JP2888587B2 - 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特異的なモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ及びそれを用いた検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素の測定方法 - Google Patents
癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特異的なモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ及びそれを用いた検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素の測定方法Info
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特
異的なモノクローナル抗体及び該抗体を産生するハイブ
リドーマに関する。
異的なモノクローナル抗体及び該抗体を産生するハイブ
リドーマに関する。
［従来の技術］ ガラクトース転移酵素（ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ（以下、GTと言うことがある））は、ウリジンジホ
スホガラクトース（UDP−ガラクトース）から種々の糖
蛋白質のオリゴ糖や単糖類の非還元残基へのガラクトー
ス転移を触媒する酵素であり、殆ど全ての組織に存在し
ている。このGTの異常な活性が種々の悪性腫瘍で認めら
れ、腫瘍マーカーとしてのGTの研究が行なわれた。その
結果、GTアイソザイムであるGT−IIの血清中の量が癌の
存在と密接な関係にあることが発見された。このGT−II
とは、Biochem.Biophys.Res.Common、65（２）、545−5
51、1075に記載されている通り、Native−PAGEにおいて
正常人に主として存在するGT−Ｉに比較し移動度の小さ
いGT酵素活性を有するバンドを定義したものである。
ーゼ（以下、GTと言うことがある））は、ウリジンジホ
スホガラクトース（UDP−ガラクトース）から種々の糖
蛋白質のオリゴ糖や単糖類の非還元残基へのガラクトー
ス転移を触媒する酵素であり、殆ど全ての組織に存在し
ている。このGTの異常な活性が種々の悪性腫瘍で認めら
れ、腫瘍マーカーとしてのGTの研究が行なわれた。その
結果、GTアイソザイムであるGT−IIの血清中の量が癌の
存在と密接な関係にあることが発見された。このGT−II
とは、Biochem.Biophys.Res.Common、65（２）、545−5
51、1075に記載されている通り、Native−PAGEにおいて
正常人に主として存在するGT−Ｉに比較し移動度の小さ
いGT酵素活性を有するバンドを定義したものである。
本発明者らはGT−IIについてさらに究明した結果、癌
に特異的なGTが存在し、GT−IIとしてNative−PAGEに認
められるバンドはその一現象に過ぎず、GT−Ｉのバン
ド、原点にも一部この癌特異性を有するGTが混在してい
ることを発見した（特願平１−4476号）。この癌に特異
的なGTは、これまで言及されてきたGT−IIとしての性質
を一部包含すると共に下記に限定されるようなその本質
となる物性を有するものである。すなわち、該GTは、癌
患者腹水よりα−ラクトアルブミンアガロースアフィニ
ティクロマトグラフィーにより精製され、SDS−PAGE還
元条件下電気泳動で約５万の分子量を示し、ネイティブ
の状態でMAb4880と反応性があり、一部自己会合してお
り、還元加熱処理によりMAb4880との反応性が増大する
と共に自己会合が亢進してゲル濾過クロマトグラフィー
で分子量20万以上の分画に検出される癌関連ヒト由来ガ
ラクトース転移酵素である。
に特異的なGTが存在し、GT−IIとしてNative−PAGEに認
められるバンドはその一現象に過ぎず、GT−Ｉのバン
ド、原点にも一部この癌特異性を有するGTが混在してい
ることを発見した（特願平１−4476号）。この癌に特異
的なGTは、これまで言及されてきたGT−IIとしての性質
を一部包含すると共に下記に限定されるようなその本質
となる物性を有するものである。すなわち、該GTは、癌
患者腹水よりα−ラクトアルブミンアガロースアフィニ
ティクロマトグラフィーにより精製され、SDS−PAGE還
元条件下電気泳動で約５万の分子量を示し、ネイティブ
の状態でMAb4880と反応性があり、一部自己会合してお
り、還元加熱処理によりMAb4880との反応性が増大する
と共に自己会合が亢進してゲル濾過クロマトグラフィー
で分子量20万以上の分画に検出される癌関連ヒト由来ガ
ラクトース転移酵素である。
［発明が解決しようとする課題］ 上述のように、癌に特異的なGTが分離され、腫瘍マー
カーとしても有用であることが示唆されている。従っ
て、本発明の目的は、上記した癌関連ヒト由来ガラクト
ース転移酵素に特異的に反応し、癌診断薬としての用途
を有する新規なモノクローナル抗体を提供することであ
る。
カーとしても有用であることが示唆されている。従っ
て、本発明の目的は、上記した癌関連ヒト由来ガラクト
ース転移酵素に特異的に反応し、癌診断薬としての用途
を有する新規なモノクローナル抗体を提供することであ
る。
［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、鋭意研究の結果、上記癌関連ヒト由来
ガラクトース転移酵素を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を作製することに成功し、また、該モノクローナ
ル抗体を用いて癌の診断が可能であることを見出し、こ
の発明を完成した。
ガラクトース転移酵素を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を作製することに成功し、また、該モノクローナ
ル抗体を用いて癌の診断が可能であることを見出し、こ
の発明を完成した。
すなわち、本発明は、癌患者腹水よりα−ラクトアル
ブミンアガロースアフィニティクロマトグラフィーによ
り精製され、SDS−PAGE還元条件下電気泳動で約５万の
分子量を示し、ネイティブの状態でMAb4880と反応性が
あり、一部自己会合しており、還元加熱処理によりMAb4
880との反応性が増大すると共に自己会合が亢進してゲ
ル濾過クロマトグラフィーで分子量20万以上の分画に検
出される癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特異的
なモノクローナル抗体を提供する。なお、MAb4880を産
生するハイブリドーマは、工業技術院生命工学工業技術
研究所にFERM BP−1758の受託番号で寄託されている。
ブミンアガロースアフィニティクロマトグラフィーによ
り精製され、SDS−PAGE還元条件下電気泳動で約５万の
分子量を示し、ネイティブの状態でMAb4880と反応性が
あり、一部自己会合しており、還元加熱処理によりMAb4
880との反応性が増大すると共に自己会合が亢進してゲ
ル濾過クロマトグラフィーで分子量20万以上の分画に検
出される癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特異的
なモノクローナル抗体を提供する。なお、MAb4880を産
生するハイブリドーマは、工業技術院生命工学工業技術
研究所にFERM BP−1758の受託番号で寄託されている。
また、本発明は本発明のモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマを提供する。
るハイブリドーマを提供する。
さらに、本発明は、上記本発明のモノクローナル抗体
と検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素とを特
異的に反応させることを含む検体中の癌関連ヒト由来ガ
ラクトース転移酵素の測定方法を提供する。
と検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素とを特
異的に反応させることを含む検体中の癌関連ヒト由来ガ
ラクトース転移酵素の測定方法を提供する。
［発明の効果］ 本発明により、癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素
を特異的に認識する新規なモノクローナル抗体及びそれ
を産生するハイブリドーマ並びにそれを用いた癌関連ヒ
ト由来ガラクトース転移酵素の測定方法が提供される。
本発明により、検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転
移酵素を測定することが可能になり、従って、本発明は
卵巣癌をはじめとする癌の診断に貢献する。
を特異的に認識する新規なモノクローナル抗体及びそれ
を産生するハイブリドーマ並びにそれを用いた癌関連ヒ
ト由来ガラクトース転移酵素の測定方法が提供される。
本発明により、検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転
移酵素を測定することが可能になり、従って、本発明は
卵巣癌をはじめとする癌の診断に貢献する。
［発明の具体的説明］ 本発明のモノクローナル抗体の作製方法を詳細に説明
する。
する。
本発明のモノクローナル抗体の作製に用いる免疫原
は、癌患者の腹水、例えば卵巣癌患者の腹水からCancer
Research 48巻、5325頁、1988年に記載の方法に従い、
α−ラクトアルブミンアフィニティークロマトグラフィ
ーにより正常人のGTと同様にして精製することができ
る。もっとも、卵巣癌患者に限らず、子宮癌、大腸癌、
肺癌、肺癌、食堂癌、肝臓癌等の癌患者にも存在し、ま
た、腹水に限らず血清その他の体液中にも存在する。
は、癌患者の腹水、例えば卵巣癌患者の腹水からCancer
Research 48巻、5325頁、1988年に記載の方法に従い、
α−ラクトアルブミンアフィニティークロマトグラフィ
ーにより正常人のGTと同様にして精製することができ
る。もっとも、卵巣癌患者に限らず、子宮癌、大腸癌、
肺癌、肺癌、食堂癌、肝臓癌等の癌患者にも存在し、ま
た、腹水に限らず血清その他の体液中にも存在する。
免疫原は、哺乳動物に免疫するが、免疫は一般的方法
により行なうことができる。すなわち、上記した免疫原
をフロイントコンプリートアジュバント等のアジュバン
トと共に腹腔内又は静脈内に投与することができる。
により行なうことができる。すなわち、上記した免疫原
をフロイントコンプリートアジュバント等のアジュバン
トと共に腹腔内又は静脈内に投与することができる。
次に、免疫動物から採取した脾細胞はマウス骨髄種細
胞と融合させる。骨髄種細胞としては既に公知の種々の
細胞、例えばX63−Ag 8.653等を用いることができる。
また、融合促進剤としてポリエチレングリコール（PE
G）等を用いることができる。脾細胞と骨髄種細胞との
混合比は１対１〜10対１程度が好ましい。
胞と融合させる。骨髄種細胞としては既に公知の種々の
細胞、例えばX63−Ag 8.653等を用いることができる。
また、融合促進剤としてポリエチレングリコール（PE
G）等を用いることができる。脾細胞と骨髄種細胞との
混合比は１対１〜10対１程度が好ましい。
細胞融合した後、通常の選択用培地で培養することに
よりハイブリドーマを選択することができる。前記した
骨髄種細胞はHAT培地中では成育できないためHAT培地中
で成育する細胞を選択すればよい。
よりハイブリドーマを選択することができる。前記した
骨髄種細胞はHAT培地中では成育できないためHAT培地中
で成育する細胞を選択すればよい。
ハイブリドーマのコロニーが充分に大きくなったとこ
ろで目的とする抗体を産生する株の検索及びクローニン
グを行なう。本発明においては、一般に抗体の検索に用
いられる方法、例えばELISA法等により行なうことがで
きる。免疫原に反応し、かつ血清タンパクと交差性のな
いものをさらに限外希釈法によりクローニングを行なう
ことによりモノクローナル化されたハイブリドーマを得
ることができる。
ろで目的とする抗体を産生する株の検索及びクローニン
グを行なう。本発明においては、一般に抗体の検索に用
いられる方法、例えばELISA法等により行なうことがで
きる。免疫原に反応し、かつ血清タンパクと交差性のな
いものをさらに限外希釈法によりクローニングを行なう
ことによりモノクローナル化されたハイブリドーマを得
ることができる。
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培
地中で培養し、培養上清から分離する方法又はハイブリ
ドーマをマウス腹腔内に投与し、その腹水より回収する
方法により得ることができる。さらに、一般的な方法、
硫酸沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等
を用いて精製することもできる。
地中で培養し、培養上清から分離する方法又はハイブリ
ドーマをマウス腹腔内に投与し、その腹水より回収する
方法により得ることができる。さらに、一般的な方法、
硫酸沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等
を用いて精製することもできる。
下記実施例において詳述するように、上記方法によ
り、MAb7907、MAb8513及びMAb8677という３つの本発明
のモノクローナル抗体が得られた。これらのモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマは微工研に寄託され
ており、その受託番号は下記実施例１に記載されてい
る。
り、MAb7907、MAb8513及びMAb8677という３つの本発明
のモノクローナル抗体が得られた。これらのモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマは微工研に寄託され
ており、その受託番号は下記実施例１に記載されてい
る。
本発明のモノクローナル抗体を用いて検体中の癌関連
ヒト由来ガラクトース転移酵素を測定することは、抗体
と抗原との間の特異的な抗原抗体反応を利用した従来の
イムノアッセイに基づいて行なうことができる。例え
ば、常法であるサンドイッチアッセイにより行なうこと
ができる。サンドイッチアッセイの場合には、本発明の
モノクローナル抗体を適当な固相担体、例えばマイクロ
プレートやプラスチックビーズ等に固定し、検体と接触
させた後、例えば125I等のラジオアイソトープ、ペルオ
キシダーゼ等の酵素で標識した、抗原決定基の異なる第
２抗体を作用させ、洗浄後、標識を測定することによっ
て行なうことができる。この場合、第２抗体としては、
モノクローナル抗体MAb4880並びに後述の実施例におい
て詳述するモノクローナル抗体MAb8507及びMAb8628を好
ましく用いることができる。
ヒト由来ガラクトース転移酵素を測定することは、抗体
と抗原との間の特異的な抗原抗体反応を利用した従来の
イムノアッセイに基づいて行なうことができる。例え
ば、常法であるサンドイッチアッセイにより行なうこと
ができる。サンドイッチアッセイの場合には、本発明の
モノクローナル抗体を適当な固相担体、例えばマイクロ
プレートやプラスチックビーズ等に固定し、検体と接触
させた後、例えば125I等のラジオアイソトープ、ペルオ
キシダーゼ等の酵素で標識した、抗原決定基の異なる第
２抗体を作用させ、洗浄後、標識を測定することによっ
て行なうことができる。この場合、第２抗体としては、
モノクローナル抗体MAb4880並びに後述の実施例におい
て詳述するモノクローナル抗体MAb8507及びMAb8628を好
ましく用いることができる。
本発明のモノクローナル抗体を癌診断に応用する場
合、通常検体としては体液が用いられ、特に血清が好ま
しく用いられる。
合、通常検体としては体液が用いられ、特に血清が好ま
しく用いられる。
本発明のモノクローナル抗体は、癌関連ガラクトース
転移酵素が自己会合した状態の高分子分画に選択的特異
性が高いことが分かっているが、血清中ではほとんどの
癌関連ガラクトース転移酵素は自己会合していない低分
子状態で存在している。しかしながら、本発明のモノク
ローナル抗体を固相に固定化して用いる場合、比較的高
い温度、好ましくは37℃以上、56℃以下で反応させるこ
とにより、抗原との反応性を高めることができる。これ
は熱により癌関連ガラクトース転移酵素の立体構造的な
変化が生じ、抗体との反応性が増すものと考えられる。
転移酵素が自己会合した状態の高分子分画に選択的特異
性が高いことが分かっているが、血清中ではほとんどの
癌関連ガラクトース転移酵素は自己会合していない低分
子状態で存在している。しかしながら、本発明のモノク
ローナル抗体を固相に固定化して用いる場合、比較的高
い温度、好ましくは37℃以上、56℃以下で反応させるこ
とにより、抗原との反応性を高めることができる。これ
は熱により癌関連ガラクトース転移酵素の立体構造的な
変化が生じ、抗体との反応性が増すものと考えられる。
［実施例］ 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
実施例１ 免疫原の調製 卵巣癌患者腹水１をCancer Research 48巻、5325
頁、1988年に記載の方法に従い、α−ラクトアルブミン
アフィニティクロマトグラフィーにより精製し、ガラク
トース転移酵素2.5mgを得た。すなわち、腹水は精製水
で４℃一晩透析後、不溶物を遠心して取り除きトリスバ
ッファー（pH7.2）、マンガンクロライド（MnCl2）、Ｎ
−アセチルグルコサミンをそれぞれ20mM、10mM、5mMに
なるように加えα−ラクトアルブミンアフィニティカラ
ム（2.5cm×50cm）に流した。上記バッファー１でカ
ラムを洗浄した後、Ｎ−アセチルグルコサミンを含まな
いバッファーで溶出を行なうGT画分を得た。得られたGT
画分はさらにα−ラクトアルブミンアフィニティカラム
で同様に操作を行ないさらに精製した。
頁、1988年に記載の方法に従い、α−ラクトアルブミン
アフィニティクロマトグラフィーにより精製し、ガラク
トース転移酵素2.5mgを得た。すなわち、腹水は精製水
で４℃一晩透析後、不溶物を遠心して取り除きトリスバ
ッファー（pH7.2）、マンガンクロライド（MnCl2）、Ｎ
−アセチルグルコサミンをそれぞれ20mM、10mM、5mMに
なるように加えα−ラクトアルブミンアフィニティカラ
ム（2.5cm×50cm）に流した。上記バッファー１でカ
ラムを洗浄した後、Ｎ−アセチルグルコサミンを含まな
いバッファーで溶出を行なうGT画分を得た。得られたGT
画分はさらにα−ラクトアルブミンアフィニティカラム
で同様に操作を行ないさらに精製した。
上記のようにして得られた癌関連ガラクトース転移酵
素0.5mgを、リン酸緩衝液（PBS）1.0mlに溶解したもの
を免疫原として用いた。
素0.5mgを、リン酸緩衝液（PBS）1.0mlに溶解したもの
を免疫原として用いた。
免疫及び細胞融合 Balb/cマウス（雌、６週令）に上記で調製した免疫原
0.5mlにフロイントコンプリートアジュバント0.5mlを加
え充分に混和したもの0.2mlを腹腔内に注射した。以
後、同様に３週間後フロイントインコンプリートアジュ
バントを用いる以外は同様に0.2mlを腹腔内に注射し、
さらに２週間後に免疫原100μｇのみを尾に静脈注射し
た。
0.5mlにフロイントコンプリートアジュバント0.5mlを加
え充分に混和したもの0.2mlを腹腔内に注射した。以
後、同様に３週間後フロイントインコンプリートアジュ
バントを用いる以外は同様に0.2mlを腹腔内に注射し、
さらに２週間後に免疫原100μｇのみを尾に静脈注射し
た。
最終免疫３日後、マウスの脾細胞を摘出し、RPMI1640
培地にて洗浄した。脾臓細胞４×108個の浮遊液とマウ
スミエローマ細胞（X63−Ag8.653）８×107の浮遊液を
混合し、遠心分離にて培地を除去した。37℃に加温した
水浴中で混合した細胞にポリエチレングリコール−RPMI
1640培地1mlを徐々に加えて穏やかに攪拌させ融合を行
なった。遠心分離により培地を除去し、細胞に15％牛胎
児血清含有RPMI1640培地40mlを加えた後、96穴プレート
に１穴当たり0.15mlずつ分配した。翌日、HAT培地（４
×10-7Ｍアミノプテリン、1.6×10-5Ｍチミジン、１×1
0-4Ｍヒポキサンチン、10％牛胎児血清を含むRPMI1640
培地）0.15mlを各ウエルに加えた。各ウエルの培地は、
更に３日又は４日ごとにHAT培地に半量ずつ交換した。
培養２週間後、約80％のウエルにハイブリドーマの生育
が認められた。
培地にて洗浄した。脾臓細胞４×108個の浮遊液とマウ
スミエローマ細胞（X63−Ag8.653）８×107の浮遊液を
混合し、遠心分離にて培地を除去した。37℃に加温した
水浴中で混合した細胞にポリエチレングリコール−RPMI
1640培地1mlを徐々に加えて穏やかに攪拌させ融合を行
なった。遠心分離により培地を除去し、細胞に15％牛胎
児血清含有RPMI1640培地40mlを加えた後、96穴プレート
に１穴当たり0.15mlずつ分配した。翌日、HAT培地（４
×10-7Ｍアミノプテリン、1.6×10-5Ｍチミジン、１×1
0-4Ｍヒポキサンチン、10％牛胎児血清を含むRPMI1640
培地）0.15mlを各ウエルに加えた。各ウエルの培地は、
更に３日又は４日ごとにHAT培地に半量ずつ交換した。
培養２週間後、約80％のウエルにハイブリドーマの生育
が認められた。
ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマ培養上清中の抗体の検索は、抗原とし
て上記免疫原の調製で得た癌関連ガラクトース転移酵素
を用いてELISA法にて行なった。
て上記免疫原の調製で得た癌関連ガラクトース転移酵素
を用いてELISA法にて行なった。
抗原をPBS中２μg/m1の濃度でELISA用マイクロタイタ
ープレートに吸着させ、１％BSA・PBS溶液にてブロッキ
ングした後、培養上清を反応させた。更に、パーオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を反応さ
せ、基質としてオルトフェニレンジアミンを用いて492n
mにおける吸光度を測定することにより目的の抗体を検
出した。その結果、都合14回の細胞融合にて作製したハ
イブリドーマ中、癌関連ガラクトース転移酵素と反応
し、血清タンパク質と反応しないハイブリドーマ８つが
得られた。
ープレートに吸着させ、１％BSA・PBS溶液にてブロッキ
ングした後、培養上清を反応させた。更に、パーオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を反応さ
せ、基質としてオルトフェニレンジアミンを用いて492n
mにおける吸光度を測定することにより目的の抗体を検
出した。その結果、都合14回の細胞融合にて作製したハ
イブリドーマ中、癌関連ガラクトース転移酵素と反応
し、血清タンパク質と反応しないハイブリドーマ８つが
得られた。
得られたハイブリドーマはHAT培地からアミノプテリ
ンを除いたHT培地に移し、更に10％牛胎児血清（FCS）
含有RPMI1640培地に移し培養した。
ンを除いたHT培地に移し、更に10％牛胎児血清（FCS）
含有RPMI1640培地に移し培養した。
次に、得られたハイブリドーマを限定希釈法によりク
ローニングした。すなわち、96穴プレートに１穴当り0.
5〜４個の密度に細胞を希釈して１穴当り106個のマウス
胸腺細胞と共に培養し、２週間後にELISA法にて抗体産
生細胞を選択した。クローニングを更に繰り返し、安定
なハイブリドーマ（MAb7907、MAb8513、MAb8677、MAb86
28MAb8507、MAb8611、MAb8913、MAb8919）が得られた。
ローニングした。すなわち、96穴プレートに１穴当り0.
5〜４個の密度に細胞を希釈して１穴当り106個のマウス
胸腺細胞と共に培養し、２週間後にELISA法にて抗体産
生細胞を選択した。クローニングを更に繰り返し、安定
なハイブリドーマ（MAb7907、MAb8513、MAb8677、MAb86
28MAb8507、MAb8611、MAb8913、MAb8919）が得られた。
モノクローナル抗体MAb7907、MAb8513は、ELISA法に
よりクラスはIgMと決定され、MAb8628、MAb8677、MAb85
07、MAb8611、MAb8919はIgG1と決定され、MAb8913はIgG
2bと決定された。このうちハイブリドーマMAb7907、MAb
8513、MAb8628、MAb8677は工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託され、その受託番号はそれぞれ微工研菌寄11
220号、同11219号、同11221号、同11222号である。
よりクラスはIgMと決定され、MAb8628、MAb8677、MAb85
07、MAb8611、MAb8919はIgG1と決定され、MAb8913はIgG
2bと決定された。このうちハイブリドーマMAb7907、MAb
8513、MAb8628、MAb8677は工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託され、その受託番号はそれぞれ微工研菌寄11
220号、同11219号、同11221号、同11222号である。
実施例２ 抗原の抗原決定基解析 実施例１で精製された免疫原を１μg/mlの濃度にPBS
で調整したものをマイクロタイタープレート（ヌンク社
製）に固定した。PBSで洗浄後、１％BSAでブロッキング
した。次に、過ヨウ素酸法によりホースラディッシュペ
ルオキシダーゼ（HRP）で標識したMAb4880、MAb7907
（以下、MAb4880−HRP、MAb7907−HRPのように記載す
る。また、これらを総称してラベル体という）を１％BS
Aで2000倍に希釈したもの100μｌをプレートに加え37
℃、１時間反応させた。反応後、PBSで洗浄し、基質と
してｏ−フェニレンジアミンを加えて発色させ波長492n
mにおける吸光度を測定した。また、MAb4880−HRP、MAb
7907−HRPそれぞれに表１に示すモノクローナル抗体を
濃度10μg/mlになるように加えて、同様の操作を行な
い、その影響を測定した。その結果を表１に示す。
で調整したものをマイクロタイタープレート（ヌンク社
製）に固定した。PBSで洗浄後、１％BSAでブロッキング
した。次に、過ヨウ素酸法によりホースラディッシュペ
ルオキシダーゼ（HRP）で標識したMAb4880、MAb7907
（以下、MAb4880−HRP、MAb7907−HRPのように記載す
る。また、これらを総称してラベル体という）を１％BS
Aで2000倍に希釈したもの100μｌをプレートに加え37
℃、１時間反応させた。反応後、PBSで洗浄し、基質と
してｏ−フェニレンジアミンを加えて発色させ波長492n
mにおける吸光度を測定した。また、MAb4880−HRP、MAb
7907−HRPそれぞれに表１に示すモノクローナル抗体を
濃度10μg/mlになるように加えて、同様の操作を行な
い、その影響を測定した。その結果を表１に示す。
表１により、上記の抗体は以下のように３つに分類す
ることができる。
ることができる。
グループ1:MAb4880、MAb8507、MAb8628 グループ2:MAb7907、MAb8513、MAb8677 グループ3:MAb8611、MAb8913、MAb8919 また、サンドイッチアッセイの抗体の組み合わせにつ
いて同一グループの組み合わせは避けるべきであること
が予想される。さらに、下記実施例３に記載されている
ように、本発明のモノクローナル抗体は上記グループ２
のモノクローナル抗体であるが、サンドイッチアッセイ
を行なう場合には、グループ２の本発明のモノクローナ
ル抗体を固相に固定し、第２抗体としてグループ１のモ
ノクローナル抗体を用いることが好ましい。
いて同一グループの組み合わせは避けるべきであること
が予想される。さらに、下記実施例３に記載されている
ように、本発明のモノクローナル抗体は上記グループ２
のモノクローナル抗体であるが、サンドイッチアッセイ
を行なう場合には、グループ２の本発明のモノクローナ
ル抗体を固相に固定し、第２抗体としてグループ１のモ
ノクローナル抗体を用いることが好ましい。
実施例３ 実施例１で得られた免疫原をビオチン化後、Sup−12
FPLCゲル濾過クロマトグラフィー（ファルマシア社製）
にて分画した（溶媒:PBS、流量:0.5ml/min）。分子量約
50万から約200の画分をＰ−１、分子量約５万から約30
万の画分をＰ−２とした。マイクロタイタープレートに
表２に示す各種抗体を濃度10μg/mlで固定化した。１％
BSAでブロッキングした後、Ｐ−１又はＰ−２を１％BSA
で所定の濃度に希釈したもの100μｌを加えて37℃１時
間反応させた。反応後、PBSで洗浄し、ストレプトアビ
ジン−HRPを１％BSAで2000倍に希釈したもの100μｌを
加え室温で30分間反応させた。反応後、PBSで洗浄し、
ｏ−フェニレンジアミンを加えて発色させ波長492nmに
おける吸光度を測定した。結果を表２に示す。
FPLCゲル濾過クロマトグラフィー（ファルマシア社製）
にて分画した（溶媒:PBS、流量:0.5ml/min）。分子量約
50万から約200の画分をＰ−１、分子量約５万から約30
万の画分をＰ−２とした。マイクロタイタープレートに
表２に示す各種抗体を濃度10μg/mlで固定化した。１％
BSAでブロッキングした後、Ｐ−１又はＰ−２を１％BSA
で所定の濃度に希釈したもの100μｌを加えて37℃１時
間反応させた。反応後、PBSで洗浄し、ストレプトアビ
ジン−HRPを１％BSAで2000倍に希釈したもの100μｌを
加え室温で30分間反応させた。反応後、PBSで洗浄し、
ｏ−フェニレンジアミンを加えて発色させ波長492nmに
おける吸光度を測定した。結果を表２に示す。
表２より、グループ２のモノクローナル抗体は癌関連
ガラクトース転移酵素を含む高分子画分であるＰ−１に
反応し、正常人に存在するガラクトース転移酵素を含む
Ｐ−２に殆ど反応しないことが分かる。一方、グループ
１の抗体MAb4880、MAb8507、MAb8628及びグループ３のM
Ab8913は、Ｐ−１に反応性を有するが、正常人に存在す
るガラクトース転移酵素を含むＰ−２に対しても反応性
を有し、グループ３のMAb8611、MAb8919はＰ−２に対し
反応性を有していることが分かる。すなわち、癌関連ガ
ラクトース転移酵素に特異的に反応する本発明のモノク
ローナル抗体としてMAb7907、MAb8513、MAb8677が得ら
れた。
ガラクトース転移酵素を含む高分子画分であるＰ−１に
反応し、正常人に存在するガラクトース転移酵素を含む
Ｐ−２に殆ど反応しないことが分かる。一方、グループ
１の抗体MAb4880、MAb8507、MAb8628及びグループ３のM
Ab8913は、Ｐ−１に反応性を有するが、正常人に存在す
るガラクトース転移酵素を含むＰ−２に対しても反応性
を有し、グループ３のMAb8611、MAb8919はＰ−２に対し
反応性を有していることが分かる。すなわち、癌関連ガ
ラクトース転移酵素に特異的に反応する本発明のモノク
ローナル抗体としてMAb7907、MAb8513、MAb8677が得ら
れた。
実施例４ 本発明の抗体MAb8513を濃度10μl/mlで1/4インチプラ
スチックビーズに４℃で一晩固定した。PBSで洗浄後、
１％BSA・PBSで37℃、一昼夜ブロッキングした。反応ト
レイに卵巣癌患者27人、良性卵巣腫瘍患者53人及び正常
人37人の血清検体50μｌ、1MNaC1を含む100mMリン酸緩
衝液（pH6.0）150μｌ及び上記ビーズを加え45℃で２時
間反応させた。反応後、PBSで３回洗浄し、MAb8628−HR
Pを１％BSA,1MNaC1を含む20mMリン酸緩衝液（pH7.3）で
2000倍に希釈したもの200μｌを加え37℃１時間反応さ
せた。反応終了後、PBSで４回洗浄し、３μg/mlのｏ−
フェニレンジアミン300μｌを加えた試験管にビーズを
移し発色反応を室温で30分間行なった。反応後、1N硫酸
1mlを加え波長492nmで吸光度を測定した。予め設定した
キャリブレータに対する相対濃度で表示した。結果を図
に示す。
スチックビーズに４℃で一晩固定した。PBSで洗浄後、
１％BSA・PBSで37℃、一昼夜ブロッキングした。反応ト
レイに卵巣癌患者27人、良性卵巣腫瘍患者53人及び正常
人37人の血清検体50μｌ、1MNaC1を含む100mMリン酸緩
衝液（pH6.0）150μｌ及び上記ビーズを加え45℃で２時
間反応させた。反応後、PBSで３回洗浄し、MAb8628−HR
Pを１％BSA,1MNaC1を含む20mMリン酸緩衝液（pH7.3）で
2000倍に希釈したもの200μｌを加え37℃１時間反応さ
せた。反応終了後、PBSで４回洗浄し、３μg/mlのｏ−
フェニレンジアミン300μｌを加えた試験管にビーズを
移し発色反応を室温で30分間行なった。反応後、1N硫酸
1mlを加え波長492nmで吸光度を測定した。予め設定した
キャリブレータに対する相対濃度で表示した。結果を図
に示す。
図より、本発明のモノクローナル抗体MAb8513により
卵巣癌の検出ができることが確認された。
卵巣癌の検出ができることが確認された。
図は、本発明のモノクローナル抗体を用いて卵巣癌患
者、良性卵巣腫瘍患者及び正常人の血清中の癌関連ヒト
由来ガラクトース転移酵素を測定した結果を示す。
者、良性卵巣腫瘍患者及び正常人の血清中の癌関連ヒト
由来ガラクトース転移酵素を測定した結果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 阪口 孝 東京都日野市さくら町１番地 コニカ株 式会社内 (56)参考文献 特開 昭62−174100（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−186984（ＪＰ，Ａ) Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖ ｏｌ．44（1984）ｐ．5725−5732 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖ ｏｌ．48（1988）ｐ．5325−5334 癌と化学療法，Ｖｏｌ．16［４ ］（1989）ｐ．1147−1151 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/06 C12N 5/16 - 5/20 C12P 21/08 G01N 33/573 - 33/574 G01N 33/577 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (3)
- 【請求項１】癌患者腹水よりα−ラクトアルブミンアガ
ロースアフィニティクロマトグラフィーにより精製さ
れ、SDS−PAGE還元条件下電気泳動で約５万の分子量を
示し、ネイティブの状態でMAb4880と反応性があり、一
部自己会合しており、還元加熱処理によりMAb4880との
反応性が増大すると共に自己会合が亢進してゲル濾過ク
ロマトグラフィーで分子量20万以上の分画に検出される
癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特異的なモノク
ローナル抗体。 - 【請求項２】請求項１記載のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ。 - 【請求項３】請求項１のモノクローナル抗体と検体中の
癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素とを特異的に反応
させることを含む検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース
転移酵素の測定方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2054567A JP2888587B2 (ja) | 1990-03-06 | 1990-03-06 | 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特異的なモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ及びそれを用いた検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素の測定方法 |
| EP91103351A EP0445750A1 (en) | 1990-03-06 | 1991-03-06 | Anti-cancer-related human galactosyltransferase monoclonal antibody |
| US07/911,273 US5308769A (en) | 1989-01-11 | 1992-07-09 | Cancer-related human galactosyltransferase GT-II |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2054567A JP2888587B2 (ja) | 1990-03-06 | 1990-03-06 | 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特異的なモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ及びそれを用いた検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03259093A JPH03259093A (ja) | 1991-11-19 |
| JP2888587B2 true JP2888587B2 (ja) | 1999-05-10 |
Family
ID=12974269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2054567A Expired - Fee Related JP2888587B2 (ja) | 1989-01-11 | 1990-03-06 | 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特異的なモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ及びそれを用いた検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素の測定方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0445750A1 (ja) |
| JP (1) | JP2888587B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5955282A (en) * | 1998-04-03 | 1999-09-21 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human galactosyltransferases |
| WO2009028417A1 (ja) * | 2007-08-24 | 2009-03-05 | Tokyo Institute Of Technology | 婦人科癌の検出方法 |
| US10247733B2 (en) | 2011-07-26 | 2019-04-02 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Antibody for detecting epithelial ovarian cancer marker and method for diagnosing epithelial ovarian cancer |
| EP2738252B1 (en) | 2011-07-26 | 2019-07-10 | National Institute of Advanced Industrial Science And Technology | Antibody for detecting epithelial ovarian cancer marker and method for diagnosing epithelial ovarian cancer |
| JP6147340B2 (ja) * | 2013-05-29 | 2017-06-14 | Jsr株式会社 | 洗浄用組成物、タンパク質精製方法、及びタンパク質 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4797356A (en) * | 1985-12-02 | 1989-01-10 | Konishiroku Photo Industries, Co., Ltd | Monoclonal antibodies specific to glactosyltransferase isoenzyme II and their use in cancer immunoassays |
| JP2813982B2 (ja) * | 1989-01-11 | 1998-10-22 | コニカ株式会社 | 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素 |
-
1990
- 1990-03-06 JP JP2054567A patent/JP2888587B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-03-06 EP EP91103351A patent/EP0445750A1/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４４（１９８４）ｐ．５７２５−５７３２ |
| Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４８（１９８８）ｐ．５３２５−５３３４ |
| 癌と化学療法，Ｖｏｌ．１６［４］（１９８９）ｐ．１１４７−１１５１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0445750A1 (en) | 1991-09-11 |
| JPH03259093A (ja) | 1991-11-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |