WO2014192877A1 - 洗浄用組成物、タンパク質精製方法、及びタンパク質 - Google Patents

洗浄用組成物、タンパク質精製方法、及びタンパク質 Download PDF

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WO2014192877A1
WO2014192877A1 PCT/JP2014/064284 JP2014064284W WO2014192877A1 WO 2014192877 A1 WO2014192877 A1 WO 2014192877A1 JP 2014064284 W JP2014064284 W JP 2014064284W WO 2014192877 A1 WO2014192877 A1 WO 2014192877A1
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WO
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group
carbon atoms
cleaning composition
composition according
target protein
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Application number
PCT/JP2014/064284
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English (en)
French (fr)
Inventor
知範 塩谷
優子 河田
友亮 岡野
佑紀 平井
勇 大谷
Original Assignee
Jsr株式会社
Ｊｓｒライフサイエンス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Definitions

  • the present invention relates to a cleaning composition, a protein purification method, and a protein.
  • Antibodies are an important element for the immune system of many animals, especially humans. Recent advances in recombination technology have made it possible to produce antibodies against cancer cells, bacteria, and viruses. For example, antibodies are produced using cell lines that are designed to be expressed at high levels. The engineered cell lines are also cultured in cultures containing various proteins including saccharides, amino acids, complex mixtures of growth factors, serum proteins and the like.
  • An object of the present invention is to provide a cleaning composition having excellent impurity removal performance used in a process for separating and purifying a target protein.
  • a cleaning composition used in a process for separating and purifying a target protein from a mixed solution containing the target protein and impurities and one type selected from the following components (A), (B) and (C) Or the composition for washing
  • C Amide solvent
  • ⁇ 2> a binding step in which a ligand immobilized on a solid phase is brought into contact with a mixed solution containing the target protein and impurities, and the ligand and the protein in the mixed solution are bound;
  • a recovery process for recovering the target protein A protein purification method comprising:
  • ⁇ 3> A target protein purified by the purification method of ⁇ 2> above.
  • the cleaning composition of the present invention exhibits excellent impurity removal performance when used in a process for separating and purifying a target protein. Therefore, according to the protein purification method of the present invention, impurities can be efficiently removed. In addition, the target protein purified by the purification method has few impurities.
  • the cleaning composition of the present invention is a cleaning composition used in a process for separating and purifying a target protein from a mixed solution containing the target protein and impurities, and includes the following components (A), (B) and (C) 1) or 2 or more types selected from the above.
  • a cationic surfactant selected from a quaternary ammonium salt type cationic surfactant having an organic group having 5 or more carbon atoms and an amine salt type cationic surfactant having an organic group having 5 or more carbon atoms.
  • B Hydroxy acid ester
  • Amide solvent a quaternary ammonium salt type cationic surfactant having an organic group having 5 or more carbon atoms.
  • the cationic surfactant of component (A) is a quaternary ammonium salt type cationic surfactant having an organic group having 5 or more carbon atoms, and an amine salt type cationic surfactant having an organic group having 5 or more carbon atoms. It is selected from agents.
  • the amine salt type cationic surfactant may be any of primary to tertiary amine salt types.
  • a quaternary ammonium salt type cationic having an organic group having 5 or more carbon atoms is preferred, and a quaternary ammonium salt type cationic surfactant represented by the following formula (1) (hereinafter also referred to as a cationic surfactant (1)) is more preferred.
  • R 1 represents an organic group having 5 or more carbon atoms
  • R 2 , R 3 and R 4 each independently represents an organic group
  • n represents an integer of 1 or more
  • Z n ⁇ represents an n-valent anion.
  • R 1 represents an organic group having 5 or more carbon atoms.
  • the carbon number means an average carbon number.
  • the average number of carbon atoms can be calculated by calculating the total number of carbon atoms of R 1 of all molecules corresponding to the cationic surfactant (1) and converting the number of carbon atoms per molecule (of R 1 of all molecules). Total number of carbons / number of molecules).
  • Examples of the organic group represented by R 1 include a hydrocarbon group having 5 to 30 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 5 to 30 carbon atoms, and a total carbon in which some of the hydrogen atoms of the hydroxyalkyl group are substituted with hydrocarbon groups.
  • a group of several 5 to 30, a polyoxyalkylene group having an average addition mole number of 10 or less and a carbon number of 5 or more, a part of hydrogen atoms of a polyoxyalkylene group having an average addition mole number of 10 or less is a hydrocarbon group
  • a substituted group having 5 to 30 total carbon atoms is preferred.
  • the carbon number of the hydrocarbon group having 5 to 30 carbon atoms in R 1 is preferably from the viewpoint of impurity removal performance and from the viewpoint of facilitating reuse of the solid phase washed with the cleaning composition of the present invention. It is 6 to 24, more preferably 8 to 22, still more preferably 9 to 20, still more preferably 10 to 18, and particularly preferably 10 to 16.
  • Examples of the hydrocarbon group include an alkyl group, an alkenyl group, and an aralkyl group.
  • the alkyl group may be linear or branched.
  • the alkenyl group may be linear or branched.
  • a decenyl group for example, a decenyl group, an undecenyl group, a dodecenyl group, a tetradecenyl group, a hexadecenyl group, etc. are mentioned.
  • the aralkyl group include a benzyl group and a phenethyl group.
  • the number of carbon atoms of the hydroxyalkyl group in R 1 is 5-30.
  • the recovered target protein From the viewpoint of suppressing the contamination of the cleaning composition to a low level, it is preferably 6 to 24, more preferably 8 to 22, still more preferably 9 to 20, still more preferably 10 to 18, particularly preferably 10 to 16. is there.
  • the alkyl group contained in the hydroxyalkyl group include the same alkyl groups as those described above.
  • the polyoxyalkylene group having an average added mole number of R 1 of 10 or less and a carbon number of 5 or more includes — (CH 2 CH 2 O) p H (p represents an integer of 3 to 10; From the viewpoint of performance, the viewpoint of facilitating the reuse of the solid phase washed with the cleaning composition of the present invention, and the viewpoint of suppressing the contamination of the cleaning composition into the recovered target protein, preferably 5 A polyoxyethylene group represented by the formula (8) is preferred.
  • the total number of carbons is 5 to 30, but from the viewpoint of impurity removal performance, from the viewpoint of facilitating the reuse of the solid phase washed with the washing composition of the present invention, the washing composition for the recovered target protein From the viewpoint of suppressing the mixing of substances to a low level, it is preferably 8 to 26, more preferably 9 to 25, still more preferably 12 to 24, still more preferably 14 to 22, and particularly preferably 16 to 20.
  • the polyoxyalkylene group is — (CH 2 CH 2 O) q H (q represents an integer of 1 to 10, preferably an integer of 1 to 7, more preferably an integer of 1 to 4, A polyoxyethylene group represented by 1 or 2 is preferred.
  • the hydrogen atom in the hydroxyl group contained in a hydroxyalkyl group or a polyoxyethylene group is preferable.
  • the hydrocarbon group is preferably an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, or an alkylaryl group, more preferably an alkylaryl group.
  • the alkylaryl group is preferably an alkylaryl group having 7 to 20 carbon atoms, more preferably an alkylphenyl group having 10 to 18 carbon atoms, and still more preferably an alkylphenyl group having 12 to 16 carbon atoms.
  • (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl group and the like can be mentioned.
  • Examples of the group in which a part of the hydrogen atoms of the polyoxyalkylene group having an average addition mole number of 10 or less are substituted with a hydrocarbon group include those represented by the following formula.
  • q in a formula is synonymous with the above.
  • R 2 , R 3 and R 4 each independently represents an organic group.
  • R 2 , R 3 and R 4 include a hydrocarbon group having 1 to 30 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 30 carbon atoms, and a total carbon in which some of the hydrogen atoms of the hydroxyalkyl group are substituted with hydrocarbon groups. 2 or more groups, polyoxyalkylene group having an average addition mole number of 10 or less, polyoxyalkylene group having an average addition mole number of 10 or less, and a total of 2 or more carbon atoms in which some hydrogen atoms are substituted with hydrocarbon groups Is preferred.
  • Examples of the hydrocarbon group having 1 to 30 carbon atoms in R 2 include an alkyl group, an alkenyl group, and an aralkyl group.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group in R 2 is preferably 1 to 12, more preferably 1 to 8, and even more preferably 1 to 4, from the viewpoint of suppressing the contamination of the recovered composition with the recovered target protein to a low level. 1 to 3 are more preferable, and 1 or 2 is particularly preferable.
  • the alkyl group may be linear or branched. Examples thereof include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, and an isobutyl group.
  • the number of carbon atoms of the alkenyl group in R 2 is preferably 2 to 12, more preferably 2 to 8, and even more preferably 2 to 4 from the viewpoint of suppressing the contamination of the washing composition into the recovered target protein to a low level. 2 or 3 is more preferable.
  • the alkenyl group may be linear or branched. Examples include ethenyl group, 1-propenyl group, 2-propenyl group, 1-butenyl group and the like.
  • the carbon number of the aralkyl group in R 2 is preferably 7 to 20, more preferably 7 to 10, and still more preferably 7 or 8.
  • Examples of the aralkyl group include a benzyl group and a phenethyl group.
  • the number of carbon atoms of the hydroxyalkyl group in R 2 is 1 to 30, but 1 to 12 is preferable and 1 to 8 is more preferable from the viewpoint of suppressing the contamination of the cleaning composition into the recovered target protein. 1 to 4 is more preferable, 1 to 3 is more preferable, and 1 or 2 is particularly preferable.
  • the alkyl group contained in the hydroxyalkyl group the same alkyl groups represented by R 2 above and the like. Examples of the hydroxyalkyl group contained in a group in which part of the hydrogen atoms of the hydroxyalkyl group are substituted with a hydrocarbon group include the same hydroxyalkyl groups as those described above.
  • Examples of the polyoxyalkylene group having an average addition mole number of R 2 of 10 or less include — (CH 2 CH 2 O) r H (r represents an integer of 1 to 10, preferably 1 to 7.
  • examples of the polyoxyalkylene group contained in a group in which part of the hydrogen atoms of the polyoxyalkylene group having an average addition mole number of 10 or less are substituted with a hydrocarbon group include the same polyoxyalkylene groups as those described above. .
  • R 2 as the substitution position of the hydrocarbon groups substituted with hydroxyalkyl groups and polyoxyalkylene groups, a hydrogen atom in the hydroxyl group contained in the hydroxyalkyl group or a polyoxyethylene group.
  • the hydrocarbon group is preferably an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, or an alkylaryl group, more preferably an alkylaryl group.
  • the alkylaryl group is preferably an alkylaryl group having 7 to 20 carbon atoms, more preferably an alkylphenyl group having 10 to 18 carbon atoms, and still more preferably an alkylphenyl group having 12 to 16 carbon atoms.
  • An example is (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl group.
  • R 2 it is easy to reuse the solid phase washed with the cleaning composition of the present invention from the viewpoint of suppressing the contamination of the cleaning composition into the recovered target protein to a low level, the viewpoint of impurity removal performance, and the cleaning composition of the present invention.
  • a hydrocarbon group having 1 to 30 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 30 carbon atoms, and a polyoxyalkylene group having an average addition mole number of 10 or less are preferable, and a hydrocarbon group having 1 to 30 carbon atoms Are more preferable, and an alkyl group and an aralkyl group are particularly preferable.
  • R 3 and R 4 are preferably hydrocarbon groups having 1 to 30 carbon atoms.
  • the number of carbon atoms of the hydrocarbon group in R 3 and R 4 is preferably 1 to 12, more preferably 1 to 8, more preferably 1 to 8, from the viewpoint of suppressing the contamination of the cleaning composition into the recovered target protein. 4 is more preferable, 1 to 3 is more preferable, and 1 or 2 is particularly preferable.
  • an alkyl group is preferable.
  • the alkyl group may be linear or branched. Examples thereof include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, and an isobutyl group.
  • the relationship between the carbon numbers of R 1 to R 4 depends on the impurity removal performance, facilitates the reuse of the solid phase washed with the cleaning composition of the present invention, and washes the recovered target protein.
  • the carbon number of R 2 ⁇ R 3 and the carbon number of R 2 ⁇ R 4 , and the carbon number of R 1 and R 2 Is preferably 10 or more.
  • the total number of carbon atoms of R 1 and R 2 is preferably 10 to 26, more preferably 12 to 24, and particularly preferably 12 to 22.
  • n means the valence of an atom or atomic group serving as a counter anion and represents an integer of 1 or more. n is preferably 1.
  • Z (atom or atomic group), specifically, in addition to a halogen atom, CH 3 SO 4 , CH 3 CH 2 SO 4 , OH, an atomic group derived from an amino acid, a fatty acid
  • a halogen atom CH 3 SO
  • cationic surfactants (1) those represented by the following formula (2) or (3) are preferable from the viewpoint of impurity removal performance.
  • these from the viewpoint of facilitating the reuse of the solid phase washed with the cleaning composition of the present invention, from the viewpoint of suppressing the contamination of the washing composition into the recovered target protein to a low level, and from the viewpoint of safety What is represented by Formula (2) is more preferable.
  • R 5 represents a hydrocarbon group having 5 to 30 carbon atoms or
  • a group represented by R 6 and R 7 each independently represent a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, n and Z n- are as defined above. ]
  • R 8 represents an alkyl group having 9 to 30 carbon atoms
  • R 9 to R 11 each independently represents a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms
  • n and Z n- are as defined above.
  • R 5 is preferably a hydrocarbon group having 5 to 30 carbon atoms from the viewpoint of impurity removal performance.
  • the carbon number means an average carbon number.
  • the average number of carbon atoms can be calculated by calculating the total number of carbon atoms of R 5 of all molecules corresponding to the cationic surfactant (2) and converting the number of carbon atoms per molecule (of R 5 of all molecules). Total number of carbons / number of molecules).
  • the number of carbon atoms of the hydrocarbon group represented by R 5 is determined from the viewpoint of impurity removal performance, the viewpoint of facilitating the reuse of the solid phase washed with the washing composition of the present invention, and washing to the recovered target protein. From the viewpoint of suppressing the mixing of the composition for use to a low level, it is preferably 6 to 24, more preferably 8 to 22, still more preferably 9 to 20, still more preferably 10 to 18, particularly preferably 10 to 16. Moreover, as said hydrocarbon group, an alkyl group is preferable. The alkyl group may be linear or branched.
  • octyl group nonyl group, decyl group, undecyl group, 1-methyldecyl group, dodecyl group, 1-methylundecyl group, 1-ethyldecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group, hexadecyl group, octadecyl group, etc.
  • decyl group 1-methyldecyl group
  • dodecyl group 1-methylundecyl group
  • 1-ethyldecyl group tridecyl group
  • tetradecyl group pentadecyl group, hexadecyl group, octadecyl group, etc.
  • R 6 and R 7 each independently represent a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms.
  • the number of carbon atoms of the hydrocarbon group is preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 or 2, from the viewpoint of suppressing the contamination of the washing composition into the collected target protein at a low level.
  • the hydrocarbon group represented by R 6 and R 7, the alkyl group.
  • the alkyl group may be linear or branched. Examples thereof include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, and an isobutyl group.
  • R 8 represents an alkyl group having 9 to 30 carbon atoms.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group is determined in terms of impurity removal performance, easy reuse of the solid phase washed with the washing composition of the present invention, and contamination of the washing composition into the recovered target protein. From the viewpoint of suppressing to a low level, it is preferably 6 to 24, more preferably 8 to 22, further preferably 9 to 20, still more preferably 10 to 18, still more preferably 10 to 16, and further preferably 10 to 14. And particularly preferably 11 to 13.
  • the alkyl group represented by R 8 may be linear or branched.
  • octyl group nonyl group, decyl group, undecyl group, 1-methyldecyl group, dodecyl group, 1-methylundecyl group, 1-ethyldecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group, hexadecyl group, octadecyl group, etc.
  • decyl group 1-methyldecyl group
  • dodecyl group 1-methylundecyl group
  • 1-ethyldecyl group tridecyl group
  • tetradecyl group pentadecyl group, hexadecyl group, octadecyl group, etc.
  • R 9 to R 11 each independently represents a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R ⁇ 6 > in Formula (2) the same thing as R ⁇ 6 > in Formula (2) is mentioned.
  • cationic surfactant examples include octyltrimethylammonium chloride, decyltrimethylammonium chloride, didecyldimethylammonium chloride, dodecyltrimethylammonium chloride, dodecyldimethylbenzylammonium chloride, tetradecyltrimethylammonium chloride, hexadecyltrimethylammonium chloride.
  • cationic surfactants may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration thereof is preferably 0.01% (w / v) or more, more preferably 0.05, in the cleaning composition of the present invention, from the viewpoint of impurity removal performance.
  • % (W / v) or more more preferably 0.1% (w / v) or more, more preferably 0.5% (w / v) or more, particularly preferably 1% (w / v) or more,
  • it is preferably 20% (w / v) or less, more preferably 10% (w / v) or less, and still more preferably 8 % (W / v) or less, more preferably 6.5% (w / v) or less, more preferably 5% (w / v) or less, more preferably 3.5% (w / v) or less, particularly preferably Is 2% (w / v) or less.
  • the hydroxy acid ester is preferably a hydroxy acid ester having 1 to 3 hydroxy groups and 1 to 3 ester bonds in the molecule, and preferably having 1 or 2 hydroxy groups and 1 or 2 ester bonds in the molecule.
  • the hydroxy acid ester possessed by is preferred.
  • the hydroxy acid ester is preferably a hydroxy acid ester derived from a hydroxy acid having 1 to 3 hydroxy groups and 1 to 3 carboxy groups in the molecule, and 1 or 2 hydroxy groups and 1 or 2
  • a hydroxy acid ester derived from a hydroxy acid having one carboxy group in the molecule is more preferred.
  • hydroxy acid ester examples include glycolic acid ester, lactic acid ester, tartronic acid ester, glyceric acid ester, hydroxybutyric acid ester, malic acid ester, tartaric acid ester, and citric acid ester.
  • ⁇ -hydroxy acid esters are preferable, glycolic acid and lactic acid esters are more preferable, and lactic acid esters are more preferable.
  • the hydroxy acid ester is preferably a hydroxy acid alkyl ester.
  • the alkyl group is preferably an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, more preferably an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and further preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • the alkyl group may be linear or branched, and examples thereof include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, and a tert-butyl group. It is done.
  • ethyl lactate is particularly preferable because it is a pharmaceutical additive that can be administered intravenously or intramuscularly and is safe for humans.
  • the said hydroxy acid ester may be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • the hydroxy acid ester When the hydroxy acid ester is used, its concentration is preferably 1% (v / v) or more, more preferably 5% (v / v) in the cleaning composition of the present invention, from the viewpoint of impurity removal performance. Or more, more preferably 10% (v / v) or more, particularly preferably 15% (v / v) or more, preferably 40% (v / v) or less, more preferably 30% (v / v). ) Or less, more preferably 20% (v / v) or less. Specifically, it is preferably 1 to 40% (v / v), more preferably 5 to 30% (v / v), further preferably 10 to 20% (v / v), and 15 to 20% (v / v). Is particularly preferred.
  • amide solvent a solvent represented by the following formula (4) is preferable.
  • R 21 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • R 22 and R 23 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or In the case where it represents an aryl group and R 21 and R 22 are both alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms, they may be bonded to each other to form a ring structure.
  • R 21 is preferably an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R 22 and R 23 are preferably an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or an aryl group.
  • the alkyl group having 1 to 4 carbon atoms represented by R 21 , R 22 and R 23 may be linear or branched, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n- Examples thereof include a butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, and a tert-butyl group.
  • the aryl group represented by R 22 and R 23 is preferably an aryl group having 6 to 12 carbon atoms.
  • Examples of the ring formed by combining the alkyl group having 1 to 4 carbon atoms represented by R 21 and R 22 with each other include a 2-pyrrolidone ring, a 2-piperidone ring, a 2-caprolactam ( ⁇ -caprolactam) ring, and the like. .
  • amide solvent examples include N, N-dimethylacetamide, N, N-diethylacetamide, N, N-dipropylacetamide, N-methyl-N-ethylacetamide, N-butyl-N-phenylacetamide, N N-dimethylpropanamide, N, N-diethylpropanamide, N-methyl-N-ethylpropanamide, N-methyl-2-pyrrolidone, N-methyl-2-caprolactam, N-ethyl-2-caprolactam, etc.
  • N, N-dimethylacetamide is particularly preferable because it is a pharmaceutical additive that can be administered intravenously or intramuscularly and is safe for humans.
  • amide-type solvent individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • the concentration thereof is preferably 1% (v / v) or more, more preferably 5% (v / v) in the cleaning composition of the present invention from the viewpoint of impurity removal performance. Or more, more preferably 10% (v / v) or more, particularly preferably 15% (v / v) or more, preferably 40% (v / v) or less, more preferably 30% (v / v). ) Or less, more preferably 20% (v / v) or less. Specifically, it is preferably 1 to 40% (v / v), more preferably 5 to 30% (v / v), further preferably 10 to 20% (v / v), and 15 to 20% (v / v). Is particularly preferred.
  • the component (A), the component (B), and the component (C) may be used alone or in combination of two or more of these components. However, when two or more kinds are combined, the impurity removal performance is further improved. Combinations of these components include combinations of component (A) and component (B), combinations of component (A) and component (C), combinations of component (B) and component (C), component (A) and component ( The combination of B) and a component (C) is mentioned.
  • the cleaning composition contains at least component (A) and further contains at least one selected from component (B) and component (C). Compositions are preferred.
  • the content ratio [(A) / (B)] of the component (A) and the component (B) is 0.01 to 10 (W / v) is preferred, 0.05 to 1 (w / v) is more preferred, and 0.05 to 0.5 (w / v) is even more preferred.
  • the content ratio [(A) / (C)] of the component (A) and the component (C) is 0.01 to 10 (W / v) is preferred, 0.05 to 1 (w / v) is more preferred, and 0.05 to 0.5 (w / v) is even more preferred.
  • the cleaning composition of the present invention may contain water; inorganic salts such as sodium phosphate, sodium chloride and sodium sulfate; amino acids; sugars and the like.
  • these other components may be used individually by 1 type, or may be used in combination of 2 or more type.
  • the concentration of the inorganic salt is preferably 1 to 1500 mM, more preferably 5 to 1000 mM, still more preferably 10 to 750 mM, and particularly preferably 200 to 750 mM in the cleaning composition from the viewpoint of impurity removal performance. .
  • the pH at 23 ° C. of the cleaning composition of the present invention is preferably 5 or more, more preferably 6 or more, still more preferably 7 or more, and preferably 9 or less, from the viewpoint of the stability of the target protein. Preferably it is 8 or less.
  • the viscosity of the cleaning composition of the present invention at 23 ° C. is preferably 0.8 to 2.0 mPa ⁇ s, and more preferably 0.8 to 1.6 mPa ⁇ s.
  • the cleaning composition of the present invention is a cleaning liquid composition.
  • the cleaning composition of the present invention is used in a process for separating and purifying a target protein from a mixed solution containing the target protein and impurities. For example, it is used by filling a column container with a solid phase on which a ligand to which a target protein is bound is fixed, and passing a washing composition through it.
  • Separation and purification processes include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel filtration chromatography, and so on. Is preferred.
  • the cleaning composition of the present invention is suitable for antibody purification by affinity chromatography using protein A as a ligand, and is particularly useful as an intermediate cleaning composition in the antibody purification.
  • intermediate washing refers to washing the solid phase in a state in which the target protein is retained in the ligand in order to wash away impurities in the separation and purification process of the target protein such as an antibody.
  • the target protein is preferably an antibody, and more preferably an IgG type antibody containing an Fc region (CH2 / CH3 region (CH2 region and CH3 region)). Moreover, you may use Fc fusion protein and a recombinant protein.
  • the antibodies include antibodies produced in animal cells, chimeric antibodies, and humanized antibodies.
  • the protein purification method of the present invention comprises: A binding step of bringing a ligand immobilized on a solid phase into contact with a mixed solution containing a target protein and impurities, and binding the ligand and the protein in the mixed solution;
  • the cleaning composition of the present invention the solid phase on which the protein-bound ligand is immobilized is washed to remove impurities, and the target protein is washed from the solid phase washed in the washing step using an elution buffer.
  • Recovery process to recover It is characterized by including. Hereinafter, each step will be described.
  • the binding step in the present invention is a step in which a ligand immobilized on a solid phase is brought into contact with a mixed solution containing the target protein and impurities to bind the ligand and the protein in the mixed solution.
  • the material of the solid phase is not particularly limited because the cleaning composition of the present invention can be used for purification using a solid phase of various materials.
  • synthetic polymers natural polymers, silica, glass, etc. Is mentioned.
  • synthetic polymers and natural polymers are preferable.
  • synthetic polymers include polystyrene resins and methacrylate resins
  • natural polymers include those composed of polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose.
  • agarose and methacrylate resin are preferable, and methacrylate resin is more preferable because it is easy to fill the column and scale up.
  • Examples of the shape of the solid phase include particles, hollow fibers, nonwoven fabrics, filters, and monoliths, but particles are preferable.
  • the ligand may be selected in consideration of the affinity with the target protein.
  • proteins such as protein A, protein G, avidin, His tag, GST tag and the like can be mentioned.
  • protein A is particularly preferable because it can be used in the production of an antibody drug. Since the cleaning composition of the present invention hardly dissociates the antibody from protein A, the antibody is recovered very efficiently when the solid phase having protein A as a ligand is washed using the cleaning composition of the present invention. be able to.
  • Examples of the mixed solution containing the target protein and impurities include a culture solution of CHO cells (Chinese hamster ovary protein) containing impurities, a culture solution of hybridoma containing impurities, and a cell disruption solution of recombinant E. coli.
  • the CHO cell culture medium contains an IgG type antibody containing an Fc region produced by CHO cells.
  • the method for binding the ligand and the target protein in the mixed solution is not particularly limited.
  • a particulate carrier on which the ligand is immobilized is filled in a column container, the mixed solution is added to the column, and the target protein and the ligand are then added. And a method of bonding them by bringing them into contact with each other.
  • the washing step in the present invention is a step of removing impurities by washing the solid phase on which the protein-bound ligand is immobilized with the washing composition of the present invention.
  • the washing step may be performed in the same manner as in the conventional intermediate washing except that the washing composition of the present invention is used.
  • the washing composition of the present invention is applied to the column while the antibody is retained in the ligand.
  • the solid phase can be washed to remove impurities by passing through the liquid.
  • Impurities include HCP (Host Cell Protein), DNA, lipids, medium-derived components, and the like.
  • HCP includes proteins derived from cell fragments of antibody-producing cells such as CHO cells.
  • the amount of the cleaning composition of the present invention is usually 1 to 10 column volumes when a column is used, but 3 to 5 column volumes are preferred.
  • the washing temperature is usually 0 to 50 ° C., preferably 5 to 35 ° C., and more preferably normal temperature.
  • the solid phase Before and after this washing step, the solid phase may be further washed with a washing solution in which an inorganic salt such as sodium chloride or sodium sulfate is added to a neutral buffer such as sodium phosphate or Tris-HCl buffer. Good.
  • an inorganic salt such as sodium chloride or sodium sulfate is added to a neutral buffer such as sodium phosphate or Tris-HCl buffer.
  • the recovery step in the present invention is a step of recovering the target protein from the solid phase washed in the washing step using an elution buffer.
  • an elution buffer For example, a method of eluting the target protein with an elution buffer and recovering the target protein using a fraction collector of a chromatography system can be mentioned.
  • the elution buffer examples include an acidic buffer solution when the ligand is protein A or the like, an imidazole-containing buffer solution when the ligand is a His tag or the like, and a glutathione-containing buffer solution when the ligand is a GST tag or the like.
  • the target protein is preferably an antibody, and more preferably an IgG type antibody containing an Fc region (CH2 / CH3 region (CH2 region and CH3 region)). Moreover, you may use Fc fusion protein and a recombinant protein.
  • the components (A) to (C) when the components (A) to (C) are contained in the solution containing the target protein after separation and purification, the components (A) to (C) may be removed after the recovery step.
  • the removal method for example, the components (A) to (C) are separated from the target protein by the difference in adsorption behavior using a carrier for ion exchange chromatography, a carrier for hydrophobic interaction chromatography or a carrier for multimodal chromatography. The method of separating and removing is mentioned.
  • Affinity chromatography carrier JX02 mainly composed of a methacrylate resin in which the protein ligand (protein A) described in the examples of WO 2012/088660 is immobilized in a column container (Tricorn 10/50 column manufactured by GE Healthcare)
  • a column was prepared by packing PB2 at a packing height of about 5 cm.
  • the obtained column was connected to AK Healthcare's AKTA Prime Plus, and 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) was passed through 5 column volumes (5 times the column volume) at a flow rate of 1 mL / min for equilibration. I let you.
  • CHO cell culture supernatant containing the biosimilar of monoclonal antibody Trastuzumab was passed through the column at a flow rate of 1 mL / min with a loading amount of about 24 g antibody / mL carrier.
  • 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) was passed through the column as the washing solution 1 at a column volume of 5 and a flow rate of 1 mL / min.
  • 20 mM sodium phosphate / 1M sodium chloride buffer (pH 7.5) was passed through the column as washing solution 2 at 5 column volumes at a flow rate of 1 mL / min.
  • Reference Example 2 The same treatment as in Reference Example 1 was carried out except that the methacrylate resin carrier (JX02-PB2) was changed to an agarose carrier (MabSelect SuRe TM), and the HCP concentration and antibody recovery rate were evaluated. The results are shown in Table 2.
  • Example 1 Examples 1 to 10 and Comparative Examples 1 and 2 Except that the cleaning solution 1 in Reference Example 1 was changed to each cleaning solution shown in Table 1, the same treatment as in Reference Example 1 was performed to evaluate the HCP concentration and antibody recovery rate. The results are shown in Table 2.
  • Example 11 The same treatment as in Reference Example 2 was performed except that the cleaning solution 1 in Reference Example 2 was changed to the cleaning solution A-2 shown in Table 1, and the HCP concentration and antibody recovery rate were evaluated. The results are shown in Table 2.
  • Example 3 (Examples 12 to 13 and Comparative Example 3) Reference Example 3 was changed except that the cleaning liquid 1 was changed to the cleaning liquid A-2 (Example 12), the cleaning liquid A-4 (Example 13), and the cleaning liquid B-1 (Comparative Example 3) shown in Table 1, respectively. The same treatment as in Example 3 was performed to evaluate the HCP concentration and antibody recovery rate. The results are shown in Table 3.
  • Affinity chromatography carrier JX02 mainly composed of a methacrylate resin in which the protein ligand (protein A) described in the example of WO 2012/088660 is immobilized on a column container (Tricorn 5/200 column manufactured by GE Healthcare)
  • a column was prepared by packing PB2 at a packing height of about 20 cm.
  • the obtained column was connected to AK Healthcare's AKTA Prime Plus, and 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) was passed through 5 column volumes (5 times the column volume) at a flow rate of 1 mL / min for equilibration. I let you. Thereafter, the column was removed from AKTA Prime Plus manufactured by GE Healthcare.
  • measurement solution 11 20 mM sodium phosphate / 500 mM sodium chloride buffer (pH 7.5) (hereinafter also referred to as measurement solution 11) is passed through AKTA Prime Plus at 5 column volumes at a flow rate of 1 mL / min, and the pressure when the column is not connected. The value was measured.
  • the column was connected, and again the measurement solution 11 was passed through AKTA Prime Plus at 5 column volumes and a flow rate of 1 mL / min, and the pressure value at the time of column connection was measured.
  • the pressure value when the column was not connected was subtracted from the pressure value when the column was connected to obtain a pressure loss value when the measurement liquid 11 was passed.
  • Table 5 The results are shown in Table 5. The pressure value when the column was not connected and the pressure value when the column was connected were measured with a pressure gauge attached to AKTA Prime Plus.
  • Example 14 to 16 and Comparative Examples 4 to 5 Except that the measurement liquid 11 in Reference Example 4 was changed to each measurement liquid shown in Table 4, the same treatment as in Reference Example 4 was performed, and the pressure loss value was evaluated. The results are shown in Table 5.
  • Example 17 to 22 The same procedure as in Reference Example 1 was performed except that the cleaning solution 1 in Reference Example 1 was changed to cleaning solutions A-21 to A23 and A31 to A33 shown in Table 6, respectively, and the HCP concentration and antibody recovery rate were evaluated. did. The results are shown in Table 7.
  • Example 23 The same treatment as in Reference Example 1 was performed except that the cleaning solution 1 in Reference Example 1 was changed to cleaning solutions A-41 and A-42 shown in Table 8, respectively, and the HCP concentration and antibody recovery rate were evaluated. The results are shown in Table 9.

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Abstract

　目的タンパク質を分離精製するプロセスに用いる不純物除去性能に優れた洗浄用組成物を提供すること。　目的タンパク質及び不純物を含む混合液から目的タンパク質を分離精製するプロセスに用いる洗浄用組成物であって、以下の成分（Ａ）、成分（Ｂ）及び成分（Ｃ）から選ばれる１種又は２種以上を含むことを特徴とする、洗浄用組成物。　（Ａ）炭素数５以上の有機基を有する第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤、及び炭素数５以上の有機基を有するアミン塩型カチオン性界面活性剤から選ばれるカチオン性界面活性剤　（Ｂ）ヒドロキシ酸エステル　（Ｃ）アミド系溶媒

Description

洗浄用組成物、タンパク質精製方法、及びタンパク質
　本発明は、洗浄用組成物、タンパク質精製方法、及びタンパク質に関する。
　抗体は、多くの動物、特にヒトの免疫系にとって重要な要素である。最近の組換技術の進歩により、癌細胞、細菌、及びウイルスに対する抗体の産生が可能になっている。例えば、抗体は、高レベルに発現するように設計されている細胞株を用いて産生される。また、設計された細胞株は、糖類、アミノ酸、成長因子の複合混合物、血清タンパク質などを含む様々なタンパク質を含む培養物中で培養される。
　抗体をはじめとするタンパク質を細胞副産物や培養物成分から分離して、研究用途にまたは治療薬・診断薬として使用するためには、十分な純度に高めることが必要となる。抗体がヒトへの投与用の薬剤として用いられるものである場合、抗体分子の精製は特に重要である。従来の抗体精製方法として、特許文献１～４に記載の方法が知られている。
米国特許第６８７００３４号明細書 特許第４０３１０４９号公報 特許第４４６０３０２号公報 特許第５１５０４８８号公報
　本発明の課題は、目的タンパク質を分離精製するプロセスに用いる不純物除去性能に優れた洗浄用組成物を提供することである。
　上記の課題は下記の手段により解決された。
　＜１＞目的タンパク質及び不純物を含む混合液から目的タンパク質を分離精製するプロセスに用いる洗浄用組成物であって、以下の成分（Ａ）、成分（Ｂ）及び成分（Ｃ）から選ばれる１種又は２種以上を含むことを特徴とする、洗浄用組成物。
　（Ａ）炭素数５以上の有機基を有する第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤、及び炭素数５以上の有機基を有するアミン塩型カチオン性界面活性剤から選ばれるカチオン性界面活性剤
　（Ｂ）ヒドロキシ酸エステル
　（Ｃ）アミド系溶媒
　＜２＞固相上に固定されたリガンドと、目的タンパク質及び不純物を含む混合液とを接触させ、前記リガンドと前記混合液中のタンパク質とを結合させる結合工程、
　上記＜１＞の洗浄用組成物で、前記タンパク質が結合したリガンドが固定された固相を洗浄して不純物を除去する洗浄工程、並びに
　溶出バッファーを用いて、前記洗浄工程で洗浄した固相から目的タンパク質を回収する回収工程、
を含むことを特徴とするタンパク質精製方法。
　＜３＞上記＜２＞の精製方法により精製されたことを特徴とする、目的タンパク質。
　本発明の洗浄用組成物は、目的タンパク質を分離精製するプロセスに用いた場合に優れた不純物除去性能を示す。
　したがって、本発明のタンパク質精製方法によれば、不純物を効率的に除去することができる。また、当該精製方法により精製された目的タンパク質は不純物が少ない。
　以下、本発明について詳細に説明する。なお、数値範囲等を表す「ａ～ｂ」等の表記は、特に断りのない限りａ及びｂをその数値範囲に含むものであり、「ａ以上、ｂ以下」と同義である。
［洗浄用組成物］
　本発明の洗浄用組成物は、目的タンパク質及び不純物を含む混合液から目的タンパク質を分離精製するプロセスに用いる洗浄用組成物であって、以下の成分（Ａ）、成分（Ｂ）及び成分（Ｃ）から選ばれる１種又は２種以上を含むことを特徴とするものである。
　（Ａ）炭素数５以上の有機基を有する第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤、及び炭素数５以上の有機基を有するアミン塩型カチオン性界面活性剤から選ばれるカチオン性界面活性剤
　（Ｂ）ヒドロキシ酸エステル
　（Ｃ）アミド系溶媒
（成分（Ａ）：カチオン性界面活性剤）
　成分（Ａ）のカチオン性界面活性剤は、炭素数５以上の有機基を有する第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤、及び炭素数５以上の有機基を有するアミン塩型カチオン性界面活性剤から選ばれるものである。上記アミン塩型カチオン性界面活性剤は、第１級～第３級アミン塩型のいずれでもよい。
　上記カチオン性界面活性剤としては、殺菌性、保存安定性、不純物除去性能の観点や、目的タンパク質を効率よく回収する観点から、炭素数５以上の有機基を有する第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤が好ましく、下記式（１）で表される第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤（以下、カチオン性界面活性剤（１）とも称する）がより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
〔式（１）中、
　Ｒ１は、炭素数５以上の有機基を示し、
　Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、有機基を示し、
　ｎは１以上の整数を示し、
　Ｚｎ－はｎ価のアニオンを示す。〕
　式（１）中、Ｒ１は、炭素数５以上の有機基を示す。ここで、Ｒ１で示される有機基が、２種以上の炭素数の有機基である場合、その炭素数は平均炭素数を意味とするものとする。平均炭素数は、カチオン性界面活性剤（１）に該当する全分子のＲ１の炭素数の総和を求めて、炭素数を１分子あたりに換算することで算出できる（全分子のＲ１の炭素数の総和／分子の数）。
　上記Ｒ１で示される有機基としては、炭素数５～３０の炭化水素基、炭素数５～３０のヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された総炭素数５～３０の基、平均付加モル数が１０以下であり炭素数が５以上であるポリオキシアルキレン基、平均付加モル数１０以下のポリオキシアルキレン基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された総炭素数５～３０の基が好ましい。
　Ｒ１における炭素数５～３０の炭化水素基の炭素数としては、不純物除去性能の観点や、本発明の洗浄用組成物で洗浄された固相の再利用を容易にする観点から、好ましくは６～２４、より好ましくは８～２２、更に好ましくは９～２０、更に好ましくは１０～１８、特に好ましくは１０～１６である。
　上記炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基が挙げられる。
　上記アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。例えば、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、１－メチルデシル基、ドデシル基、１－メチルウンデシル基、１－エチルデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基等が挙げられる。
　上記アルケニル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。例えば、デセニル基、ウンデセニル基、ドデセニル基、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基等が挙げられる。
　上記アラルキル基としては、ベンジル基、フェネチル基等が挙げられる。
　Ｒ１におけるヒドロキシアルキル基の炭素数は５～３０であるが、不純物除去性能の観点や、本発明の洗浄用組成物で洗浄された固相の再利用を容易にする観点、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点から、好ましくは６～２４、より好ましくは８～２２、更に好ましくは９～２０、更に好ましくは１０～１８、特に好ましくは１０～１６である。ヒドロキシアルキル基に含まれるアルキル基としては、上記アルキル基と同様のものが挙げられる。
　Ｒ１における平均付加モル数が１０以下であり炭素数が５以上であるポリオキシアルキレン基としては、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＨ（ｐは３～１０の整数を示すが、不純物除去性能の観点や、本発明の洗浄用組成物で洗浄された固相の再利用を容易にする観点、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点から、好ましくは５～８の整数である）で表されるポリオキシエチレン基が好ましい。
　Ｒ１におけるヒドロキシアルキル基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された基、及び平均付加モル数１０以下のポリオキシアルキレン基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された基の総炭素数は、５～３０であるが、不純物除去性能の観点や、本発明の洗浄用組成物で洗浄された固相の再利用を容易にする観点、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点から、好ましくは８～２６、より好ましくは９～２５、更に好ましくは１２～２４、更に好ましくは１４～２２、特に好ましくは１６～２０である。また、上記ポリオキシアルキレン基としては、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑＨ（ｑは１～１０の整数を示すが、好ましくは１～７の整数、より好ましくは１～４の整数、更に好ましくは１又は２である）で表されるポリオキシエチレン基が好ましい。
　また、ヒドロキシアルキル基及びポリオキシアルキレン基に置換された炭化水素基の置換位置としては、ヒドロキシアルキル基又はポリオキシエチレン基に含まれる水酸基中の水素原子が好ましい。また、上記炭化水素基としては、炭素数１～１０のアルキル基、炭素数６～２０のアリール基、アルキルアリール基が好ましく、アルキルアリール基がより好ましい。当該アルキルアリール基としては、炭素数７～２０のアルキルアリール基が好ましく、炭素数１０～１８のアルキルフェニル基がより好ましく、炭素数１２～１６のアルキルフェニル基が更に好ましい。例えば、（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル基等が挙げられる。
　平均付加モル数１０以下のポリオキシアルキレン基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された基としては、下記式で示されるものが挙げられる。なお、式中のｑは前記と同義である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　また、式（１）中、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、有機基を示す。
　Ｒ２、Ｒ３及びＲ４としては、炭素数１～３０の炭化水素基、炭素数１～３０のヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された総炭素数２以上の基、平均付加モル数が１０以下であるポリオキシアルキレン基、平均付加モル数１０以下のポリオキシアルキレン基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された総炭素数２以上の基が好ましい。
　Ｒ２における炭素数１～３０の炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基が挙げられる。
　Ｒ２におけるアルキル基の炭素数としては、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点から、１～１２が好ましく、１～８がより好ましく、１～４が更に好ましく、１～３が更に好ましく、１又は２が特に好ましい。また、上記アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基等が挙げられる。
　Ｒ２におけるアルケニル基の炭素数としては、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点から、２～１２が好ましく、２～８がより好ましく、２～４が更に好ましく、２又は３が更に好ましい。また、上記アルケニル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。例えば、エテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－ブテニル基等が挙げられる。
　Ｒ２におけるアラルキル基の炭素数としては、７～２０が好ましく、７～１０がより好ましく、７又は８が更に好ましい。アラルキル基としては、ベンジル基、フェネチル基等が挙げられる。
　Ｒ２におけるヒドロキシアルキル基の炭素数は１～３０であるが、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点から、１～１２が好ましく、１～８がより好ましく、１～４が更に好ましく、１～３が更に好ましく、１又は２が特に好ましい。ヒドロキシアルキル基に含まれるアルキル基としては、上記Ｒ２で示されるアルキル基と同様のものが挙げられる。
　また、ヒドロキシアルキル基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された基に含まれるヒドロキシアルキル基としては、上記ヒドロキシアルキル基と同様のものが挙げられる。
　Ｒ２における平均付加モル数が１０以下であるポリオキシアルキレン基としては、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＨ（ｒは１～１０の整数を示すが、好ましくは１～７の整数、より好ましくは１～４の整数、更に好ましくは１又は２である）で表されるポリオキシエチレン基が好ましい。
　また、平均付加モル数１０以下のポリオキシアルキレン基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された基に含まれるポリオキシアルキレン基としては、上記ポリオキシアルキレン基と同様のものが挙げられる。
　また、Ｒ２において、ヒドロキシアルキル基及びポリオキシアルキレン基に置換された炭化水素基の置換位置としては、ヒドロキシアルキル基又はポリオキシエチレン基に含まれる水酸基中の水素原子が好ましい。また、上記炭化水素基としては、炭素数１～１０のアルキル基、炭素数６～２０のアリール基、アルキルアリール基が好ましく、アルキルアリール基がより好ましい。当該アルキルアリール基としては、炭素数７～２０のアルキルアリール基が好ましく、炭素数１０～１８のアルキルフェニル基がより好ましく、炭素数１２～１６のアルキルフェニル基が更に好ましい。例えば、（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル基が挙げられる。
　上記Ｒ２の中でも、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点、不純物除去性能の観点や、本発明の洗浄用組成物で洗浄された固相の再利用を容易にする観点から、炭素数１～３０の炭化水素基、炭素数１～３０のヒドロキシアルキル基、平均付加モル数が１０以下であるポリオキシアルキレン基が好ましく、炭素数１～３０の炭化水素基がより好ましく、アルキル基、アラルキル基が特に好ましい。
　また、Ｒ３及びＲ４としては、炭素数１～３０の炭化水素基が好ましい。Ｒ３及びＲ４における炭化水素基の炭素数としては、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点から、１～１２が好ましく、１～８がより好ましく、１～４が更に好ましく、１～３が更に好ましく、１又は２が特に好ましい。
　また、Ｒ３及びＲ４における炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。また、アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基等が挙げられる。
　また、Ｒ１～Ｒ４の炭素数の関係は、不純物除去性能の観点や、本発明の洗浄用組成物で洗浄された固相の再利用を容易にする観点、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点からは、Ｒ２の炭素数≧Ｒ３の炭素数、且つＲ２の炭素数≧Ｒ４の炭素数であり、Ｒ１とＲ２との炭素数の合計が１０以上であるのが好ましい。当該Ｒ１とＲ２との炭素数の合計は、上記と同様の観点から、好ましくは１０～２６であり、より好ましくは１２～２４であり、特に好ましくは１２～２２である。
　また、式（１）中、ｎは、対アニオンとなる原子又は原子団の価数を意味し、１以上の整数を示す。ｎは好ましくは１である。
　また、式（１）中、Ｚ（原子又は原子団）としては、具体的には、ハロゲン原子、ＣＨ３ＳＯ４、ＣＨ３ＣＨ２ＳＯ４、ＯＨの他、アミノ酸に由来する原子団、脂肪酸に由来する原子団、炭素数１～３０の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基を有するリン酸エステルに由来する原子団、ホスホン酸エステルに由来する原子団、スルホン酸エステルに由来する原子団、硫酸エステルに由来する原子団、重合度３以上のスチレンスルホン酸を有するか又は置換基として炭化水素基を有することがある多環式芳香族化合物のスルホン化物のホルマリン縮合物を含有するアニオン性オリゴマー又はポリマーに由来する原子団が挙げられる。
　これらの中でも、Ｚとしては、ハロゲン原子が好ましく、塩素原子、臭素原子がより好ましく、塩素原子が特に好ましい。
　上記カチオン性界面活性剤（１）の中でも、不純物除去性能の観点から、下記式（２）又は（３）で表されるものが好ましい。このうち、本発明の洗浄用組成物で洗浄された固相の再利用を容易にする観点、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点や安全性の観点からは、式（２）で表されるものがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
〔式（２）中、
　Ｒ５は、炭素数５～３０の炭化水素基又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
で表わされる基を示し、
　Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して、炭素数１～４の炭化水素基を示し、
　ｎ及びＺｎ－は前記と同義である。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
〔式（３）中、
　Ｒ８は、炭素数９～３０のアルキル基を示し、
　Ｒ９～Ｒ１１は、それぞれ独立して、炭素数１～４の炭化水素基を示し、
　ｎ及びＺｎ－は前記と同義である。〕
　式（２）中、Ｒ５としては、不純物除去性能の観点から、炭素数５～３０の炭化水素基が好ましい。ここで、Ｒ５で示される炭化水素基が、２種以上の炭素数の炭化水素基である場合、その炭素数は平均炭素数を意味とするものとする。平均炭素数は、カチオン性界面活性剤（２）に該当する全分子のＲ５の炭素数の総和を求めて、炭素数を１分子あたりに換算することで算出できる（全分子のＲ５の炭素数の総和／分子の数）。
　上記Ｒ５で示される炭化水素基の炭素数は、不純物除去性能の観点や、本発明の洗浄用組成物で洗浄された固相の再利用を容易にする観点、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点から、好ましくは６～２４、より好ましくは８～２２、更に好ましくは９～２０、更に好ましくは１０～１８、特に好ましくは１０～１６である。
　また、上記炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。当該アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。例えば、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、１－メチルデシル基、ドデシル基、１－メチルウンデシル基、１－エチルデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基等が挙げられる。
　式（２）中、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して、炭素数１～４の炭化水素基を示す。当該炭化水素基の炭素数としては、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点から、１～３が好ましく、１又は２が特に好ましい。
　また、Ｒ６及びＲ７で示される炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。当該アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基等が挙げられる。
　式（３）中、Ｒ８は、炭素数９～３０のアルキル基を示す。当該アルキル基の炭素数は、不純物除去性能の観点や、本発明の洗浄用組成物で洗浄された固相の再利用を容易にする観点、回収した目的タンパク質への洗浄用組成物の混入を低レベルに抑える観点から、好ましくは６～２４、より好ましくは８～２２、更に好ましくは９～２０、更に好ましくは１０～１８、更に好ましくは１０～１６であり、更に好ましくは１０～１４であり、特に好ましくは１１～１３である。
　また、Ｒ８で示されるアルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。例えば、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、１－メチルデシル基、ドデシル基、１－メチルウンデシル基、１－エチルデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基等が挙げられる。
　式（３）中、Ｒ９～Ｒ１１は、それぞれ独立して、炭素数１～４の炭化水素基を示す。当該炭化水素基としては、式（２）中のＲ６と同様のものが挙げられる。
　上記カチオン性界面活性剤の具体例としては、塩化オクチルトリメチルアンモニウム、塩化デシルトリメチルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、臭化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。
　これら中でも、静脈又は筋肉内投与が可能な医薬品添加物であり、ヒトに対する安全性が担保されているという観点からは、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムが好ましい。この中でも、安全性と不純物除去性能との両立の観点から、塩化ベンザルコニウムが特に好ましい。
　なお、塩化ベンザルコニウムは、式（１）において、Ｒ１＝平均炭素数が１０～１５の範囲内のアルキル基、Ｒ２＝ベンジル基、Ｒ３＝Ｒ４＝メチル基、Ｚｎ－＝Ｃｌ－の化合物である。
　また、上記カチオン性界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　上記カチオン性界面活性剤を用いる場合、その濃度としては、不純物除去性能の観点から、本発明の洗浄用組成物中、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上、特に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上であり、また、分離精製する際の圧力上昇を抑える観点から、本発明の洗浄用組成物中、好ましくは２０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは８％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは６．５％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは３．５％（ｗ／ｖ）以下、特に好ましくは２％（ｗ／ｖ）以下である。
　カチオン性界面活性剤の濃度を上記のような範囲とすることにより、分離精製する際の圧力上昇が大幅に抑えられ、且つ優れた不純物除去性能が得られる。
（成分（Ｂ）：ヒドロキシ酸エステル）
　ヒドロキシ酸エステルとしては、１～３個のヒドロキシ基及び１～３個のエステル結合を分子内に有するヒドロキシ酸エステルが好ましく、１又は２個のヒドロキシ基及び１又は２個のエステル結合を分子内に有するヒドロキシ酸エステルが好ましい。
　また、ヒドロキシ酸エステルとしては、１～３個のヒドロキシ基及び１～３個のカルボキシ基を分子内に有するヒドロキシ酸に由来するヒドロキシ酸エステルが好ましく、１又は２個のヒドロキシ基及び１又は２個のカルボキシ基を分子内に有するヒドロキシ酸に由来するヒドロキシ酸エステルがより好ましい。
　また、上記ヒドロキシ酸エステルとしては、グリコール酸エステル、乳酸エステル、タルトロン酸エステル、グリセリン酸エステル、ヒドロキシ酪酸エステル、リンゴ酸エステル、酒石酸エステル、クエン酸エステル等が挙げられる。
　ヒドロキシ酸エステルの中でも、α－ヒドロキシ酸エステルが好ましく、グリコール酸、乳酸エステルがより好ましく、乳酸エステルがさらに好ましい。
　また、ヒドロキシ酸エステルは、ヒドロキシ酸アルキルエステルであることが好ましい。上記アルキル基としては、炭素数１～１０のアルキル基が好ましく、炭素数１～５のアルキル基がより好ましく、炭素数１～３のアルキル基がさらに好ましい。また、アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられる。
　上記のようなヒドロキシ酸エステル中でも、静脈内投与又は筋肉内投与が可能な医薬品添加物であり、ヒトに対する安全性が担保されていることから、乳酸エチルが特に好ましい。
　なお、上記ヒドロキシ酸エステルは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてよい。
　上記ヒドロキシ酸エステルを用いる場合、その濃度としては、不純物除去性能の観点から、本発明の洗浄用組成物中、好ましくは１％（ｖ／ｖ）以上、より好ましくは５％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは１０％（ｖ／ｖ）以上、特に好ましくは１５％（ｖ／ｖ）以上であり、また、好ましくは４０％（ｖ／ｖ）以下、より好ましくは３０％（ｖ／ｖ）以下、更に好ましくは２０％（ｖ／ｖ）以下である。具体的には１～４０％（ｖ／ｖ）が好ましく、５～３０％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１０～２０％（ｖ／ｖ）がさらに好ましく、１５～２０％（ｖ／ｖ）が特に好ましい。
（成分（Ｃ）：アミド系溶媒）
　アミド系溶媒としては、下記式（４）で表される溶媒が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
〔式（４）中、Ｒ２１は、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を示し、Ｒ２２及びＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、又はアリール基を示し、Ｒ２１とＲ２２がともに炭素数１～４のアルキル基の場合には、互いに結合して環構造を形成していてもよい。〕
　Ｒ２１としては、炭素数１～４のアルキル基が好ましい。また、Ｒ２２及びＲ２３としては、炭素数１～４のアルキル基、アリール基が好ましい。
　また、Ｒ２１、Ｒ２２及びＲ２３で示される炭素数１～４のアルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基が挙げられる。
　Ｒ２２及びＲ２３で示されるアリール基としては、炭素数６～１２のアリール基が好ましい。具体的にはフェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
　Ｒ２１及びＲ２２で示される炭素数１～４のアルキル基が互いに結合して形成する環としては、２－ピロリドン環、２－ピペリドン環、２－カプロラクタム（ε－カプロラクタム）環等が挙げられる。
　上記アミド系溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジプロピルアセトアミド、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアセトアミド、Ｎ－ブチル－Ｎ－フェニルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパンアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルプロパンアミド、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルプロパンアミド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ－メチル－２－カプロラクタム、Ｎ－エチル－２－カプロラクタム等が挙げられる。
　これらの中でも、静脈内投与又は筋肉内投与が可能な医薬品添加物であり、ヒトに対する安全性が担保されていることから、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミドが特に好ましい。
　なお、上記アミド系溶媒は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてよい。
　上記アミド系溶媒を用いる場合、その濃度としては、不純物除去性能の観点から、本発明の洗浄用組成物中、好ましくは１％（ｖ／ｖ）以上、より好ましくは５％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは１０％（ｖ／ｖ）以上、特に好ましくは１５％（ｖ／ｖ）以上であり、また、好ましくは４０％（ｖ／ｖ）以下、より好ましくは３０％（ｖ／ｖ）以下、更に好ましくは２０％（ｖ／ｖ）以下である。具体的には１～４０％（ｖ／ｖ）が好ましく、５～３０％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１０～２０％（ｖ／ｖ）がさらに好ましく、１５～２０％（ｖ／ｖ）が特に好ましい。
　本発明の洗浄用組成物において、上記成分（Ａ）、成分（Ｂ）、成分（Ｃ）は、これらの成分のうち１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよいが、２種以上を組み合わせた場合、不純物除去性能が更に向上する。
　これら成分の組み合わせとしては、成分（Ａ）と成分（Ｂ）の組み合わせ、成分（Ａ）と成分（Ｃ）の組み合わせ、成分（Ｂ）と成分（Ｃ）の組み合わせ、成分（Ａ）と成分（Ｂ）と成分（Ｃ）の組み合わせが挙げられる。斯様な組み合わせを含有する洗浄用組成物の中でも、不純物除去性能の観点から、成分（Ａ）を少なくとも含み、更に成分（Ｂ）及び成分（Ｃ）から選ばれる１種以上を含有する洗浄用組成物が好ましい。
　また、上記各成分のうち成分（Ａ）と成分（Ｂ）をともに用いる場合、成分（Ａ）と成分（Ｂ）との含有割合〔（Ａ）／（Ｂ）〕は、０．０１～１０（ｗ／ｖ）が好ましく、０．０５～１（ｗ／ｖ）がより好ましく、０．０５～０．５（ｗ／ｖ）がさらに好ましい。
　また、上記各成分のうち成分（Ａ）と成分（Ｃ）をともに用いる場合、成分（Ａ）と成分（Ｃ）との含有割合〔（Ａ）／（Ｃ）〕は、０．０１～１０（ｗ／ｖ）が好ましく、０．０５～１（ｗ／ｖ）がより好ましく、０．０５～０．５（ｗ／ｖ）がさらに好ましい。
（その他の成分）
　本発明の洗浄用組成物中には、上記成分の他に、水；リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム等の無機塩；アミノ酸；糖等を含んでいてもよい。なお、これらその他の成分は、１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　また、上記無機塩の濃度としては、不純物除去性能の観点からは、洗浄用組成物中、１～１５００ｍＭが好ましく、５～１０００ｍＭがより好ましく、１０～７５０ｍＭが更に好ましく、２００～７５０ｍＭが特に好ましい。
　本発明の洗浄用組成物の２３℃におけるｐＨは、目的タンパク質の安定性の観点から、好ましくは５以上、より好ましくは６以上、更に好ましくは７以上であり、また、好ましくは９以下、より好ましくは８以下である。
　また、本発明の洗浄用組成物の２３℃における粘度としては、０．８～２．０ｍＰａ・ｓが好ましく、０．８～１．６ｍＰａ・ｓがより好ましい。
　また、本発明の洗浄用組成物は、洗浄用液状組成物であるのが好ましい。
　本発明の洗浄用組成物は、目的タンパク質及び不純物を含む混合液から目的タンパク質を分離精製するプロセスに用いられるものである。例えば、目的タンパク質が結合したリガンドが固定された固相をカラム容器に充填し、洗浄用組成物を通液する等して使用される。
（分離精製プロセス）
　分離精製プロセスとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどが挙げられ、選択性に優れ、高純度な目的タンパク質が得られることから、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい。
　特に、本発明の洗浄用組成物は、プロテインＡをリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーによる抗体精製に適し、当該抗体精製における中間洗浄用の組成物として特に有用である。斯様な洗浄に本発明の洗浄用組成物を用いた場合、不純物が非常に効果的に除去され、且つ、プロテインＡから抗体が解離しにくいため、抗体を極めて効率よく回収することができる。
　中間洗浄とは、抗体などの目的タンパク質の分離精製プロセスにおいて、不純物を洗浄除去するために、リガンドに目的タンパク質を保持させた状態で固相を洗浄することをいう。
（目的タンパク質）
　目的タンパク質としては、抗体が好ましく、Ｆｃ領域（ＣＨ２／ＣＨ３領域（ＣＨ２領域及びＣＨ３領域））を含むＩｇＧ型の抗体がより好ましい。また、Ｆｃ融合タンパク質、組換えタンパク質を用いてもよい。なお、抗体には、動物細胞で産生された抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体が含まれる。
［タンパク質精製方法］
　本発明のタンパク質精製方法は、
　固相上に固定されたリガンドと、目的タンパク質及び不純物を含む混合液とを接触させ、前記リガンドと前記混合液中のタンパク質とを結合させる結合工程、
　本発明の洗浄用組成物で、前記タンパク質が結合したリガンドが固定された固相を洗浄して不純物を除去する洗浄工程、並びに
　溶出バッファーを用いて、前記洗浄工程で洗浄した固相から目的タンパク質を回収する回収工程、
を含むことを特徴とするものである。
　以下、各工程について説明する。
（結合工程）
　本発明における結合工程とは、固相上に固定されたリガンドと、目的タンパク質及び不純物を含む混合液とを接触させ、前記リガンドと前記混合液中のタンパク質とを結合させる工程である。
　固相の材質は、本発明の洗浄用組成物は種々の材質の固相を用いた精製に利用できるため特に限定されるものではなく、合成高分子、天然高分子の他、シリカ、ガラスなどが挙げられる。
　これらの中でも、合成高分子、天然高分子が好ましい。合成高分子としては、ポリスチレン樹脂、メタクリレート樹脂が挙げられ、天然高分子としては、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類で構成されるものが挙げられる。この中でも、アガロース、メタクリレート樹脂が好ましく、カラムへの充填やスケールアップが容易であることから、メタクリレート樹脂がより好ましい。
　固相の形状としては、粒子、中空繊維、不織布、フィルター、モノリスが挙げられるが、粒子が好ましい。
　リガンドは、目的タンパク質との親和性を考慮して選択すればよい。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ等のタンパク質が挙げられる。
　これらの中でも、抗体医薬の製造において用いることが可能であることから、プロテインＡが特に好ましい。本発明の洗浄用組成物は、プロテインＡから抗体を解離させにくいため、本発明の洗浄用組成物を用いてプロテインＡをリガンドとする固相の洗浄をした場合、抗体を極めて効率よく回収することができる。
　目的タンパク質及び不純物を含む混合液としては、例えば、不純物を含むＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣タンパク質）の培養液、不純物を含むハイブリドーマの培養液、遺伝子組換え大腸菌の細胞破砕液が挙げられる。ＣＨＯ細胞の培養液には、不純物の他に、ＣＨＯ細胞が産生したＦｃ領域を含むＩｇＧ型の抗体が含まれる。
　リガンドと混合液中の目的タンパク質とを結合させる方法は特に限定されないが、例えば、リガンドが固定化された粒子状の担体をカラム容器に充填し、混合液をカラムに添加し、目的タンパク質とリガンドとを接触させることで結合させる方法が挙げられる。
（洗浄工程）
　本発明における洗浄工程とは、本発明の洗浄用組成物で、前記タンパク質が結合したリガンドが固定された固相を洗浄して不純物を除去する工程である。
　洗浄工程は、本発明の洗浄用組成物を用いること以外は常法の中間洗浄と同様にして行えばよく、例えば、リガンドに抗体が保持された状態のまま本発明の洗浄用組成物をカラムに通液させることで固相を洗浄して不純物を除去すればよい。
　不純物としては、ＨＣＰ（Ｈｏｓｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＤＮＡ、脂質、培地由来成分などが挙げられる。ＨＣＰには、ＣＨＯ細胞等の抗体産生細胞の細胞片由来のタンパク質が含まれる。
　本発明の洗浄用組成物の使用量は、カラムを用いる場合は、通常１～１０カラム容量であるが、３～５カラム容量が好ましい。
　洗浄温度は、通常０～５０℃であるが、５～３５℃が好ましく、常温がより好ましい。
　なお、本洗浄工程の前後に、リン酸ナトリウムやトリス塩酸緩衝液などの中性緩衝液に塩化ナトリウムや硫酸ナトリウムなどの無機塩を添加した洗浄液などを用いて、更に固相を洗浄してもよい。
（回収工程）
　本発明における回収工程とは、溶出バッファーを用いて、前記洗浄工程で洗浄した固相から目的タンパク質を回収する工程である。例えば、溶出バッファーで目的タンパク質を溶出させ、クロマトグラフィーシステムのフラクションコレクターを用いて目的タンパク質を回収する方法が挙げられる。
　溶出バッファーとしては、リガンドがプロテインＡ等の場合は酸性緩衝液、リガンドがＨｉｓタグ等の場合はイミダゾール含有緩衝液、リガンドがＧＳＴタグ等の場合はグルタチオン含有緩衝液などが挙げられる。
　目的タンパク質は上記と同様に、抗体が好ましく、Ｆｃ領域（ＣＨ２／ＣＨ３領域（ＣＨ２領域及びＣＨ３領域））を含むＩｇＧ型の抗体がより好ましい。また、Ｆｃ融合タンパク質、組換えタンパク質を用いてもよい。
　なお、分離精製した目的タンパク質を含む溶液中に成分（Ａ）～（Ｃ）が含まれる場合、回収工程の後、成分（Ａ）～（Ｃ）を除去してもよい。除去方法としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー用担体、疎水性相互作用クロマトグラフィー用担体又はマルチモーダルクロマトグラフィー用担体を用いて、吸着挙動の差異により目的タンパク質から成分（Ａ）～（Ｃ）を分離除去する方法が挙げられる。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（参考例１）
　カラム容器（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製Ｔｒｉｃｏｒｎ１０／５０　ｃｏｌｕｍｎ）に、国際公開第２０１２／０８６６６０号の実施例に記載のタンパク質リガンド（プロテインＡ）を固定化させたメタクリレート樹脂を主成分とするアフィニティークロマトグラフィー担体ＪＸ０２－ＰＢ２を充填高さ約５ｃｍで充填してカラムを作製した。得られたカラムをＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ＡＫＴＡ　Ｐｒｉｍｅ　Ｐｌｕｓに接続し、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量（カラム容積の５倍）、流速１ｍＬ／分にて通液し、平衡化させた。
　次いで、モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂのバイオシミラーを含有するＣＨＯ細胞培養上清を、約２４ｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量で、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
　次いで、洗浄液１として、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
　次いで、洗浄液２として、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
　次いで、洗浄液３として、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
　その後、１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Ａｂｓ．２８０＞１００ｍＡｕの溶出フラクションを回収した。
　そして、Ｃｙｇｎｕｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製　ＣＨＯ　ＨＣＰ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ，３Ｇを用い、回収したフラクション中に含有されるＨｏｓｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）濃度を測定した。結果を表２に示した。
　また、分光光度計（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製ＳｍａｒｔＳｐｅｃＰｌｕｓ）を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度を測定し、回収液量を乗ずることで抗体回収量を算出し、さらに添加抗体量で除することにより、抗体回収率を測定した。結果を表２に示した。
（参考例２）
　メタクリレート樹脂担体（ＪＸ０２－ＰＢ２）を、アガロース担体（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ（商標））に変更する以外は参考例１と同様の処理を行い、ＨＣＰ濃度と抗体回収率の評価を実施した。結果を表２に示した。
（実施例１～１０及び比較例１～２）
　参考例１における洗浄液１を、表１に記載の各洗浄液にそれぞれ変更した以外は、参考例１と同様の処理を行い、ＨＣＰ濃度と抗体回収率の評価を実施した。結果を表２に示した。
（実施例１１）
　参考例２における洗浄液１を、表１に記載の洗浄液Ａ－２に変更した以外は、参考例２と同様の処理を行い、ＨＣＰ濃度と抗体回収率の評価を実施した。結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
（参考例３）
　モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂのバイオシミラーを含有するＣＨＯ細胞培養上清（約２４ｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量）を、モノクローナル抗体Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔのバイオシミラーを含有するＣＨＯ細胞培養上清（約６．５ｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量）に変更する以外は参考例１と同様の処理を行い、ＨＣＰ濃度と抗体回収率の評価を実施した。結果を表３に示した。
（実施例１２～１３及び比較例３）
　参考例３における洗浄液１を、表１に記載の洗浄液Ａ－２（実施例１２）、洗浄液Ａ－４（実施例１３）、洗浄液Ｂ－１（比較例３）にそれぞれ変更した以外は、参考例３と同様の処理を行い、ＨＣＰ濃度と抗体回収率の評価を実施した。結果を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　上記表２及び３に示すように、洗浄液Ａ－１～Ａ－１０を用いることによって、ＨＣＰを効率的に洗浄除去できた。
（参考例４）
　カラム容器（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製Ｔｒｉｃｏｒｎ５／２００　ｃｏｌｕｍｎ）に、国際公開第２０１２／０８６６６０号の実施例に記載のタンパク質リガンド（プロテインＡ）を固定化させたメタクリレート樹脂を主成分とするアフィニティークロマトグラフィー担体ＪＸ０２－ＰＢ２を充填高さ約２０ｃｍで充填してカラムを作製した。得られたカラムをＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ＡＫＴＡ　Ｐｒｉｍｅ　Ｐｌｕｓに接続し、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量（カラム容積の５倍）、流速１ｍＬ／分にて通液し、平衡化させた。その後、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ＡＫＴＡ　Ｐｒｉｍｅ　Ｐｌｕｓからカラムを取り外した。
　次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００ｍＭ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）（以下、測定液１１とも称する）を５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてＡＫＴＡ　Ｐｒｉｍｅ　Ｐｌｕｓに通液し、カラム未接続時の圧力値を測定した。
　次にカラムを接続し、再度、測定液１１を５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてＡＫＴＡ　Ｐｒｉｍｅ　Ｐｌｕｓに通液し、カラム接続時の圧力値を測定した。当該カラム接続時の圧力値からカラム未接続時の圧力値を差し引き、測定液１１を通液した際の圧力損失値とした。結果を表５に示した。
　なお、カラム未接続時の圧力値とカラム接続時の圧力値は、ＡＫＴＡ　Ｐｒｉｍｅ　Ｐｌｕｓに付属の圧力計により測定した。
（実施例１４～１６及び比較例４～５）
　参考例４における測定液１１を、表４に記載の各測定液にそれぞれ変更した以外は、参考例４と同様の処理を行い、圧力損失値の評価を実施した。結果を表５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
（実施例１７～２２）
　参考例１における洗浄液１を、表６に記載の洗浄液Ａ－２１～Ａ２３、Ａ３１～Ａ３３にそれぞれ変更した以外は、参考例１と同様の処理を行い、ＨＣＰ濃度と抗体回収率の評価を実施した。結果を表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
（実施例２３及び２４）
　参考例１における洗浄液１を、表８に記載の洗浄液Ａ－４１、Ａ－４２にそれぞれ変更した以外は、参考例１と同様の処理を行い、ＨＣＰ濃度と抗体回収率の評価を実施した。結果を表９に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020

Claims (17)

  1. 　目的タンパク質及び不純物を含む混合液から目的タンパク質を分離精製するプロセスに用いる洗浄用組成物であって、
    以下の成分（Ａ）、成分（Ｂ）及び成分（Ｃ）から選ばれる１種又は２種以上を含むことを特徴とする、
    洗浄用組成物。
    　（Ａ）炭素数５以上の有機基を有する第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤、及び炭素数５以上の有機基を有するアミン塩型カチオン性界面活性剤から選ばれるカチオン性界面活性剤
    　（Ｂ）ヒドロキシ酸エステル
    　（Ｃ）アミド系溶媒
  2. 　前記カチオン性界面活性剤が、下記式（１）で表されるものである、
    請求項１に記載の洗浄用組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式（１）中、
    　Ｒ１は、炭素数５以上の有機基を示し、
    　Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、有機基を示し、
    　ｎは１以上の整数を示し、
    　Ｚｎ－はｎ価のアニオンを示す。〕
  3. 　Ｒ１が、
    炭素数５～３０の炭化水素基、
    炭素数５～３０のヒドロキシアルキル基、
    ヒドロキシアルキル基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された総炭素数５～３０の基、
    平均付加モル数が１０以下であり炭素数が５以上であるポリオキシアルキレン基、
    又は平均付加モル数１０以下のポリオキシアルキレン基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された総炭素数５～３０の基である、
    請求項２に記載の洗浄用組成物。
  4. 　Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が、それぞれ独立して、
    炭素数１～３０の炭化水素基、
    炭素数１～３０のヒドロキシアルキル基、
    ヒドロキシアルキル基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された総炭素数２以上の基、
    平均付加モル数が１０以下であるポリオキシアルキレン基、
    又は平均付加モル数１０以下のポリオキシアルキレン基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された総炭素数２以上の基である、
    請求項２又は３のいずれか１項に記載の洗浄用組成物。
  5. 　Ｒ２の炭素数≧Ｒ３の炭素数、且つＲ２の炭素数≧Ｒ４の炭素数であり、
    Ｒ１とＲ２との炭素数の合計が１０以上である、
    請求項２～４のいずれか１項に記載の洗浄用組成物。
  6. 　前記カチオン性界面活性剤が、下記式（２）又は（３）で表されるものである、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の洗浄用組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     〔式（２）中、
    　Ｒ５は、炭素数５～３０の炭化水素基又は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     で表わされる基を示し、
    　Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して、炭素数１～４の炭化水素基を示し、
    　ｎは１以上の整数を示し、
    　Ｚｎ－はｎ価のアニオンを示す。〕
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     〔式（３）中、
    　Ｒ８は、炭素数９～３０のアルキル基を示し、
    　Ｒ９～Ｒ１１は、それぞれ独立して、炭素数１～４の炭化水素基を示し、
    　ｎ及びＺｎ－は前記と同義である。〕
  7. 　前記カチオン性界面活性剤が、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムである、
    請求項１～６のいずれか１項に記載の洗浄用組成物。
  8. 　前記カチオン性界面活性剤の濃度が、０．０１～２０％（ｗ／ｖ）である、
    請求項１～７のいずれか１項に記載の洗浄用組成物。
  9. 　前記ヒドロキシ酸エステルが、１～３個のヒドロキシ基及び１～３個のエステル結合を分子内に有するヒドロキシ酸エステルである、
    請求項１～８のいずれか１項に記載の洗浄用組成物。
  10. 　前記アミド系溶媒が、下記式（４）で表される溶媒である、
    請求項１～９のいずれか１項に記載の洗浄用組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     〔式（４）中、
    　Ｒ２１は、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を示し、
    　Ｒ２２及びＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、又はアリール基を示し、
    　Ｒ２１とＲ２２がともに炭素数１～４のアルキル基の場合には、互いに結合して環構造を形成していてもよい。〕
  11. 　前記カチオン性界面活性剤を少なくとも含み、更に前記ヒドロキシ酸エステル及び前記アミド系溶媒から選ばれる１種以上を含有する、
    請求項１～１０のいずれか１項に記載の洗浄用組成物。
  12. 　前記目的タンパク質を分離精製するプロセスが、アフィニティークロマトグラフィーである、
    請求項１～１１のいずれか１項に記載の洗浄用組成物。
  13. 　前記目的タンパク質が抗体である、
    請求項１～１２のいずれか１項に記載の洗浄用組成物。
  14. 　前記目的タンパク質の分離精製が、合成高分子又は天然高分子を固相とするアフィニティークロマトグラフィーによる分離精製である、
    請求項１～１３のいずれか１項に記載の洗浄用組成物。
  15. 　前記目的タンパク質の分離精製が、アガロース又はメタクリレート樹脂を固相とするアフィニティークロマトグラフィーによる分離精製である、
    請求項１～１４のいずれか１項に記載の洗浄用組成物。
  16. 　固相上に固定されたリガンドと、目的タンパク質及び不純物を含む混合液とを接触させ、前記リガンドと前記混合液中のタンパク質とを結合させる結合工程、
    　請求項１～１５のいずれか１項に記載の洗浄用組成物で、前記タンパク質が結合したリガンドが固定された固相を洗浄して不純物を除去する洗浄工程、並びに
    　溶出バッファーを用いて、前記洗浄工程で洗浄した固相から目的タンパク質を回収する回収工程、
    を含むことを特徴とするタンパク質精製方法。
  17. 　請求項１６に記載の精製方法により精製されたことを特徴とする、目的タンパク質。
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