WO2016006658A1 - 非エンベロープウイルス粒子の製造方法 - Google Patents

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WO2016006658A1
WO2016006658A1 PCT/JP2015/069770 JP2015069770W WO2016006658A1 WO 2016006658 A1 WO2016006658 A1 WO 2016006658A1 JP 2015069770 W JP2015069770 W JP 2015069770W WO 2016006658 A1 WO2016006658 A1 WO 2016006658A1
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peg
enveloped virus
virus particles
virus
sample
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PCT/JP2015/069770
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敏和 西江
泰広 川野
修平 坂本
榎　竜嗣
高蔵　晃
峰野　純一
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タカラバイオ株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N7/02—Recovery or purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing non-enveloped virus particles with high purity without complicated operations.
  • a method using a vector for gene transfer using a virus (hereinafter referred to as a viral vector) is used as a biological method.
  • a viral vector is a vector in which a naturally occurring virus is modified so that a desired gene or the like can be transferred to a target.
  • Technological development has progressed in recent years.
  • a virus vector prepared using a gene recombination technique is called a gene recombinant virus vector.
  • viruses having no envelope such as viruses having an envelope such as adenovirus and adeno-associated virus (hereinafter, AAV) are well known.
  • AAV can infect a wide variety of cells including humans, infects non-dividing cells such as blood cells, muscles, and nerve cells that have been differentiated, and is less susceptible to side effects because it is not pathogenic to humans.
  • non-dividing cells such as blood cells, muscles, and nerve cells that have been differentiated
  • side effects because it is not pathogenic to humans.
  • the utility value as a vector for gene transfer used in gene therapy methods for the treatment of cancer and infectious diseases is It has attracted attention in recent years.
  • an element essential for virus particle formation is usually introduced into a cell in the form of a nucleic acid construct, and a cell having the ability to produce a virus (hereinafter referred to as a virus producing cell) is prepared. This is done by culturing cells to express elements essential for virus particle formation.
  • a virus producing cell a cell having the ability to produce a virus
  • This is done by culturing cells to express elements essential for virus particle formation.
  • those that require cis supply and those that can be supplied in trans are separated and introduced into cells for virus production, thereby producing wild-type virus and gene
  • Patent Document 1 A method for preventing independent replication at the infection site of the recombinant virus is taken (Patent Document 1).
  • rAAV genetically modified AAV vector derived from AAV
  • the first developed method is to 1) leave the ITRs at both ends of the wild-type AAV genome, and supply rAAV plasmid with nucleic acid except rep and cap genes, and 2) supply Rep and Cap proteins to trans.
  • rAAV plasmid with nucleic acid except rep and cap genes
  • Rep and Cap proteins to trans.
  • plasmids into host cells, 3) as a helper virus that supplies auxiliary elements for the formation of infectious viral particles.
  • a method of using herpes virus, vaccinia virus or the like as a helper virus instead of adenovirus is also known.
  • the virus-producing cells that have achieved virus production are then collected and crushed, and the resulting cell disruption solution containing rAAV particles is subjected to a process such as filter filtration, ultracentrifugation, chromatography, or ultrafiltration as appropriate. rAAV particles are purified to the final product.
  • Non-patent Document 1 a method for obtaining virus particles with higher titer and purity is required, and various improved methods are disclosed.
  • Patent Document 1 a method that promotes the production of virus particles and the release rate of the particles into the culture supernatant by culturing virus-producing cells under stress conditions in which the pH of the culture medium is increased.
  • Patent Document 1 a method that promotes the production of virus particles and the release rate of the particles into the culture supernatant by culturing virus-producing cells under stress conditions in which the pH of the culture medium is increased.
  • Patent Document 1 a method that promotes the production of virus particles and the release rate of the particles into the culture supernatant by culturing virus-producing cells under stress conditions in which the pH of the culture medium is increased.
  • it is a device about the process after purification of the produced virus.
  • a rapid and simple method has been proposed as a method for purifying virus particles (Non-patent Document 1).
  • the method is also SDS in terms of purity. -Many bands considered to be impurities are observed in PAGE, which is not sufficient from the viewpoint of purity and simplicity. As described above, there is still room for improvement in the method for treating virus-producing cells that is performed before the virus particles are subjected to purification.
  • An object of the present invention is to provide a production method for obtaining high-purity non-enveloped virus particles without complicated operations.
  • the present inventors have determined that a sample containing non-envelope virus particles has at least two concentrations. It was found that high-purity non-enveloped virus particles can be obtained by treating with PEG of the present invention, and the present invention has been completed.
  • the present invention is a method for producing non-enveloped viral particles comprising: (A) treating a sample containing non-enveloped virus particles with a first concentration of polyethylene glycol (PEG); (B) removing the precipitate generated in the step (a), treating the resulting supernatant with a second concentration of PEG, and (c) removing the precipitate from the precipitate generated in the step (b).
  • PEG polyethylene glycol
  • the first PEG concentration is exemplified by 0.5 to 4%
  • the second PEG concentration is exemplified by 3 to 10%.
  • the second PEG concentration is higher than the first PEG concentration.
  • the sample containing non-enveloped virus particles may be a crude extract obtained by contacting non-enveloped virus-producing cells with an acidic solution, or culture of non-enveloped virus-producing cells. When non-enveloped virus particles leak into the medium, the supernatant of the culture solution may be used. In addition, when non-enveloped virus particles are formed in vitro by mixing virus nucleic acid and virus protein in vitro, the mixed solution may be used as a sample as it is.
  • the sample containing non-enveloped virus particles may be a sample that has been subjected to nuclease treatment, and the sample containing non-enveloped virus particles may be a sample that has been subjected to chloroform treatment.
  • the sample containing non-enveloped virus particles may be a sample obtained by further treating a crude extract obtained by contacting non-enveloped virus-producing cells with an acidic solution with an acid.
  • the method of the present invention may include a step of performing a chloroform treatment after the step (c).
  • the non-enveloped virus may be an adeno-associated virus.
  • the acidic solution may be a solution containing a cation and citric acid.
  • the present invention provides a production method for obtaining high-purity non-enveloped virus particles without complicated operations. Furthermore, non-enveloped virus particles produced using the production method are provided. The virus particles produced by the method of the present invention can also be applied to conventional methods for purifying non-enveloped virus particles.
  • a non-enveloped virus refers to a virus other than an enveloped virus.
  • the envelope virus refers to a virus having a lipid layer or a lipid bilayer on the surface of the virus.
  • Representative non-enveloped viruses include DNA genome viruses, such as adenoviruses, parvoviruses, papovaviruses, and human papillomaviruses, and RNA viruses such as rotaviruses, coxsackie viruses, enteroviruses, and sapoviruses.
  • DNA genome viruses such as adenoviruses, parvoviruses, papovaviruses, and human papillomaviruses
  • RNA viruses such as rotaviruses, coxsackie viruses, enteroviruses, and sapoviruses.
  • non-enveloped virus there is no particular limitation on the non-enveloped virus to which the production method of the present invention is applied, and non-enveloped viruses that have already been known for production, non-enveloped viruses newly obtained from nature, or genetic recombination derived therefrom. Viral vectors may be used.
  • the non-enveloped virus produced by the production method of the present invention is preferably exemplified by adenovirus or AAV belonging to Parvoviridae.
  • virus particle means a particle composed of a protein shell called capsid.
  • the “virus vector” means a virus genome (nucleic acid form) contained in the virus particle.
  • an rAAV particle is a particle composed of a protein shell called a capsid and contains an rAAV vector.
  • the rAAV vector contains viral genomic DNA present in rAAV particles.
  • virus particle includes a virus-like particle not containing a virus genome (for example, AAV hollow particle: WO 2012/144446).
  • rAAV vector-derived virus-like particles or AAV hollow particles are a category of rAAV particles.
  • a virus-producing cell refers to a cell that expresses an element necessary for virus production and produces virus particles.
  • the virus-producing cells used in the production method of the present invention are not particularly limited, and may be virus-producing cells obtained in the environment or from clinical specimens of patients with infectious diseases, or may be virus-produced cells that have been artificially produced.
  • kits for producing recombinant adenovirus vector and rAAV vector producing cells are also commercially available.
  • the essential elements for rAAV particle formation include, for example, (A) a nucleic acid encoding an AAV-derived Rep protein and a nucleic acid encoding a Cap protein, (B) an adenovirus-derived element, such as E1a By introducing a protein, an E1b protein, an E2 protein, an E4 protein, a nucleic acid that supplies VARNA, and (C) a nucleic acid encapsulated in the rAAV particle into an arbitrary cell, a cell that produces rAAV particles can be produced.
  • a method of using an adenovirus or the like as a helper virus instead of the nucleic acid described in (B) is also known.
  • the arbitrary cells are not particularly limited, and are mammalian cells such as humans, monkeys, rodents, etc., preferably 293 cells (ATCC CRL-1573) with high transfection efficiency, 293T / 17 cells (ATCC CRL- 11268), 293F cells, 293FT cells (all manufactured by Life Technologies), G3T-hi cells (International Publication No. 06/035829 pamphlet), AAV293 cells (available from Stratagene), which are commercially available cell lines for virus production, Sf9 Examples include insect cells such as cells (ATCC CRL-1711).
  • the 293 cell or the like constantly expresses the adenovirus E1 protein so that one or several of these proteins necessary for rAAV production may be expressed transiently or constitutively. It may be a modified cell.
  • nucleic acid encoding the AAV-derived Rep protein and the nucleic acid encoding the Cap protein can be mounted on a plasmid or viral vector and introduced into a cell.
  • Introduction of these nucleic acids into cells can be performed by a known method using, for example, a commercially available or known plasmid or viral vector.
  • the nucleic acid encapsulated in the rAAV particles is composed of an AAV-derived ITR sequence and a nucleic acid that is desired to be mounted on an rAAV vector.
  • the nucleic acid desired to be loaded on the rAAV vector includes any foreign gene such as a polypeptide (enzyme, growth factor, cytokine, receptor, structural protein, etc.), antisense RNA, ribozyme, decoy, RNA that causes RNA interference, etc.
  • the nucleic acid which supplies is illustrated.
  • an appropriate promoter, enhancer, terminator or other transcriptional regulatory element may be inserted into the nucleic acid to control the expression of the foreign gene.
  • the nucleic acid encapsulated in the rAAV particle may contain any foreign gene desired to be loaded into the rAAV vector between the two ITR sequences, or the rAAV vector between the two ITR sequences. It may contain any foreign gene desired to be loaded on and one or more elements for controlling the expression of the foreign gene.
  • the nucleic acid encapsulated in the viral particle can be introduced into the cell in the form of a plasmid as a nucleic acid construct.
  • the plasmid can be constructed using, for example, a commercially available rAAV vector plasmid, such as pAAV-CMV Vector (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • a nucleic acid encapsulated in a viral particle can be introduced into a cell by infection with a viral vector that retains the genome containing the nucleic acid sequence.
  • a viral vector that retains the genome containing the nucleic acid sequence.
  • the said viral vector is not specifically limited, For example, a baculovirus vector can be used.
  • Non-enveloped virus-producing cells can be cultured under known culture conditions.
  • the non-enveloped virus-producing cells are derived from mammalian cells, examples include culturing at a temperature of 30 to 37 ° C., a humidity of 95%, and a CO 2 concentration of 5 to 10%.
  • the non-enveloped virus-producing cells are derived from insect cells Is exemplified by shaking culture at 26 to 30 ° C., but the present invention is not limited to such conditions. If growth of a desired non-enveloped virus-producing cell or production of a desired non-enveloped virus can be achieved, it may be carried out at a temperature, humidity, or CO 2 concentration other than the above ranges.
  • the non-enveloped virus-producing cells are 12 to 150 hours, preferably 48 to 120 hours when the non-enveloped virus-producing cells are derived from mammalian cells. In the case of insect cell-derived, it is 3 to 11 days, preferably 5 to 9 days.
  • the sample containing non-enveloped virus particles used in the method of the present invention is not particularly limited to the present invention, but is prepared by disrupting or lysing non-envelope virus-producing cells cultured as described above. Can do.
  • the present invention can also be carried out using the supernatant of the culture solution as a sample.
  • the present invention can also be carried out using a mixed solution as a sample.
  • non-enveloped virus-producing cells can be carried out by a known method such as ultrasonic treatment, freeze-thaw treatment, enzyme treatment, osmotic pressure treatment or the like.
  • a sample containing non-enveloped virus can be obtained by contacting non-enveloped virus-producing cells with an acidic solution. This step involves suspending the non-enveloped virus-producing cell pellet collected by removing the culture solution by centrifugation or filtration after culturing, or suspending the non-enveloped virus-producing cell culture in the culture solution. It is carried out by an operation of adding a component that can be made acidic.
  • the temperature and time when contacting with the acidic solution are not particularly limited, and the temperature is, for example, 0 to 40 ° C., preferably 4 to 37 ° C., and the time is, for example, 1 minute to 48 hours, preferably 5 Minutes to 24 hours are exemplified.
  • the non-enveloped virus particles are used as a sample containing non-enveloped virus particles in the method of the present invention in a state where they are contacted with an acidic solution or after neutralization.
  • the non-enveloped virus particles can be stored for a long time in an ultra-low temperature freezer such as ⁇ 80 ° C. in a state in contact with an acidic solution or in a state after neutralization.
  • the acidic solution refers to a solution showing acidity.
  • the solution should be a solution that exhibits a pH lower than that during culture of non-enveloped virus-producing cells and that can process non-enveloped virus-producing cells that have achieved virus production to obtain a sample containing non-enveloped virus particles.
  • the acidic solution used in the present invention include a solution having a pH of 3.0 to 6.9, preferably a pH of 3.0 to 6.0, and more preferably a pH of 3.0 to 5.0.
  • Examples of the acidic solution used in the present invention include citric acid, acetic acid, malic acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, lactic acid, propionic acid, butyric acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, Examples include maleic acid, tartaric acid, benzoic acid, sulfosalicylic acid, formic acid, and salts thereof, and a solution containing a compound selected from a good buffer having a buffer range of less than pH 7, such as MES and Bis-Tris.
  • an acidic solution containing citric acid, acetic acid, phosphoric acid, and salts thereof is preferably used.
  • the concentration of the compound in the acidic solution is preferably 5 mM to 1 M, more preferably 10 to 500 mM.
  • the solvent used in the acidic solution is not particularly limited, and water, a buffer solution, a cell culture medium, and the like can be appropriately selected. Moreover, the solvent may contain various ions according to the subsequent operation. Examples of such ions include, but are not limited to, cations such as sodium ions, potassium ions, and magnesium ions.
  • the acidic solution solvent of the present invention preferably contains cations such as water, sodium chloride solution, potassium chloride solution, magnesium chloride solution, sodium ion such as physiological saline, potassium ion, and / or magnesium ion. Examples include an aqueous solution or an aqueous solution containing a saccharide such as a glucose solution and a sucrose solution.
  • the sodium ion and / or potassium ion concentration in the solution is not particularly limited, and examples thereof include 5 mM to 2.7 M, preferably 5 mM to 1 M, and more preferably 20 to 800 mM. Although not particularly limited, for example, in the case of 30 to 40 mM citrate buffer, about 200 mM sodium ion is already contained, but the citrate buffer further added with 50 to 100 mM sodium ion is acidic. It may be used as a solution.
  • the component that can be added to the culture solution of non-enveloped virus-producing cells to make the culture solution acidic is a component that makes the pH of the culture solution lower than the pH during culture of non-envelope virus-producing cells, and virus production There is no limitation as long as it is a component that can obtain a crude extract containing non-enveloped virus particles from non-enveloped virus-producing cells.
  • Examples of components that can make the culture solution used in the present invention acidic include, for example, citric acid, acetic acid, malic acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, lactic acid, propionic acid, butyric acid, oxalic acid, malonic acid, and succinic acid.
  • the amount of the component capable of acidifying the culture solution is not particularly limited as long as the crude extract containing non-enveloped virus particles can be obtained from the non-enveloped virus-producing cells in which virus production has been achieved. It is determined. Furthermore, various ionic components may be added together with a component capable of making the culture solution acidic. For example, the same ionic solution as described for the acidic solution can be used.
  • a sample containing non-enveloped virus particles obtained through the above-described steps (hereinafter also referred to as “crude extract of virus particles”) is difficult to precipitate non-envelope virus particles.
  • a concentration ie, a first concentration of polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the first PEG concentration is, for example, in the range of 0.5 to 4% (hereinafter,% means W / V), and preferably in the range of 1 to 3%.
  • An appropriate PEG concentration may be determined by the method described in the book example 1.
  • the obtained supernatant is further treated with a second concentration of PEG.
  • the second concentration is higher than the first concentration.
  • Non-enveloped virus particles precipitate in the presence of the second concentration of PEG and are separated from soluble contaminants in the presence of this concentration of PEG.
  • the second concentration of PEG solution is, for example, in the range of 3 to 10%, preferably in the range of 4 to 8%.
  • the appropriate concentration of PEG can be appropriately determined by, for example, the method described in Example 1 of the present specification. What is necessary is just to determine a density
  • Non-enveloped virus particles precipitated by treatment with the second concentration of PEG are recovered by known methods such as filtration or centrifugation. Since the method of the present invention can be purified and concentrated at the same time, it can be suitably used for a sample containing non-enveloped virus particles having a low concentration. Although it does not specifically limit, The case where the non-enveloped virus particle
  • PEG that can be used in the method of the present invention is not particularly limited, and those having various average molecular weights can be used.
  • PEG having an average molecular weight of 200 to 10,000, preferably PEG having an average molecular weight of 4,000 to 10,000 is used in the present invention. More preferably, PEG having an average molecular weight of 6,000 to 8,000 can be used.
  • a first concentration of PEG treatment of a sample containing non-enveloped virus particles, and a second concentration of PEG treatment on the supernatant obtained from the first concentration of PEG treatment comprises converting solid PEG into the sample and although it can be carried out by adding to the supernatant, it is preferable to prepare a solution of PEG prepared in advance so that the final concentration of PEG in the sample and the supernatant is the first concentration and the second concentration, respectively. It is carried out by adding to a concentration.
  • the sample and supernatant to which PEG has been added to a predetermined concentration are cooled at a low temperature, for example, 0 to 10 ° C., for example, 1 minute to 48. It is carried out by standing for a time, preferably 5 minutes to 24 hours, more preferably 30 minutes to 2 hours.
  • the separation of the supernatant and the precipitate in these PEG treatments may be performed by a known solid-liquid separation method such as filtration. It is preferably carried out by centrifugation.
  • the method for producing a non-enveloped virus of the present invention can be combined with a known virus purification method.
  • a sample containing a non-enveloped virus particle may be treated with nuclease before the step of treating with the first concentration of PEG.
  • the nuclease used in the step is preferably one that acts on DNA in the crude extract, and examples include benzonase (Benzonase (registered trademark), manufactured by Merck Millipore), Cryonase Cold-active nuclease (manufactured by Takara Bio Inc.), and the like.
  • the temperature and time conditions of the nuclease treatment step may be appropriately determined according to the type of enzyme used, and are not particularly limited.
  • contaminants may be precipitated by treating a sample containing a non-enveloped virus particle (crude extract of virus particles) with an acid.
  • the acid is not particularly limited as long as it lowers the pH of a sample containing non-enveloped virus particles. Examples of the acid include the same solutions or components exemplified as the acidic solution used for the preparation of the sample containing non-enveloped virus particles or the component that can be made acidic.
  • the acidic solution used when preparing the sample containing non-envelope virus particles is used.
  • the solution or acidic component and the acidic solution or acidic component used in the acid treatment step of the sample containing non-enveloped virus particles prior to the treatment with the first concentration of PEG are of the same type. It may be an acid or a different kind of acid.
  • the treatment temperature and treatment time for the acid treatment step are not particularly limited and may be determined as appropriate. For example, the temperature is 0 to 10 ° C., the time is 1 minute to 48 hours, preferably 5 minutes to 24 hours, and more preferably 30 minutes to 2 hours.
  • citrate or citrate buffer so that the final concentration of citrate is increased by 50 to 200 mM in a crude extract obtained by treating cells with 30 to 40 mM citrate buffer. Can be added to precipitate impurities in the crude extract.
  • the “sample containing non-enveloped virus particles (crude extract of virus particles)” after the acid treatment is used in the next step while remaining acidic or neutralized.
  • chloroform treatment can be combined with the method of the present invention.
  • a sample containing non-enveloped virus particles may be treated with chloroform in advance, followed by treatment with the first concentration of PEG and treatment with the second concentration of PEG, completing the two-stage PEG treatment. Then, chloroform treatment may be continued.
  • the chloroform treatments may be combined.
  • the chloroform treatment step may be performed according to a conventional method. In an example of the chloroform treatment, 99% purity chloroform of the same volume is added to a solution containing non-enveloped virus particles, and the mixture is sufficiently stirred and centrifuged. Non-enveloped virus particles are present in the obtained supernatant (aqueous layer), and impurities are present in the chloroform layer or the interface.
  • Nuclease treatment, acid treatment, and chloroform treatment of a sample containing non-enveloped virus particles prior to the step of treating with the first concentration of PEG, and chloroform treatment after treatment with the second concentration of PEG Any one may be combined with the method of the present invention, or any two or more treatments may be combined with the method of the present invention.
  • these treatments are performed in any order. You may go.
  • Non-enveloped virus particles can be obtained as the final product.
  • Purification of the non-enveloped virus particles by the chromatography is performed by ion exchange columns (for example, Mustang Q (manufactured by Pall)), affinity columns (for example, AVB Sepharose (manufactured by GE), heparin columns, etc.), hydroxyapatite columns, etc. Can be implemented. Further, impurities can be precipitated by treatment with the above-described high concentration acid.
  • the degree of acquisition of non-enveloped virus particles is indicated using the titer of non-enveloped virus as an evaluation method.
  • the titer of the non-enveloped virus is not particularly limited, but a) the number of genomes of the non-enveloped virus (genomic titer) in a fixed amount of sample, b) to the non-enveloped virus cells measured experimentally C) infectivity (infectivity titer), or c) a method of measuring the purity of the protein that constitutes the non-enveloped virus, specified as necessary.
  • a method for measuring the genome titer for example, a method of measuring the number of copies of the viral genome in a sample by the PCR method is exemplified.
  • Infectious titer can be measured by, for example, infecting appropriate target cells with a serial dilution of the sample and detecting cell shape change (cytopathy), detecting transgene expression, Examples thereof include a method for measuring the copy number of the introduced viral genome.
  • cytopathy cell shape change
  • transgene expression Examples thereof include a method for measuring the copy number of the introduced viral genome.
  • Examples of a method for measuring the purity of a protein constituting a non-enveloped virus include a method for analyzing the protein by SDS-PAGE or a method for quantifying it by an immunological method.
  • a kit for producing non-enveloped virus particles is provided.
  • a sample containing non-enveloped virus particles is added to a PEG suitable for the operation of treating the sample with the first PEG concentration and the second PEG concentration in the method for producing non-envelope virus particles of the present invention, for example, the sample.
  • the PEG solution which can be made with the above two concentrations.
  • reagents used in the preparation of crude extracts from non-enveloped virus-producing cells such as acidic solutions, vectors containing nucleic acids that supply essential elements for non-enveloped virus particle formation, and non-enveloped virus particles It is good also as a kit containing the vector etc. which contain the nucleic acid enclosed with.
  • kits used in the production method and non-enveloped virus particles produced by the production method are also provided.
  • the pharmaceutical composition which uses the non-enveloped virus particle acquired using the manufacturing method of this invention as an active ingredient is also provided.
  • the pharmaceutical composition can be appropriately prepared according to the production technique of a virus preparation for gene therapy.
  • non-enveloped virus particles obtained by further concentrating, purifying and processing non-enveloped virus particles obtained by the production method of the present invention by a known method can be used as a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition can be used ex vivo on patient-derived cells or can be administered directly to the patient.
  • Example 1 Examination of PEG precipitation concentration (1) Seeding of cells for producing rAAV particles CellBIND (registered trademark) T225 flask (manufactured by Corning) was suspended in DMEM (manufactured by Hyclone) in DMEM (manufactured by Sigma). Turbid 293T / 17 cells were seeded. Thereafter, the cells were cultured for 3 days in a CO 2 incubator at 37 ° C., and it was confirmed that the cells were approximately 70% confluent.
  • CellBIND registered trademark
  • DMEM manufactured by Hyclone
  • DMEM manufactured by Sigma
  • AAV2 type 2 AAV
  • Rep protein and Cap protein using the calcium phosphate method to cells obtained in Example 1-
  • PRC plasmid containing Cell Bio Labs pHLP plasmid containing sequences encoding E2A, VA, V4 of adenovirus (Cell Bio Labs)
  • expression of fluorescent protein AsRed2 between two ITRs of AAV2 genome 25 ⁇ g each of pAAV-AsRed2 plasmids for example, plasmids described in International Publication No.
  • the mixture was allowed to stand and mixed again with a vortex mixer for 15 seconds. Thereafter, centrifugation was performed at 14,000 ⁇ g, 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was collected. A solution obtained by adding 1/10 amount of 2M Tris-HCl (pH 9.5) to the obtained supernatant was used as a crude extract.
  • PEG precipitation 1/100 amount of 1M MgCl 2 was added to the crude extract obtained in Example 1- (3), followed by treatment with benzonase (manufactured by Merck Millipore) for 1 hour at 37 ° C. (final concentration 250 U). / ML).
  • a 60% polyethylene glycol (PEG) -8000 (Promega) solution was added to the crude extract after the benzonase treatment so that the final concentrations of PEG were 8%, 6%, 4%, 2%, and 1%, respectively.
  • the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes. Thereafter, centrifugation was performed at 1,500 ⁇ g, 4 ° C. for 30 minutes, the supernatant was removed, and the pellet was collected.
  • the pellet was suspended in a solution containing 25 mM EDTA, 150 mM NaCl, 50 mM HEPES (pH 7.4), and allowed to stand overnight at 4 ° C. as a PEG precipitate.
  • Genomic titration DNase I prepared by the method described in the instructions from the crude extract obtained in Example 1- (3) and 2 ⁇ L of the PEG precipitate obtained in Example 1- (4) (Takara Bio Inc.) The reaction solution was added to 18 ⁇ L and mixed, and then enzymatic reaction was performed to remove free genomic DNA and plasmid DNA. Thereafter, in order to inactivate DNase I, heat treatment was performed at 99 ° C. for 10 minutes to obtain a DNase I-treated rAAV particle-containing solution.
  • lane 1 crude extract
  • lane 2 8% PEG precipitation
  • lane 3 6% PEG precipitation
  • lane 4 4% PEG precipitation
  • lane 5 2% PEG precipitation
  • lane 6 1% PEG precipitation.
  • Example 2 Removal of Contaminants by PEG Precipitation Operation (1) Acquisition of Crude Extract by Citrate Buffer Treatment A crude extract was obtained in the same manner as in Examples 1- (1) to (3). After adding 1/100 amount of 1M MgCl 2 to this crude extract, benzonase treatment was performed at 37 ° C. for 1 hour.
  • Example 2- (1) PEG precipitation, washing, and concentration with 100K UF
  • the benzonase-treated crude extract obtained in Example 2- (1) was subjected to any of the following treatments A to F to prepare a sample.
  • a 60% PEG-8000 solution was added to and mixed with the benzonase-treated crude extract so that the final concentration of PEG was 8%, and allowed to stand on ice for 30 minutes, after which 1,500 ⁇ g, 4 ° C.
  • the pellet was collected by centrifugation for 30 minutes.
  • the collected pellet was suspended in PBS (manufactured by Gibco) and allowed to stand at 4 ° C. overnight to dissolve the pellet.
  • a 60% PEG-8000 solution was added to the benzonase-treated crude extract so that the final concentration of PEG was 2%, mixed, and allowed to stand on ice for 30 minutes, after which 1,500 ⁇ g, 4 ° C. The supernatant was collected by centrifugation for 30 minutes. Next, a 60% PEG-8000 solution was added to the collected supernatant to a final concentration of 8%, mixed, and allowed to stand on ice for 30 minutes, after which 1,500 ⁇ g, 4 ° C., 30 minutes The pellet was collected by centrifugation. The recovered pellet was suspended in PBS (manufactured by Gibco) and allowed to stand at 4 ° C. overnight to dissolve the pellet.
  • PBS manufactured by Gibco
  • sample F After preparing the same sample E as the above-mentioned E, it was further concentrated by a 100K ultrafiltration centrifuge unit (100K UF) to obtain sample F.
  • Example 2- (2) Protein purity measurement The protein purity of the sample obtained in Example 2- (2) was measured in the same manner as in Example 1- (6). The result is shown in FIG. In FIG. 2, lanes 1 to 7 are in order of the benzonase-treated crude extract and A to F.
  • Example 3 Contaminant Removal by Combination of PEG Precipitation Operation and Chloroform Treatment
  • Acquisition of Crude Extract by Citrate Buffer Treatment The crude extract was obtained in the same manner as in Examples 1- (1) to (3). I got it. After adding 1/100 amount of 1M MgCl 2 to this crude extract, benzonase treatment was performed at 37 ° C. for 1 hour.
  • a 60% PEG-8000 solution was added to the benzonase-treated crude extract so that the final concentration of PEG was 1%, mixed, and allowed to stand on ice for 30 minutes, after which 1,500 ⁇ g, 4 ° C. The supernatant was collected by centrifugation for 30 minutes. Next, a 60% PEG-8000 solution was added to the collected supernatant so as to have a final concentration of 5%, mixed and allowed to stand on ice for 30 minutes, and then 1500 ⁇ g, 4 ° C., 30 minutes. The pellet was collected by centrifugation. The collected pellet was suspended in PBS (manufactured by Gibco) and allowed to stand at 4 ° C. overnight to dissolve the pellet.
  • PBS manufactured by Gibco
  • sample J A supernatant obtained by preparing the same sample I as in sample I and subjecting it to chloroform treatment was designated as sample J.
  • Example 3- (2) Protein purity measurement The protein purity of the sample obtained in Example 3- (2) was measured in the same manner as in Example 1- (6). The result is shown in FIG. In FIG. 3, lane 1: G, lane 2: H, lane 3: I, lane 4: J.
  • Example 4 Addition of citric acid and removal of impurities by PEG precipitation operation (1) Acquisition of crude extract by citrate buffer treatment
  • Citric acid precipitation 1/20 amount of 2M citric acid solution was added to the crude extract obtained in Example 4- (1), mixed well, and allowed to stand at 4 ° C. for 90 minutes. After standing, centrifugation was performed at 2,380 ⁇ g, 4 ° C. for 20 minutes, and the supernatant was collected as a citric acid-treated supernatant.
  • a 40% PEG-6,000 solution was added to the supernatant so that the final concentration of PEG was 8%. After mixing, the solution was allowed to stand on ice for 60 minutes. Thereafter, centrifugation was performed at 2,380 ⁇ g, 4 ° C. for 30 minutes, and the pellet was collected. The pellet was suspended in a solution containing 10 mM MgCl 2 , 75 mM NaCl, 50 mM HEPES (pH 8.0) and allowed to stand at 4 ° C. overnight. Thereafter, centrifugation was performed at 2,380 ⁇ g, 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant 1 was recovered.
  • HNE buffer 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 25 mM EDTA
  • HNE buffer 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 25 mM EDTA
  • Example 4- (2) and Example 4- (3) were measured by the same method as in Example 1- (5). The results are shown in Table 4.
  • Example 4- (2) and Example 4- (3) Protein purity measurement The protein purity of the samples obtained in Example 4- (2) and Example 4- (3) was measured by the same method as in Example 1- (6).
  • rAAV particles purified by ultracentrifugation were used as a comparative control. The result is shown in FIG. In FIG. 4, lane 1: crude extract, lane 2: citric acid-treated supernatant, lane 3: supernatant after 1% PEG precipitation, lane 4: 8% PEG precipitation (supernatant 1), lane 5: 8% PEG Precipitate (supernatant 2), lane P: ultracentrifugated rAAV particles (comparative control).
  • the supernatant 1 had fewer bands than the crude extract and the citric acid precipitate.
  • Table 4 it is shown that high titer and high purity rAAV particles can be purified by combining citric acid precipitation and PEG precipitation.
  • Example 5 Removal of contaminants from insect cell culture supernatant by two-step PEG precipitation (1) Cultivation of insect cells for production of rAAV particles PSFM-J1 medium (manufactured by Wako) was added to CELLBAG (registered trademark) (manufactured by GE Healthcare). 2 L of Sf9 cells suspended in 2). Thereafter, using WAVE25 (manufactured by GE Healthcare), the cells were cultured with shaking at 28 ° C. until the cell density reached approximately 2 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • PSFM-J1 medium manufactured by Wako
  • CELLBAG registered trademark
  • WAVE25 manufactured by GE Healthcare
  • Example 5- (1) Infection with baculovirus vector for producing rAAV particles
  • a genome containing a vector genome sequence containing an expression cassette of a target gene between two ITR regions of AAV2 is retained.
  • Example 5- (2) Acquisition of insect cell culture supernatant A part of the culture solution obtained in Example 5- (2) was collected and centrifuged at 1,750 ⁇ g, 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was collected. . The supernatant obtained here was used as an insect cell culture supernatant.
  • Example 5- (3) PEG precipitation 7 mL of the insect cell culture supernatant obtained in Example 5- (3) was divided into two tubes. In one tube, add a 40% PEG-6,000 solution so that the final concentration of PEG is 8%, mix, and let stand on ice for 30 minutes, then 1,500 ⁇ g, 4 ° C. The pellet was collected by centrifugation for 30 minutes. The collected pellet was suspended in 140 ⁇ L of DPBS and allowed to stand overnight at 4 ° C. to dissolve the pellet, thereby obtaining a sample (8% PEG precipitation).
  • Example 5- (4) Protein purity measurement The protein purity of the sample obtained in Example 5- (4) was measured in the same manner as in Example 1- (6). The result is shown in FIG. In FIG. 5, lane 1: 8% PEG precipitation, lane 2: 2-8% PEG precipitation, M: molecular weight marker.
  • FIG. 5 shows that 2-8% PEG precipitation (lane 2) had fewer bands than 8% PEG precipitation (lane 1). This indicates that impurities in the insect cell culture supernatant can be removed by PEG precipitation. Moreover, when combined with the results of Example 5- (5), it is shown that rAAV particles can be purified by PEG precipitation.
  • the highly non-enveloped virus particles can be obtained without complicated operations by the non-enveloped virus production method of the present invention.
  • the non-enveloped virus particles prepared by the production method of the present invention and compositions containing such particles as active ingredients are very useful as gene transfer methods in basic research of gene therapy or clinical applications.

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Abstract

　非エンベロープウイルス粒子を含有する試料を少なくとも二種類の濃度のＰＥＧで処理することを特徴とする非エンベロープウイルス粒子の製造方法、当該製造方法に使用されるキット、及び当該製造方法で製造した非エンベロープウイルス粒子、当該非エンベロープウイルス粒子を有効成分とする医薬組成物が提供される。

Description

非エンベロープウイルス粒子の製造方法
　本発明は、非エンベロープウイルス粒子を煩雑な操作なく高純度に製造する方法に関する。
　現在、遺伝子組換え分野や医療分野においては、ヒトを含む哺乳動物細胞に遺伝子を導入する方法として、電気穿孔や金属微粒子を用いる物理的方法、核酸、ポリカチオン、もしくはリポソームを用いる化学的方法等に加えて、生物学的方法としてウイルスを用いた遺伝子導入用のベクター（以下、ウイルスベクター）を用いる方法が用いられる。ウイルスベクターとは、天然由来のウイルスを改変し、所望の遺伝子等を標的に移入することができるようにしたベクターのことで、近年技術開発が進んでいる。一般に、遺伝子組換え技術を用いて作製したウイルスベクターは、遺伝子組換えウイルスベクターと呼ばれるが、そういった遺伝子組換えウイルスベクターの由来となるウイルスとしては、レトロウイルスやレンチウイルス、センダイウイルス、ならびにヘルペスウイルス等のエンベロープを持つウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（以下、ＡＡＶ）等のエンベロープを持たないウイルス（非エンベロープウイルス）がよく知られている。
　特にＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞等の分化を終えた非***細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること等から、先天性遺伝子疾患の治療の他、癌や感染症の治療を目的とした遺伝子治療法に用いる遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が、近年注目されている。
　遺伝子組換えウイルスの製造方法としては、通常、ウイルス粒子形成に必須な要素を核酸構築物の形で細胞に導入し、ウイルスを産生する能力を有する細胞（以下、ウイルス産生細胞）を作製し、当該細胞を培養してウイルス粒子形成に必須な要素を発現させることで行われる。一般的には、前記ウイルス粒子形成に必須な要素のうち、シス供給を要するものとトランス供給可能なものを分離してウイルス産生用の細胞に導入することで、野生型ウイルスの産生、及び遺伝子組換えウイルスの感染先での自立複製を防ぐ方法が取られる（特許文献１）。
　以下、ＡＡＶを由来とした遺伝子組換えＡＡＶ（以下、ｒＡＡＶ）ベクターを例に挙げて具体的に説明する。最初に開発された方法は、１）野生型ＡＡＶゲノムの両端のＩＴＲを残し、ｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子を除いた核酸をプラスミドに搭載したｒＡＡＶプラスミド、及び２）Ｒｅｐ、Ｃａｐタンパク質をトランスに供給するためのｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子発現プラスミド、の宿主細胞への導入に加えて、感染性ウイルス粒子形成のための補助要素を供給するヘルパーウイルスとして３）アデノウイルスを宿主細胞に感染させる方法である（特許文献２）。アデノウイルスに換えて、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス等をヘルパーウイルスとして使用する方法も知られている。上記方法を用いると、理論上、製造されたベクター液中にアデノウイルス（もしくはその他のヘルパーウイルス）が混入するが、それを回避するため、上記３）に代わって３’）アデノウイルス由来要素のうち、ＡＡＶのウイルス粒子形成に必須な要素のみを発現するヘルパープラスミドの導入、を用いる製造方法（ヘルパーフリー系）が開発された（特許文献３）。
　ウイルス産生が達成されたウイルス産生細胞は、その後、回収、破砕され、得られたｒＡＡＶ粒子を含む細胞破砕液を適宜フィルターろ過、超遠心、クロマトグラフィー、又は限外ろ過等の工程に供することによってｒＡＡＶ粒子が精製され、最終製造物となる。
　現在、ｒＡＡＶの利用が遺伝子治療の基礎研究、又は臨床応用の分野に広がるにつれ、より高力価、高純度のウイルス粒子を取得する方法が必要とされ、各種の改良方法が開示されている。例えば、培養培地のｐＨを上昇させたストレス条件下でウイルス産生細胞を培養することで、ウイルス粒子の産生と当該粒子の培養上清への放出割合を促す方法（特許文献１）が知られているが、それ以外は産生されたウイルスの精製以降の工程についての工夫である。また、ウイルス粒子の精製方法においても、迅速かつ簡便な方法が提案されている（非特許文献１）。当該方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）相と水相の二相分割方法、ＰＥＧ沈殿、クロロホルム処理、及び透析の四種類の処理工程を含む複雑な精製方法であることに加え、純度の上でもＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて不純物と思われるバンドが多数認められており、純度及び簡便さという観点からみると十分ではない。以上のように、ウイルス粒子を精製に供する前に実施されるウイルス産生細胞の処理方法については、依然改善の余地が残されている。
国際公開第００／１４２０５号パンフレット 国際公開第９７／０６２７２号パンフレット 国際公開第９７／１７４５８号パンフレット
ジャーナル　オブ　バイロロジカル　メソッズ（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第１８３巻、第２号、１３９～１４６頁（２０１２年）
　本発明の目的は、煩雑な操作なく高純度の非エンベロープウイルス粒子を得るための製造方法を提供することにある。
　本発明者らは煩雑な操作なく高純度の非エンベロープウイルス粒子を得るための製造方法を提供することを目的に鋭意研究を重ねた結果、非エンベロープウイルス粒子を含有する試料を少なくとも二種類の濃度のＰＥＧで処理することで、高純度の非エンベロープウイルス粒子が得られることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明を概説すれば、本発明は非エンベロープウイルス粒子の製造方法であって、
（ａ）非エンベロープウイルス粒子を含有する試料を第一の濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で処理する工程、
（ｂ）前記（ａ）工程で生成した沈殿物を除去し、得られた上清を第二の濃度のＰＥＧで処理する工程、及び
（ｃ）前記（ｂ）工程で生成した沈殿物から非エンベロープウイルス粒子を取得する工程、
を含む、方法に関する。
　本発明の方法において、第一のＰＥＧ濃度としては０．５～４％が、また第二のＰＥＧ濃度としては３～１０％が、それぞれ例示される。なお、第二のＰＥＧ濃度は第一のＰＥＧ濃度を超える濃度である。また、本発明の方法において、非エンベロープウイルス粒子を含有する試料は、非エンベロープウイルス産生細胞を酸性の溶液に接触させて得られる粗抽出液であってもよいし、非エンベロープウイルス産生細胞の培養中に培地中に非エンベロープウイルス粒子が漏出するような場合には培養液の上清であってもよい。また、ウイルス核酸とウイルス蛋白質をｉｎ　ｖｉｔｒｏで混合することにより非エンベロープウイルス粒子がｉｎ　ｖｉｔｒｏで形成される場合には、混合溶液をそのまま試料として用いてもよい。また、非エンベロープウイルス粒子を含有する試料は、ヌクレアーゼ処理を施された試料であってもよく、非エンベロープウイルス粒子を含有する試料は、クロロホルム処理を施された試料であってもよい。また、非エンベロープウイルス粒子を含有する試料は、非エンベロープウイルス産生細胞を酸性の溶液に接触させて得られる粗抽出液をさらに酸で処理した試料であってもよい。さらに、本発明の方法において、前記（ｃ）工程の後にクロロホルム処理を行う工程を含んでもよい。
　本発明の方法において、非エンベロープウイルスは、アデノ随伴ウイルスであってもよい。また、本発明の方法において、酸性の溶液がカチオン、及びクエン酸を含む溶液であってもよい。
　本発明により、煩雑な操作なく高純度の非エンベロープウイルス粒子を得るための製造方法が提供される。更に、当該製造方法を用いて製造した非エンベロープウイルス粒子が提供される。本発明の方法で製造されたウイルス粒子は、従来の非エンベロープウイルス粒子の精製方法にも適用可能である。
各ＰＥＧ濃度で処理したサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真である。 二段階のＰＥＧ濃度で処理したサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真である。 二段階のＰＥＧ濃度で処理、及びクロロホルム処理したサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真である。 高濃度の酸処理、及び二段階のＰＥＧ濃度で処理したサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真である。 二段階のＰＥＧ濃度で処理した昆虫細胞培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真である。
　本明細書において非エンベロープウイルスとは、エンベロープウイルス以外のウイルスを指す。ここでエンベロープウイルスとは、ウイルス表面に脂質層もしくは脂質２重層を持つウイルスを指す。非エンベロープウイルスの代表的なものとしては、ＤＮＡをゲノムとするウイルスについては、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ヒトパピローマウイルス等、ＲＮＡをゲノムとするウイルスについては、ロタウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、サポウイルス、ノロウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、アストロウイルス等が例示される。
　本発明の製造方法が適用される非エンベロープウイルスに特に限定はなく、既に産生方法が知られた非エンベロープウイルスでも、天然から新たに取得された非エンベロープウイルス、又はそれらを由来とする遺伝子組換えウイルスベクターでもよい。本発明の製造方法で製造される非エンベロープウイルスには、好適にはアデノウイルス、又はパルボウイルス科のＡＡＶが例示される。
　本明細書において、「ウイルス粒子」とはカプシド（ｃａｐｓｉｄ）と呼ばれるタンパク質の殻から構成された粒子を意味する。また「ウイルスベクター」とは、前記のウイルス粒子に包含されているウイルスゲノム（核酸形状）を意味する。例えば、ＡＡＶの場合、ｒＡＡＶ粒子は、カプシド（ｃａｐｓｉｄ）と呼ばれるタンパク質の殻から構成された粒子であって、ｒＡＡＶベクターを含む。また、ｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶ粒子内に存在するウイルスゲノムＤＮＡを含むものである。さらに本明細書では、「ウイルス粒子」には、ウイルスゲノムを含んでいないウイルス様粒子（例えばＡＡＶ中空粒子：国際公開第２０１２／１４４４４６号パンフレット）の場合も含む。特に限定はされないが、ｒＡＡＶベクター由来のウイルス様粒子、又はＡＡＶ中空粒子は、ｒＡＡＶ粒子の範疇である。
　本明細書においてウイルス産生細胞とは、ウイルス産生に必要な要素を発現し、ウイルス粒子を産生する細胞のことを指す。本発明の製造方法で用いられるウイルス産生細胞に特に限定はなく、環境中や、感染症の患者の臨床検体等から得られたウイルス産生細胞でもよく、人為的に作製したウイルス産生細胞でもよい。
　種々の非エンベロープウイルスを産生する細胞が知られており、また、その作製方法もよく知られている。さらに遺伝子組換えアデノウイルスベクターやｒＡＡＶベクターの産生細胞を製造するためのキットも市販されている。ｒＡＡＶベクターを例に挙げて説明すると、ｒＡＡＶ粒子形成に必須な要素として、例えば、（Ａ）ＡＡＶ由来Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸及びＣａｐタンパク質をコードする核酸、（Ｂ）アデノウイルス由来要素、例えばＥ１ａタンパク質、Ｅ１ｂタンパク質、Ｅ２タンパク質、Ｅ４タンパク質、ＶＡＲＮＡを供給する核酸、（Ｃ）ｒＡＡＶ粒子に封入される核酸を任意の細胞に導入することにより、ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞を作製することができる。なお、前記の（Ｂ）に記載された核酸に換えてアデノウイルス等をヘルパーウイルスとして使用する方法も知られている。
　前記任意の細胞としては、特に限定はなく、ヒト、サル、げっ歯類等の哺乳動物細胞、好適にはトランスフェクション効率が高い２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１５７３）、２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１１２６８）、２９３Ｆ細胞、２９３ＦＴ細胞（いずれもライフテクノロジーズ社製）、Ｇ３Ｔ－ｈｉ細胞（国際公開第０６／０３５８２９号パンフレット）、市販のウイルス産生用細胞株であるＡＡＶ２９３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１７１１）などの昆虫細胞が例示される。また、例えば、前記２９３細胞等はアデノウイルスＥ１タンパク質を恒常的に発現するが、このような、ｒＡＡＶ産生に必要なタンパク質の１つ、又はいくつかを一過的もしくは恒常的に発現するように改変した細胞であってもよい。
　前記のＡＡＶ由来Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸及びＣａｐタンパク質をコードする核酸、ならびに前記のアデノウイルス由来要素を供給する核酸の形態には限定はなく、それぞれの要素を供給可能な１又は複数の核酸構築物として、プラスミドやウイルスベクターに搭載して、細胞に導入することができる。これらの核酸の細胞への導入は、例えば、市販又は公知のプラスミド又はウイルスベクターを用いて公知の方法により行うことができる。
　前記のｒＡＡＶ粒子に封入される核酸は、ＡＡＶ由来のＩＴＲ配列とｒＡＡＶベクターに搭載することが望まれる核酸で構成される。ｒＡＡＶベクターに搭載することが望まれる核酸としては、任意の外来遺伝子、例えばポリペプチド（酵素、成長因子、サイトカイン、レセプター、構造タンパク質等）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、デコイ、ＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡ等を供給する核酸が例示される。加えて外来遺伝子の発現の制御のため、適当なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターやその他の転写調節要素が前記の核酸に挿入されていてもよい。例えば、ｒＡＡＶ粒子に封入される核酸は、２つのＩＴＲ配列の間にｒＡＡＶベクターに搭載することが望まれる任意の外来遺伝子を含んでいてもよく、または、２つのＩＴＲ配列の間に、ｒＡＡＶベクターに搭載することが望まれる任意の外来遺伝子、及び該外来遺伝子の発現の制御のための１以上の要素を含んでいてもよい。ウイルス粒子に封入される核酸は核酸構築物として、プラスミドの形態で細胞に導入することができる。前記のプラスミドは、例えば市販のｒＡＡＶベクタープラスミドであるｐＡＡＶ－ＣＭＶ　Ｖｅｃｔｏｒ等（タカラバイオ社製）を使用して構築することができる。または、ウイルス粒子に封入される核酸は、該核酸配列を含むゲノムを保持するウイルスベクターの感染で細胞に導入することもできる。前記のウイルスベクターは、特に限定はされないが、例えばバキュロウイルスベクターを使用することができる。
　非エンベロープウイルス産生細胞の培養は、公知の培養条件で行うことができる。例えば、非エンベロープウイルス産生細胞が哺乳動物細胞由来の場合は温度３０～３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５～１０％での培養が例示され、非エンベロープウイルス産生細胞が昆虫細胞由来の場合は２６～３０℃での振盪培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。所望の非エンベロープウイルス産生細胞の増殖、又は所望の非エンベロープウイルスの産生が達成できるのであれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ２濃度で実施してもよい。また、培養期間についても特に限定はなく、所望の非エンベロープウイルス産生細胞の増殖、又は所望の非エンベロープウイルスの産生が達成できる培養期間であればいずれであってもよい。例えば、非エンベロープウイルス粒子形成に必要な要素を細胞に導入後、非エンベロープウイルス産生細胞が哺乳動物細胞由来の場合は１２～１５０時間、好適には４８～１２０時間であり、非エンベロープウイルス産生細胞が昆虫細胞由来の場合は３～１１日間、好適には５～９日間である。
　本発明の方法に使用される非エンベロープウイルス粒子を含有する試料は、特に本発明を限定するものではないが、上記のように培養された非エンベロープウイルス産生細胞を破砕もしくは溶解して調製することができる。非エンベロープウイルス産生細胞の培養中に培地中に非エンベロープウイルス粒子が漏出するような場合には、培養液の上清を試料として本発明を実施することもできる。また、ウイルス核酸とウイルス蛋白質をｉｎ　ｖｉｔｒｏで混合することにより非エンベロープウイルス粒子がｉｎ　ｖｉｔｒｏで形成される場合には、混合溶液を試料として本発明を実施することもできる。非エンベロープウイルス産生細胞の破砕や溶解は、超音波処理、凍結融解処理、酵素処理、浸透圧処理等の公知の方法で実施することができる。さらに、本明細書実施例に記載されているように、非エンベロープウイルス産生細胞を酸性の溶液と接触させることにより非エンベロープウイルスを含有する試料を得ることもできる。当該工程は、培養後に遠心分離やろ過によって培養液を除去して回収された非エンベロープウイルス産生細胞のペレットを酸性の溶液に懸濁する操作、もしくは非エンベロープウイルス産生細胞の培養液に培養液を酸性とし得る成分を添加する操作、により実施される。酸性の溶液と接触している際の温度と時間は特に限定はなく、温度としては例えば０～４０℃、好適には４～３７℃、時間としては例えば１分～４８時間、好適には５分～２４時間が例示される。この接触操作により非エンベロープウイルス粒子は産生細胞外に放出される。該非エンベロープウイルス粒子は、酸性の溶液と接触させた状態あるいは中和した後の状態で、本発明の方法において非エンベロープウイルス粒子を含有する試料として使用される。また、該非エンベロープウイルス粒子は、酸性の溶液と接触させた状態あるいは中和した後の状態で、－８０℃等の超低温フリーザーにおいて長期に保存することも可能である。
　前記酸性の溶液とは酸性を示す溶液のことを指す。当該溶液は、非エンベロープウイルス産生細胞の培養時のｐＨより低いｐＨを示し、かつウイルス産生が達成された非エンベロープウイルス産生細胞を処理して非エンベロープウイルス粒子を含有する試料を取得できる溶液であれば限定はない。本発明に使用される酸性の溶液としては、例えば、ｐＨ３．０～６．９、好ましくはｐＨ３．０～６．０、更に好ましくはｐＨ３．０～５．０の溶液が例示される。本発明に使用される酸性の溶液としては、例えば、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、安息香酸、スルホサリチル酸、ギ酸、及びそれらの塩等、更に、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ等の緩衝域がｐＨ７未満のグッドバッファーから選択される化合物を含有する溶液が例示される。本発明には、好適にはクエン酸、酢酸、リン酸、及びそれらの塩を含有する酸性の溶液が使用される。当該酸性の溶液における前記化合物の濃度としては、好ましくは濃度５ｍＭ～１Ｍ、より好ましくは１０～５００ｍＭが例示される。
　前記酸性の溶液で用いる溶媒には特に限定はなく、水、緩衝液、細胞培養用培地等、適宜選択可能である。また、溶媒は引き続いての操作に応じて各種イオンを含んでいてもよい。このようなイオンとしては、限定するものではないが、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオンなどのカチオンが挙げられる。本発明の酸性の溶液の溶媒としては、好適には水、塩化ナトリウム溶液、塩化カリウム溶液、塩化マグネシウム溶液、生理的食塩水等のナトリウムイオン、カリウムイオン、及び／又はマグネシウムイオンなどのカチオンを含む水溶液、もしくはブドウ糖溶液、ショ糖溶液等の糖類を含む水溶液等が例示される。当該溶液中のナトリウムイオン、及び／又はカリウムイオン濃度としては、特に限定はないが、例えば、５ｍＭ～２．７Ｍ、好ましくは、５ｍＭ～１Ｍ、より好ましくは２０～８００ｍＭが例示される。特に限定はされないが例えば、３０～４０ｍＭのクエン酸緩衝液の場合、すでに約２００ｍＭのナトリウムイオンが含まれているが、該クエン酸緩衝液にさらに５０～１００ｍＭのナトリウムイオンを加えたものを酸性の溶液として用いてもよい。
　非エンベロープウイルス産生細胞の培養液に添加して培養液を酸性とし得る成分は、該培養液のｐＨを非エンベロープウイルス産生細胞の培養時のｐＨより低いｐＨにする成分であり、かつ、ウイルス産生が達成された非エンベロープウイルス産生細胞から非エンベロープウイルス粒子を含む粗抽出液を取得できる成分であれば限定はない。本発明に使用される培養液を酸性とし得る成分としては、例えば、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、安息香酸、スルホサリチル酸、ギ酸、及びそれらの塩等、ならびに上記の酸性の溶液と同様の溶液が挙げられる。培養液を酸性とし得る成分の添加量としては、ウイルス産生が達成された非エンベロープウイルス産生細胞から非エンベロープウイルス粒子を含む粗抽出液を取得できる量であれば特に限定されず、当業者により適宜決定される。さらに、該培養液を酸性とし得る成分と共に、各種イオン成分を添加してもよく、例えば、上記の酸性の溶液について記載されたのと同様のイオン溶液を使用できる。
　本発明の方法においては、例えば上記のような工程を経て得られた非エンベロープウイルス粒子を含有する試料（以下、「ウイルス粒子の粗抽出液」ともいう）は、非エンベロープウイルス粒子が沈澱しにくい濃度、すなわち第一の濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で処理される。当該第一の濃度のＰＥＧの存在下では、一部の夾雑物が選択的に沈殿する。第一のＰＥＧ濃度は、例えば０．５～４％（以下、％はＷ／Ｖを意味する）の範囲、好ましくは１～３％の範囲が挙げられるが、当然ながら、適宜、例えば本明細書実施例１に記載の方法で、適切なＰＥＧ濃度を決定すればよい。
　本発明においては、前記第一の濃度のＰＥＧ処理で生成した沈殿物を除去した後、得られた上清をさらに第二の濃度のＰＥＧで処理する。第二の濃度は前記第一の濃度よりも高い濃度である。当該第二の濃度のＰＥＧの存在下で非エンベロープウイルス粒子は沈殿するため、この濃度のＰＥＧ存在下で可溶性の夾雑物と分離される。第二の濃度のＰＥＧ溶液は、例えば３～１０％の範囲、好ましくは４～８％の範囲が挙げられるが、当然ながら、適宜、例えば本明細書実施例１記載の方法で、適切なＰＥＧ濃度を決定すればよい。第二の濃度のＰＥＧでの処理により沈殿した非エンベロープウイルス粒子は、ろ過又は遠心分離等の公知の方法によって回収される。本発明の方法は、精製と濃縮を同時に行うことができることから、濃度の低い非エンベロープウイルス粒子を含有する試料において好適に使用することができる。特に限定はされないが、培養上清に漏出した非エンベロープウイルス粒子を回収する場合等が例示される。
　本発明の方法に使用できるＰＥＧには特に限定はなく、種々の平均分子量のものを使用することができる。例えば平均分子量２００～１０，０００のＰＥＧ、好ましくは平均分子量４，０００～１０，０００のＰＥＧが本発明では使用される。さらに好ましくは、平均分子量６，０００～８，０００のＰＥＧが使用できる。非エンベロープウイルス粒子を含有する試料の第一の濃度のＰＥＧ処理、及び第一の濃度のＰＥＧ処理で得られた上清への第二の濃度のＰＥＧ処理は、固体のＰＥＧを前記の試料及び上清に添加して実施することもできるが、好ましくはあらかじめ調製しておいたＰＥＧの溶液を、前記の試料及び上清中でのＰＥＧの終濃度が各々、第一の濃度及び第二の濃度となるように添加することで実施される。第一の濃度のＰＥＧ処理、及び第二の濃度のＰＥＧ処理は、所定の濃度になるようにＰＥＧを添加した前記の試料及び上清を低温、例えば０～１０℃で、例えば１分～４８時間、好適には５分～２４時間、さらに好適には３０分～２時間静置することにより実施される。これらＰＥＧ処理における上清と沈澱の分離はろ過のような公知の固液分離方法で実施すればよい。好適には遠心分離により実施される。
　本発明の非エンベロープウイルスの製造方法には、公知のウイルス精製方法を組み合わせることができる。例えば、前記第一の濃度のＰＥＧで処理する工程の前に、非エンベロープウイルス粒子を含有する試料（ウイルス粒子の粗抽出液）をヌクレアーゼで処理してもよい。当該工程で使うヌクレアーゼは、粗抽出液中のＤＮＡに作用するものが好ましく、例えばベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、メルクミリポア社製）、Ｃｒｙｏｎａｓｅ　Ｃｏｌｄ-ａｃｔｉｖｅ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（タカラバイオ社製）等が例示される。該ヌクレアーゼ処理工程の温度及び時間条件は、使用する酵素の種類に応じて適宜決定すればよく、特に限定はされない。または、第一の濃度のＰＥＧで処理する工程の前に、非エンベロープウイルス粒子を含有する試料（ウイルス粒子の粗抽出液）を酸で処理することにより、夾雑物を沈殿させてもよい。前記の酸は、非エンベロープウイルス粒子を含有する試料のｐＨを下げるものであればよく、特に限定されない。前記の酸の例としては、非エンベロープウイルス粒子を含有する試料の調製のために使用される酸性の溶液または酸性とし得る成分として例示されたのと同様の溶液または成分が挙げられる。非エンベロープウイルス粒子を含有する試料が非エンベロープウイルス産生細胞を酸性の溶液と接触させることにより得られた粗抽出液である場合は、前記非エンベロープウイルス粒子を含有する試料の調製時に使用した酸性の溶液又は酸性とし得る成分と、第一の濃度のＰＥＧで処理する工程の前の非エンベロープウイルス粒子を含有する試料の酸処理工程で使用される酸性の溶液又は酸性とし得る成分は、同じ種類の酸であってもよいし、又は異なる種類の酸であってもよい。該酸処理工程のための処理温度及び処理時間については特に限定はなく、適宜決定すればよい。例えば、温度としては０～１０℃、時間としては１分～４８時間、好適には５分～２４時間、さらに好適には３０分～２時間が挙げられる。特に限定はされないが例えば、３０～４０ｍＭのクエン酸緩衝液で細胞を処理して得られた粗抽出液に、クエン酸の終濃度が５０～２００ｍＭ上昇するようにクエン酸、又はクエン酸緩衝液を添加することにより、粗抽出液中の夾雑物を沈殿させることができる。該酸処理後の「非エンベロープウイルス粒子を含有する試料（ウイルス粒子の粗抽出液）」は、酸性のままで、あるいは中和した後に、次工程に用いられる。
　また本発明の方法にクロロホルム処理を組み合わせることができる。例えば、非エンベロープウイルス粒子を含有する試料をあらかじめクロロホルム処理した後に、第一の濃度のＰＥＧでの処理ならびに第二の濃度のＰＥＧでの処理を実施してもよく、二段階のＰＥＧ処理が終了した後に続けてクロロホルム処理してもよい。前記クロロホルム処理は、組み合わせてもよい。当該クロロホルム処理工程は、常法にしたがって行えばよい。当該クロロホルム処理の一例では、非エンベロープウイルス粒子を含有する溶液にこれと同容量の９９％純度のクロロホルムを添加し、十分に撹拌後遠心分離する。得られた上清（水層）に非エンベロープウイルス粒子が存在し、クロロホルム層或いは界面に夾雑物が存在することになる。
　前記の第一の濃度のＰＥＧで処理する工程の前の非エンベロープウイルス粒子を含有する試料のヌクレアーゼ処理、酸処理、およびクロロホルム処理、ならびに第二の濃度のＰＥＧでの処理後のクロロホルム処理は、いずれか１つを本発明の方法に組み合わせてもよく、またはいずれか２以上の処理を本発明の方法に組み合わせてもよい。前記の第一の濃度のＰＥＧで処理する工程の前の非エンベロープウイルス粒子を含有する試料のヌクレアーゼ処理、酸処理、およびクロロホルム処理のうち２以上を組み合わせる場合は、これらの処理はいずれの順序で行ってもよい。
　上記の、二段階のＰＥＧ処理の工程を経て得られた、非エンベロープウイルス粒子の粗精製物は、引き続き超遠心、クロマトグラフィー、限外ろ過、その他公知の方法による精製に供し、濃縮もしくは精製した非エンベロープウイルス粒子を最終製造物として取得することができる。前記クロマトグラフィーによる非エンベロープウイルス粒子の精製は、イオン交換カラム（例えば、ムスタングＱ（ｐａｌｌ社製））やアフィニティカラム（例えば、ＡＶＢ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ社製）やヘパリンカラム等）、ハイドロキシルアパタイトカラム等によって実施することができる。また、前記の高濃度の酸による処理を行って夾雑物を沈殿させることができる。
　本明細書では、非エンベロープウイルス粒子の取得の程度は評価方法として非エンベロープウイルスの力価等を用いて示される。前記非エンベロープウイルスの力価は、特に限定はないが、一定量の試料中のａ）非エンベロープウイルスのゲノムの個数（ゲノム力価）、ｂ）実験的に測定される非エンベロープウイルスの細胞への感染能力（感染力価）、又はｃ）非エンベロープウイルスを構成するタンパク質の純度を測定する方法のいずれかであり、必要に応じて明示される。
　ゲノム力価の測定方法としては、例えば試料中のウイルスゲノムのコピー数をＰＣＲ法で測定する方法が例示される。
　また、感染力価の測定方法としては、例えば試料の系列希釈液を適当な標的細胞に感染させ、細胞の形状変化（細胞変性）を検出する方法、導入遺伝子の発現を検出する方法、細胞に導入されたウイルスゲノムのコピー数を測定する方法等が例示される。
　非エンベロープウイルスを構成するタンパク質の純度を測定する方法としては、例えば当該タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析する方法あるいは免疫的手法で定量する方法等が例示される。
　さらに、本発明の一の態様として、非エンベロープウイルス粒子を製造するためのキットが提供される。本キットには、非エンベロープウイルス粒子を含有する試料を本発明の非エンベロープウイルス粒子の製造方法における第一のＰＥＧ濃度及び第二のＰＥＧ濃度で処理する操作に適したＰＥＧ、例えば試料に添加して前記の二つの濃度と為し得るＰＥＧ溶液を含有する。さらに、非エンベロープウイルス産生細胞からの粗抽出物の調製に使用される試薬、例えば、酸性の溶液や、非エンベロープウイルスの粒子形成に必須な要素を供給する核酸を含むベクター、非エンベロープウイルスの粒子に封入される核酸を含むベクター等を含むキットとしてもよい。
　本発明により、非エンベロープウイルス粒子の製造方法の他、当該製造方法に使用されるキット、及び当該製造方法で製造した非エンベロープウイルス粒子も提供される。また、本発明の製造方法を用いて取得した非エンベロープウイルス粒子を有効成分とする医薬組成物も提供される。当該医薬組成物は、遺伝子治療用のウイルス製剤の製造技術に従って適宜調製することができる。例えば、本発明の製造方法により得られた非エンベロープウイルス粒子を公知の方法で更に濃縮、精製、加工して得られた非エンベロープウイルス粒子を医薬組成物とすることができる。当該医薬組成物は、患者由来の細胞に体外で使用するか、もしくは患者へ直接投与することもできる。
　以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１　ＰＥＧ沈殿濃度の検討
（１）ｒＡＡＶ粒子製造用細胞の播種
　ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）Ｔ２２５フラスコ（コーニング社製）に、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＤＭＥＭ（シグマ社製）に懸濁した２９３Ｔ／１７細胞を播種した。その後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで３日間培養し、細胞がおよそ７０％コンフルエントになっていることを確認した。
（２）ｒＡＡＶ粒子製造用プラスミドのトランスフェクション
　実施例１－（１）で得られた細胞に、リン酸カルシウム法を用いて、２型ＡＡＶ（以下、ＡＡＶ２）のＲｅｐタンパク質、及びＣａｐタンパク質をコードする配列を含むｐＲＣプラスミド（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ社製）、アデノウイルスのＥ２Ａ、ＶＡ、Ｖ４をコードする配列を含むｐＨＬＰプラスミド（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ社製）、ＡＡＶ２ゲノムの２つのＩＴＲの間に蛍光タンパク質ＡｓＲｅｄ２の発現カセットとして「ＣＭＶプロモーター配列、ＡｓＲｅｄ２をコードする配列、ＰｏｌｙＡ配列」を含むｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２プラスミド（例えば、国際公開第２０１４／００７１２０号パンフレット記載のプラスミド）をそれぞれ２５μｇずつトランスフェクションした。トランスフェクション６時間後、培地を完全に除去し、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭをフラスコ１枚当たり４０ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２日間培養した。
（３）クエン酸バッファー処理による粗抽出液の取得
　実施例１－（２）で得られた各フラスコに、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（和光純薬社製）０．５ｍＬを添加し、室温で数分間インキュベートすることで細胞を剥離させた。その後、溶液ごと細胞を回収し、１，７５０×ｇ、４℃、１０分間遠心後、上清を除去した。細胞ペレットを２ｍＬの３８．１ｍＭ　クエン酸バッファー（３８．１ｍＭ　クエン酸、７４．８ｍＭ　クエン酸ナトリウム、７５ｍＭ　塩化ナトリウム）で再懸濁し、１５秒間ボルテックスミキサーで混和を行い、３７℃ウォーターバスで５分間静置、再び１５秒間ボルテックスミキサーで混和を行った。その後、１４，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心を行い、上清を回収した。得られた上清に１／１０量の２Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を添加した溶液を粗抽出液とした。
（４）ＰＥＧ沈殿
　実施例１－（３）で得られた粗抽出液に、１／１００量の１Ｍ　ＭｇＣｌ２を添加後、３７℃で１時間ベンゾナーゼ（メルクミリポア社製）処理（終濃度２５０Ｕ／ｍＬ）を行った。ベンゾナーゼ処理後の粗抽出液に６０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－８０００（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）溶液をそれぞれＰＥＧの終濃度が８％、６％、４％、２％、１％になるように添加し、混合後、氷上にて３０分間静置した。その後、１，５００×ｇ、４℃、３０分間遠心を行い、上清を除去し、ペレットを回収した。ペレットを２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含む溶液に懸濁し、４℃で終夜静置した溶液をＰＥＧ沈殿液とした。
（５）ゲノム力価測定
　実施例１－（３）で得られた粗抽出液、及び実施例１－（４）で得られたＰＥＧ沈殿液２μＬを、説明書に記載の方法で調製したＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）反応液１８μＬに添加して混合後、酵素反応を行い遊離のゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡを除去した。その後、ＤＮａｓｅＩを不活化するために９９℃、１０分間の熱処理を行って、ＤＮａｓｅＩ処理済みのｒＡＡＶ粒子含有溶液を得た。ＤＮａｓｅＩ処理済みのｒＡＡＶ粒子含有溶液２０μＬに、注射用水（大塚製薬社製）１５μＬ、１０ｘＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫバッファー（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ７．８）、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ、５％　ＳＤＳ）４μＬ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（タカラバイオ社製）１μＬを添加し、５５℃で１時間処理した。その後、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを不活化するために９５℃、１０分間の熱処理を行った後、４℃あるいは－２０℃にて保存した。この溶液を注射用水で５０倍希釈して得られた希釈液の２μＬをｒＡＡＶ粒子のゲノム力価測定に使用した。ゲノム力価測定にはＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑＩＩ（タカラバイオ社製）を使用し、反応液の調製等の操作はキット添付の説明書に従った。標準品としては、ｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２プラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩ（タカラバイオ社製）で消化し、線状化したＤＮＡを用いた。なお、リアルタイムＰＣＲに用いたプライマー配列は、ＡｓＲｅｄ２発現カセットに搭載されたＣＭＶプロモーター配列にアニーリングする配列とした。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１より、粗抽出液、８％ＰＥＧ沈殿、６％ＰＥＧ沈殿、４％ＰＥＧ沈殿のゲノム力価はほぼ同じだった。一方、２％ＰＥＧ沈殿、及び１％ＰＥＧ沈殿のゲノム力価は、それらに比べて著しく低かった。このことは、２％ＰＥＧ、及び１％ＰＥＧではｒＡＡＶベクターはあまり沈殿しないことを示す。
（６）タンパク質純度測定
　実施例１－（３）で得られた粗抽出液、及び実施例１－（４）で得られたＰＥＧ沈殿液１０μＬに２×サンプルバッファー（タカラバイオ社製）を１０μＬ加えて混合し、９５℃、１０分間処理を行った。各処理液１０μＬを４－２０％ポリアクリルアミドゲル（アトー社製）にアプライし電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルを適当量のＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステイン溶液（バイオラッド社製）に浸し、遮光して９０分間振とうした。振とう後のゲルをＬｕｍｉｎｏｓｈｏｔ４００（タカラバイオ社製）にて撮影した。その結果を図１に示す。図１中、レーン１：粗抽出液、レーン２：８％ＰＥＧ沈殿、レーン３：６％ＰＥＧ沈殿、レーン４：４％ＰＥＧ沈殿、レーン５：２％ＰＥＧ沈殿、レーン６：１％ＰＥＧ沈殿、である。
　図１より、６％ＰＥＧ沈殿、４％ＰＥＧ沈殿、２％ＰＥＧ沈殿はほぼ同じ電気泳動パターンだった。このことは、６％ＰＥＧ沈殿条件、４％ＰＥＧ沈殿条件、２％ＰＥＧ沈殿条件で、ほぼ同じ夾雑物が沈殿することを示す。表１の通り、２％ＰＥＧではｒＡＡＶ粒子はあまり沈殿しないことと合わせると、２％ＰＥＧの濃度付近で、ｒＡＡＶ粒子をあまり沈殿させることなく、夾雑物のみを沈殿、除去できることを示す。
実施例２　ＰＥＧ沈殿操作による夾雑物の除去
（１）クエン酸バッファー処理による粗抽出液の取得
　実施例１－（１）～（３）と同様の方法で粗抽出液を取得した。この粗抽出液に１／１００量の１Ｍ　ＭｇＣｌ２を添加後、３７℃で１時間ベンゾナーゼ処理を行った。
（２）ＰＥＧ沈殿、洗浄、及び１００Ｋ　ＵＦによる濃縮
　実施例２－（１）で得たベンゾナーゼ処理粗抽出液に下記Ａ～Ｆいずれかの処理を実施し、サンプルを調製した。
　Ａ：ベンゾナーゼ処理粗抽出液にＰＥＧの終濃度が８％となるように６０％ＰＥＧ－８０００溶液を加えて混合し、氷上にて３０分間静置し、その後に１，５００×ｇ、４℃、３０分間遠心を行ってペレットを回収した。回収したペレットをＰＢＳ（ギブコ社製）に懸濁し、４℃で終夜静置してペレットを溶解し、サンプルＡとした。
　Ｂ：上記Ａと同じ操作で得たペレットを８％ＰＥＧ－８０００溶液でリンスした後にＰＢＳ（ギブコ社製）に懸濁した。懸濁液を４℃で終夜静置してペレットを溶解し、サンプルＢとした。
　Ｃ：上記Ｂと同じ操作でサンプルＢと同じものを調製した後、さらに１００Ｋ限外ろ過遠心ユニット（１００Ｋ　ＵＦ）（ミリポア社製）により濃縮し、サンプルＣとした。
　Ｄ：ベンゾナーゼ処理粗抽出液にＰＥＧの終濃度が２％となるように６０％ＰＥＧ－８０００溶液を加えて混合し、氷上にて３０分間静置し、その後に１，５００×ｇ、４℃、３０分間遠心を行って上清を回収した。次いで、回収した上清に終濃度が８％となるように６０％ＰＥＧ－８０００溶液を加えて混合し、氷上にて３０分間静置し、その後に１，５００×ｇ、４℃、３０分間遠心を行ってペレットを回収した。回収したペレットをＰＢＳ（ギブコ社製）に懸濁し、４℃で終夜静置してペレットを溶解し、サンプルＤとした。
　Ｅ：上記Ｄと同じ操作で得たペレットを８％ＰＥＧ－８０００溶液でリンスした後にＰＢＳ（ギブコ社製）に懸濁した。懸濁液を４℃で終夜静置してペレットを溶解し、サンプルＥとした。
　Ｆ：上記Ｅと同じ操作でサンプルＥと同じものを調製した後、さらに１００Ｋ限外ろ過遠心ユニット（１００Ｋ　ＵＦ）により濃縮し、サンプルＦとした。
（３）ゲノム力価測定
　実施例２－（２）で得られたサンプルＡ～Ｆの総ゲノム力価を、実施例１－（５）と同様の方法で測定した。その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２より、２％ＰＥＧ沈殿除去を行ったサンプル（Ｄ、Ｅ）の総ゲノム力価は、２％ＰＥＧ沈殿除去を行わなかったサンプル（Ａ、Ｂ）の総ゲノム力価の約半分であった。このことは、２％ＰＥＧ沈殿除去操作の回収率は約５０％であることを示す。
（４）タンパク質純度測定
　実施例２－（２）で得られたサンプルのタンパク質純度を、実施例１－（６）と同様の方法で測定した。その結果を図２に示す。図２中、レーン１～７は、ベンゾナーゼ処理粗抽出液、Ａ～Ｆの順である。
　図２より、２％ＰＥＧ沈殿除去を行ったサンプル（Ｄ、Ｅ）は、２％ＰＥＧ沈殿除去を行わなかったサンプル（Ａ、Ｂ）よりも、バンドが少なかった。このことは、２％ＰＥＧ沈殿操作後の上清を用いることで、通常の８％ＰＥＧ沈殿よりも高純度のｒＡＡＶ粒子を精製できることを示す。
実施例３　ＰＥＧ沈殿操作、及びクロロホルム処理の組合せによる夾雑物の除去
（１）クエン酸バッファー処理による粗抽出液の取得
　実施例１－（１）～（３）と同様の方法で粗抽出液を取得した。この粗抽出液に１／１００量の１Ｍ　ＭｇＣｌ２を添加後、３７℃で１時間ベンゾナーゼ処理を行った。
（２）ＰＥＧ沈殿、及びクロロホルム処理
　実施例３－（１）で得たベンゾナーゼ処理粗抽出液に下記Ｇ～Ｊいずれかの処理を実施し、サンプルを調製した。
　Ｇ：ベンゾナーゼ処理粗抽出液に等量の９９％純度のクロロホルムを添加し、１０秒間ボルテックスミキサーで混和した後に１４，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心を行い、上清を回収した（これらの操作を「クロロホルム処理」とする）。この上清にＰＥＧの終濃度が１％となるように６０％ＰＥＧ－８０００溶液を加えて混合し、氷上にて３０分間静置し、その後に１，５００×ｇ、４℃、３０分間遠心を行って上清を回収した。次いで、回収した上清に終濃度が５％となるように６０％ＰＥＧ－８０００溶液を加えて混合し、氷上にて３０分間静置し、その後に１，５００×ｇ、４℃、３０分間遠心を行ってペレットを回収した。回収したペレットをＰＢＳ（ギブコ社製）に懸濁し、４℃で終夜静置してペレットを溶解し、サンプルＧとした。
　Ｈ：上記Ｇと同じ操作でサンプルＧと同じものを調製した後、さらにこれにクロロホルム処理を施して得た上清をサンプルＨとした。
　Ｉ：ベンゾナーゼ処理粗抽出液にＰＥＧの終濃度が１％となるように６０％ＰＥＧ－８０００溶液を加えて混合し、氷上にて３０分間静置し、その後に１，５００×ｇ、４℃、３０分間遠心を行って上清を回収した。次いで、回収した上清に終濃度が５％となるように６０％ＰＥＧ－８０００溶液を加えて混合し、氷上にて３０分間静置し、その後に１，５００×ｇ、４℃、３０分間遠心を行ってペレットを回収した。回収したペレットをＰＢＳ（ギブコ社製）に懸濁し、４℃で終夜静置してペレットを溶解し、サンプルＩとした。
　Ｊ：上記Ｉと同じ操作でサンプルＩと同じものを調製し、これにクロロホルム処理を施して得た上清をサンプルＪとした。
（３）ゲノム力価測定
　実施例３－（２）で得られたサンプルのゲノム力価を、実施例１－（５）と同様の方法で測定した。その結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３より、クロロホルム処理ありのサンプルとクロロホルム処理なしのサンプルのゲノム力価はほぼ同じだった。このことは、ＰＥＧ沈殿とクロロホルム処理を組み合わせたとき、クロロホルム処理でｒＡＡＶ粒子の力価があまり損なわれないことを示す。
（４）タンパク質純度測定
　実施例３－（２）で得られたサンプルのタンパク質純度を、実施例１－（６）と同様の方法で測定した。その結果を図３に示す。図３中、レーン１：Ｇ、レーン２：Ｈ、レーン３：Ｉ、レーン４：Ｊ、である。
　図３より、クロロホルム処理ありのサンプルは、クロロホルム処理なしのサンプルよりもバンドが少なかった。このことは、ＰＥＧ沈殿とクロロホルム処理を組み合わせたとき、クロロホルム処理で夾雑物を除去できることを示す。表３の結果と合わせると、ＰＥＧ沈殿とクロロホルム処理を組み合わせることで、高力価で高純度のｒＡＡＶ粒子を精製できることを示す。
実施例４　クエン酸添加、及びＰＥＧ沈殿操作による夾雑物の除去
（１）クエン酸バッファー処理による粗抽出液の取得
　実施例１－（１）～（３）と同様の方法で粗抽出液を取得した。
（２）クエン酸沈殿
　実施例４－（１）で得られた粗抽出液に、１／２０量の２Ｍクエン酸溶液を加えてよく混合し、４℃で９０分間静置した。静置後、２，３８０×ｇ、４℃、２０分間遠心を行い、上清をクエン酸処理上清として回収した。
（３）ＰＥＧ沈殿
　実施例４－（２）で得られたクエン酸処理上清に、１／４量の２Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ９．０）、及び１／１００量の１Ｍ　ＭｇＣｌ２を添加後、添付の説明書の指示に従い３７℃で１時間ベンゾナーゼ処理を行った。その後、４０％ＰＥＧ－６，０００（ナカライテスク社製）溶液をＰＥＧの終濃度が１％になるように添加し、混合後、氷上にて３０分間静置した。その後、２，３８０×ｇ、４℃、３０分間遠心を行い、上清を回収した。上清に、４０％ＰＥＧ－６，０００溶液をＰＥＧの終濃度が８％となるように添加し、混合後、氷上にて６０分間静置した。その後、２，３８０×ｇ、４℃、３０分間遠心を行い、ペレットを回収した。ペレットを１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）を含む溶液に懸濁し、４℃で終夜静置した。その後、２，３８０×ｇ、４℃、１０分間遠心を行い、上清１を回収した。残ったペレットをＨＮＥバッファー（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ）で再懸濁し、すぐに２，３８０×ｇ、４℃、１０分間遠心を行い、上清２を回収した。
（４）ゲノム力価測定
　実施例４－（２）、及び実施例４－（３）で得られたサンプルのゲノム力価を、実施例１－（５）と同様の方法で測定した。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４より、ＰＥＧ沈殿操作前のゲノム力価とＰＥＧ沈殿操作後のゲノム力価はあまり変化していなかった。
（５）タンパク質純度測定
　実施例４－（２）、実施例４－（３）で得られたサンプルのタンパク質純度を、実施例１－（６）と同様の方法で測定した。なお、比較対照として、超遠心精製されたｒＡＡＶ粒子を用いた。その結果を図４に示す。図４中、レーン１：粗抽出液、レーン２：クエン酸処理上清、レーン３：１％ＰＥＧ沈殿後上清、レーン４：８％ＰＥＧ沈殿（上清１）、レーン５：８％ＰＥＧ沈殿（上清２）、レーンＰ：超遠心精製ｒＡＡＶ粒子（比較対照）、である。
　図４より、上清１は、粗抽出液やクエン酸沈殿液よりもバンドが少なかった。表４の結果と合わせると、クエン酸沈殿とＰＥＧ沈殿を組み合わせることで、高力価で高純度のｒＡＡＶ粒子を精製できることを示す。
実施例５　二段階のＰＥＧ沈殿操作による昆虫細胞培養上清の夾雑物除去
（１）ｒＡＡＶ粒子製造用昆虫細胞の培養
　ＣＥＬＬＢＡＧ（登録商標）（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にＰＳＦＭ－Ｊ１培地（Ｗａｋｏ社製）に懸濁した２ＬのＳｆ９細胞を播種した。その後ＷＡＶＥ２５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、細胞の密度がおよそ２×１０＾６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるまで２８℃で振盪培養した。
（２）ｒＡＡＶ粒子製造用バキュロウイルスベクターの感染
　実施例５－（１）で得られた細胞に、「ＡＡＶ２の２つのＩＴＲ領域間に目的遺伝子の発現カセットを含むベクターゲノム配列を含むゲノムを保持するバキュロウイルスベクター」と「ＡＡＶ２のＲｅｐタンパク質及びＡＡＶ８のＣａｐタンパク質をコードする配列を含むゲノムを保持するバキュロウイルスベクター」をＭＯＩ＝０．３で共感染させ、７日間培養した。
（３）昆虫細胞培養上清の取得
　実施例５－（２）で得られた培養液から一部を分取し、１，７５０×ｇ、４℃、１０分間遠心後、上清を回収した。ここで得た上清を昆虫細胞培養上清とした。
（４）ＰＥＧ沈殿
　実施例５－（３）で得られた昆虫細胞培養上清を７ｍＬずつ２本のチューブに分けた。片方のチューブには、ＰＥＧの終濃度が８％となるように４０％ＰＥＧ－６，０００溶液を加えて混合し、氷上にて３０分間静置し、その後に１，５００×ｇ、４℃、３０分間遠心を行ってペレットを回収した。回収したペレットを１４０μＬのＤＰＢＳに懸濁し、４℃で終夜静置してペレットを溶解し、サンプル（８％ＰＥＧ沈殿）とした。もう片方のチューブには、ＰＥＧの終濃度が２％となるように４０％ＰＥＧ－６０００溶液（ＤＰＢＳに溶解）を加えて混合し、氷上にて３０分間静置し、その後に１，５００×ｇ、４℃、３０分間遠心を行って上清を回収した。次いで、回収した上清に、ＰＥＧの終濃度が８％となるように４０％ＰＥＧ－６０００溶液を加えて混合し、氷上にて３０分間静置し、その後に１，５００×ｇ、４℃、３０分間遠心を行ってペレットを回収した。回収したペレットを１４０μＬのＤＰＢＳに懸濁し、４℃で終夜静置してペレットを完全に溶解し、サンプル（２～８％ＰＥＧ沈殿）とした。
（５）ゲノム力価測定
　実施例５－（４）で得られたサンプルのゲノム力価を、実施例１－（５）と同様の方法で測定した。その結果、８％ＰＥＧ沈殿と２～８％ＰＥＧ沈殿のゲノム力価はほぼ同じだった。
　（６）タンパク質純度測定
　実施例５－（４）で得られたサンプルのタンパク質純度を、実施例１－（６）と同様の方法で測定した。その結果を図５に示す。図５中、レーン１：８％ＰＥＧ沈殿、レーン２：２～８％ＰＥＧ沈殿、Ｍ：分子量マーカーである。
　図５より、２～８％ＰＥＧ沈殿（レーン２）は８％ＰＥＧ沈殿（レーン１）よりもバンドが少なかった。このことは、ＰＥＧ沈殿で昆虫細胞培養上清の夾雑物を除去できることを示す。また、実施例５－（５）の結果と合わせると、ＰＥＧ沈殿で、ｒＡＡＶ粒子を精製できることを示す。
　本発明の非エンベロープウイルスの製造方法により、煩雑な操作なく高純度の非エンベロープウイルス粒子を得ることができる。本発明の製造方法で調製された非エンベロープウイルス粒子や当該粒子を有効成分とする組成物は、遺伝子治療の基礎研究、又は臨床応用の分野における遺伝子導入方法として非常に有用である。

Claims (10)

  1. 　非エンベロープウイルス粒子の製造方法であって、
    （ａ）非エンベロープウイルス粒子を含有する試料を第一の濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で処理する工程、
    （ｂ）前記（ａ）工程で生成した沈殿物を除去し、得られた上清を第二の濃度のＰＥＧで処理する工程、及び
    （ｃ）前記（ｂ）工程で生成した沈殿物から非エンベロープウイルス粒子を取得する工程、
    を含む、方法。
  2. 　第一のＰＥＧ濃度が、０．５～４％である請求項１に記載の方法。
  3. 　第二のＰＥＧ濃度が、３～１０％である請求項１または２に記載の方法。
  4. 　非エンベロープウイルス粒子を含有する試料が、非エンベロープウイルス産生細胞を酸性の溶液に接触させて得られる粗抽出液である請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　非エンベロープウイルス粒子を含有する試料が、ヌクレアーゼ処理を施された試料である請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　非エンベロープウイルス粒子を含有する試料が、クロロホルム処理を施された試料である請求項１～５いずれか１項に記載の方法。
  7. 　非エンベロープウイルス粒子を含有する試料が、非エンベロープウイルス産生細胞を酸性の溶液に接触させて得られる粗抽出液をさらに酸で処理した試料である請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　（ｃ）工程の後にクロロホルム処理を行う工程を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　非エンベロープウイルスがアデノ随伴ウイルスである請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　酸性の溶液がカチオン、及びクエン酸を含むことを特徴とする請求項４～９のいずれか１項に記載の方法。
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