JP6611381B2 - 薬剤送達粒子及びその製造方法 - Google Patents
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Description
む薬物組成物に関する。
術が開発されている。ウイルスの感染能や複製能を利用したウイルスベクターも、その一
つであり、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等に由来する種々のベ
クターが知られている。中でも、アデノ随伴ウイルスベクターは、近年、遺伝子治療にお
いて有用な遺伝子導入担体として期待されている。
表記する。)は、パルボウイルスに属する非病原性のウイルスであって、自己複製能を欠
損しているため自律的増殖ができず、増殖にはアデノウイルスやヘルペスウイルスの共感
染を必要とするため感染性が低い。また宿主において免疫原性が低い性質も有する。その
ような特徴から遺伝子導入の担体として、安全性が高いという利点を有している。加えて
、宿主域が広いことから種々の細胞に感染可能であり、また1〜9型の各血清型AAVに由来
するベクターも開発されていることから(非特許文献1)、それぞれの血清型における感
染標的細胞の特異性を応用して、神経細胞、筋細胞、肝細胞等、特定の細胞、組織及び器
官での遺伝子発現が可能となっている。
n vivoでの遺伝子発現の一過性、野生型ウイルス混入の可能性、遺伝子発現とその作用の
発現に時間を要する、大きな遺伝子を組込むことが出来ない、副反応が出現した場合に発
現を制御する機構が必要等の様々な問題点があった。
プシドを発現させ、これを薬剤の送達担体として利用することを提唱した(非特許文献2
)。カプシド内部にウイルスゲノムを含まない空のカプシド、すなわち中空カプシドは、
標的細胞の特異的認識、吸着、侵入、脱穀等のウイルスの初期感染活性は有するが、ウイ
ルス由来の遺伝子を全く有さないためウイルスの増殖活性はない。したがって、中空カプ
シドは、薬剤の標的細胞特異的送達性と投与個体に対する安全性を兼ね備えた理想的な薬
剤送達系(DDS;Drug Delivery System)の担体となり得る。それ故、中空カプシドをDDS
の担体として利用するには、カプシド内部に目的の薬剤を導入する技術が非常に重要とな
ってくる。
に取り込ませた後に再構成させる導入方法を提示している(非特許文献2)。しかし、尿
素等の変性剤をカプシドに作用させると、カプシドが有する初期感染活性までもが失われ
てしまい、送達担体として機能し得なくなるという問題があった。結局のところ、カプシ
ドの初期感染活性を保持したままで送達物質としての薬剤を中空カプシドに導入する技術
は、提唱から7年以上経過した現在もなお確立されていない。例えば、特許文献1ではAAV
中空粒子の送達担体としての有用性は示唆しているが、中空カプシドを送達担体として利
用した具体的な実例に関しては、何も記載されていない。それ故、当業者間では、Samuls
kiの提唱する技術は、実現不可能な技術と認識されていた。
持した状態で、核酸、ペプチド及び/又は低分子化合物を導入する方法を開発し、それを
提供することを目的とする。
達することのできる薬剤送達粒子の提供を目的とする。
効率を高める方法、及びウイルス中空粒子の精製方法の開発と、その提供を目的とする。
性を維持したまま中空カプシド内部に任意の核酸、ペプチド及び/又は低分子を導入する
ことに成功した。また、この薬剤を包含したカプシドと宿主細胞を混合することにより、
カプシドに内包された薬剤を該細胞内に効果的に導入できることも確認した。さらに、宿
主細胞内での中空カプシドの生産量を増加する方法及び中空カプシドの精製方法を開発し
た。本発明は、これらの知見と結果に基づくものであり、以下を提供するものである。
)0.1〜20%の界面活性剤を含む溶液中で中空カプシド又は中空粒子と薬剤を混合する工
程、及び(b)前記混合工程後の混合液を−5〜50℃で保持して、薬剤を中空カプシド又
は中空粒子内に導入する工程を含む前記製造方法。
又は(2)に記載の製造方法。
、Tween-80、オクチル-β-グルコシド、OTG、SDS、CHAPS、CHAPSO、及びPEGとPPGのコポ
リマーからなる群から選択される一以上の界面活性剤である、(1)〜(3)のいずれか
に記載の製造方法。
に記載の製造方法。
ーからなる群から選択される一以上の核酸である、(1)〜(5)のいずれかに記載の製
造方法。
プター、リボザイム、モレキュラー・ビーコン及びリボスイッチからなる群から選択され
る一以上の核酸である、(6)に記載の製造方法。
)に記載の製造方法。
製造方法。
〜(9)のいずれかに記載の製造方法。
10)のいずれかに記載の製造方法。
該カプシド又は被膜粒子が由来するウイルス自身の遺伝子を含まない外因性の核酸、ペプ
チド及び/又は低分子化合物である前記薬剤送達粒子。
片を含むベクターからなる群から選択される一以上の核酸である、(12)に記載の薬剤
送達粒子。
ダプター、リボザイム、モレキュラー・ビーコン及びリボスイッチからなる群から選択さ
れる一以上の核酸である、(13)に記載の薬剤送達粒子。
13)に記載の薬剤送達粒子。
の薬剤送達粒子。
6)のいずれに記載の薬剤送達粒子。
(17)のいずれかに記載の薬剤送達粒子。
は(12)〜(18)のいずれかに記載の薬剤送達粒子の少なくとも一つを有効成分とし
て含む薬物組成物。
び/又は該宿主細胞の抽出液を加熱する工程を含む中空カプシド若しくは被覆粒子又はウ
イルス粒子の精製方法であって、加熱温度が45℃以上55℃よりも低い場合には加熱時間が
10分〜90分であり、又は加熱温度が55℃以上60℃以下の場合には加熱時間が3分〜30分で
ある前記精製方法。
ノウイルス由来のE1A遺伝子領域、E1B19k遺伝子、E2A遺伝子領域、E4orf6遺伝子及びVA R
NAをコードする遺伝子を導入する工程を含む前記製造方法。
(22)に記載の製造方法。
する細胞株を選択する工程、をさらに含む、(22)又は(23)に記載の製造方法。
または図面に記載される内容を包含する。
及び/又は低分子化合物を薬剤として包含することができる。また、本発明の薬剤送達粒
子によれば、薬剤を標的細胞特異的に送達することができる。
率的に目的の薬剤を中空カプシド又は中空粒子内に導入することができる。それによって
安全性が高く、かつ標的細胞特異性を有する薬剤送達粒子を提供することができる。
、品種改良用薬剤、又は標識用薬剤等を送達することができる。
。
率的に不純物を除去することができる。
1−1.概要
本発明の第1の実施形態は、薬剤送達粒子である。本発明の薬剤送達粒子は、薬剤とカ
プシド又は被膜粒子を構成因子として含み、内包する薬剤の宿主細胞内導入能を有する。
本発明の「薬剤送達粒子」は、カプシド(1)又は被膜粒子(2)とそれに包含される
薬剤(3)を構成因子として含む。以下、それぞれについて説明をする。
「カプシド(capsid)」は、ウイルス粒子(virion)において、ウイルス核酸又はコア
を取り囲む複数の単位タンパク質(カプソメア:capsomere)からなる外皮(coat)又は
殻(shell)である。本明細書では、単に「カプシド」と標記した場合には当該構造体を
意味する。また、カプシドにおいて、その内部にウイルス核酸、コア又は他の物質を何も
含まないカプシドタンパク質のみから構成されたものを、本明細書では「中空カプシド(
empty capsid)」と呼ぶ。これに対して、その内部にウイルス核酸やコアを含むものを、
「ヌクレオカプシド(nucleocapsid)」と呼ぶ。
ればよい。例えば、適用する生物種を、動物とする場合には動物ウイルス由来のカプシド
を、植物とする場合には植物ウイルス由来のカプシドを、そして細菌とする場合にはバク
テリオファージ由来のカプシドを、それぞれ用いればよい。好ましくは、動物ウイルス由
来又は植物ウイルス由来のカプシドである。
群を問わない。具体的には、例えば、RNAウイルスであれば、レトロウイルス科、ピコル
ナウイス科、カリシウイルス科、アストロウイスル科、フラビウイスル科、トガウイルス
科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、
オルソミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科又はビ
ルナウイルス科に属するいずれのウイルス由来のカプシドであってもよい。また、DNAウ
イルスであれば、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、イリド
ウイルス科、ヘパドナウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、又はパポバウ
イルス科に属するいずれのウイルス由来のカプシドであってもよい。RNAウイルス群のレ
トロウイルス科に属するウイルスや、DNAウイルス群のアデノウイルス科、パルボウイル
ス科又はヘルペスウイルス科に属するウイルスは、前記カプシドの由来ウイルスとして好
適に使用できる。レトロウイルス科のオンコウイルス、レンチウイルス若しくはスプーマ
ウイルス、アデノウイルス科のアデノウイルス、又はパルボウイルス科のAAVは、前記カ
プシドの由来ウイルスとして特に好適に使用できる。
ス群を問わない。具体的には、例えば、RNAウイルスであれば、テヌイウイルス属、トバ
モウイルス群、ポティウイルス科、ダイアンソウイルス群、ブロモウイルス群、ククモウ
イルス群、ラブドウイルス科、レオウイルス科又はクリプティックウイルス群に属するい
ずれのウイルス由来のカプシドであってもよい。また、DNAウイルスであれば、カリモウ
イルス属、バドナウイルス属又はジェミニウイルス属のいずれのウイルス由来のカプシド
であってもよい。
含んでいてもよい。ここでいう「変異」とは、カプソメアを構成するアミノ酸配列におい
て、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されていることをいう。アミノ酸置
換の場合、類似アミノ酸間での置換が好ましい。「類似アミノ酸」とは、アミノ酸を電荷
、側鎖、極性、芳香族性等の性質に基づいて分類した場合に、同一の集団に属するアミノ
酸をいう。このような集団には、例えば、塩基性アミノ酸群(アルギニン、リジン、ヒス
チジン)、酸性アミノ酸群(アスパラギン酸、グルタミン酸)、非極性アミノ酸群(グリ
シン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチ
オニン、トリプトファン)、極性無電荷アミノ酸群(セリン、スレオニン、アスパラギン
、グルタミン、チロシン、システイン)、分枝鎖アミノ酸群(ロイシン、イソロイシン、
バリン)、芳香族アミノ酸群(フェニルアラニン、チロシン)、異節環状アミノ酸群(ヒ
スチジン、トリプトファン、プロリン)、脂肪族アミノ酸群(グリシン、アラニン、ロイ
シン、イソロイシン、バリン)が挙げられる。
達担体として機能する。カプシドは、大別すると正20面体型とらせん型が知られているが
、本発明の薬剤送達粒子のカプシドは、薬剤を包含できる限り、いずれの形態であっても
よい。
る場合、当該カプシドは、それ自身がウイルスの本来的に有する初期感染活性を有する。
の細胞表面に吸着(adsorption)し、宿主細胞内で増殖された後、細胞外に放出(releas
e;エンベロープを有さない裸のカプシドの場合)又は出芽(budding;エンベロープを有
するカプシド、すなわち後述する被膜粒子の場合)されるまでの一連の過程をいう。「初
期感染」とは、宿主細胞へのウイルス粒子の侵入段階をいう。具体的には、ウイルスの宿
主細胞表面への吸着、宿主細胞内への侵入(penetration)及び宿主細胞内でのカプシド
の破壊による脱穀(uncoating)までを指す。それに対して「後期感染」とは、ウイルス
感染における増殖段階であって、具体的には、例えば、宿主細胞内に遊離したウイルス遺
伝子の転写又はウイルス遺伝子の逆転写とプロウイルスとしての宿主染色体への組み込み
を介した後の転写、ウイルスタンパク質の翻訳、ウイルス核酸の複製、カプソマーによる
カプシドの構築とウイルス核酸のカプシド内へのパッケージング、及び娘ウイルス粒子の
宿主細胞からの放出又は出芽までを指す。
ターを標的分子として認識し、それに吸着することによって達成される。故に、カプシド
の宿主細胞の特異性は、宿主細胞上のレセプターの有無によって決定される。例えば、CD
4をレセプターとするヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、CD4を細胞表面に有するヘルパーT
細胞を標的細胞とする。したがって、本発明の薬剤送達粒子に対して、標的細胞の特異性
を付与するためには、標的細胞が有するレセプターを認識し、吸着し得るウイルスのカプ
シドを用いればよい。前述の例で言えば、本発明の薬剤送達粒子の標的細胞をヘルパーT
細胞に特定したい場合には、ヘルパーT細胞の細胞表面に存在するレセプターCD4タンパク
質を認識し、吸着するHIVのカプシドを薬剤送達粒子の構成因子とすればよい。つまり、
本発明の薬剤送達粒子は、中空カプシド又は後述する中空粒子が本来的に有する標的細胞
特異的な送達活性を利用して、その内部に包含する目的の薬剤を該標的細胞内に送達する
ことを特徴とする。
飾を含む。「機能上の修飾」とは、カプシドとその標的細胞間の特異的な結合活性を増強
又は安定化する上で有用な修飾をいう。例えば、グリコシル化、脱グリコシル化、PEG化
が挙げられる。「標識上の修飾」とは、薬剤送達粒子又はその標的細胞をin vivoで検出
する上で有用な修飾をいう。例えば、蛍光色素(フルオレセイン、FITC、ローダミン、テ
キサスレッド、Cy3、Cy5、Alexa Fluor(登録商標))、蛍光タンパク質(例えば、PE、APC
、GFP、Venus、YFP、DsRed、Sirius)、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ)、放射性同位元素(例えば、3H、14
C、35S)又はビオチン若しくは(ストレプト)アビジンによる標識が挙げられる。カプシ
ドの修飾は、タンパク質への修飾が可能で、かつカプシドの有するウイルスの初期感染活
性に影響を与えない方法であれば、特に限定はしない。また、市販の修飾キットを用いて
もよい。例えば、Alexa Fluor 568 Protein Labeling Kit (A10238)(Molecular Probes
社)が挙げられる。
本明細書において「被膜粒子」とは、エンベロープを纏ったカプシドをいう。また、本
明細書では、被膜粒子において、エンベロープを纏った中空カプシドを「中空粒子」と呼
ぶ。以降、本明細書において、カプシド及び被膜粒子をまとめて「カプシド等」とし、中
空カプシド及び中空粒子をまとめて「中空カプシド等」とする。
ルスが有する。脂質二重膜で構成され、所々にスパイク又はエンベロープタンパク質と呼
ばれるウイルス由来の糖タンパク質が埋め込まれている。エンベロープの脂質二重膜は、
ウイルスが宿主細胞から出芽する際に宿主細胞の細胞質膜又は核膜の一部を纏ったもので
あり、宿主細胞に由来する。
由来ウイルス種に応じて追加される選択的な構成因子である。すなわち、本発明の薬剤送
達粒子に用いるカプシドの由来ウイルスがエンベロープを本来的に有する種である場合に
は、原則として必須の構成因子となる。エンベロープを本来的に有するウイルス種では、
通常、エンベロープが宿主細胞への初期感染活性における吸着及び侵入の機能を担ってい
るためである。そのようなウイルス種の具体例として、例えば、オルソミクソウイルス科
のインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス科の単純ヘルペスウイルス、及びレトロウ
イルス科のHIVが挙げられる。一方、アデノウイルスやAAVのようにエンベロープを本来的
に有さないウイルス種や、エンベロープを本来的に有するウイルス種であってもカプシド
のみで初期感染活性の全てを有するウイルス種の場合には、エンベロープは必要に応じて
適宜選択すればよい。
自身が本来的に有するウイルスの初期感染活性のうち、少なくとも吸着活性及び侵入活性
を有する。一方、被膜粒子のカプシドは、初期感染活性のうち、少なくとも脱穀活性を有
していればよい。
よく、また修飾されていてもよい。
本明細書において「薬剤」とは、本発明の薬剤送達粒子に内包される送達物質であり、
具体的には、核酸、ペプチド、低分子化合物、又はその組合せである。薬剤は、標的細胞
及び適用した生体に生物学的、物理学的、又は化学的効果をもたらし得る。生物学的効果
には、例えば、標的遺伝子発現の増強若しくは抑制等の遺伝子発現制御、タンパク質の機
能制御、免疫賦活若しくは免疫抑制等の免疫系制御、又は細胞若しくは生体の生理機能の
制御が挙げられる。物理学的又は化学的効果は、例えば、カプシド等又は薬剤の標識によ
る標的細胞の生体内におけるイメージング化(例えば、FITG、GFP、X線、PET、MRI又はCT
イメージング化)又は追跡効果が挙げられる。以下、それぞれの薬剤について説明をする
。
本明細書において「核酸」は、天然型核酸、化学修飾核酸、人工核酸、核酸類似体及び
それらの組合せを含む。
びRNAをいう。ただし、本実施形態の天然型核酸は、薬剤送達粒子を構成するカプシドの
由来ウイルス自身の遺伝子の全部又はその一部を含まない外因性の核酸である。「由来ウ
イルスの遺伝子の全部又は一部を含む核酸」には、例えば、由来ウイルスのウイルス核酸
や由来ウイルスの遺伝子に基づいて構築されたウイルスベクターが該当する。
ネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2'-O-
メチル型DNA/RNA等が挙げられる。
ヌクレオチドのみが連結してなる核酸をいう。ここでいう「非天然型ヌクレオチド」とは
、前記天然型ヌクレオチドに類似の性質及び/又は構造を有する人工的に構築された又は
人工的に化学修飾された自然界に存在しないヌクレオチドをいう。
れた高分子化合物をいう。例えば、ペプチド核酸(PNA:Peptide Nucleic Acid)、ホス
フェート基を有するペプチド核酸(PHONA)、架橋化核酸(BNA/LNA:Bridged Nucleic Ac
id/Locked Nucleic Acid)、モルフォリノ核酸(ホルフォリノオリゴを含む)等が挙げら
れる。
、当該分野で公知の標識物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素(例えば
、32P、3H、14C)、DIG、ビオチン、蛍光色素(例えば、FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、F
AM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA)、又は発光物質(例えば、アク
リジニウムエスター)が挙げられる。
クター、mRNA若しくはその断片、又はその組合せが挙げられる。
生物学的機能、例えば、酵素機能、触媒機能又は生物学的阻害若しくは亢進機能(例えば
、転写、翻訳の阻害又は亢進)を有する核酸をいう。具体的には、例えば、RNA干渉剤、
核酸アプタマー(RNAアプタマー及びDNAアプタマーを含む)、アンチセンスDNA、リボザ
イム(デオキシリボザイムを含む)、U1アダプター、モレキュラー・ビーコン、リボスイ
ッチ、又は転写因子結合領域等が挙げられる。特にRNA干渉剤は、薬剤送達粒子の薬剤と
して好ましく適用できる。ここで、「RNA干渉剤」とは、生体内においてRNA干渉(RNA in
teference:RNAi)を誘導し、標的とする遺伝子の転写産物の分解を介してその遺伝子の
発現を抑制(サイレンシング)することができる物質をいう。例えば、siRNA(small int
erfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)又はmiRNA(micro RNA)(pri-miRNA及びpr
e-miRNAを含む)が挙げられる。RNA干渉剤は、遺伝子発現の抑制効果とその有用性が確認
されながらも裸のRNA分子では生体内でヌクレアーゼによる分解を受けるため不安定であ
り、それ故、標的細胞内へ送達させる有効な手段が十分には確立されていなかった。しか
し、本発明の薬剤送達粒子によれば、薬剤がカプシド内に保護されているため、生体内投
与後にも標的細胞内に送達されるまでヌクレアーゼ等の分解から免れることができる。薬
剤送達粒子は、中空カプシド等内に2種以上の機能性核酸を含むことができる。
を含む。人工染色体には、ヒト人工染色体(HAC; Human Artificial Chromosome)、酵母
人工染色体(YAC; Yeast Artificial Chromosome)、菌人工染色体(BAC; Bacterial Art
ificial Chromosome)、及びP1由来人工染色体(PAC; P1-derived Artificial Chromosom
e)を含む。好ましくは、HACである。前述のように、ウイルスベクターは、カプシドの由
来ウイルスの遺伝子に基づいて構築されたウイルスベクターを含まない。
伝子又はその断片を含むことができる。例えば、転写因子、シグナル伝達因子、細胞外分
泌性タンパク質又は酵素をコードする遺伝子、又はそれらの活性を有する断片が挙げられ
る。包含される遺伝子が、野生型遺伝子であるか、又は変異遺伝子であるかは問わない。
また、異なる遺伝子を含む二以上のベクターが薬剤として包含されていてもよい。
現可能な状態で包含することが好ましい。ここで「発現可能な状態」とは、ベクターに含
まれる遺伝子又はその断片が標的細胞内で発現可能なように、核酸発現システム内のプロ
モーターとターミネーターの制御下に配置されていることをいう。「核酸発現システム」
とは、遺伝子の発現に必要な発現調節エレメントを、機能可能な状態で少なくとも一組有
する系である。発現調節エレメントには、プロモーター及びターミネーターの他、必要に
応じてエンハンサ及びポリA付加シグナルが含まれる。
薬剤送達粒子を適用する生物種又はその近縁種由来のプロモーターが好ましい。例えば、
ヒトへの投与を目的とする薬剤送達粒子であれば、プロモーターはヒト由来であることが
好ましい。プロモーターには、発現パターンに応じて、過剰発現型プロモーター、構成的
プロモーター、部位特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、又は誘導性プロモー
ター等が知られているが、薬剤送達粒子では、いずれのプロモーターも使用することがで
きる。導入する細胞内での所望の発現パターンに応じて、適宜選択すればよい。
であれば特に限定はしない。好ましくはプロモーターと同一生物種由来のターミネーター
であり、より好ましくはプロモーターが由来する生物種のゲノム上で、そのプロモーター
と組となっているターミネーターである。
特に限定はされない。好ましくはプロモーターと同一生物種由来のターミネーターである
。
れる。
選抜又は標識マーカー遺伝子を含むこともできる。標識若しくは選抜マーカー遺伝子には
、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光又は発光レポーター遺伝子(例えば、ルシフェラーゼ、
β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニターゼ(GUS)、又はGFP)、又は酵素遺伝子が挙げ
られる。
片を含んでいてもよい。mRNAは、mRNA前駆体又は成熟mRNAのいずれであってもよい。好ま
しくは成熟mRNAである。また、mRNA又はその断片は、5’末端にm7Gキャップ構造を、及び
/又は3’末端にポリA鎖を含んでいてもよい。mRNAがコードするタンパク質は、野生型で
あるか、又は変異型であるかは問わない。
内容量は、由来ウイルスの種類によって異なるため、包含される核酸の塩基数もカプシド
の由来ウイルス種によって左右される。通常は、50kb以下、好ましくは20kb以下、より好
ましくは10kb以下、一層好ましくは5kb以下である。
本明細書におけるペプチドは、オリゴペプチド、ポリペプチドのいずれも含む。オリゴ
ペプチドの具体例としては、ペプチドホルモンやポリペプチド断片が挙げられる。ポリペ
プチド具体例としては、抗体、転写因子、シグナル伝達因子、酵素が挙げられる。
抗体フラグメントを含む。
意のクラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びIgY)、又は任意のサブクラス(例え
ば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)であってもよい。薬剤としてモノクローナル
抗体又はポリクローナル抗体を用いる場合、抗体は、薬剤送達粒子を投与する生物種と同
種由来の抗体であることが好ましい。例えば、薬剤送達粒子をヒトに投与する場合、薬剤
としてのモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、ヒト抗体であることが好ましい
。
抗体」とは、異なる動物由来の抗体のアミノ酸配列を組み合わせて作製される抗体で、あ
る抗体の定常領域(C領域)を他の抗体のC領域で置換した抗体である。例えば、マウスモ
ノクローナル抗体のC領域をヒト抗体のC領域と置き換えた抗体が該当する。これによりヒ
ト体内における当該抗体に対する免疫反応を軽減し得る。「ヒト化抗体」とは、ヒト以外
の哺乳動物、例えば、マウス抗体のV領域における相補性決定領域(CDR)とヒト抗体のCD
Rとを置換したモザイク抗体である。「多重特異性抗体」とは、多価抗体、すなわち抗原
結合部位を一分子内に複数有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピト
ープと結合する抗体をいう。例えば、IgGのように2つの抗原結合部位を有する抗体で、そ
れぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する二重特異性抗体(Bispecific抗体)
が挙げられる。
う。例えば、組換えDNA法を用いて新たに合成された抗体が挙げられる。具体的には、例
えば、単鎖抗体(scFv:single chain Fragment of variable region)、ダイアボディ(
diabody)、トリアボディ(triabody)又はテトラボディ(tetrabody)等が挙げられる。
修飾を含む。機能上の修飾には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミ
ド化、リン酸化、又はPEG化が挙げられる。標識上の修飾には、蛍光色素(フルオレセイ
ン、FITC、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5、)、蛍光タンパク質(例えば、PE、
APC、GFP、)、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ
、グルコースオキシダーゼ)、放射性同位元素(例えば、3H、14C、35S)又はビオチン若
しくは(ストレプト)アビジンによる標識が挙げられる。
カプシドの内容量は、由来ウイルスの種類によって異なり、また同じアミノ酸数のペプチ
ドでもその立体構造によってカプシド内部への導入の可否が異なることから、それらを勘
案して適宜定めればよい。通常は、500kDa以下、好ましくは100kDa以下、より好ましくは
80kDa以下、さらに好ましくは50kDa以下である。
本明細書において「低分子化合物」とは、分子量5000以下、好ましくは2000以下、より
好ましくは1000以下の化合物であって、前記核酸及びペプチド以外の物質が該当する。例
えば、ホルモン(例えば、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲステロン、アルドステロ
ン、コルチゾール等のステロイドホルモン)、神経伝達物質(例えば、アドレナリン、エ
ピネフリン、ノルアドレナリン、ドーパミン)、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、及び
免疫抑制剤等の様々な医薬化合物が挙げられる。また、特定の低分子化合物と同等の薬理
活性を有する低分子化合物の誘導体、又はその塩も含む。
本発明の薬剤送達粒子によれば、ウイルスベクターのようなウイルス由来の遺伝子を含
まないことから適用後の安全性が高く、かつ従来カプシド内への導入が困難であったペプ
チドや低分子化合物を薬剤として包含することができる。また、薬剤送達粒子を構成する
カプシド又はエンベロープの血清型に基づく標的細胞特異的送達活性により、特定の細胞
内に薬剤を送達することができる。
侵入段階である初期感染活性は有しているが、カプシド等の由来ウイルスの遺伝子の全部
又は一部を含む核酸を包含しないため、ウイルスの増殖段階である後期感染性を欠損して
いる。したがって、本発明の薬剤送達粒子の適用により、内包する薬剤をエンドサイトー
シス又は膜融合を介して標的細胞内に送達し得るが、標的細胞内でのウイルス粒子の増殖
に伴う標的細胞の生理機能の破綻、及び宿主細胞からのウイルス粒子の放出又は出芽に伴
う宿主細胞の細胞膜の損傷を生じない。このため、様々な分子や遺伝子の機能解析を、細
胞の機能に影響を及ぼすことなく行うことが可能となる。
2−1.概要
本発明の第2の実施形態は、薬剤送達粒子の製造方法である。
る案は従来からあったが、ウイルスの初期感染活性を保持したままで、送達物質である薬
剤を中空カプシドに導入する技術は、これまで確立されていなかった。本製造方法によれ
ば、中空カプシド等のウイルスの初期感染活性を維持したままで、簡便な方法で、その内
部に薬剤を導入し、第1実施形態の薬剤送達粒子を製造することができる。
本発明の製造方法は、混合工程(1)及び導入工程(2)を含む。さらに、必要に応じ
て除去工程(3)を含むことができる。以下、各工程について具体的に説明をする。なお
、本製造方法において、一連の工程は、汚染(コンタミ)等を防止するために、無菌条件
下で行われることが望ましい。
「混合工程」とは、界面活性剤を含む溶液中で中空カプシド等と薬剤を混合する工程で
ある。
とができる。中空カプシド等の調製については後述する。本工程で用いる中空カプシド等
は、精製処理後のものが好ましい。宿主細胞のタンパク質をはじめとする不純物が混在し
ている場合、次の導入工程で薬剤の導入効率が低減するためである。
る2種以上の薬剤を導入することもできる。この場合、上記溶液中に異なる2種以上の薬剤
を加えればよい。第1実施形態と異なり、本実施形態では、必要であれば、使用する中空
カプシド等由来ウイルス自身の遺伝子の全部又はその一部を薬剤として使用することがで
きる。例えば、由来ウイルスのウイルス核酸や由来ウイルスの遺伝子に基づいて構築され
たウイルスベクターを薬剤に使用してもよい。
-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween-20、Tween-80、オクチル-β-グルコシド又はOTG
のような非イオン性界面活性剤、PEGとPPGのコポリマーのような高分子非イオン性界面活
性剤、SDSのような陰イオン性界面活性剤、CHAPS又はCHAPSOのような両性イオン性界面活
性剤、又はそれらの組合せのいずれであってもよい。好ましくは、非イオン性界面活性剤
である。
媒には、例えば、水(蒸留水、滅菌水、脱イオン水を含む)、生理食塩水、又はリン酸バ
ッファが挙げられる。好ましくは水である。溶液中の界面活性剤の濃度は、容量%で0.1
%〜20%、好ましくは1%〜20%、より好ましくは3%〜18%、さらに好ましくは5%〜15
%である。
空カプシド等に導入する薬剤の種類に応じて適宜定めればよい。
のバッファで分量を調節し、撹拌器や撹拌棒等により撹拌して十分に混合して、混合液を
調製すればよい。
「導入工程」とは、前記混合工程後に得られた混合液を所定の温度で保持して、薬剤を
中空カプシド等内に導入する工程をいう。
てしまう可能性が高く、50℃よりも高い場合には中空カプシド等及び/又は薬剤が変性及
び/又は失活してしまう可能性が高いためである。好ましくは0〜40℃、又は4〜35℃であ
る。
と薬剤の導入に不十分であり、120分よりも長く保持しても導入効率の増大は見込めない
ためである。より好ましくは、10分〜90分、又は15分〜60分である。
ば、軽く撹拌しても構わない。
達粒子が得られる。
「除去工程」とは、前記導入工程の後に溶液中の界面活性剤を除去する工程である。本
工程は、選択工程であり、必要に応じて行えばよい。
使用する。薬剤送達粒子は、前記導入工程で製造され得るが、薬剤送達粒子を含む導入工
程後の溶液中には、使用した界面活性剤が混在している。薬剤送達粒子を生体に適用する
場合、この界面活性剤は、通常、生体に有害な影響をもたらし得る。それ故、製造された
薬剤送達粒子を後述する組成物の有効成分として使用する場合には、本工程で界面活性剤
を除去しておくことが好ましい。
使用すればよく、特に限定はしない。例えば、限外濾過膜を利用した除去方法、透析膜又
は透析カセットによる透析操作を用いた除去方法が挙げられる。薬剤送達粒子のカプシド
や被膜粒子の大きさは、通常10nm以上である。そこで、細孔径が10nmよりも小さい、すな
わち分画分子量100kMW以下の限外濾過膜を用いて導入工程後の混合液を流通させることに
より、導入工程後の溶液中の界面活性剤を分離、除去し、薬剤送達粒子を回収することが
できる。また、中空カプシド等に取り込まれなかった遊離の薬剤も、その種類によっては
、薬剤送達粒子が適用される生体に有害な影響をもたらし得る。しかし、この方法によれ
ば、同時に導入工程後の溶液中の遊離の薬剤も分離、除去することができるので便利であ
る。なお、限外濾過膜を用いた方法では、導入工程において薬剤を取り込まなかった中空
カプシド等は除去できない。しかし、中空カプシド等は、上述のように初期感染活性を有
するが、後期感染活性を欠損していることから、薬剤送達粒子に混在していても問題はな
い。
本実施形態の混合工程で使用する中空カプシド等は、ウイルスに感染した宿主細胞から
直接調製することができる。また、中空カプシドのみ得ることを目的とする場合、組換え
カプシドとして調製することもできる。
中空カプシド等は、通常、ウイルスに感染した宿主細胞内でウイルスが増殖し、娘ウイ
ルス粒子が構築される際に、同時に形成される。したがって、中空粒子等は、ウイルスに
感染した宿主細胞の抽出液から、又はウイルス粒子の放出若しくは出芽後の培養液から直
接調製することができる。この場合、宿主細胞の抽出液又は培養液には中空カプシド等と
共にウイルス粒子も混在している。それ故、宿主細胞の抽出液又は培養液からウイルス粒
子を分離し、又は失活させて、中空カプシド等を精製することが好ましい。これらは、公
知の方法を利用すればよい。例えば、ウイルス粒子の分離と中空カプシド等の調製方法は
、塩化セシウムを用いた密度勾配遠心法、及び特開2007-117003に記載のイオン交換膜を
用いる方法が挙げられる。
おけるヘルパーウイルスの共感染を必要とする。したがって、ヘルパーウイルス未感染細
胞に、このようなウイルスを感染させても、その細胞内では増殖しないことから、宿主細
胞抽出後のウイルス粒子の失活又は除去を要さずに使用できる。それ故、本発明の薬剤送
達粒子の製造方法で使用する中空カプシドの由来ウイルスとして好ましい。特にAAVは、
それ自体に病原性が知られていないことから安全性が高く、より好ましい。ヘルパーウイ
ルスを必要とするウイルス由来の中空カプシド等を宿主細胞内で生産させる場合、宿主細
胞にヘルパーウイルスを共感染させるか、ヘルパーウイルスの一部遺伝子(ヘルパー遺伝
子)を宿主細胞内で予め又は同時に発現させておく必要がある。
V複製に関与するRep遺伝子及びカプシドタンパク質をコードするCap遺伝子、並びにそれ
らの遺伝子の5'末端及び3'末端に位置するITR(Inverted Terminal Repeat)である。AAV
が感染し得る任意の宿主細胞に、これらの遺伝子を含む発現ベクター等を公知の形質転換
又はトランスフェクション法等により導入してAAVを感染させることによって、感染した
宿主細胞又はその培養液から中空カプシドを回収することができる。宿主細胞から中空カ
プシドを回収する方法は、公知の方法を用いればよい。例えば、宿主細胞を破砕して得ら
れる細胞抽出液から、後述する実施例に記載の方法で回収すればよい。
用することもできる。例えば、アデノウイルスのE1A遺伝子領域及びE1B19k遺伝子(本明
細書では、しばしばこれらを総称して「E1遺伝子領域」とする。)を内在するヒト胎児腎
細胞株(Human Embryonic Kidny Cell line)であるHEK293細胞(本明細書では、しばし
ば「293細胞」と略す)の利用が挙げられる。293細胞を用いてAAVを複製及び増殖させる
場合には、ヘルパー遺伝子としてアデノウイルスのE2A遺伝子領域、E4orf6遺伝子及びVA
RNAをコードする遺伝子のみを293細胞に導入すればよく、E1遺伝子領域の導入を必要とし
ないのでAAV由来中空カプシドの生産に好適である。
遺伝子と共に293細胞にアデノウイルスのE1遺伝子領域をさらに導入してAAV産生能増強細
胞株を調製してもよい。上記のように、293細胞は、既にアデノウイルスE1遺伝子領域を
包含することから、通常はE1遺伝子領域を導入する必要はない。しかし、本発明者らは、
後述の実施例1で示すように、E1遺伝子領域発現プラスミドを、ヘルパー遺伝子等を含む
他のプラスミドと同時に293細胞に導入した場合、AAVの力価がヘルパー遺伝子のみを導入
した293細胞よりも一層高くなり、AAV産生が増強されることを見出した。このメカニズム
の詳細については定かではないが、E1遺伝子産物は、アデノウイルス初期遺伝子の発現の
マスタースイッチとして機能すること(Matsushita, T., et al., 2004, J. Gen. Virol.
, 85: 2209-2214)から、E1遺伝子領域の細胞内発現量を通常の293細胞内発現量よりも増
強することで、アデノウイルスの下流の遺伝子群の発現量がより増強され、結果として宿
主細胞からより多くのAAV由来中空カプシドが生産され得たものと推測される。
VA RNAをコードする遺伝子をそれぞれ発現可能な状態で、例えば、発現ベクターに挿入し
た状態で、293細胞に導入することによって達成し得る。必要であれば、上記各遺伝子又
は遺伝子領域を含む発現ベクターを293細胞に導入後、E1遺伝子領域、E2A遺伝子領域、E4
orf6遺伝子及びVA RNAをコードする遺伝子からなる群の一以上を安定的に発現し得る293
細胞を選択し、当該調製された新たな細胞系列を利用することもできる。
AAV遺伝子(Rep遺伝子、Cap遺伝子、ITR等)を発現又は機能可能な状態で導入すればよい
。
領域を含む発現ベクターと共に導入してもよい。Bcl-xLは、従来の研究から、E1B19k遺伝
子の機能を補完すること(Matsushitaら、J. Gen. Virol., 2004, 85: 2209-2214)が知ら
れており、後述する実施例2で示すように、E1遺伝子領域をさらに活性化することができ
る。また、Bcl-xLは、細胞死(アポトーシス)を抑制する効果もあり(Yamaguchiら、Gene
Ther., 2003, 10: 375-85)、遺伝子導入操作に伴う細胞毒性を抑制することもできる。
入させた後、それらを安定的に発現し得るようにライン化した細胞株を用いてもよい。例
えば、後述する実施例2に記載のHEK293EB株等が挙げられる。
中空カプシド等のみを調製する場合、所望のウイルスのCap遺伝子を含む発現ベクター
を、適当な宿主細胞内で発現させてもよい。例えば、AAVの組換え中空カプシド等を必要
とするのであれば、所望の血清型AAVのCap遺伝子(具体的には、例えば、1型であれば、
配列番号1で示される塩基配列からなるCap遺伝子、2型であれば、配列番号2で示される
塩基配列からなるCap遺伝子、5型であれば、配列番号3で示される塩基配列からなるCap
遺伝子、6型であれば、配列番号4で示される塩基配列からなるCap遺伝子、7型であれば
、配列番号5で示される塩基配列からなるCap遺伝子、8型であれば、配列番号6で示され
る塩基配列からなるCap遺伝子又は9型であれば、配列番号7で示される塩基配列からなる
Cap遺伝子)を含むヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入すれば足りる。Cap遺伝子を
宿主細胞内で発現させた後に、その宿主細胞を破砕した細胞抽出液から、又はその宿主細
胞の培養液から、組換え中空カプシド等を得ることができる。細胞抽出液や培養液からの
回収方法は、当該分野で公知の方法により行えばよい。
能な発現ベクターを用いれば、その種類も問わない。例えば、細菌、枯草菌、酵母、昆虫
細胞、動物細胞、植物細胞を用いることができる。このとき、大腸菌用発現ベクターとし
ては、例えば、pET21α系、pGEX4T系、pC118系、pC119系、pC18系、pC19系を、枯草菌由
来発現ベクターとしては、例えば、pUB110系、pTP5系を、酵母由来発現ベクターとしては
、例えば、YEp13系、YEp24系、YCp50系を、昆虫細胞用発現ベクターとしては、バキュロ
ウイルスを、動物細胞用発現ベクターとしては、pC18系又はpC19系の(例えば、pA1-11、
pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)を、植物細胞用発現ベクターとしては、pRI系若
しくはpGW系のバイナリーベクター等を、それぞれ利用すればよい。このような発現ベク
ターは、各製造メーカー(Novagen社、宝酒造、第一化学薬品、Qiagen社、Stratagene社
、Promega社、Roche Diagnositics社、インビトロジェン社、Genetics Institute社、GE
ヘルスケア社等)から入手することもできる。
行えばよい。例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual Second Ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
Yorkに記載の方法を参考にすればよい。
細胞破砕物からAAV由来中空カプシドを精製する方法は、当該分野で公知の方法に基づ
いて精製すればよい。例えば、一般的な方法である、セシウム密度勾配超遠心法によって
精製することができる。又はイオン交換クロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィ
ーを用いた精製方法が、例えば、特許第3313117、特表2000−510682、特表平11−511326
、特表2001−513644、特表2001−514845号、又は米国特許第6,593,123号等に開示されて
おり、それを利用して精製してもよい。さらに、特開2007-117003に開示された、イオン
交換膜を用いて中空カプシドとウイルス粒子とを分離、精製する方法を利用してもよい。
ス粒子の比重が近接するため、両者を十分に分離することは困難という問題がある。上記
各種クロマトグラフィーを用いた精製方法は、ビーズ充填カラムを用いるため、サンプル
の拡散が不十分であり、またサンプルのカラムへの吸着効率が低く、かつカラムの容積が
大きいため吸着及び溶出に時間がかかる等、精製の効率面での問題がある。さらに、イオ
ン交換膜を用いた上記方法は、精製後にも可溶性タンパク質等の不純物の混入が多いとい
う問題がある。
ク質を凝固させることによって、可溶性タンパク質を簡便に除去する新規精製方法を開発
した。本精製方法は、中空カプシド等のみならず、ウイルスベクターのようなウイルスゲ
ノムを含むウイルス粒子の精製にも使用することができる。一般に、可溶性タンパク質を
加熱によって凝固させた後に除去する方法は、周知の方法であるが、中空カプシド等やウ
イルス粒子の精製を下記に示す温度及び加熱時間条件で行い、可溶性タンパク質を除去す
る方法は、これまで知られていない。上記中空カプシド等やウイルス粒子の精製するため
の所定の加熱温度は、45〜60℃の範囲であることが好ましい。45℃よりも低い温度では、
可溶性タンパク質の変性が不十分で凝固しない可能性があり、また60℃よりも高い温度で
は、目的の中空カプシド等やウイルス粒子が変性して、ウイルスの初期感染活性が失活し
てしまう可能性があるためである。より好ましい温度範囲は48〜58℃、さらに好ましい温
度範囲は50〜55℃である。
好ましい過熱時間は3分〜30分であり、より好ましくは5分〜20分、さらに好ましくは5分
〜10分である。55〜60℃の範囲で30分よりも長く加熱した場合、中空カプシド等が熱変性
して、初期感染活性が失活する可能性があるためである。一方、加熱温度が45℃以上で55
℃よりも低い場合、好ましい過熱時間は10分〜90分であり、より好ましくは15分〜60分、
さらに好ましくは20分〜40分である。45℃以上で55℃よりも低い温度範囲で、10分よりも
短い加熱時間では、可溶性タンパク質の変性が不十分で凝固しない可能性があるからであ
る。したがって、加熱時間は、加熱温度を考慮して、上記範囲内で適宜定めればよい。
ト、マイクロ波(電子レンジ)又は誘導加熱(IH)、湯煎等で加熱すればよい。加熱処理
によって凝固し、又は凝集した可溶性タンパク質の除去は、当該分野で公知の方法によっ
て行い得る。例えば、遠心によって凝固タンパク質を沈殿させ、上清を回収する方法、又
はろ過によって凝固タンパク質を除去する方法が挙げられる。本発明の加熱処理による中
空カプシド等やウイルス粒子の精製方法を上述の一以上の公知精製方法と組み合わせても
よい。例えば、本発明の過熱慮理による中空カプシド等やウイルス粒子の精製方法は、不
純物としての可溶性タンパク質を除去するには有効であるが、中空カプシド等とウイルス
粒子を分離することはできない。しかし、本発明の精製方法と、例えば、前記特開2007-1
17003に記載のイオン交換膜を用いる方法とを組み合わせることによって、中空カプシド
のみを高純度で精製することができる。
本発明の製造方法によれば、中空カプシド等の初期感染活性を喪失させることなく、簡
便かつ効率的に薬剤を中空カプシド等に導入させて、薬剤送達粒子を製造することができ
る。本製造方法で得られた薬剤送達粒子は、使用する中空カプシド等がウイルスの後期感
染活性を喪失しているためウイルスの増殖活性がなく安全性が高い。
ができるため、より多くの中空粒子を調製することができる。
た宿主細胞抽出液又は宿主細胞培養液中の可溶性タンパク質を簡便に、除去することがで
きる。
3−1.概要
本発明の第3の実施形態は、薬物組成物である。本発明の薬物組成物は、第1実施形態
の薬剤送達粒子又は第2実施形態の製造方法で得られる薬剤送達粒子の少なくとも一つを
有効成分として含むことを特徴とする。
本明細書において「薬物組成物」は、有効成分である薬剤送達粒子に含まれる薬剤の作
用によって、それを適用した生物又はその細胞に何らかの生理的作用を付与することを目
的とする組成物である。そのような生理作用には、例えば、疾患若しくは病害抵抗性、薬
物抵抗性若しくは感受性、生理活性の増強若しくは抑制、及び/又は新規形質が挙げられ
る。適用する生物が動物、特にヒトであって、有効成分の作用によって疾患の予防、診断
、及び/又は治療を目的とする場合、本明細書では、特に「医薬組成物」という。本明細
書において「予防」とは疾患又は病害の罹患を防ぐことをいう。「治療」とは、罹患した
疾患又は病害及び/又はそれに伴う症状を緩和又は除去することをいう。
の若しくは異なる薬理効果を有する他の薬剤を含むことができる。
本実施形態の薬剤送達粒子は、第1の実施形態の薬剤送達粒子又は第2の実施形態の製
造法で得られる薬剤送達粒子である。一の薬物組成物中に含まれる薬剤送達粒子は、異な
る二以上のものであってもよい。この場合、薬剤送達粒子は、カプシド等が互いに異なる
ウイルス由来であってもよいし、及び/又は薬物が互いに異なる種類であってもよい。例
えば、標的細胞の異なる薬剤送達粒子を含んでいてもよい。
類及び/又はその有効量、適用対象細胞、疾患又は病害の種類、薬物組成物の剤形(形態
、大きさを含む)、並びに後述する担体の種類によって異なり、それぞれの条件を勘案し
、適宜定められる。
機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する生体に対して所望しない有害
な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被検体の情報及び投与
経路等の様々な条件によって変化し得る。
体がヒトの場合には、特に「被検者」とする。また、「被検体の情報」とは、薬物組成物
を適用する生体の様々な個体情報であって、例えば、被験者の場合であれば、全身の健康
状態、疾患・病害に罹患している場合にはその進行度や重症度、年齢、体重、性別、食生
活、薬剤感受性、併用薬物の有無及び治療に対する耐性等を含む。薬剤送達粒子の最終的
な有効量、及びそれに基づいて算出される適用量は、個々の被検体の情報等に応じて、最
終的には医師、歯科医師、獣医師又は植物医師等の判断によって決定され得る。
「担体」とは、薬物組成物の製剤化や生体への適用を容易にし、また薬剤送達粒子に包
含される薬剤の効果を維持するために、その作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される
物質をいう。
、乳化剤、流動添加調節剤又は潤滑沢剤が挙げられる。
糖(具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース
、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デ
ンプン及びセルロースを含む)、金属塩(例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カル
シウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム)、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、
高分子量のポリエチレングリコール(PEG)、プルロニック、或いはそれらの組み合わせ
が挙げられる。
ンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び/又はポリビニル
ピロリドン等が挙げられる。
ビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が
挙げられる。
カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム)が挙げられる。
、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
添加剤の他、必要に応じて矯味矯臭剤、溶解補助剤(可溶化剤)、懸濁剤、希釈剤、界面
活性剤、安定剤、吸収促進剤(例えば、第4級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウ
ム等)、増量剤、付湿剤、保湿剤(例えば、グリセリン、澱粉等)、吸着剤(例えば、澱
粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等)、崩壊抑制剤(例えば、白糖
、ステアリン、カカオバター、水素添加油等)、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸
化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
化剤、分散剤及び界面活性剤等が挙げられる。
る。
レン脂肪アルコールエーテル、アルキルスルホネート及びアリールスルホネート)が該当
する。
ールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩
及びアンモニウム塩、アルキルアリールスルホネート、アルキルスルフェート、アルキル
スルホネート、脂肪アルコールスルフェート、脂肪酸及び硫酸化脂肪アルコールグリコー
ルエーテル、さらに、スルホン化ナフタレン及びナフタレン誘導体とホルムアルデヒドの
縮合物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドの縮合
物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノー
ル、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル
、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコール
エーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコール及び脂肪アルコール/
エチレンオキシドの縮合物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテ
ル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルア
セタール、ソルビトールエステル、リグノ亜硫酸廃液、及びメチルセルロースが該当する
。
ある。
用する場合には農学上許容可能なものを使用する。
本発明の薬物組成物は、有効成分である薬剤送達粒子の作用を阻害又は抑制しない範囲
で、薬剤送達粒子に包含される薬剤と同一又は異なる薬理作用を有する他の薬剤を一以上
含むことができる。例えば、被験者の場合、治療対象疾患に対して併発する可能性の高い
他の疾患が存在する場合、他の疾患に対する治療剤を含んでいてもよい。また、被検体が
植物の場合、例えば、殺虫剤、殺菌剤、肥料を含んでいてもよい。
薬物組成物の剤形は、適用方法及び/又は処方条件によって異なる。
別することができる。これについては後述する。
ドロップ剤、トローチ剤を含む)、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤等を挙げることができる。
さらに固形剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼ
ラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。
与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分されるが、薬物組成物も、それぞれの投与
方法に適した剤形にすることができる。全身又は組織内投与に適した剤形としては、例え
ば、液剤である注射剤が挙げられる。経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、
例えば、液剤(塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む)、懸濁剤(乳剤、クリーム剤を
含む)、粉剤(点鼻剤、吸引剤を含む)、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げ
ることができる。経直腸的投与に適した剤形としては、例えば、坐剤等を挙げることがで
きる。
はその組み合わせが挙げられる。溶液剤、油性分散液剤、エマルション剤、懸濁製剤、粉
剤、散剤、ペースト剤、ゲル剤、ペレット剤、錠剤及び粒剤とすることができる。
て当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
本発明の薬物組成物を製剤化するには、原則として当該分野で公知の方法を利用するこ
とができる。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Merck Publishing Co.
,Easton,Pa.)に記載の方法を用いればよい。
溶解し、必要に応じて製薬上許容可能な担体を加え、当該分野で慣用されている方法によ
り製造することができる。
ル、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポ
リオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。これらは、殺菌されてい
ることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
薬物組成物の有効成分である薬剤送達粒子は、ウイルスの標的細胞特異的な感染活性を
利用したものである。それ故、薬物組成物の適用方法は、薬物組成物に含まれる薬剤送達
粒子がその標的細胞に接触し得る方法であれば、当該分野で公知の単位形態で適用するこ
とができる。
ば、経口投与法及び非経口投与法が挙げられる。非経口投与法は、さらに、局所投与法(
例えば、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与のような組織内投与法、経皮投与、経粘膜投
与、又は経直腸的投与等)に細分できる。本発明の薬物組成物は、これらの投与単位形態
のいずれを使用してもよい。限定はしないが、好ましい方法は、注射、経口投与、又は経
粘膜投与である。
送達粒子を全身に行き渡らせることができるからである。さらに、侵襲性が比較的低く、
被検体に与える負担が小さいからである。注射による薬物組成物の注入部位は、特に限定
しない。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、
経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内、舌下等が挙げられる。好ましくは、静脈内注
射、動脈内注射等の血管内への注射である。
を介して体内に取り込まれ得る場合、侵襲性が低く、投与が容易だからである。
薬剤送達粒子が植物体に接触し得る方法であれば、当該分野で公知の慣用の方法を使用す
ることができる。植物体への接触方法としては、例えば、植物体への噴霧、散布、塗布、
注入、浸漬、有傷接種(針接種を含む)、根部からの吸収等の方法が挙げられる。適用対
象植物体への接触部位は、地上部であれば、葉、花芽、実、茎、枝等、また地下部であれ
ば根、根茎、根塊等、所望の箇所でよく、特に限定しない。薬剤送達粒子の由来するウイ
ルスの感染経路に応じて、適宜勘案すればよい。
(目的)
既存の内在性E1遺伝子領域を含むHEK293細胞に、さらにE1遺伝子領域発現プラスミドを
導入した場合、その導入量による、AAVの産生量の変化を検証した。
225cm2フラスコ16個を用いて、フラスコあたり2×107個の293細胞を10%FBS+/DMEM/
F12培地で5%CO2下37℃にて培養した。培養48時間後にリン酸カルシウム法にて、AAVのIT
R(Inverted Terminal Repeat)とLacZ遺伝子を含むAAVベクタープラスミドをフラスコあ
たり23μg、2型AAVのrep遺伝子及び8型AAVのcap遺伝子をクローニングしたAAVヘルパープ
ラスミドをフラスコあたり23μg、2型アデノウイルスのE2A遺伝子領域、E4orf6遺伝子、V
A-RNAをコードする遺伝子をクローニングしたアデノウイルスヘルパープラスミドをフラ
スコあたり23μg、及びE1遺伝子領域発現プラスミド(pE1Δ55)をフラスコあたり0、2.3、
6.9又は23μgで導入し(各n=4)、AAV粒子を細胞内で複製させた。pE1Δ55を0、2.3、6.9
μgで用いた場合には、プラスミド内の総量が同一となる様にコントロールプラスミド(pC
MV)にて調製した。なお、pE1Δ55は、E1B遺伝子領域よりE1B55k遺伝子のみを欠失したE1
遺伝子領域発現プラスミドである。6時間後に10%FBS+/DMEM/F12培地で培地交換を行な
った。72時間後に細胞を回収し、細胞ペレットの凍結融解を6回繰り返し、毎回ボルテッ
クス操作にてよく混和した。DNaseI処理にて残存するプラスミドを消化後、Q-PCR法にてA
AVのコピー数(g.c.)を定量化した。
, Methods Enzymol., Vol 346: Gene Therapy Methods (ed. by M. Ian Phillips), 2002
, 378-393; Okada T., et al., Methods., 2002, 28: 237-247;及びOkada T., et al.,
Hum. Gene Ther., 2005, 16: 1212-1218に記載の方法に基づいて行った。
図1に結果を示す。この図で示すように、HEK293細胞に、E1遺伝子領域発現プラスミド
を導入した場合、導入する発現プラスミドの量依存的に、AAV産生量が向上することが明
らかとなった。
(目的)
E1遺伝子領域及びBcl-xL遺伝子を安定的に発現する293細胞を構築し、Bcl-xL遺伝子の
発現増強による、AAVの産生量を検証した。
まず、E1遺伝子領域及びBcl-xL遺伝子を安定的に発現する293細胞株を構築した。E1遺
伝子領域発現プラスミドpE1Δ55、Bcl-xL遺伝子発現プラスミド、及びネオマイシン発現
プラスミドを20:20:1の比率にて293細胞に導入し、ネオマイシン耐性の細胞株のクロー
ンを10個単離して増殖させた。このうち、最も増殖率の高いクローンを選択してライン化
し、「HEK293EB細胞株」(本明細書では、しばしば「293EB細胞株」と略す)とした。
を、それぞれ10%FBS+/DMEM/F12培地で培養した。培養48時間後にリン酸カルシウム法
にて、293EB細胞については、AAVのITR-LacZ遺伝子を含むAAVベクタープラスミドをフラ
スコあたり23μg、2型AAVのrep遺伝子及び8型AAVのcap遺伝子をクローニングしたAAVヘル
パープラスミドをフラスコあたり23μg、2型アデノウイルスのE2A、E4、VA-RNA遺伝子を
クローニングしたアデノウイルスヘルパープラスミドをフラスコあたり23μgで、293細胞
については、さらにE1遺伝子発現プラスミドpE1Δ55をフラスコあたり23μgで、それぞれ
導入した。6時間後に10%FBS+/DMEM/F12培地で培地交換を行なった。72時間後にそれ
ぞれの細胞を遠心して回収し、細胞ペレットの凍結融解を6回繰り返し、毎回ボルテック
ス操作にて十分に混合した。DNaseI処理にて残存するプラスミドを消化後、Q-PCR法にて
ベクターのゲノムコピー数を定量化した。
。
結果を図2に示す。この図で示すように、293細胞と比較して、E1遺伝子領域及びBcl-x
L遺伝子を安定的に発現する293EB細胞ではAAV産生量が2.1倍に増加することが明らかとな
った。
(目的)
細胞破砕物からAAVやAAV由来中空カプシドを精製する場合、従来法では密度勾配超遠心
やイオン交換精製で行っていたが、不純物の混入が多く、精製効率が十分とは言い難かっ
た。
ち、沈殿、除去することにより、ウイルス粒子や中空カプシドを簡便に精製する方法を見
出した。そこで、検討するため、以下の検討を行った。
中空カプシドの初期感染活性を可能な限り保持し得る至適条件を検討した。
1.4×108個の293EB細胞を、225cm2フラスコ28本(又は6320cm2の10段フラスコ1個)を
用いて10%FBS+/DMEM/F12培地で5%CO2下37℃にて培養した。培養48時間後に、AAVのITR
(Inverted Terminal Repeat)を含むルシフェラーゼ遺伝子を挿入したAAVベクタープラ
スミド、AAVの2型rep及び9型cap遺伝子をクローニングしたAAVヘルパープラスミド、及び
2型アデノウイルスのE2A、E4、VA-RNA遺伝子をクローニングしたアデノウイルスヘルパー
プラスミドをそれぞれ650μgずつリン酸カルシウム法で293EB細胞に導入し、AAV粒子及び
AAV中空カプシドを該細胞内で複製させた。6時間後に10%FBS+/DMEM/F12培地で培地交
換を行なった。72時間後に細胞を遠心にて回収し、細胞ペレットを30mLのTBSバッファに
て懸濁した。このサンプルの凍結融解を4〜6回繰り返し、毎回ボルテックス操作にて十分
に混合した。
、300μLの0.5M EDTAを添加して反応を停止させた。900μLの5M NaClを加えてよく混和し
、4℃で10,000×g、10分間遠心して上清を回収した。
℃/30分、50℃/60分、55℃/10分、55℃/20分及び55℃/30分の各条件(それぞれn=4)で加
熱後、生じた凝固物を4℃、10,000×gの条件下で10分間遠心して、沈殿物を回収し、その
平均値(mg)を算出した。また、24ウェルプレートにて培養した293細胞に、1x1011ゲノ
ムコピー/ウェルの条件で、上記各条件にて処理後のカプシドを混合した。初期感染活性
を、細胞の遺伝子発現で検証し、その評価として、Bright−Glo Luciferase Assay Syste
m(Promega社)を用い、サーモ・エレクトリック社製発光プレートリーダーAppliskanを用
いて、ルシフェラーザ活性を定量した。
。
表1に結果を示す。この表では、ルシフェラーゼ活性をRLU(relative light unit)で示
している。この結果から、いずれの条件でも未処理と比較して、可溶性タンパク質を30%
以上多く除去できることが明らかとなった。一方、55℃で20分以上処理した場合には、遺
伝子発現が低減することがわかった。各条件を比較すると、50℃では60分以下、55℃では
20分よりも短い時間が適当であることが示された。
(目的)
本発明の薬剤送達粒子の製造方法による薬剤送達方法の製造の実施とその細胞内送達能
の効果を検証した。
(1)中空カプシドの製造
4×108個の293EB細胞を、225cm2フラスコ28本(又は6320cm2の10段フラスコ1個)を用
いて、10%FBS+/DMEM/F12培地で、5%CO2下37℃にて培養した。培養48時間後に、AAVのI
TRを含むeGFP遺伝子を挿入したAAVベクタープラスミド、9型AAVのrep及びcap遺伝子をク
ローニングしたAAVヘルパープラスミド、及び2型アデノウイルスのE2A、E4、VA RNA遺伝
子をクローニングしたアデノウイルスヘルパープラスミドをそれぞれ650μgずつリン酸カ
ルシウム法にて293EB細胞に導入し、AAV粒子及びAAV中空カプシドを該細胞内で複製させ
た。72時間後に細胞を遠心にて回収し、細胞ペレットを30mLのTBSバッファにて懸濁した
。このサンプルの凍結融解を4〜6回繰り返し、毎回ボルテックス操作にて十分に混合した
。
、300μLの0.5M EDTAを添加して反応を停止させた。900μLの5M NaClを加えてよく混和し
、4℃で10,000×g、10分間遠心して上清を回収した。
0,000×g、10分間遠心して上清を回収した。
1.50g/mL塩化セシウム溶液上に1.25g/mL塩化セシウム溶液を重層し、さらにこの上に前
記(1)で回収した上清を重層した。16℃で25,000×g、3時間超遠心後、塩化セシウム層
を遠心チューブ下方から0.5mLずつ回収した。各分画の屈折率(RI:refractive index:
)を測定し、RIが1.365〜.368の画分を回収した後、サンプルの約100倍量のMHNバッファ
(3.33mM MES、3.33mM HEPES(pH6.5)、3.33mM NaOAc)に対し、30分間透析した。得られ
たサンプルの約5倍量のMHNバッファでサンプルを希釈した。
イオン交換膜として基材表面にスルホン酸基を保持する陽イオン交換膜ムスタングS(
ポール コーポレーション)を使用した。FPLCシステムとして、AKTA explorer 100(GEヘ
ルスケア)を用い、精製操作を行った。MHNバッファでムスタングSアクロディスクを平衡
化した後、流速3mL/分でサンプルをムスタングSアクロディスクに中空カプシドを吸着さ
せ、AAV粒子を分離、除去した。10CVのMHNバッファでムスタングSアクロディスクを洗浄
し、0〜100%B(2M NaCl)/50CVの濃度勾配条件下にてピークの画分に含まれる中空カプシ
ドを溶出し、画分量1mLで回収した。電子顕微鏡により、中心に黒い部分があるウイルス
ゲノムが入っていない中空カプシドであることを確認した。
最終濃度0.5%のTriton X-100(Wako)の存在下で、(1)〜(3)で調製した9型AAV
(AAV9)の中空カプシド4μgを、最終濃度10μMの3’-カルボキシフルオレセイン標識化
モルフォリノオリゴ(Gene Tools社)(以下、「フルオレセイン-PMO」とする)を薬剤と
して混合した後、PBSにて総量を20μLとした。その後、軽く撹拌して氷上で30分間静置し
た。
を用いて、Triton X-100及び未導入のフルオレセイン-PMOを除去した。具体的には、前記
混合サンプル20μLを500μLのPBS溶液に懸濁し、Vivaspin 500にて15,000回転/分の速度
で、4℃にて10分間遠心した。この操作を2回繰り返し、最終サンプルをPBS溶液で20μLに
調整した。ここで得られた薬剤送達粒子を便宜的に「AAV9/PMO」とする。
ヒト横紋筋肉種細胞(RD)株(財団法人ヒューマンサイエンス振興財団、ヒューマンサ
イエンス研究資源バンクより入手;JCRB9072)に(4)で調製したAAV9/PMOを投与して混
合し、薬剤の細胞内への取り込みと局在を評価した。具体的には、1.0×104個のRD細胞を
7μLのAAV9/PMOと混合し、5% CO2、37℃の培養条件下で培養した。培地は、ペニシリン(1
00IU/mL)及びストレプトマイシン(100μg/mL)含有DMEM/F12(1:1)培地を用い、血清は終濃
度10%とした。また、対照用として、フルオレセイン-PMOのみを1.0×104個のRD細胞と混
合したサンプル、及び従来技術のPMO用トランスフェクション試薬エンドポーター(Gene T
ools社)を用いて、フルオレセイン-PMOをRD細胞に導入したサンプルを調製した。この際
、エンドポーターの投与量は、100μLのウェルの培地あたり0.6μLとし、終濃度は6μMと
した。
MOのRD細胞内への取り込みと局在を評価した。また、処理120時間後のRD細胞の形態を観
察した。
図3に結果を示す。A〜Cは、投与24時間後の蛍光図である。Aはフルオレセイン-PMOの
みで処理したRD細胞を、Bはエンドポーターで処理したRD細胞を、CはPAAV9/PMOで処理し
たRD細胞を、それぞれ示す。またD及びEは、それぞれエンドポーターで処理したRD細胞と
PAAV9/PMOで処理したRD細胞の処理120時間後のRD細胞の形態を示す。
まれないことが示された。これに対して、B及びCでは、細胞内に蛍光が観察され細胞内へ
フルオレセイン-PMOの取り込みが認められたが、Cでは、核を中心として、Bを上回る強い
蛍光が観察され、高効率で細胞内、特に核内にPMOが取り込まれたことが示唆された。そ
こで、画像解析ソフトBZ-II(KEYENCE社)を用いてB及びCにおける蛍光強度を測定し、フ
ルオレセイン-PMOの取り込み率を比較した。核内の蛍光強度値(RFU)の平均値は、エンド
ポーターを用いた場合が55であったのに対して、PAAV9/PMOを用いた場合には414であり、
PAAV9/PMOの方が約7.5倍高かった。また、細胞質に対する核の蛍光強度の比率は、エンド
ポーターの場合は2.0、PAAV9/PMOの場合は4.6であり、中空カプシドの方が2倍強の値を示
した。
ではほとんどの細胞が死滅しており(図3D)、エンドポーターの細胞毒性が示唆された
のに対して、PAAV9/PMO処理の場合には細胞の死滅はほとんどなく、また形態的な変化も
認められなかった(図3E)。
りもPMOの細胞内、特に核への送達効率が高く、さらに標的細胞に対する安全性が立証さ
れた。
(目的)
実施例4では、中空カプシド等内に導入する薬剤として低分子化合物である3’-カルボ
キシフルオレセインで標識化した核酸類似体のモルフォリノオリゴを本発明の製造方法に
よって導入した。そこで、本実施例では、薬剤を他の核酸又はペプチドにした場合であっ
ても、本発明の製造方法によって実施例4と同様に中空カプシド等内に導入でき、かつ製
造されたその薬剤送達粒子が細胞内に導入され得ることを検証した。
(1)中空カプシドの製造から分離及び精製
AAV中空カプシドの製造から分離及び精製までは、実施例4に記載の方法と同様である
ことから、その記載は省略する。
(i)FITC-siRNA
モルフォリノオリゴ以外の他の核酸としてFITC標識化したsiRNA(FITC-siRNA)を用い
た。FITC-siRNAは、siRNAコントロール配列のセンス鎖であるsiCont-s(Sigma Genosys)の
5’末端にFITC標識したもの(5'-Fluorescein (5,6-FAM) UUCUCCGAACGUCACGUUU-3';配列
番号8)と、同コントロール配列のアンチセンス鎖であり、5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAUU-3
'(配列番号9)で示す塩基配列を有するsiCont-as (Sigma Genosys)からなるsiRNAを使
用した。当該FITC-siRNAの合成は、Sigma genosysに合成委託した。
ペプチドとしてAlexa488標識されたウシ血清アルブミン(BSA)(Alexa488-BSA; Molec
ular Probes,A13100)及び抗ラットAlexa-IgG (Molecular Probes, A21208)を使用した
。
AAV中空カプシド7.8μg (0.65mg/mL)を12μLとPBSを4μL混合し、界面活性剤として0.5
% Pluronic F-68(PEGのコポリマーである高分子非イオン性界面活性剤)を1μL加えた溶
液に、100μMのFITC-siRNAを3μL、50μMのAlexa488-BSAを1μL又は13μMのAlexa-IgGを
加え、PBSで20μLにメスアップしたものを、30分間、室温に静置した。その後、PBSで200
μLにメスアップした後、70%エタノールで滅菌した限外濾過カラムを用いて30μLまで濃
縮し、さらに同一操作を反復して、フリーのsiRNA、BSA又はIgGを除去した。
基本的な方法は、実施例4に記載の方法と同じである。10% Fetal Bovine Serum (CCB,
Lot8D0264)及び1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Sigma P4458)を添加したDMEM/F12(
1:1)培地(Gibco,#11320)で培養したヒト横紋筋肉腫RD細胞株(財団法人ヒューマンサイエ
ンス振興財団、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、JCRB9072)を10,000 cel
ls/wellとなるように96wellプレートに播種し、37℃、5% CO2下で一晩培養した。その後
、前記濃縮後の30μL溶液のうち1/5量(6μL)を培養液に添加し、さらに同条件で20時間
培養した。
観察(励起330-385nm)を行い、AAV9/PMOのRD細胞内への取り込みと局在を評価した。
図6に結果を示す。この結果から、本発明の製造方法によって、モルフォリノオリゴ以
外の酸FITC標識された核酸であるsiRNAであっても、またAlexaで標識されたペプチド(BS
A及びIgG)であっても中空カプシド等内に導入でき、さらにその薬剤送達粒子が細胞内に
導入され得ることが確認された。特に、FITC-siRNAでは、導入されたFITC-siRNAが核に送
達されていることも示された。
らの組合せを中空カプシド等内に導入することが可能であり、さらに、その結果得られる
薬剤送達粒子は、ウイルスカプシド等の感染性に基づいて、所定の細胞内に導入されるこ
とが立証された。
(目的)
薬剤を効率的に中空カプシド等内に導入するための界面活性剤の濃度条件について検証
した。
薬剤送達粒子の調製の基本的な手順は、前記実施例4(4)に記載の方法に従った。た
だし、界面活性剤にはTween20を用い、その濃度は、0、0.5、0.75、1、3及び10%とし、
また薬剤にはFITC標識化PMO(以下、「FITC-PMO」とする)を用いた。さらに、AAV中空カ
プシド、及びTween20を混合後、4℃で30分間静置した。
外濾過膜Vivaspin 500(30kDa MWCO)で遠心分離し、分離後、それぞれのサンプルの蛍光
強度を測定して、カラムにかける前の蛍光量との割合を算出し、取り込み率とした。
結果を図4に示す。取り込み率は、濃度依存的に上昇し、10%では半数以上の割合で効
果的に取り込みが可能なことが明らかとなった。
(目的)
本発明の薬剤送達粒子に用いる中空カプシド等が標的細胞特異的送達活性を有すること
を検証した。
Alexa Fluor 568 Protein Labeling Kit(Molecular Probes)を用いて、AAV9由来中空カ
プシドを蛍光標識した。具体的な標識方法については、添付のプロトコルに従った。続い
て、ヒト線維芽細胞(WI-38)株にMyoD発現アデノウイルスベクター(MOI=10)を感染させて
筋分化誘導した細胞と、誘導処理しない細胞のそれぞれに、前記蛍光標識したAAV9中空カ
プシドを投与した。MyoD発現アデノウイルスベクターでの感染から4日後、AAV9中空カプ
シド投与から16時間後に細胞における蛍光を観察した。なお、AAV9の標的細胞は筋細胞で
ある。
図5に結果を示す。Aは筋分化非誘導処理のWI-38株を、Bは筋分化誘導処理後のWI-38株
を、それぞれ示す。未分化のWI-38細胞では、わずかな蛍光しか観察されなかった(図5A
)が、筋分化したWI-38細胞では細胞質や核膜周囲に強い蛍光が観察された(図5B)。す
なわち、蛍光標識したAAV9中空カプシドは、筋分化細胞に親和性が高く、細胞内では核膜
周囲に集積していることが確認された。この結果は、中空カプシド等が標的細胞特異性な
送達活性を有していることを示している。
にとり入れるものとする。
Claims (1)
- アデノ随伴ウイルス(AAV)の中空カプシド又は該ウイルス粒子の精製方法であって、 AAVの中空カプシド又は該ウイルス粒子を生産した、ヘルパーウイルスに未感染の宿主細胞の培養液及び/又は該宿主細胞の抽出液を加熱する工程、及び
加熱後の前記培養液及び/又は前記細胞抽出液から遠心又は濾過によって凝固タンパク質を除去する工程
を含み、
ここで、前記加熱温度が45℃以上55℃未満であって、かつ加熱時間が10分〜90分であり、又は加熱温度が55℃以上60℃以下であって、かつ加熱時間が3分〜30分である
前記精製方法。
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