WO2016186188A1 - イムノクロマト試験片及びそれを用いたイムノクロマト法 - Google Patents

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理沙 小樋山
治 石川
友樹 篠原
恭 宮澤
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Definitions

  • the present invention relates to an immunochromatographic test piece capable of suppressing the influence of interfering substances contained in a test sample and an immunochromatographic method using the same.
  • the effects of interfering substances may be seen as false negatives or false positives in rapid diagnostics based on immunochromatography.
  • many rapid diagnostic agents based on immunochromatography are widely used as one means for measuring a viral or bacterial infection quickly and simply and determining a treatment policy.
  • the false positives or false negatives described above may prompt wrong treatment, delay treatment, and sometimes even death in rapid diagnostic drugs based on immunochromatography.
  • Patent Document 2 a method of processing a sample with a sample processing solution containing a compound having two or more sulfate groups has been reported.
  • the object of the present invention is to suppress the influence of interfering substances in the immunochromatography method contained in the test sample, and accurately detect the target substance in the test sample regardless of the amount used for the test sample test. It is to provide an immunochromatographic test strip that enables specific measurement and an immunochromatographic method using the same.
  • the inventors of the present application impregnated a polymer obtained by polymerizing a hydrophobic cyclic monomer having an ionic functional group into a specific portion of an immunochromatographic test piece, thereby suppressing the influence of an interfering substance, It has been found that a substance to be detected in a test sample can be accurately and specifically measured regardless of the amount used for the test of the test sample, and the present invention has been completed.
  • the present invention is an immunochromatographic test piece having a sample pad, a labeled region, a detection region, and an absorption band from the upstream side, and has a hydrophobic ionic functional group upstream from the labeled region.
  • this invention provides the immunochromatography method performed using the immunochromatography test piece of the said invention.
  • the influence of interfering substances is suppressed, and the detected substance in the test sample is accurately and specifically measured regardless of the amount used for the test sample test. It is possible.
  • the present invention relates to an immunochromatographic test piece that prevents false positives and false negatives, particularly false negatives, and enables accurate measurement of a substance to be detected.
  • false positive means that a signal indicating positive is generated in the assay even though the sample does not contain the detected substance.
  • False negative means that the detected substance is contained in the sample. Despite being included, no positive signal is generated in the assay.
  • an immunochromatography method immunochromatography method
  • a substance to be detected is present in a sample
  • a complex of immobilized substance-detected substance-labeling reagent is formed on a solid support, and the complex
  • the signal of the labeling reagent that is emitted from is generated, but in the case of false negative, the generation of the signal is inhibited due to the reason that the above complex is not formed.
  • the immunochromatographic test strip comprises a support having a detection region on which an antibody (antibody 1) that captures an object to be measured (antigen or the like) is immobilized, a labeled region having a movable labeled antibody (antibody 2), and a sample drop.
  • an antibody antibody 1 that captures an object to be measured (antigen or the like)
  • a labeled region having a movable labeled antibody (antibody 2)
  • the number of detection regions and the type of labeled antibody contained in the labeled body region are not limited to one, and two or more antigens can be tested in the same test by using antibodies corresponding to a plurality of measurement objects. It can be measured with a piece.
  • FIG. 1 is a diagram showing a preferred form of a typical immunochromatographic test piece.
  • the immunochromatographic test piece is not limited to that shown in FIG.
  • reference numeral 1 is a support
  • reference numeral 2 is a marker area
  • reference numeral 3 is a detection area
  • reference numeral 4 is a sample pad
  • reference numeral 5 is an absorption band
  • reference numeral 6 is a backing sheet. .
  • FIG. 1 is a top view and the bottom is a cross-sectional view.
  • a support having two detection regions formed on a backing sheet, an absorption band, a marker region, and a sample pad are laminated. And as shown in the figure, one end of the absorption band and one end of the support, the other end of the support and one end of the label area, the other end of the label area and the sample pad One end of each is overlapped, thereby forming a continuous lateral flow channel.
  • the support is a material having the ability to immobilize an antibody for capturing a test substance (antigen), and has a performance that does not prevent the liquid from passing in the horizontal direction.
  • it is a porous thin film having a capillary action, and is a material capable of transporting a liquid and components dispersed therein by absorption.
  • the material forming the support is not particularly limited, and examples thereof include cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, polyvinylidene difluoride (PVDF), glass fiber, nylon, and polyketone. Of these, a thin film using nitrocellulose is more preferred.
  • the labeled body region is composed of a porous substrate containing a labeled antibody, and the glass substrate or nonwoven fabric that is generally used can be used as the material of the substrate.
  • the substrate is preferably in the form of a pad having a thickness of about 0.3 mm to 0.6 mm in order to impregnate a large amount of labeled antibody.
  • the detection region refers to a partial region of the support on which an antibody that captures a test substance (antigen) is immobilized.
  • the detection region is provided with at least one region on which an antibody for capturing an antigen is immobilized.
  • the sample pad is a part for dropping a specimen or a specimen prepared using the specimen, and is a porous material having water absorption.
  • the material generally used cellulose, glass fiber, non-woven fabric and the like can be used.
  • it is preferably a pad shape having a thickness of about 0.3 mm to 1 mm.
  • the sample pad and the above-described marker body region are merely functional distinctions and do not necessarily need to be individual materials. That is, it is possible that a partial region of the material set as the sample pad has the function of the marker region.
  • the absorption band is a member for absorbing components that are supplied to the support and are not involved in the reaction in the detection region.
  • As the material filter paper with high water retention, sponge, etc. made of general natural polymer compounds, synthetic polymer compounds, etc. can be used, but those having high water absorption are preferable for promoting the development of the specimen. .
  • the backing sheet is a member for affixing and fixing all the above-mentioned materials, that is, the support, the sample pad, the marker region, and the absorption band with a partial overlap.
  • the backing sheet is not necessarily required as long as these materials are arranged and fixed at an optimal interval, but it is generally preferable to use the backing sheet for convenience in manufacturing or use.
  • the specimen passes through a porous flow path formed by a series of connections of a sample pad, a label body region, a support, a detection region, and an absorption band. Therefore, in this embodiment, all of these become the specimen movement area.
  • the specimen movement region defined in this specification does not matter whether the specimen is inside or the interface.
  • the polymer may be impregnated with the sample pad, or may be impregnated with a porous material different from the sample pad and disposed between the sample pad and the marker region.
  • the polymer obtained by polymerizing a hydrophobic cyclic monomer having an ionic functional group used in the present invention has the following characteristics.
  • a sulfone group or a salt thereof As an ionic functional group, regardless of whether it is an anionic functional group or a cationic functional group, a sulfone group or a salt thereof, a carboxylic acid or a salt thereof, or an amine (a quaternary amine that is ionized in an aqueous solution).
  • a sulfone group or a salt thereof is particularly preferable.
  • examples of the hydrophobic ring include an aromatic ring and a cycloalkyl ring, which may be a heterocyclic ring containing an oxygen atom, a nitrogen atom, a sulfur atom, or the like, or may be a condensed ring in which they are condensed.
  • an aromatic ring is preferable, and examples of the aromatic ring include a benzene ring, a naphthalene ring, and an anthracene ring, and a benzene ring or a naphthalene ring is preferable, and a benzene ring is more preferable.
  • Preferred polymers used in the present invention include polyanetol sulfonic acid sodium salt, polystyrene sulfonic acid sodium salt (PS-1, PS-5, PS-50, PS-100 (trade name, manufactured by Tosoh Corporation)), naphthalene sulfone.
  • PS-1, PS-5, PS-50, PS-100 trade name, manufactured by Tosoh Corporation
  • naphthalene sulfone naphthalene sulfone.
  • Sodium salt of acid formalin condensate, sodium salt of aromatic sulphonic acid formalin condensate specifically, disrol (trade name, manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.), demol (trade name, manufactured by Kao Corporation), PS-1900 (trade name, manufactured by Lion Corporation), Politi N-100K (trade name, manufactured by Lion Corporation), and the like.
  • preferred polymers used in the present invention include those in which the repeating unit is represented by the following general formula [I].
  • Ar represents a hydrophobic ring
  • X represents an ionic functional group
  • R1 to R3 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group
  • n represents an integer of 0 to 10
  • the hydrogen atom bonded to each carbon atom may be substituted with a substituent that does not impair the effects of the present invention.
  • X and Ar are the above-described ionic functional group and hydrophobic ring, respectively.
  • R1 to R3 are alkyl groups, lower (1 to 4 carbon atoms, the same shall apply hereinafter) alkyl groups are preferred.
  • N is preferably 0 to 3.
  • a hydrogen atom bonded to each carbon atom constituting Ar may be substituted with a substituent that does not inhibit the effect of the present invention. Examples of such a substituent include a lower alkyl group and a lower alkoxyl. The group can be mentioned.
  • M is an atom or group that becomes a monovalent cation in an aqueous solution, preferably an alkali metal such as sodium or potassium, and R 1 to R 3 are independently a hydrogen atom or a lower alkoxyl group. R 4 to R 6 each independently represent a hydrogen atom or a lower alkyl group.
  • anethole sulfonates represented by the following formula [III] anethole sulfonates represented by the following formula [III]
  • styrene sulfonates represented by the following formula [IV] styrene sulfonates represented by the following formula [IV]
  • M has the same meaning as in the formula [I], and is preferably an alkali metal such as sodium or potassium.
  • the molecular weight of the polymer is preferably 1000 to 100,000, and more preferably 1000 to 60,000.
  • the above repeating units can be used alone or in combination of two or more.
  • the polymer used in the present invention preferably comprises only the above repeating units, but may contain other units within a range that does not adversely affect the effects of the present invention.
  • the content of such other units in the polymer is 20 mol% or less, preferably 10 mol% or less, more preferably 5 mol% or less.
  • the amount of the polymer used in the present invention is not particularly limited, but is usually about 0.01 ⁇ g to 1 mg, preferably about 0.1 ⁇ g to 0.1 mg per immunochromat test piece. However, it is preferable to select an optimal amount that is effective depending on the type of the polymeric ionic surfactant to be used, the type of inorganic salt to be used, the composition of the sample suspension, the amount of addition, and the like.
  • inorganic salts water-soluble ones such as sodium compounds, potassium compounds, cesium compounds, magnesium compounds, calcium compounds, strontium compounds, and combinations thereof are preferably used, but are not limited thereto.
  • Sodium chloride, potassium chloride, lithium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, sodium iodide, sodium bromide and the like are preferable, and sodium chloride and magnesium chloride are particularly preferable.
  • the amount of the inorganic salt of the present invention is not particularly limited, but is usually about 0.01 ⁇ mol to 1 mmol, preferably about 0.1 ⁇ mol to 0.1 mmol, per test piece of immunochromatographic test piece. However, it is preferable to select an optimal amount that is effective depending on the type of the polymeric ionic surfactant to be used, the type of inorganic salt to be used, the composition of the sample suspension, the amount of addition, and the like.
  • the measurement is started by applying a specimen or a specimen prepared using the specimen to the sample pad.
  • the specimen sample to be provided may be suspended in advance in the specimen suspension, but the specimen may be directly provided to the sample pad.
  • Specimens provided to the sample pad are developed in the horizontal direction sequentially into the labeled body region, the support and the absorption band by capillary action.
  • the labeled antibody is released into the liquid and developed on the support as the specimen sample is developed.
  • the antigen is specifically captured by the capture antibody in the detection region of the support, and the antigen forms a complex with the labeled antibody by a specific reaction.
  • an antibody sandwich via the antigen is established in the detection region, and the labeled antibody-antigen complex can be measured in the detection region.
  • a polymer preferably a polymer, in which a hydrophobic cyclic monomer having an ionic functional group is polymerized before the specimen is developed from the sample pad to the labeled body region.
  • a reagent that suppresses the influence of the interfering substance is previously added to the specimen suspension, and the specimen is suspended in the specimen suspension.
  • specimens consisting of biological samples are collected without being quantified with a swab, etc., so the amount of specimen varies, and as a result, the specimen suspension is diluted with an excessive amount of specimen, thereby suppressing the effects of interfering substances
  • the reagent to be diluted is also diluted, resulting in a problem that a sufficient suppression effect cannot be obtained.
  • the present invention uses a polymer that is preliminarily polymerized with a hydrophobic cyclic monomer having an ionic functional group at a position upstream from the labeled region, preferably a member impregnated with a polymer and an inorganic salt, and a constant amount is always sampled.
  • a polymer that is preliminarily polymerized with a hydrophobic cyclic monomer having an ionic functional group at a position upstream from the labeled region preferably a member impregnated with a polymer and an inorganic salt, and a constant amount is always sampled.
  • the biological sample to be measured is not particularly limited, but a biological sample capable of greatly exerting the effect of the present invention to suppress the influence of interfering substances is preferable, and serum, plasma, blood, urine, feces, Body fluids such as saliva, tissue fluid, spinal fluid, wiping fluid, and the like, or dilutions thereof are preferred.
  • specimens mixed with a substance derived from a mucous membrane of a living body, sputum, saliva, throat wiping liquid, nasal cavity wiping liquid, nasal cavity suction liquid, keratoconjunctival wiping liquid, fecal specimen and the like are preferable.
  • the substance to be detected is an antigen or antibody that can be measured by an immunoassay, that is, an assay using an antigen-antibody reaction.
  • the antigen may be any antigen that can produce an antibody, and examples thereof include proteins, polysaccharides, lipids and the like. Protozoa, fungi, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia, viruses and the like containing these substances can also be measured.
  • Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 to 4 Effects of interfering substances in saliva and inhibitory effects of interfering substances by the conventional method and the present invention Immobilization of anti-Mycoplasma pneumoniae antibody on nitrocellulose membrane
  • Anti-Mycoplasma pneumoniae antibody was applied to the membrane on the sample pad side, and anti-mouse IgG antibody was applied to the absorber side in a linear form. Thereafter, the nitrocellulose membrane was dried at 45 ° C. for 30 minutes to obtain an anti-Mycoplasma pneumoniae antibody-immobilized membrane.
  • This membrane is referred to as “antibody-immobilized membrane” in this example.
  • Anti-Mycoplasma pneumoniae antibody was diluted with purified water to 1.0 mg / mL, and colored polystyrene particles were added to this to 0.1%, and after stirring, Add carbodiimide to 1% and stir further. The supernatant was removed by centrifugation and resuspended in 50 mM Tris (pH 9.0) and 3% BSA to obtain anti-mycoplasma pneumoniae antibody-bound colored polystyrene particles. This particle is referred to as “antibody-immobilized particle” in this example.
  • test piece using a non-woven fabric coated with nothing as a sample pad is called a “conventional test piece”.
  • the test piece includes a sample pad, a dry pad (labeled body region), an antibody-immobilized membrane (detection region), and an absorption band from the upstream along the flow of the specimen.
  • Saliva treatment A swab was included in the mouth, and the saliva was sucked well, and the sample was suspended in a sample treatment solution (Quick Navi-sample suspension; manufactured by Denka Seken) (saliva treatment sample).
  • a sample treatment solution Quick Navi-sample suspension; manufactured by Denka Seken
  • swabs were included in the mouth and saliva was often sucked, and this was suspended in a sample treatment solution (Quick Navi-Sample suspension; manufactured by Denka Seken Co., Ltd.) to which sodium polystyrenesulfonate was added (conventional saliva treatment) Specimen).
  • Measurement Mycoplasma pneumoniae antigen was added to and mixed with the sample-treated solution as it was or a saliva-treated sample, and 50 ⁇ L of this was added dropwise to the test piece of the present invention and the conventional method test piece. After 15 minutes, whether or not colored polystyrene particles were deposited on a predetermined position on which the anti-Mycoplasma pneumoniae antibody was immobilized was determined visually. The case where the degree of linear deposition was strong was rated as +, the case where judgment was difficult was ⁇ , and the case where deposition was not observed was marked as-.
  • Comparative Example 2 in which the saliva-treated specimen was applied, not only the colored polystyrene particles were not deposited on the predetermined position where the anti-mycoplasma pneumoniae antibody was immobilized, but also the particles at the position where the anti-mouse IgG antibody was immobilized. The accumulation of was not seen.
  • the addition of sodium polystyrene sulfonate in the liquid system corresponding to the conventional method restored the particle deposition at the position where the anti-mouse IgG antibody was immobilized, but the anti-Mycoplasma pneumoniae antibody was used. Slight deposition was observed at the solidified position.
  • Example 2 using the immunochromatographic test piece of the present invention (impregnated with polystyrene sulfonic acid and salt), the position where the anti-mouse IgG antibody was solid-phased even in the case of a saliva-treated sample However, particle deposition was easily confirmed even at the position where the anti-Mycoplasma pneumoniae antibody was immobilized. That is, it is clear that the method of the present invention more effectively reduces the influence on the antigen-antibody reaction due to the interfering substance derived from the living body than the conventional method.
  • Examples 11 to 17 Type of polymer polymerized with hydrophobic cyclic monomer having ionic functional group
  • Test pieces containing a predetermined amount (40 ⁇ g / test piece) of various active agents (Table 2) and a predetermined amount (4 ⁇ mol / test piece) of sodium chloride were prepared. Using this, the inhibitory effect on the interfering substances in saliva was confirmed by the same method as in Example 2. The results are shown in Table 2.
  • the average molecular weight of each surfactant is 10,000 to 30,000 for PS-1, 50,000 to 100,000 for PS-5, 16000 for Poly PS-1900, 3000 to 4000 for Demol NL, and 7000 for Demol EP. 8000.
  • Example 3 Types of inorganic salts
  • PS-1 Tosoh
  • a test piece of the present invention was prepared which contained a predetermined amount (4 ⁇ mol / test piece) of various inorganic salts (Table 3).
  • the inhibitory action on interfering substances in saliva was confirmed. The results are shown in Table 3.
  • Example 18 Advantage obtained by using a polymer obtained by polymerizing a hydrophobic cyclic monomer having an ionic functional group and an inorganic salt in the same manner as in Examples 1 and 2, and a hydrophobic cyclic monomer having an ionic functional group
  • PS-1 trade name, Tosoh

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Abstract

被検試料に含まれるイムノクロマト法における妨害物質による影響を抑制し、被検試料中の被検出物質を、被検試料の試験に供される量によらず、正確に、特異的に測定することを可能にするイムノクロマト試験片及びそれを用いたイムノクロマト法が開示されている。イムノクロマト試験片は、上流側からサンプルパッドと、標識体領域と、検出領域と、吸収帯とを具備するイムノクロマト試験片であって、標識体領域よりも上流に、イオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマーが含浸されている。

Description

イムノクロマト試験片及びそれを用いたイムノクロマト法
　本発明は、被検試料に含まれる妨害物質による影響を抑制することが可能なイムノクロマト試験片及びそれを用いたイムノクロマト法に関する。
　臨床試験において、生体試料を被検試料とした免疫学的測定法は多数存在し、その被検出物質に結合するリガンドとの反応に影響を与える妨害物質が、生体試料中に存在することが知られている。妨害物質による影響の抑制には、分子量が１０００ないし１０万であるイオン性界面活性剤の使用が既に報告されている（特許文献１）。
　妨害物質による影響は、イムノクロマトを原理とする迅速診断薬においては偽陰性あるいは偽陽性として見られることがある。また、イムノクロマトを原理とする迅速診断薬の多くは、ウイルスまたは細菌感染症を迅速・簡便に測定し、治療方針を決定する一つの手段として広く使用されている。上述の偽陽性あるいは偽陰性は、イムノクロマトを原理とする迅速診断薬において、間違った治療を促し、治療を遅らせ、時には死に至る場合もある。
　特に、偽陰性は正確な診断・治療の妨げとなるため、非常に大きな問題である。この偽陽性及び偽陰性を防止するために、硫酸基を２個以上有する化合物を含む検体処理液で検体を処理する方法が報告されている。（特許文献２）。
特開２００５－２４１４１５号公報 特開２０１４－１４９１８９号公報
　本発明の目的は、被検試料に含まれるイムノクロマト法における妨害物質による影響を抑制し、被検試料中の被検出物質を、被検試料の試験に供される量によらず、正確に、特異的に測定することを可能にするイムノクロマト試験片及びそれを用いたイムノクロマト法を提供することである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、イオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマーを、イムノクロマト試験片の特定の部位に含浸させることにより、妨害物質による影響を抑制し、被検試料中の被検出物質を、被検試料の試験に供される量によらず、正確に、特異的に測定することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、上流側からサンプルパッドと、標識体領域と、検出領域と、吸収帯とを具備するイムノクロマト試験片であって、標識体領域よりも上流に、イオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマーが含浸されているイムノクロマト試験片を提供する。また、本発明は、上記本発明のイムノクロマト試験片を用いて行うイムノクロマト法を提供する。
　本発明のイムノクロマト試験片によれば、妨害物質による影響を抑制し、被検試料中の被検出物質を、被検試料の試験に供される量によらず、正確に、特異的に測定することが可能である。
典型的なイムノクロマト試験片の構造を模式的に示す図である。
　本発明は、偽陽性及び偽陰性、特に偽陰性を防止し、被検出物質を正確に測定することを可能にするイムノクロマト試験片に係る。ここで、偽陽性とは、検体中に被検出物質が含まれていないのにもかかわらず、アッセイにおいて陽性を示すシグナルが発生することをいい、偽陰性とは、検体中に被検出物質が含まれているのにもかかわらず、アッセイにおいて陽性を示すシグナルが発生しないことをいう。例えば、イムノクロマト法（イムノクロマトグラフィー法）においては、検体中に被検出物質が存在する場合、固定化した物質-被検出物質-標識試薬の複合体が固相支持体上に形成され、該複合体から発する標識試薬のシグナルが発生するが、偽陰性においては、上記の複合体が形成されない等の理由によりシグナルの発生が阻害されてしまう。
　イムノクロマト試験片は、測定対象物（抗原等）を捕捉する抗体（抗体１）が固定化された検出領域を有する支持体、移動可能な標識抗体（抗体２）を有する標識体領域、検体を滴加するサンプルパッド、展開された検体液を吸収する吸収帯、これら部材を１つに貼り合わせるためのバッキングシートを具備する。
　なお、検出領域の数および標識体領域に含まれる標識抗体の種類は１つに限られるものではなく、複数の測定対象物に対応する抗体を用いることで、２つ以上の抗原を同一の試験片にて測定することができる。
　図１は、典型的なイムノクロマト試験片の好ましい１形態を示した図である。なお、イムノクロマト試験片は、図１に示すものに限定されるものではない。図１中、参照番号１が支持体、参照番号２が標識体領域、参照番号３が検出領域、参照番号４がサンプルパッド、参照番号５が吸収帯、参照番号６がバッキングシートを指している。
　図１の上が上面図、下が切断断面図である。図の例では、バッキングシート上に２個の検出領域が形成された支持体、吸収帯、標識体領域、サンプルパッドらがそれぞれ積層されている。そして図示のように、吸収帯の一方の端部と支持体の一方の端部、支持体の他方の端部と標識体領域の一方の端部、標識体領域の他方の端部とサンプルパッドの一方の端部がそれぞれ重ね合わされており、これにより連続したラテラルフローの流路が形成されている。
　支持体は、被検物質（抗原）を捕捉するための抗体を固定化する性能を持つ材料であり、かつ液体が水平方向に通行することを妨げない性能を持つ。好ましくは、毛細管作用を有する多孔性薄膜であり、液体およびそれに分散した成分を吸収により輸送可能な材料である。支持体を成す材質は特に限定されるものではなく、例えばセルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ガラス繊維、ナイロン、ポリケトンなどが挙げられる。このうちニトロセルロースを用いて薄膜としたものがより好ましい。
　標識体領域は、標識抗体を含む多孔性基材から成り、基材の材質は一般的に用いられているガラス繊維や不織布等を用いることができる。該基材は、多量の標識抗体を含浸させるために、厚さ0.3mm～0.6mm程度のパッド状であることが好ましい。
　検出領域は、被検物質（抗原）を捕捉する抗体が固定化された支持体の一部の領域を指す。検出領域は、抗原を捕捉するための抗体を固定化した領域を少なくとも１つ設ける。
　サンプルパッドは、検体または検体を用いて調製された試料を滴加するための部位であり、吸水性を持つ多孔性材料である。該材料には一般的に用いられるセルロース、ガラス繊維、不織布等を用いることができる。多量の検体を免疫測定に用いるために、厚さ0.3mm～1mm程度のパッド状であることが好ましい。なお、サンプルパッドと前述の標識体領域はあくまで機能的な区別であって、必ずしも個別の材料である必要はない。すなわち、サンプルパッドとして設置した材料の一部領域が標識体領域の機能を有することも可能である。
　吸収帯は、支持体に供給され検出領域で反応に関与しなかった成分を吸収するための部材である。該材料には、一般的な天然高分子化合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高いろ紙、スポンジ等を用いることができるが、検体の展開促進のためには吸水性が高いものが好ましい。
　バッキングシートは、前述の全ての材料、すなわち支持体、サンプルパッド、標識体領域、吸収帯らが、部分的な重なりをもって貼付・固定されるための部材である。バッキングシートは、これら材料らが最適な間隔で配置・固定されるのであれば、必ずしも必要ではないが、製造上あるいは使用上の利便性から、一般的には用いた方が好ましい。
　図１で説明した形態の試験片において、検体は、サンプルパッド、標識体領域、支持体、検出領域、吸収帯らの一連の接続により形成された多孔性流路を通過する。よって本形態においては、これら全てが検体移動領域となる。各構成材料の材質や形態によって、検体が材料内部を浸透せず界面を通行する形態もありうるが、本明細書で定義する検体移動領域は材料の内部か界面かを問わないため、該形態の試験片も本明細書の範囲に含まれる。
　本発明のイムノクロマト試験片では、標識体領域よりも上流（検体の流れの上流）に、すなわち、サンプルパッド内又はサンプルパッドと標識体領域との間に、イオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマーが含浸されている。これにより、被検試料中の被検出物質を被検試料の試験に供される量によらず、正確に、特異的に測定することが可能になる。
　前記ポリマーは、サンプルパッドに含浸させてもよいし、サンプルパッドとは別の多孔性材料に含浸させて、サンプルパッドと標識体領域との間に配置してもよい。
　本発明で用いられるイオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマーは以下の特徴を持つ。
　イオン性官能基としては、陰イオン性官能基か陽イオン性官能基かを問わず、スルホン基若しくはその塩、カルボン酸若しくはその塩又はアミン（水溶液中でイオン化される第４級アミン等）が好ましく、特にスルホン基又はその塩が好ましい。
  また、疎水性環としては、芳香環やシクロアルキル環が挙げられ、酸素原子、窒素原子又はイオウ原子等を含む複素環であってもよいし、それらが縮合した縮合環であってもよい。疎水性環としては芳香環が好ましく、芳香環としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環等が例示され、好ましくはベンゼン環又はナフタレン環、さらに好ましくはベンゼン環である。
　本発明に用いられる好ましいポリマーとして、ポリアネト－ルスルホン酸ナトリウム塩、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム塩（PS-1、PS-5、PS-50、PS-100(商品名、東ソー社製)等）、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物のナトリウム塩、芳香族スルホン酸ホルマリン縮合物のナトリウム塩（具体的には、ディスロ－ル（商品名、日本乳化剤社製）、デモ－ル（商品名、花王社製）、ポリティＰＳ－１９００（商品名、ライオン社製）、ポリティＮ－１００Ｋ（商品名、ライオン社製）等）を挙げることができる。
  また、本発明で用いられる好ましいポリマーとして、繰返し単位が、下記一般式[I]で表されるものを挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
ただし、式[I]中、Arは疎水性環、Ｘはイオン性官能基、R1ないしR3は互いに独立に水素原子又はアルキル基を示し、nは０ないし１０の整数を示し、Arを構成する各炭素原子に結合している水素原子は、本発明の効果を阻害しない置換基で置換されていてもよい。
　上記一般式[I]において、Ｘ及びArは、それぞれ上記したイオン性官能基及び疎水性環である。R1ないしR3がアルキル基の場合、低級（炭素数１～４、以下同じ）アルキル基が好ましい。また、ｎは０ないし３が好ましい。また、Arを構成する各炭素原子に結合している水素原子は、本発明の効果を阻害しない置換基で置換されていてもよく、このような置換基の例として、低級アルキル基及び低級アルコキシル基を挙げることができる。
  一般式[I]で表される繰返し単位のうち、下記一般式[II]で表されるものが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　式[II]中、Ｍは、水溶液中で１価の陽イオンとなる原子又は基、好ましくはナトリウムやカリウムのようなアルカリ金属、R1ないしR3は、互いに独立に水素原子又は低級アルコキシル基、R4ないしR6は、互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す。
  上記一般式[I]で表される繰返し単位のうち、特に好ましいものとして、下記式[III]で表されるアネトールスルホン酸塩、下記式[IV]で表されるスチレンスルホン酸塩及び下記式[V]で示されるナフタレン酸スルホン酸ホルマリン縮合物塩を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
ただし、式[III]、[IV]及び[V]中、Ｍは式[I]と同義であり、好ましくはナトリウムやカリウムのようなアルカリ金属である。
  上記ポリマーの分子量は、好ましくは１０００～１０万であり、さらに好ましくは、１０００～６万である。
　上記繰返し単位は、１種のみでも２種以上を組み合わせて採用することもできる。本発明に用いられるポリマーは、上記繰返し単位のみから成ることが好ましいが、本発明の効果に悪影響を与えない範囲で他の単位を含んでいてもよい。通常、このような他の単位のポリマー中の含量は、２０モル％以下、好ましくは１０モル％以下、さらに好ましくは５モル％以下である。
　本発明に用いられるポリマーの使用量は、特に限定されないが、通常、イムノクロマト試験片の一試験片あたり0.01μg～1mg程度であり、好ましくは0.1μg～0.1mg程度である。もっとも、使用する高分子イオン性界面活性剤の種類、使用する無機塩類の種類、検体浮遊液の組成や滴加量などにより効果が得られる最適な量を選択することが好ましい。
　上記ポリマーと共に、無機塩類を含浸させることが、妨害物質による影響をさらに排除する上で好ましい。無機塩類としては、ナトリウム化合物、カリウム化合物、セシウム化合物、マグネシウム化合物、カルシウム化合物、ストロンチウム化合物等の無機化合物のうち水溶性のもの及びそれらを組み合わせたものが好適に用いられるがそれらに限定されない。塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ヨウ化ナトリウム、臭化ナトリウム等が好ましく、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムが特に好ましい。
　本発明の無機塩類の使用量は、特に限定されないが、通常、イムノクロマト試験片の一試験片あたり0.01μmol~1m mol程度であり、好ましくは0.1μmol～0.1mmol程度である。もっとも、使用する高分子イオン性界面活性剤の種類、使用する無機塩類の種類、検体浮遊液の組成や滴加量などにより効果が得られる最適な量を選択することが好ましい。
　図１の形態に基づき、本発明の試験片の使用方法について述べる。測定は、検体または検体を用いて調製された試料をサンプルパッドに供することにより開始される。供する検体試料は予め検体浮遊液に浮遊してもよいが、検体を直接サンプルパッドに供してもよい。
　サンプルパッドに供された検体は毛管作用によって標識体領域、支持体、吸収帯へと順次、水平方向に展開される。標識体領域では検体試料の展開と共に標識抗体が液中に放出され支持体へと展開される。検体試料中に抗原が存在する場合において、支持体の検出領域では捕捉抗体により抗原が特異的に捕捉され、なおかつ抗原は標識抗体とも特異的反応により複合体を形成する。これにより検出領域では抗原を介した抗体のサンドイッチが成立し、標識抗体－抗原複合物を検出領域にて測定することができる。
　本発明のイムノクロマト試験片を用いた方法において、検体が、サンプルパッドから標識体領域へ展開するまでの間に、イオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマー及び好ましくはポリマーと無機塩類と接触することで、検体中の妨害物質による影響が抑制される。
　従来は検体中の妨害物質による影響を回避するために、予め検体浮遊液に妨害物質による影響を抑制する試薬を添加しておき、検体を検体浮遊液に浮遊させることで回避していた。しかし、生体試料からなる検体はスワブ等で定量せずに採取することから、検体量にバラつきがあり、その結果、過剰量の検体により検体浮遊液が希釈されることで妨害物質による影響を抑制する試薬も希釈され、十分な抑制効果が得られないという問題が起こる。本発明は、予め標識体領域よりも上流の位置にイオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマー、好ましくはポリマーと無機塩類を含浸させた部材を用い、常に一定量をサンプルパッドに供することで、妨害物質による影響を抑制する試薬が効果を失う程に希釈されることなく、正確に、特異的に測定できる。
　本発明の方法において、測定対象となる生体試料は、特に限定されないが、妨害物質の影響を抑制するという本発明の効果を大いに発揮できる生体試料が好ましく、血清、血漿、血液、尿、便、唾液、組織液、髄液、拭い液等の体液等又はその希釈物が好ましい。特に、生体の粘膜由来の物質が混入している検体、喀痰、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、角結膜拭い液、糞便検体等が好ましい。
　本発明のイムノクロマト試験片を用いた方法において、測定対象となる被検出物質はイムノアッセイ、すなわち抗原抗体反応を利用したアッセイで測定し得る抗原又は抗体である。抗原としては抗体を作製し得るものなら如何なる抗原でもよく、例えば、タンパク質、多糖類、脂質等が挙げられる。これらの物質を含む原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス等も測定し得る。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１及び２、比較例１～４
唾液中の妨害物質の影響と従来法と本発明法による妨害物質の抑制効果
１．抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
　抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液及び抗マウスＩｇＧ抗体を準備し、ＰＥＴフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンのサンプルパッド側に抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体、吸収体側に抗マウスＩｇＧ抗体をそれぞれ線状に塗布した。その後、ニトロセルロースメンブレンを４５℃、３０分間乾燥させ、抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体固定化メンブレンを得た。このメンブレンを本実施例において、「抗体固定化メンブレン」と呼ぶ。
２．抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
　抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。この粒子を、本実施例において、「抗体固定化粒子」と呼ぶ。
３．抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布・乾燥
　２で作製した抗体固定化粒子をグラスファイバー不織布の所定量１．０μｇを塗布し、４５℃、３０分間乾燥させた。得られた不織布を、本実施例において、「乾燥パッド」と呼ぶ。
４．妨害物質抑制成分含浸不織布の作製
　ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（分子量14000)、ＮａＣｌを所定量になるようＴｘ１００と共に不織布に塗布、乾燥し、妨害物質抑制成分含浸不織布を得た。（一試験片あたり、8μgポリスチレンスルホン酸ナトリウム、40μmol　NaCl）
５．マイコプラズマ・ニューモニエ試験片の作製
　１で作製した抗体固定化メンブレン、３で作製した乾燥パッド、４で作製した妨害物質抑制成分含浸不織布を他部材（バッキングシート、吸収帯）と貼り合せて５ｍｍ幅に切断し、マイコプラズマ・ニューモニ試験片とした。妨害物質抑制成分含浸不織布をサンプルパッドとして用いた試験片を本実施例において、「本発明試験片」と呼ぶ。４で作製した妨害物質抑制成分含浸不織布の代わりに、何も塗布していない同部材を用いて同様の試験片を作製し、比較例に使用した。何も塗布していない不織布をサンプルパッドとして用いた試験片を「従来法試験片」と呼ぶ。なお、試験片は、検体の流れに沿って、上流から、サンプルパッド、乾燥パッド（標識体領域）、抗体固定化メンブレン（検出領域）、吸収帯を具備するものである。
６. 唾液処理
　スワブを口に含み、よく唾液を吸わせて、これを検体処理液（クイックナビ-検体浮遊液；デンカ生研社製）に浮遊した（唾液処理検体）。また、スワブを口に含み、よく唾液を吸わせて、これを検体処理液（クイックナビ-検体浮遊液；デンカ生研社製）にポリスチレンスルホン酸ナトリウムを添加したものに浮遊した（従来法唾液処理検体）。
７．　測定
　検体処理液そのままあるいは唾液処理検体に、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原を添加・混和し、そのうち50μLを本発明試験片及び従来法試験片に滴加した。15分後に抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体を固定化した所定位置上の着色ポリスチレン粒子の堆積の有無とその程度を目視判定にて行った。その線状の堆積の程度が強いものを＋とし、判定が難しい場合を±、堆積がみられなかったものを－とした。
８. 結果
　結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表１に示されるように、従来の試験片（ポリスチレンスルホン酸ナトリウムを含浸せず）では、本来＋（陽性）と判定されるべき抗原量が存在するにもかかわらず、唾液処理した検体の場合には、唾液中の妨害物質により判定結果が－（偽陰性）となった（比較例１、２）。特許文献１に記載されているように、検体にポリスチレンスルホン酸ナトリウムを添加した場合でも、唾液処理検体では判定が不明瞭となった（比較例４）。これに対し、本発明の試験片を用いた場合には、唾液処理の有無によらず明瞭に判定することができた（実施例１、２）。また、唾液処理検体を適用した比較例２では、抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体を固定化した所定位置上の着色ポリスチレン粒子の堆積が無いのみならず、抗マウスＩｇＧ抗体を固相化した位置にも粒子の堆積がみられなかった。一方、従来法に相当する液系でのポリスチレンスルホン酸ナトリウムの添加条件（比較例４）では抗マウスＩｇＧ抗体を固相化した位置での粒子の堆積は回復するものの、抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体を固相化した位置ではわずかにしか堆積がみられなかった。それら従来法と比較して、本発明のイムノクロマト試験片（ポリスチレンスルホン酸と塩を含浸）を用いた実施例２では、唾液処理した検体であっても、抗マウスＩｇＧ抗体を固相化した位置でも、抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体を固相化した位置でも粒子の堆積を容易に確認できた。すなわち、従来法に比べ本発明法は、生体由来の妨害物質による抗原抗体反応への影響をより効果的に低減したことは明らかである。
実施例１１～１７
イオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマーの種類
　実施例１及び２と同様にして、イオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマーを含有する市販の界面活性剤各種（表２）を所定量(40μｇ／試験片)含有し、かつ塩化ナトリウムを所定量（4μmol／試験片）含有する試験片を作製した。これを用いて、実施例２と同様の方法で、唾液中の妨害物質への抑制作用を確認した。結果を表２に示す。なお、各界面活性剤の平均分子量は、PS-1が１万～３万、PS-5が５万～１０万、ポリティPS-1900が１６０００、デモールNLが３０００～４０００、デモールEPが７０００～８０００である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表２に示すように、ポリマーの種類により効果の大小はあるもの、いずれの場合もポリマーを含浸することにより明らかな改善効果がみられた。
実施例３　無機塩類の種類
１．実施例１及び２と同様の方法で、イオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマーを含有する市販の界面活性剤であるPS-1（東ソー）を所定量(2μｇ／試験片)含有し、かつ各種無機塩類（表３）を所定量（4μmol／試験片）含有する本発明試験片を作製した。
実施例２と同様の方法で、唾液中の妨害物質への抑制作用を確認した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　イオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマーを含有する市販の界面活性剤と共に、各種無機塩類を併用することで、生体由来の妨害物質による抗原抗体反応への影響が低減されたことを確認した。また、無機塩類の種類により程度に大小はあるものの、全ての無機塩類で妨害物質への抑制効果は確認された。
実施例１８
イオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマーと無機塩類を併用することで得られる優位性
　実施例１及び２と同様の方法で、イオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマーを含有する市販の界面活性剤であるPS-1（商品名、東ソー）を所定量(表４)含有し、かつ塩化ナトリウムを所定量（表４）含有する試験片を作製した。実施例２と同様の方法で、唾液中の妨害物質への抑制作用を確認した。さらに、バックグラウンドの高さ(テストライン以外のメンブレンへの粒子残りによるものであり、視認性の低下をもたらす)も評価した。結果を表４及び表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 　　　　　　　　　　　　　　　　　※太枠内本実施例
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 　　　　　　　　　　　　　　　　　※太枠内本実施例
　表４に示すように、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム(PS-1)を単独で含浸させた場合、低濃度では判定が不明瞭となった（高濃度では明瞭）が、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムと塩化ナトリウムを併用することで、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムが低濃度の場合でも明瞭に判定できた。また、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム単独の場合、高濃度ではバックグランドが高くなり（表５）視認性が低下したが、塩化ナトリウムを併用した場合には、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムが高濃度の場合でもバックグランドが低かった。このことから、PS-1単独、NaCl単独で使用するよりも、これらを併用することは明らかな優位性を持つといえる。
　１　支持体（検出領域を含む）
　２　標識体領域
　３　検出領域
　４　サンプルパッド
　５　吸収帯
　６　バッキングシート

Claims (10)

  1. 　上流側からサンプルパッドと、標識体領域と、検出領域と、吸収帯とを具備するイムノクロマト試験片であって、標識体領域よりも上流に、イオン性官能基を有する疎水性環式モノマーが重合されたポリマーが含浸されているイムノクロマト試験片。
  2. 前記ポリマーと共に無機塩類を含浸させた請求項１記載のイムノクロマト試験片。
  3.   前記ポリマーの繰返し単位が、下記一般式[I]で表される請求項１又は２記載のイムノクロマト試験片。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （ただし、Arは疎水性環、Ｘはイオン性官能基、R1ないしR3は互いに独立に水素原子又はアルキル基を示し、nは０ないし１０の整数を示し、Arを構成する各炭素原子に結合している水素原子は、本発明の効果を阻害しない置換基で置換されていてもよい）。
  4.   前記疎水性環式モノマーが、芳香族モノマーである請求項１～３のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片。
  5.   前記芳香族モノマーがベンゼン環を含有する請求項４記載のイムノクロマト試験片。
  6.   前記イオン性官能基がスルホン基若しくはその塩、カルボン酸若しくはその塩又はアミンである請求項１ないし５のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片。
  7.   前記イオン性官能基がスルホン基又はその塩である請求項６記載のイムノクロマト試験片。
  8.   前記ポリマーの繰返し単位が、下記一般式[II]で表される請求項３記載のイムノクロマト試験片。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （ただし、Ｍは水溶液中で１価の陽イオンとなる原子又は基、R1ないしR3は、上記一般式[I]におけるR1ないしR3と同義、R4ないしR6は互いに独立に、水素原子、低級アルコキシル基又は低級アルキル基を示す）
  9.   前記繰返し単位が、アネトールスルホン酸塩又はスチレンスルホン酸塩である請求項７記載のイムノクロマト試験片。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片を用いて行うイムノクロマト法。
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