured by Sysmex Corporation
  • the magnetic particles in the obtained mixture were collected to remove the supernatant, and the HISCL cleaning solution (300 ⁇ L) was added to wash the magnetic particles.
  • the supernatant was removed, the fourth reagent (50 ⁇ L) and the fifth reagent (100 ⁇ L) were added to the magnetic particles, mixed well, and the chemiluminescence intensity was measured.
  • the reaction time was 17 minutes throughout the entire process.
  • the chemiluminescence intensity obtained was applied to a calibration curve, and the concentration of each free protein marker was calculated.
  • x varies depending on the marker used for the determination.
  • Table 1 shows “x” corresponding to the marker used for the determination.
  • [PD-L1], [PD-1] and [CTLA-4] are values of the concentrations of free PD-L1, free PD-1 and free CTLA-4 in the liquid sample, respectively.
  • ROC curve Receiveiver / Operatorating / Characteristic curve
  • FIGS. A predetermined threshold was determined from the ROC curve. If the predicted value is higher than or equal to the predetermined threshold, the liquid sample is determined to be a sample derived from a cancer patient. If the predicted value is lower than the predetermined threshold, the liquid sample is derived from a healthy person It was determined as a sample. Table 2 shows the area under each curve (AUC) of each ROC curve and the specificity when the sensitivity according to the above determination is about 90%.
  • the ROC curve was created, the threshold was calculated, and the sensitivity and specificity were calculated using StatFlex (manufactured by Artec).
  • AUC is a combination of free PD-L1 and free PD-1 than when free PD-L1, free PD-1 and free CTLA-4 were each used for determination, or The combination of free PD-L1, free PD-1 and free CTLA-4 was higher.
  • the combination of free PD-L1 and free PD-1 is used rather than the case where free PD-L1 and free PD-1 are each used for judgment. It was higher. This specificity was increased by further combining free CTLA-4 with free PD-L1 and free PD-1.
  • the sample is a cancer patient-derived sample can be determined with high accuracy from the concentration values of free PD-L1 and free PD-1 in the liquid sample. Moreover, it was shown that the determination accuracy is further improved by further using the concentration value of free CTLA-4 for the determination.

Abstract

本発明は、がんの判定方法に関する。さらに、本発明は、がんの判定のための装置及びコンピュータプログラムに関する。

Description

がんの判定方法、がんの判定のための装置及びコンピュータプログラム
　本発明は、がんの判定方法に関する。さらに、本発明は、がんの判定のための装置及びコンピュータプログラムに関する。
　活性化したＴ細胞の表面には、PD-1 (Programmed cell death-1)と呼ばれる受容体分子が発現している(非特許文献１参照)。PD-1は、Ｔ細胞の過剰な活性化を抑制して、生体の免疫応答を負に制御する分子として知られている。また、活性化したＴ細胞の表面には、CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte antigen-4)と呼ばれる分子も発現している。CTLA-4も、PD-1と同様に、Ｔ細胞の活性化を抑制する機能を有する。一方、がん局所の細胞には、PD-1のリガンドであるPD-L1 (Programmed cell death-ligand 1)を細胞表面に発現するものがある。そのようながん局所の細胞は、自らのPD-L1とＴ細胞のPD-1との結合を介してＴ細胞の活性化を抑制し、Ｔ細胞の攻撃を回避することが知られている。その結果、がんは生体内で増大する。実際、がん局所のPD-L1発現量とがん患者の予後不良率には相関関係がある。このように、PD-L1、PD-1及びCTLA-4は、免疫の抑制に関与することから、免疫チェックポイント分子とも呼ばれる。
Agata Y.ら, Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. Int. Immunol., vol.8, pp.765-772 (1996)
　PD-L1は細胞膜に存在する分子であるので、PD-L1の検出によりがんの判定を行うためには、被検者から採取した組織を試料に用いる必要がある。例えば、がん患者から腫瘍組織を採取して病理組織標本を作製し、PD-L1の免疫染色を行う方法が知られている。また、がん細胞における遺伝子変異を確認することで、免疫原性の判定をする方法も採用されている。しかし、次の理由により、従来の方法は改善すべき点がある。１）組織の採取は、被検者への負担が大きい。２）がん発症の原因がＴ細胞にある場合、PD-L1の検出による判定方法では、結果を得ることができない。３）組織標本は採取場所によりばらつきが大きく、がん組織全体、もしくは全身における免疫チェックポイント関連分子の発現量を定量することができない。よって、被検者への負担が小さく、且つ、がん細胞及びＴ細胞の全身的な免疫チェックポイント関連分子量を定量する、がんの判定方法が望まれる。
　上述のとおり、PD-L1、PD-1及びCTLA-4は免疫活性化状態の抑制に関わる分子であり、生体の免疫状態が活性化すると、細胞表面でこれらの分子の発現が亢進することが知られている。ここで、生体ががんに罹患している場合、この生体内では、がんを排除するためにＴ細胞が活性化するとともに、Ｔ細胞表面ではCTLA-4及びPD-1の発現が亢進すると考えられる。また、がん局所の細胞表面では、活性化したＴ細胞の攻撃を避けるためにPD-L1の発現が亢進すると考えられる。本発明者らは、これらの分子の発現が細胞表面において増加すると、細胞表面から遊離する分子の量も増加すると考えた。すなわち、本発明者らは、がん患者の体内では、細胞表面から遊離したPD-L1、PD-1及びCTLA-4が増加すると考えた。
　本発明者らは、血液試料などの液体試料中の遊離タンパク質マーカーとして遊離PD-L1及び遊離PD-1を測定することにより、該試料が、がんを罹患した被検者から採取されたものであるかを判別できることを見出して、本発明を完成した。
　よって、本発明は、被検者から採取した液体試料中の遊離タンパク質マーカーとして遊離PD-L1及び遊離PD-1を測定する工程と、測定結果に基づいて、上記の液体試料が、がんを罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定する工程とを含む、がんの判定方法を提供する。
　また、本発明は、プロセッサ及びこのプロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、上記のメモリには、被検者から採取した液体試料中の遊離タンパク質マーカーとして遊離PD-L1及び遊離PD-1の測定値を取得するステップと、上記のマーカーの測定値に基づいて、上記の液体試料が、がんを罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定するステップとを上記のコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、がんの判定装置を提供する。
　さらに、本発明は、コンピュータが読み取り可能な媒体に記録されているコンピュータプログラムであって、このコンピュータプログラムが、被検者から採取した液体試料中の遊離タンパク質マーカーとして遊離PD-L1及び遊離PD-1の測定値を取得するステップと、上記のマーカーの測定値に基づいて、上記の液体試料が、がんを罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定するステップとを上記のコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムである、がんの判定のためのコンピュータプログラムを提供する。
　本発明によると、被検者から採取された液体試料を用いるため、試料の採取における被検者への負担が小さい。また、本発明は、液体試料が、がんに罹患した被検者から採取したものであるか否かを客観的に評価することを可能にする。
がんの判定装置の一例を示した概略図である。 がんの判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。 がんの判定装置を用いたがんの判定のフローチャートである。 がんの判定装置を用いたがんの判定のフローチャートである。 がんの判定装置を用いたがんの判定のフローチャートである。 遊離PD-L1の濃度値に基づく予測値から判定を行ったときのROC曲線である。 遊離PD-1の濃度値に基づく予測値から判定を行ったときのROC曲線である。 遊離CTLA-4の濃度値に基づく予測値から判定を行ったときのROC曲線である。 遊離PD-L1及び遊離PD-1の濃度値に基づく予測値から判定を行ったときのROC曲線である。 遊離PD-L1、遊離PD-1及び遊離CTLA-4の濃度値に基づく予測値から判定を行ったときのROC曲線である。
［１．がんの判定方法］
　本発明のがんの判定方法(以下、単に「判定方法」ともいう)では、まず、被検者から採取した液体試料中の遊離タンパク質マーカーとして遊離PD-L1及び遊離PD-1を測定する。本実施形態では、遊離PD-L1及び遊離PD-1に加えて、遊離CTLA-4をさらに測定してもよい。
　液体試料を採取される被検者は特に限定されず、例えば、がんの罹患が疑われる者であってもよい。本実施形態において、がんの種類は特に限定されず、例えば、固形がん及び血液がんなどの種々のがんを判定の対象とすることができる。固形がんとしては、例えば、肺がん、腎臓がん、卵巣がん、メラノーマなどが挙げられる。血液がんとしては、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられる。
　液体試料は、被検者から採取され、遊離タンパク質が含まれ得る液状の試料であれば特に限定されない。そのような液体試料としては、例えば、血液試料、脳脊髄液、胸水、腹水、リンパ液、尿などが挙げられる。本実施形態では、液体試料としては血液試料が好ましい。血液試料としては、全血、血漿及び血清が挙げられ、特に血漿及び血清が好ましい。
　液体試料に細胞などの不溶性の夾雑物が含まれる場合は、例えば、遠心分離、ろ過などの公知の手段により、液体試料から夾雑物を除去してもよい。また、液体試料は、必要に応じて適切な水性媒体で希釈してもよい。そのような水性媒体は、後述の測定を妨げないかぎり特に限定されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液は、中性付近のpH(例えば６以上８以下のpH)で緩衝作用を有するかぎり、特に限定されない。そのような緩衝液は、例えば、HEPES、MES、Tris、PIPESなどのグッド緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などが挙げられる。
　本実施形態においてマーカーとして測定される遊離PD-L1、遊離PD-1及び遊離CTLA-4は、いずれも遊離タンパク質である。本明細書において「遊離タンパク質」とは、液体試料中の細胞の表面から脱離して、該細胞の外部に存在するタンパク質をいう。そのような遊離タンパク質は、液体試料の液体成分(液相)に可溶化したタンパク質、ベシクルに内包されたタンパク質、及びベシクルの表面に存在するタンパク質のいずれであってもよい。ベシクルは、膜で構成された小胞であれば特に限定されない。ベシクルは、内部に液相を含んでいてもよい。好ましいベシクルは細胞外小胞であり、例えば、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体などが挙げられる。
　遊離タンパク質マーカーを測定する手段は、液体試料に含まれる遊離タンパク質マーカーの量又は濃度を反映する値(以下、「マーカーの測定値」ともいう)を取得できるかぎり、特に限定されない。本実施形態では、遊離タンパク質マーカーと特異的に結合可能な物質を用いて、該マーカーを捕捉する方法が好ましい。このような物質により捕捉された遊離タンパク質マーカーを、当該技術において公知の方法で検出することにより、液体試料に含まれる遊離タンパク質マーカーを測定できる。
　遊離タンパク質マーカーと特異的に結合可能な物質としては、例えば、抗体、アプタマーなどが挙げられるが、それらの中でも抗体が特に好ましい。PD-L1、PD-1及びCTLA-4の各タンパク質に対する抗体自体は、当該技術において公知であり、一般に入手可能である。遊離タンパク質マーカーに対する抗体は、遊離タンパク質マーカーと特異的に結合できる抗体であれば、特に限定されない。そのような抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びそれらの断片(例えば、Fab、F(ab')2など)のいずれであってもよい。また、市販の抗体を用いてもよい。
　抗体を用いて遊離タンパク質マーカーを測定する方法は、特に限定されず、公知の免疫学的測定法から適宜選択できる。本実施形態においては、酵素結合免疫吸着法(ELISA法)が好ましく、サンドイッチELISA法が特に好ましい。測定工程の一例として、サンドイッチELISA法により、液体試料中の遊離タンパク質マーカーを測定する場合について、以下に説明する。
　まず、遊離タンパク質マーカーと、遊離タンパク質マーカーを捕捉するための抗体(以下、「捕捉用抗体」ともいう)と、遊離タンパク質マーカーを検出するための抗体(以下、「検出用抗体」ともいう)とを含む複合体を固相上に形成させる。該複合体は、遊離タンパク質マーカーを含み得る液体試料と、捕捉用抗体と、検出用抗体とを混合することにより形成できる。そして、複合体を含む溶液を、捕捉用抗体を捕捉できる固相と接触させることにより、上記の複合体を固相上に形成させることができる。あるいは、捕捉用抗体をあらかじめ固定させた固相を用いてもよい。すなわち、捕捉用抗体を固定させた固相と、液体試料と、検出用抗体とを接触することにより、上記の複合体を固相上に形成させることができる。なお、捕捉用抗体及び検出用抗体がいずれもモノクローナル抗体の場合は、互いのエピトープが異なっていることが好ましい。
　捕捉用抗体の固相への固定の態様は、特に限定されない。例えば、捕捉用抗体と固相とを直接結合させてもよいし、捕捉用抗体と固相とを別の物質を介して間接的に結合させてもよい。直接の結合としては、例えば、物理的吸着などが挙げられる。間接的な結合としては、例えば、ビオチンと、アビジン又はストレプトアビジン(以下、「アビジン類」ともいう)との組み合わせを介した結合が挙げられる。この場合、捕捉用抗体をあらかじめビオチンで修飾し、固相にアビジン類をあらかじめ結合させておくことにより、ビオチンとアビジン類との結合を介して、捕捉用抗体と固相とを間接的に結合させることができる。
　固相の素材は特に限定されず、例えば、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体(酸化鉄、酸化クロム及びフェライトなど)、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えば、粒子、膜、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。それらの中でも粒子が好ましく、磁性粒子が特に好ましい。
　本実施形態においては、複合体の形成工程と複合体の検出工程との間に、複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去するB/F(Bound/Free)分離を行ってもよい。未反応の遊離成分とは、複合体を構成しない成分をいう。例えば、遊離タンパク質マーカーと結合しなかった捕捉用抗体及び検出用抗体などが挙げられる。B/F分離の手段は特に限定されないが、固相が粒子であれば、遠心分離により、複合体を捕捉した固相だけを回収することによりB/F分離ができる。固相がマイクロプレートやマイクロチューブなどの容器であれば、未反応の遊離成分を含む液を除去することによりB/F分離ができる。また、固相が磁性粒子の場合は、磁石で磁性粒子を磁気的に拘束した状態でノズルによって未反応の遊離成分を含む液を吸引除去することによりB/F分離ができ、自動化の観点で好ましい。未反応の遊離成分を除去した後、複合体を捕捉した固相をPBSなどの適切な水性媒体で洗浄してもよい。
　そして、固相上に形成された複合体を、当該技術において公知の方法で検出することにより、液体試料に含まれる遊離タンパク質マーカーの測定値を取得できる。例えば、検出用抗体として、標識物質で標識した抗体を用いた場合は、その標識物質により生じるシグナルを検出することにより、液体試料におけるマーカーの測定値を取得できる。あるいは、検出用抗体に対する標識二次抗体を用いた場合も、同様にして液体試料におけるマーカーの測定値を取得できる。
　また、抗体を用いて遊離タンパク質マーカーを測定する方法の例として、特開平１－２５４８６８号公報に記載の免疫複合体転移法を用いることもできる。
　本明細書において、「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナル強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。半定量的な検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。本実施形態では、シグナルの強度を定量的又は半定量的に検出することが好ましい。
　標識物質は、検出可能なシグナルが生じるかぎり、特に限定されない。例えば、それ自体がシグナルを発生する物質(以下、「シグナル発生物質」ともいう)であってもよいし、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよい。シグナル発生物質としては、例えば、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば、酵素が挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)などの蛍光色素、GFPなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。それらの中でも、標識物質として、酵素が好ましく、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼが特に好ましい。
　シグナルを検出する方法自体は、当該技術において公知である。本実施形態では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択すればよい。例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、分光光度計などの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
　酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質として、CDP-Star(登録商標)(4-クロロ-3-(メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2'-(5'-クロロ)トリクシロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)、CSPD(登録商標)(3-(4-メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)などの化学発光基質、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、5-ブロモ-6-クロロ－インドリルリン酸２ナトリウム、p-ニトロフェニルリン酸などの発色基質が挙げられる。また、酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合、基質としては、ルミノール及びその誘導体などの化学発光基質、2, 2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸アンモニウム)(ABTS)、1, 2-フェニレンジアミン(OPD)、3, 3',5, 5'-テトラメチルベンジジン(TMB)などの発色基質が挙げられる。
　標識物質が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダーなどの公知の装置を用いて測定できる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。
　シグナルの検出結果は、マーカーの測定値として用いることができる。例えば、シグナルの強度を定量的に検出する場合は、シグナル強度の測定値自体又は該測定値から取得される値を、マーカーの測定値として用いることができる。シグナル強度の測定値から取得される値としては、例えば、該測定値から陰性対照試料の測定値又はバックグラウンドの値を差し引いた値、該測定値を検量線に当てはめて取得した値などが挙げられる。陰性対照試料は、適宜選択できるが、例えば、健常人から得た液体試料などが挙げられる。
　本実施形態では、磁性粒子に固定された捕捉用抗体と、標識物質で標識された検出用抗体とを用いるサンドイッチELISA法により、液体試料に含まれる遊離タンパク質マーカーを測定することが好ましい。この場合、測定は、HISCLシリーズ(シスメックス株式会社製)などの市販の全自動免疫測定装置を用いて行ってもよい。
　次いで、本実施形態に係る試料の判別方法では、測定結果に基づいて、上記の液体試料が、がんに罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定する。
　本実施形態においては、上記の測定により取得した遊離タンパク質マーカーの測定値と、各マーカーに対応する所定の閾値とを比較し、比較結果に基づいて、液体試料が、がんに罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定することが好ましい。
　例えば、遊離PD-L1及び遊離PD-1の測定値を取得している場合、遊離PD-L1の測定値と第１の閾値とを比較し、遊離PD-1の測定値と第２の閾値とを比較して、それらの比較結果に基づいて判定を行う。判定の一例を挙げると、遊離PD-L1の測定値が第１の閾値より高いか又は第１の閾値と同じであり、且つ、遊離PD-1の測定値が第２の閾値より高いか又は第２の閾値と同じであるとき、液体試料は、がんに罹患した被検者から採取されたものであると判定してもよい。また、遊離PD-L1の測定値が第１の閾値より低いか、又は、遊離PD-1の測定値が第２の閾値より低いとき、液体試料は、がんに罹患した被検者から採取されたものではないと判定してもよい。
　例えば、遊離PD-L1、遊離PD-1及び遊離CTLA-4の測定値を取得している場合、遊離PD-L1の測定値と第１の閾値とを比較し、遊離PD-1の測定値と第２の閾値とを比較し、遊離CTLA-4の測定値と第３の閾値とを比較して、それらの比較結果に基づいて判定を行う。判定の一例を挙げると、遊離PD-L1の測定値が第１の閾値より高いか又は第１の閾値と同じであり、且つ、遊離PD-1の測定値が第２の閾値より高いか又は第２の閾値と同じであり、且つ、遊離CTLA-4の測定値が第３の閾値より高いか又は第３の閾値と同じであるとき、液体試料は、がんに罹患した被検者から採取されたものであると判定してもよい。また、遊離PD-L1の測定値が第１の閾値より低いか、遊離PD-1の測定値が第２の閾値より低いか、又は、遊離CTLA-4の測定値が第３の閾値より低いとき、液体試料は、がんに罹患した被検者から採取されたものではないと判定してもよい。
　さらなる実施形態では、上記の測定により取得した遊離タンパク質マーカーの測定値から多変量解析によって取得される予測値と、予測値に対応する所定の閾値とを比較し、比較結果に基づいて、液体試料が、がんに罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定してもよい。多変量解析は、ロジスティック回帰分析、重回帰分析、判別分析などの公知の解析法から適宜選択できる。それらの中でも、ロジスティック回帰分析が好ましい。
　例えば、遊離PD-L1及び遊離PD-1の測定値を取得している場合、これらの測定値を、多変量解析(例えばロジスティック回帰分析)により作成した判別式に代入して、予測値を取得する。遊離CTLA-4の測定値をさらに取得している場合も、上記と同様にして、取得した全てのマーカーの測定値を、多変量解析(例えばロジスティック回帰分析)により作成した判別式に代入して、予測値を取得する。そして、取得した予測値と所定の閾値とを比較して、比較結果に基づいて判定を行う。判定の一例を挙げると、取得した予測値が所定の閾値より高いか又は所定の閾値と同じであるとき、液体試料は、がんに罹患した被検者から採取されたものであると判定してもよい。また、取得した予測値が所定の閾値より低いとき、液体試料は、がんに罹患した被検者から採取されたものではないと判定してもよい。
　本実施形態では、遊離PD-L1及び遊離PD-1の測定値を取得している場合、予測値は、下記の式(I)の回帰式を用いて算出してもよい。また、遊離PD-L1、遊離PD-1及び遊離CTLA-4の測定値を取得している場合、予測値は、下記の式(II)の回帰式を用いて算出してもよい。これらの回帰式は、多重ロジスティックモデルに基づいて構築された式である。式中、[PD-L1]、[PD-1]及び[CTLA-4]は、それぞれ、遊離PD-L1、遊離PD-1及び遊離CTLA-4の測定値である。b0は切片の係数、b1～b3は各遊離タンパク質マーカーの係数である。係数は、最尤法などの公知の方法により決定できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　上記の各マーカーに対応する所定の閾値及び予測値に対応する閾値は特に限定されず、例えば、種々のがんの患者から採取した液体試料における遊離タンパク質マーカーのデータを蓄積することにより、経験的に設定できる。あるいは、次のようにして所定のカットオフ値を設定してもよい。健常人及び種々のがん患者から液体試料を採取し、遊離タンパク質マーカーの測定値を取得する。そして、取得した測定値から、各マーカーについて健常人とがん患者とを区別可能な値を求め、得られた値を、各マーカーに対応する所定のカットオフ値として設定する。あるいは、健常人及び種々のがん患者から液体試料から取得したマーカーの測定値を、多変量解析により作成した判別式に代入して、健常人の予測値及びがん患者の予測値を取得する。そして、取得した予測値から、健常人とがん患者とを区別可能な値を求め、得られた値を、予測値に対応する所定のカットオフ値として設定する。
　本実施形態の判定方法は、医師などに対して、がんの診断を補助する情報の提供を可能にする。すなわち、本実施形態の判定方法は、がんの判定又は診断を補助する方法と解釈することもできる。
［２．がんの判定のための装置及びコンピュータプログラム］
　本発明の範囲には、上記の本実施形態に係るがんの判定方法を実施するための装置も含まれる。そのような装置は、がんの判定装置(以下、単に「判定装置」ともいう)である。また、本発明の範囲には、上記の本実施形態に係るがんの判定方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムも含まれる。そのようなコンピュータプログラムは、がんの判定のためのコンピュータプログラムである。
　以下に、上記の本実施形態の方法を実施するための装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本実施形態は、この例に示される形態のみに限定されない。図１は、がんの判定装置の概略図である。図１に示された判定装置１０は、免疫測定装置２０と、該免疫測定装置２０と接続されたコンピュータシステム３０とを含む。
　本実施形態において、免疫測定装置の種類は特に限定されず、遊離タンパク質マーカーの測定方法に応じて適宜選択できる。図１に示される例では、免疫測定装置２０は、捕捉用抗体を固定した磁性粒子及び酵素標識された検出用抗体を用いるサンドイッチELISA法により生じる化学発光シグナルを検出可能な市販の自動免疫測定装置である。免疫測定装置２０は、用いた標識物質に基づくシグナルの検出が可能であれば特に限定されず、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。
　捕捉用抗体を固定した磁性粒子を含む試薬、酵素標識された検出用抗体を含む試薬及び被検者から採取した液体試料を免疫測定装置２０にセットすると、該免疫測定装置２０は、各試薬を用いて抗原抗体反応を実行し、遊離タンパク質マーカーと特異的に結合した酵素標識抗体に基づく光学的情報として化学発光シグナルを取得し、得られた光学的情報をコンピュータシステム３０に送信する。
　コンピュータシステム３０は、コンピュータ本体３００と、入力部３０１と、検体情報や判定結果などを表示する表示部３０２とを含む。コンピュータシステム３０は、免疫測定装置２０から光学的情報を受信する。そして、コンピュータシステム３０のプロセッサは、光学的情報に基づいて、ハードディスク３１３にインストールされた、がんの判定のためのコンピュータプログラムを実行する。なお、コンピュータシステム３０は、図１に示されるように、免疫測定装置２０とは別個の機器であってもよいし、免疫測定装置２０を内包する機器であってもよい。後者の場合、コンピュータシステム３０は、それ自体で判定装置１０となってもよい。市販の自動免疫測定装置に、上記のがんの判定のためのコンピュータプログラムを搭載してもよい。
　図２を参照して、コンピュータ本体３００は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３１０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３１１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３１２と、ハードディスク３１３と、入出力インターフェイス３１４と、読取装置３１５と、通信インターフェイス３１６と、画像出力インターフェイス３１７とを備えている。ＣＰＵ３１０、ＲＯＭ３１１、ＲＡＭ３１２、ハードディスク３１３、入出力インターフェイス３１４、読取装置３１５、通信インターフェイス３１６及び画像出力インターフェイス３１７は、バス３１８によってデータ通信可能に接続されている。また、免疫測定装置２０は、通信インターフェイス３１６により、コンピュータシステム３０と通信可能に接続されている。
　ＣＰＵ３１０は、ＲＯＭ３１１又はハードディスク３１３に記憶されているプログラム及びＲＡＭ３１２にロードされたプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３１０は、遊離タンパク質マーカーの測定値を算出し、ＲＯＭ３１１又はハードディスク３１３に記憶されている各マーカーに対応する所定の閾値を読み出し、液体試料ががんに罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定する。あるいは、ＣＰＵ３１０は、ＲＯＭ３１１又はハードディスク３１３に記憶されている多変量解析の判別式を読み出して、遊離タンパク質マーカーの測定値から予測値を算出してもよい。さらに、ＣＰＵ３１０は、ＲＯＭ３１１又はハードディスク３１３に記憶されている予測値に対応する所定の閾値を読み出し、液体試料ががんに罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定してもよい。ＣＰＵ３１０は、判定結果を出力して表示部３０２に表示させる。
　ＲＯＭ３１１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３１１には、前述のようにＣＰＵ３１０によって実行されるコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータが記録されている。ＲＯＭ３１１には、所定の閾値、多変量解析の判別式など、後述の判定フローに用いられるデータが記録されていてもよい。
　ＲＡＭ３１２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３１２は、ＲＯＭ３１１及びハードディスク３１３に記録されているプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３１２はまた、これらのプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３１０の作業領域として利用される。
　ハードディスク３１３は、ＣＰＵ３１０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(上記のがんの判定のためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。ハードディスク３１３には、所定の閾値、多変量解析の判別式など、後述の判定フローに用いられるデータが記録されていてもよい。
　読取装置３１５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ－ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ－ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読取装置３１５は、可搬型記録媒体４０に記録されたプログラム又はデータを読み取ることができる。
　入出力インターフェイス３１４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ－２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３１４には、キーボード、マウスなどの入力部３０１が接続されている。操作者は、該入力部３０１により、コンピュータ本体３００に各種の指令を入力することが可能である。
　通信インターフェイス３１６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータ本体３００は、通信インターフェイス３１６により、プリンタなどへの印刷データの送信も可能である。
　画像出力インターフェイス３１７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３０２に接続されている。これにより、表示部３０２は、ＣＰＵ３１０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力できる。表示部３０２は、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
　図３Ａを参照して、判定装置１０により実行される、がんの判定フローについて説明する。ここでは、捕捉用抗体を固定した磁性粒子及び酵素標識された検出用抗体を用いるサンドイッチELISA法により生じる化学発光シグナルから、遊離PD-L1及び遊離PD-1の測定値を取得し、取得した測定値を用いて判定を行なう場合を例として説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されない。
　ステップＳ１０１において、ＣＰＵ３１０は、免疫測定装置２０から光学的情報(化学発光シグナル)を取得し、取得した光学的情報から遊離PD-L1及び遊離PD-1の測定値を算出してハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ１０２において、ＣＰＵ３１０は、算出した遊離PD-L1の測定値と、ハードディスク３１３に記憶された第１の閾値とを比較する。遊離PD-L1の測定値が第１の閾値より高いか又は第１の閾値と同じであるとき、処理はステップＳ１０３に進行する。ステップＳ１０３において、ＣＰＵ３１０は、算出した遊離PD-1の測定値と、ハードディスク３１３に記憶された第２の閾値とを比較する。遊離PD-1の測定値が第２の閾値より高いか又は第２の閾値と同じであるとき、処理はステップＳ１０４に進行する。ステップＳ１０４において、ＣＰＵ３１０は、液体試料ががんに罹患した被検者から採取したものであるとの判定結果をハードディスク３１３に記憶する。
　一方、ステップＳ１０２において、遊離PD-L1の測定値が第１の閾値より低いとき、処理はステップＳ１０５に進行する。ステップ１０３において、遊離PD-1の測定値が第２の閾値より低いとき、処理はステップＳ１０５に進行する。ステップＳ１０５において、ＣＰＵ３１０は、液体試料ががんに罹患した被検者から採取したものではないとの判定結果をハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ１０６において、ＣＰＵ３１０は、判定結果を出力し、表示部３０２に表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、被検者のがんの診断を補助する情報を医師などに提供することができる。なお、この例において、ステップＳ１０２及びステップＳ１０３の処理は順序を入れ替えることができる。
　図３Ｂを参照して、判定装置１０により実行される、がんの判定フローについて説明する。ここでは、遊離PD-L1及び遊離PD-1の測定値に加えて、さらに遊離CTLA-4の測定値を取得し、取得した測定値を用いて判定を行なう場合を例として説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されない。
　ステップＳ２０１において、ＣＰＵ３１０は、免疫測定装置２０から光学的情報(化学発光シグナル)を取得し、取得した光学的情報から遊離PD-L1、遊離PD-1及び遊離CTLA-4の測定値を算出してハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ２０２において、ＣＰＵ３１０は、算出した遊離PD-L1の測定値と、ハードディスク３１３に記憶された第１の閾値とを比較する。遊離PD-L1の測定値が第１の閾値より高いか又は第１の閾値と同じであるとき、処理はステップＳ２０３に進行する。ステップＳ２０３において、ＣＰＵ３１０は、算出した遊離PD-1の測定値と、ハードディスク３１３に記憶された第２の閾値とを比較する。遊離PD-1の測定値が第２の閾値より高いか又は第２の閾値と同じであるとき、処理はステップＳ２０４に進行する。ステップＳ２０４において、ＣＰＵ３１０は、算出した遊離CTLA-4の測定値と、ハードディスク３１３に記憶された第３の閾値とを比較する。遊離CTLA-4の測定値が第３の閾値より高いか又は第３の閾値と同じであるとき、処理はステップＳ２０５に進行する。ステップＳ２０５において、ＣＰＵ３１０は、液体試料ががんに罹患した被検者から採取したものであるとの判定結果をハードディスク３１３に記憶する。
　一方、ステップＳ２０２において、遊離PD-L1の測定値が第１の閾値より低いとき、処理はステップＳ２０６に進行する。ステップ２０３において、遊離PD-1の測定値が第２の閾値より低いとき、処理はステップＳ２０６に進行する。ステップ２０４において、遊離CTLA-4の測定値が第３の閾値より低いとき、処理はステップＳ２０６に進行する。ステップＳ２０６において、ＣＰＵ３１０は、液体試料ががんに罹患した被検者から採取したものではないとの判定結果をハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ２０７において、ＣＰＵ３１０は、判定結果を出力し、表示部３０２に表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、被検者のがんの診断を補助する情報を医師などに提供することができる。なお、この例において、ステップＳ２０２、ステップＳ２０３及びステップＳ２０４の処理は順序を入れ替えることができる。
　図４を参照して、判定装置１０により実行される、がんの判定フローについて説明する。ここでは、取得した遊離PD-L1及び遊離PD-1の測定値から、多重ロジスティックモデルにより予測値を取得し、得られた予測値を用いて判定を行なう場合を例として説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されない。
　ステップＳ３０１において、ＣＰＵ３１０は、免疫測定装置２０から光学的情報(化学発光シグナル)を取得し、取得した光学的情報から遊離PD-L1及び遊離PD-1の測定値を算出してハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ３０２において、ＣＰＵ３１０は、遊離PD-L1及び遊離PD-1の測定値から、ＲＯＭ３１１又はハードディスク３１３に記憶した判別式に従って、多重ロジスティックモデルに基づく予測値Ｐを算出する。ステップＳ３０３において、ＣＰＵ３１０は、算出した予測値Ｐと、ハードディスク３１３に記憶された予測値に対応する所定の閾値とを比較する。予測値Ｐが所定の閾値より高いか又は所定の閾値と同じであるとき、処理はステップＳ３０４に進行し、ＣＰＵ３１０は、液体試料ががんに罹患した被検者から採取したものであるとの判定結果をハードディスク３１３に記憶する。一方、ステップＳ３０３において、予測値Ｐが所定の閾値より低いとき、処理はステップＳ３０５に進行し、ＣＰＵ３１０は、液体試料ががんに罹患した被検者から採取したものではないとの判定結果をハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ３０６において、ＣＰＵ３１０は、判定結果を出力し、表示部３０２に表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、被検者のがんの診断を補助する情報を医師などに提供することができる。
　この例において、遊離CTLA-4の測定値をさらに取得している場合は、ステップＳ３０２において、ＣＰＵ３１０は、遊離PD-L1、遊離PD-1及び遊離CTLA-4の測定値から予測値Ｐを算出してもよい。
　以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
　実施例１では、健常人由来の液体試料とがん患者由来の液体試料とを、遊離タンパク質マーカーの濃度値に基づいて判別した。
１．液体試料
　液体試料として、健常人及びがん患者から得たヒト血漿(EDTA含有)を用いた。健常人の血漿(50検体)はBioreclamationIVT社より入手し、がん患者の血漿(60検体)はProteogenentec社及びBioreclamationIVT社より入手した。がん患者の内訳は、肺がん患者(21検体)、腎臓がん患者(18検体)、メラノーマ患者(15検体)及び卵巣がん患者(６検体)である。
２．遊離タンパク質マーカーの測定
(2.1) 試薬の調製
(2.1.1) 第１試薬(ビオチン標識抗体溶液)
・PD-L1捕捉用第１試薬
　捕捉用抗体として、抗PD-L1抗体(クローンNo.27A2)を用いた。この抗体を、Biotin Labeling Kit-SH (Catalog No. LK10、同人化学社製)を用いてビオチンで標識した。具体的な操作は、該キットに添付のマニュアルに従って行った。得られたビオチン標識抗PD-L1抗体を100 mM MES(pH 6.5)に添加して、PD-L1捕捉用第１試薬(抗体濃度５μg/ml)を調製した。
・PD-1捕捉用第１試薬
　捕捉用抗体として、抗PD-1抗体(クローンNo.MIH4)を用いた。この抗体を、上記と同様にしてビオチンで標識した。得られたビオチン標識抗PD-1抗体を100 mM HEPES(pH ７.5)に添加して、PD-1捕捉用第１試薬(抗体濃度５μg/ml)を調製した。
・CTLA-4捕捉用第１試薬
　捕捉用抗体として、抗CTLA-4抗体(クローンNo.BNI3)を用いた。この抗体を、上記と同様にしてビオチンで標識した。得られたビオチン標識抗CTLA-4抗体を100 mM MES(pH 6.5)に添加して、CTLA-4捕捉用第１試薬(抗体濃度５μg/ml)を調製した。
(2.1.2) 第２試薬(ストレプトアビジン結合粒子含有液)
　表面にストレプトアビジンが固定された磁性粒子(平均粒子径２μm。磁性粒子１gあたりのストレプトアビジンの量は2.9～3.5 mg。以下、「STA結合磁性粒子」ともいう)を、10 mM HEPES緩衝液(pH 7.5)で３回洗浄した。洗浄後のSTA結合磁性粒子を、ストレプトアビジン濃度が18～22μg/ml(STA結合磁性粒子の濃度が0.48～0.52 mg/ml)となるように、10 mM HEPES(pH 7.5)に添加し、STA結合粒子含有液を得た。
(2.1.3) 第３試薬(アルカリホスファターゼ標識抗体溶液)
・PD-L1検出用第３試薬
　検出用抗体として、抗PD-L1抗体(クローンNo. 9L814)を用いた。この抗体を、Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH (Catalog No. LK13、同人化学社製)を用いてアルカリホスファターゼで標識した。具体的な操作は、該キットに添付のマニュアルに従って行った。得られたアルカリホスファターゼ標識抗PD-L1抗体をゲルろ過にて精製した。このアルカリホスファターゼ標識抗PD-L1抗体を、100 mM MES(pH 6.5)に75倍希釈となるように添加してPD-L1検出用第３試薬を調製した。
・PD-1検出用第３試薬
　検出用抗体として、抗PD-1抗体(クローンNo.PD1.3.1.3)を用いた。この抗体を、上記と同様にしてアルカリホスファターゼで標識し、精製した。得られたアルカリホスファターゼ標識抗PD-1抗体を、100 mM HEPES(pH 7.5)に75倍希釈となるように添加して、PD-1検出用第３試薬を調製した。
・CTLA-4検出用第３試薬
　検出用抗体として、抗CTLA-4抗体(クローンNo.14D3)を用いた。この抗体を、上記と同様にしてアルカリホスファターゼで標識し、精製した。得られたアルカリホスファターゼ標識抗CTLA-4抗体を、100 mM MES(pH 6.5)に75倍希釈となるように添加して、CTLA-4検出用第３試薬を調製した。
(2.1.4) 第４試薬(測定用緩衝液)
　HISCL R4試薬(シスメックス株式会社製)を第４試薬として使用した。
(2.1.5) 第５試薬(基質溶液)
　アルカリホスファターゼの化学発光基質としてCDP-Star(登録商標)(アプライドバイオシステムズ社)を含むHISCL R5試薬(シスメックス株式会社製)を、第５試薬として使用した。
(2.2) 測定
　各遊離タンパク質マーカーの測定は、上記の第１～第５試薬を用いて全自動免疫測定装置HISCL-800(シスメックス株式会社製)により行った。なお、この測定は、磁性粒子上でのサンドイッチELISAをベースとしている。具体的には、第１試薬(50μL)に血漿(20μL)を加えて混合した後、第２試薬(30μL)を加えて混合した。得られた混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除き、HISCL洗浄液(300μL)を加えて磁性粒子を洗浄した。上清を除き、磁性粒子に第３試薬(80μL)を添加して混合した。得られた混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除き、HISCL洗浄液(300μL)を加えて磁性粒子を洗浄した。上清を除き、磁性粒子に第４試薬(50μL)及び第５試薬(100μL)を添加し、よく混合して、化学発光強度を測定した。反応時間は全工程を通して17分間であった。得られた化学発光強度を検量線に当てはめて、各遊離タンパク質マーカーの濃度を算出した。
３．判定及び結果
　健常人(n=50)及びがん患者(n=60)のそれぞれに由来する液体試料中のマーカーの濃度値から、多重ロジスティックモデルに基づいて、各検体の予測値(Ｐ)を算出した。具体的には、予測値を下記の回帰式から算出した。この多重ロジスティック回帰分析はStatFlex(アーテック社製)を用いて行った。
回帰式：　Ｐ＝１／(１＋exp(－ｘ))
　式中、「ｘ」は、判定に用いたマーカーによって異なる。表１に、判定に用いたマーカーに対応した「ｘ」を示す。表中、[PD-L1]、[PD-1]及び[CTLA-4]は、それぞれ、液体試料における遊離PD-L1、遊離PD-1及び遊離CTLA-4の濃度の値である。「ｘ」における各係数は、健常人とがん患者をあわせた全検体(n=110)のデータを用いて算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　算出した各試料の予測値に基づいてROC曲線(Receiver Operatorating Characteristic curve)を作成した。判定に用いたマーカーに対応したROC曲線を図５～９に示す。また、ROC曲線から所定の閾値を決定した。そして、予測値が所定の閾値より高いか又は所定の閾値と同じ場合、液体試料はがん患者由来の試料であると判定し、予測値が所定の閾値より低い場合、液体試料は健常人由来の試料と判定した。表２に、各ROC曲線の曲線下面積(AUC)、並びに上記の判定による感度が約90％のときの特異度を示した。なお、ROC曲線の作成、閾値の算出、並びに感度及び特異度の算出は、StatFlex(アーテック社製)を用いて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表２に示されるように、AUCは、遊離PD-L1、遊離PD-1及び遊離CTLA-4をそれぞれ単独で判定に用いた場合よりも、遊離PD-L1及び遊離PD-1の組み合わせ、又は遊離PD-L1、遊離PD-1及び遊離CTLA-4の組み合わせを用いた方が高かった。また、判定による感度が約90％のときの特異度は、遊離PD-L1及び遊離PD-1をそれぞれ単独で判定に用いた場合よりも、遊離PD-L1及び遊離PD-1の組み合わせを用いた方が高かった。この特異度は、遊離PD-L1及び遊離PD-1に遊離CTLA-4をさらに組み合わせることにより、より高くなった。よって、液体試料中の遊離PD-L1及び遊離PD-1の濃度値により、該試料ががん患者由来の試料であるか否かを高い精度で判別可能であることが示された。また、遊離CTLA-4の濃度値をさらに判定に用いることで、判定精度がより向上することが示された。
　１０　　　判定装置
　２０　　　免疫測定装置
　３０　　　コンピュータシステム
　４０　　　記録媒体
　３００　　コンピュータ本体
　３０１　　入力部
　３０２　　表示部
　３１０　　ＣＰＵ
　３１１　　ＲＯＭ
　３１２　　ＲＡＭ
　３１３　　ハードディスク
　３１４　　入出力インターフェイス
　３１５　　読取装置
　３１６　　通信インターフェイス
　３１７　　画像出力インターフェイス
　３１８　　バス

Claims (12)

  1. 　被検者から採取した液体試料中の遊離タンパク質マーカーとして遊離PD-L1 (Programmed cell death-ligand 1)及び遊離PD-1 (Programmed cell death-1)を測定する工程と、
    　測定結果に基づいて、前記液体試料が、がんを罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定する工程と
    を含む、がんの判定方法。
  2. 　前記測定工程において、前記液体試料中の遊離タンパク質マーカーとして遊離CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte antigen-4)をさらに測定し、
    　前記判定工程において、前記遊離PD-L1、前記遊離PD-1及び前記遊離CTLA-4の測定結果に基づいて、前記液体試料が、がんを罹患した被検者から採取されたものであるか否かが判定される、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記がんが、固形がんである請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記がんが、肺がん、腎臓がん、卵巣がん又はメラノーマである請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記判定工程において、前記測定工程で取得した前記遊離タンパク質マーカーの測定値と、各マーカーに対応する所定の閾値とを比較し、比較結果に基づいて、前記液体試料が、がんに罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定する請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記判定工程において、前記測定工程で取得した前記遊離タンパク質マーカーの測定値から多変量解析によって取得される予測値と、予測値に対応する所定の閾値とを比較し、比較結果に基づいて、前記液体試料が、がんに罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定する請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記液体試料が、血液試料である請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記多変量解析が、ロジスティック回帰分析である請求項６に記載の方法。
  9. 　プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
    前記メモリには、下記のステップ：
    　被検者から採取した液体試料中の遊離タンパク質マーカーとして遊離PD-L1 (Programmed cell death-ligand 1)及び遊離PD-1 (Programmed cell death-1)の測定値を取得するステップと、
    　前記マーカーの測定値に基づいて、前記液体試料が、がんを罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定するステップと
    を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
    がんの判定装置。
  10. 　前記測定値取得ステップにおいて、前記液体試料中の遊離タンパク質マーカーとして遊離CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte antigen-4)の測定値をさらに取得する請求項９に記載の装置。
  11. 　コンピュータが読み取り可能な媒体に記録されているコンピュータプログラムであって、
    前記コンピュータプログラムが、下記のステップ：
    　被検者から採取した液体試料中の遊離タンパク質マーカーとして遊離PD-L1 (Programmed cell death-ligand 1)及び遊離PD-1 (Programmed cell death-1)の測定値を取得するステップと、
    　前記マーカーの測定値に基づいて、前記液体試料が、がんを罹患した被検者から採取されたものであるか否かを判定するステップと
    を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムである、
    がんの判定のためのコンピュータプログラム。
  12. 　前記測定値取得ステップにおいて、前記液体試料中の遊離タンパク質マーカーとして遊離CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte antigen-4)の測定値をさらに取得する請求項１１に記載のコンピュータプログラム。
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