CN109906272A - 产生人抗体的非人动物和使用该非人动物的人抗体制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可在后代中稳定地保持且能够产生人抗体的非人动物、该非人动物的制作方法，以及利用该非人动物制造人抗体的方法，其特征在于，所述非人动物含有小鼠人工染色体，所述小鼠人工染色体包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座和/或人抗体λ轻链基因或基因座，且至少2个对应于人抗体基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除。

Description

产生人抗体的非人动物和使用该非人动物的人抗体制作方法
技术领域
本发明涉及包含人抗体基因的小鼠人工染色体(Mouse Artificial Chromosome(MAC))，以及含有该MAC并可以产生人抗体的非人动物。
本发明还涉及上述非人动物的制作方法。
本发明还涉及使用上述非人动物制造人抗体的方法。
背景技术
抗体在医疗领域中作为癌症、类风湿性关节炎等治疗药而被应用。例如，曲妥珠单抗(Trastuzumab)作为针对癌细胞表面的HER2(或ErbB2)的分子靶向抗体药物，用于治疗乳腺癌。此外，托珠单抗(Tocilizumab)是人源化抗人白介素6(IL-6)受体抗体，用于类风湿性关节炎的治疗药。
为了在对人给药时提高治疗效果和安全性，要求抗体是人源化抗体或人抗体。人源化抗体是将来自小鼠等异种动物的抗体重链和轻链的互补决定区的氨基酸序列替换为人抗体的相应互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)而得到的抗体，可以结合单克隆抗体制作技术和DNA重组技术进行制作。而人抗体则是抗体的氨基酸序列完全来自人的抗体，可以通过利用携带人抗体基因的人抗体产生小鼠(例如KM小鼠(协和发酵麒麟株式会社))的技术、将ScFV等抗体以重组抗体的形式呈现在纤维状噬菌体表面的噬菌体展示法等制作。
与本发明相关的技术是制作可以产生人抗体的小鼠等非人动物的技术，这种动物保持有人抗体基因。由于构成该人抗体基因的重链基因、κ轻链基因、λ轻链基因分别存在于不同的染色体上，并且由于具有大约0.9Mb以上的大小，因此如果要制作产生人抗体的非人动物，需要人工染色体载体等染色体工程技术。
专利文献1中公开了一种非人动物和人抗体的制造方法，其使用包含人抗体基因的人类人工染色体能够产生人抗体的小鼠等。
专利文献2中公开了一种转基因有蹄动物，其特征在于，含有编码人免疫球蛋白基因的整体或其一部分的1个以上的核酸，并且所述有蹄动物选自由牛、绵羊和山羊组成的组，所述人免疫球蛋白基因表达经过重排的1个以上的人免疫球蛋白分子。
专利文献3中公开了一种人类人工染色体载体、具有该人类人工染色体载体的动物，以及生产人抗体的方法，所述人类人工染色体载体包含人抗体重链基因、人抗体轻链基因和人抗体替换轻链基因。
专利文献4中公开了一种小鼠人工染色体。
非专利文献1中对利用转基因动物生产人抗体进行了综述。该文献中举出了在目前的转基因动物中，人抗体的生产效率低的问题。作为该问题的解决方法，文献中提出了将内源性抗体基因敲除，并使人可变区的V、D、J片段与内源性C基因结合的方案。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本国专利第4082740号公报
专利文献2：日本国专利第3797974号公报
专利文献3：国际公布WO 2011/062206
专利文献4：日本国专利第5557217号公报
非专利文献
非专利文献1：M.Bruggemann et al.,Arc.Immunol.Ther.Exp.(2015)63:101-108
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供一种稳定地保持且可以传递给后代的产生人抗体的非人动物(例如小鼠、大鼠等)，以及使用该动物的人抗体的制造方法。
解决问题的技术方案
概括而言，本发明包含以下特征：
(1)一种非人动物，其含有小鼠人工染色体载体(以下称作“hIGHK-MAC”)，hIGHK-MAC包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体κ轻链基因或基因座。
(2)一种非人动物，其含有小鼠人工染色体载体(以下称作“hIGHL-MAC”)，hIGHL-MAC包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
(3)一种非人动物，其含有小鼠人工染色体(以下称“hIGHK-MAC”)和小鼠人工染色体载体(以下称“hIGHL-MAC”)，hIGHK-MAC包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体κ轻链基因或基因座；hIGHL-MAC包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
(4)一种非人动物，其含有小鼠人工染色体载体(以下称“hIGHKL-MAC”)，hIGHKL-MAC包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
(5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的非人动物，其中，所述非人动物为哺乳动物。
(6)根据上述(5)所述的非人动物，其中，所述哺乳动物为啮齿类。
(7)根据上述(6)所述的非人动物，其中，所述啮齿类为小鼠或大鼠。
(8)根据上述(1)～(7)中任一项所述的非人动物，其中，所述非人动物的至少2个内源性抗体基因或基因座被敲除。
(9)一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，所述方法包括：使上述(1)所述的非人动物与其中对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的同种非人动物进行交配，并选择含hIGHK-MAC且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
(10)一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，所述方法包括：使上述(2)所述的非人动物与其中对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座相的内源性抗体基因或基因座被敲除的同种非人动物进行交配，并选择含hIGHL-MAC且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
(11)一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，所述方法包括以下步骤：使上述(1)所述的非人动物与上述(2)所述的非人动物进行交配，制作含hIGHK-MAC和hIGHL-MAC的非人动物；以及使制作的非人动物与其中对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的同种非人动物进行交配，并选择含hIGHK-MAC和hIGHL-MAC且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
(12)一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，所述方法包括：使含有小鼠人工染色体载体(hIGHK-MAC)且对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物与含有小鼠人工染色体载体(hIGHL-MAC)且对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物进行交配，并选择含hIGHK-MAC和hIGHL-MAC且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物，其中，所述hIGHK-MAC包含人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ轻链基因或基因座，所述hIGHL-MAC包含人抗体重链基因或基因座以及人抗体λ轻链基因或基因座。
(13)一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，所述方法包括：使上述(4)所述的非人动物其中对应于人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座以及人抗体λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因被敲除的同种非人动物进行交配，并选择含hIGHKL-MAC且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
(14)一种制造人抗体的方法，所述方法包括以下步骤：向上述(1)～(8)中任一项所述的非人动物给予抗原物质；以及从所述非人动物中回收所产生的与所述抗原物质结合的人抗体。
(15)根据上述(14)所述的方法，其中，所述抗原物质为细胞、蛋白质、多肽或肽。
(16)一种制造人单克隆抗体的方法，所述方法包括以下步骤：向上述(1)～(8)中任一项所述的非人动物给予抗原物质；从所述非人动物中取出脾脏细胞；将所述脾脏细胞与骨髓瘤进行融合，制作杂交瘤；以及从所述杂交瘤中回收与所述抗原物质结合的抗体。
(17)根据上述(16)所述的方法，其中，所述抗原物质为细胞、蛋白质、多肽或肽。
(18)一种小鼠人工染色体载体，其包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座和/或人抗体λ轻链基因或基因座。
本发明的非人动物是产生敲除了内源性抗体重链和轻链基因或基因座，且携带人抗体重链和轻链基因或基因座的人抗体的非人动物。这种动物具有以下优点：在后代中稳定地保持有人抗体基因或基因座(即重链基因或基因座、κ轻链基因或基因座，以及λ轻链基因或基因座)，且能够产生人抗体。其中，小鼠人工染色体具有以下特征：几乎不包含来自小鼠的基因；携带人抗体基因；以及在小鼠、大鼠等啮齿类中稳定地传递给后代。
本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2016-213844号的公开内容。
附图说明
图1表示利用小鼠人工染色体(MAC)的人抗体产生小鼠和大鼠的制作步骤的概要。
图2表示人2号染色体的修饰，包括：在人2号染色体上的κ轻链基因的着丝粒(cen)侧***loxP序列，并在该基因的端粒(Tel)侧***FRT序列。
图3表示使用显示的靶向载体的同源重组法来修饰人2号染色体等位基因而得到的携带loxP的重组等位基因的制作。
图4是双色(two-color)FISH分析图，其表示在人2号染色***点特异性地***有PGKhygloxP5’HPRT(箭头)。
图5表示使用显示的靶向载体的同源重组法向人2号染色体等位基因中***FRT位点的步骤。
图6是双色FISH分析图，其表示保持有单拷贝，还***有PGK5’HPRTFRTBsd(箭头)的人2号染色体。
图7表示使用Cre/loxP***将人2号染色体上的IGK区域易位克隆到MAC的IGK-MAC的制作。
图8是双色FISH分析图，其表示在CHO细胞中独立保持有MAC(下侧箭头)和修饰的人2号染色体(上侧箭头)。
图9是双色FISH分析图，其表示独立保持有在MAC中携带IGK区域的IGK-MAC(下侧箭头)和副产物(上侧箭头)。
图10表示修饰的人14号染色体，其***有用于在IGK-MAC携带的IGH区域的FRT序列。
图11表示使用显示的靶向载体的同源重组法来修饰人14号染色体等位基因而得到的携带FRT的重组等位基因的制作。
图12是双色FISH分析图，其表示保持有单拷贝的人14号染色体，还***有PGKhyg3’FRTHPRT(箭头)。
图13是双色FISH分析图，其表示在CHO细胞中保持有单拷贝的表示来自PGKhygFRT3’HPRT的信号的人14号染色体。
图14表示在IGK-MAC携带的IGH区域的IGHK-MAC的制作步骤。
图15是双色FISH分析图，其确认到独立保持有单拷贝的IGK-MAC(下侧箭头)和单拷贝的修饰的人14号染色体(上侧箭头)的克隆。
图16是表示确认到独立存在单拷贝的IGHK-MAC(上侧箭头)的双色FISH分析图。下侧箭头表示因FRT/FLP重组而形成的副产物。
图17是表示以下内容的图：关于CHO IGHK-MAC克隆，使用BAC克隆CH17-405H5(IGK区域)和CH17-262H11(IGH区域)作为探针进行双色FISH分析，在该克隆内的MAC上分别观察到表示IGK区域和IGH区域存在的信号，确认构建了IGHK-MAC(箭头)。左框图：信号重合的图。中框图：仅表示CH17-405H5(IGK区域)的信号的图。右框图：仅表示CH17-262H11(IGH区域)的信号的图。
图18是表示以下内容的图：关于CHO IGHK-MAC克隆，使用BAC克隆CH17-216K2(IGK区域)和CH17-212P11(IGH区域)的组合作为探针进行双色FISH分析，在该克隆内的MAC上分别观察到表示IGK区域和IGH区域存在的信号，确认构建了IGHK-MAC(箭头)。左框图：信号重合的图。中框图：仅表示CH17-216K2(IGK区域)的信号的图。右框图：仅表示CH17-212P11(IGH区域)的信号的图。
图19是表示IGHK-MAC(箭头)转移到CHO K1细胞株的双色FISH分析图。
图20是对于CHO K1细胞株中的IGHK-MAC(箭头)使用BAC克隆CH17-216K2(IGK区域)和CH17-212P11(IGH区域)作为探针的双色FISH分析图。
图21是对于CHO K1细胞株中的IGHK-MAC(箭头)使用BAC克隆CH17-405H5(IGK区域)和RP11-731F5(IGH区域)作为探针的双色FISH分析图。
图22是携带IGHK-MAC(箭头)的小鼠ES的FISH分析图。
图23是携带IGHK-MAC(箭头)的大鼠ES的FISH分析图。
图24是来自携带IGHK-MAC的ES细胞且小鼠Igh、Igk被破坏的嵌合体小鼠中的流式细胞仪分析结果。
图25是来自携带IGHK-MAC的小鼠HKD31 6TG-9细胞的，IGHK-MAC是后代传递的(子孫伝達)，且Igh、Igk被破坏的小鼠中的流式细胞仪分析结果。
图26是来自携带IGHK-MAC的小鼠XO ES9细胞的，IGHK-MAC是后代传递的且Igh、Igk被破坏的小鼠中的流式细胞仪分析结果。
图27是来自携带IGHK-MAC的ES细胞的嵌合体大鼠(雄和雌)的图像。
图28是针对IGHK-MAC后代传递的大鼠，用ELISA评价血清中的人抗体产生的结果。
图29表示人22号染色体的修饰，包括：在人22号染色体上的λ轻链基因的着丝粒侧***loxP序列，并在该基因的端粒侧***FRT序列。
图30表示使用显示的靶向载体的同源重组法来修饰人22号染色体等位基因而得到的携带loxP的重组等位基因的制作。
图31是双色FISH分析图，其表示在人22号染色***点特异性地***有PGKhygloxP5’HPRT(箭头)。
图32表示使用显示的靶向载体的同源重组法将FRT位点***人22号染色体等位基因中的步骤。
图33是双色FISH分析图，其表示在人22号染色***点特异性地***有PGK5’HPRTFRTBsd(箭头)。
图34表示使用Cre/loxP***将人22号染色体上的IGL区域易位克隆到MAC的IGL-MAC的制作。
图35是双色FISH分析图，其表示在CHO细胞中独立保持有MAC(左侧箭头)和修饰的人22号染色体(右侧箭头)。
图36是双色FISH分析图，其表示独立保持有在MAC携带的IGL区域的IGL-MAC(右侧箭头)和副产物(左侧箭头)。
图37表示在IGL-MAC携带的IGH区域的IGHL-MAC的制作步骤。
具体实施方式
本发明提供一种非人动物，以及使用该非人动物制造人抗体的方法，其中，该非人动物含有小鼠人工染色体(Mouse Artificial Chromosome(MAC))，该小鼠人工染色体包含人抗体重链和轻链基因或基因座。
下面，对本发明进行更加详细的说明。
1.产生人抗体的非人动物
1.1小鼠人工染色体(MAC)
本说明书中的小鼠人工染色体(也称为“小鼠人工染色体载体”)是通过自上而下的方法构建的人工染色体，该人工染色体除了通过染色体修饰从小鼠染色体中将基因区域完全或基本完全删除而得到的天然着丝粒以外，在两个末端含有端粒序列，还可以含有DNA序列***位点等外源元件，作为这样载体的制作例，举例有本发明人开发的小鼠人工染色体载体的制作步骤(日本专利再表2011/083870号公报和日本专利第5557217号)。
小鼠人工染色体作为独立于应导入的细胞本来的染色体，能够稳定地复制和分配。来自小鼠的染色体片段为小鼠的1～19号、X和Y染色体中的任意染色体，优选为1号～19号染色体中的任意片段(长臂的所有内源基因数的至少99.5％、优选基本100％被删除的长臂片段)，该片段中包含靠近着丝粒的小鼠染色体长臂的位点删除了长臂远端的长臂片段。
小鼠染色体的序列信息可以从DDBJ/EMBL/基因库、圣克鲁斯生物技术公司等的染色体数据库获得。
染色体的“长臂”是指从小鼠染色体的着丝粒侧起包括基因区域的染色体区域。另一方面，小鼠染色体中几乎不存在短臂。
“远端”表示远离着丝粒的区域(即端粒侧)。相反，靠近着丝粒的区域(即着丝粒侧)则称为“近端”。长臂远端表示位于比长臂的特定位点更靠近端粒侧的区域；长臂近端表示位于比长臂的特定位点更靠近着丝粒侧的区域。
小鼠人工染色体载体的特征为：包含来自小鼠染色体的天然着丝粒、从着丝粒附近的小鼠染色体长臂的位点删除了上臂远端的来自小鼠染色体的长臂片段、端粒序列；以及在哺乳类的细胞和个体组织中稳定地保持。
术语“来自小鼠染色体的天然着丝粒”是指任何一个小鼠染色体的整个着丝粒(完整的着丝粒)。因此，在这种着丝粒中，不包含使用小鼠染色体的着丝粒序列的一部分偶然或人工获得的具有着丝粒功能的结构，以及其他动物种类的染色体的着丝粒。
由于要求尽可能地排除内源基因的影响，以使本发明的载体在小鼠、大鼠等啮齿类的细胞或组织中稳定地保持，且不会妨碍小鼠的个体发生和后代传递，因此，“从靠近着丝粒的小鼠染色体长臂的位点删除了上臂远端的来自小鼠染色体的长臂片段”是指为为了除去小鼠染色体长臂中的内源基因而在靠近着丝粒的长臂位点删除而得到的长臂片段。这指的是，在通过在靠近着丝粒的长臂位点处删除全部内源基因(数)的至少99.5％、优选至少99.7％、更优选至少99.8％、最优选99.9％～100％，而得到的长臂片段。
本说明书中使用的“保持率”是指在小鼠、大鼠等啮齿类等哺乳动物的培养细胞或组织细胞中，存在人工染色体的细胞的比例。
本发明的染色体载体“稳定地保持”，表示在细胞***时该染色体载体不易发生脱落，即，即使在***后也会在细胞内稳定地保持，因此，该染色体载体可以有效地传递给子细胞或后代小鼠。
例如在来自小鼠11号染色体片段的人工染色体载体中，上述长臂片段例如但不限于由删除了比该11号染色体的长臂的AL671968或BX572640(位于比AL671968更靠近着丝粒侧)、CR954170(位于比AL671968和BX572640更靠近着丝粒侧)或AL713875(位于比AL671968更靠近着丝粒侧)更远端的区域的长臂片段组成。此外，例如在来自小鼠15号染色体片段的人工染色体载体中，上述长臂片段例如但不限于由删除了比AC121307、AC161799等位置更远端的区域的长臂片段组成。在来自小鼠16号染色体片段的人工染色体载体中，上述长臂片段例如但不限于删除了比AC127687、AC140982等位置更远端的区域的长臂片段组成。这些基本结构中，还可以包含用于***人抗体基因序列的loxP等DNA序列***位点。
该载体在包括小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类的哺乳类的细胞或个体组织中保持率提高，由此在细胞内稳定地保持，因此能够长期稳定地保持有目标人抗体基因(组)，可以在啮齿类的个体间或组织间长期表达而不会出现导入基因量的差异。作为与人类人工染色体(HAC)相比的有意思的特性，是在包括HAC的保持率低于20％的非常低的血液***组织在内的组织间的差异极少，保持率在试验后的任何组织(例如来自肝脏、肠、肾脏、脾脏、肺、心脏、骨骼肌、大脑或骨髓的组织)中均为90％以上。
本说明书中的“DNA序列***位点”表示人工染色体中可以***目标DNA(包含基因)序列的位点，例如位点特异性重组酶的识别位点等。这种识别位点例如包括但不限于：loxP(Cre重组酶识别位点)、FRT(Flp重组酶识别位点)、φC31attB和φC31attP(φC31重组酶识别位点)、R4attB和R4attP(R4重组酶识别位点)、TP901-1attB和TP901-1attP(TP901-1重组酶识别位点)，或Bxb1attB和Bxb1attP(Bxb1重组酶识别位点)等。
本说明书中的“位点特异性重组酶”是用于在这些酶的识别位点特异性地与目标DNA序列发生重组的酶。可举出：Cre整合酶(也称为Cre重组酶)、Flp重组酶、φC31整合酶、R4整合酶、TP901-1整合酶、Bxb1整合酶等。
本说明书中的“端粒序列”为同种或异种的天然端粒序列，或人工端粒序列。其中，同种表示与人工染色体载体的染色体片段的来源小鼠为同种的动物；而异种则表示该小鼠以外的哺乳动物(包括人)。此外，人工端粒序列是指(TTAGGG)N序列(n表示重复)等人工制作的具有端粒功能的序列。端粒序列引入到人工染色体例如可以通过国际公布WO 00/10383记载的端粒截短(端粒序列的替换)来进行。端粒截短可以在本发明的人工染色体制作中用于缩短染色体。
本说明书中的“胚胎干细胞”或“ES细胞”是从来自哺乳动物的受精卵胚囊的内细胞团建立的具有分化多能性和半永久性增殖能力的干细胞(M.J.Evans and M.H.Kaufman(1981)Nature 292:154-156；J.A.Thomson et al.(1999)Science 282:1145-1147；J.A.Thomson et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844-7848；J.A.Thomson etal.(1996)Biol.Reprod.55:254-259；J.A.Thomson and V.S.Marshall(1998)Curr.Top.Dev.Biol.38:133-165)。具有与该细胞同等性质、且通过体细胞的重编程进行人工诱导的细胞是“人工多能干细胞”或“iPS细胞”(K.Takahashi and S.Yamanaka(2006)Cell 126:663-676；K.Takahashi et al.(2007)Cell 131:861-872；J.Yu et al.(2007)Science 318:1917-1920)。
下面对小鼠人工染色体载体的制作及其用途进行说明。
本发明的人工染色体载体可以通过包括以下步骤(a)～(c)的方法来制作：
(a)获得携带小鼠染色体的细胞的步骤；
(b)删除小鼠染色体的长臂远端，使其不包含内源基因(数)的大部分(99.5％～100％、优选100％)的步骤；以及
(c)在长臂近端***1个以上的DNA序列***位点的步骤。
其中，步骤(b)和(c)的顺序也可颠倒。
步骤(a)：
为了制作本发明的人工染色体载体，首先要制作保持有小鼠染色体的细胞。例如，可以通过以下方式制作：将携带耐药基因(例如杀稻瘟菌素S抗性基因(blasticidin Sregistance gene)(BSr))标记的小鼠染色体的小鼠成纤维细胞即小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast)(mChr11-BSr)和导入有G418抗性基因即neo基因的小鼠A9细胞(ATCC VA20110-2209)即小鼠A9(neo)进行细胞融合，从保持有抗药性基因标记的小鼠染色体的小鼠A9杂种细胞即小鼠A9x小鼠胚胎成纤维细胞(mouse A9x mouse embryonicfibroblast)(neo；mChr11-BSr)中，将其染色体转移到同源重组率高的细胞中。小鼠成纤维细胞可以根据文献记载的方法得到，例如，小鼠成纤维细胞可以根据能从日本CLEA株式会社得到的C57B6品系的小鼠建立。作为同源重组率高的细胞，例如可以使用鸡DT40细胞(Dieken et al.,Nature Genetics,12:174-182,1996)。此外，上述转移可以通过公知的染色体转移法，例如微核细胞融合法(Koi et al.,Jpn.J.Cancer Res.,80:413-418,1973)进行。
步骤(b)：
在携带来自小鼠的单一染色体的细胞中，删除该小鼠染色体的长臂远端。此时，重要的是，将存在于长臂上的内源基因的大部分删除(或者除去或缺失)，构建携带小鼠着丝粒的人工染色体。确定切断位置，以删除(或者除去或缺失)存在于长臂上的全部内源基因(数)的至少99.5％、优选至少99.7％、更优选至少99.8％、最优选99.9％～100％。由此，可以稳定并以高保持率在导入有人工染色体的来自哺乳动物、优选来自小鼠、大鼠等啮齿类的细胞、组织或个体中保持，用于目标基因(组)的准确分析、物质生产等。上述内源基因的删除，例如可以通过端粒截短来进行。具体而言，在携带小鼠染色体的细胞中，构建携带人工端粒序列的靶向载体，并通过同源重组获得其中在染色体上的所希望位置***有人工或天然端粒序列的克隆，由此，通过端粒截短来得到缺失突变体。即，所希望位置(或位点)是要删除的长臂远端的切割位置，在该位置，人工端粒序列通过同源重组被替换、***，长臂远端被删除。该位置可以通过构建靶向载体时的靶序列的设计来适当设定。例如，根据小鼠染色体长臂的DNA序列设计靶序列，使得在与该靶序列相比离端粒侧更近的位置发生端粒截短。由此可以得到大部分内源基因被删除的小鼠11号染色体片段。关于其他染色体，也可同样实施端粒截短。
步骤(c)：
作为DNA序列***位点，优选可以***位点特异性重组酶的识别位点。即，已知某种酶会识别特定的识别位点，在该识别位点特异性地产生DNA的重组的现象。本发明的小鼠人工染色体载体可以利用由这种酶和该酶的识别位点组成的***，来***和携带目标基因或DNA序列。作为该***，例如可举出：来自噬菌体P1的Cre酶及其识别位点loxP序列的***(Cre/loxP***；B.Sauer in Methods of Enzymology；1993,225:890-900)、来自芽殖酵母的Flp酶及其识别位点FRT(Flp Recombination Target)序列的***(Flp/FRT***)、来自链霉菌噬菌体的φC31整合酶及其识别位点φC31attB/attP序列的***、R4整合酶及其识别位点R4attB/attP序列的***、TP901-1整合酶及其识别位点TP901-1attB/attP序列的***、Bxb1整合酶及其识别位点Bxb1attB/attP序列的***等，但只要能发挥DNA序列***位点的功能，则不限于上述***。
为了***这种位点特异性重组酶的识别位点，可以利用公知方法如同源重组法，***位置和数量可以在长臂近端和短臂近端内适当地设定。
在小鼠人工染色体载体中，可以***单一种类识别位点或不同种类的识别位点。通过设定识别位点，可以找到目标基因或者基因座或DNA序列(即人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座，或人抗体λ轻链基因或基因座)的***位置，因此***位置固定，不会受到预想外的位置效应(position effect)。
在具有DNA序列***位点的小鼠人工染色体载体中，优选可以保留目标基因或DNA序列的***位点，并预先***报告基因。作为报告基因，没有特别限制，例如可举出：荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP或EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)等)基因、标签蛋白编码DNA、β-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等，优选GFP或EGFP。
小鼠人工染色体载体还可以包含选择标记基因。选择标记物在用该载体筛选转化的细胞时有效。作为选择标记基因，可举出：正选择标记基因和负选择标记基因中的任一种，或它们二者。正选择标记基因包括抗药性基因，例如新霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、杀稻瘟菌素S(BS)抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、遗传霉素(G418)抗性基因、潮霉素抗性基因等。此外，负选择标记基因例如包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因、白喉毒素A片段(DT-A)基因等。HSV-TK一般与更昔洛韦或阿昔洛韦组合使用。
作为在小鼠人工染色体载体中***报告基因或目标外源基因或DNA的方法，可以优选使用同源重组法。同源重组可使用靶向载体来进行，所述靶向载体是在与小鼠染色体上的***位置的5’侧区和3’侧区的碱基序列(各约1～4kb，优选约2～4kb)同源的两个序列(5’臂和3’臂)之间连接应***的DNA盒而得到的。作为出于该目的而使用的载体，例如可举出质粒、噬菌体、粘粒、病毒等，优选为质粒。用于构建靶向载体的基本质粒的示例为V907或V913(Lexicon Genetics)等，但并不限于此。基本载体可以包含启动子、增强子、选择标记基因、复制起点等在构建载体时普遍***的1个或2个以上的序列或元件。
利用上述方法制作的小鼠人工染色体载体包含来自小鼠的染色体片段(其包含天然着丝粒、至少99％、优选至少99.5％～100％的内源基因被删除的长臂片段和(如果存在)短臂)和人工端粒序列。此外，上述着丝粒是用于制作人工染色体的小鼠染色体的整个着丝粒结构。在该载体的DNA结构中，可以***如下DNA序列***位点、选择标记基因、外源基因(或DNA)等。
上述小鼠人工染色体载体中，优选包含1个或多个DNA序列***位点，例如位点特异性重组酶的识别位点(例如Cre酶识别位点loxP序列)。其中，位点特异性重组酶的识别位点例如为GFP-PGKneo-loxP-3’HPRT类型的loxP序列，或者5’HPRT-loxP-hyg类型或PGKneo-loxP-3’HPRT类型的loxP序列，或者GFP-5’HPRT-loxP-PGKhyg类型的loxP序列，但并不限于此。其中，GFP是绿色荧光蛋白基因，PGKneo是磷酸甘油酸激酶启动子/新霉素抗性基因盒，HPRT是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因，hyg是潮霉素抗性基因。
上述小鼠人工染色体载体还可以包含报告基因、选择标记基因(正选择标记基因、负选择标记基因等)。该载体还可以包含目标外源基因或DNA序列。
本发明的小鼠人工染色体载体具有现有的人工染色体载体的优点，可举出：1)由于不被***宿主染色体中而是独立地维持，因此不会破坏宿主基因；2)由于稳定地携带一定的拷贝数(可以是复数(多)拷贝)，且受到宿主细胞的生理表达控制，因此不会发生***的基因过量表达和表达消失；3)由于可导入的DNA大小没有限制，因此可以导入含有表达调控区的基因和多种基因/异构体(isoform)；除此以外，还可举出以下优点：4)啮齿类细胞或啮齿类个体中的保持率高于现有的人工染色体；5)实现导入基因的长期稳定表达，且后代传递率提高，因此基因导入小鼠的制作效率有提高；6)载体导入后的组织间的差异小，即保持率在任何组织中均为90％以上，即使在HAC的保持率低于20％的血液***组织中，保持率也是90％以上等。
如下文所述，上述小鼠人工染色体载体可以包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座和/或人抗体λ轻链基因或基因座。即，其含有小鼠人工染色体载体(hIGHK-MAC)、小鼠人工染色体载体(hIGHL-MAC)和小鼠人工染色体载体(hIGHKL-MAC)中的任一种，所述小鼠人工染色体载体(hIGHK-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体κ轻链基因或基因座；所述小鼠人工染色体载体(hIGHL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座；所述小鼠人工染色体载体(hIGHKL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
1.2人抗体基因
在本发明的小鼠人工染色体载体中，可以导入人抗体基因。
本说明书中使用的“人抗体基因或基因座”，如无特别说明，则是指来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座、来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座，以及/或者来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座。具体而言，人抗体基因或基因座例如由人14号染色体的免疫球蛋白重链基因座(人)NC_000014.9((碱基编号105586437……106879844)或(碱基编号105264221……107043718))、人2号染色体的免疫球蛋白κ基因座(人)NC_000002.12((碱基编号88857361……90235368)或(碱基编号88560086……90265666))，以及人22号染色体的免疫球蛋白λ基因座(人)NC_000022.11((碱基编号22026076……22922913)或(碱基编号21620362……23823654))记载的碱基序列表示。人抗体重链基因或基因座约为1.3Mb碱基长度，人抗体κ轻链基因或基因座约为1.4Mb碱基长度，人抗体λ轻链基因或基因座约为0.9Mb碱基长度。
附带说明，小鼠的抗体重链基因或基因座位于小鼠第12号染色体上，小鼠的抗体κ轻链基因或基因座位于小鼠第6号染色体上，小鼠抗体λ轻链基因或基因座位于小鼠第16号染色体上。具体而言，小鼠抗体重链基因或基因座例如由染色体(Chromosome)12,NC_000078.6(113258768……116009954,互补序列(complement))记载的碱基序列表示，小鼠抗体κ轻链基因或基因座由染色体(Chromosome)6,NC_000072.6(67555636……70726754)记载的碱基序列表示，小鼠抗体λ轻链基因或基因座由染色体(Chromosome)16,NC_000082.6(19026858……19260844,互补序列(complement))记载的碱基序列表示。
另外，大鼠的抗体重链基因或基因座位于大鼠第6号染色体上，大鼠的抗体κ轻链基因或基因座位于大鼠第4号染色体上，大鼠抗体λ轻链基因或基因座位于大鼠第11号染色体上。同样，这些基因或基因座的碱基序列可以从美国NCBI(基因库等)、公知文献等获得。
即，本发明中，包含上述人抗体基因的上述小鼠人工染色体载体是包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体载体(hIGHK-MAC)，或者是包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体载体(hIGHL-MAC)，或者是包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座、来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座，以及来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座这三者的小鼠人工染色体载体(hIGHKL-MAC)。这些载体可以通过使用本说明书记载的染色体工程技术来制作。
以下记载的本发明的非人动物，是携带上述包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体载体，以及包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体载体的动物；或者是携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座、来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座，以及来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体载体的动物。由此，上述非人动物在被给予抗原物质时，可以产生对该物质的人抗体。
本说明书中，人抗体可以是人免疫球蛋白(Ig)的任何类型和亚类。该类型包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，亚类包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。这些类型和亚类可以根据重链的不同而分类，IgG链称为γ链，与IgG1～IgG4相对应地称为γ1、γ2、γ3和γ4链，IgA、IgM、IgD、IgE分别称为α链(α1和α2)、μ链、δ链、ε链。已知任何抗体的轻链都有κ链和λ链，在免疫球蛋白基因的重排的过程中，如果κ链基因的重构无效，则会发生λ链基因的重构。此外，人抗体重链基因座从5’起至3’依次含有：包含VH1、VH2……VHm(其中，m例如为38～46)的V(可变(variable))区基因；包含DH1、DH2……DHn(其中，n例如为23)的D(多样性(diversity))区基因；包含JH1、JH2……JHr(其中，r为6)的J(连接(joining))区基因；包含Cμ、Cδ、Cγ3、Cγ1、Cα1、Cγ2、Cγ4、Cε、Cα2的C(恒定(constant))区基因。免疫***中，经由上述人免疫球蛋白基因的重排而产生的抗体就是人抗体。
人抗体分子由2条人抗体重链和2条人抗体轻链组成，每条重链和每条轻链通过二硫键结合，并且，2条重链具有在恒定(C)区通过2个二硫键结合的结构。此外，抗体分子的可变(V)区有3个高变区，被称为互补决定区(complementarity-determining region(CDR))，从N末端侧起，叫做CDR1、CDR2和CDR3。根据该CDR区序列的不同，抗体对抗原的结合特性有变化。已知免疫球蛋白基因的重构会使抗体产生多样性。
1.3非人动物的制作
如上所述，本发明的非人动物，是携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体载体、包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体载体的动物；或者是携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座、来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座，以及来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体载体的动物。
具体而言，例如通过图1所示的步骤，可以制作能够产生人抗体的本发明的非人动物(小鼠和大鼠)。
下面将针对利用小鼠人工染色体的非人动物的制作例进行说明。
用细胞融合法将通过导入位点特异性重组酶的识别位点(例如loxP和FRT)修饰的、携带来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的动物细胞(例如DT40)和携带来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的动物细胞(例如DT40)(图1的步骤1、2)分别转移到携带小鼠人工染色体(MAC)的啮齿类细胞(例如CHO)中之后(图1的步骤3)，诱导位点特异性重组酶(例如Cre)表达，由此制作携带包含人抗体κ轻链基因或基因座的MAC的啮齿类细胞，以及携带包含人抗体λ轻链基因或基因座的MAC的啮齿类细胞(图1的步骤4)。
在向动物细胞(例如DT40)中携带的人14号染色体上的人抗体重链基因或基因座的附近导入位点特异性重组酶的识别位点(例如FRT)之后(图1的步骤5)，用细胞融合法将修饰的携带人抗体重链基因或基因座的动物细胞转移到携带MAC的啮齿类细胞(例如CHO)中，制作携带包含人抗体重链基因或基因座的MAC的啮齿类细胞(图1的步骤6)。
将上述携带包含人抗体κ轻链基因或基因座的MAC的啮齿类细胞，以及携带包含人抗体λ轻链基因或基因座的MAC的啮齿类细胞，分别与上述携带人抗体重链基因或基因座的啮齿类细胞进行融合，由此将包含人抗体κ轻链基因或基因座的MAC，或包含人抗体λ轻链基因或基因座的MAC转移到携带人抗体重链基因或基因座的啮齿类细胞内之后(图1的步骤7)，诱导位点特异性重组酶(例如FLP)，由此分别制作携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的MAC的啮齿类细胞，以及携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的MAC的啮齿类细胞(图1的步骤8)。
通过微核细胞融合法，将上述携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的MAC的啮齿类细胞，以及携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的MAC的啮齿类细胞，分别与非人动物(例如小鼠或大鼠)分化多能干细胞(例如ES细胞或iPS细胞)进行融合，制作携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的MAC的非人动物分化多能干细胞，以及携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的MAC的非人动物分化多能干细胞(图1的步骤9)。
将上述携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的MAC的非人动物分化多能干细胞，以及携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的MAC的非人动物分化多能干细胞，分别移植到非人动物的早期胚胎(例如8细胞期胚胎或胚囊期胚胎)中，制作携带上述各MAC的嵌合体动物，再制作后代动物(图1的步骤10)。再通过后代动物之间的交配，制作携带上述各MAC的后代动物。
通过使用相同方法，可以制作含有上述小鼠人工染色体载体(hIGHKL-MAC)的非人动物，所述小鼠人工染色体载体(hIGHKL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
使上述携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的MAC的非人动物，或者携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的MAC的非人动物，与对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的同种非人动物进行交配，制作：携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的MAC、且对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物；或者携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的MAC、且对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
或者，使上述携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的MAC的非人动物，以及携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的MAC的非人动物，与对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座相对应的内源性抗体基因或基因座被敲除的同种非人动物进行交配，制作携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的MAC以及携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的MAC、且对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座中的内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
或者，使含有小鼠人工染色体载体(hIGHKL-MAC)的非人动物，与对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的同种非人动物进行交配，制作含hIGHKL-MAC且该动物的该内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物，其中，所述小鼠人工染色体载体(hIGHKL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
下面对上述方法进行更加详细的说明。
本说明书中，“非人动物”是除了人以外的哺乳动物，例如啮齿类(例如小鼠、大鼠、仓鼠等)、有蹄类(例如牛、山羊等)等，优选为啮齿类，更优选为大鼠。
本发明中包含人抗体基因的小鼠人工染色体载体，可以转移或导入到任何细胞。其方法例如包括微核细胞融合法、脂质体转染法、磷酸钙法、微注射法、电穿孔法等，优选方法为微核细胞融合法。
微核细胞融合法是通过含有小鼠人工染色体载体且具有微核形成能力的供体细胞(例如小鼠A9细胞、CHO细胞)与所希望的受体细胞的微核融合，将该载体转移到该其他细胞中的方法。具有微核形成能力的细胞用多倍体诱导剂(例如秋水仙酰胺、秋水仙素等)处理，形成微核多核细胞，通过细胞松弛素处理形成微核体，进行上述处理后，与所希望的受体细胞进行细胞融合。
可导入上述小鼠人工染色体载体的受体细胞包括：动物细胞，优选包括人细胞的哺乳动物细胞；例如***、***细胞等生殖系列细胞；胚胎干(ES)细胞、***干(GS)细胞、成体干细胞等干细胞；体细胞；胚胎细胞；成体细胞；正常细胞；疾病细胞；原代培养细胞；继代细胞或株化细胞等。干细胞例如包括：ES细胞、胚胎生殖(EG)细胞、胚胎癌(EC)细胞、mGS细胞、人间充质干细胞等多能干细胞；人工多能干(iPS)细胞；来自核移植克隆胚胎的胚胎干(ntES)细胞等。优选的细胞选自由以下细胞组成的组：来自哺乳动物(优选包括小鼠、大鼠的啮齿类)的体细胞、非人生殖系列细胞、干细胞和前体细胞。当细胞是来自啮齿类等哺乳类的细胞时，导入有本发明载体的哺乳类(例如小鼠、大鼠等啮齿类)的细胞或组织中，载体被更加稳定地保持，即载体从细胞的脱落明显降低，或不会发生脱落。
细胞例如为：肝细胞、肠细胞、肾细胞、脾细胞、肺细胞、心脏细胞、骨骼肌细胞、脑细胞、骨髓细胞、淋巴细胞、巨核细胞、***、卵子等。
组织例如为：肝脏、肠、肾脏、脾脏、肺、心脏、骨骼肌、大脑、骨髓、***、卵巢等组织。
ES细胞可以通过从目标动物的受精卵的胚囊提取内细胞团，将丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层来建立和维持(M.J.Evans和M.H.Kaufman(1981)Nature292:154-156)。
iPS细胞通过以下方式，在约3～5周内生成集落：在体细胞(包括成体干细胞)导入某特定的重编程因子(DNA或蛋白质)，用适当的培养基进行培养、继代培养。重编程因子例如已知有：由Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc组成的组合；由Oct3/4、Sox2和Klf4组成的组合；由Oct4、Sox2、Nanog和Lin28组成的组合；或者由Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28组成的组合等(K.Takahashi and S.Yamanaka,Cell 126:663-676(2006)；WO 2007/069666；M.Nakagawa et al.,Nat.Biotechnol.26:101-106(2008)；K.Takahashi et al.,Cell131:861-872(2007)；J.Yu et al.,Science 318:1917-1920(2007)；J.Liao et al.,CellRes.18,600-603(2008))。培养的例子包括：将经过丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞株(例如STO)作为饲养细胞，在该饲养细胞层上使用ES细胞用培养基，在大约37℃的温度下培养已导入载体的体细胞(约104～105细胞/cm2)。饲养细胞不是必需的(Takahashi,K.etal.,Cell 131:861-872(2007))。基础培养基例如可以使用Dulbecco’s Modified Eagle培养基(DMEM)、Ham’s F-12培养基、它们的混合培养基等；ES细胞用培养基可以使用小鼠ES细胞用培养基、灵长类ES细胞用培养基(Reprocell公司)等。
已知ES细胞和iPS细胞有助于生殖系列，因此可以通过包括以下内容的方法来制作非人动物(或转基因动物(人除外))：将导入有包含目标人抗体基因或基因座的本发明的小鼠人工染色体载体的这些细胞注入到该细胞的来源即同种哺乳动物的胚胎的胚囊中，将该胚胎移植到假母的子宫中，使其出生。此外，通过使得到的雌雄转基因动物进行交配，可以制作纯合子动物，进而制作其后代动物。
经由本发明的小鼠人工染色体载体，在ES细胞和iPS细胞等分化多能细胞、其他的上述细胞类中导入上述人抗体基因或基因座，由此可以制作能够产生人抗体的非人动物。
这种非人动物中，关于小鼠人工染色体载体所包含的人抗体基因或基因座，优选对应于人抗体重链和轻链(κ和λ)基因或基因座的内源基因或基因座被敲除(破坏或缺失)。关于敲除方法，可以使用基因靶向法、CRISPR/Cas9***的基因组编辑法(M.Jinek et al.,Science 337:816-821(2012)等)等。内源基因被敲除、且携带人抗体基因或基因座的非人动物可以通过以下方式制作：使携带包含人抗体基因(基因座)的小鼠人工染色体载体的嵌合体非人动物或其后代，与每簇缺失相对应的内源基因的嵌合体动物或后代进行交配，再使得到的该内源基因异源缺失的动物彼此进行交配。
通过上述方法，可以制作：1)携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的MAC、且对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除、且携带非人动物小鼠人工染色体载体的细胞和转基因非人动物；2)携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的MAC、且对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除、且携带非人动物小鼠人工染色体载体的细胞和转基因非人动物；3)携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座的MAC并且携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座和来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的MAC、且对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除、且携带非人动物小鼠人工染色体载体的细胞和转基因非人动物；或者，4)携带包含来自人14号染色体的人抗体重链基因或基因座、来自人2号染色体的人抗体κ轻链基因或基因座以及来自人22号染色体的人抗体λ轻链基因或基因座的MAC、且对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除、且携带非人动物小鼠人工染色体载体的细胞和转基因非人动物。具体的非人动物的示例是携带小鼠人工染色体载体的小鼠和大鼠等啮齿类。
另外，可以产生人抗体的转基因大鼠的制作通过上述方法有时不会成功。以下(A)、(B)和(C)记载的方法是上述方法的替代方法。
(A)大鼠ES细胞(雄品系)的制作
大鼠的ES细胞与小鼠ES细胞的情况相同(M.J.Evans and M.H.Kaufman,Nature1981；292(5819):154-156)，是从大鼠胚囊期胚胎或8细胞期胚胎的内细胞团建立的具有多分化能力和自我复制能力的细胞株。例如，使用含有白血病抑制因子(LIF)的培养基，在小鼠胚胎成纤维细胞(MEFF)饲养层上培养溶解了卵透明带的大鼠胚囊，7～10天后将从胚囊形成的生长物(outgrowth)分散，将其转移到MEF饲养层上进行培养，大约7天后，出现ES细胞。关于大鼠ES细胞的制作，例如K.Kawaharada et al.,World J Stem Cells 2015；7(7):1054-1063有记载。
ES细胞有雌品系和雄品系，本发明可以使用雄品系的大鼠ES细胞，更优选使用根据杂种大鼠制作的雄品系的大鼠ES细胞。通过使用该ES细胞和ROSI法以及荧光筛选法，能够得到可传递给后代的模型大鼠。雄品系的ES细胞可以通过以下方式来筛选：使用XY染色体探针(例如可从Chromosome Science Labo Inc.等获得)分析制作的ES细胞株的XY核型。本说明书中，“雄品系的ES细胞”或“ES细胞(雄品系)”是指具有XY核型的ES细胞。
作为与ES细胞相似的干细胞，已知有上述人工多能干(iPS)细胞；作为ES细胞的替代，也可以使用大鼠iPS细胞(W.Li et al.,Cell Stem Cell 2009；4:16-19；S.Hamanakaet al.,PLoS One 2011；6:e22008)。
(B)微核细胞融合(MMCT)
微核细胞融合法如上所述，是可以将例如单一或少数染色体或其片段等约0.9Mb以上的巨核酸(这里是指包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座，或人抗体λ轻链基因或基因座的染色体或其片段)从供体细胞转移到受体细胞的技术。该方法包括：将供体细胞微核化的第1步骤；将微核化细胞脱核的第2步骤；将微细胞分离的第3步骤；将微细胞和受体细胞融合的第4步骤；以及选择存活的微细胞杂种克隆的第5步骤。
除了上述说明以外，下面再对MMCT进行更加详细的说明。
供体细胞的微核化可以通过将动物细胞在含有秋水仙酰胺等微核细胞诱导剂的培养基中长时间培养来进行。其中，微核细胞诱导剂具有诱发染色体解凝和核膜重新形成的能力。微核细胞诱导剂的浓度只要能引起微核化就没有限制，例如，如果是秋水仙酰胺，则每约5×106个受体细胞为约0.01μg/ml～约1μg/ml，优选为0.05～0.5μg/ml。通过微核化，从供体细胞形成含有少量细胞质和包含1个或少数染色体的微核的细胞，即微细胞。关于培养，使用供体细胞的培养条件，一般使用动物细胞用培养基作为培养基。动物细胞用培养基例如含有Eagle培养基(MEM)、Eagle最低基础培养基(EMEM)、Dulbecco’s ModifiedEagle’s培养基(DMEM)、Ham’s F12培养基等。培养基中也可以加入胎牛血清(FBS)、替代血清(Stem Sure(R)Serum Replacement等)等。温度为室温～约37℃，此外培养时间以约40～80小时为宜。
微核化细胞的脱核使用细胞松弛素B进行。将含有微核化的细胞的培养液倒入离心管，以约10μg/ml的浓度加入细胞松弛素B，在34℃以约11,900×g进行离心分离。将沉降的微细胞悬浮在无血清培养基中并回收。微细胞的纯化可以通过超滤来进行。准备孔径8μm、5μm、3μm这三种膜，依次过滤。
微细胞与受体细胞的融合，是在完全汇合前结束培养的受体细胞上重叠纯化微细胞进行培养。微细胞融合细胞可以通过选择抗药株等方法来进行。
该融合可以使用聚乙二醇(PEG)法、逆转录法等(T.Suzuki et al.,PLOS ONE,DOI:10.1371/journal.pone.0157187(2016))方法、MV法(M.Katoh et al.,BMCBiotechnology 2010,10:37)等进行。逆转录法是使用来自亲嗜性(ecotropic)或双嗜性(amphotropic)MLV的缺失R肽的Env(R-peptide-deleted Env(EnvΔR))进行微细胞和受体细胞融合的方法，在啮齿类细胞中是效率最高的方法。此外，MV法是使用麻疹病毒融合体(measles virus fusogen)的血凝素蛋白(MV-H)和融合蛋白(MV-F)促进微细胞融合的方法。从预先通过MV-H质粒和MV-F质粒转化的供体细胞制作的微细胞，由于在细胞膜表面存在表达的融合体，因此容易与受体细胞发生细胞-细胞融合。
优选地，预先向供体细胞导入上述人染色体或其片段作为外源核酸。此时，该人染色体向微细胞移动，通过微细胞融合而被导入受体细胞内。结果是该受体细胞通过人染色体而被转化。
(C)卵子内圆形***细胞注射(ROSI)
ROSI(Round Spermatid Injection，圆形***细胞注射)法是在将从上述嵌合体大鼠(雄)的***取出的生精管切碎制作悬浮液时，将圆形***细胞吸到吸量管内，在吸量管内将核与细胞质混杂在一起，然后将其注入大鼠卵子进行显微受精的方法(C.Tsurumakiet al.,J.Mamm.Ova Res.2009；26:86-93(Jp))。进一步，将受精的卵子移植到假母的子宫，嵌合体大鼠出生后，使用携带上述人抗体基因或基因座的雌大鼠(或雄大鼠)，与纯种或杂种、优选杂种的雄大鼠(或雌大鼠)进行交配，可以得到在大鼠各种组织内携带人抗体基因或基因座的大鼠。
作为ROSI法的替代，也可以通过卵胞浆内单***显微注射法(ICSI)来对卵子和***进行显微受精。
概括而言，本发明的非人动物包含以下动物。
1)一种非人动物，其特征在于，所述非人动物含有小鼠人工染色体(hIGHK-MAC)，所述小鼠人工染色体(hIGHK-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体κ轻链基因或基因座。
2)一种非人动物，其特征在于，所述非人动物含有小鼠人工染色体(hIGHL-MAC)，所述小鼠人工染色体(hIGHL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
3)一种非人动物，其特征在于，所述非人动物含有小鼠人工染色体(hIGHK-MAC)和小鼠人工染色体(hIGHL-MAC)，所述小鼠人工染色体(hIGHK-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体κ轻链基因或基因座；所述小鼠人工染色体(hIGHL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
4)一种非人动物，其特征在于，所述非人动物含有小鼠人工染色体(hIGHKL-MAC)，所述小鼠人工染色体(hIGHKL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
5)一种非人动物，其特征在于，所述非人动物含有小鼠人工染色体(hIGHK-MAC)，且对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除，其中，所述小鼠人工染色体(hIGHK-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体κ轻链基因或基因座。
6)一种非人动物，其特征在于，所述非人动物含有小鼠人工染色体(hIGHL-MAC)，且对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除，其中，所述小鼠人工染色体(hIGHL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
7)一种非人动物，其特征在于，所述非人动物含有小鼠人工染色体(hIGHK-MAC)和小鼠人工染色体(hIGHL-MAC)，且对应于人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座以及人抗体λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除，其中，所述小鼠人工染色体(hIGHK-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体κ轻链基因或基因座；所述小鼠人工染色体(hIGHL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
8)一种大鼠，其特征在于，所述大鼠含有小鼠人工染色体(hIGHKL-MAC)，且对应于人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座以及人抗体λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因被敲除，其中，所述小鼠人工染色体(hIGHKL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
上述非人动物为啮齿类、有蹄类等哺乳动物、鸟类等。啮齿类包括小鼠、大鼠、仓鼠等。有蹄类包括牛、山羊等。鸟类包括家鸡(例如鸡)等。优选的非人动物为小鼠、大鼠和牛，更优选为大鼠。
能够产生人抗体的非人动物的制作方法包括以下方法。
1)一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，包括：使含有包含人抗体重链基因或基因座和人抗体κ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体(hIGHK-MAC)的非人动物，与对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的同种非人动物进行交配，选择含hIGHK-MAC、且对应于人抗体重链基因或基因座和人抗体κ和λ轻链基因或基因座相的内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
2)一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，包括：使含有包含人抗体重链基因或基因座和人抗体λ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体(hIGHL-MAC)的非人动物，与对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的同种非人动物进行交配，选择含hIGHL-MAC、且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
3)一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，包括以下步骤：使含有包含人抗体重链基因或基因座和人抗体κ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体(hIGHK-MAC)的非人动物，与含有包含人抗体重链基因或基因座以及人抗体λ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体(hIGHL-MAC)的非人动物进行交配，制作含hIGHK-MAC和hIGHL-MAC的非人动物；使制作的非人动物与对应于人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座以及人抗体λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的同种非人动物进行交配，并选择含hIGHK-MAC和hIGHL-MAC且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
4)一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，所述方法包括：使含有小鼠人工染色体(hIGHK-MAC)且对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物与含有小鼠人工染色体(hIGHL-MAC)且与人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座相对应的内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物进行交配，并选择含hIGHK-MAC和hIGHL-MAC且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物，其中，所述hIGHK-MAC包含人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ轻链基因或基因座，所述hIGHL-MAC包含人抗体重链基因或基因座以及人抗体λ轻链基因或基因座。
5)一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，包括：使含有包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座以及人抗体λ轻链基因或基因座的小鼠人工染色体(hIGHKL-MAC)的非人动物，与对应于人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座以及人抗体λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因被敲除的同种非人动物进行交配，选择含hIGHKL-MAC、且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
2.人抗体的制造
本发明提供一种制造人抗体的方法，包括：向上述非人动物给予抗原物质，回收所产生的与该抗原物质结合的人抗体。
通过该方法回收的抗体，可以通过柱色谱法回收，该柱色谱法包括：将含有该抗体的抗血清，在填充有结合了抗原物质的载体(例如琼脂糖凝胶、硅胶等)的柱中上样，然后从载体中洗脱与该载体结合的人抗体。
本发明还提供一种制造人单克隆抗体的方法，包括以下步骤：向上述非人动物给予抗原物质；从所述非人动物中取出脾脏细胞；将所述脾脏细胞与骨髓瘤进行融合，制作杂交瘤；以及从所述杂交瘤中回收与所述抗原物质结合的抗体。
人单克隆抗体的纯化可以使用上述柱色谱法进行。
抗原物质一般为细胞、蛋白质、多肽或肽。人抗体当前用作癌症、骨质疏松症、类风湿性关节炎等的治疗药，此外，很多其他的人抗体正处于作为高胆固醇血症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、肿瘤、过敏性疾病、疼痛、心血管病、代谢紊乱等的治疗药的临床试验阶段。关于这种抗原物质，在上述非专利文献1中有例举。此外，作为抗原物质的上述细胞的示例，有肿瘤细胞等。本发明可以用于包括这种抗原物质的多种抗原物质
[实施例]
结合以下实施例，对本发明进行更加具体的说明，但本发明的范围并不受这些实施例限制。图1表示人抗体产生小鼠、大鼠的制作概要。
[实施例1]人2号染色体的修饰
为了向小鼠人工染色体载体(MAC)易位克隆IGK、IGH区域，向人2号染色体中***重组序列loxP序列、FRT序列(图2)。
[A]向人2号染色体***loxP序列
为了通过使用Cre/LoxP***的相互易位来向小鼠人工染色体载体MAC易位克隆人2号染色体上的IGK区域，在同源重组频率高的鸡DT40细胞内，将loxP序列***人2号染色体中。
[A.1]制作向人2号染色体***loxP的载体
作为用于向携带人2号染色体的细胞DT40 521D4(#2)中***loxP序列的基本质粒，使用v901(Lexicon genetics)。作为loxP***位点的人2号染色体的DNA序列从基因库数据库(NC_000002.12)获得。
从DT40(#2)提取基因组DNA作为模板，同源重组的靶序列的扩增所使用的质粒的序列如下所示。
cos138-F6B：
5’-TCGAGGATCCCACATAGACATTCAACCGCAAAGCAG-3’(SEQ ID NO:1)
cos138-R6B：
5’-TCGAGGATCCAGGCCCTACACATCAAAAAGTGAAGCA-3’(SEQ ID NO:2)
PCR使用日本宝生物株式会社(京都，日本国)生产的TP600作为热循环仪，使用KODFX(东洋纺)PCR酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃12分钟进行30个循环。用BamHI(NEB)将消化PCR产物，通过琼脂糖凝胶分离纯化后，克隆到v901的BamHI位点。(载体名：v901-cos138)。此时，为了确认目标靶序列是否被克隆，通过EcoRV(NEB)、BglII(NEB)、AvrII(NEB)各限制酶进行消化，通过电泳进行确认，然后进行序列分析。
作为含有PGKhygro和loxP、PGK HPRT exon1-2的盒的基本质粒，使用v913(Lexicon genetics)。5’HPRT-loxP将寡核苷酸合成的loxP序列克隆到V820(Lexicongenetics)的XbaI位点。将5’HPRT-loxP克隆到V907(Lexicon genetics)的ClaI和AscI，将PGKhygro克隆到ClaI和KpnI位点(载体名：pX6.1)。
用KpnI(NEB)和AscI(NEB)消化pX6.1的PGKhygro-loxP-PGK HPRT exon1-2，用Blunting high kiT(东洋纺)使成为平滑末端，用Blunting high kit使v901-cos138的SpeI位点成为平滑末端，然后进行连接。(载体名：v901-cos138hygloxP5’HPRT)。将靶向载体、靶序列，以及通过同源重组而产生的染色体等位基因示于图3。
[A.2]在鸡DT40细胞中，向人2号染色体中***loxP
鸡DT40细胞的培养是在加入有10％胎牛血清(Gibco，以下记作FBS)、1％鸡血清(Gibco)、10-4M 2-巯基乙醇(Sigma)的RPMI1640培养基(Gibco)中进行。将约107个DT40(#2)细胞在无添加RPMI1640培养基中洗涤一次，悬浮在0.5ml的无添加RPMI1640培养基中，加入25μg用限制酶NotI(NEB)酶切成线状的靶向载体v901-cos138hygloxP5’HPRT，转移到电穿孔用的细胞小室(Cuvette)(bio-rad)中，室温下静置10分钟。将细胞小室放置在基因电穿孔仪(bio-rad)上，以550V、25μF的条件施加电压。室温下静置10分钟后，分注到12块96孔培养板中，培养24小时。更换为含1.5mg/ml潮霉素(Wako(大阪，日本国))的培养基中，进行约2周的选择培养。通过5次反应获得191个抗药株，将随机选择的44个克隆用于下面的分析。
[A.3]同源重组体的筛选
为了提取潮霉素抗性株的基因组DNA作为模板来筛选重组体，使用以下引物进行PCR，确认在人2号染色体上是否发生了位点特异性的重组。其引物如下所示。
cos138sp L：5’-CTGAGAAGAGTCATTGTTTATGGTAGACT-3’(SEQ ID NO:3)
cos138sp R：5’-ATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGT-3’(SEQ ID NO:4)
x6.1cosRa L：5’-GGGGAATAAACACCCTTTCCAAATCCTC-3’(SEQ ID NO:5)
x6.1cosRa R：5’-ACCAAGTAACCGATCAAACCAACCCTTG-3’(SEQ ID NO:6)
关于cos138sp L、cos138sp R的引物，使用Accuprime Taq DNA聚合酶(ThermoFisher Scientific)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在94℃2分钟的热变性，然后按94℃15秒、60℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
关于x6.1cosRa L、x6.1cosRa R的引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃12分钟进行30个循环。
此外，使用人2号染色体上的引物，确认是否保持区域。其引物如下所示。
D2S177F：5’-AGCTCAGAGACACCTCTCCA-3’(SEQ ID NO:7)
D2S177R：5’-CTGTATTAGGATACTTGGCTATTGA-3’(SEQ ID NO:8)
FABP1-F：5’-TATCAAGGGGGTGTCGGAAATCGTG-3’(SEQ ID NO:9)
FABP1-R：5’-ACTGGGCCTGGGAGAACCTGAGACT-3’(SEQ ID NO:10)
EIF2AK3-F：5’-AGGTGCTGCTGGGTGGTCAAGT-3’(SEQ ID NO:11)
EIF2AK3-R：5’-GCTCCTGCAAATGTCTCCTGTCA-3’(SEQ ID NO:12)
RPIA-F：5’-CTTACCCAGGCTCCAGGCTCTATT-3’(SEQ ID NO:13)
RPIA-R：5’-CTCTACCTCCCTACCCCATCATCAC-3’(SEQ ID NO:14)
IGKC-F：5’-TGGAAGGTGGATAACGCCCT-3’(SEQ ID NO:15)
IGKC-R：5’-TCATTCTCCTCCAACATTAGCA-3’(SEQ ID NO:16)
IGKV-F：5’-AGTCAGGGCATTAGCAGTGC-3’(SEQ ID NO:17)
IGKV-R：5’-GCTGCTGATGGTGAGAGTGA-3’(SEQ ID NO:18)
Vk3-2F：5’-CTCTCCTGCAGGGCCAGTCA-3’(SEQ ID NO:19)
Vk3-2R：5’-TGCTGATGGTGAGAGTGAACTC-3’(SEQ ID NO:20)
D2S159_1F：5’-CTCTAACTGAATCAAGGGAATGAAC-3’(SEQ ID NO:21)
D2S159_1R：5’-AGCAGTTTGAGTTTAGGATGAAGG-3’(SEQ ID NO:22)
使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
PCR的结果是，3个克隆为阳性，关于这些克隆，进行下面的分析。
[A.4]双色FISH分析
根据上述结果，在3个克隆中，按照松原等人著的FISH实验步骤(秀润社，1994)进行双色FISH分析。将人cot-1DNA和pX6.1作为探针进行FISH分析，结果是在全部3个克隆中，人2号染色体100％携带单拷贝，还出现了来自PGKhygloxP5’HPRT的信号，在位点特异性***作为阴性对照的PGKhygloxP5’HPRT之前的人2号染色体上未检测到信号，因此确认PGKhygloxP5’HPRT已被位点特异性地***(图4)。3个克隆中，选择521D4loxP1-28、521D4loxP4-6这两个克隆，进行下面的实验。
[B]在携带loxP的人2号染色体上***FRT位点
为了通过loxP易位将将人2号染色体上的IGK区域和人14号染色体上的IGH区域克隆到MAC内，将FRT位点***到***有loxP的人2号染色体中。
[B.1]制作向人2号染色体***FRT的载体
作为用于向DT40(#2)中***FRT序列的基本质粒，使用pMA-RQ(Lifetechnologies)。向该载体克隆人工基因合成序列PGK5’HPRTFRT(Life technologies)(载体名：pMA-kD9FRT)。首先，用XhoI和EcoRI消化pCMV/Bsd(Invitrogen)，将电泳后用凝胶提取CMVBsd序列的所得物，与用EcoRI和XhoI消化pMA-kD9FRT后得到的突出末端连接(载体名：pMA-kD9FRTBsd)。
FRT***位点的人2号染色体的DNA序列从基因库数据库(NC_000002.12)获得。从DT40(#2)提取基因组DNA作为模板，同源重组的靶序列的扩增所使用的质粒的序列如下所示。
kD-R9La L：
5’-TCGAGCGGCCGCAGGATCTTTGGGGGACTGAATGGGGTGTGCT-3’(SEQ ID NO:23)
kD-R9La R：
5’-TCGAACGCGTTGGAACCCTCATACGTTGCTGGTGGAATGT-3’(SEQ ID NO:24)
KD-F9Ra L：
5’-CGAGGATCCATTTCTCCACATCCTAGCCAACACTTGACATTTCCT-3’(SEQ ID NO:25)
KD-F9Ra R：
5’-TCGAGGATCCGCCAGGGAGACAGATGCCAAGTACGGTTTAG-3’(SEQ ID NO:26)
关于kD-R9La L和kD-R9La R的引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃2.5分钟进行30个循环。将得到的PCR产物用NotI(NEB)和MluI(NEB)消化，电泳后进行凝胶提取，与用NotI和MluI消化pMA-kD9FRTBsd而生成的突出末端连接。(载体名：pMA-kD9FRTL)
关于KD-F9Ra L和KD-F9Ra R的引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃2.5分钟进行30个循环。将得到的PCR产物用BamHI消化，克隆到pMA-kD9FRTL的BamHI位点。(载体名：pMA-kD9FRTLR)。将靶向载体、靶序列，以及通过同源重组而产生的染色体等位基因示于图5。
[B.2]在鸡DT40细胞中，向携带loxP的人2号染色体中***FRT
鸡DT40细胞的培养是在加入有10％FBS、1％鸡血清(Gibco)、10-4M 2-巯基乙醇(Sigma)的RPMI1640培养基(Gibco)中进行。将DT40(#2)、521D4loxP1-28和521D4 loxP4-6约107个细胞在无添加RPMI1640培养基中洗涤一次，悬浮在0.5ml的无添加RPMI1640培养基中，加入25μg用限制酶NotI(NEB)酶切成线状的靶向载体pMA-kD9FRTLR，转移到电穿孔用的细胞小室(Cuvette)(bio-rad)中，室温下静置10分钟。将细胞小室放置在基因电穿孔仪(bio-rad)上，以550V、25μF的条件施加电压。室温下静置10分钟后，分注到12块96孔培养板中，培养24小时。用15μg/mL的杀稻瘟菌素(funakoshi株式会社)进行药物筛选，在各3次反应中，从521D4loxP1-28、521D4 loxP4-6获得86个克隆、82个克隆为抗药株，从中分别随机选择24个克隆，提取基因组DNA。为了将其作为模板来筛选重组体，使用以下引物进行PCR，确认在人2号染色体上是否发生了位点特异性的重组。其引物如下所示。
kD9tcLa L：5’-TGAGAACACAGGGGTCTCCATTCTGACT-3’(SEQ ID NO:27)
kD9tcLa R：5’-ACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAG-3’(SEQ ID NO:28)
kD9tcRa L：5’-GACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCT-3’(SEQ ID NO:29)
kD9tcRa R：5’-TGGTCACTGAAGCTTTCCATCTGCTCTT-3’(SEQ ID NO:30)
关于这些引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
此外，也进行PCR以确认loxP序列和人2号染色体区域。引物如下所示。
人2号染色体上loxP序列确认引物：
cos138sp L(同上)
cos138sp R(同上)
x6.1cosRa L(同上)
x6.1cosRa R(同上)
关于cos138sp L、cos138sp R的引物，使用Accuprime Taq DNA聚合酶(ThermoFisher Scientific)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在94℃2分钟的热变性，然后按94℃15秒、60℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
关于x6.1cosRa L、x6.1cosRa R的引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃12分钟进行30个循环。进一步，进行PCR分析以用于确认人2号染色体区域。其引物如下所示。
D2S177F(同上)
D2S177R(同上)
FABP1-F(同上)
FABP1-R(同上)
EIF2AK3-F(同上)
EIF2AK3-R(同上)
RPIA-F(同上)
RPIA-R(同上)
IGKC-F(同上)
IGKC-R(同上)
IGKV-F(同上)
IGKV-R(同上)
Vk3-2F(同上)
Vk3-2R(同上)
D2S159_1F(同上)
D2S159_1R(同上)
使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
结果是分别从521D4 loxP1-28、521D4 loxP4-6获得7个克隆和3个克隆的阳性克隆。
[B.3]双色FISH分析
根据上述结果，在7个克隆和3个克隆中，按照松原等人著的FISH实验步骤(秀润社(东京，日本国)，1994)进行双色FISH分析。将人cot-1DNA和pMA-kD9FRTBsd作为探针进行FISH分析，结果是在全部克隆中，人2号染色体以87％以上的比例保持有单拷贝，还出现了来自PGK5’HPRTFRTBsd的信号，在位点特异性***PGK5’HPRTFRTBsd之前的作为阴性对照的人2号染色体上未检测到信号，因此确认PGK5’HPRTFRTBsd已被位点特异性地***(图6)。其中，选择521D4loxP1-28FRT1-23和521D4 loxP4-6FRT1-15这两个克隆，进行下面的实验。
[实施例2]通过易位克隆，在小鼠人工染色体载体(MAC)中携带人2号染色体IGK区域
在携带MAC的CHO细胞中，将人2号染色体上的IGK区域通过易位克隆到MAC。易位克隆使用Cre/loxP***，通过使人2号染色体和MAC相互易位，使MAC携带IGK区域(图7)。
[A]修饰的人2号染色体向携带MAC的CHO细胞(CHO MAC)的染色体导入
为了在CHO内使用Cre/LoxP***，并将人2号染色体区域易位克隆到MAC，将修饰的人2号染色体转移到携带MAC的CHO细胞中。
[A.1]微核细胞融合与抗药性克隆的分离
使用供体细胞DT40 521D4 loxP1-28FRT1-23和521D4 loxP4-6 FRT1-15，对携带MAC载体的CHO hprt缺失细胞(从人类科学研究资源库获得，登记号JCRB0218)CHO(HPRT-)进行微核细胞融合法。
在供体细胞汇合时，在加入有20％FBS、0.025μg/ml秋水仙酰胺的状态下，孵育12小时，使微核形成，然后回收细胞，将其悬浮在无血清DMEM培养基中，然后注入到用多聚-L-赖氨酸(Wako)覆盖的离心用烧瓶中，孵育30分钟，使细胞贴附在烧瓶上。除去无血清DMEM培养基，在离心用烧瓶中倒满预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液，以34℃、8000rpm离心1小时。将微细胞悬浮在无血清DMEM培养基中，用8μm、5μm、3μm过滤器纯化。将纯化的微细胞悬浮在用DMEM制备的0.05mg/ml PHA-P(Sigma)溶液2mL中，除去培养液，然后加入到在6cm细胞培养皿中达到汇合的受体CHO MAC细胞中。孵育15分钟，使微核贴附到CHO细胞。然后，用1ml的PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全溶解在6mL无血清DMEM培养基中，加入1ml二甲基亚砜进行过滤除菌]进行融合持续正好1分钟。用5mL无血清DMEM进行4次清洗操作以除去PEG，然后加入CHO培养液。24小时后，将细胞接种到10个10cm细胞培养皿中，加入800μg/mL的G418(Promega)、6μg/mL的杀稻瘟菌素，选择培养10天。分别进行2次反应，获得分别来自供体DT40 521D4loxP1-28FRT1-23和521D4 loxP4-6FRT1-15的26个克隆、49个克隆的抗药株，从中随机选择21个克隆、24个克隆，进行下面的分析。通过荧光确认到MAC中携带有EGFP表达盒，并且药物筛选克隆中携带MAC。
[A.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
提取抗药性克隆的DNA，将其作为模板，进行PCR，确认修饰人2号染色体是否转移到了CHO MAC细胞。引物如下所示。
修饰的人2号染色体上loxP序列确认引物：
cos138sp L(同上)
cos138sp R(同上)
x6.1cosRa L(同上)
x6.1cosRa R(同上)
关于cos138sp L、cos138sp R的引物，使用Accuprime Taq DNA聚合酶(ThermoFisher Scientific)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在94℃2分钟的热变性，然后按94℃15秒、60℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
关于x6.1cosRa L、x6.1cosRa R的引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃12分钟进行30个循环。
用于确认人2号染色体区域的引物：
D2S177 F(同上)
D2S177 R(同上)
FABP1-F(同上)
FABP1-R(同上)
EIF2AK3-F(同上)
EIF2AK3-R(同上)
RPIA-F(同上)
RPIA-R(同上)
IGKC-F(同上)
IGKC-R(同上)
IGKV-F(同上)
IGKV-R(同上)
Vk3-2 F(同上)
Vk3-2 R(同上)
D2S159_1 F(同上)
D2S159_1 R(同上)
使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认修饰的人2号染色体上FRT序列的引物：
kD9tcLa L(同上)
kD9tcLa R(同上)
kD9tcRa L(同上)
kD9tcRa R(同上)
关于这些引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
结果是获得了3个克隆和4个克隆的阳性细胞。
[A.3]双色FISH分析
关于3个克隆和4个克隆，将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，结果是获得独立地携带MAC和修饰的人2号染色体的阳性细胞(图8)、CHO(MAC)hChr.2LF1-15#9和CHO(MAC)hChr.2LF1-15#16。
[B]人2号染色体区域易位克隆到MAC
使用Cre/LoxP***，使包含IGK区域的人2号染色体片段易位到MAC。
[B.1]通过Cre表达获得HAT抗性染色体重组体
MAC携带loxP位点，在Cre重组酶存在下与修饰的人2号染色体的loxP位点发生重组。此外，发生重组时变成副产物的未并入MAC内的人2号染色体区域的5’HPRT与变成副产物的未并入MAC末端的3’HPRT连接，发生HPRT基因的重构，CHO(hprt-/-)获得HAT抗性。
关于CHO(MAC)hChr.2 LF1-15#9和CHO(MAC)hChr.2 LF1-15#16，当在10cm细胞培养皿中达到汇合时，使用Lipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific)，参照厂商的操作步骤加入18μg的Cre表达质粒(载体名：pBS185)。加入后经过6小时后，更换培养液，24小时后，接种到10个10cm细胞培养皿中，用1×HAT(Sigma)、4μg/mL的杀稻瘟菌素进行药物筛选。
将得到的HAT抗性克隆的各23、24个克隆用于下面的分析。
[B.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了筛选相互易位克隆，使用以下引物利用从HAT抗性株提取的基因组DNA作为模板来进行PCR，确认在人2号染色体片段和MAC上是否发生了染色体相互易位。所述引物序列如下所示。
TRANS L1：5'-TGGAGGCCATAAACAAGAAGAC-3'(SEQ ID NO:31)
TRANS R1：5'-CCCCTTGACCCAGAAATTCCA-3'(SEQ ID NO:32)
KJneo：5'-CATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3’(SEQ ID NO:33)
PGKr-2：5'-ATCTGCACGAGACTAGTGAGACGTGCTA-3’(SEQ ID NO:34)
关于这些引物，使用LA taq(日本宝生物株式会社)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按94℃10秒、60℃30秒、72℃3分钟进行30个循环。
此外，进行PCR，确认人2号染色体区域和FRT序列是否被维持。引物如下所示。
用于确认人2号染色体区域的引物：
D2S177 F(同上)
D2S177 R(同上)
FABP1-F(同上)
FABP1-R(同上)
EIF2AK3-F(同上)
EIF2AK3-R(同上)
RPIA-F(同上)
RPIA-R(同上)
IGKC-F(同上)
IGKC-R(同上)
IGKV-F(同上)
IGKV-R(同上)
Vk3-2F(同上)
Vk3-2R(同上)
D2S159_1 F(同上)
D2S159_1 R(同上)
使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认人2号染色体上FRT序列的引物：
kD9 tcLa L(同上)
kD9 tcLa R(同上)
kD9 tcRa L(同上)
kD9 tcRa R(同上)
关于这些引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
结果是23个克隆和24个克隆为PCR阳性。
[B.3]双色FISH分析
关于随机选择的各6个克隆，将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，结果确认到，关于5个克隆和1个克隆中，MAC和修饰的人2号染色体之间发生了相互易位，并且在MAC中携带IGK区域的IGK-MAC、副产物独立保持(图9)。选择CHO IGK-MAC#9-3和CHO IGK-MAC#16-1这两个克隆，进行下面的实验。
[实施例3]人14号染色体的修饰和转移到CHO(hprt-/-)细胞
将人14号染色体进行修饰，将修饰的人14号染色体转移到用于在IGK-MAC携带IGH区域的宿主细胞CHO(hprt-/-)(图10)。
[A]人14号染色体的修饰
为了通过易位克隆来使IGK-MAC携带人14号染色体IGH区域，将重组序列FRT序列***到人14号染色体中。
[A.1]制作向人14号染色体***FRT的载体
作为用于向DT40(#14)中***FRT序列的基本质粒，使用pMA-RQ(Lifetechnologies)。向该载体克隆人工基因合成序列FRT位点(Life technologies)(载体名：pMA-14SC355)。首先，用KpnI和ClaI消化pX6.1载体，将电泳后用凝胶提取PGKhyg序列的所得物，与用KpnI和ClaI消化pMA-14SC355后得到的突出末端连接(载体名：pMA-14SC355hyg)。进一步，将向质粒v907(Lexicon genetics)中***loxP序列和3’HPRT而形成的质粒(载体名：pX3.1)用XbaI和AscI消化，并将所得到的3’HPRT序列，与用NheI(NEB)和MluI(NEB)位点将pMA-SC355hyg消化后得到的突出末端连接(载体名：pMA-SC355hyg3’HPRT)。
FRT***位点的人14号染色体的DNA序列从基因库数据库(NC_000014.9)获得。从DT40(#14)提取基因组DNA作为模板，同源重组的靶序列的扩增所使用的质粒的序列如下所示。
NotISC355-F：
5’-TCGAGCGGCCGCGTACAATCTTGGATCACTACAACCTCTGCCTA-3’(SEQ ID NO:35)
AscISC355-R：
5’-TCGAGGCGCGCCAGGATTATAGATGTGAGCCATCACTAAGACTCCT-3’(SEQ ID NO:36)
SalISC355-F4：
5’-TCGAGTCGACAGCACGTTGGGAGGCCAAGGCAGGAGAATA-3’(SEQ ID NO:37)
BamHISC355-R4：
5’-TCGAGGATCCTGGCTGACACAGCCAGTCCCGGATT-3’(SEQ ID NO:38)
关于这些引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
将通过使用SalISC355-F4和BamHISC355-R4的引物的PCR得到的产物用SalI和BamHI消化，与用SalI和BamHI将pMA-SC355hyg3’HPRT消化而生成的突出末端连接(pMA-SC355hyg3’HPRTR)。然后，将通过使用NotISC355-F和AscISC355-R的引物的PCR得到的产物用NotI和AscI消化，与用NotI和AscI将pMA-SC355hyg3’HPRTR消化而生成的突出末端连接(载体名：pMA-SC355hyg3’HPRTRL)。将靶向载体、靶序列，以及通过同源重组而产生的染色体等位基因示于图11。
[A.2]在鸡DT40细胞中，向人14号染色体中***FRT
鸡DT40细胞的培养是在加入有10％FBS、1％鸡血清(Gibco)、10-4M 2-巯基乙醇(Sigma)的RPMI1640培养基(Gibco)中进行。将约107个DT40(#14)细胞在无添加RPMI1640培养基中洗涤一次，悬浮在0.5ml的无添加RPMI1640培养基中，加入25μg用限制酶NotI(NEB)酶切成线状的靶向载体pMA-SC355hyg3’HPRTRL，转移到电穿孔用的细胞小室(Cuvette)(bio-rad)中，室温下静置10分钟。将细胞小室放置在基因电穿孔仪(bio-rad)上，以550V、25μF的条件施加电压。室温下静置10分钟后，分注到12块96孔培养板中，培养24小时。用1.5mg/mL潮霉素进行药物筛选，进行3次反应后，获得73个克隆的抗药株。从中随机选择23个克隆，提取基因组DNA。将其作为模板，通过PCR确认在人14号染色体上是否发生了位点特异性重组。其引物如下所示。
14TarC_La F：5’-AGCAATTAGGGCCTGTGCATCTCACTTT-3’(SEQ ID NO:39)
14TarC_La R：5’-CCAGCTCATTCCTCCCACTCATGATCTA-3’(SEQ ID NO:40)
14TarC_Ra F：5’-CATCTGGAGTCCTATTGACATCGCCAGT-3’(SEQ ID NO:41)
14TarC_Ra R：5’-CTTATTCCTCCTTCTGCCCACCCTTCAT-3’(SEQ ID NO:42)
关于这些引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃6分钟进行35个循环。
此外，进行PCR分析以用于确认14号染色体区域。其引物如下所示。
MTA1-F3：5’-AGCACTTTACGCATCCCAGCATGT-3’(SEQ ID NO:43)
MTA1-R3：5’-CCAAGAGAGTAGTCGTGCCCCTCA-3’(SEQ ID NO:44)
ELK2P2-F：5’-CCCACTTTACCGTGCTCATT-3’(SEQ ID NO:45)
ELK2P2-R：5’-ATGAAGGTCCGTGACTTTGG-3’(SEQ ID NO:46)
g1(g2)-F：5’-ACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTC-3’(SEQ ID NO:47)
g1(g2)-R：5’-CACTTGTACTCCTTGCCATTCAGC-3’(SEQ ID NO:48)
VH3-F：5’-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3’(SEQ ID NO:49)
VH3-R：5’-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3’(SEQ ID NO:50)
CH3F3：5’-AGGCCAGCATCTGCGAGGAT-3’(SEQ ID NO:51)
CH4R2：5’-GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3’(SEQ ID NO:52)
使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒或56℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
PCR的结果是，10个克隆为阳性，关于这些克隆，进行下面的分析。
[A.3]双色FISH分析
在随机选择的6个克隆中，将人cot-1DNA和pMA-SC355hyg3’HPRT作为探针进行FISH分析，结果是在全部克隆中，人14号染色体以90％以上的比例保持有单拷贝，还出现了来自PGKhyg3’FRTHPRT的信号，在位点特异性***PGKhyg3’FRTHPRT之前作为阴性对照的人14号染色体上未检测到信号，因此确认PGKhygFRT3’HPRT已被位点特异性地***(图12)。其中，选择14DT40#2-4_FRT 3-17和3-19这两个克隆，进行下面的实验。
[B]修饰的人14号染色体转移到CHO(hprt-/-)株
为了在CHO(hprt-/-)细胞株中使IGK-MAC携带14号染色体的IGH区域，将修饰的人14号染色体转移到CHO(hprt-/-)细胞株中。
[B.1]微核细胞融合与抗药性克隆的分离
使用供体细胞14DT40#2-4_FRT 3-17和3-19，对CHO(HPRT-)进行微核细胞融合法。
在供体细胞汇合时，在加入有20％FBS、0.025μg/ml秋水仙酰胺的状态下，孵育12小时，使微核形成，然后回收细胞，悬浮在无血清DMEM培养基中，然后注入到用多聚-L-赖氨酸(Wako)覆盖的离心用烧瓶中，孵育30分钟，使细胞贴附在烧瓶上。除去无血清DMEM培养基，在离心用烧瓶中倒满预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液，以34℃、8000rpm离心1小时。将微细胞悬浮在无血清DMEM培养基中，用8μm、5μm、3μm过滤器纯化。将纯化的微细胞悬浮在用DMEM制备的0.05mg/ml PHA-P(Sigma)溶液2mL中，除去培养液，然后加入到在6cm细胞培养皿中达到汇合的受体CHO(hprt-/-)细胞株中。孵育15分钟，使微核贴附到CHO细胞。然后，用1ml的PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全溶解在6mL无血清DMEM培养基中，加入1ml二甲基亚砜进行过滤除菌]进行融合，持续正好1分钟。用5mL无血清DMEM进行4次清洗操作以除去PEG，然后加入CHO培养液。24小时后，将细胞接种到10个10cm细胞培养皿中，加入400μg/mL的G418，选择培养10天。分别进行2次反应，对于得到的15个抗药株克隆、2个抗药株克隆，进行下面的分析。
[B.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了确认修饰的人14号染色体是否被转移到了CHO(hprt-/-)细胞株中，进行PCR分析。引物如下所示。
用于确认修饰的人14号染色体上的FRT序列的引物：
14TarC_La F(同上)
14TarC_La R(同上)
14TarC_Ra F(同上)
14TarC_Ra R(同上)
关于这些引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃6分钟进行35个循环。
用于确认人14号染色体区域的引物：
MTA1-F3(同上)
MTA1-R3(同上)
ELK2P2-F(同上)
ELK2P2-R(同上)
g1(g2)-F(同上)
g1(g2)-R(同上)
VH3-F(同上)
VH3-R(同上)
CH3F3(同上)
CH4R2(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒或56℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
结果是获得14个克隆和2个克隆的PCR阳性克隆。
[B.3]双色FISH分析
关于随机选择的6个克隆和2个克隆，将人cot-1DNA和pMA-SC355hyg3’HPRT作为探针进行FISH分析，结果确认到携带单拷贝的表示来自PGKhygFRT3’HPRT的信号的14号染色体的阳性细胞(图13)。将CHO hprt-/-14FRT#3-17_8和CHO hprt-/-14FRT#3-17_14用于以后的实验。
[实施例4]使用相互易位，将人14号染色体上的IGH区域并入IGK-MAC
将制作的IGK-MAC转移到携带修饰的人14号染色体的CHO(hprt-/-)细胞株中，产生通过FRT/Flp***的重组，使IGK-MAC携带IGH区域，制作IGHK-MAC(图14)。
[A]IGK-MAC转移到修饰人14号染色体携带CHO CHO(hprt-/-)细胞株
[A.1]微核细胞融合与抗药性克隆的分离
在细胞培养皿中培养供体细胞CHO IGK-MAC#9-3，在汇合时更换为加入有20％FBS、0.1μg/ml秋水仙酰胺的F12培养基中，再培养48小时，之后更换为加入有20％FBS、0.1μg/ml秋水仙酰胺的F12培养基中，再孵育过夜，形成微细胞。除去培养液，在离心用烧瓶中倒满预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液，以34℃、8000rpm离心1小时。将微核(也称作“微细胞”)悬浮在无血清DMEM培养基中，用8μm、5μm、3μm过滤器纯化。纯化后，将微细胞悬浮在用DMEM制备的0.05mg/ml PHA-P(Sigma)溶液2mL中，除去培养液，然后加入到在6cm细胞培养皿中达到汇合的受体CHO hprt-/-14FRT#3-17_8和CHO hprt-/-14FRT#3-17_14中。孵育15分钟，使微核贴附到CHO细胞。然后，用1ml的PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全溶解在6mL无血清DMEM培养基中，加入1ml二甲基亚砜进行过滤除菌]进行融合持续正好1分钟。用5mL无血清DMEM进行4次清洗操作以除去PEG，然后加入CHO培养液。24小时后，将细胞接种到10个10cm细胞培养皿中，加入600μg/mL的G418和6μg/mL的杀稻瘟菌素，选择培养10天。对于得到的18个抗药株克隆、15个抗药株克隆，进行下面的分析。
[A.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了确认IGK-MAC是否转移到了携带修饰的人14号染色体的CHO(hprt-/-)株中、修饰的人14号染色体是否被维持，进行PCR分析。下面示出所使用的引物。
IGK-MAC的确认引物
KJneo(同上)
PGKr-2(同上)
关于这些引物，使用LA taq(日本宝生物株式会社)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按94℃10秒、60℃30秒、72℃3分钟进行30个循环。
用于确认IGK-MAC上的FRT***位点的引物：
kD9 tcLa L(同上)
kD9 tcLa R(同上)
kD9 tcRa L(同上)
kD9 tcRa R(同上)
关于这些引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
用于确认人2号染色体区域的引物：
D2S177 F(同上)
D2S177 R(同上)
EIF2AK3-F(同上)
EIF2AK3-R(同上)
RPIA-F(同上)
RPIA-R(同上)
IGKC-F(同上)
IGKC-R(同上)
IGKV-F(同上)
IGKV-R(同上)
Vk3-2 F(同上)
Vk3-2 R(同上)
使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认修饰的人14号染色体上的FRT***位点的引物：
14TarC_La F(同上)
14TarC_La R(同上)
14TarC_Ra F(同上)
14TarC_Ra R(同上)
关于这些引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃6分钟进行35个循环。
用于确认人14号染色体区域的引物：
MTA1-F3(同上)
MTA1-R3(同上)
ELK2P2-F(同上)
ELK2P2-R(同上)
g1(g2)-F(同上)
g1(g2)-R(同上)
VH3-F(同上)
VH3-R(同上)
CH3F3(同上)
CH4R2(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒或56℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
结果是12个克隆和15个克隆为PCR阳性。
[A.3]双色FISH分析
关于随机选择的6个克隆和5个克隆，将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，结果确认到各独立维持有单拷贝的IGK-MAC和修饰的人14号染色体的克隆(图15)。选择CHO Igk-MAC#9-3 8-5和CHO Igk-MAC#9-3 14-9这两个克隆，进行下面的实验。
[B]使用FRT/Flp重组***的IGHK-MAC的构建
通过FRT/Flp***将IGK-MAC和修饰的人14号染色体相互易位，由此将来自人14号染色体的IGH区域易位克隆到IGK-MAC上，构建IGHK-MAC。
[B.1]通过FLP表达获得HAT抗性染色体重组体
使用IGK-MAC上的FRT位点和修饰的人14号染色体上的FRT位点，在FLP重组酶的存在下进行相互易位。此外，当发生重组时，5’HPRT与在IGHK-MAC上的3’HPRT连接，发生HPRT基因的重构，获得HAT抗性。关于CHO Igk-MAC#9-3 8-5和CHO Igk-MAC#9-3 14-9，在10cm细胞培养皿中，在汇合时使用Lipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific)，参照厂商的操作步骤添加18μg的FLP表达质粒。加入后经过6小时后，更换培养液，24小时后，接种到10个10cm细胞培养皿中，用1×HAT、6μg/mL的杀稻瘟菌素进行药物筛选。
将得到的HAT抗性克隆的各24个克隆用于下面的分析。
[B.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了使用FRT/FLP***进行期望的相互易位，并确认是否构建了IGHK-MAC，提取抗药性克隆的DNA，作为模板，进行PCR分析。所使用的引物如下所示。
用于确认相互易位连接位点的引物：
TRANS L1(同上)
TRANS R1(同上)
CMVr-1：5’-CCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACG-3’(SEQ ID NO:53)
PGKr-2(同上)
KJneo(同上)
PGKr-2(同上)
关于这些引物，使用LA taq(日本宝生物株式会社)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按94℃10秒、60℃30秒、72℃3分钟进行30个循环。
用于确认人2号染色体区域的引物：
D2S177 F(同上)
D2S177 R(同上)
EIF2AK3-F(同上)
EIF2AK3-R(同上)
RPIA-F(同上)
RPIA-R(同上)
IGKC-F(同上)
IGKC-R(同上)
IGKV-F(同上)
IGKV-R(同上)
Vk3-2 F(同上)
Vk3-2 R(同上)
使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认人14号染色体区域的引物：
MTA1-F3(同上)
MTA1-R3(同上)
ELK2P2-F(同上)
ELK2P2-R(同上)
g1(g2)-F(同上)
g1(g2)-R(同上)
VH3-F(同上)
VH3-R(同上)
CH3F3(同上)
CH4R2(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒或56℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。结果是各有22、24个克隆为阳性。
[B.3]双色FISH分析
分别随机选择6个克隆，将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，结果是多余的2号染色体区域易位增加了未***到MAC中的为副产物的14号染色体的长度，这表示发生了相互易位，并且确认到独立存在单拷贝的被认为是IGHK-MAC的染色体(图16)。结果是选择CHO IGHK-MAC 8-1和CHO IGHK-MAC 14-7这两个克隆，进行下面的实验。
关于这两个克隆，使用BAC克隆CH17-405H5(IGK区域：CHORI)和CH17-262H11(IGH区域：CHORI)，以及CH17-216K2(IGK区域：CHORI)和CH17-212P11(IGH区域：CHORI)的组合作为探针，进行双色FISH分析，详细分析IGHK-MAC是否被实际构建。结果是两个克隆均在MAC上分别观察到表示IGK区域和IGH区域存在的信号，确认到IGHK-MAC已被构建(图17、图18)。
[实施例5]IGHK-MAC转移到CHO K1细胞株
在IGHK-MAC和用于构建IGHK-MAC的相互易位时形成的副产物中，均携带Neo抗性基因，在通过微核细胞融合法转移到目标细胞时，当用G418进行药物筛选时，则会获得IGHK-MAC和副产物的任一种或者或二者转移到其中的细胞。由于在MAC上携带EGFP，因此可以确认IGHK-MAC是否转移到了目标细胞中，而为了制作可有效进行染色体导入的且只携带IGHK-MAC的供体细胞，将IGHK-MAC转移到CHO K1细胞株中。
[A]微核细胞融合与抗药性克隆的分离
通过染色体转移，制作只携带IGHK-MAC的细胞株。
[A.1]IGHK-MAC转移到CHO K1株
在细胞培养皿中培养供体细胞CHO IGHK-MAC 8-1和CHO IGHK-MAC 14-7，在汇合时更换为加入有20％FBS、0.1μg/ml秋水仙酰胺的F12培养基中，再培养48小时，之后更换为加入有20％FBS、0.1μg/ml秋水仙酰胺的F12培养基中，再孵育过夜，形成微细胞。除去培养液，在离心用烧瓶中倒满预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液，以34℃、8000rpm离心1小时。将微核(也称作“微细胞”)悬浮在无血清DMEM培养基中，用8μm、5μm、3μm过滤器纯化。纯化后，将微细胞悬浮在2mL用DMEM制备的0.05mg/ml PHA-P(Sigma)溶液中，除去培养液，然后加入到在6cm细胞培养皿中达到汇合的受体CHO K1细胞株中。孵育15分钟，使微核贴附到CHO细胞。然后，用1ml的PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全溶解在6mL无血清DMEM培养基中，加入1ml二甲基亚砜进行过滤除菌]进行融合，持续正好1分钟。用5mL无血清DMEM进行4次清洗操作以除去PEG，然后加入CHO培养液。24小时后，将细胞接种到10个10cm细胞培养皿中，加入800μg/mL的G418，选择培养10天。对得到的抗药株20个克隆、13个克隆，进行下面的分析。对于得到的这些克隆，确认IGHK-MAC上GFP的荧光蛋白表达。
[A.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了确认IGHK-MAC已转移到CHO K1细胞株中，提取抗药性克隆的DNA，将其作为模板，进行PCR分析。所使用的引物如下所示。
用于确认相互易位连接位点的引物：
TRANS L1(同上)
TRANS R1(同上)
CMVr-1(同上)
PGKr-2(同上)
KJneo(同上)
PGKr-2(同上)
关于这些引物，使用LA taq(日本宝生物株式会社)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按94℃10秒、60℃30秒、72℃3分钟进行30个循环。
用于确认人2号染色体区域的引物：
EIF2AK3-F(同上)
EIF2AK3-R(同上)
RPIA-F(同上)
RPIA-R(同上)
IGKC-F(同上)
IGKC-R(同上)
IGKV-F(同上)
IGKV-R(同上)
Vk3-2 F(同上)
Vk3-2 R(同上)
使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认人14号染色体区域的引物：
MTA1-F3(同上)
MTA1-R3(同上)
ELK2P2-F(同上)
ELK2P2-R(同上)
g1(g2)-F(同上)
g1(g2)-R(同上)
VH3-F(同上)
VH3-R(同上)
CH3F3(同上)
CH4R2(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒或56℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
结果是获得了14个克隆和10个克隆的阳性克隆。
[A.3]双色FISH分析
分别随机选择6个克隆，将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，结果是关于各2个克隆，确认到如期望那样只携带IGHK-MAC(图19)。
筛选各2个克隆，使用BAC克隆CH17-216K2(IGK区域)和CH17-212P11(IGH区域)，以及CH17-405H5(IGK区域)和RP11-731F5(IGH区域)的组合作为探针，进行双色FISH分析，结果是将维持期望的IGHK-MAC结构的CHO K1 IGHK-MAC 8-1#1、CHO K1 IGHK-MAC 14-7#9用于以后的实验(图20、图21)。
[实施例6]IGHK-MAC转移到小鼠ES细胞和大鼠ES细胞
[A]IGHK-MAC转移到小鼠ES细胞
为了制作人抗体产生小鼠，需要将IGHK-MAC转移到小鼠ES细胞中，在受精卵8细胞期进行注射，制作嵌合体小鼠，使IGHK-MAC传递给后代。
[A.1]微核细胞融合与抗药性克隆的分离
供体细胞使用CHO K1 IGHK-MAC 8-1-1、CHO K1 IGHK-MAC 14-7-9。在细胞培养皿中培养供体细胞，在汇合时更换为加入有20％FBS、0.1μg/ml秋水仙酰胺的F12培养基中，再培养48小时，之后更换为加入有20％FBS、0.1μg/ml秋水仙酰胺的F12培养基中，再孵育过夜，形成微细胞。除去培养液，在离心用烧瓶中倒满预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液，以34℃、8000rpm离心1小时。将微核(也称作“微细胞”)悬浮在无血清DMEM培养基中，用8μm、5μm、3μm过滤器纯化。纯化后，以2000rpm离心10分钟。以2000rpm离心10分钟，悬浮在5ml无血清DMEM培养基中。再以2000rpm离心10分钟。受体细胞使用小鼠ES细胞HKD31 6TG-9(小鼠的Igh和Igk基因被破坏。专利：国际公布WO 98/37757记载)和XO ES9(抗体基因未被破坏)。关于培养，在DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-highglucose：SIGMA)中加入10％FCS、LIF(Murine Leukemia Inhibitory Factor，小鼠白血病抑制因子)、1×10-5M 2-ME(2-巯基乙醇：SIGMA)、L-谷氨酰胺(3.5g/ml：GIBCO)、丙酮酸钠溶液(3.5g/ml：GIBCO)、MEM非必须氨基酸(0.125mM：GIBCO)，在5％CO2、37℃下进行培养。用PBS(-)将在10cm细胞培养皿中达到汇合的小鼠ES细胞的细胞表面洗涤2次后，通过胰蛋白酶处理使细胞分散，用在DMEM培养基中加入10％FBS而形成的培养液回收，以1500rpm进行离心，除去上清液，再次悬浮在5ml无血清培养液中，缓慢加入到含有微细胞离心后的沉淀的无血清培养基中，再以1200rpm进行离心。除去上清液，用0.5ml的PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全溶解在无血清DMEM培养基中，加入1ml二甲基亚砜进行过滤除菌]进行融合，持续正好1分30秒。缓慢加入13mL无血清培养液(DMEM)，以1200rpm进行离心。除去上清液，加入普通小鼠ES细胞的培养液，将经过丝裂霉素处理的G418抗性小鼠胚胎成纤维细胞用作饲养细胞，接种到2个直径10cm的细胞培养皿中，孵育过夜。加入G418，使其变成250μg/mL，进行3～4周选择培养。分别进行4、4、6、6次反应，结果是分别获得6、4、7、4个EGFP阳性且具有抗药性的克隆，进行下面的分析。
[A.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了确认IGHK-MAC已转移到小鼠ES细胞株中，提取抗药性克隆的DNA，将其作为模板，进行PCR分析。所使用的引物如下所示。
用于确认相互易位连接位点的引物：
TRANS L1(同上)
TRANS R1(同上)
CMVr-1(同上)
PGKr-2(同上)
KJneo(同上)
PGKr-2(同上)
关于这些引物，使用LA taq(日本宝生物株式会社)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按94℃10秒、60℃30秒、72℃3分钟进行30个循环。
用于确认人2号染色体区域的引物：
EIF2AK3-F(同上)
EIF2AK3-R(同上)
RPIA-F(同上)
RPIA-R(同上)
IGKC-F(同上)
IGKC-R(同上)
IGKV-F(同上)
IGKV-R(同上)
Vk3-2 F(同上)
Vk3-2 R(同上)
使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认人14号染色体区域的引物：
MTA1-F3(同上)
MTA1-R3(同上)
ELK2P2-F(同上)
ELK2P2-R(同上)
g1(g2)-F(同上)
g1(g2)-R(同上)
VH3-F(同上)
VH3-R(同上)
CH3F3(同上)
CH4R2(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒或56℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
结果是关于HKD31 6TG-9，来自CHO K1 IGHK-MAC 8-1-1的4个克隆、来自CHO K1IGHK-MAC 14-7-9的2个克隆为PCR阳性；关于XO ES9，来自CHO K1 IGHK-MAC 8-1-1的4个克隆、来自CHO K1 IGHK-MAC 14-7-9的2个克隆为PCR阳性，对它们进行下面的分析。
[A.3]双色FISH分析
将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，结果是关于HKD31 6TG-9，来自CHO K1 IGHK-MAC 8-1-1的4个克隆、来自CHO K1 IGHK-MAC 14-7-9的1个克隆如期望那样只携带IGHK-MAC；关于XO ES9，来自CHO K1 IGHK-MAC 8-1-1的3个克隆、来自CHO K1IGHK-MAC 14-7-9的1个克隆如期望那样只携带IGHK-MAC，确认到小鼠ES的正常核型得以维持(图22)。
使用这些克隆，进行以下实验。
[B]IGHK-MAC转移到大鼠ES细胞
为了制作人抗体产生大鼠，需要将IGHK-MAC转移到大鼠ES细胞中，在8细胞期进行注射，制作嵌合体大鼠，使IGHK-MAC传递给后代。
[B.1]微核细胞融合与抗药性克隆的分离
如上述A.1所述，使用与向小鼠ES细胞的微核细胞融合法相同的方法，将IGHK-MAC导入到大鼠ES细胞中。供体细胞使用CHO IGHK-MAC 8-1、CHO IGHK-MAC 14-7、CHO K1IGHK-MAC 8-1-1、CHO K1 IGHK-MAC 14-7-9。融合后，孵育过夜，加入G418，使其变成150μg/mL，进行3～4周选择培养。各进行2次反应，K1株则各进行8次反应，结果是获得GFP阳性且具有抗药性的克隆、来自CHO IGHK-MAC 8-1的9个克隆、来自CHO IGHK-MAC 14-7的12个克隆、来自CHO K1 IGHK-MAC 8-1#1的90个克隆、来自CHO K1 IGHK-MAC 14-7#9的34个克隆。对于来自CHO IGHK-MAC 8-1的9个克隆、来自CHO IGHK-MAC 14-7的12个克隆，进行下面的分析。
[B.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了确认IGHK-MAC已转移到大鼠ES细胞株中，提取抗药性克隆的DNA，将其作为模板，进行PCR分析。所使用的引物如下所示。
用于确认相互易位连接位点的引物：
TRANS L1(同上)
TRANS R1(同上)
CMVr-1(同上)
PGKr-2(同上)
KJneo(同上)
PGKr-2(同上)
关于这些引物，使用LA taq(日本宝生物株式会社)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按94℃10秒、60℃30秒、72℃3分钟进行30个循环。
用于确认人2号染色体区域的引物：
EIF2AK3-F(同上)
EIF2AK3-R(同上)
RPIA-F(同上)
RPIA-R(同上)
IGKC-F(同上)
IGKC-R(同上)
IGKV-F(同上)
IGKV-R(同上)
Vk3-2 F(同上)
Vk3-2 R(同上)
使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认人14号染色体区域的引物：
MTA1-F3(同上)
MTA1-R3(同上)
ELK2P2-F(同上)
ELK2P2-R(同上)
g1(g2)-F(同上)
g1(g2)-R(同上)
VH3-F(同上)
VH3-R(同上)
CH3F3(同上)
CH4R2(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒或56℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。对于得到的6个阳性克隆和9个阳性克隆，进行下面的分析。
[B.3]双色FISH分析
将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，结果是关于rES14-7#4、#6和rES8-1#3、#8这4个克隆，确认到如期望那样只携带IGHK-MAC，大鼠ES的正常核型(42条)得以维持(图23)。使用这4个克隆，进行下面的实验。
[实施例7]小鼠和大鼠的嵌合体制作和后代传递
使用携带IGHK-MAC的ES细胞，制作嵌合体小鼠和嵌合体大鼠，传递给后代。
[A]携带IGHK-MAC的小鼠的制作
制作携带IGHK-MAC的小鼠，并进行分析。对于过程中得到的嵌合体，也进行分析。
[A.1]嵌合体小鼠的制作
使用得到的携带IGHK-MAC的小鼠ES细胞，按照基因靶向(实验医学，1995)的方法，制作嵌合体小鼠。使用通过MCH(ICR)(白色，从日本CLEA公司购买)的雌雄进行交配得到的桑椹胚和8细胞期胚胎，作为宿主。将注射胚胎移植到假母，通过毛色可以判定出生的仔鼠是否为嵌合体。
将注入有HKD31 6TG-9和XO ES9小鼠ES(IGHK-MAC)雌克隆的胚胎移植到假母，由此得到嵌合体小鼠(关于毛色，确认到深棕色的部分)。嵌合体的制作使用HKD31 6TG-9IGHK-MAC8-1-1#1、3、5、6、HKD31 6TG-9 IGHK-MAC 14-7-9#1、XO ES9 IGHK-MAC 8-1-1#1、2的小鼠ES细胞。其中，关于HKD31 6TG-9 IGHK-MAC 14-7-9#1，将注射的51个胚胎移植到3只假母，结果得到3只100％嵌合体、1只90％嵌合体(通过毛色判定)。关于XO ES9 IGHK-MAC8-1-1#1，将注射的140个胚胎移植到8只假母，结果得到6只100％嵌合体小鼠、7只80％-90％嵌合体小鼠。
[A.2]嵌合体小鼠的IGHK-MAC保持分析
按照发育工程实验手册(胜木元也，讲谈社Scientific，1987)记载的方法，从出生3周以上的嵌合体小鼠取得尾巴，使用Puregene DNA分离试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA。按照实施例6记载的引物和PCR条件进行PCR分析，确认IGHK-MAC的保持。
进一步，从嵌合体小鼠采血，然后进行细胞固定，制作标本，将人Cot-1和小鼠小卫星DNA作为探针进行FISH分析，由此以染色体水平确认携带IGHK-MAC的细胞。
[A.3]来自携带IGHK-MAC的ES细胞的嵌合体小鼠的人IGM表达评价
HKD31小鼠ES细胞的小鼠Igh、Igk基因被破坏。产生B淋巴细胞所必需的抗体μ链基因被敲除的小鼠，由于缺失负责体液免疫的成熟B淋巴细胞，因此无法产生抗体。因此，HKD31小鼠ES细胞在嵌合体小鼠中无法成为成熟B细胞。关于用于制作嵌合体小鼠的携带IGHK-MAC的HKD31小鼠细胞，如果人IGM从IGHK-MAC表达，则可以补救该缺失，能够检测到GFP阳性的B细胞。由此，可以间接验证IGHK-MAC上的IGM基因的功能性表达。从嵌合体小鼠采集血液，使用针对小鼠CD45R(B220)的抗体染色，通过流式细胞仪检测小鼠B细胞。分析是否存在CD45R和GFP均为阳性的细胞，由此能够确认来自IGHK-MAC的IGM的功能性表达。使用针对小鼠CD45R(B220)的抗体，将血液细胞染色，确认人IGM、CD45R、GFP为阳性的细胞。采集外周血，将血液转移到放入有肝素PBS的试管中，翻转混合，进行冰冷。在4℃下以2000rpm离心3分钟后，除去上清液，然后加入各种抗体，在4℃下反应30分钟，用加入5％胎牛血清的PBS(5％FBS/PBS)洗涤。进行完最后的离心后，向沉淀加入1.2％葡聚糖/生理盐水，敲击后，室温下静置45分钟，使红细胞自然沉降。将上清液转移到新试管，在4℃下以2000rpm离心3分钟后除去上清液，向沉淀加入室温溶血剂(0.17M NH4Cl)，静置5分钟。在4℃下以2000rpm离心3分钟，用5％FBS/PBS洗涤后用500μl的5％FBS/PBS悬浮，将所得物作为分析样品，用流式细胞仪进行分析。关于来自HKD31 6TG-9 IGHK-MAC 14-7-9#1的嵌合体小鼠，利用上述方法分析外周血淋巴细胞，结果确认到GFP和B220均为阳性的细胞，得到表示构建的IGHK-MAC的功能性的结果(图24)。
[A.4]嵌合体小鼠血清中的人抗体的检测
嵌合体小鼠中，为了确认人抗体基因轻链、重链、各种同种型表达，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中的人抗体浓度。ELISA按照如下记载的方法进行。富山、安东，单克隆抗体实验手册，讲谈社，1987；安东、千叶，单克隆抗体实验操作入门，讲谈社，1991；石川，超高灵敏度酶免疫测定法，学会出版中心，1993；Ed Harlow and David Lane，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；A.Doyle andJ.B.Griffiths，Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures，John Wiley&Sons Ltd.，1996。参考这些文献记载的方法，依据测定***，改善反应时间和温度，使得它们在例如4℃过夜进行。关于特定的抗体检测，使用试剂盒实施。测定人抗体(hγ、hμ、hκ、hγ1、hγ2、hγ3、hγ4、hα、hε、hδ)的表达和血清中的浓度。基本操作如下所示。
将待测定的针对人免疫球蛋白的抗体稀释，涂抹在ELISA孔板上，在4℃下过夜。血清样品的测定使用封闭剂、样品和在标记抗体的稀释液中加入5％胎牛血清而形成的PBS。洗涤涂抹的孔板，然后进行1小时以上的封闭。将孔板洗涤，然后加入样品孵育30分钟以上，洗涤孔板，然后加入稀释的酶标记的抗人和小鼠免疫球蛋白抗体，孵育1小时以上后，洗涤孔板，加入底物液使其显色。此外，根据测定***利用基本相同的操作，使用生物素标记的抗体，洗涤孔板后向其加入抗生物素蛋白-酶复合物进行孵育，然后洗涤，加入底物液。用微孔板阅读仪测定吸光度。关于血清中浓度的测定，将浓度已知的标准品逐步稀释，与样品同时进行ELISA，绘制标准曲线并进行分析，由此可以确定浓度。
[A.5]人抗体的表达分析和序列鉴定
根据来自嵌合体大鼠脾脏的RNA合成cDNA，进行人抗体基因可变区的克隆和碱基序列的确定。关于方法，实施与专利(国际公布号WO98/37757)记载的方法相同地实施，由此可以分析和评价。
[A.6]抗原特异性人抗体产生应答的评价
关于嵌合体小鼠，评价能否看到抗原特异性人抗体滴度的增加。关于方法，实施与专利(国际公布号WO 98/37757)记载的相同方法用人血清白蛋白免疫，分析抗体效价的上升。
[B]来自携带IGHK-MAC的嵌合体小鼠的IGHK-MAC的后代传递
[B.1]IGHK-MAC后代传递
使上述[A]制作的雌嵌合体小鼠(嵌合率约为100％)与ICR雄小鼠进行交配，对出生的仔鼠，观察来自ES细胞的IGHK-MAC的显性遗传性状GFP的荧光。如果观察到GFP的荧光，则能够确认小鼠个体中IGHK-MAC传递给后代，并稳定地保持。IGHK-MAC传递给后代的小鼠品系，称为mTC(IGHK-MAC)。
使1个体的来自HKD31 6TG-9 IGHK-MAC 14-7-9#1的嵌合体小鼠(毛色判定为90％)与小鼠Igh、Igk被破坏的小鼠(HKD)反复进行交配，结果得到12个体的小鼠，其中的1个体观察到GFP的荧光，确认到IGHK-MAC的后代传递(F1)。该小鼠品系称为HKD mTC(IGHK-MAC)。使该F1小鼠与HKLD(还具有小鼠Igλ低表达的突变)小鼠进行交配，结果得到8只小鼠，其中的3只确认到IGHK-MAC的后代传递(F2)。
对于来自XO ES9 IGHK-MAC 8-1-1#1的嵌合体小鼠，使得到的高嵌合体小鼠(毛色判定为>80％)共12只进行交配。10只嵌合体小鼠与HKD小鼠进行交配，得到97只小鼠，其中的32只观察到GFP的荧光，确认到IGHK-MAC的后代传递(F1)。进一步使2只嵌合体小鼠与HKLD小鼠进行交配，得到18只小鼠，其中的3只观察到GFP的荧光，确认到IGHK-MAC的后代传递(F1)。关于F1个体，使3只与HKD小鼠进行交配，结果在33只中的10个个体确认到后代传递(F2)。此外，使4个个体的F1个体与HLKD小鼠进行交配，结果在40只中的21个个体确认到后代传递(F2)。得到的后代传递F2个体中的12只为HKD的基因型即HKD mTC(IGHK-MAC)。
[B.2]携带IGHK-MAC的小鼠的IGHK-MAC保持确认
对于mTC(IGHK-MAC)，与(实施例7)[A.2]同样地进行分析，由此可以详细地确认IGHK-MAC的后代传递。关于来自XO ES9 IGHK-MAC 8-1-1#1的后代传递个体，将尾巴的DNA作为模板进行PCR并确认个体的GFP表达，结果均为阳性，确认到IGHK-MAC传递给后代，并被稳定地维持。
[B.3]携带IGHK-MAC的小鼠的人IGM表达评价
通过与(实施例7)[A.3]同样地进行分析，可以间接评价HKD mTC(IGHK-MAC)中的IGHK-MAC的保持和功能性。关于来自HKD31 6TG-9 IGHK-MAC 14-7-9#1的后代传递个体HKDmTC(IGHK-MAC)，以及通过将尾巴的DNA作为模板的PCR分析确认为阳性的个体，对外周血淋巴细胞确认GFP阳性和B220/GFP均为阳性的细胞的存在，结果均为阳性，得到了表示传递给后代的IGHK-MAC被稳定地维持并发挥功能的结果。通过流式细胞仪分析进行评价，结果是外周血淋巴细胞中GFP阳性细胞(MAC保持细胞)的比例为98.45％，频率高；B细胞的比例为7.9％(图25)。此外，关于来自XO ES9 IGHK-MAC8-1-1#1的后代传递个体HKD mTC(IGHK-MAC)，以及通过将尾巴的DNA作为模板的PCR分析来确认为阳性的个体，对外周血淋巴细胞确认GFP阳性和B220/GFP均为阳性的细胞存在。外周血淋巴细胞中GFP阳性细胞(MAC保持细胞)的比例为90.14％，频率高；B细胞的比例为22.06％(图26)。
[B.4]携带IGHK-MAC的小鼠的人抗体产生能力评价
关于mTC(IGHK-MAC)，与(实施例7)[A.4][A.5][A.6]同样地评价。
[C]携带IGHK-MAC的大鼠的制作
制作携带IGHK-MAC的大鼠，并进行分析。对于过程中得到的嵌合体，也进行分析。
[C.1]嵌合体大鼠的制作
使用上述实施例6中得到的IGHK-MAC保持大鼠ES细胞克隆，利用Hirabayashi等人的方法(Mol Reprod Dev.2010Feb；77(2):94.doi:10.1002/mrd.21123.)，制作嵌合体大鼠。使用通过Crlj：WI大鼠(白色，从日本Charles River公司购买)的雌雄进行交配得到的胚囊期胚胎，作为宿主。将注射胚胎移植到假母，通过毛色可以判定出生的仔大鼠是否为嵌合体。
将注入有携带IGHK-MAC的ES克隆大鼠ES(IGHK-MAC)14-7#4和8-1#3(在上述实施例6中获得的)的25个和18个胚胎移植到假母，结果生出了8只和4只嵌合体大鼠(关于毛色，确认到深棕色的部分)(图27)。在刚出生不久的时期，观察到来自ES细胞的IGHK-MAC的显性遗传性状GFP的荧光，能够确认ES细胞的贡献。
[C.2]来自携带IGHK-MAC的ES细胞的嵌合体大鼠的IGHK-MAC保持的确认
与上述[A.2]同样地进行分析，更加详细地确认IGHK-MAC的保持。关于血液细胞，将人Cot-1和小鼠cot-1DNA用作探针，实施FISH分析。
[C.3]嵌合体大鼠的人抗体产生能力评价
关于嵌合体大鼠，与(实施例7)[A.3][A.4][A.5][A.6]同样地评价。
[D]来自携带IGHK-MAC的嵌合体大鼠的IGHK-MAC的后代传递
[D.1]来自携带IGHK-MAC的嵌合体大鼠的IGHK-MAC的后代传递
使上述[C]制作的嵌合体大鼠(嵌合率约为100％)与Crlj:WI大鼠进行交配，对出生的仔大鼠，观察来自ES细胞的IGHK-MAC的显性遗传性状GFP的荧光。观察到GFP的荧光，能够确认大鼠个体中IGHK-MAC传递给后代，并稳定地保持。其中的IGHK-MAC传递给后代的大鼠品系，称为rTC(IGHK-MAC)。对3个个体的来自rES8-1#3的F1大鼠的外周血淋巴细胞的GFP阳性率进行评价，结果确认到传递给后代的IGHK-MAC维持在高保持率，为98.23％、96.62％、95.79％。
[D.2]携带IGHK-MAC的大鼠的IGHK-MAC保持确认
关于rTC(IGHK-MAC)，与[C.2]同样地进行分析，由此可以详细地确认IGHK-MAC的后代传递。
[D.3]携带IGHK-MAC的大鼠的人抗体产生能力评价
关于rTC(IGHK-MAC)，与(实施例7)[A.3][A.4][A.5][A.6]同样地评价。
关于rTC，进行检测人抗体IgM和IgG的ELISA分析。在阴性对照中分析野生型的大鼠血清，结果确认到rTC的血清中存在IgM和IgG，表示rTC产生了人抗体(图28)。
[实施例8]人22号染色体的修饰
为了向小鼠人工染色体载体MAC易位克隆IGL、IGH区域，向人22号染色体中***loxP位点、FRT位点(图29)。
[A]向人22号染色体***loxP序列
[A.1]制作向人22号染色体***loxP的载体
作为用于向携带人22号染色体的细胞DT40 52-18#22(#22)中***loxP序列的基本质粒，使用pX6.1(同上)。作为loxP***位点的人22号染色体的DNA序列，从基因库数据库(NC_000022.11)获得。
从DT40(#22)提取基因组DNA作为模板，使用如下所示的质粒的序列扩增同源重组的靶序列。
HindIII553La L：
5’-TGTAGCTGACTTTAGCCACCCACAAGTAC-3’(SEQ ID NO:54)
AscI553La R：
5’-TCGAGGCGCGCCCTCAAACTCCTGGGTGTAAATGATCCTCCTGC-3’(SEQ ID NO:55)
KpnI553Ra L：
5’-TGAGGGTACCGTGCAGTAAAGTATGATTGAGC-3’(SEQ ID NO:56)
SalI553Ra R：
5’-TCGAGTCGACCTTGCTGATTATACCTCATCTCCTTCCCTC-3’(SEQ ID NO:57)
PCR使用日本宝生物株式会社生产的TP600作为热循环仪，使用KODFX(东洋纺)PCR酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃6分钟进行30个循环。将HindIII553La L和AscI553La R的PCR产物用HindIII(NEB)和AscI(NEB)消化，用琼脂糖凝胶分离纯化后，与用HindIII和AscI将pX6.1消化而形成的突出末端连接。(载体名：pX6.1553L)。进一步，将KpnI553Ra L和SalI553Ra R的PCR产物用KpnI(NEB)和SalI(NEB)消化，用琼脂糖凝胶分离纯化后，与用KpnI和SalI将pX6.1553L消化而形成的突出末端连接(载体名：pX6.1553LR)。将靶向载体、靶序列，以及通过同源重组而产生的染色体等位基因示于图30。
[A.2]向鸡DT40细胞中的人22号染色体中***loxP
鸡DT40细胞的培养是在加入有10％胎牛血清(Gibco，以下记作FBS)、1％鸡血清(Gibco)、10-4M 2-巯基乙醇(Sigma)的RPMI1640培养基(Gibco)中进行。将约107个DT40(#22)细胞在无添加RPMI1640培养基中洗涤一次，悬浮在0.5ml的无添加RPMI1640培养基中，加入25μg用限制酶NotI(NEB)酶切成线状的靶向载体pX6.1553LR，转移到电穿孔用的细胞小室(Cuvette)(bio-rad)中，室温下静置10分钟。将细胞小室放置在基因电穿孔仪(bio-rad)上，以550V、25μF的条件施加电压。室温下静置10分钟后，分注到12块96孔培养板中，培养24小时。更换为含1.0mg/ml潮霉素(Wako)的培养基中，进行约2周的选择培养，得到32个克隆的抗药株。
[A.3]同源重组体的筛选
为了提取潮霉素抗性株的基因组DNA作为模板来筛选重组体，使用以下引物进行PCR，确认在人22号染色体上是否发生了位点特异性的重组。其引物如下所示。
22CeT La L：5’-CCTGCCTTCTTGTTTCAGCTCTCAACTG-3’(SEQ ID NO:58)
22CeT La R：5’-GACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCT-3’(SEQ ID NO:59)
22CeT Ra L：5’-ATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGT-3’(SEQ ID NO:60)
22CeT Ra R：5’-ACACTTTAGTCCCTGTCCCCTCAACGAG-3’(SEQ ID NO:61)
PCR使用日本宝生物株式会社生产的TP600作为热循环仪，使用KODFX(东洋纺)PCR酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
此外，进行PCR，确认是否也保持有人22号染色体区域。其引物如下所示。
553P-F：5’-AGATCTCTTGAGCCCAGCAGTTTGA-3’(SEQ ID NO:62)
553P-R：5’-TGAAGTTAGCCGGGGATACAGACG-3’(SEQ ID NO:63)
PPM1F L：5’-AACGGCAGCCAAACCAAAGA-3’(SEQ ID NO:64)
PPM1F R：5’-ACCAGGACTGGCTGGGCATA-3’(SEQ ID NO:65)
IGLVI-70L：5’-AGTCTGCGCTGACCCAGGAA-3’(SEQ ID NO:66)
IGLVI-70R：5’-TTGAGCCAGAGAAGCGGTCA-3’(SEQ ID NO:67)
GNAZ L：5’-TCCACTTGGGGGTCTGCATT-3’(SEQ ID NO:68)
GNAZ R：5’-TGGTGCTGAGCAGCTGTGTG-3’(SEQ ID NO:69)
LIF L：5’-TGGGACTTAGGTGGGCCAGA-3’(SEQ ID NO:70)
LIF R：5’-GCCTCCCCAAGAGCCTGAAT-3’(SEQ ID NO:71)
hVpreB1-F：5’-TGTCCTGGGCTCCTGTCCTGCTCAT-3’(SEQ ID NO:72)
hVpreB1-Rm：5’-GGCGGCGACTCCACCCTCTT-3’(SEQ ID NO:73)
hVpreB3-F：5’-CACTGCCTGCCCGCTGCTGGTA-3’(SEQ ID NO:74)
hVpreB3-R：5’-GGGCGGGGAAGTGGGGGAGAG-3’(SEQ ID NO:75)
hL5-F：5’-AGCCCCAAGAACCCAGCCGATGTGA-3’(SEQ ID NO:76)
hL5-R：5’-GGCAGAGGGAGTGTGGGGTGTTGTG-3’(SEQ ID NO:77)
344-F：5’-ATCATCTGCTCGCTCTCTCC-3’(SEQ ID NO:78)
344-R：5’-CACATCTGTAGTGGCTGTGG-3’(SEQ ID NO:79)
350P-F：5’-ACCAGCGCGTCATCATCAAG-3’(SEQ ID NO:80)
350P-R：5’-ATCGCCAGCCTCACCATTTC-3’(SEQ ID NO:81)
IgL-F：5’-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3’(SEQ ID NO:82)
IgL-Rm：5’-GAGAGTTGGAGAAGGGGTGACT-3’(SEQ ID NO:83)
SERPIND1L：5’-ACCTAGAGGGTCTCACCTCC-3’(SEQ ID NO:84)
SERPIND1R：5’-CCCTGGACATCAAGAATGG-3’(SEQ ID NO:85)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、在63℃、62℃、60℃、56℃、55℃、50℃中之一30秒、72℃1分钟进行35个循环。
结果是17个克隆为PCR阳性。
[A.4]双色FISH分析
从上述结果随机选择的10个克隆中，按照松原等人著的FISH实验步骤(秀润社，1994)进行双色FISH分析。将人cot-1DNA和pX6.1作为探针进行FISH分析，结果是在9个克隆中，人2号染色体70％以上携带单拷贝，还出现了来自PGKhygloxP5’HPRT的信号，在位点特异性***PGKhygloxP5’HPRT之前的作为阴性对照的人22号染色体上未检测到信号，因此确认PGKhygloxP5’HPRT已被位点特异性地***(图31)。下面的实验使用22DT40 KloxP3 1-5、2-1这两个克隆。
[B]在携带loxP的人22号染色体上***FRT位点
为了通过loxP易位将人22号染色体上的IGL区域，和人14号染色体上的IGH区域克隆到MAC内，将FRT位点***到***有loxP的人2号染色体中。
[B.1]制作向人22号染色体***FRT的载体
作为用于向DT40(#22)中***FRT序列的基本质粒，使用pMA-kD9FRTBsd。FRT***位点的人22号染色体的DNA序列从基因库数据库(NC_000022.11)获得。从DT40(#22)提取基因组DNA作为模板，使用如下所示的质粒的序列扩增同源重组的靶序列。
BamHISL350La L：
5’-TCGAGGATCCGGCCTCCCAAAGGATTATAGACGTGAGCCACTGT-3’(SEQ ID NO:86)
AscISL350La R：
5’-TCGAGGCGCGCCGGCACCTCTCCTATTTTCTTCACAGCACTT-3’(SEQ ID NO:87)
AscISL350Ra L：
5’-TCGAGGCGCGCCAGCATGGTGGCCCGCACGTATAGTCGCAGCTA-3’(SEQ ID NO:88)
NotISL350Ra R：
5’-TCGAGCGGCCGCAAAGAAGGGGCCCGCCTCTGCCTCTAAATCCTGAC-3’(SEQ ID NO:89)
PCR使用日本宝生物株式会社生产的TP600作为热循环仪，使用KODFX(东洋纺)PCR酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行30个循环。将BamHISL350La L和AscISL350La R的PCR产物用BamHI(NEB)和AscI(NEB)消化，用琼脂糖凝胶分离纯化后，与用BamHI和AscI将pMA-kD9FRTBsd消化而形成的突出末端连接。(载体名：pMA-kD9FRTBsd22L)。进一步，将AscISL350Ra L和NotISL350Ra R的PCR产物用MluI(NEB)和NotI(NEB)消化，用琼脂糖凝胶分离纯化后，与用AscI和NotI将pMA-kD9FRTBsd22L消化而形成的突出末端连接(载体名：pMA-kD9FRTBsd22LR)。将靶向载体、靶序列，以及通过同源重组而产生的染色体等位基因示于图32。
[B.2]在鸡DT40细胞中，向携带loxP的人22号染色体中***FRT
鸡DT40细胞的培养是在加入有10％胎牛血清(Gibco，以下记作FBS)、1％鸡血清(Gibco)、10-4M 2-巯基乙醇(Sigma)的RPMI1640培养基(Gibco)中进行。将22DT40KloxP3 1-5和22DT40KloxP3 2-1约107个细胞在无添加RPMI1640培养基中洗涤一次，悬浮在0.5ml的无添加RPMI1640培养基中，加入25μg用限制酶NotI(NEB)酶切成线状的靶向载体pMA-kD9FRTBsd22LR，转移到电穿孔用的细胞小室(Cuvette)(bio-rad)中，室温下静置10分钟。将细胞小室放置在基因电穿孔仪(bio-rad)上，以550V、25μF的条件施加电压。室温下静置10分钟后，分注到12块96孔培养板中，培养24小时。
用15μg/mL的杀稻瘟菌素(funakoshi株式会社)进行药物筛选，提取杀稻瘟菌素抗性株的基因组DNA。为了将其作为模板来筛选重组体，使用以下引物进行PCR，确认在人22号染色体上是否发生了位点特异性的重组。其引物如下所示。
22TeT La L：5’-TGCAGGTATCTGTTGGTGTCCCTGTTTT-3’(SEQ ID NO:90)
22TeT La R：5’-GACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCT-3’(SEQ ID NO:91)
22TeT Ra L：5’-AGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGA-3’(SEQ ID NO:92)
22TeT Ra R：5’-CTGTCCTATCCTTGCAGCTGTCTTCCAG-3’(SEQ ID NO:93)
PCR使用日本宝生物株式会社生产的TP600作为热循环仪，使用K OD FX(东洋纺)PCR酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行35个循环，确认重组。
用于确认loxP***位点是否被维持的引物如下所示。
22CeT La L(同上)
22CeT La R(同上)
22CeT Ra L(同上)
22CeT Ra R(同上)
PCR使用日本宝生物株式会社生产的TP600作为热循环仪，使用KODFX(东洋纺)PCR酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
此外，进行PCR，确认是否也保持有人22号染色体区域。其引物如下所示。
553P-F(同上)
553P-R(同上)
PPM1F L(同上)
PPM1F R(同上)
IGLVI-70 L(同上)
IGLVI-70 R(同上)
GNAZ L(同上)
GNAZ R(同上)
LIF L(同上)
LIF R(同上)
hVpreB1-F(同上)
hVpreB1-Rm(同上)
hVpreB3-F(同上)
hVpreB3-R(同上)
hL5-F(同上)
hL5-R(同上)
344-F(同上)
344-R(同上)
350P-F(同上)
350P-R(同上)
IgL-F(同上)
IgL-Rm(同上)
SERPIND1 L(同上)
SERPIND1 R(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、在63℃、62℃、60℃、56℃、55℃、50℃中之一30秒、72℃1分钟进行35个循环。关于22DT40 KloxP3 1-5和22DT40 KloxP3 2-1各24个药物抗性克隆中，PCR阳性克隆为21个和16个克隆。根据该结果，各选择5个克隆，进行下面的实验。
[B.3]双色FISH分析
将人cot-1DNA和pMA-kD9FRTBsd作为探针，进行FISH分析。确认到人22号染色体以高比例保持有单拷贝，还出现了来自PGK5’HPRTFRTBsd的信号，在位点特异性***PGK5’HPRTFRTBsd之前的作为阴性对照的人2号染色体上未检测到信号，确认PGK5’HPRTFRTBsd已被位点特异性地***(图33)。结果是将22DT40 KL3F1-5#2-1、22DT40 KL3F2-1#1-2、#1-3这3个克隆用于下面的实验。
[实施例9]通过易位克隆，在小鼠人工染色体载体(MAC)中并入人22号染色体区域(图34)
[A]修饰的人22号染色体向携带MAC的CHO细胞(CHO MAC)的染色体导入
为了在CHO内使用Cre/LoxP***，并将人22号染色体区域易位克隆到MAC，将修饰的人22号染色体转移到携带MAC的CHO细胞中。
[A.1]微核细胞融合与抗药性克隆的分离
使用供体细胞即携带修饰的人22号染色体的DT40，对携带MAC载体的CHO hprt缺失细胞(从人类科学研究资源库获得，登记号JCRB0218)CHO(HPRT-)进行微核细胞融合法。
在供体细胞汇合时，在加入有20％FBS、0.025μg/ml秋水仙酰胺的状态下，孵育12小时，使微核形成，然后回收细胞，悬浮在无血清DMEM培养基中，然后注入到用多聚-L-赖氨酸(Wako)覆盖的离心用烧瓶中，孵育30分钟，使细胞贴附在烧瓶上。除去无血清DMEM培养基，在离心用烧瓶中倒满预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液，以34℃、8000rpm离心1小时。将微细胞悬浮在无血清DMEM培养基中，用8μm、5μm、3μm过滤器纯化。将纯化的微细胞悬浮在用DMEM制备的0.05mg/ml PHA-P(Sigma)溶液2mL中，除去培养液，然后加入到在6cm细胞培养皿中达到汇合的受体CHO MAC细胞中。孵育15分钟，将微核贴附到CHO细胞。然后，用1ml的PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全溶解在6mL无血清DMEM培养基中，加入1ml二甲基亚砜进行过滤除菌]进行融合持续正好1分钟。用5mL无血清DMEM进行4次清洗操作以除去PEG，然后加入CHO培养液。24小时后，将细胞接种到10个10cm细胞培养皿中，加入800μg/mL的G418(Promega)、8μg/mL的杀稻瘟菌素，选择培养10天。各进行2次反应，关于供体细胞22DT40 KL3F 1-5#2-1、22DT40 KL3F 2-1#1-2、#1-3，得到的药物抗性细胞为2、10、12个克隆。通过荧光确认到MAC中携带有EGFP表达盒，药物筛选克隆中保持有MAC。
[A.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
提取抗药性克隆的DNA，将其作为模板，进行PCR，确认修饰的人22号染色体是否转移到了CHO MAC细胞。
用于确认loxP***位点是否被维持的引物如下所示。
22CeT La L(同上)
22CeT La R(同上)
22CeT Ra L(同上)
22CeT Ra R(同上)
PCR使用日本宝生物株式会社生产的TP600作为热循环仪，使用KODFX(东洋纺)PCR酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
用于确认FRT***位点是否被维持的引物如下所示。
22TeT La L(同上)
22TeT La R(同上)
22TeT Ra L(同上)
22TeT Ra R(同上)
PCR使用日本宝生物株式会社生产的TP600作为热循环仪，使用KODFX(东洋纺)PCR酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
此外，进行PCR，确认是否也保持有人22号染色体区域。其引物如下所示。
553P-F(同上)
553P-R(同上)
PPM1F L(同上)
PPM1F R(同上)
IGLVI-70 L(同上)
IGLVI-70 R(同上)
GNAZ L(同上)
GNAZ R(同上)
LIF L(同上)
LIF R(同上)
hVpreB1-F(同上)
hVpreB1-Rm(同上)
hVpreB3-F(同上)
hVpreB3-R(同上)
hL5-F(同上)
hL5-R(同上)
344-F(同上)
344-R(同上)
350P-F(同上)
350P-R(同上)
IgL-F(同上)
IgL-Rm(同上)
SERPIND1 L(同上)
SERPIND1 R(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、在63℃、62℃、60℃、56℃、55℃、50℃中之一30秒、72℃1分钟进行35个循环。结果是来自22DT40 KL3F 1-5#2-1、22DT40 KL3F 2-1#1-2、#1-3的克隆、2、9、12个克隆为PCR阳性。根据该结果，筛选6个PCR阳性克隆，进行下面的实验。
[A.3]双色FISH分析
关于PCR分析阳性克隆，将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，筛选独立携带MAC和修饰人22号染色体的阳性细胞。根据分析的结果(图35)，将CHO(MAC1)KL3F#2-2、CHO(MAC1)KL3F#3-1这2个克隆用于下面的实验。
[B]人22号染色体区域易位克隆到MAC
使用Cre/LoxP***，使包含IGL区域的人22号染色体片段易位到MAC。
[B.1]通过Cre表达获得HAT抗性染色体重组体
MAC携带loxP位点，在Cre重组酶存在下与修饰的人22号染色体的loxP位点发生重组。此外，发生重组时未***到MAC中的为副产物的人22号染色体区域中的的5’HPRT与为副产物的MAC末端的3’HPRT连接，发生HPRT基因的重构，CHO(hprt-/-)获得HAT抗性。
关于携带修饰的人22号染色体和MAC的CHO(hprt-/-)，当在10cm细胞培养皿中达到汇合时，使用Lipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific)，参照厂商的操作步骤加入18μg的Cre表达质粒(载体名：pBS185)。加入后经过6小时后，更换培养液，24小时后，接种到10个10cm细胞培养皿中，用1×HAT(Sigma)、8μg/mL的杀稻瘟菌素进行药物筛选。
关于CHO(MAC1)KL3F#2-2、CHO(MAC1)KL3F#3-1，对得到的24、22个HAT抗性克隆进行以下分析。
[B.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了提取HAT抗性株的基因组DNA作为模板来筛选相互易位克隆，使用以下引物进行PCR，确认在人22号染色体片段和MAC上是否发生了染色体相互易位。其引物如下所示。
TRANS L1(同上)
TRANS R1(同上)
KJneo(同上)
PGKr-2(同上)
关于这些引物，使用LA taq(日本宝生物株式会社)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按94℃10秒、60℃30秒、72℃3分钟进行30个循环。
用于确认FRT***位点是否被维持的引物如下所示。
22TeT La L(同上)
22TeT La R(同上)
22TeT Ra L(同上)
22TeT Ra R(同上)
PCR使用日本宝生物株式会社生产的TP600作为热循环仪，使用KODFX(东洋纺)PCR酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
另外，对人22号染色体区域进行PCR分析。下面示出序列。
553P-F(同上)
553P-R(同上)
PPM1F L(同上)
PPM1F R(同上)
IGLVI-70 L(同上)
IGLVI-70 R(同上)
GNAZ L(同上)
GNAZ R(同上)
LIF L(同上)
LIF R(同上)
hVpreB1-F(同上)
hVpreB1-Rm(同上)
hVpreB3-F(同上)
hVpreB3-R(同上)
hL5-F(同上)
hL5-R(同上)
344-F(同上)
344-R(同上)
350P-F(同上)
350P-R(同上)
IgL-F(同上)
IgL-Rm(同上)
SERPIND1 L(同上)
SERPIND1 R(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、在63℃、62℃、60℃、56℃、55℃、50℃中之一30秒、72℃1分钟进行35个循环。关于CHO(MAC1)KL3F#2-2、CHO(MAC1)KL3F#3-1，17、7个克隆为阳性，分别筛选6、4个克隆，用于下面的实验。
[B.3]双色FISH分析
将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，确认到MAC和修饰的人2号染色体发生了相互易位，并且其中IGL区域被***到MAC的IGL-MAC、副产物被独立保持(图36)。结果是对筛选的2个克隆的阳性细胞(命名为CHO IGL-MAC)，进行以下实验。
[实施例10]使用相互易位，将人14号染色体上的IGH区域并入IGL-MAC
将制作的IGL-MAC转移到携带修饰的人14号染色体的CHO(hprt-/-)细胞株中，引发通过FRT/Flp***的重组，使IGL-MAC携带IGH区域，制作IGHL-MAC(图37)。
[A]IGL-MAC转移到携带修饰的人14号染色体的CHO CHO(hprt-/-)细胞株
[A.1]微核细胞融合与抗药性克隆的分离
在细胞培养皿中培养供体细胞CHO IGL-MAC，在汇合时更换为加入有20％FBS、0.1μg/ml秋水仙酰胺的F12培养基中，再培养48小时，之后更换为加入有20％FBS、0.1μg/ml秋水仙酰胺的F12培养基中，再孵育过夜，形成微细胞。除去培养液，在离心用烧瓶中倒满预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液，以34℃、8000rpm离心1小时。将微核(也称作“微细胞”)悬浮在无血清DMEM培养基中，用8μm、5μm、3μm过滤器纯化。纯化后，将微细胞悬浮在用DMEM制备的0.05mg/ml PHA-P(Sigma)溶液2mL中，除去培养液，然后加入到在6cm细胞培养皿中达到汇合的受体CHO hprt-/-14FRT#3-17_8和CHO hprt-/-14FRT#3-17_14中。孵育15分钟，使微核贴附到CHO细胞。然后，用1ml的PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全溶解在6mL无血清DMEM培养基中，加入1ml二甲基亚砜进行过滤除菌]进行融合，持续正好1分钟。用5mL无血清DMEM进行4次清洗操作以除去PEG，然后加入CHO培养液。24小时后，将细胞接种到10个10cm细胞培养皿中，加入800μg/mL的G418和8μg/mL的杀稻瘟菌素，选择培养10天，对于得到的抗药株进行下面的分析。
[A.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了确认IGL-MAC是否转移到了携带修饰的人14号染色体的CHO(hprt-/-)株中、修饰的人14号染色体是否被维持，进行PCR分析。下面示出所使用的引物。
KJneo(同上)
PGKr-2(同上)
关于这些引物，使用LA taq(日本宝生物株式会社)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按94℃10秒、60℃30秒、72℃3分钟进行30个循环。
用于确认FRT***位点是否被维持的引物如下所示。
22TeT La L(同上)
22TeT La R(同上)
22TeT Ra L(同上)
22TeT Ra R(同上)
PCR使用日本宝生物株式会社生产的TP600作为热循环仪，使用KODFX(东洋纺)PCR酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃5分钟进行35个循环。
另外，对人22号染色体区域进行PCR分析。下面示出序列。
553P-F(同上)
553P-R(同上)
PPM1F L(同上)
PPM1F R(同上)
IGLVI-70 L(同上)
IGLVI-70 R(同上)
GNAZ L(同上)
GNAZ R(同上)
LIF L(同上)
LIF R(同上)
hVpreB1-F(同上)
hVpreB1-Rm(同上)
hVpreB3-F(同上)
hVpreB3-R(同上)
hL5-F(同上)
hL5-R(同上)
344-F(同上)
344-R(同上)
350P-F(同上)
350P-R(同上)
IgL-F(同上)
IgL-Rm(同上)
SERPIND1 L(同上)
SERPIND1 R(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、在63℃、62℃、60℃、56℃、55℃、50℃中之一30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认人14号染色体区域的引物：
MTA1-F3(同上)
MTA1-R3(同上)
ELK2P2-F(同上)
ELK2P2-R(同上)
g1(g2)-F(同上)
g1(g2)-R(同上)
VH3-F(同上)
VH3-R(同上)
CH3F3(同上)
CH4R2(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒或56℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认修饰的人14号染色体上的FRT***位点的引物：
14TarC_La F(同上)
14TarC_La R(同上)
14TarC_Ra F(同上)
14TarC_Ra R(同上)
关于这些引物，使用KOD FX(东洋纺)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按98℃15秒、68℃6分钟进行35个循环。
根据该结果，对PCR阳性的克隆进行下面的实验。
[A.3]双色FISH分析
将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，确认独立携带有单拷贝的IGL-MAC和单拷贝的修饰的人14号染色体的克隆。选择阳性细胞(命名为CHO#14IGL-MAC)，进行下面的实验。
[B]使用FRT/Flp重组***的IGHL-MAC的构建
通过FRT/Flp***将IGL-MAC和修饰的人14号染色体相互易位，由此将来自人14号染色体的IGH区域易位克隆到IGL-MAC上，构建IGHL-MAC。
[B.1]通过FLP表达获得HAT抗性染色体重组体
使用IGL-MAC上的FRT位点和修饰的人14号染色体上的FRT位点，在FLPo重组酶的存在下进行相互易位。此外，当发生重组时，5’HPRT与IGHL-MAC上的3’HPRT连接，发生HPRT基因的重构，获得HAT抗性。关于CHO#14IGL-MAC，在10cm细胞培养皿中，在汇合时使用Lipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific)，参照厂商的操作步骤添加18μg的FLP表达质粒。加入后经过6小时后，更换培养液，24小时后，接种到10个10cm细胞培养皿中，用1×HAT、8μg/mL的杀稻瘟菌素进行药物筛选。
将得到的HAT抗性克隆用于下面的分析。
[B.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了使用FRT/FLP***进行期望的相互易位，并确认是否构建了IGHK-MAC，提取抗药性克隆的DNA，作为模板，进行PCR分析。所使用的引物如下所示。
用于确认相互易位连接位点的引物：
TRANS L1(同上)
TRANS R1(同上)
CMVr-1(同上)
PGKr-2(同上)
KJneo(同上)
PGKr-2(同上)
关于这些引物，使用LA taq(日本宝生物株式会社)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按94℃10秒、60℃30秒、72℃3分钟进行30个循环。
对人22号染色体区域进行PCR分析。下面示出序列。
553P-F(同上)
553P-R(同上)
PPM1F L(同上)
PPM1F R(同上)
IGLVI-70 L(同上)
IGLVI-70 R(同上)
GNAZ L(同上)
GNAZ R(同上)
LIF L(同上)
LIF R(同上)
hVpreB1-F(同上)
hVpreB1-Rm(同上)
hVpreB3-F(同上)
hVpreB3-R(同上)
hL5-F(同上)
hL5-R(同上)
344-F(同上)
344-R(同上)
350P-F(同上)
350P-R(同上)
IgL-F(同上)
IgL-Rm(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、在63℃、62℃、60℃、56℃、55℃、50℃中之一30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认人14号染色体区域的引物：
MTA1-F3(同上)
MTA1-R3(同上)
ELK2P2-F(同上)
ELK2P2-R(同上)
g1(g2)-F(同上)
g1(g2)-R(同上)
VH3-F(同上)
VH3-R(同上)
CH3F3(同上)
CH4R2(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒或56℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
[B.3]双色FISH分析
使用BAC克隆CH17-95F2(IGL区域)和CH17-262H11(IGH区域)，以及CH17-424L4(IGL区域)和CH17-212P11(IGH区域)的组合作为探针，进行双色FISH分析，详细分析IGHL-MAC是否被实际构建。将在MAC上分别观察到表示IGL区域和IGH区域的存在的信号的设为阳性，确认IGHL-MAC已被构建(命名为CHO IGHL-MAC)，筛选克隆，进行下面的实验。
[实施例11]IGHL-MAC转移到CHO K1细胞株
在IGHL-MAC和用于构建IGHL-MAC的相互易位时形成的副产物中，均携带Neo抗性基因，在通过微核细胞融合法转移到目标细胞时，当用G418进行药物筛选时，则会获得分别转入了IGHL-MAC或副产物或转入了IGHL-MAC和副产物二者的细胞。由于在MAC上携带EGFP，因此可以确认IGHL-MAC是否转移到了目标细胞中，而为了制作可有效进行染色体导入的且只携带IGHL-MAC的供体细胞，将IGHL-MAC转移到CHO K1细胞株中。
[A]微核细胞融合与抗药性克隆的分离
通过染色体转移，制作只携带IGHL-MAC的细胞株。
[A.1]IGHL-MAC转移到CHO K1株
在细胞培养皿中培养供体细胞CHO IGHL-MAC，在汇合时更换为加入有20％FBS、0.1μg/ml秋水仙酰胺的F12培养基中，再培养48小时，之后更换为加入有20％FBS、0.1μg/ml秋水仙酰胺的F12培养基中，再孵育过夜，形成微细胞。除去培养液，在离心用烧瓶中倒满预先在37℃下保温的细胞松弛素B(10μg/ml，Sigma)溶液，以34℃、8000rpm离心1小时。将微核(也称作“微细胞”)悬浮在无血清DMEM培养基中，用8μm、5μm、3μm过滤器纯化。纯化后，将微细胞悬浮在用DMEM制备的0.05mg/ml PHA-P(Sigma)溶液2mL中，除去培养液，然后加入到在6cm细胞培养皿中达到汇合的受体CHO K1细胞株中。孵育15分钟，使微核贴附到CHO细胞。然后，用1ml的PEG1000(Wako)溶液[将5g的PEG1000完全溶解在6mL无血清DMEM培养基中，加入1ml二甲基亚砜进行过滤除菌]进行融合，持续正好1分钟。用5mL无血清DMEM进行4次清洗操作以除去PEG，然后加入CHO培养液。24小时后，将细胞接种到10个10cm细胞培养皿中，加入800μg/mL的G418，选择培养10天。对于得到的抗药株，进行下面的分析。
[A.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了确认IGHL-MAC已转移到CHO K1细胞株中，提取抗药性克隆的DNA，将其作为模板，进行PCR分析。所使用的引物如下所示。
用于确认相互易位连接位点的引物：
TRANS L1(同上)
TRANS R1(同上)
CMVr-1(同上)
PGKr-2(同上)
KJneo(同上)
PGKr-2(同上)
关于这些引物，使用LA taq(日本宝生物株式会社)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按94℃10秒、60℃30秒、72℃3分钟进行30个循环。
对人22号染色体区域进行PCR分析。下面示出序列。
553P-F(同上)
553P-R(同上)
PPM1F L(同上)
PPM1F R(同上)
IGLVI-70 L(同上)
IGLVI-70 R(同上)
hVpreB1-F(同上)
hVpreB1-Rm(同上)
hVpreB3-F(同上)
hVpreB3-R(同上)
hL5-F(同上)
hL5-R(同上)
344-F(同上)
344-R(同上)
350P-F(同上)
350P-R(同上)
IgL-F(同上)
IgL-Rm(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、在63℃、62℃、60℃、56℃、55℃、50℃中之一30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认人14号染色体区域的引物：
MTA1-F3(同上)
MTA1-R3(同上)
ELK2P2-F(同上)
ELK2P2-R(同上)
g1(g2)-F(同上)
g1(g2)-R(同上)
VH3-F(同上)
VH3-R(同上)
CH3F3(同上)
CH4R2(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒或56℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。对PCR分析阳性的细胞株，进行下面的分析。
[A.3]双色FISH分析
将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，确认独立地携带单拷贝的IGHL-MAC。
进一步，使用BAC克隆CH17-95F2(IGL区域)和CH17-262H11(IGH区域)，以及CH17-424L4(IGL区域)和CH17-212P11(IGH区域)的组合作为探针，进行双色FISH分析，详细分析IGHL-MAC的结构。将在MAC上分别观察到表示IGL区域和IGH区域存在的信号的设为阳性(命名为CHO K1 IGHL-MAC)，用于下面的实验。
[实施例12]IGHL-MAC转移到小鼠ES细胞和大鼠ES细胞
[A]IGHL-MAC转移到小鼠ES细胞
为了制作人抗体产生小鼠，需要将IGHL-MAC转移到小鼠ES细胞中，在受精卵8细胞期进行注射，制作嵌合体小鼠，使IGHL-MAC传递给后代。
[A.1]微核细胞融合与抗药性克隆的分离
供体细胞使用CHO K1 IGHL-MAC。使用与实施例6[A.1]相同的方法进行微核细胞融合，获得EGFP阳性且具有抗药性的株，进行下面的分析。
[A.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了确认IGHL-MAC已转移到小鼠ES细胞株中，提取抗药性克隆的DNA，将其作为模板，进行PCR分析。所使用的引物如下所示。
用于确认相互易位连接位点的引物：
TRANS L1(同上)
TRANS R1(同上)
CMVr-1(同上)
PGKr-2(同上)
KJneo(同上)
PGKr-2(同上)
关于这些引物，使用LA taq(日本宝生物株式会社)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按94℃10秒、60℃30秒、72℃3分钟进行30个循环。
对人22号染色体区域进行PCR分析。下面示出序列。
553P-F(同上)
553P-R(同上)
PPM1F L(同上)
PPM1F R(同上)
IGLVI-70 L(同上)
IGLVI-70 R(同上)
hVpreB1-F(同上)
hVpreB1-Rm(同上)
hVpreB3-F(同上)
hVpreB3-R(同上)
hL5-F(同上)
hL5-R(同上)
344-F(同上)
344-R(同上)
350P-F(同上)
350P-R(同上)
IgL-F(同上)
IgL-Rm(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、在63℃、62℃、60℃、56℃、55℃、50℃中之一30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认人14号染色体区域的引物：
MTA1-F3(同上)
MTA1-R3(同上)
ELK2P2-F(同上)
ELK2P2-R(同上)
g1(g2)-F(同上)
g1(g2)-R(同上)
VH3-F(同上)
VH3-R(同上)
CH3F3(同上)
CH4R2(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒或56℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。对PCR分析阳性的细胞株，进行下面的分析。
[A.3]双色FISH分析
将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，确认只携带IGHL-MAC，且维持小鼠ES的正常核型。
使用BAC克隆CH17-95F2(IGL区域)和CH17-262H11(IGH区域)，以及CH17-424L4(IGL区域)和CH17-212P11(IGH区域)的组合作为探针，进行双色FISH分析，详细分析IGHL-MAC是否被实际构建。将在MAC上于期望的位置分别观察到表示IGL区域和IGH区域存在的信号的设为阳性细胞株(HKD31 IGHL-MAC)，用于注射。
[B]IGHL-MAC转移到大鼠ES细胞
为了制作人抗体产生大鼠，需要将IGHL-MAC转移到大鼠ES细胞中，在受精卵8细胞期进行注射，制作嵌合体小鼠，使IGHL-MAC传递给后代。
[B.1]微核细胞融合与抗药性克隆的分离
如上述实施例6[A.1]所述，使用与向小鼠ES细胞的微核细胞融合法相同的方法，将IGHL-MAC导入到大鼠ES细胞中。供体细胞使用CHO K1 IGHL-MAC。融合后，孵育过夜，加入G418，使其变成150μg/mL，进行3～4周选择培养。将结果为GFP阳性且具有抗药性的克隆用于下面的分析。
[B.2]通过PCR分析筛选抗药性克隆
为了确认IGHL-MAC已转移到大鼠ES细胞株中，提取抗药性克隆的DNA，将其作为模板，进行PCR分析。所使用的引物如下所示。
用于确认相互易位连接位点的引物：
TRANS L1(同上)
TRANS R1(同上)
KJneo(同上)
PGKr-2(同上)
关于这些引物，使用LA taq(日本宝生物株式会社)，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在98℃1分钟的热变性，然后按94℃10秒、60℃30秒、72℃3分钟进行30个循环。
对人22号染色体区域进行PCR分析。下面示出序列。
553P-F(同上)
553P-R(同上)
PPM1F L(同上)
PPM1F R(同上)
IGLVI-70 L(同上)
IGLVI-70 R(同上)
hVpreB1-F(同上)
hVpreB1-Rm(同上)
hVpreB3-F(同上)
hVpreB3-R(同上)
hL5-F(同上)
hL5-R(同上)
344-F(同上)
344-R(同上)
350P-F(同上)
350P-R(同上)
IgL-F(同上)
IgL-Rm(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、在63℃、62℃、60℃、56℃、55℃、50℃中之一30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用于确认人14号染色体区域的引物：
MTA1-F3(同上)
MTA1-R3(同上)
ELK2P2-F(同上)
ELK2P2-R(同上)
g1(g2)-F(同上)
g1(g2)-R(同上)
VH3-F(同上)
VH3-R(同上)
CH3F3(同上)
CH4R2(同上)
关于使用这些引物的PCR，使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒或56℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。对PCR分析阳性的细胞株，进行下面的分析。
[B.3]双色FISH分析
将人cot-1DNA和小鼠cot-1DNA作为探针进行FISH分析，确认独立携带单拷贝的IGHL-MAC，且维持大鼠ES的正常核型(42条)。使用BAC克隆CH17-95F2(IGL区域)和CH17-262H11(IGH区域)，以及CH17-424L4(IGL区域)和CH17-212P11(IGH区域)的组合作为探针，进行双色FISH分析，进一步详细分析IGHL-MAC的结构。将在MAC上于期望的位置分别观察到表示IGL区域和IGH区域存在的信号的设为阳性细胞株(命名为rESIGHL-MAC)，用于注射。
[实施例13]携带IGHL-MAC的小鼠和大鼠的制作和后代传递(子孫伝達)个体的制作
使用携带IGHL-MAC的小鼠和大鼠ES细胞，与(实施例7)同样地进行操作，由此可以制作携带IGHL-MAC的后代传递小鼠和大鼠。关于后代传递小鼠、大鼠和在过程中得到的嵌合体小鼠，与(实施例7)、(实施例12)同样地进行分析，确认IGHL-MAC的保持和抗体表达(也包括hλ)。制作的携带IGHL-MAC的小鼠和大鼠品系分别称为mTC(IGHL-MAC)、rTC(IGHL-MAC)。
[实施例14]人抗体产生小鼠的制作
使携带IGHK-MAC和IGHL-MAC的小鼠，与小鼠Igh和Igk基因被破坏且具有Igl突变(具有Igl的表达变低的突变)的小鼠进行交配，制作人抗体产生小鼠。
[A]Igh和Igk基因缺失、Igl低表达的小鼠的制作
为了制作人抗体产生小鼠，制作小鼠抗体基因缺失或低表达的小鼠。
[A.1]Igh和Igk基因缺失、Igl低表达的小鼠的制作
使从HKD31(小鼠Igh、Igk基因被破坏的)小鼠ES得到的小鼠品系，与具有小鼠Igl低表达的突变的CD-1(ICR、从Charles River公司购买)进行交配，制作Igh和Igk基因缺失、Igl低表达的小鼠。
来自CD-1的小鼠Iglc突变通过PCR-RFLP分析来确认。
使用以下引物进行PCR。
mIglc1VnC L：5’-CCTCAGGTTGGGCAGGAAGA-3’(SEQ ID NO:94)
J3C1：5’-GACCTAGGAACAGTCAGCACGGG-3’(SEQ ID NO:95)
使用Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)Taq聚合酶，缓冲液和dNTPS(dATP、dCTP、DGTP、dTTP)在被推荐添加时使用。温度、循环条件为在95℃10分钟的热变性，然后按95℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环。
用KpnI-HF(NEB)处理PCR产物，电泳后，将未确认到PCR产物切割的那些被判定为携带突变等位基因。结果是得到了在两个等位基因中确认到Igλ突变的小鼠(称为LD品系)。
[A.2]小鼠抗体基因的表达评价
通过流式细胞仪(FCM)分析和ELISA，来评价小鼠抗体表达的消失和基本未表达。
如实施例7[A.3]所述，如果Igh基因被破坏，Igμ的表达消失，则无法得到B细胞，通过判定有无B细胞，可以评价Igh基因缺失。FCM分析与以前的报告(Proc Natl Acad Sci US A.2000 Jan 18；97(2):722-7.)同样地进行，观察到B细胞缺失的个体，被判定为小鼠Igh缺失。对认为小鼠Igh、Igκ被破坏的小鼠(称为HKD品系)的外周血淋巴细胞进行FCM分析，结果显示出B细胞的标记即B220为阴性，因此表示该小鼠的Igh基因被破坏。进一步，进行与Igλ突变小鼠的交配，结果得到Igh、Igκ被破坏且在两个等位基因均有Igλ突变的小鼠(称为HKLD品系)。
另外，关于得到的小鼠，除了小鼠Igh以外，Igk、Igl的表达也与以前的报告(ProcNatl Acad Sci U S A.2000 Jan 18；97(2):722-7.)同样地进行ELISA，确认到表达消失和低表达。
[A.3]人抗体产生小鼠的制作
使携带IGHK-MAC的小鼠或携带IGHL-MAC的小鼠，与小鼠IghKO、IgkKO、Igl突变小鼠进行交配，制作人抗体产生小鼠。
[B]人抗体产生小鼠的评价
[B.1]FACS分析
为了确认携带IGHK-MAC或IGHL-MAC的B细胞的存在，进行流式细胞仪分析。使用针对小鼠CD45R(B220)的抗体，将血液细胞染色，确认人IGM、CD45R、GFP为阳性的细胞。使用肝素涂覆的毛细管，从眼窝采血，将血液转移到放入有肝素PBS的试管中，翻转混合，进行冰冷。在4℃下以2000rpm离心3分钟后，除去上清液，然后加入各种抗体，在4℃下反应30分钟，用加入5％胎牛血清的PBS(5％FBS/PBS)洗涤。进行完最后的离心后，向沉淀加入1.2％葡聚糖/生理盐水，敲击后，室温下静置45分钟，使红细胞自然沉降。将上清液转移到新试管，在4℃下以2000rpm离心3分钟后除去上清液，向沉淀加入室温的溶血剂(0.17M NH4Cl)，静置5分钟。在4℃下以2000rpm离心3分钟，用5％FBS/PBS洗涤后用500μl的5％FBS/PBS悬浮，将所得物作为分析样品，用流式细胞仪进行分析。对HKD mTC(IGHK-MAC)小鼠进行流式细胞仪分析，结果是关于外周血淋巴细胞，确认到B220、GFP均为阳性的细胞存在。这至少表示，IGHK-MAC发挥功能，人的IGH，尤其是IgM正在表达。
[B.2]人抗体的表达分析δ
为了确认人抗体基因轻链、重链、各种同种型的表达，通过ELISA进行测定。与(实施例7)[A.4]记载的方法相同，包括确认有无小鼠抗体表达在内，测定小鼠抗体(mγ、mμ、mκ、mλ)、人抗体(hγ、hμ、hκ、hλ、hγ1、hγ2、hγ3、hγ4、hα、hε、hδ)的表达和血清中的浓度。
[B.3]人抗体的表达分析和序列鉴定
根据来自人抗体产生小鼠的脾脏的RNA合成cDNA，进行人抗体基因可变区的克隆和碱基序列的确定。可通过与(实施例7)[A.5]同样地实施，进行分析和评价。
[B.4]抗原特异性人抗体产生应答的评价
关于人抗体产生小鼠，评价能否看到抗原特异性人抗体产生应答。
与(实施例7)[A.6]记载的方法相同地用人血清白蛋白免疫，分析抗体效价的上升。
[B.5]获得来自人抗体产生小鼠的人抗体产生杂交瘤
可以与专利(国际公布号WO 98/37757)记载的方法同样地获得人抗体产生杂交瘤。
[实施例15]人抗体产生大鼠的制作
使携带IGHK-MAC和IGHL-MAC的大鼠，与大鼠Igh、Igk、Igl被破坏的KO大鼠进行交配，制作人抗体产生大鼠。
[A]人抗体产生大鼠的制作和评价
[A.1]人抗体产生大鼠的制作
通过使携带IGHK-MAC和IGHL-MAC的大鼠品系与大鼠Igh、Igκ、Igλ基因被破坏的大鼠品系进行交配，可以制作人抗体产生大鼠。
[A.2]FACS分析
确认携带IGHK-MAC或IGHL-MAC的B细胞。按照与(实施例14)[B.1]相同的方法实施，抗体使用抗大鼠CD45R(B220)抗体，溶血剂使用0.15MNH4Cl。
[A.3]人Ig的表达分析
为了通过ELISA确认人抗体基因轻链、重链、各种同种型的表达，可以通过与(实施例7)[A.4]同样地进行分析来评价人抗体产生。使用抗大鼠免疫球蛋白抗体，评价大鼠抗体(rγ、rμ、rκ、rλ)的表达。
[A.4]人抗体的表达分析和基因序列鉴定
可以使用与上述(实施例7)[A.5]相同的方法，进行抗体基因序列的确定、分析与评价。
[A.5]抗原特异性人抗体产生应答的评价
可以与(实施例14)[A.6]的记载同样地实施并进行评价。
[A.6]获得来自人抗体产生大鼠的人抗体产生杂交瘤
可以按照与(实施例14)[B.5]相同的方法实施，获得人抗体产生杂交瘤。
工业实用性
根据本发明，可以使用包括例如大鼠等啮齿类的非人动物制作人抗体，因此在药物抗体的制造中有用。
本说明书所引用的全部出版物、专利以及专利申请均通过直接引用而并入本说明书。
序列表
<110> 国立大学法人鸟取大学
染色体移入股份公司
<120> 产生人抗体的非人动物和使用该非人动物的人抗体制作方法
<130> PH-7059-PCT
<150> JP 2016-213844
<151> 2016-10-31
<160> 95
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 1
tcgaggatcc cacatagaca ttcaaccgca aagcag 36
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 2
tcgaggatcc aggccctaca catcaaaaag tgaagca 37
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 3
ctgagaagag tcattgttta tggtagact 29
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 4
atccccatgt gtatcactgg caaactgt 28
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 5
ggggaataaa caccctttcc aaatcctc 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 6
accaagtaac cgatcaaacc aacccttg 28
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
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<223> 引物
<400> 7
agctcagaga cacctctcca 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 8
ctgtattagg atacttggct attga 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 9
tatcaagggg gtgtcggaaa tcgtg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 10
actgggcctg ggagaacctg agact 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 11
aggtgctgct gggtggtcaa gt 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 12
gctcctgcaa atgtctcctg tca 23
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 13
cttacccagg ctccaggctc tatt 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
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<223> 引物
<400> 14
ctctacctcc ctaccccatc atcac 25
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 15
tggaaggtgg ataacgccct 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
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<223> 引物
<400> 16
tcattctcct ccaacattag ca 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
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<223> 引物
<400> 17
agtcagggca ttagcagtgc 20
<210> 18
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 18
gctgctgatg gtgagagtga 20
<210> 19
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 19
ctctcctgca gggccagtca 20
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 20
tgctgatggt gagagtgaac tc 22
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
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<223> 引物
<400> 21
ctctaactga atcaagggaa tgaac 25
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 22
agcagtttga gtttaggatg aagg 24
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 23
tcgagcggcc gcaggatctt tgggggactg aatggggtgt gct 43
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 24
tcgaacgcgt tggaaccctc atacgttgct ggtggaatgt 40
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 25
cgaggatcca tttctccaca tcctagccaa cacttgacat ttcct 45
<210> 26
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 26
tcgaggatcc gccagggaga cagatgccaa gtacggttta g 41
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 27
tgagaacaca ggggtctcca ttctgact 28
<210> 28
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 28
acaatcaaca gcatccccat ctctgaag 28
<210> 29
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 29
gacgtgctac ttccatttgt cacgtcct 28
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tggtcactga agctttccat ctgctctt 28
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tggaggccat aaacaagaag ac 22
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<223> 引物
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ccccttgacc cagaaattcc a 21
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<223> 引物
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catcgccttc tatcgccttc ttgacg 26
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<212> DNA
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<223> 引物
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atctgcacga gactagtgag acgtgcta 28
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 35
tcgagcggcc gcgtacaatc ttggatcact acaacctctg ccta 44
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<212> DNA
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<223> 引物
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tcgaggcgcg ccaggattat agatgtgagc catcactaag actcct 46
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<212> DNA
<213> 人工的
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<223> 引物
<400> 37
tcgagtcgac agcacgttgg gaggccaagg caggagaata 40
<210> 38
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<213> 人工的
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<223> 引物
<400> 38
tcgaggatcc tggctgacac agccagtccc ggatt 35
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agcaattagg gcctgtgcat ctcacttt 28
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ccagctcatt cctcccactc atgatcta 28
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catctggagt cctattgaca tcgccagt 28
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<213> 人工的
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<223> 引物
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cttattcctc cttctgccca cccttcat 28
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agcactttac gcatcccagc atgt 24
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ccaagagagt agtcgtgccc ctca 24
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cccactttac cgtgctcatt 20
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atgaaggtcc gtgactttgg 20
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accccaaagg ccaaactctc cactc 25
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cacttgtact ccttgccatt cagc 24
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<213> 人工的
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<223> 引物
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agtgagataa gcagtggatg 20
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<212> DNA
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<223> 引物
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cttgtgctac tcccatcact 20
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<212> DNA
<213> 人工的
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<223> 引物
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aggccagcat ctgcgaggat 20
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<212> DNA
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<223> 引物
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gtggcagcaa gtagacatcg 20
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<212> DNA
<213> 人工的
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cctattggcg ttactatggg aacatacg 28
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<212> DNA
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<223> 引物
<400> 54
tgtagctgac tttagccacc cacaagtac 29
<210> 55
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 55
tcgaggcgcg ccctcaaact cctgggtgta aatgatcctc ctgc 44
<210> 56
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 56
tgagggtacc gtgcagtaaa gtatgattga gc 32
<210> 57
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 57
tcgagtcgac cttgctgatt atacctcatc tccttccctc 40
<210> 58
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 58
cctgccttct tgtttcagct ctcaactg 28
<210> 59
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 59
gacgtgctac ttccatttgt cacgtcct 28
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 60
atccccatgt gtatcactgg caaactgt 28
<210> 61
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 61
acactttagt ccctgtcccc tcaacgag 28
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 62
agatctcttg agcccagcag tttga 25
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 63
tgaagttagc cggggataca gacg 24
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 64
aacggcagcc aaaccaaaga 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 65
accaggactg gctgggcata 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 66
agtctgcgct gacccaggaa 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 67
ttgagccaga gaagcggtca 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 68
tccacttggg ggtctgcatt 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 69
tggtgctgag cagctgtgtg 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 70
tgggacttag gtgggccaga 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 71
gcctccccaa gagcctgaat 20
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 72
tgtcctgggc tcctgtcctg ctcat 25
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 73
ggcggcgact ccaccctctt 20
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 74
cactgcctgc ccgctgctgg ta 22
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 75
gggcggggaa gtgggggaga g 21
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 76
agccccaaga acccagccga tgtga 25
<210> 77
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 77
ggcagaggga gtgtggggtg ttgtg 25
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 78
atcatctgct cgctctctcc 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 79
cacatctgta gtggctgtgg 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 80
accagcgcgt catcatcaag 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 81
atcgccagcc tcaccatttc 20
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 82
ggagaccacc aaaccctcca aa 22
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 83
gagagttgga gaaggggtga ct 22
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 84
acctagaggg tctcacctcc 20
<210> 85
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 85
ccctggacat caagaatgg 19
<210> 86
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 86
tcgaggatcc ggcctcccaa aggattatag acgtgagcca ctgt 44
<210> 87
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 87
tcgaggcgcg ccggcacctc tcctattttc ttcacagcac tt 42
<210> 88
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 88
tcgaggcgcg ccagcatggt ggcccgcacg tatagtcgca gcta 44
<210> 89
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 89
tcgagcggcc gcaaagaagg ggcccgcctc tgcctctaaa tcctgac 47
<210> 90
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 90
tgcaggtatc tgttggtgtc cctgtttt 28
<210> 91
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 91
gacgtgctac ttccatttgt cacgtcct 28
<210> 92
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 92
agcagagctc gtttagtgaa ccgtcaga 28
<210> 93
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 93
ctgtcctatc cttgcagctg tcttccag 28
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
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<223> 引物
<400> 94
cctcaggttg ggcaggaaga 20
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 95
gacctaggaa cagtcagcac ggg 23

Claims (18)

1.一种非人动物，其含有小鼠人工染色体载体(hIGHK-MAC)，所述小鼠人工染色体载体(hIGHK-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体κ轻链基因或基因座。
2.一种非人动物，其含有小鼠人工染色体载体(hIGHL-MAC)，所述小鼠人工染色体载体(hIGHL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
3.一种非人动物，其含有小鼠人工染色体载体(hIGHK-MAC)和小鼠人工染色体载体(hIGHL-MAC)，所述小鼠人工染色体载体(hIGHK-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体κ轻链基因或基因座；所述小鼠人工染色体载体(hIGHL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
4.一种非人动物，其含有小鼠人工染色体载体(hIGHKL-MAC)，所述小鼠人工染色体载体(hIGHKL-MAC)包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座，以及人抗体λ轻链基因或基因座。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的非人动物，其中，所述非人动物为哺乳动物。
6.根据权利要求5所述的非人动物，其中，所述哺乳动物为啮齿类。
7.根据权利要求6所述的非人动物，其中，所述啮齿类为小鼠或大鼠。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的非人动物，其中，所述非人动物的至少2个内源性抗体基因或基因座被敲除。
9.一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，所述方法包括：使权利要求1所述的非人动物与其中对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的同种非人动物进行交配，并选择含hIGHK-MAC且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
10.一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，所述方法包括：使权利要求2所述的非人动物与其中对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的同种非人动物进行交配，并选择含hIGHL-MAC且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
11.一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，所述方法包括以下步骤：
使权利要求1所述的非人动物与权利要求2所述的非人动物进行交配，制作含hIGHK-MAC和hIGHL-MAC的非人动物；以及
使制作的非人动物与其中对应于人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的同种非人动物进行交配，并选择含hIGHK-MAC和hIGHL-MAC且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
12.一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，所述方法包括：使含有小鼠人工染色体载体(hIGHK-MAC)且对应于所述人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物与含有小鼠人工染色体载体(hIGHL-MAC)且对应于所述人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ和λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物进行交配，并选择含hIGHK-MAC和hIGHL-MAC且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物，其中，所述hIGHK-MAC包含人抗体重链基因或基因座以及人抗体κ轻链基因或基因座，所述hIGHL-MAC包含人抗体重链基因或基因座以及人抗体λ轻链基因或基因座。
13.一种能够产生人抗体的非人动物的制作方法，所述方法包括：使权利要求4所述的非人动物与其中对应于人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座以及人抗体λ轻链基因或基因座的内源性抗体基因被敲除的同种非人动物进行交配，并选择含hIGHKL-MAC且所述内源性抗体基因或基因座被敲除的非人动物。
14.一种制造人抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
向权利要求1～8中任一项所述的非人动物给予抗原物质；以及
从所述非人动物中回收所产生的与所述抗原物质结合的人抗体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述抗原物质为细胞、蛋白质、多肽或肽。
16.一种制造人单克隆抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
向权利要求1～8中任一项所述的非人动物给予抗原物质；
从所述非人动物中取出脾脏细胞；
将所述脾脏细胞与骨髓瘤进行融合，制作杂交瘤；以及
从所述杂交瘤中回收与所述抗原物质结合的抗体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述抗原物质为细胞、蛋白质、多肽或肽。
18.一种小鼠人工染色体载体，其包含人抗体重链基因或基因座、人抗体κ轻链基因或基因座和/或人抗体λ轻链基因或基因座。
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