WO2016125266A1 - 延寿命活性を有する物質をスクリーニングする方法 - Google Patents
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- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
Definitions
- the present invention relates to a method for screening a substance having one or more activities selected from longevity activity, aging-inhibiting activity, obesity-inhibiting activity, insulin sensitivity-reducing activity, adipose tissue mass-increasing activity, and diabetes-improving activity,
- the present invention relates to a reagent used for the screening and a screening kit containing the reagent.
- the present invention relates to a non-human knockout animal in which a part or all of the base sequence encoding Mex-3B protein is destroyed or mutated.
- the present invention relates to a treatment method comprising the step of knocking out the function of Mex-3B protein in a subject.
- the mechanism related to life extension control has not been fully elucidated, and the emergence of a more effective life extension agent is awaited.
- Regarding the elucidation of the mechanism for controlling the longevity for example, the fact that the lifespan is significantly shortened by obesity, but the fact that the lifespan is significantly extended by restricting calorie intake in animal experiments has been elucidated (Non-patent Document 1). ). As a result, it is recognized that elucidation of lipid metabolism control is important for prolonging life.
- Patent Document 1 describes an apoptosis-inducing gene called D8.
- D8 described in Patent Document 1 is also referred to as Mex-3B.
- Mex-3B apoptosis-inducing gene
- the present invention elucidates the life span control phenomenon from an approach at the gene level, and further extends the life span activity, aging suppression activity, obesity suppression activity, insulin sensitivity reduction improvement activity, fat tissue mass increase suppression activity, and diabetes improvement activity
- An object of the present invention is to provide a method for screening a substance having one or more activities selected from:
- the present invention provides a non-human knockout animal in which a part or all of the base sequence encoding Mex-3B protein is destroyed or mutated, and a treatment method including a step of knocking out the function of Mex-3B protein in a subject. The purpose is to do.
- the present inventors surprisingly show that the Mex-3B protein knockout mouse inhibits fat accumulation; the body weight is reduced and insulin sensitivity is increased. Found that; and extended life.
- life span activity e.g., life span activity, aging inhibitory activity, obesity inhibitory activity, insulin sensitivity reduction improvement activity, adipose tissue mass increase inhibitory activity, and diabetes improvement activity.
- the present inventors have found a method of screening a substance having one or more activities selected from
- the present invention is as follows.
- a method for screening a substance having one or more activities selected from the activity of suppressing the increase in diabetes and the activity of improving diabetes comprising at least the following steps: (I) contacting a candidate substance or a control with a Mex-3B protein-related factor or a Mex-3B protein-related non-human organism; (Ii) a step of measuring an index value; (Iii) detecting the action of the candidate substance by comparing the result based on (i) and (ii) above with the result of the control; and (iv) selecting a candidate substance whose value serving as the index has changed
- Mex-3B protein-related factor or a Mex-3B protein-related non-human organism is (1) Mex-3B protein-related factor is (2) a nucleic acid comprising a base sequence encoding Mex-3B protein, (3) Mex-3B protein, (4) an antibody against Mex-3B protein, and (5) a non-human knockout animal in which part or all of the base sequence encoding Mex-3B protein is destroyed or mutated,
- the method according to [1] which is at least one selected from the group consisting of:
- Mex-3B protein-related factor is (2) a nucleic acid comprising a base sequence encoding Mex-3B protein, (3) Mex-3B protein, (4) an antibody against Mex-3B protein, and (5) a non-human knockout animal in which part or all of the base sequence encoding Mex-3B protein is destroyed or mutated, Longevity activity, anti-aging activity, obesity-inhibiting activity, activity to reduce insulin sensitivity, suppression of increase in adipose tissue mass, including Mex-3B protein-related factor or Mex-3B protein-related non-human organism selected from the group consisting of A screening reagent for a substance having one or more activities selected from an activity and an activity for improving diabetes.
- One or more activities selected from the longevity activity, aging inhibition activity, obesity inhibition activity, insulin sensitivity reduction improvement activity, adipose tissue mass increase inhibition activity, and diabetes improvement activity comprising the screening reagent according to [3]
- Non-human knockout animal in which a part or all of the base sequence encoding Mex-3B protein is destroyed or mutated, extending life span, suppressing aging, suppressing obesity, improving insulin sensitivity reduction, fat
- a non-human knockout animal having one or more phenotypes selected from the group consisting of suppression of increase in tissue mass and improvement of diabetes.
- a substance having one or more activities selected from long-lived activity, aging-inhibiting activity, obesity-inhibiting activity, insulin sensitivity-reducing activity, adipose tissue mass-increasing activity, and diabetes-improving activity can be conveniently obtained.
- the method can be efficiently screened.
- FIG. 1 is a diagram showing gene targeting used for the production of the Mex-3B knockout mouse of the present invention.
- FIG. 2 is a fluorescence photograph showing the results of in-situ hybridization of G418-resistant clones used for the production of Mex-3B knockout mice.
- FIG. 3 is a photograph showing the results of genotyping PCR analysis of Mex-3 + / + , Mex-3 +/ ⁇ and Mex-3B ⁇ / ⁇ mice used for the production of Mex-3B knockout mice.
- FIG. 4 is a photograph showing an analysis result by Western blotting using an anti-Mex-3B antibody used for the production of a Mex-3B knockout mouse.
- FIG. 1 is a diagram showing gene targeting used for the production of the Mex-3B knockout mouse of the present invention.
- FIG. 2 is a fluorescence photograph showing the results of in-situ hybridization of G418-resistant clones used for the production of Mex-3B knockout mice.
- FIG. 3
- FIG. 5 is a graph showing the change over time in the body weight of Mex-3 + / + , Mex-3 +/ ⁇ and Mex-3B ⁇ / ⁇ mice.
- FIG. 6 is a graph showing the lifespan of wild-type mice (WT), Mex-3B heterodeficient mice (HT), and Mex-3B homodeficient (knockout: KO) mice.
- FIG. 7 is a photograph and graph showing an increase in adipose tissue of Mex-3B knockout mice and wild type mice.
- FIG. 8 is a graph showing insulin sensitivity of 60-day-old male Mex-3B knockout mice and wild-type mice.
- FIG. 9 is a graph showing insulin sensitivity of 600-day-old male Mex-3B knockout mice and wild-type mice.
- FIG. 10 shows the results of an analysis of the mouse aging expression system.
- FIG. 11 shows the change in body weight in the high fat diet load experiment of mice and the result of the insulin load experiment.
- FIG. 12 shows the results of measurement of adipose tissue weight in mice loaded with a high fat diet.
- FIG. 13 shows the measurement results of serum components of mice loaded with a high fat diet.
- the present invention relates to a method for screening a substance having one or more activities selected from longevity activity, aging-inhibiting activity, obesity-inhibiting activity, insulin sensitivity-reducing activity, adipose tissue mass-increasing activity, and diabetes-improving activity,
- the present invention relates to a reagent used for the screening and a screening kit containing the reagent.
- the present invention relates to a non-human knockout animal in which part or all of the base sequence encoding Mex-3B protein is destroyed or mutated.
- the present invention relates to a treatment method comprising the step of knocking out the function of Mex-3B protein in a subject. The present invention will be described below.
- the present invention uses a Mex-3B protein-related factor or a Mex-3B protein-related non-human organism to select a long-lived activity, aging-inhibiting activity, obesity-inhibiting activity, or insulin sensitivity reduction from among candidate substances.
- the present invention relates to a method for screening a substance having one or more activities selected from the activity for improving the above, activity for suppressing the increase in the amount of adipose tissue, and activity for improving diabetes.
- the outline of the present invention will be described below.
- Mex-3B protein is known to have post-transcriptional regulation and apoptosis-inducing functions.
- apoptosis by enhancing the expression of the apoptosis promoting factor Bim by post-transcriptional control.
- the structure of the Mex-3B protein it is known that there are two KH domains, which are RNA binding domains, on the N-terminal side, and a RING finger domain involved in ubiquitination on the C-terminal side.
- the present inventors prepared a knockout mouse in which the Mex-3B gene was deleted (FIG. 1), analyzed the characteristics of the knockout mouse, and found the following findings: a) Mex-3B knockout mouse male has a significantly longer lifespan than that of the wild type (FIG. 6) and suppresses aging (FIG. 10); b) Mex-3B knockout mice have small adipose tissue (FIGS. 7 and 12); and c) Mex-3B knockout mice have a significantly reduced body weight compared to wild type (FIG. 5), and males are insulin sensitive. Is increased (FIGS. 8, 9 and 11), and the increase in diabetes marker is suppressed (FIG. 13); Got.
- Mex-3B knockout mice have a long life span, aging is suppressed, obesity associated with aging is suppressed, an increase in the amount of adipose tissue is also suppressed, insulin sensitivity reduction is improved, and diabetes is improved Was shown to be. From this, it was newly shown that the Mex-3B protein is an RNA-binding protein related to metabolic control and is involved in the lifetime control mechanism.
- the present inventor considered that a substance that suppresses the expression or function of Mex-3B is a promising substance that is involved in the mechanism for extending the lifetime. Based on this, it is possible to screen for compounds having one or more activities selected from long-lived activity, aging-inhibiting activity, obesity-inhibiting activity, insulin sensitivity-reducing activity, adipose tissue mass-increasing activity, and diabetes-improving activity. It becomes.
- the screened substance is useful because it can be applied to a long-lived active agent having a completely new mechanism of action.
- the screening method of the present invention uses the above-mentioned Mex-3B protein-related factor or Mex-3B protein-related non-human organism, from among candidate substances, prolonging life activity, aging-inhibiting activity,
- An object of the present invention is to search for a substance having one or more activities (hereinafter also referred to as the activity of the present invention) selected from an obesity suppressing activity, an insulin sensitivity reducing activity, an adipose tissue mass increase inhibiting activity, and a diabetes improving activity. To do.
- the Mex-3B protein-related factor includes any substance that can be contacted with a candidate substance and can search for a substance having long-lived activity. Examples thereof include a nucleic acid containing a base sequence encoding Mex-3B protein, Mex-3B protein and an antibody thereof. Examples of Mex-3B protein-related non-human organisms include knockout animals (preferably non-human mammals) related to Mex-3B protein.
- sequence data of the Mex-3B protein for example, data registered in a database such as GenBank (NIH genetic sequence database) or DDBJ (DNA Data Bank of Japan) can be used.
- the cDNA of the human-derived Mex-3B protein has 3534 bases, and NM_032246 (SEQ ID NO: 1) is registered in GenBank, and the amino acid sequence is registered as NP_115622 (SEQ ID NO: 2) of 569 amino acid residues.
- the Mex-3B protein antibody includes, for example, a method of measuring expression of Mex-3B protein by Western blotting or ELISA using an anti-Mex-3B protein antibody that is specific to Mex-3B protein. can give.
- the antibody can be prepared using a known method.
- Examples of knockout animals related to Mex-3B protein include long-lived non-human knockout animals in which Mex-3B protein-related factors disrupt or mutate part or all of the base sequence encoding Mex-3B protein. .
- a substance that suppresses the function of the Mex-3B protein is a promising substance that participates in a mechanism for extending the lifetime. Therefore, a substance that suppresses the expression of Mex-3B protein is preferable as a candidate for a long-lived active agent in order to promote a long-life mechanism, and further, an aging inhibitor (anti-aging agent), an obesity inhibitor (anti-obesity agent), insulin It is also preferable as a candidate for a sensitivity reduction improving agent (insulin resistance improving agent), an adipose tissue mass increase inhibitor, and a diabetes therapeutic agent.
- a substance includes any substance as long as it has the above-mentioned properties.
- These compounds may be novel compounds or known compounds.
- These substances may form salts, and salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids) are used, especially physiologically acceptable.
- physiologically acceptable acids eg, inorganic acids
- bases eg, organic acids
- the acid addition salts are preferred.
- salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
- inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
- organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
- succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
- Examples of the screening method of the present invention include a method in which an expression vector operably linked to the Mex-3B gene is prepared and introduced into cells to express the Mex-3B protein.
- a method for preparing an expression vector in which a Mex-3B gene is operably linked to a gene encoding a labeling substance and introducing the expression vector into a cell for expression is described below.
- the labeling substance is used as a detection means for detecting the measurement index of the screening method of the present invention, and any one of a fluorescent labeling substance, a radiolabeling substance, and an antibody labeled with these labeling substances is used.
- ⁇ GFP green fluorescent protein
- Examples of the fluorescent labeling substance include GFP, EGFP (Enhanced-humanized GFP) or rsGFP (red-shift GFP), which are mutants modified with GFP (GFP variant). It is also possible to use GFP derived from yellow fluorescent protein (YFP), cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (FPBFP), and Renilla reniformis.
- the genes encoding them can be used in the present invention.
- the base sequences of the genes encoding these are known, and commercially available products can be used, or the sequence information can be easily obtained through public databases such as GenBank.
- the cell into which the expression vector has been introduced is divided into a test cell for contacting the candidate substance and an untreated control cell, and the labeled signal is detected by bringing the candidate substance into contact with the test cell by addition or the like.
- contact means that the candidate substance is treated so as to interact with the cell into which the expression vector has been introduced.
- the candidate substance is added to the cell culture system, or the cell is cultured in the presence of the candidate substance. It means to do anything.
- the “index value” in the screening method of the present invention refers to the expression level of a gene, mRNA or protein that serves as an index for searching for a substance that suppresses the expression of Mex-3B protein.
- the mRNA expression level or protein expression level of Mex-3B protein can be mentioned.
- index value in the screening method of the present invention is the degree of interaction between the Mex-3B protein and its target mRNA, and the change in the function of the target mRNA due to the interaction. May be.
- the expression level of Bim when the expression level of Bim varies due to the variation in the function of the target mRNA, the expression level of Bim can be used as an index.
- “measurement” in the screening method of the present invention means quantifying the value serving as the index in the cells or animals cultured under appropriate conditions.
- mRNA or protein of Mex-3B protein When a normal animal is used, the length of life, aging phenotype, body weight, adipose tissue weight, insulin sensitivity, or diabetes marker is measured. Quantification of mRNA or protein can be performed using a known method. mRNA can be quantified by, for example, Northern hybridization or quantitative RT-PCR, and protein can be quantified by, for example, Western blotting using an anti-Mex-3B protein antibody (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003).
- the signal intensity (signal intensity) of the labeling substance can be determined by quantifying by a method suitable for each labeling protein such as fluorescence intensity, band density in electrophoresis, or by visual observation. And the candidate substance when signal intensity is reduced rather than a control
- the expression of the Mex-3B protein is not suppressed, and the recombinant protein in which the expressed labeled protein and the Mex-3B protein are bound emits fluorescence.
- a candidate substance that can be a substance having the above-mentioned long-lived activity is added, since the expression of Mex-3B protein is inhibited, the label signal emitted from the cell after contacting the candidate substance is It becomes weaker than the intensity of the label signal emitted from the control cells.
- a candidate substance whose expression level is changed can be selected by measuring and comparing and detecting a specific gene expression level of the cell after contacting the control cell with the candidate substance.
- the labeling substance can be detected by immunoblot using an anti-labeled protein antibody such as an anti-GFP antibody, so that multiple samples can be processed in a short time, and high-throughput screening is performed. Can do.
- a candidate substance is administered to an animal or a part thereof, and a value that is a specific index for prolonging life in the present invention described in “Substances with prolonging life activity” is directly measured. And selecting a candidate substance that exhibits a value comparable to or higher than that of the Mex-3B protein knockout animal, which is the control, to screen for a substance having the activity of the present invention. The method of doing is also included. Since this method can evaluate the effect of a substance at an individual level as an in vivo system, it is preferable.
- the specific value of the “value to be used as an index” is as follows. For the animal administered with the candidate substance, the substance inhibits fat accumulation; decreases body weight; and increases insulin sensitivity. And so on. Candidate substances exhibiting these indices are preferred as substances that can extend the lifetime.
- the fat accumulation inhibition means that the accumulation of body fat is inhibited by suppressing or delaying the growth of adipose tissue in the body.
- Adipose tissue refers to a connective tissue composed of adipocytes and having a function of storing energy as fat.
- the adipose tissue related to the present invention includes any adipose tissue such as those under the skin in the body and those around the internal organs. Examples include epididymal fat tissue and abdominal fat. Fat accumulation can be measured using any known method.
- the change in body weight refers to the change in body weight over time and can be measured by a known method.
- Increased insulin sensitivity means a decrease in blood glucose level when insulin is administered, and an increase in insulin sensitivity means that the blood glucose level decreases more quickly due to insulin administration. Any known method for measuring blood glucose level can be used for evaluation of increased insulin sensitivity.
- mice examples include mice, rats, rabbits, guinea pigs, pigs, sheep and goats other than humans.
- a mouse that is easy to handle and easy to breed is preferable.
- a Mex-3B protein knockout animal used as a control can be produced using a known method.
- the knockout mouse in which a part of the Mex-3B protein shown in FIG. 1 is deleted is preferable for the screening method of the present invention.
- “Animal or part thereof” includes both the whole body of an animal's body and limited tissues or organs. In the case of limited tissues or organs, it includes those extracted from animals.
- Examples of the method for administering the candidate substance to the test animal include oral administration, intravenous injection, application, subcutaneous administration, intradermal administration, and intraperitoneal administration.
- the method is appropriately selected according to the symptoms of the test animal and the nature of the candidate substance. You can choose.
- the dosage of the candidate substance can be appropriately selected according to the administration method, the nature of the candidate substance, and the like.
- Candidate substances to be screened according to the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds (polymers or low molecular compounds), fermentation products, cell extracts, cell culture supernatants, and plant extracts. Fluids, tissue extracts of mammals (eg, mice, rats, pigs, cows, sheep, monkeys, humans, etc.), plasma and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds. There may be. These candidate substances may form a salt. As described above, the salts of candidate substances include physiologically acceptable acids (for example, inorganic acids and organic acids) and bases (for example, metal acids). ) And the like are used.
- physiologically acceptable acids for example, inorganic acids and organic acids
- bases for example, metal acids
- Mex-3B protein-related factor can be combined with another solvent or solute to form a composition.
- a composition for example, distilled water, pH buffer reagent, salt, protein, surfactant and the like can be combined.
- the reaction reagent has a label detectable by an appropriate chemical or physical detection means.
- a labeling agent used in a measurement method using such a labeling substance for example, a fluorescent substance, an enzyme, a radioisotope, a luminescent substance and the like are used. An ELISA method using an enzyme for labeling is widely used.
- luminescent substances such as H and 14 C include luciferin, lucigenin, luminol, and luminol derivatives.
- the reaction medium includes a buffer solution that gives optimum conditions for the reaction or is useful for stabilizing the reaction product, a stabilizer for the reactant, and the like.
- a candidate substance sample is composed of instructions for interpreting the results obtained by performing screening, reaction reagents, reaction medium in which the reaction is performed, and a substrate that provides a place for the assay.
- a verification sample for use as a comparison reference or for creating a calibration curve, a detector, and the like may be included.
- the detection means of the screening method of the present invention include those capable of detecting the label, such as a spectroscope, a radiation detector, and a light scattering detector.
- Non-human knockout animal of the present invention is a non-human knockout animal in which part or all of the base sequence encoding Mex-3B protein has been disrupted or mutated, and has an extended life span. And having one or more phenotypes selected from the group consisting of suppression of aging, suppression of obesity, improvement of insulin sensitivity reduction, suppression of increase in adipose tissue mass, and improvement of diabetes.
- a non-human knockout animal in which part or all of the base sequence encoding Mex-3B protein is disrupted or mutated is an animal in which the expression of Mex-3B has been lost or reduced, and should be prepared by methods known to those skilled in the art. Can do.
- a non-human mammal is preferable, and examples thereof include mice, rats, hamsters, guinea pigs, cows, pigs, goats, etc. Among them, rodents, more preferably mice.
- a non-human knockout animal can be prepared by arbitrarily converting the chromosomal Mex-3B gene using a genetic engineering technique such as gene targeting.
- a construct (targeting vector) containing a nonexistent Mex-3B gene is prepared based on a clone isolated from a genomic library, introduced into an ES cell, and homologous recombination is performed.
- a Mex-3B gene mutant clone in which is generated is obtained.
- “Mex-3B gene not having the ability to express” refers to the introduction of a mutation that inhibits the expression of Mex-3B, or a mutation that causes loss of the function of the protein encoded by the gene. It is a Mex-3B gene that does not express Mex-3B when transfected into a living body.
- Mutation can be introduced into the Mex-3B gene by removing a part or all of the base sequence of the Mex-3B gene and inserting or replacing another gene by a known genetic engineering technique.
- knockout mice in which the expression of Mex-3B is reduced or eliminated can be produced by disrupting the function of the promoter or exon, or shifting the codon reading frame.
- Examples of the gene to be introduced for destroying the function of the promoter or exon include a drug resistance gene, such as a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, preferably a neomycin resistance gene.
- any gene generally used in the gene targeting method can be used.
- ES cells can be established from blastocysts of non-human mammals.
- mouse ES cells include TT2 ES cells established from hybrid primary blastocysts between C57BL / 6 mice and CBA / JNCrj mice.
- Selection of Mex-3B gene mutant clones in which homologous recombination has occurred from ES cells into which the targeting vector has been introduced can be performed by analyzing the genotype of the clone into which the targeting vector has been introduced. Genotype analysis can be performed by PCR or Southern blotting.
- Mex- A deletion of the 3B gene can be detected.
- deletion of the Mex-3B gene can be detected based on the size of DNA detected using the Mex-3B gene or a DNA sequence in the vicinity thereof as a probe.
- the mutant clone can be easily selected using the drug resistance of the mutant clone.
- the Mex-3B gene mutant clone thus obtained was injected into a blastocyst or 8-cell stage embryo of a fertilized egg of a non-human mammal, and the uterus of a homologous non-human mammal made into a pseudopregnant state.
- a chimeric individual composed of cells having a normal Mex-3B locus and cells having a mutated Mex-3B locus.
- An individual in which a mutation has been introduced into one of the homologous chromosomes (hetero-deficient individual) or an individual in which the mutation has been introduced into both homologous chromosomes (homo-deficient individual) can be obtained by crossing between the chimeric individual and the wild-type individual. In general, heterozygous individuals are obtained by such crossing. Homo deficient individuals can be obtained by crossing heterogene deficient individuals.
- the acquired knockout animal has one or more phenotypes selected from the group consisting of prolonging lifespan, suppressing aging, suppressing obesity, improving insulin sensitivity, suppressing adipose tissue mass increase, and improving diabetes. Whether or not it has can be evaluated according to the method described in the examples of the present specification.
- Treatment method including the step of knocking out the function of Mex-3B protein
- the life of the subject can be prolonged, the aging can be suppressed,
- One or more selected from suppression of obesity, improvement of insulin sensitivity reduction, suppression of increase in adipose tissue mass, and improvement of diabetes can be achieved. That is, according to the present invention, there is provided a method for treating a subject, comprising a step of knocking out the function of Mex-3B protein in the subject.
- Mex-3B protein inhibitor that is, a drug that suppresses the expression and / or function of Mex-3B protein
- Mex-3B protein inhibitor selected by the screening method of the present invention is long-lived activity, aging inhibitory activity, obesity inhibitory activity, insulin sensitivity reduction improving activity, adipose tissue mass increase inhibitory activity, and diabetes improving activity
- a substance having one or more activities selected from the following can be used. Specifically, siRNA or LNA (Locked Nucleic Acid) targeting Mex-3B can be used, or a low molecular compound having a Mex-3B protein inhibitory action may be used.
- the administration method of the above Mex-3B protein inhibitor is not particularly limited, and it may be oral administration or parenteral administration.
- the dose of the Mex-3B protein inhibitor is not particularly limited, and can be appropriately set according to the weight of the subject, the degree of symptoms, the type of active ingredient, and the like.
- Example 1 The purpose of this example is to create a Mex-3B knockout mouse.
- the targeting vector was designed as shown in FIG. An approximately 2.5 kb genomic Mex-3B fragment (SEQ ID NO: 1) in BAC clone (GenBank Accession No. AC122736) was replaced with a neomycin resistance cassette (pgkbg2Neo) (SEQ ID NO: 3) to be deleted.
- This targeting vector was linearized and introduced into half the amount of embryonic stem cells of three 10 cm dishes that became confluent by electroporation. G418 resistant colonies were selected and confirmed to have undergone homologous recombination using primers specific for Mex-3B and the neomycin resistance cassette.
- the primers used are as follows.
- the resulting chimeric mouse male was mated with a balb / c mouse female to produce a heterozygote.
- the genotype of the offspring was identified by Genotyping PCR (FIG. 3). Proteins were collected from Mex-3B + / + or Mex-3B ⁇ / ⁇ thymus and spleen and confirmed by Western blotting for the presence of Mex-3B expression. As a result, it was shown that Mex-3B expression was not observed in the thymus and spleen of Mex-3B ⁇ / ⁇ (FIG. 4). Mex-3B +/ ⁇ mice were backcrossed to balb / c mice more than 10 times. Litters were used as experimental controls. Mex-3B -/- mice were born according to Mendel's law and were healthy for more than 10 months.
- Example 2 The purpose of this example is to measure the life span of Mex-3B knockout mice and compare it to wild type mice.
- KO Mex-3B knockout mice prepared in Example 1
- Example 3 The purpose of this example is to measure the weight of adipose tissue in Mex-3B knockout mice and compare it with wild type mice.
- the Mex-3B knockout (KO) mouse and wild type (WT) mouse prepared in Example 1 were subjected to statistical processing by measuring the spleen, epididymal fat tissue and kidney by the following method. First, body weights were measured after euthanizing the mice. Thereafter, the mouse was dissected and each organ was removed. The weight of each organ was measured by measuring the weight of each organ and interrupting with the body weight.
- the vertical axis of the graph represents the relative value when the weight of the organ per WT body weight is 1.
- Example 4 The purpose of this example is to perform an insulin sensitivity test of Mex-3B knockout mice and compare it with wild-type mice.
- the Mex-3B knockout (KO) mouse and wild type (WT) mouse prepared in Example 1 were fasted by the following method, an insulin sensitivity test was performed, the body weight was measured, and statistical processing was performed. That is, 60-day-old and 600-day-old male wild-type and Mex-3B knockout mice bred alone were fasted for 17 hours, and then glucose was intraperitoneally administered to each mouse at 2 mg / kg. Thereafter, blood was continuously collected from the tail vein of the mouse, and the blood glucose level was measured to examine insulin sensitivity.
- KO Mex-3B knockout
- Example 5 Analysis of mouse aging phenotype 600-day-old BALB line wild-type (WT) and Mex-3B homo-deficient (KO) males and females were sleeped by anesthesia, and the sores (inflammation) around the eyes were observed. Then, the number of individuals with a sore was counted. At the same time, the outer skin was peeled off from each mouse and the spine flexion was observed.
- WT wild-type
- KO Mex-3B homo-deficient
- mice have a reduced aging phenotype
- mice 13 to 18 weeks old male BALB line wild type mice and 13 to 18 Mex-3B-deficient mice were grouped according to body weight, bred alone, and normal diet (10 kcal % Fat, Normal Diet: ND) and high fat diet (60 kcal% Fat, High Fat Diet: HFD) (Research diets) were fed, and body weight was measured for 13 weeks. After breeding, the animals were fasted for 6 hours and sacrificed, and the weight of epididymal fat tissue and subcutaneous fat tissue in each group were measured. Student's t-test was used for the significant difference test of body weight and tissue weight.
- the measurement result of body weight is shown in FIG. 11A, and the measurement result of adipose tissue weight is shown in FIG.
- Mex-3B-deficient male mice are alleviated from worsening obesity associated with high-fat diet loading.
- the increase in adipose tissue associated with high-fat diet load is moderated.
- Insulin tolerance test Insulin Tolerance Test (ITT) Human recombinant Insulin (Invitrogen) diluted with PBS to 1 IU (International Unit) / kg was injected into the peritoneal cavity of BALB line wild-type and Mex-3B KO mice fasted for 4 hours under single breeding conditions. It was administered internally. Thereafter, blood glucose levels in the tail vein were measured over time at 0, 15, 30, 60, 90, and 120 minutes using Asensia Breeze 2 (Bayer Pharmaceutical Co., Ltd.). Student's t-test was used for the significant difference test.
- ITT Insulin Tolerance Test
- mice were administered a normal diet (ND) or a high fat diet (HFD) for 12 weeks at 8 weeks of age.
- Blood was analyzed from each group of mice, and serum levels of Glucose, total cholesterol, glucoalbumin, and hemoglobin A1c were measured.
- Mouse blood was collected from the inferior vena cava using a syringe and a 23G needle during anesthesia. After blood collection, the blood was transferred to a 1.5 mL tube, left to stand at room temperature for 1 hour after inversion stirring. Thereafter, the mixture was centrifuged at 4 ° C.
- Mex-3B-deficient male mice have an increased insulin sensitivity as well as an increase in life span and resistance to obesity caused by a high fat diet or overeating.
- aged Mex-3B-deficient male mice have been confirmed to be resistant to aging because the sores around the eyes (inflammation) and the significant flexion of the spine that appear with aging are reduced.
- the results were consistent with the extended lifespan.
- Mex-3B-deficient mice with enhanced insulin sensitivity have an anti-obesity / diabetes phenotype. It seems that it is suitable.
- Mex-3B contributes to metabolic control in animals. Therefore, Mex-3B-deficient mice have a lean form due to the absence of metabolic control by this Mex-3B, and insulin sensitivity is enhanced. As a result, a mechanism similar to caloric restriction works, and Mex-3B It is possible that the deficient male mouse has an extended life span. This indicates that a Mex-3B inhibitor can be a therapeutic agent for obesity and diabetes, and at the same time, is considered to be useful as an anti-aging agent that delays the progression of aging.
- the longevity activity inhibition by Mex-3B protein is avoided, the longevity activity, the aging inhibition activity, the obesity inhibition activity, the insulin sensitivity reduction improvement activity, the adipose tissue mass increase inhibition activity, and the diabetes improvement
- a compound having one or more activities selected from the activities can be searched.
- obesity can be prevented by administering a substance searched by the above screening method to animals such as humans and promoting the lifespan control mechanism.
- the screening method of the present invention comprises a novel long-life drug having a new mechanism of action, an aging inhibitor (anti-aging agent), an obesity inhibitor (anti-obesity agent), and an insulin sensitivity-reducing agent (insulin resistance). It is expected to contribute to the development of an improving agent), an adipose tissue growth inhibitor, a therapeutic agent for diabetes, and the like.
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Abstract
本発明の課題は、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質をスクリーニングする方法を提供することである。上記課題は、（ｉ）Mex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物に、候補物質又は対照を接触させる工程；（ｉｉ）指標となる値を測定する工程；（ｉｉｉ）候補物質の作用を、上記（ｉ）及び（ｉｉ）に基づく結果と、対照の結果とを比較して検出する工程；並びに（ｉｖ）前記指標となる値が変化した候補物質を選択する工程を含む方法により解決される。
Description
本発明は、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質をスクリーニングする方法、当該スクリーニングに用いる試薬及び当該試薬を含むスクリーニングキットに関する。さらに本発明は、Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物に関する。さらに本発明は、対象者におけるMex-3Bタンパク質の機能をノックアウトする工程を含む処置方法に関する。
延寿命制御に関するメカニズムは十分には解明されておらず、より効果的な延寿命剤の出現が待ち望まれている。延寿命制御メカニズムの解明については例えば、肥満により寿命が著しく短縮される一方で、動物実験において摂取カロリー制限を行うと、有意に寿命が延長するといった事実等が解明されている（非特許文献１）。その結果、脂質代謝制御を解明することが延寿命に重要であることが認識されている。
特許文献１には、D8と称するアポトーシス誘導遺伝子が記載されている。特許文献１に記載されたD8は、Mex-3Bとも称される。しかしながら、当該Mex-3Bタンパク質が延寿命や脂質代謝に関連があるという報告は今までになかった。
Ricki J. Colman et al. Science (2009)
本発明は、遺伝子レベルでのアプローチから延寿命制御現象を解明し、さらに延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物、並びに対象者におけるMex-3Bタンパク質の機能をノックアウトする工程を含む処置方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、Mex-3Bタンパク質のノックアウトマウスを作製した結果、意外にも、当該Mex-3Bタンパク質ノックアウトマウスが、脂肪の蓄積が阻害されること；体重が低下しておりインスリン感受性が亢進していること；及び寿命が延長していることを見出した。それにより、Mex-3Bタンパク質の機能あるいは発現に関連する因子を用いて、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質をスクリーニングする方法を見出した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ Mex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物を用いて、候補物質の中から、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、少なくとも次の工程：
（ｉ）Mex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物に、候補物質又は対照を接触させる工程；
（ｉｉ）指標となる値を測定する工程；
（ｉｉｉ）候補物質の作用を、上記（ｉ）及び（ｉｉ）に基づく結果と、対照の結果とを比較して検出する工程；並びに
（ｉｖ）前記指標となる値が変化した候補物質を選択する工程；
を含む、方法。
［１］ Mex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物を用いて、候補物質の中から、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、少なくとも次の工程：
（ｉ）Mex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物に、候補物質又は対照を接触させる工程；
（ｉｉ）指標となる値を測定する工程；
（ｉｉｉ）候補物質の作用を、上記（ｉ）及び（ｉｉ）に基づく結果と、対照の結果とを比較して検出する工程；並びに
（ｉｖ）前記指標となる値が変化した候補物質を選択する工程；
を含む、方法。
［２］ Mex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物が、
（１）Mex-3Bタンパク質関連因子が、
（２）Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、
（３）Mex-3Bタンパク質、
（４）Mex-3Bタンパク質に対する抗体、及び
（５）Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物、
からなる群から選択される少なくとも１つである、［１］記載の方法。
（１）Mex-3Bタンパク質関連因子が、
（２）Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、
（３）Mex-3Bタンパク質、
（４）Mex-3Bタンパク質に対する抗体、及び
（５）Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物、
からなる群から選択される少なくとも１つである、［１］記載の方法。
［３］
（１）Mex-3Bタンパク質関連因子が、
（２）Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、
（３）Mex-3Bタンパク質、
（４）Mex-3Bタンパク質に対する抗体、及び
（５）Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物、
からなる群から選択されるMex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物を含む、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質のスクリーニング試薬。
（１）Mex-3Bタンパク質関連因子が、
（２）Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、
（３）Mex-3Bタンパク質、
（４）Mex-3Bタンパク質に対する抗体、及び
（５）Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物、
からなる群から選択されるMex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物を含む、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質のスクリーニング試薬。
［４］ ［３］記載のスクリーニング試薬を含む、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質のスクリーニングキット。
［５］ Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物であって、寿命の延長、老化の抑制、肥満の抑制、インスリン感受性低減の改善、脂肪組織量の増大の抑制、及び糖尿病の改善からなる群から選ばれる１以上の表現型を有する、非ヒトノックアウト動物。
［６］ 対象者におけるMex-3Bタンパク質の機能をノックアウトする工程を含む、寿命の延長、老化の抑制、肥満の抑制、インスリン感受性低減の改善、脂肪組織量の増大の抑制、及び糖尿病の改善から選ばれる１以上を達成するための処置方法。
本発明によれば、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質を簡便な方法で効率よくスクリーニングすることができる。
本発明は、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質をスクリーニングする方法、当該スクリーニングに用いる試薬及び当該試薬を含むスクリーニングキットに関する。更に本発明は、Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物に関する。さらに本発明は、対象者におけるMex-3Bタンパク質の機能をノックアウトする工程を含む処置方法に関する。以下に本発明を説明する。
（１）本発明の概要
本発明はMex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物を用いて、候補物質の中から、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質をスクリーニングする方法に関する。以下、本発明の概要について説明する。
Mex-3Bタンパク質は転写後調節やアポトーシス誘導の機能を有することが知られている。具体的には、アポトーシス促進因子Bimの発現を転写後制御により高めることにより、アポトーシスを誘導することが知られている。Mex-3Bタンパク質の構造としては、Ｎ末端側にＲＮＡ結合ドメインであるＫＨドメインが２つあり、Ｃ末端側にはユビキチン化に関わるＲＩＮＧフィンガードメインがあることが知られている。
本発明はMex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物を用いて、候補物質の中から、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質をスクリーニングする方法に関する。以下、本発明の概要について説明する。
Mex-3Bタンパク質は転写後調節やアポトーシス誘導の機能を有することが知られている。具体的には、アポトーシス促進因子Bimの発現を転写後制御により高めることにより、アポトーシスを誘導することが知られている。Mex-3Bタンパク質の構造としては、Ｎ末端側にＲＮＡ結合ドメインであるＫＨドメインが２つあり、Ｃ末端側にはユビキチン化に関わるＲＩＮＧフィンガードメインがあることが知られている。
本発明者らは、当該Mex-3B遺伝子を欠損させた（図１）ノックアウトマウスを作製し、当該ノックアウトマウスの特性を解析し、以下の知見：
ａ）Mex-3Bノックアウトマウスオスでは野生型に比して有意に寿命が延長し（図６）、老化が抑制している（図１０）；
ｂ）Mex-3Bノックアウトマウスでは脂肪組織が小さい（図７及び図１２）；及び
ｃ）Mex-3Bノックアウトマウスは体重が野生型に比して有意に低下し（図５）、オスではインシュリン感受性が亢進し（図８、９及び図１１）、さらに糖尿病マーカーの増加が抑制されている（図１３）；
を得た。
ａ）Mex-3Bノックアウトマウスオスでは野生型に比して有意に寿命が延長し（図６）、老化が抑制している（図１０）；
ｂ）Mex-3Bノックアウトマウスでは脂肪組織が小さい（図７及び図１２）；及び
ｃ）Mex-3Bノックアウトマウスは体重が野生型に比して有意に低下し（図５）、オスではインシュリン感受性が亢進し（図８、９及び図１１）、さらに糖尿病マーカーの増加が抑制されている（図１３）；
を得た。
これらの知見から、Mex-3Bノックアウトマウスは、寿命が長く、老化が抑制され、加齢に伴う肥満を抑制し、脂肪組織量の増加も抑制され、さらにインスリン感受性低減が改善され、糖尿病が改善されることが示された。これより、Mex-3Bタンパク質は代謝制御に関するＲＮＡ結合タンパク質であり、寿命制御メカニズムに関与していることが新たに示された。
以上の観点より、本発明者は、Mex-3Bの発現あるいは機能を抑制する物質は延寿命メカニズムに関与する有力な物質であると考えた。これに基づいて、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する化合物のスクリーニングが可能となる。また、スクリーニングされた物質は、全く新たな作用機序を有する延寿命活性薬剤等に適用できるために有用である。
（２）本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、上記Mex-3Bタンパク質の関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物を用いて、候補物質の中から、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性（以下、本発明の活性とも称する）を有する物質を探索することを目的とする。具体的には、（ｉ）Mex-3Bタンパク質の関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物に、候補物質又は対照を接触させる工程；（ｉｉ）指標となる値を測定する工程；（ｉｉｉ）候補物質の作用を、上記（ｉ）および（ｉｉ）に基づく結果と、対照の結果とを比較して検出する工程；並びに（ｉｖ）指標となる値が変化した候補物質を選択する工程；を含む、方法である。
本発明のスクリーニング方法は、上記Mex-3Bタンパク質の関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物を用いて、候補物質の中から、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性（以下、本発明の活性とも称する）を有する物質を探索することを目的とする。具体的には、（ｉ）Mex-3Bタンパク質の関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物に、候補物質又は対照を接触させる工程；（ｉｉ）指標となる値を測定する工程；（ｉｉｉ）候補物質の作用を、上記（ｉ）および（ｉｉ）に基づく結果と、対照の結果とを比較して検出する工程；並びに（ｉｖ）指標となる値が変化した候補物質を選択する工程；を含む、方法である。
＜Mex-3Bタンパク質関連因子、Mex-3Bタンパク質関連非ヒト生物＞
Mex-3Bタンパク質関連因子とは、候補物質に接触させて延寿命活性を有する物質を探索することができる物質であればいかなる物質をも含む。例えば、Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、Mex-3Bタンパク質及びその抗体などが挙げられる。Mex-3Bタンパク質関連非ヒト生物としては、Mex-3Bタンパク質に関連するノックアウト動物（好ましくは、非ヒト哺乳動物）などがあげられる。Mex-3Bタンパク質のシークエンスデータは、例えばGenBank（NIH genetic sequence database）や、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）等のデータベースに登録されているデータを使用することができる。ここで、ヒト由来Mex-3Bタンパク質のｃＤＮＡは３５３４塩基でありGenBankにＮＭ＿０３２２４６（配列番号１）と、アミノ酸配列は５６９アミノ酸残基のＮＰ＿１１５６２２(配列番号２)と登録されている。Mex-3Bタンパク質の抗体とは、例えば、Mex-3Bタンパク質に特異的な抗体である抗Mex-3Bタンパク質抗体を用いて、Mex-3Bタンパク質の発現をウェスタンブロッティングやELISA法で測定する方法などがあげられる。当該抗体は公知の方法を用いて作製できる。Mex-3Bタンパク質に関連するノックアウト動物としては、例えば、Mex-3Bタンパク質関連因子がMex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた延寿命非ヒトノックアウト動物があげられる。
Mex-3Bタンパク質関連因子とは、候補物質に接触させて延寿命活性を有する物質を探索することができる物質であればいかなる物質をも含む。例えば、Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、Mex-3Bタンパク質及びその抗体などが挙げられる。Mex-3Bタンパク質関連非ヒト生物としては、Mex-3Bタンパク質に関連するノックアウト動物（好ましくは、非ヒト哺乳動物）などがあげられる。Mex-3Bタンパク質のシークエンスデータは、例えばGenBank（NIH genetic sequence database）や、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）等のデータベースに登録されているデータを使用することができる。ここで、ヒト由来Mex-3Bタンパク質のｃＤＮＡは３５３４塩基でありGenBankにＮＭ＿０３２２４６（配列番号１）と、アミノ酸配列は５６９アミノ酸残基のＮＰ＿１１５６２２(配列番号２)と登録されている。Mex-3Bタンパク質の抗体とは、例えば、Mex-3Bタンパク質に特異的な抗体である抗Mex-3Bタンパク質抗体を用いて、Mex-3Bタンパク質の発現をウェスタンブロッティングやELISA法で測定する方法などがあげられる。当該抗体は公知の方法を用いて作製できる。Mex-3Bタンパク質に関連するノックアウト動物としては、例えば、Mex-3Bタンパク質関連因子がMex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた延寿命非ヒトノックアウト動物があげられる。
＜延寿命活性などを有する物質＞
上記のように、Mex-3Bタンパク質の機能を抑制する物質は延寿命メカニズムに関与する有力な物質であるといえる。従って、Mex-3Bタンパク質の発現を抑制する物質は、延寿命メカニズムを促進するため延寿命活性薬剤の候補として好ましく、さらに老化抑制剤（抗老化剤）、肥満抑制剤（抗肥満剤）、インスリン感受性低減改善剤（インスリン抵抗改善剤）、脂肪組織量の増大抑制剤、及び糖尿病治療剤などの候補としても好ましい。本発明における形質的な延寿命の指標としては、当該物質を投与された個体において、脂肪の蓄積が阻害される；体重が低下する；及びインスリン感受性が亢進することなどがあげられる。これらの形質を促進する物質は寿命を延長させる物質として好ましい。このような物質としては、上記の性質を有する物質であれば、いかなる物質も含まれるが、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これらの物質は塩を形成していてもよく、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
上記のように、Mex-3Bタンパク質の機能を抑制する物質は延寿命メカニズムに関与する有力な物質であるといえる。従って、Mex-3Bタンパク質の発現を抑制する物質は、延寿命メカニズムを促進するため延寿命活性薬剤の候補として好ましく、さらに老化抑制剤（抗老化剤）、肥満抑制剤（抗肥満剤）、インスリン感受性低減改善剤（インスリン抵抗改善剤）、脂肪組織量の増大抑制剤、及び糖尿病治療剤などの候補としても好ましい。本発明における形質的な延寿命の指標としては、当該物質を投与された個体において、脂肪の蓄積が阻害される；体重が低下する；及びインスリン感受性が亢進することなどがあげられる。これらの形質を促進する物質は寿命を延長させる物質として好ましい。このような物質としては、上記の性質を有する物質であれば、いかなる物質も含まれるが、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これらの物質は塩を形成していてもよく、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
＜スクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法としては、Mex-3B遺伝子を作動可能に結合させた発現ベクターを作製し、これを細胞内に導入してMex-3Bタンパク質を発現させる方法等があげられる。例えば、標識物質をコードする遺伝子にMex-3B遺伝子を作動可能に結合させた発現ベクターを作製し、これを細胞内に導入して発現させる方法を例示して、以下説明する。
本発明のスクリーニング方法としては、Mex-3B遺伝子を作動可能に結合させた発現ベクターを作製し、これを細胞内に導入してMex-3Bタンパク質を発現させる方法等があげられる。例えば、標識物質をコードする遺伝子にMex-3B遺伝子を作動可能に結合させた発現ベクターを作製し、これを細胞内に導入して発現させる方法を例示して、以下説明する。
発現ベクターの構築、ベクターの細胞への導入法は周知であり、当分野における通常の技術を用いて行うことができる（例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)参照）。標識物質及びMex-3Bタンパク質をコードする各遺伝子を連結するベクターは、市販のものを用いることができる。
標識物質とは、本発明のスクリーニング方法の測定の指標を検出するための検出手段として使用されるものであり、蛍光標識物質、放射標識物質、これらの標識物質で標識された抗体のいずれを使用することもできる。検出操作が容易である点で、オワンクラゲ（Aequorea victorea）由来の緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein: GFP）が好ましい。蛍光標識物質としては、GFPのほか、GFPを改変した変異体（GFPバリアント）であるEGFP（Enhanced-humanized GFP）又はrsGFP（red-shift GFP）などが挙げられる。また、黄色蛍光タンパク質（yellow fluorescent protein: YFP）、藍色蛍光タンパク質（cyan fluorescent protein: CFP）、青色蛍光タンパク質（blue fluorescent protein: BFP）、ウミシイタケ（Renilla reniformis）由来のGFPを使用することも可能であり、これらをコードする遺伝子を本発明に使用することができる。これらをコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、市販品を用いることができ、あるいは、GenBank等の公共データベースを通じて配列情報を容易に入手することができる。
発現ベクターを導入した細胞を、候補物質を接触させるための試験用細胞と、未処理の対照細胞に分け、試験用細胞に候補物質を添加等により接触させて標識シグナルを検出する。ここで「接触」とは、候補物質が発現ベクターを導入した細胞と相互作用するように処理することを意味し、細胞培養系に候補物質を添加すること、候補物質の存在下で細胞を培養することのいずれをも意味する。
本発明のスクリーニング方法における「指標となる値」としては、Mex-3Bタンパク質の発現を抑制する物質の探索の指標となる遺伝子、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量等をいう。例えば、Mex-3Bタンパク質のｍＲＮＡ発現量又はタンパク質発現量などがあげられる。
さらに、本発明のスクリーニング方法における「指標となる値」の別の例としては、Mex-3Bタンパク質とその標的ｍＲＮＡとの相互作用の程度、並びに当該相互作用による上記標的ｍＲＮＡの機能の変動であってもよい。例えば、上記標的ｍＲＮＡの機能の変動によりＢｉｍの発現量が変動する場合には、Ｂｉｍの発現量を指標にすることができる。
本発明のスクリーニング方法における「測定」について、具体的には、適当な条件で培養した上記細胞又は動物における、上記指標となる値を定量することをいい、例えば、Mex-3Bタンパク質のｍＲＮＡ又はタンパク質を定量すること、正常動物を用いる場合は、寿命の長さ、老化の表現型、体重、脂肪組織重量、インシュリン感受性又は糖尿病マーカーを測定することをいう。
ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ－ＰＣＲによって、タンパク質の定量は、例えば、抗Mex-3Bタンパク質抗体等を用いたウェスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ－ＰＣＲによって、タンパク質の定量は、例えば、抗Mex-3Bタンパク質抗体等を用いたウェスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
標識物質のシグナルの強さ（シグナル強度）は、蛍光強度、電気泳動におけるバンドの濃さ等の各々の標識タンパク質に適した方法により定量するか、あるいは目視することにより調べることができる。そして、対照よりもシグナル強度を低下させたときの候補物質を、Mex-3Bタンパク質の機能を抑制する物質として選択する。
ここで、対照細胞では、Mex-3Bタンパク質の発現が抑制されず、発現した標識タンパク質とMex-3Bタンパク質が結合した組換えタンパク質は、蛍光を発する。これに対し、上記延寿命活性を有する物質となりうる候補物質が添加された場合は、Mex-3Bタンパク質の発現が阻害されるため、候補物質を接触させた後の細胞から発せられる標識シグナルは、対照細胞から発せられる標識シグナルの強さよりも弱くなる。また、対照細胞と候補物質を接触させた後の細胞の特定の遺伝子発現量を指標の値として測定、比較検出することにより、当該発現量が変化した候補物質を選択することもできる。当該方法では、抗GFP抗体等の抗標識タンパク質抗体を用いたイムノブロット等により標識物質を検出することが可能であるので、多検体を短時間で処理することができ、ハイスループットスクリーニングを行うことができる。
さらに、本発明のスクリーニング方法には、候補物質を動物又はその一部に投与し、『延寿命活性などを有する物質』で記載した本発明における具体的な延寿命の指標となる値を直接測定し、対照であるMex-3Bタンパク質ノックアウト動物の測定結果と比較して、当該ノックアウト動物と同程度かそれよりも高い値を呈する候補物質を選択することにより、本発明の活性を有する物質をスクリーニングする方法も含まれる。本方法はin vivo系として、個体レベルでの物質の効果を評価できるため、好ましい。この場合、「指標とする値」の測定具体的な指標としては、候補物質を投与された動物について、当該物質により、脂肪の蓄積が阻害される；体重が低下する；及びインスリン感受性が亢進することなどがあげられる。これらの指標を示す候補物質は寿命を延長させうる物質として好ましい。
脂肪蓄積阻害とは、体内の脂肪組織の生育が抑制又は遅延することにより、体内脂肪の蓄積が阻害されることをいう。脂肪組織とは、脂肪細胞で構成され、かつ、エネルギーを脂肪として蓄える機能を有する結合組織をいう。本発明に関する脂肪組織には、体内において皮膚下にあるもの及び内臓周囲にあるもの等のいずれの脂肪組織をも含まれる。例えば、精巣上体脂肪組織や腹部脂肪があげられる。脂肪蓄積は公知のいかなる方法をも用いて測定できる。
体重の変化は体重の経時的変化をいい、公知の方法で測定できる。
インシュリン感受性亢進とは、インシュリンを投与した場合の血糖値の低下について、インシュリン感受性が亢進するとは、インシュリンの投与により血糖値がよりはやく低下することをいう。インシュリン感受性亢進の評価は、公知のいかなる血糖値の測定方法をも用いることができる。
体重の変化は体重の経時的変化をいい、公知の方法で測定できる。
インシュリン感受性亢進とは、インシュリンを投与した場合の血糖値の低下について、インシュリン感受性が亢進するとは、インシュリンの投与により血糖値がよりはやく低下することをいう。インシュリン感受性亢進の評価は、公知のいかなる血糖値の測定方法をも用いることができる。
スクリーニングに用いる動物としては、ヒトを除くマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヒツジ及びヤギなどが挙げられる。本発明では取り扱いが容易で繁殖しやすいマウスが好ましい。対照として用いるMex-3Bタンパク質ノックアウト動物は公知の方法を用いて作製できる。例えば、図１で示したMex-3Bタンパク質の一部を欠損させたノックアウトマウスは、本発明の上記スクリーニング方法に好ましい。「動物又はその一部」とは、動物の生体の全身、及び限定された組織又は器官の両者を含む。限定された組織又は器官の場合は、動物から摘出されたものも含む。
候補物質を試験動物に投与する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、塗布、皮下投与、皮内投与、腹腔投与などが用いられ、試験動物の症状、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、候補物質の投与量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
本発明のスクリーニングの対象となる候補物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物（高分子又は低分子化合物）、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩としては、上記のように、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸や有機酸など）や塩基（例えば、金属酸など）等との塩が用いられる。
（３）スクリーニング試薬
本発明のMex-3Bタンパク質関連因子を用いたスクリーニングを行う場合は、上記のMex-3Bタンパク質関連因子を他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。たとえば、蒸留水、pH緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤などを組み合わせることができる。
本発明のMex-3Bタンパク質関連因子を用いたスクリーニングを行う場合は、上記のMex-3Bタンパク質関連因子を他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。たとえば、蒸留水、pH緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤などを組み合わせることができる。
反応試薬は適当な化学的または物理的検出手段により検出可能な標識を有する。そのような標識物質を用いる測定法に使用される標識剤として、たとえば蛍光物質、酵素、放射性同位元素、発光物質などが用いられる。標識に酵素を用いたELISA法は広く利用されている。
蛍光物質として、フルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネートなど、酵素として、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼなど、放射性同位元素として、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃなど、発光物質として、ルシフェリン、ルシゲニン、ルミノール、ルミノール誘導体などが例示される。
さらに、反応媒体として、反応の至適条件を与えるか、反応生成物質の安定化などに有用な緩衝液、反応物質の安定化剤などが含まれる。
さらに、反応媒体として、反応の至適条件を与えるか、反応生成物質の安定化などに有用な緩衝液、反応物質の安定化剤などが含まれる。
（４）スクリーニングキット
本発明のMex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物を用いたスクリーニングを行う場合、特別の条件、操作などは必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作に準じて行なわれ、必要であれば若干の修飾を加えて好適な測定系を構築できる。そのためのもっとも簡便かつ効率的な測定を行なうことを可能とするのは、上記試薬をキット化することである。キット化により、通常の検査室または実験室で、特殊な分析機器、熟練した操作、高度の知識は必要とせずに、効率的に定量を行なうことができる。アッセイキットの構成および形態は、とくに限定されるものでなく所定の目的を達成できるものであればその内容は限定されない。一般には候補物質試料について、スクリーニングを実行し得られた結果を解釈するための使用説明書、反応試薬、反応が行なわれる場となる反応媒体、アッセイの場を提供する基材などから構成される。さらに所望により、比較基準とするためのあるいは検量線を作成するための照合サンプル、検出器なども含んでもよい。本発明のスクリーニング方法の検出手段としては、分光器、放射線検出器、光散乱検出器といった上記標識を検出可能なものがあげられる。
本発明のMex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物を用いたスクリーニングを行う場合、特別の条件、操作などは必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作に準じて行なわれ、必要であれば若干の修飾を加えて好適な測定系を構築できる。そのためのもっとも簡便かつ効率的な測定を行なうことを可能とするのは、上記試薬をキット化することである。キット化により、通常の検査室または実験室で、特殊な分析機器、熟練した操作、高度の知識は必要とせずに、効率的に定量を行なうことができる。アッセイキットの構成および形態は、とくに限定されるものでなく所定の目的を達成できるものであればその内容は限定されない。一般には候補物質試料について、スクリーニングを実行し得られた結果を解釈するための使用説明書、反応試薬、反応が行なわれる場となる反応媒体、アッセイの場を提供する基材などから構成される。さらに所望により、比較基準とするためのあるいは検量線を作成するための照合サンプル、検出器なども含んでもよい。本発明のスクリーニング方法の検出手段としては、分光器、放射線検出器、光散乱検出器といった上記標識を検出可能なものがあげられる。
（５）本発明の非ヒトノックアウト動物
本発明の非ヒトノックアウト動物は、Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物であって、寿命の延長、老化の抑制、肥満の抑制、インスリン感受性低減の改善、脂肪組織量の増大の抑制、及び糖尿病の改善からなる群から選ばれる１以上の表現型を有することを特徴とする。
本発明の非ヒトノックアウト動物は、Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物であって、寿命の延長、老化の抑制、肥満の抑制、インスリン感受性低減の改善、脂肪組織量の増大の抑制、及び糖尿病の改善からなる群から選ばれる１以上の表現型を有することを特徴とする。
Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物は、Mex-3Bの発現が消失又は低下した動物であり、当業者に公知の方法により作製することができる。非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物が好ましく、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ヤギ等が挙げられるが、その中でげっ歯類、より好ましくはマウスである。非ヒトノックアウト動物は、例えばジーンターゲティング法等の遺伝子工学的手法を利用して、染色体のMex-3B遺伝子を任意に変換させることにより作製できる。ジーンターゲティング法では、まず、ゲノムライブラリーより単離したクローンを基に、発現能を有さないMex-3B遺伝子を含む構築物（ターゲティングベクター）を作製し、ＥＳ細胞に遺伝子導入し、相同組換えが生じたMex-3B遺伝子変異クローンを得る。「発現能を有さないMex-3B遺伝子」とは、Mex-3Bの発現を阻害するような変異、または該遺伝子がコードする蛋白質の機能を喪失させるような変異が導入された結果、細胞や生体にトランスフェクションしたときにMex-3Bを発現しないMex-3B遺伝子である。Mex-3B遺伝子への変異の導入は、公知の遺伝子工学的手法により、Mex-3B遺伝子の塩基配列の一部または全部の除去や別の遺伝子の挿入または置換を行なうことにより実施できる。このような変異の導入の結果、プロモーターまたはエキソンの機能の破壊、あるいはコドンの読み取り枠がずれることにより、Mex-3Bの発現が低下あるいは消失したノックアウトマウスが作製できる。プロモーターまたはエキソンの機能を破壊するために導入する遺伝子として、薬剤耐性遺伝子等、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、好ましくはネオマイシン耐性遺伝子が例示できる。ここに例示した遺伝子以外に、ジーンターゲティング法で一般的に用いられている遺伝子がいずれも使用できる。ＥＳ細胞は、非ヒト哺乳動物の胚盤胞から樹立できる。マウスのＥＳ細胞として、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＣＢＡ／ＪＮＣｒｊマウスの間の雑種第一代胚盤胞から樹立したＴＴ２ ＥＳ細胞を例示できる。ターゲティングベクターを遺伝子導入したＥＳ細胞からの、相同組換えが生じたMex-3B遺伝子変異クローンの選別は、ターゲティングベクターを遺伝子導入したクローンについて、その遺伝子型を解析することにより実施できる。遺伝子型の解析は、ＰＣＲまたはサザンブロッティング法により実施できる。ＰＣＲでは、プライマーとしてターゲティングベクター中のMex-3B遺伝子の部分塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよびプロモーターまたはエキソンの機能を破壊するために導入した遺伝子の部分配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することにより、Mex-3B遺伝子の欠失を検出することができる。サザンブロッティング法では、Mex-3B遺伝子またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとして用いて検出されたＤＮＡのサイズにより、Mex-3B遺伝子の欠失を検出できる。あるいは、ターゲティングベクターの作製に薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、変異クローンの薬剤耐性を利用して、該変異クローンを容易に選別できる。このようにして得られたMex-3B遺伝子変異クローンを非ヒト哺乳動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）または８細胞期胚に注入し、偽妊娠状態にした同種の非ヒト哺乳動物の子宮に移植することにより、正常なMex-3B遺伝子座をもつ細胞と変異したMex-3B遺伝子座をもつ細胞とから構成されるキメラ個体が得られる。キメラ個体と野生型個体との交配により相同染色体の一方に変異が導入された個体（ヘテロ欠損個体）または相同染色体の両方に変異が導入された個体（ホモ欠損個体）を取得できる。一般的には、このような交配によりヘテロ欠損個体が得られる。ホモ欠損個体は、ヘテロ遺伝子欠損個体同志の交配により取得できる。
取得されたノックアウト動物個体が、寿命の延長、老化の抑制、肥満の抑制、インスリン感受性低減の改善、脂肪組織量の増大の抑制、及び糖尿病の改善からなる群から選ばれる１以上の表現型を有するかどうかについては、本願明細書の実施例に記載した方法に準じて評価することができる。
（６）Mex-3Bタンパク質の機能をノックアウトする工程を含む処置方法
本発明によれば、対象者におけるMex-3Bタンパク質の機能をノックアウトすることによって、対象者の、寿命の延長、老化の抑制、肥満の抑制、インスリン感受性低減の改善、脂肪組織量の増大の抑制、及び糖尿病の改善から選ばれる１以上を達成することができる。即ち、本発明によれば、対象者におけるMex-3Bタンパク質の機能をノックアウトする工程を含む、対象者の処置方法が提供される。
本発明によれば、対象者におけるMex-3Bタンパク質の機能をノックアウトすることによって、対象者の、寿命の延長、老化の抑制、肥満の抑制、インスリン感受性低減の改善、脂肪組織量の増大の抑制、及び糖尿病の改善から選ばれる１以上を達成することができる。即ち、本発明によれば、対象者におけるMex-3Bタンパク質の機能をノックアウトする工程を含む、対象者の処置方法が提供される。
対象者におけるMex-3Bタンパク質の機能をノックアウトするための手段として、Mex-3Bタンパク質阻害剤（即ち、Mex-3Bタンパク質の発現及び／又は機能を抑制する薬剤）を対象者に投与することが挙げられる。Mex-3Bタンパク質阻害剤としては、本発明のスクリーニング方法により選択される、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質を使用することができる。具体的には、Mex-3Bを標的とするｓｉＲＮＡ又はＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）などを挙げることができ、あるいはMex-3Bタンパク質阻害作用を有する低分子化合物でもよい。
上記したMex-3Bタンパク質阻害剤の投与方法は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよい。Mex-3Bタンパク質阻害剤の投与量も特に限定されず、対象者の体重、症状の程度、有効成分の種類などに応じて適宜設定することができる。
上記したMex-3Bタンパク質阻害剤の投与方法は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよい。Mex-3Bタンパク質阻害剤の投与量も特に限定されず、対象者の体重、症状の程度、有効成分の種類などに応じて適宜設定することができる。
次に、本発明を実施例によって説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。
（実施例１）
本実施例はMex-3Bノックアウトマウスを作製することを目的とする。
ターゲティングベクターの設計は図1のように行った。BAC clone（GenBank Accession No. AC122736）中の約2.5kbのゲノミックMex-3B断片（配列番号１）をネオマイシン耐性カセット（pgkbg2Neo）（配列番号３）と置換し欠損させた。このターゲッティングベクターを直鎖化し、それをconfluentとなった10cm dish 3枚分の半量の胚性幹細胞に電気穿孔法により導入した。G418耐性コロニーを選択し、Mex-3Bとネオマイシン耐性カセットに特異的なプライマーを用いて相同組み換えを起こしたことを確認した。用いたプライマーは以下の通りである。
mD8フォワードプライマー
５'-GTCACTCAGGCCATCCGCATTTTTTCCTGA-３'（配列番号４）
mD8リバースプライマー
５'-GTGTTCTAGAACGAGCGCTGTAGGAACCCA-３'（配列番号５）
Neoプライマー
５'-GTTGGTTTTTGTGTGCGGCGCGCCGTTTAA-３'（配列番号６）
相同組換えクローンは、BACクローンおよびターゲティングベクターをtemplate DNAとしてランダムなプライマーで作製したプローブを用いたFISH法により確認した（図２）。得られたクローンをC57BL6マウスの胚盤胞にインジェクトしてキメラマウスを作製した。
本実施例はMex-3Bノックアウトマウスを作製することを目的とする。
ターゲティングベクターの設計は図1のように行った。BAC clone（GenBank Accession No. AC122736）中の約2.5kbのゲノミックMex-3B断片（配列番号１）をネオマイシン耐性カセット（pgkbg2Neo）（配列番号３）と置換し欠損させた。このターゲッティングベクターを直鎖化し、それをconfluentとなった10cm dish 3枚分の半量の胚性幹細胞に電気穿孔法により導入した。G418耐性コロニーを選択し、Mex-3Bとネオマイシン耐性カセットに特異的なプライマーを用いて相同組み換えを起こしたことを確認した。用いたプライマーは以下の通りである。
mD8フォワードプライマー
５'-GTCACTCAGGCCATCCGCATTTTTTCCTGA-３'（配列番号４）
mD8リバースプライマー
５'-GTGTTCTAGAACGAGCGCTGTAGGAACCCA-３'（配列番号５）
Neoプライマー
５'-GTTGGTTTTTGTGTGCGGCGCGCCGTTTAA-３'（配列番号６）
相同組換えクローンは、BACクローンおよびターゲティングベクターをtemplate DNAとしてランダムなプライマーで作製したプローブを用いたFISH法により確認した（図２）。得られたクローンをC57BL6マウスの胚盤胞にインジェクトしてキメラマウスを作製した。
作製したキメラマウスの雄をbalb/cマウスの雌と交配してヘテロ接合体を作製した。ヘテロ接合体同士を交配したのち、産仔の遺伝子型をGenotyping PCRにより同定した（図３）。Mex-3B+/+またはMex-3B-/-の胸腺および脾臓からタンパク質を回収し、ウェスタンブロッティングでMex-3Bの発現の有無を確認した。その結果、Mex-3B-/-の胸腺および脾臓では、Mex-3Bの発現が見られないことが示された（図４）。Mex-3B+/-マウスをbalb/cマウスに10回以上戻し交配した。実験のコントロールには同腹仔を用いた。Mex-3B-/-マウスはメンデルの法則通りの個体数が生まれ、10ヶ月以上健常であった。
さらに、Mex-3+/+、Mex-3+/-及びMex-3B-/-マウスの体重の経時変化を測定した。結果を図５に示す。これより、Mex-3Bタンパク質ノックアウトマウスは正常に生育することが示された。
（実施例２）
本実施例は、Mex-3Bノックアウトマウスの寿命を測定し、野生型マウスと比較することを目的とする。
BALBの野生型（ＷＴ：ｎ＝２０）およびMex-3Bヘテロ欠損（ＨＴ：ｎ＝６５）、ホモ欠損マウス［実施例１で作製したMex-3Bノックアウト（ＫＯ）マウス］（ｎ＝３２）はSPF環境下において、自由摂食させ、同腹子は同一ケージにて飼育させた。各々のマウスが死亡した日を記録し、生後100日以内に死亡した個体は記録より除去した。得られた記録より生存曲線を作製し、同時に平均寿命を求めた。生存曲線に対する有意差検定にはLogrank検定を用い、平均寿命に対する有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。
本実施例は、Mex-3Bノックアウトマウスの寿命を測定し、野生型マウスと比較することを目的とする。
BALBの野生型（ＷＴ：ｎ＝２０）およびMex-3Bヘテロ欠損（ＨＴ：ｎ＝６５）、ホモ欠損マウス［実施例１で作製したMex-3Bノックアウト（ＫＯ）マウス］（ｎ＝３２）はSPF環境下において、自由摂食させ、同腹子は同一ケージにて飼育させた。各々のマウスが死亡した日を記録し、生後100日以内に死亡した個体は記録より除去した。得られた記録より生存曲線を作製し、同時に平均寿命を求めた。生存曲線に対する有意差検定にはLogrank検定を用い、平均寿命に対する有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。
その結果を図６に示す。これより、本発明のMex-3Bタンパク質ノックアウトマウスの寿命の平均は、野生型マウスの寿命よりも有意に長いことが示された。
（実施例３）
本実施例は、Mex-3Bノックアウトマウスの脂肪組織の重量を測定し、野生型マウスと比較することを目的とする。
実施例１で作製したMex-3Bノックアウト（ＫＯ）マウスと野生型（ＷＴ）マウスについて、脾臓、精巣上体脂肪組織及び腎臓について、以下の方法で測定し統計処理をした。まず、上記マウスを安楽死させた後に体重を測定した。その後、マウスを解剖し各臓器を摘出した。各臓器の重量を測定し、体重で割り込むことにより、体重あたりの臓器の重さを算出した。グラフの縦軸はＷＴの体重あたりの臓器の重さを1とした場合の相対値を表している。
本実施例は、Mex-3Bノックアウトマウスの脂肪組織の重量を測定し、野生型マウスと比較することを目的とする。
実施例１で作製したMex-3Bノックアウト（ＫＯ）マウスと野生型（ＷＴ）マウスについて、脾臓、精巣上体脂肪組織及び腎臓について、以下の方法で測定し統計処理をした。まず、上記マウスを安楽死させた後に体重を測定した。その後、マウスを解剖し各臓器を摘出した。各臓器の重量を測定し、体重で割り込むことにより、体重あたりの臓器の重さを算出した。グラフの縦軸はＷＴの体重あたりの臓器の重さを1とした場合の相対値を表している。
その結果を図７に示す。これより、本発明のMex-3Bノックアウトマウスは脂肪組織が野生型マウスの脂肪組織よりも少ないことが示された。これより、本発明のMex-3Bノックアウトマウスでは、脂肪の蓄積が阻害されることが示された。
（実施例４）
本実施例は、Mex-3Bノックアウトマウスのインシュリン感受性試験を行い、野生型マウスと比較することを目的とする。
実施例１で作製したMex-3Bノックアウト（ＫＯ）マウスと野生型（ＷＴ）マウスについて、以下の方法で絶食させて、インシュリン感受性試験を行い、体重を測定し、統計処理をした。つまり、それぞれ単独飼育した６０日齢及び６００日齢の雄の野生型及びMex-3Bノックアウトマウスを１７時間絶食させた後、それぞれのマウスに２mg/kgとなるようにグルコースを腹腔内投与した。その後、継時的にマウス尾静脈から採血し、血糖値を測定してインシュリン感受性を検討した。
本実施例は、Mex-3Bノックアウトマウスのインシュリン感受性試験を行い、野生型マウスと比較することを目的とする。
実施例１で作製したMex-3Bノックアウト（ＫＯ）マウスと野生型（ＷＴ）マウスについて、以下の方法で絶食させて、インシュリン感受性試験を行い、体重を測定し、統計処理をした。つまり、それぞれ単独飼育した６０日齢及び６００日齢の雄の野生型及びMex-3Bノックアウトマウスを１７時間絶食させた後、それぞれのマウスに２mg/kgとなるようにグルコースを腹腔内投与した。その後、継時的にマウス尾静脈から採血し、血糖値を測定してインシュリン感受性を検討した。
その結果を図８及び図９に示す。これより、本発明のMex-3Bノックアウトマウスは、野生型に比較して、インシュリン感受性が亢進していることが示された。
（実施例５）
マウスの老化の表現系の解析
600日齢のBALBラインの野生型（ＷＴ）およびMex-3B ホモ欠損（ＫＯ）マウスの雌雄をそれぞれ麻酔により眠らせ、目の周囲に存在するただれ（炎症）を観察し、ただれが存在する個体数をカウントした。同時に、各マウスから外皮をはがし、背骨の屈曲具合を観察した。
マウスの老化の表現系の解析
600日齢のBALBラインの野生型（ＷＴ）およびMex-3B ホモ欠損（ＫＯ）マウスの雌雄をそれぞれ麻酔により眠らせ、目の周囲に存在するただれ（炎症）を観察し、ただれが存在する個体数をカウントした。同時に、各マウスから外皮をはがし、背骨の屈曲具合を観察した。
その結果を図１０に示す。目の周りにただれが生じている個体数をカウントしたものを写真下に表記した。Mex-3B 欠損マウスは老化の表現型が軽減している
（実施例６）
マウスへの高脂肪食負荷実験
7‐9週齢雄のBALBラインの野生型マウス, Mex-3B欠損マウス13-18匹を体重ごとに群分けしたうえで、単独飼育し、通常食(10 kcal%Fat, Normal Diet:ND)、高脂肪食（60 kcal%Fat, High Fat Diet:HFD)(Research diets)を給餌し、13週間それぞれ体重を測定した。飼育後、6時間絶食をさせて屠殺し、各群における精巣上体脂肪組織重量、皮下脂肪組織重量を測定した。体重および組織重量の有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。
マウスへの高脂肪食負荷実験
7‐9週齢雄のBALBラインの野生型マウス, Mex-3B欠損マウス13-18匹を体重ごとに群分けしたうえで、単独飼育し、通常食(10 kcal%Fat, Normal Diet:ND)、高脂肪食（60 kcal%Fat, High Fat Diet:HFD)(Research diets)を給餌し、13週間それぞれ体重を測定した。飼育後、6時間絶食をさせて屠殺し、各群における精巣上体脂肪組織重量、皮下脂肪組織重量を測定した。体重および組織重量の有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。
体重の測定結果を図１１Ａに示し、脂肪組織重量の測定結果を図１２に示す。有意差検定は、高脂肪食負荷を与えた野生型マウスとMex-3B欠損マウス間の間で検定したもののみを表記した。（ WT ND n=7, KO ND n=4, WT HFD n=10, KO HFD n=9 *p<0.05 ）
Mex-3B欠損雄マウスは高脂肪食負荷に伴う肥満の悪化が緩和されている。また、Mex-3B欠損雄マウスは高脂肪食負荷に伴う脂肪組織の増加が緩和されている。
Mex-3B欠損雄マウスは高脂肪食負荷に伴う肥満の悪化が緩和されている。また、Mex-3B欠損雄マウスは高脂肪食負荷に伴う脂肪組織の増加が緩和されている。
（実施例７）
インスリン負荷実験：Insulin Tolerance Test（ITT）
単独飼育条件下で4時間絶食にかけたBALBラインの野生型およびMex-3B KOマウスに対して、1 IU（International Unit）/ kgとなるように、PBSで希釈したHuman recombinant Insulin（Invitrogen）を腹腔内投与した。その後、0，15，30，60，90，120分と経時的に尾静脈における血糖値を、アセンシアブリーズ2（バイエル薬品株式会社）を用いて測定した。有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。
インスリン負荷実験：Insulin Tolerance Test（ITT）
単独飼育条件下で4時間絶食にかけたBALBラインの野生型およびMex-3B KOマウスに対して、1 IU（International Unit）/ kgとなるように、PBSで希釈したHuman recombinant Insulin（Invitrogen）を腹腔内投与した。その後、0，15，30，60，90，120分と経時的に尾静脈における血糖値を、アセンシアブリーズ2（バイエル薬品株式会社）を用いて測定した。有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。
測定の結果を図１１Ｂに示す。Mex-3B 欠損雄マウスは高脂肪食負荷に伴うインスリン感受性の悪化が緩和されている。
（実施例８）
マウス血清の調整および血清成分の測定
BALBラインの野生型およびMex-3B 欠損雄マウス8週齢に12週間通常食（Normal diet:ND）もしくは高脂肪食（High hat diet:HFD）を投与した。各群のマウスから血液を解析し、血清中のGlucose, 総コレステロール、グルコアルブミン、ならびにヘモグロビンA1cの値を測定した。
マウスの血液は、麻酔中にシリンジと23G注射針を用いて下大静脈から採血した。採血後、血液は1.5 mLチューブに移し、転倒攪拌後、常温で1時間静置した。その後に、4℃、3000 rpmで30分間遠心し、上清をとることで血清を得た。ヘモグロビンA1cを測定するための全血は、マウス血液30μLを10 mMのEDTA 5μLを混合させたものを用いた。マウスの血液成分の測定は長浜ライフサイエンスラボラトリーに解析を委託した（発色法による測定）。有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。
WT ND n=7, KO ND n=4, WT HFD n=10, KO HFD n=9 *p<0.05 **p<0.01
マウス血清の調整および血清成分の測定
BALBラインの野生型およびMex-3B 欠損雄マウス8週齢に12週間通常食（Normal diet:ND）もしくは高脂肪食（High hat diet:HFD）を投与した。各群のマウスから血液を解析し、血清中のGlucose, 総コレステロール、グルコアルブミン、ならびにヘモグロビンA1cの値を測定した。
マウスの血液は、麻酔中にシリンジと23G注射針を用いて下大静脈から採血した。採血後、血液は1.5 mLチューブに移し、転倒攪拌後、常温で1時間静置した。その後に、4℃、3000 rpmで30分間遠心し、上清をとることで血清を得た。ヘモグロビンA1cを測定するための全血は、マウス血液30μLを10 mMのEDTA 5μLを混合させたものを用いた。マウスの血液成分の測定は長浜ライフサイエンスラボラトリーに解析を委託した（発色法による測定）。有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。
WT ND n=7, KO ND n=4, WT HFD n=10, KO HFD n=9 *p<0.05 **p<0.01
測定結果を図１３に示す。Mex-3B欠損雄マウスは高脂肪食負荷に伴う血糖値、血清中コレステロール値、ならびに糖尿病マーカーの増加が抑制されている。
（まとめ）
上記の解析の結果、Mex-3B 欠損雄マウスは寿命の延長とともに、インスリン感受性が亢進していること、高脂肪食や過食による肥満に対して抵抗性を有することが分かってきた。この時、老齢のMex-3B 欠損雄マウスは老化に伴って現れてくる目の周りのただれ（炎症）や背骨の著しい屈曲が軽減されていることから、老化に対する抵抗性があることも確認され、寿命の延長している結果と一致していた。一方で、インスリン感受性の悪化は、肥満や糖尿病に対して大きな原因として考えられることから、インスリン感受性が亢進しているMex-3B 欠損マウスが抗肥満・糖尿病の表現系を有することは非常に理にかなっていると考えられる。
上記の解析の結果、Mex-3B 欠損雄マウスは寿命の延長とともに、インスリン感受性が亢進していること、高脂肪食や過食による肥満に対して抵抗性を有することが分かってきた。この時、老齢のMex-3B 欠損雄マウスは老化に伴って現れてくる目の周りのただれ（炎症）や背骨の著しい屈曲が軽減されていることから、老化に対する抵抗性があることも確認され、寿命の延長している結果と一致していた。一方で、インスリン感受性の悪化は、肥満や糖尿病に対して大きな原因として考えられることから、インスリン感受性が亢進しているMex-3B 欠損マウスが抗肥満・糖尿病の表現系を有することは非常に理にかなっていると考えられる。
これまで、寿命を延ばす有効な手段として、摂取カロリーを削減することが知られている。この摂取カロリーの制限による寿命の延長効果は、ハエやマウス、サルなど多くの生物種において報告されている。一方で、肥満は心筋梗塞や脳血管疾患など、様々な疾病を誘引することが知られており、罹患および死亡に対する大きなリスクファクターとして考えられている。Mex-3B欠損雄マウスは、やせ型を呈し、インスリン感受性が亢進していることから、先のカロリー制限を模倣した機構で寿命が延長していることが示唆された。
上記の結果を踏まえると、Mex-3B は動物個体内において代謝制御に寄与していることが示唆された。従って、Mex-3B欠損マウスはこのMex-3B による代謝制御が存在しないためにやせ型を呈し、インスリン感受性が亢進していること、そしてその結果としてカロリー制限と同様の機構が働き、Mex-3B 欠損雄マウスは寿命が延長している可能性が考えられる。このことはすなわち、Mex-3B 阻害剤は、肥満や糖尿病に対する治療薬になりうることを示しており、同時に老化の進行を遅らせる抗老化剤としても有用であると考えられる。
以上、本発明者によってなされた発明をその実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることはいうまでもない。
本発明のスクリーニング方法により、Mex-3Bタンパク質による延寿命活性阻害を回避し、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する化合物の探索を行うことができる。また、上記スクリーニング方法により探索した物質をヒト等の動物に投与して、寿命制御メカニズムを促進することにより、延寿命のほか肥満の予防をすることができる。このように、本発明のスクリーニング方法は、新たな作用機序を有する新規な延寿命薬剤、老化抑制剤（抗老化剤）、肥満抑制剤（抗肥満剤）、インスリン感受性低減改善剤（インスリン抵抗改善剤）、脂肪組織量の増大抑制剤、及び糖尿病治療剤等の開発に寄与できると期待される。
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
Claims (6)
- Mex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物を用いて、候補物質の中から、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性、及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、少なくとも次の工程：
（ｉ）Mex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物に、候補物質又は対照を接触させる工程；
（ｉｉ）指標となる値を測定する工程；
（ｉｉｉ）候補物質の作用を、上記（ｉ）及び（ｉｉ）に基づく結果と、対照の結果とを比較して検出する工程；並びに
（ｉｖ）前記指標となる値が変化した候補物質を選択する工程；
を含む、方法。 - Mex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物が、
（１）Mex-3Bタンパク質関連因子が、
（２）Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、
（３）Mex-3Bタンパク質、
（４）Mex-3Bタンパク質に対する抗体、及び
（５）Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物、
からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１記載の方法。 - （１）Mex-3Bタンパク質関連因子が、
（２）Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、
（３）Mex-3Bタンパク質、
（４）Mex-3Bタンパク質に対する抗体、及び
（５）Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物、
からなる群から選択されるMex-3Bタンパク質関連因子又はMex-3Bタンパク質関連非ヒト生物を含む、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質のスクリーニング試薬。 - 請求項３記載のスクリーニング試薬を含む、延寿命活性、老化抑制活性、肥満抑制活性、インスリン感受性低減の改善活性、脂肪組織量の増大抑制活性及び糖尿病改善活性から選ばれる１以上の活性を有する物質のスクリーニングキット。
- Mex-3Bタンパク質をコードする塩基配列の一部若しくは全てを破壊又は変異させた非ヒトノックアウト動物であって、寿命の延長、老化の抑制、肥満の抑制、インスリン感受性低減の改善、脂肪組織量の増大の抑制、及び糖尿病の改善からなる群から選ばれる１以上の表現型を有する、非ヒトノックアウト動物。
- 対象者におけるMex-3Bタンパク質の機能をノックアウトする工程を含む、寿命の延長、老化の抑制、肥満の抑制、インスリン感受性低減の改善、脂肪組織量の増大の抑制、及び糖尿病の改善から選ばれる１以上を達成するための処置方法。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2019098194A1 (ja) * | 2017-11-14 | 2021-01-14 | 国立大学法人広島大学 | 老化状態の評価方法、情報の提示方法、及び老化状態を改善又は予防する物質のスクリーニング方法 |
-
2015
- 2015-02-04 WO PCT/JP2015/053092 patent/WO2016125266A1/ja active Application Filing
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2019098194A1 (ja) * | 2017-11-14 | 2021-01-14 | 国立大学法人広島大学 | 老化状態の評価方法、情報の提示方法、及び老化状態を改善又は予防する物質のスクリーニング方法 |
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