WO2017003086A1 - 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 억제 및 예방용 조성물 - Google Patents

콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 억제 및 예방용 조성물 Download PDF

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강영규
김수현
박찬웅
전희영
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    • A61K2800/10—General cosmetic use

Definitions

  • the present invention relates to a composition for inhibiting and preventing muscle diseases containing soybean leaf extract as an active ingredient, and may be usefully used in the field of preparing food, pharmaceutical or cosmetic compositions related to muscle diseases.
  • sarcopenia of pathological aspects directly causes muscle strength to increase the risk of falls or fractures, as well as the development of myopathy and various physical functions. It increases the risk of death overall by causing reductions and disorders and an increase of 8.2 times more in risk for diabetes and cardiovascular disease.
  • the suppression and prevention of muscle loss has been considered as one of the important challenges directly related to the improvement and prevention of various organic diseases, as well as the overall health problems.
  • the aging population is rapidly progressing due to a decrease in fertility rate and a prolonged life expectancy.
  • the 2010 Statistics Office the elderly population over 65 years old is 15.7% in 2020, compared with 9.1% in 2005. It is projected to reach 24.1% in 2030, which is the fastest increase and decrease rate among OECD countries, which is also an urgent task in terms of social welfare.
  • BCAA branch-chain amino acid
  • Atrogin1 and Murf1 are ubiquitin ligases that are specifically expressed in muscle cells, resulting in muscle loss caused by ubiquitination and proteosome-dependent degradation of muscle proteins due to their increased expression. It is known.
  • the present inventors have found that in the process of finding a solution to solve muscle loss from a new perspective, using a composition containing soybean leaf extract as an active ingredient in relation to the above mechanism has a significant effect on muscle loss inhibition.
  • the present invention has been completed.
  • an object of the present invention is to provide a composition for inhibiting and preventing muscle diseases containing soybean leaf extract as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a substance capable of suppressing and preventing muscle loss.
  • the present invention provides a composition for inhibiting and preventing muscle diseases containing soybean leaf extract as an active ingredient.
  • the soybean leaf extract is characterized in that the extract of the soybean leaves of R6 to R8 phase of the soybean growth stage.
  • the soybean leaf extract is characterized in that at least one selected from the raw (bean) extract, its fraction, its dried, its dried fraction, its fermentation and its concentrate.
  • composition may be utilized in the form of a food, pharmaceutical or cosmetic composition.
  • the present invention through the above problem solving means provides a composition that can inhibit and prevent muscle diseases.
  • soybean leaf extract as an active ingredient, it provides a substance that can directly or indirectly improve or prevent various muscle diseases.
  • Soybean leaf extract is an active ingredient provided as a natural component is low in human side effects and easy to obtain, it is economical to manufacture because it fully utilizes soybean leaves that were not well utilized in the conventional industry.
  • Figure 2 is a graph showing the relative cellular activity (%) of each experimental group, control group and comparison group compared to normal myocytes (control).
  • Figure 3 is a graph showing the expression (%) of the relative Atrogin1 gene (mRNA) of each experimental group, control group and comparison group compared to normal myocytes (control).
  • Figure 4 is a graph showing the expression (%) of Murf1 gene (mRNA) relative to each of the experimental group, the control group and the control group compared to the normal myocytes (control).
  • the present invention provides a composition for inhibiting and preventing myopathy containing soybean leaf extract as an active ingredient.
  • muscle disease of the present invention, at least to be understood as including all exceptions if the muscle disease directly or indirectly related to the expression of Atrogin1 or Murf1 protein to be described later.
  • muscle disease directly or indirectly related to the expression of Atrogin1 or Murf1 protein to be described later.
  • all muscle diseases that are associated with, directly or indirectly associated with myopathy, muscle loss and muscular dystrophy.
  • the 'bean' is not limited in kind, for example, Rhynchosia Nolubilis , Glycine max (L.) Merr . , Fence beans ( Vicia) faba ), kidney beans ( Phaseolus vulgaris ), stained kidney beans ( Phaseolus vulgaris L. ), red beans ( Vigna angularis ), soybeans ( Phaseolus angularis WF . WIGHT. ) Peas ( Pisum sativum L.) and soybean ( Glycine max MERR ) may be any one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the form of soybeans can be any form suitable for extracting the active ingredient.
  • the object of extraction in the present invention is limited to the 'bean leaf', which is different from the component material of the soybean and soybean leaves as shown in Example 1 and FIG. 1 to be described later, inhibiting and preventing muscle diseases in soybean leaf extract compared to soybean extract This is because the effect of is significant.
  • the present invention can be actively utilized soybean leaves that have been less conventionally utilized industrially, economical and easy to manufacture.
  • Soybean leaf extract having a better muscle disease inhibitory and preventive effect in the present invention soybean leaf extract of the R6 to R8 stage of the entire growth stage of the following beans.
  • VE period 1-2 weeks after planting seeds, with cotyledons from soil
  • VC season Cotyledon blooms wide, a word grows over it, and leaves are formed.
  • Period V1 A word is formed from the first outer leaf, resulting in three leaves.
  • V2 phase One more word from V1 Stage, resulting in 3 leaves
  • V3 phase Three more leaves are created in the V2 Stage.
  • V4 season 3 more leaves are created in V3 Stage.
  • soybean leaves of R7 to R8 phase Preferably soybean leaves of R7 to R8 phase, more preferably soybean leaf extract of R7 phase.
  • the soybean leaves of the R7 to R8 period is referred to as 'autumn soybean leaf' as the soybean leaf at the time when the leaf color changes to yellow.
  • extract refers to an ingredient material extracted from a natural product, regardless of the extraction method, extraction solvent, extracted component or form of the extract.
  • extract it is a broad concept that includes all components obtained by extracting a component dissolved in a solvent from a natural product using water or an organic solvent, a specific component of a natural product, and a product obtained by extracting only a specific component such as an oil. It also includes all materials obtained through.
  • the extract of the present invention may be in the form of any one or more selected from the group consisting of raw soybean leaf extract, further processed or fermented or enzymatically treated fraction, dried product, dried fraction, fermented product and concentrate.
  • the method for obtaining the soybean leaf extract of the present invention is not limited to any specific method as long as it is generally used in the industry, and is usually washed, dried, and then immersed by extracting and immersing the soybean leaf powder into water or an organic solvent.
  • Soybean leaf extract can be obtained by separating the residue and the filtrate through filtration and centrifugation, and concentrating the separated filtrate under reduced pressure.
  • the solvent for extraction one or more of water, ethanol, methanol, butanol, ether, ethyl acetate, chloroform, or a mixed solvent of these organic solvents and water may be selected, and water or 30 to 70% in consideration of the safety of the raw material. Preference is given to using concentrations of ethanol. It is effective to use a mixture of each filtrate obtained through repeated extraction. For example, after obtaining a primary extract from ethanol as described above, ethyl acetate was added to the residue to obtain a secondary extract, and the filtered filtrate of the extracts was mixed by repeating 1 to 2 additional extractions. It is.
  • the extract After obtaining the extract can be obtained by cooling, heating and filtration at room temperature in a conventional manner known in the art to obtain a liquid, or may be further subjected to the process of evaporating, spray drying or freeze drying the solvent.
  • concentration of the extract there is no particular limitation on the concentration of the extract, but with reference to Examples 2 or Experimental Examples 1 to 2 to be described later, it usually shows sufficient effects at around 100 ppm, and specifically, depending on the symptoms and extent of the disease and the form of the composition provided. Can be used as a concentration.
  • Soybean leaf extract of the present invention inhibits the expression or activity of ubiquitin ligase of skeletal muscle to inhibit and prevent muscle diseases.
  • the ubiquitin ligase in the body is an enzyme that induces the degradation of the protein by attaching ubiquitin as a kind of death signal on the surface of the protein to be destroyed.
  • Atrogin1 and Murf1 are overexpressed mainly in patients with myopathy accompanied by pathological muscle loss or atrophy, and induce sarcopenia. Is one of the direct causes of molecular biology. When Atrogin1 and Murf1 are overexpressed, the degradation pathway is excessively activated as compared with the synthesis of myocytes, which results in the loss of normal myocytes.
  • the soybean leaf extract of the present invention can prevent muscle loss by inhibiting overexpression of the Atrogin1 and Murf1 genes, and can also improve and prevent other muscle diseases organically related thereto.
  • the composition of the present invention can be actively used for the senior layer.
  • composition of the present invention may be provided in the formulation of any one of food, pharmaceutical and cosmetic compositions.
  • the food composition is mainly a composition of a health functional food, and includes the soybean leaf extract as an active ingredient, mixed with a conventional food composition, or added as it is, or may be used together with another food or one component of the food.
  • the type of food is not particularly limited and may be utilized in all forms that can be commonly accepted, including beverages, teas, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes.
  • the pharmaceutical composition may be prepared by further comprising at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the soybean leaf extract and other active ingredients.
  • at least one pharmaceutically acceptable carrier for example, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and any one or more of these components may be mixed and used as necessary, and other conventional agents such as antioxidants, buffers, bacteriostatic agents, etc. may be used. Additives may be added.
  • the pharmaceutical composition may be formulated into an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, or the like, orally for administration by additionally adding a diluent, a dispersant, a surfactant, a binder and a lubricant.
  • an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, or the like, orally for administration by additionally adding a diluent, a dispersant, a surfactant, a binder and a lubricant.
  • the oral dosage form may be a tablet, a pill, a granule, a fine granule, a powder, a powder, a soft capsule, a hard capsule, an emulsion. (Iii), a syrup agent and a drink agent.
  • the cosmetic composition may further include all the components included in the bean leaf extract as an active ingredient and included in other functional additives and a general cosmetic composition.
  • the functional additive may be, for example, any one or more of water-soluble vitamins, oil-soluble vitamins, polymer peptides, polymer polysaccharides, sphingolipids, and seaweed extracts. Also, if necessary, fats and oils, moisturizers, emollients, surfactants, organic and inorganic pigments, organic powders, UV absorbers, preservatives, fungicides, antioxidants, plant extracts, pH adjusters, alcohols, pigments, flavors, blood circulation accelerators, A cooling agent, a restriction
  • the formulation of the cosmetic composition can be appropriately selected according to the application characteristics, such as skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisturizing lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, moisturizing cream, hand cream, foundation , Powder, essence, nutrition essence, pack, soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion and body cleanser, spray and the like can be provided.
  • application characteristics such as skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisturizing lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, moisturizing cream, hand cream, foundation , Powder, essence, nutrition essence, pack, soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion and body cleanser, spray and the like can be provided.
  • FIG. 1 HPLC component analysis results are shown in FIG. 1.
  • (a) is a soybean leaf extract and (b) is a soybean extract.
  • soybean leaf extract and soybean extract shows a different separation pattern. As the peaks appear at different points in time, the components of the soybean extract and the soybean extract are not identical to each other.
  • the soybean leaves collected at each growth period (VC / V2 / V4 / R2 / R4 / R6 / R7, 7 total) were washed with purified water, dried and then granulated. 100 g of the bean leaf powder was added to 1 liter of an aqueous 70% by weight ethanol solution, and extracted at room temperature (25) for 12 hours, followed by filtration with a 300 mesh filter cloth.
  • the extract was added to a 3-liter separatory funnel, and 1 liter of ethyl acetate was added. After shaking, the mixture was shaken and completely separated into two layers to obtain an upper layer (ethyl acetate layer). The lower layer is again extracted twice with a separatory funnel. Each separated upper layer was combined and concentrated under reduced pressure to 50 using a distillation apparatus with a cooling condenser and dried. Thus, 10.3 g of bean leaf extract of each step was obtained.
  • Dexamethasone is a type of glucocorticoid that increases the expression of Atrogin1 and Murf1 in vitro and in vivo to promote protein degradation, leading to a decrease in skeletal muscle and death of muscle cells. Induces a decrease in cell activity. Therefore, an experimental model for treating dexamethasone in muscle cells is a useful evaluation model for evaluating the function of myotropenia, and is widely used.
  • C2C12 progenitor cells of rats
  • Experimental Example 1 was purchased from the American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) and used for culture. The culture of the cells was performed using 10% FBS, 100units / mL Penicillin, and 100mg / mL streptomycin. A containing DMEM medium was used. The specific experimental method is as follows.
  • C2C12 is dispensed into 12-well plates and cultured until the cells are confluent to about 80 to 90% of the plates. Then, 2% horse serum (Horse serum) and DMEM medium was exchanged to induce differentiation of cells. After the culture was further cultured for 5 to 7 days after the medium exchange, the dexamethasone was treated to a final concentration of 1 uM, and at the same time the VC / V2 / V4 / R2 / R4 / obtained in Example 2 above Soybean leaf extract of the R6 / R7 phase was treated to a final concentration of 100 ppm.
  • dexibuprofen As a control, cells treated with no treatment other than dexamethasone were used.In comparison, the final concentration of dexibuprofen (dexibuprofen), which is known to be effective for muscle pain by inhibiting inflammation, was used instead of soybean leaf extract. Treated cells were used.
  • FIG. 2 is a graph showing the relative cell activity of the experimental group, the control group (Dex) and the comparative group (dexibuprofen) compared to the normal myocytes (control).
  • Table 1 above describes the changes in cell activity of the experimental group and the comparative group compared to the control group.
  • the experimental group treated with the soybean leaf extract of R4 to R7 step significantly increased the activity of myocytes to 6.2 to 18.1% compared to the control group, in particular the soybean leaf extract of R7 step to restore the cell activity very effectively Appeared.
  • soybean leaf extract of the present invention has muscle loss suppression and prevention effects.
  • cDNA was synthesized using the extracted and quantified 1 ⁇ g / ⁇ L RNA and reverse transcription system (Promega). Expression patterns of the genes were measured using primers and probes (Applied biosystems) designed for each gene of synthesized cDNA and Atrogin1, Murf1, and GAPDH. Polymerase chain reaction (PCR) reaction and analysis were performed using the Rotor-Gene 3000 system (Corbett Research, Sydney, Australia). In order to increase the reliability, each sample was repeatedly measured three times to derive the average value.
  • 3 and 4 are graphs showing the relative expression levels of genes (mRNA) of Atrogin1 and Murf1 in the experimental group, the control group (Dex) and the comparative group (dexibuprofen) compared to the normal myocytes (control).
  • Tables 2 and 3 describe changes in Atrogin1 and Murf1 gene (mRNA) expression in the experimental and comparative groups compared to the control group.
  • the control group treated with dexamethasone compared to normal myocytes showed that Atrogin1 and Murf1 genes were overexpressed.
  • the experimental group further treated with the soybean leaf extract showed a decrease in the Atrogin1 and Murf1 gene expression levels.
  • composition containing the soybean leaf extract of the present invention as an active ingredient has excellent efficacy in inhibiting and preventing muscle diseases, and is expected to have high industrial applicability in various forms such as food, pharmaceutical or cosmetic compositions. do.

Abstract

본 발명은 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 억제 및 예방용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 콩의 생육 단계 중 R6 내지 R8 단계의 콩잎 추출물을 포함함으로써 근세포에 특이적으로 발현하는 Atrogin1 및 Murf1의 과발현을 억제하고 근세포의 세포활성을 회복함으로써 근손실을 억제하고 예방하는 효과가 있다.

Description

콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 억제 및 예방용 조성물
본 출원은 2015년 6월 30일자 한국 특허 출원 제10-2015-0092701호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함한다.
본 발명은 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 억제 및 예방용 조성물에 관한 것으로, 근질환에 관한 식품, 약학 또는 화장료 조성물의 제조 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.
인간이 태어나서 30세까지는 근육이 성장하며 강해지지만 30세 이후부터는 근육의 밀도와 기능이 점차적으로 약화되기 시작한다. 특히 꾸준한 신체적 운동을 하지 않을 경우 30세 이후로는 10년마다 3 내지 5% 정도의 근육량이 감소하게 되며, 운동을 지속한다 하더라도 어느 정도의 근육 손실을 경험하게 된다. 이러한 대부분의 근손실은 주로 노화에 동반하여 일어나는 현상이지만, 그 세부적인 유발 기전에 있어서는 다양한 양상을 가진다.
통상의 단순 노화로 인한 근손실과는 달리 병리학적 양상의 근감소증 (sarcopenia)은 직접적으로 근력 저하를 유발하여 낙상이나 골절의 위험을 높이는 것은 물론, 근질환(myopathy)의 발병, 각종 신체기능의 감소 및 장애를 일으키고, 당뇨병 및 심혈관계 질환에 대한 위험성 또한 8.2배 이상 증가시키는 등 전체적으로 사망의 위험성을 높인다.
따라서 근손실의 억제 및 예방은, 기타 유기적으로 연관되는 다양한 근질환의 개선과 예방은 물론, 전반적인 건강의 문제로 직결되는 중요한 해결 과제 중 하나로 생각되어 오고 있다. 또한 현재 우리나라는 출산율의 감소와 평균 수명의 연장으로 인구의 고령화가 급격하게 진행되고 있으며, 특히 2010년 통계청의 자료에 의하면 65세 이상의 노인 인구가 2005년의 9.1%에 대비 2020년에는 15.7%, 2030년에는 24.1%에 이를 것으로 전망하고 있고 있는 바, 이는 OECD 국가 중 가장 빠른 증감률에 해당하여 사회 복지적 관점에서 역시 시급한 해결 과제로 분류된다.
이러한 흐름에 따라 근손실을 억제하고 예방하기 위한 많은 연구들이 진행 중에 있다. 그 중 대표적인 것은 근육을 구성하는 필수 아미노산 중 하나인 류신(leucine)을 포함하는 BCAA(branched-chain amino acid)에 관한 연구이다. 그러나 상기 연구와 관련하여 류신은 노인의 골격 근육량 변화에는 큰 영향을 주지 못한다는 보고가 있어 이것이 근감소증의 근본적인 해결책이 되기에는 어려움이 많을 것으로 예상된다.
한편, 최근에는 근감소증과 관련하여 Atrogin1 및 Murf1의 특이적인 기능이 밝혀져 주목받고 있다. Atrogin1 및 Murf1은 근세포에 특이적으로 발현하는 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)로, 이것의 발현 증가로 인하여 근육 단백질들이 유비퀴틴화(ubiquitination)되고 프로테아좀(proteosome) 의존적으로 분해됨으로써 근손실이 유발되는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 새로운 관점에서 근손실을 해결할 수 있는 방안들을 모색하는 과정에서, 상기 메커니즘과 관련하여 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 활용하면 근손실 억제에 상당한 효과가 있음을 확인하게 된 바, 본 발명을 완성하게 되었다.
[선행문헌]
콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 제형 (대한민국 공개특허 10-2012-0022085)
상기한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 억제 및 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
보다 상세하게는 근손실을 억제 및 예방할 수 있는 물질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
아울러 수득이 용이하면서도 부작용이 최소화된 천연 유래의 콩잎 추출물을 유효 성분으로 포함하는 근질환 억제 및 예방용 식품 조성물, 약학 조성물 또는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 억제 및 예방용 조성물을 제공한다.
상기 콩잎 추출물은 콩의 생육 단계 중 R6 내지 R8기의 콩잎의 추출물인 것을 특징으로 한다.
상기 콩잎 추출물은 생(生)콩잎 추출물, 이의 분획물, 이의 건조물, 이의 건조 분획물, 이의 발효물 및 이의 농축물 중 어느 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 조성물은 식품, 약학 또는 화장료 조성물 등의 형태로 활용 가능하다.
상기한 과제 해결 수단을 통하여 본 발명은 근질환을 억제 및 예방할 수 있는 조성물을 제공한다.
보다 상세하게는 콩잎 추출물을 유효성분으로 포함하여 근손실을 억제 및 예방할 수 있는 물질을 제공함으로써 직, 간접적으로 다양한 근질환의 개선 또는 예방이 가능한 물질을 제공한다.
상기 제공되는 유효성분인 콩잎 추출물은 천연성분으로서 인체 부작용이 적고 수득이 쉬우며, 종래 산업상 활용도가 저조했던 콩잎을 충분히 활용하므로 제조에도 경제적이다.
도 1은 HPLC를 이용하여 (a) 콩잎 추출물 및 (b) 콩 추출물의 성분을 비교 분석한 결과이다.
도 2는 정상적인 근세포(control) 대비 각 실험군, 대조군 및 비교군의 상대적인 세포활성도(%)를 나타낸 그래프이다.
도 3 은 정상적인 근세포(control) 대비 각 실험군, 대조군 및 비교군의 상대적인 Atrogin1 유전자(mRNA)의 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 정상적인 근세포(control) 대비 각 실험군, 대조군 및 비교군의 상대적인 Murf1의 유전자(mRNA)의 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환(myopathy) 억제 및 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 ‘근질환’이라 함은, 최소한 후술할 Atrogin1 또는 Murf1 단백질의 발현과 직,간접적으로 관련되는 근질환이라면 예외 없이 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 주로 근감소증, 근손실 및 근위축 질환을 동반하거나 이와 직, 간접적으로 연관되는 모든 근질환을 의미한다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기 내용은 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 가장 대표적인 실시 형태만을 기재한 것으로서 본 발명의 권리 범위는 이에 한정되지 않으며 하기 내용과 균등한 모든 범위를 포괄한다.
본 발명에 있어서, ‘콩’은 그 종류에 제한이 없으며, 예컨대 서목태(Rhynchosia Nolubilis), 약콩(Glycine max(L.) Merr .), 울타리콩(Vicia faba), 강낭콩(Phaseolus vulgaris), 얼룩강낭콩(Phaseolus vulgaris L.), 적두(Vigna angularis), 거두(Phaseolus angularis W.F . WIGHT.), 완두콩(Pisum sativum L.) 및 대두(Glycine max MERR)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 콩의 형태는 유효 성분을 추출하기에 적합한 형태라면 어느 것이나 가능하다.
다만 본 발명에서 추출의 대상은 ‘콩잎’으로 한정되는데, 이는 후술되는 실시예 1 및 도 1에서 나타나는 바와 같이 콩과 콩잎의 성분 물질이 상이하고, 콩 추출물에 비하여 콩잎 추출물에서 근질환 억제 및 예방의 효과가 유의적이기 때문이다. 또한, 본 발명은 종래 산업적으로 활용도가 적어 버려지던 콩잎을 적극 활용할 수 있어 경제적이며 제조가 용이하다.
본 발명에서 보다 우수한 근질환 억제 및 예방 효과를 가지는 콩잎 추출물은, 하기 콩의 전체 생육 단계 중 R6 내지 R8 시기의 콩잎 추출물이다.
VE 시기: 종자를 심은 후 1 내지 2주 후 상태, 토양으로부터 떡잎이 올라옴
VC 시기: 떡잎이 활짝 피며, 그 위로 한마디가 자라나고 외엽이 생성됨
V1 시기: 첫번째 외엽으로부터 한마디가 생성 되어 3개의 잎이 생성됨
V2 시기: V1 Stage에서 한마디가 더 생성되어 3개의 잎이 생성됨
V3 시기: V2 Stage에서 한다미가 더 생성되어 3개의 잎이 생성됨
V4 시기: V3 Stage에서 한다미가 더 생성되어 3개의 잎이 생성됨
R2 시기: 콩꽃이 활짝 핀 상태
R4 시기: 콩깍지 생성이 완료된 상태
R5 시기: 콩깍지 안에 콩이 생성 되는 상태
R6 시기: 콩깍지 안에 녹색의 콩이 생성 완료된 상태
R7 시기: 콩깍지와 콩이 노란색으로 변해 가는 상태
R8 시기: 잎 떨어지면서 콩깍지와 콩이 완전히 노란색으로 변한 상태
바람직하게는 R7 내지 R8 시기의 콩잎, 보다 바람직하게는 R7 시기의 콩잎 추출물이다. 상기 R7 내지 R8 시기의 콩잎은 잎의 색이 노랗게 변하는 시기의 콩잎이라 하여 ‘단풍콩잎’이라고 지칭하기도 한다.
본 명세서에서 ‘추출물’이라 함은, 천연물로부터 추출되는 성분 물질을 의미하며 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문한다. 예컨대, 물이나 유기 용매를 이용하여 천연물로부터 용매에 용해되는 성분을 추출해 낸 것, 천연물의 특정 성분, 오일과 같은 특정 성분만을 추출하여 얻어진 것 등을 모두 포함하는 광의의 개념이며, 추출 후 가공 등을 거쳐 얻어지는 물질 또한 모두 포함한다. 구체적으로 본 발명의 추출물은 생(生)콩잎 추출물, 추가적 가공이나 발효 또는 효소 처리된 분획물, 건조물, 건조 분획물, 발효물 및 농축물로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상 선택되는 형태일 수 있다.
본 발명의 콩잎 추출물을 수득하는 방법은 이 업계에서 일반적으로 사용되는 방법이라면 어느 특정의 것으로 제한되지 않으나, 통상, 세척하고 건조되어 세말화 된 콩잎 가루를 물 또는 유기용매에 넣고 추출하여 침적시킨 후 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 상기 분리된 여액을 감압 농축하는 방법으로 콩잎 추출물을 얻을 수 있다.
추출을 위한 용매로는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들 유기용매와 물의 혼합용매 중 어느 하나 이상이 선택될 수 있으며, 원료의 안전성을 고려하여 물 또는 30 내지 70 % 농도의 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 추출물은 반복 추출을 통해 얻은 각 여액들을 혼합하여 사용하는 것이 효과적이다. 이를 테면 상기한 바와 같이 에탄올로부터 1차 추출물을 얻은 후, 잔사에 대해 에틸아세테이트를 가하여 2차 추출물을 얻고, 이것의 잔사에 대하여 다시 1 내지 2회의 추가 추출을 반복하여 상기 추출물들의 걸러진 여액을 혼합하는 것이다.
상기 추출물을 얻은 이후에는 이 기술분야에 알려진 통상적인 방법으로 상온에서 냉침, 가열 및 여과하여 액상물을 얻을 수 있으며, 또는 추가로 용매를 증발, 분무 건조 또는 동결 건조하는 과정을 더 거칠 수 있다.
추출물의 농도에 또한 특별한 제한은 없으나, 후술할 실시예 2 또는 실험예 1 내지 2를 참조하면 통상 100 ppm 내외에서도 충분한 효과를 보이며, 구체적으로는 질환의 증상과 정도 및 조성물의 제공 형태에 따라 다양한 농도로 활용 가능하다.
본 발명의 콩잎 추출물은 골격근의 유비퀴틴 리가아제의 발현 또는 활성을 억제하여 근질환을 억제 및 예방한다. 일반적으로 체내의 유비퀴틴 리가아제는 소멸 대상 단백질의 표면에 일종의 사멸 신호로 유비퀴틴을 부착시킴으로써 해당 단백질이 분해되도록 유도하는 효소이다. 특히, 골격근 감소시에 특이적으로 발현하는 Atrogin1 및 Murf1이라는 유비퀴틴 리가아제가 존재한다. 그러나 상기 Atrogin1 및 Murf1은 불필요한 단백질 사멸을 유도하는 통상의 체내 유비퀴틴 리가아제와 달리, 주로 병리학적 근손실 또는 근위축이 동반되는 근질환 환자에게서 과발현되는 양상을 보이며, 현재 근감소증(sarcopenia)을 유발하는 분자생물학적인 직접 원인 중 하나로 알려져 있다. 상기 Atrogin1 및 Murf1이 과발현되면 근세포의 합성에 비하여 분해 경로가 지나치게 활성화되고, 이로 인해 정상적인 근세포의 소실이 일어나게 된다.
상기한 메커니즘과 관련하여, 본 발명의 콩잎 추출물은 Atrogin1 및 Murf1 유전자의 과발현을 억제함으로써 근손실을 방지하고 나아가 이와 유기적으로 연관된 기타 근질환 또한 개선 및 예방할 수 있다.
대다수의 근손실 질환은 노화에 따른 퇴행성 질환의 일종으로 분류되는 것을 고려할 때, 본 발명의 조성물은 시니어(senior)층을 대상으로 적극 활용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품, 약학 및 화장료 조성물 중 어느 하나의 제형으로 제공될 수 있다.
본 발명의 일 활용 형태로서 식품 조성물은, 주로 건강기능식품의 조성물이며, 상기 콩잎 추출물을 유효성분으로 포함하고 종래의 식품 조성물에 혼합하여 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 그 식품의 일 성분과 함께 사용될 수도 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며 음료, 차, 드링크제, 알콜음료 및 비타민 복합제 등을 포함하여 통상적으로 인정될 수 있는 모든 형태로 활용 가능하다.
본 발명의 또 다른 일 활용 형태로서 약학 조성물은, 상기 콩잎 추출물 및 기타 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 더 포함하여 제조될 수 있다. 이를테면, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 어느 하나 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 약학 조성물은 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 경구 투여용 제형으로 제제화할 수 있다.
상기 경구 투여용 제형은 정제(錠劑), 환제(丸劑), 과립제(顆粒劑), 세립제(細粒劑), 산제(散劑), 분제(粉劑), 연질 캡슐제, 경질 캡슐제, 유탁제(乳濁劑), 시럽제 및 드링크제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형태일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 활용 형태로서 화장료 조성물은, 상기 콩잎 추출물을 유효성분으로 포함하고 기타 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 모든 성분을 더 포함할 수 있다.
상기 기능성 첨가물로는 예컨대 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스 중 어느 하나 이상일 수 있다. 또한 필요에 따라 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 더 배합할 수도 있다.
상기 화장료 조성물의 제형은 적용 특성에 따라 적절히 선택할 수 있으며 예컨대 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 파우더, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저, 스프레이 등의 제형으로 제공될 수 있다.
이하, 본 발명에 관한 실시예 1 내지 2 및 실험예 1 내지 2를 제시한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 실시 및 효과에 관한 일 예들에 해당할 뿐, 본 발명의 권리 범위 및 효과가 이에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 콩잎과 콩 추출물의 성분 비교
콩잎과 콩 추출물의 구성 성분이 동일하지 않음을 확인하기 위하여 HPLC(high performance liquid chromatography)를 사용한 성분 분석을 실시하였다.
HPLC 분석 조건
콩잎, 콩 추출물 각각을 70 % 에탄올에 녹여 10,000 ppm 용액으로 만든 후, HPLC(Waters사, 2695 model)를 이용하였고, 검출기(Waters사, 2996 PDA 검출기)를 사용하여 성분 분석을 진행하였다. 고정상은 Kanto Chemical사의 Mightysil RP-18 GP 250-4.6 (5㎛) 칼럼을 이용하였고, 이동상은 물과 아세토나이트릴에 대한 아세트산 0.1% 용액을 혼합사용하였다.
HPLC 분석 결과
HPLC 성분 분석 결과는 도 1로 제시한다. 도 1에 있어서, (a)는 콩잎 추출물 및 (b)는 콩 추출물이다.
도 1에 따르면 콩잎 추출물과 콩 추출물은 서로 다른 분리 패턴을 보인다. 각 시점에 따라 피크가 나타나는 부분들이 전체적으로 상이한 바, 콩 추출물과 콩잎 추출물의 구성 성분은 서로 동일하지 않음을 명확히 확인할 수 있다.
[ 실시예 2] 콩잎 추출물의 제조
생장 시기별 (VC/V2/V4/R2/R4/R6/R7시기, 총 7시기)로 채취한 각각의 콩잎을 정제수로 세척하고 건조시킨 다음 세말화하였다. 상기 콩잎 가루 100 g을 70 중량% 에탄올 수용액 1리터에 넣고 상온(25)에서 12시간 추출한 후, 300 메쉬 여과포로 여과하였다.
상기 추출액을 3 리터 분액 깔때기에 넣고 에틸아세테이트 1리터를 가한 후, 흔들어서 섞어준 다음 두 층으로 완전히 분리되면 상층(에틸아세테이트 층)을 취한다. 하층을 다시 분액 깔대기로 두 번 더 추출한다. 각각의 분리된 상층을 모두 합한 뒤 냉각 콘덴서가 달린 증류 장치를 이용하여 50로 감압 농축하고 건조하였다. 그리하여 각 단계의 콩잎 추출물을 10.3 g 수득하였다.
[ 실험예 1] 근세포의 세포활성 회복능 평가
본 실험예 1에서는 콩잎 추출물이 덱사메타존(Dexamethasone)에 의한 근손실 유발 모델에서 근세포의 세포활성 감소에 대한 회복 효능을 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
덱사메타존은 당질 코르티코이드의 일종으로, 시험관 내(in vitro)와 생체 내(in vivo)에 있어서 Atrogin1과 Murf1의 발현을 증가시켜 단백질의 분해작용을 촉진함으로써 골격근의 감소를 유발하고 근세포의 사멸을 유도하여 세포의 활성을 저하시킨다. 따라서 근세포에 덱사메타존 을 처리하는 실험모델은 근감소증에 대한 기능을 평가함에 있어 유용한 평가 모델이며, 널리 이용되고 있다.
본 실험예 1에 사용된 C2C12(쥐의 근원세포) 는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구매하여 사용하였고, 세포의 배양에는 10% FBS과 100units/mL Penicillin, 100mg/mL streptomycin을 포함하는 DMEM배지를 이용하였다. 구체적인 실험 방법은 하기와 같다.
먼저 실험군을 준비하기 위하여, C2C12를 12웰 플레이트에 분주한 후 세포가 플레이트의 80 내지 90%정도로 융합(confluent)할 때까지 배양한다. 이어서, 2% 말 혈청(Horse serum)과 DMEM 배지로 교환하여 세포의 분화를 유도하였다. 배지 교환 이후 5 내지 7일 더 배양하여 세포의 분화가 완료된 후, 덱사메타존을 최종농도가 1uM이 되도록 처리하였고, 이와 동시에 상기에서 실시예 2에서 수득한 VC/V2/V4/R2/R4/R6/R7시기의 콩잎 추출물을 최종농도 100 ppm이 되도록 처리하였다.
한편 대조군으로는 덱사메타존 이외에는 아무 처리를 하지 않은 세포를 사용하였고, 비교군으로는 콩잎 추출물 대신, 염증을 억제시켜 근육통에 효과가 있는 물질로 알려진 덱시부프로펜(dexibuprofen)을 최종농도 100uM이 되도록 처리한 세포를 사용하였다.
물질을 처리 한 후 24시간이 경과한 후 CCK8(cholecystokinin 8) 용액 10%를 포함하는 배지로 교환하고 10분간 반응시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포활성을 측정하였다. 신뢰도를 높이기 위하여 각 시료는 3회씩 반복 측정하여 그 평균값을 도출하였다.
실험의 결과는 도 2 및 하기 표 1과 같다.
실험군 비교군
처리물질 VC V2 V4 R2 R4 R6 R7 덱시부프로펜
대조군 대비 세포활성도 변화량 (%) 0.4 -1.3 -2.0 2.5 6.2 9..1 18.1 -4.1
도 2는 정상적인 근세포(control) 대비 실험군, 대조군(Dex) 및 비교군(dexibuprofen)의 상대적인 세포활성도를 나타낸 그래프이다. 상기 표 1은 대조군 대비 실험군 및 비교군의 세포활성도 변화량을 기재한 것이다.
도 2를 참조하면, 정상적인 근세포와 비교하여 덱사메타존으로 처리한 대조군의 경우 근세포활성이 저하됨을 확인할 수 있었다. 이러한 대조군에 비하여, 콩잎 추출물로 처리된 실험군은 전체적으로 근세포의 활성이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
구체적으로 상기 표 1을 보면, R4 내지 R7 단계의 콩잎 추출물이 처리된 실험군에서는 대조군 대비 6.2 내지 18.1%로 근세포의 활성이 유의하게 증가하였으며, 특히 R7 단계의 콩잎 추출물은 매우 효과적으로 세포활성을 회복시키는 것으로 나타났다.
이에 따라, 본 발명의 콩잎 추출물은 근손실 억제 및 예방 효능을 가짐을 확인할 수 있었다.
한편, 비교군으로 덱시부프로펜으로 처리한 군에서는 근세포의 활성 회복이 관찰되지 않았는데, 이로부터 일반적인 근육통 억제 물질은 근손실의 억제 또는 예방에 적합하지 못하며 그 작용 기전 또한 상이함을 알 수 있다.
[ 실험예 2] Atrogin1 및 Murf1 유전자( mRNA )의 발현 억제능 평가
본 실험예 2에서는 콩잎 추출물이 덱사메타존에 의한 근손실 유발 모델에서 Atrogin1과 Murf1의 mRNA의 과발현에 대한 억제 효능을 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
본 실험예 2의 실험군, 대조군 및 비교군은 상기 실험예 1과 동일하게 준비하였다.
단, 각 최종 물질을 처리 한 후 6시간이 경과되었을 때, 차가운 식염수로 2회 세척한 후, 트리졸 시약(TRIzol agent, Invitrogen)으로 RNA를 추출하였다.
이후, 상기 추출하여 정량한 1 ㎍/㎕의 RNA와 역전사 시스템(Promega)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 및 Atrogin1, Murf1, GAPDH의 각 유전자에 대하여 미리 디자인된 프라이머(Primer)와 프루브(probe)(Applied biosystems)를 이용하여 각 유전자들의 발현 양상을 측정하였다. 이때 PCR(polymerase chain reaction) 반응과 분석은 로터-진 3000 시스템(Rotor-Gene 3000 system; Corbett Research, Sydney, Australia)을 이용하였다. 신뢰도를 높이기 위하여 각 시료는 3회씩 반복 측정하여 그 평균값을 도출하였다.
실험 결과는 도 3, 도 4 및 하기 표 2 및 표 3과 같다.
실험군 비교군
처리물질 VC V2 V4 R2 R4 R6 R7 덱시부프로펜
대조군 대비 Atrogin1유전자 발현 변화량 (%) -2.0 -4.7 -0.6 -8.2 -14.9 -16.2 -31.6 -2.6
실험군 비교군
처리물질 VC V2 V4 R2 R4 R6 R7 덱시부프로펜
대조군 대비 Murf1 유전자 발현 변화량 (%) -4.2 -2.4 -8.5 -9.9 -13.7 -17.5 -24.1 -3.3
도 3 및 도 4는 정상적인 근세포(control) 대비 실험군, 대조군(Dex) 및 비교군(dexibuprofen)의 상대적인 Atrogin1, Murf1의 유전자(mRNA) 발현량을 나타낸 그래프이다. 상기 표 2 및 표 3은 대조군 대비 실험군 및 비교군의 Atrogin1, Murf1 유전자(mRNA) 발현 변화량을 기재한 것이다.
도 3 및 도 4를 참조하면, 정상적인 근세포 대비 덱사메타존으로 처리한 대조군의 경우 Atrogin1 및 Murf1유전자가 과발현됨을 확인할 수 있었다. 상기 대조군과 비교하여 콩잎 추출물이 더 처리된 실험군에서는 전체적으로 Atrogin1 및 Murf1 유전자 발현량이 감소하는 것으로 나타났다.
구체적으로 상기 표 2를 통해 Atrogin1에 있어서는, 대조군 대비 R2 내지 R7 단계의 콩잎 추출물이 처리된 실험군에서 유전자의 발현량이 8.2 내지 31.6%로 유의하게 감소하였으며, 특히 R7 단계의 콩잎 추출물을 처리한 실험군에서 매우 효과적이었다.
또한 상기 표 3을 보면, Murf1에 있어서는 대조군 대비 V4 내지 R7 단계의 콩잎 추출물이 처리된 실험군에서 유전자 발현량이 8.5 내지 24.1%로 유의하게 감소하였으며 특히 R7 단계의 콩잎 추출물을 처리한 실험군에서 매우 효과적이었다.
한편, 덱시부프로펜을 처리한 비교군에서는 Atrogin1 및 Murf1 유전자의 발현 억제 효과가 미미하였으며, 이로부터 일반적인 근육통 억제 물질은 근손실의 억제 또는 예방에 적합하지 못하며 그 작용 기전 또한 상이함을 알 수 있다.
상기한 결과로부터, 본 발명의 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 근질환의 억제 및 예방에 우수한 효능을 가지는 바, 식품, 약학 또는 화장료 조성물 등의 다양한 형태로 산업상 활용 가능성이 높을 것으로 기대된다.

Claims (15)

  1. 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환(myopathy) 억제 및 예방용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 근질환은 근감소증(sarcopenia), 근손실 및 근위축 질환으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 근질환은 노인성 근질환인 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 근세포의 세포활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 골격근의 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)의 발현 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 Atrogin1 또는 Murf1 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 콩잎 추출물은 콩의 생육 단계 중 R6 내지 R8기 중 어느 한 단계에 해당하는 콩잎의 추출물인 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 콩잎 추출물은 콩의 생육 단계 중 R7기의 콩잎 추출물인 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 콩은 서목태(Rhynchosia Nolubilis), 약콩(Glycine max(L.) Merr .) 울타리콩(Vicia faba), 강낭콩(Phaseolus vulgaris), 얼룩강낭콩(Phaseolus vulgaris L.), 적두(Vigna angularis), 거두(Phaseolus angularis W.F . WIGHT.), 완두콩(Pisum sativum L.) 및 대두(Glycine max MERR)로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 콩잎 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 콩잎 추출물은 에탄올 및 에틸아세테이트로 순차적으로 추출된 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 콩잎 추출물은,
    콩잎을 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합물 용매를 가하여 1차 추출하는 단계;
    상기 1차 추출물에 유기용매를 가하여 2차 추출하는 단계; 및
    상기 1차 및 2차 추출물을 포함하는 최종 추출물을 감압 농축 및 건조하는 단계를 포함하는 방법으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방 용 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 콩잎 추출물은 생(生)콩잎 추출물, 이의 분획물, 이의 건조물, 이의 건조 분획물, 이의 발효물 및 이의 농축물로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물, 약학 조성물 및 화장료 조성물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 경구투여 제형의 조성물인 것을 특징으로 하는 근질환 억제 및 예방용 조성물.
PCT/KR2016/004828 2015-06-30 2016-05-09 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 억제 및 예방용 조성물 WO2017003086A1 (ko)

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