JP5861001B2 - 非エンベロープウイルスの製造方法 - Google Patents
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Description
ウイルス産生が達成されたウイルス産生細胞は、その後、回収、破砕され、得られたrAAVベクターを含む細胞破砕液を適宜フィルターろ過、超遠心、クロマトグラフィー、又は限外ろ過等の工程に供することによってrAAVベクターが精製され、最終製造物となる。
[1]非エンベロープウイルスの製造方法であって、
(a)非エンベロープウイルスを産生する能力を有する細胞を培養する工程、
(b)前記細胞と酸性の溶液とを接触させる工程、及び
(c)非エンベロープウイルスを取得する工程、
を含む、方法、
[2]酸性の溶液が、pH3.0〜6.9である[1]に記載の方法、
[3]酸性の溶液が、更にナトリウムイオン及び/又はカリウムイオンを含有することを特徴とする[1]または[2]に記載の方法、
[4](c)の工程が、非エンベロープウイルスを精製する工程を含む[1]〜[3]のいずれか1つに記載の方法、
[5]非エンベロープウイルスを精製する工程が、超遠心、クロマトグラフィー、及び限外ろ過から選択される操作により実施される[4]に記載の方法、
[6]非エンベロープウイルスがアデノ随伴ウイルスベクターである[1]〜[5]のいずれか1つに記載の方法、
[7]酸性の溶液がカチオン、及びクエン酸を含むことを特徴とする[1]〜[6]のいずれか1つに記載の方法、
に関する。
一過性に導入する方法には特に限定はなく、公知の一過性導入方法、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、ポリエチレンイミン法、エレクトロポレーション法等が使用可能である。また市販の試薬、例えばTransIT(登録商標)−293 Reagent、TransIT(登録商標)−2020(以上、Mirus社製)、Lipofectamine 2000 Reagent、Lipofectamine 2000CD Reagent(以上、ライフテクノロジーズ社製)、FuGene(登録商標)Transfection Reagent(プロメガ社製)等を用いてもよい。また、バキュロウイルスを用いた昆虫細胞を利用した導入法を利用することもできる。
また恒常的に導入する方法には特に限定はなく、公知の恒常的導入方法、例えばレトロウイルスベクターを用いる方法、プラスミドの一過性導入方法と同様の方法で導入し、染色体に組み込まれた細胞を選択する方法等が使用可能である。レトロウイルスベクターを用いる方法においては、市販の試薬、例えばRetorovirus Constructive System(タカラバイオ社製)を用いてもよい。
感染力価の測定方法としては、例えば非エンベロープウイルスの系列希釈液を適当な標的細胞に感染させ、細胞の形状変化(細胞変性)を検出する方法、導入遺伝子の発現を検出する方法、細胞に導入されたウイルスゲノムのコピー数を測定する方法等が例示される。
非エンベロープウイルスを構成するタンパク質量(あるいはタンパク質純度)を測定する方法としては、例えば当該タンパク質を免疫的手法で定量する方法等が例示される。
非エンベロープウイルスの粒子形成に必須な要素を供給する核酸を含むベクター、
非エンベロープウイルスの粒子に封入される核酸を含むベクター、および
酸性の溶液、
を含むキットが提供される。前記キットは、得られた非エンベロープウイルス含有溶液を中和するための中和液をさらに含んでいてもよい。
酸性の溶液、および
中和用の溶液、
を含むキットであってもよい。
酸性の溶液、
中和用の溶液、
ウイルス精製用カラム、および
カラム精製操作に使用される各種の緩衝液、
を含むキットであってもよい。
(1)rAAVベクター製造用細胞の播種
細胞培養用10cmディッシュ(コーニング社製)2枚に、10%FBS(ニチレイバイオサイエンス社製)を含むDMEM/F12(ギブコ社製)に懸濁した293細胞を播種した。その後、37℃のCO2インキュベーターで終夜培養し、細胞がおよそ70%コンフルエントになっていることを確認した。
実施例1−(1)で得られた細胞に、リン酸カルシウム法を用いて、2型AAV(以下、AAV2)のRepタンパク質、及びCapタンパク質をコードするpRCプラスミド(Cell Bio Labs社製)、アデノウイルスのE2A、VA、V4配列を含むpHLPプラスミド(Cell Bio Labs社製)、AAV2の2つのITRの間に蛍光タンパク質AcGFP1の発現カセットとして「CMVプロモーター配列、AcGFP1をコードする配列、PolyA配列」を含むpAAV−AcGFPプラスミドをそれぞれ23.1μgずつトランスフェクションした。トランスフェクション7時間後、培地を完全に除去し、DMEM/F12をディッシュ1枚当たり15mL添加し、37℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例1−(2)で得られたディッシュから培地を完全に除去した後、20mM EDTA(和光純薬社製)を含むPBS(ギブコ社製)3mLを各ディッシュへ添加し、室温で数分間反応させることで細胞を剥離させた。その後、溶液ごと細胞を回収し、1,750×g、4℃、10分間遠心後、上清を除去した。細胞ペレットを4mLのPBSで再懸濁し、2mLずつ2本の遠心管に分注した。それぞれの遠心管を1,750×g、4℃、10分間遠心後、上清を除去した。
実施例1−(3)で得られた遠心管の一方にPBSを1mL添加し、超音波破砕装置(ビーエム機器社製)で破砕、休止のサイクルを5回繰り返し、rAAVベクターを含む破砕液を調製した。破砕液を14,000×g、4℃、10分間遠心後、その上清を回収してrAAVベクターの粗抽出液とした。
実施例1−(3)で得られた遠心管のもう一方に酸性の溶液としてACD−A液(テルモ社製)を1mL添加し、15秒間ボルテックスミキサーで混和を行い、37℃ウォーターバスで5分間静置、再び15秒間ボルテックスミキサーで混和を行った。その後、14,000×g、4℃、10分間遠心した。得られた上清を粗抽出液とした。なお、ACD−A液の組成は、2.2w/v% クエン酸ナトリウム水和物、0.8w/v% クエン酸水和物、2.2w/v% ブドウ糖であり、pHは4.5〜5.5である。
実施例1−(4)、及び実施例1−(5)で調製した粗抽出液2μLをDNaseIバッファー(タカラバイオ社製)で50倍希釈した後、説明書に記載の濃度のDNaseI(タカラバイオ社製)で処理し、遊離のゲノムDNAやプラスミドDNAを除去した。その後、DNaseIを不活化するために75℃、30分間の熱処理を行って、DNaseI処理済みのrAAVベクター含有溶液を得た後、4℃あるいは−20℃にて保存した。このDNaseI処理済みのrAAVベクター含有溶液100μLに、buffer AL(キアゲン社製)を100μL添加し、56℃、10分間処理した。この溶液を注射用水(大塚製薬社製)で100倍希釈し、この希釈液2μLをrAAVベクターのゲノム力価測定に使用した。ゲノム力価測定にはSYBR Premix ExTaqII(タカラバイオ社製)を使用し、反応液の調製等の操作はキット添付の説明書に従った。標準品としては、pAAV−AcGFPプラスミドを制限酵素EcoRI(タカラバイオ社製)で消化し、線状化したDNAを用いた。なお、リアルタイムPCRに用いたプライマー配列は、AcGFP1発現カセットに搭載されたCMVプロモーター配列にアニーリングする配列とした。更に、実施例1−(4)、及び実施例1−(5)で調製した粗抽出液のタンパク質濃度をNanoDrop1000(Thermo Fisher Scientific社製)のタンパク質濃度測定モードにてA280を測定した。これらの結果を表1に示す。
(1)rAAVベクターの産生とACD−A液による粗抽出液の取得
実施例1−(1)〜(3)と同様の方法でrAAVベクター産生細胞を回収した。ただし本実施例では、培養容器をCellBIND(登録商標)T225フラスコ(コーニング社製)に変更し、付随する反応系をこれに合わせてスケールアップした。回収した細胞ペレットに10mLのACD−A液を加え、15秒間ボルテックスミキサーで混和を行い、37℃ウォーターバスで5分間静置、再び15秒間ボルテックスミキサーで混和を行い、その後、14,000×g、4℃、10分間遠心した。得られた上清を粗抽出液とした。また、比較対照として、同じ条件で培養したrAAVベクター産生細胞より一般的なrAAVベクターの抽出法である凍結融解法を用いて粗抽出液を調製し、それをベンゾナーゼ(登録商標)(メルクミリポア社製)処理(終濃度250U/mL)した後、2回超遠心を行って精製したrAAVベクター液を用いた。
実施例2−(1)で得られた粗抽出液を14,000×g、4℃、20分間遠心し、上清を回収した。回収した上清をポアサイズ0.2μmのポジダインフィルター(ポール社製)でろ過し、これを粗精製物とした。
実施例2−(2)で得られた粗精製物をウルトラクリアチューブ(ベックマン・コールター社製)に入れ、塩化セシウムを用いた密度勾配超遠心法にて常法により精製を行った。
実施例2−(3)で得られた超遠心後のチューブの最下部を注射針で穿孔し、流出してくる液を3〜6滴ずつ回収した。目視できる浮遊物が混入した時点で回収を終了し、それぞれの画分の屈折率(RI)を屈折率計(Reichert社製)で測定した。
実施例2−(4)で得られた画分のゲノム力価を実施例1−(6)と同様の方法で測定した。結果を2−(4)で測定した屈折率とともに表2に示す。
実施例2−(4)で得られた画分の中でrAAVベクター集積が特に高かった画分5〜10を透析膜(Thermo社製)に入れ、PBSにて透析を行った。得られた各画分のそれぞれ10μLに2×サンプルバッファー(タカラバイオ社製)を10μL加えて混合し、95℃、5分間処理を行った。比較対照として、実施例2−(1)で示した凍結融解法にて精製したrAAVベクター液を用いた。各処理液10μLを12.5%ポリアクリルアミドゲル(アトー社製)にアプライし電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルを適当量のOriole蛍光ゲルステイン溶液(バイオラッド社製)に浸し、遮光して90分間振とうした。振とう後のゲルをLuminoshot400(タカラバイオ社製)にて撮影した。その結果を図1に示す。
実施例2−(1)で得られたACD−A液処理による粗抽出液、実施例2−(2)で得られた超遠心精製前の粗精製物、実施例2−(6)の透析後の画分6と画分10、及び比較対照として、実施例2−(1)で得られた凍結融解法精製rAAVベクター液のdsDNA量をPicoGreen dsDNA Quantitation Kit(インビトロジェン社製)に記載のプロトコルに従って測定した。結果を表3に示す。
(1)クロマトグラフィー用粗抽出液の調製
実施例2−(1)及び(2)と同様の方法で粗精製物を調製した。この粗精製物を注射用水(大塚製薬社製)にて5倍希釈しアプライ用サンプルとした。
シリンジ(テルモ社製)、ポアサイズ0.2μmのポジダインフィルター、陽イオン交換膜(Mustang S;ポール社製)の順で接続し、陽イオン交換クロマトグラフィー装置とした。注射用水で5倍希釈したACD−A液をシリンジに5mL充てんし、1分間におよそ4mLの流速になるよう通液した。次にシリンジを交換し、実施例3−(1)で調製したアプライ用サンプル10mLを同様に通液した。この時の透過液をフロースルーとして回収した。シリンジを交換し、注射用水5倍希釈したACD−A液5mLを同様に通液した。この時の透過液をウォッシュ液として回収した。更にシリンジを交換しそれぞれ(1)50mM グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(pH9)、(2)PBS、(3)2M NaClを3mLずつ同様の流速で通液した。この時の透過液を(1)溶出液1、(2)溶出液2、(3)溶出液3とした。
実施例3−(2)で得られた各画分のゲノム力価を実施例1−(6)と同様の方法で測定した。結果を表4に示す。
実施例3−(2)で得られた各溶出液を透析膜(Thermo社製)に入れ、PBSにて透析を行い、実施例2−(6)と同様の方法でタンパク質純度の測定を行った。比較対照として、実施例2−(4)にて酸性の溶液で抽出後、超遠心精製されたrAAVベクター(画分10)も同様に純度測定を行った。結果を図2に示す。
(1)rAAVベクター産生細胞の回収
実施例1−(1)〜(3)と同様の方法でrAAVベクター産生細胞を回収した。ただし本実施例では培養容器をCellBIND(登録商標)T75フラスコ(コーニング社製)に変更し、付随する反応系をこれに合わせてスケールアップした。
実施例4−(1)で得られたrAAVベクター産生細胞にACD−A液1mLを加えた。15秒間ボルテックスミキサーで混和した後、(1)37℃、(2)21℃、(3)4℃にて5分間静置し、更に15秒間ボルテックスミキサーで混和した後、14,000×g、4℃、10分間遠心した。得られた上清を粗抽出液とした。
実施例4−(2)で得られた各粗抽出液のゲノム力価を実施例1−(6)と同様の方法で測定した。結果を表5に示す。
(1)rAAVベクター産生細胞の回収
実施例4−(1)と同様の方法でrAAVベクター産生細胞を回収した。ただし本実施例では宿主とする細胞を293T細胞に変更した。
実施例5−(1)で得られたrAAVベクター産生細胞から以下の3条件で粗抽出液を取得した。超音波破砕については実施例1−(4)と同様の方法で抽出を行った。ACD−A液処理については実施例1−(5)と同様の方法で抽出を行った。凍結融解に関しては300μLのPBSに細胞ペレットを再懸濁し、「ドライアイス・エタノール溶液で5分間静置、37℃ウォーターバスで3分間静置、ボルテックスミキサーで1分間混和」の処理を3回繰り返すことで、rAAVベクターを含む細胞破砕液を調製した。この細胞破砕液を14,000×g、4℃、20分間遠心後、その上清を回収して700μLのPBSを添加し、粗抽出液とした。
実施例5−(2)で得られた各粗抽出液のゲノム力価を実施例1−(6)と同様の方法で測定した。結果を表6に示す。
(1)ACD−A液と等価のクエン酸バッファー調製、及び各塩濃度のクエン酸バッファー調製
実施例5−(1)と同様の方法でrAAVベクター産生細胞を回収した。回収した細胞に実施例6−(1)で調製した各バッファー、及びACD−A液を加え、実施例1−(5)と同様の方法で粗抽出液を取得した。比較対照として、実施例1−(4)と同様の方法で、超音波破砕による粗抽出液も調製した。
実施例6−(2)で得られた各粗抽出液のゲノム力価を実施例1−(6)と同様の方法で測定した。結果を表7に示す。
HT1080細胞を5×10^4cells/wellとなるよう10%FBSを含むDMEM(シグマ社製)に懸濁し、24ウェルプレート(コーニング社製)に1mLずつ播種し37℃のCO2インキュベーターで培養した。翌日、実施例6−(2)で得られた各rAAVベクターを含む粗抽出液を各ウェルに2μLずつ添加し、感染させた。2日後、トリプルセレクト(インビトロジェン社製)で細胞を分散した後、FACS CantoII(ベクトン・ディッキンソン社製)を用いて、rAAVベクター感染によって導入された蛍光タンパク質(AcGFP1)を発現している細胞を検出し、AcGFP1陽性細胞の割合(%)を算出した。この値は各粗抽出液中のrAAVベクターの感染力価とみなすことができる。結果を表8に示す。
(1)rAAVベクター産生細胞の培養
実施例1−(1)〜(2)と同様の方法でrAAVベクター産生細胞を培養した。ただし本実施例では、培養容器をCellBIND(登録商標)T225フラスコ(コーニング社製)に変更し、付随する反応系をこれに合わせてスケールアップした。
トランスフェクション48時間後のrAAVベクター産生細胞に0.5M EDTA(pH8.0)を添加し、10分間静置した後にrAAVベクター産生細胞を回収した。回収した細胞を1,750×g、4℃、10分間遠心を行い、遠心後に上清を完全に除いた。その後、細胞ペレットに2mLの実施例6−(1)で調製したクエン酸バッファー+50mM NaClを添加し、ボルテックスミキサーで混和後に5分間静置させ、再度ボルテックスミキサーで混和を行った後に1,750×g、4℃、10分間遠心を行い、上清を回収した。回収した上清に、中和を目的に1/13量の2M Tris−Cl(pH9.5)を添加し、更に1/100量の1M MgCl2を添加した溶液を粗抽出液とした。また、上記細胞ペレットに2mLのDMEMを添加し、液体窒素と37℃ウォーターバスで3回の凍結融解を行うことにより得た溶液を粗抽出液(比較対照)として用いた。
実施例7−(2)で得られた各粗抽出液にCold−active Nuclease(タカラバイオ社製)を終濃度0.2unit/μLになるように添加して、37℃、30分間反応させた。反応後2,380×g、4℃、10分間遠心を行い、上清を回収した。回収した上清に1/10量の5%デオキシコール酸ナトリウムを添加し、37℃で30分間反応させた。反応後、2,380×g、4℃、10分間遠心し、上清をアプライ用サンプルとした。
0.7mLのヘパリン樹脂(日本ポール社製)50% スラリーをHisTALON Gravity Columns(クロンテック社製)へ添加し、ヘパリン樹脂カラムを作製した。その後、ヘパリン樹脂カラムを3.5mLのPBSで平衡化し、上記のアプライ用ウイルスサンプルを2.8mLアプライした。3.5mLの終濃度0.1M NaClを追加添加したPBSで樹脂を洗浄し、洗浄後に1mLの終濃度0.4M NaClを追加添加したPBSを通液した。この時の透過液を、rAAVベクターを含む溶出液として回収した。rAAVベクターを含む溶出液を、アミコンウルトラ(Amicon Ultra)−0.5遠心式フィルターユニット ウルトラセル(Ultracel)−100メンブレン(ミリポア社製)に添加後、2,000×g、4℃、5分間遠心し、脱塩、濃縮を行った。同様の操作を繰り返し、すべての溶出液を脱塩、濃縮した後、0.5%ソルビトールを含むPBS200μLでメンブレン上のrAAVベクターを回収した。回収したrAAVベクター液はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で純度を確認した。結果を図3に示す。
(1)酸性バッファーの調製
rAAVベクター粗抽出液の取得用バッファーとして53.4mMのクエン酸と53.4mMのクエン酸ナトリウムを含むクエン酸バッファー(pH4.2)を調製した。このバッファーに、更に終濃度200mM、400mM、600mM、800mM、1.0M、1.5M、2.0M、2.5Mとなるように塩化ナトリウムを加えたバッファーも用意し、粗抽出液の取得に用いた。
実施例5−(1)と同様の方法でrAAVベクター産生細胞を回収した。回収した細胞に実施例8−(1)で調製した各バッファー、及びACD−A液を加え、実施例1−(5)と同様の方法で粗抽出液を取得した。
実施例8−(2)で得られた各粗抽出液のゲノム力価を実施例1−(6)と同様の方法で測定した。結果を表9に示す。
(1)クエン酸バッファーによる粗抽出液の取得
実施例6−(2)と同様の方法でrAAVベクターを含む粗抽出液を取得した。ただし本実施例では、抽出バッファーとして実施例6−(1)の方法で調製したクエン酸バッファー+200mM NaClを用いた。
実施例9−(1)で得られたrAAVベクターを含む粗抽出液に1/10量の1Mクエン酸溶液を加えてよく懸濁し、4℃で60分間静置した。静置後、1,750×g、4℃、20分間遠心を行い、その上清を回収し、クエン酸沈殿後液とした。
粗抽出液とクエン酸沈殿後液のゲノム力価、及びタンパク質濃度(A280)を実施例1−(6)と同様の方法で測定した。結果を表10に示す。
(1)各種酸性の溶液での粗抽出液の取得
実施例6−(2)と同様の方法でrAAVベクターを含む粗抽出液を取得した。ただし本実施例では、抽出バッファーとして実施例6−(1)の方法で調製した「クエン酸バッファー+200mM NaCl((i)、及び(ii))」、又は「クエン酸バッファー+200mM NaClにあらかじめ1/10量の1Mクエン酸を添加した溶液((iii))」を用いた。比較対照として、実施例1−(4)と同様の方法で、超音波破砕による粗抽出液も調製した((iv))。
実施例10−(1)で得られた粗抽出液(i)〜(iv)の一部を分取し、Before液(i)〜(iv)とした。粗抽出液(ii)の残りには、1/10量の1Mクエン酸溶液を加えてよく懸濁し、4℃で60分間静置した。一方、粗抽出液(i)、粗抽出液(iii)、及び粗抽出液(iv)の残りには、それぞれの抽出時に用いた溶液1/10量を加えてよく懸濁し、4℃で60分間静置した。静置後、1,750×g、4℃、20分間遠心し、その上清を回収し、After液(i)〜(iv)とした。
Before液(i)〜(iv)とAfter液(i)〜(iv)のゲノム力価、及びタンパク質濃度(A280)を実施例1−(6)と同様の方法で測定した。更に、「ゲノム力価/A280測定値」を算出し、AAV純度とした。結果を図4−1〜図4−3に示す。
Claims (5)
- アデノ随伴ウイルスの製造方法であって、
(a)アデノ随伴ウイルスを産生する能力を有する細胞を培養する工程、
(b)培地を除去後、前記細胞と酸性の溶液とを接触させる工程、及び
(c)アデノ随伴ウイルスを取得する工程、
を含み、前記酸性の溶液がpH3.0〜6.9である、方法。 - 酸性の溶液が、更にナトリウムイオン及び/又はカリウムイオンを含有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- (c)の工程が、アデノ随伴ウイルスを精製する工程を含む請求項1または2に記載の方法。
- アデノ随伴ウイルスを精製する工程が、超遠心、クロマトグラフィー、及び限外ろ過から選択される操作により実施される請求項3に記載の方法。
- 酸性の溶液がカチオン、及びクエン酸を含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
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