JP2013504621A - プロテインaの結晶および架橋した結晶ならびにその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2009年9月15日に出願された米国仮出願番号61/242,537の利益を主張し、上記米国仮出願の開示は、その全容が参考として本明細書に援用される。
プロテインAは、もともとは細菌Staphylococcus aureusの細胞壁において見いだされた40〜60kDaの表面タンパク質である。プロテインAは、免疫グロブリンに結合することができるので、生化学の研究における用途が見いだされている。プロテインAは、多くの哺乳動物種由来のタンパク質、とりわけIgGに結合する。プロテインAは、免疫グロブリンのFc領域に、重鎖と相互作用することによって結合する。免疫学および他の生物学的の研究において使用するために、組換え型のStaphylococcusのプロテインAがE.coliにおいて作製されることも多い。プロテインAは多くの場合、蛍光色素、酵素、ビオチン、コロイド金または放射性ヨウ素などの他の分子と、抗体結合部位に影響を及ぼすことなくカップリングされる。同様に、プロテインAは、磁気、ラテックスおよびアガロースビーズとカップリングされて広く利用されている。プロテインAは多くの場合、固体支持体上に固定化され、血清または腹水などの粗製のタンパク質混合物から総IgGを精製するための信頼できる方法として使用されているか、または上記のマーカーの1つとカップリングされて抗体の存在を検出する。ビーズと結合体化したプロテインAを用いた免疫沈降試験も、タンパク質またはタンパク質複合体を、目的のタンパク質またはタンパク質複合体に対する抗体によって間接的に精製するために一般に使用されている。さらに、プロテインAは、多種多様な供給源からのモノクローナル抗体の精製において広く使用されている。
本発明は、一部において、例えば、抗体を精製するための革新的なプロテインAシステム(例えば、クロマトグラフィーシステム)を開発するために作製される、プロテインAの架橋したタンパク質の結晶(CLPC)を調製することに関する。プロテインAのCLPCにより、高い安定性および耐化学性と共に、高度に濃縮されたプロテインA活性という利点が提供される。プロテインAの濃度が濃縮されることにより、カラムサイズ(使用する場合)、緩衝液の容積およびプロセスの時間が縮小する。さらに、プロテインAの結晶を架橋することにより、例えば、免疫グロブリン(例えば、抗体)を精製(例えば、クロマトグラフィーを使用して)する間にプロテインAが浸出することを防ぐかまたは減少させることができる。全体として、これにより抗体作製の時間および費用が縮小する。
本発明は、結晶性のプロテインAおよび架橋したプロテインAを含む組成物、および、そのような結晶性組成物を作出し、微生物、血清、血漿、哺乳動物の細胞培養物から免疫グロブリン/抗体またはFc断片、Fab断片、単鎖抗体およびモノクローナル抗体を分離するために使用する方法に関する。本明細書に記載の結晶性組成物は、他の物質との混合物における免疫グロブリンを含有する液体由来の少なくとも1種の免疫グロブリンに、そのFc部分を通じて結合することができる。
タンパク質の結晶を、水溶液または水溶液を含有する有機溶媒からタンパク質を制御結晶化することによって成長させる。制御する条件としては、例えば、溶媒の蒸発速度、適切な共溶質および緩衝剤の存在、pHならびに温度が挙げられる。タンパク質の結晶化に影響を及ぼすさまざまな因子についての包括的な総説は、McPherson、Methods Enzymol.、114巻、112〜20頁(1985年)によって公開されている。McPhersonおよびGilliland、J. Crystal Growth、90巻、51〜59頁(1988年)に、結晶化されたタンパク質および核酸、ならびにそれらが結晶化された条件の包括的な一覧が編集されている。結晶および結晶化の方法の大要、ならびに解明されたタンパク質および核酸の構造の座標のリポジトリは、Brookhaven National LaboratoryにおけるProtein Data Bankによって維持されている[http//www.pdb.bnl.gov;Bernsteinら、J. Mol. Biol.、112巻、535〜42頁(1977年)]。これらの参考文献を使用して、適切な架橋したタンパク質の結晶を形成するための前段階として、タンパク質を結晶化するために必要な条件を決定することができ、ならびに他のタンパク質に対する結晶化戦略をガイドすることができる。あるいは、知的試行錯誤検索戦略(intelligent trial and error search strategy)により、ほとんどの場合、多くのタンパク質について、適切な結晶化の条件を提示することができ、許容できるレベルの純度を実現することができる[例えば、C.W. Carter、Jr.およびC.W. Carter、J. Biol. Chem.、254巻、12219〜23頁(1979年)を参照されたい]。
安定化された結晶。プロテインAの結晶を適切な媒質において成長させたら、それらを、場合によって、例えば架橋によって安定化することができる。架橋により、構成物である結晶のタンパク質分子間に共有結合性の連結が導入されることによって結晶格子が安定化する。これにより、タンパク質を、結晶格子が存在することと、またはさらにインタクトなタンパク質が存在することと適合しないであろう代替の環境に移すことが可能になる。プロテインAの結晶は、例えば、リシンのアミン基、チオール(スルフヒドリル)基、および炭水化物部分を通じて架橋することができる。架橋した結晶も、本明細書において「プロテインA−CLPC」、「CLPC−プロテインA」または「CLPC」と称される。
I.反応性のアシルドナー、例えば:カルボン酸エステルRCOOR’、アミドRCONHR’、アシルアジドRCON3、カルボジイミドR−N=C=N−R’、Nヒドロキシイミドエステル、RCO−O−NR’、イミドエステルR−C=NH2+(OR’)、無水物RCO−O−COR’、カーボネートRO−CO−O−R’、ウレタンRNHCONHR’、酸ハロゲン化物RCOHal(Hal=ハロゲン)、アシルヒドラジドRCONNR’R’’、およびOアシルイソ尿素RCO−O−C=NR’(−NR’’R’’’)など、
II.反応性のカルボニル基、例えば、アルデヒドRCHOおよびケトンRCOR’、アセタールRCO(H2)R’、およびケタールRR’CO2R’R’’など(タンパク質の固定化および架橋の当業者に公知の官能基を含有する反応性のカルボニルは、文献に記載されている(Pierceカタログおよびハンドブック、Pierce Chemical Company、Rockford、111.(1994年);S. S. Wong、Chemistry of Protein Conjugation and Cross−linking、CRC Press、Boca Raton、Fla.(1991年))、
III.アルキルドナーまたはアリールドナー、例えば:ハロゲン化アルキルまたはハロゲン化アリールR−Hal、アジドR−N3、硫酸エステルRSO3R’、リン酸エステルRPO(OR’3)、アルキルオキソニウム塩R3O+、スルホニウムR3S+、硝酸エステルRONO2、MichaelアクセプターRCR’=CR’’’COR’’、フッ化アリールArF、イソニトリルRN+=C−、ハロアミンR2N−Hal、アルケン、およびアルキンなど、
IV.硫黄含有基、例えば、ジスルフィドRSSR’、スルフヒドリルRSH、およびエポキシドR2C_OCR’2など、および
V.塩、例えば、アルキルアンモニウム塩またはアリールアンモニウム塩R4N+、カルボン酸塩RCOO−、硫酸塩ROSO3−、リン酸塩ROPO3’’、およびアミンR3Nなど。
諸言
抗体を精製するための革新的なプロテインAクロマトグラフィーシステムを開発するために、プロテインAの架橋した結晶(CLPC)を作製した。プロテインAのCLPCにより、高い安定性および耐化学性と併せて高度に濃縮されたプロテインA活性という利点が提供される。濃縮したプロテインAの濃度により、カラムサイズ、緩衝液の容積およびプロセスの時間が縮小する。さらに、プロテインAの結晶の架橋により、クロマトグラフィーの間にプロテインAが浸出することが防がれる。全体として、これにより、抗体を作成する時間および費用が低下する。
抗体を精製するための架橋したプロテインA結晶を開発すること。
・組換え型のプロテインA、Repligen Corporation、カタログ番号rPA50。
・組換え型のプロテインA、Fitzgerald International、カタログ番号30−AP75。
・Amicon Ultra−4遠心濾過ユニット、Millipore、カタログ番号UFC801008。
・Nalgene MF75 Series Disposable Sterilization Filterユニット、0.2ミクロン、Fisher Scientific、カタログ番号09−740−36K。
・pH導電率計、Denver Instrument、モデル220。
・シリコン処理した円形カバースライド:Hampton Research、カタログ番号HR3−233。
・VDXTMプレート、Hampton Research、カタログ番号HR3−140。
・8453紫外可視分光光度計、Agilent Technologies。
・硫酸アンモニウム、Fisher Scientific、カタログ番号BP212R−1。
・塩酸溶液、Fisher Scientifics、カタログ番号A481−212。
・カコジル酸ナトリウム三水和物、Sigma−Aldrich、カタログ番号C0250。
・塩化ナトリウム、Fisher Scientific、カタログ番号S271−3。
・トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Trizma Base)、Sigma−Aldrich、カタログ番号T−4661。
・DI(逆浸透&脱イオン)H2O。
・Crystal Screen Kit、Hampton Research、カタログ番号HR2−110。
・Crystal Screen 2 Kit、Hampton Research、カタログ番号HR2−112。
・JBScreen Classic1、Jena Bioscience、カタログ番号CS−101L。
・JBScreen Classic2、Jena Bioscience、カタログ番号CS−102L。
・JBScreen Classic3、Jena Bioscience、カタログ番号CS−103L。
・JBScreen Classic4、Jena Bioscience、カタログ番号CS−104L。
・Wizard I ランダムスパースマトリックス結晶化スクリーニング、Emerald BioSystems。
・Wizard II ランダムスパースマトリックス結晶化スクリーニング、Emerald BioSystems。
組換え型のプロテインAの結晶化を、懸滴蒸気拡散結晶化法を用いて行った。プロテインAの結晶を、1mlのバッチサイズにスケールアップし、架橋した。
3.5Mの硫酸アンモニウム
硫酸アンモニウム46.2gを100mlのDI H2Oに溶解させ、溶液を滅菌濾過した。
カコジル酸ナトリウム21.4gを80mlのDI H2Oに溶解させた。濃HCl溶液を用いてpHを6.5に調整した。次いで、DI H2Oを用いて緩衝溶液を100mlに調整し、0.2ミクロンのNalgene Filterユニットを用いて滅菌濾過した。
塩化ナトリウム29.2gを100mlのDI H2Oに溶解させ、溶液を滅菌濾過した。
3.5Mの硫酸アンモニウム2.86mlを、1Mのカコジル酸ナトリウム0.5ml、pH6.5、5Mの塩化ナトリウム0.2mlおよび1.44mlの濾過したDI H2Oと混合することによってWizard IIスクリーニングキットの社内処方♯4を調製した。
Trizma Base12.11gを80mlのDI H2Oに溶解させた。濃HCl溶液を用いてpHを7に調整した。DI H2Oを用いて緩衝液を100mlに調整し、滅菌濾過した。次いで、1Mのトリス−HCl緩衝液を濾過したDI H2Oで100倍に希釈した。
最初の結晶化スクリーニングを、Fitzgerald Internationalからの組換え型のプロテインAを、DI H2O中50.6mg/mlで用いて実施した。Hampton Researchからの懸滴蒸気拡散結晶化法を使用して(参考文献を参照されたい)、プロテインA試料を室温で、24ウェルプレート中、1:1のタンパク質/試薬比で、以下の8つの異なるスクリーニングキットを用いてスクリーニングした:JBScreen Classic1、JBScreen Classic2、JBScreen Classic3、JBScreen Classic4、Wizard I、Wizard II、Hampton Crystal ScreenおよびHampton Crystal Screen2。加えて、120mg/mlに濃縮したプロテインA試料を用いて、Amicon遠心濾過ユニットで結晶スクリーニングを実施した(タンパク質の濃度は、280nmにおける分光測定によって決定した)。
バッチにおいて、Fitzgerald Internationalからの組換え型のプロテインAを用いて、最初の懸滴結晶化スクリーニングにおいて結晶を作製した条件の1つ(すなわち、2Mの硫酸アンモニウム、0.1Mのカコジル酸緩衝液、pH6.5および0.2MのNaClを含有するWizard IIマトリックス結晶化スクリーニングの処方♯4)を用いてプロテインAの結晶化をセットアップした。FitzgeraldのプロテインA試料を、「懸滴におけるプロテインAの結晶化」の節に記載の通り120mg/mlまで濃縮し、30μlのマイクロバッチにおいて、上記の結晶化試薬を用いて結晶スクリーニングを実施した。バッチを、6日から15日間、ひっくり返さずに室温でインキュベートした。バッチ結晶をまた、Repligen Corporationからの組換え型のプロテインAを用いて同じ結晶化の条件下で調製した。次いで、プロテインAの結晶化を、Repligenの組換え型のプロテインA(53mg/mlまたは120mg/mlのいずれか)およびWizard II結晶化スクリーニングの社内処方♯4を使用して0.5mlのバッチにスケールアップした。バッチを室温で6日間インキュベートした。同様にRepligenのプロテインAを53mg/mlで用いてプロテインAの結晶を1mlバッチにスケールアップした。プロテインA試料を、Wizard II結晶化スクリーニングの社内処方♯4と混合した。試料を、室温で、ひっくり返しながら4週間インキュベートした。
15mg/mlのプロテインAの結晶を含有する試料500μl(Wizard IIスクリーニングキットの処方♯4中スラリー50%)を、20μlのグルタルアルデヒド25%を用いて架橋した(最終的なグルタルアルデヒド濃度は1%であった)。試料をすぐに5秒間ボルテックスし、室温で20分間、撹拌せずにインキュベートした。インキュベートした後、1mlのWizard II結晶化スクリーニングの処方♯4を試料に加え(最終的なグルタルアルデヒド濃度は、0.33%であった)、複合体を5秒間ボルテックスした。次いで、試料を室温で1時間、撹拌せずにインキュベートした。架橋した後、プロテインA試料をpH7、10mMのトリス−HCl緩衝液1mlで3回洗浄し(遠心分離を4,500rpmで5分間行った)、プロテインAの架橋した結晶(CLPC)をpH7、10mMのトリス−HCl緩衝液1mlに再懸濁させた。
プロテインAの懸滴結晶
懸滴結晶化法を使用して、Fitzgerald InternationalからのプロテインAの結晶を、50.6mg/mlまたは120mg/mlのいずれかのタンパク質試料、およびWizard II結晶化スクリーニングの処方♯4を用いて作製した(図1)。同様に、Wizard I結晶化スクリーニングの処方♯8(クエン酸緩衝液中2Mの硫酸アンモニウム、pH5.5)を用いて、ならびに以下のWizard II結晶化スクリーニングの処方を用いても結晶を作製した:♯31(1Mのクエン酸ナトリウム、0.1Mのトリス−HCl緩衝液、pH7、0.2MのNaCl)、♯35(0.1Mの酢酸緩衝液中0.8MのNaH2PO4/1.2MのK2PO4、pH4.5)および♯41(2Mの硫酸アンモニウム、トリス−HCl緩衝液、pH7、0.2Mの硫酸リチウム)、データは示していない。すべての条件において、結晶サイズは約5ミクロンで、なめらかな立方形(soft cubic shape)であった。
図2に示されている通り、Repligen Corporationからの組換え型のプロテインAを、1mlバッチにおいて、Wizard II結晶化スクリーニングの処方♯4を用いて結晶化した。バッチにおける結晶化により、立方形の結晶および針状の結晶の両方が作製された。立方形の結晶のサイズは約10ミクロンであり、一方針状のサイズは、それよりも小さかった。同様の結晶が、Repligen CorporationおよびFitzgerald Internationalの両方からのプロテインAを用いた30μlのバッチにおいて、およびRepligenのプロテインAを用いた500μlのバッチにおいて得られた。
Repligen CorporationからのプロテインAの結晶を、架橋剤であるグルタルアルデヒドを用いて架橋した。プロテインAの結晶を架橋したことによって結晶の形態またはサイズは変化しなかった(図3)。
−Crystal Growth 101 Literature、Hanging Drop Vapor Diffusion Crystallization(2001年)、Hampton Research Corporation。
浸出:架橋したプロテインA結晶のpH制御溶解性
pHを7.5から2.0まで減少させた後に、種々の架橋したプロテインA結晶の溶解性を検査する。架橋した結晶を、50mMのグリシンHCl(pH2.0)中、1mg/mlでインキュベートする。37℃で撹拌しながら5時間インキュベートした後、一定分量を取り出す。溶解していない架橋した結晶を2000rpmで遠心分離することによって分離し、上清を、0.22μmのフィルターを通して濾過した後、可溶性タンパク質の濃度をOD280nmにおいて測定する。
目的
この実験の目的は、ヒトIgGを使用して、架橋したプロテインAの結晶の結合能を決定することであった。
機器:
卓上遠心分離機:Eppendorf遠心分離機5415D
Eppendorfチューブ、1ml
バキュームポンプ
Whatman濾紙ディスク:25mmカタログ番号1825025
天秤:Mettler Toledo AG285
コニカルフラスコ。
架橋したプロテインA結晶:社内製
ヒトIgG:ICN Biomedical,Inc.カタログ番号64145
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠剤:Sigmaカタログ番号P−4417
グリシン:Fluka♯50046
0.1NのNaOH:Acrosカタログ番号12419−0010。
緩衝液の調製
リン酸緩衝生理食塩水(PBS):
錠剤1つを蒸留水200mlに溶解させてリン酸緩衝生理食塩水を得た。
グリシン7.5gを水90mlに溶解させた。1NのHClを用いてpHを2.0に調整した。DI水を使用して容積を100mlにした。その後にpHを確認し、必要であれば再度2.0に調整した。
本実験で使用した架橋したプロテインAの結晶(CLPC)は、10mMのトリス、pH7.0中にあった。50μlのCLPCを遠心分離して、上清を除去した。抗体を結合させるために、ペレットをPBSに再懸濁させ、PBSで3回洗浄して、PBS中でCLPCを平衡化した。
架橋したプロテインAの結晶の結合能を、CLPC1グラム当たりに結合し、溶出されたヒトIgGの量として算出した。実験の各工程におけるIgGの濃度が、以下の表1に示されている。
これらの実験から、結合能は架橋したプロテインAの結晶1グラム当たり2406.38mgのヒトIgGであると算出された。
目的
この実験の目的は、ヒトIgGを使用して、架橋したプロテインAの結晶の結合能を決定することであった。
機器:
卓上遠心分離機:Eppendorf遠心分離機5415D
Eppendorfチューブ、1ml
バキュームポンプ
Whatman濾紙ディスク:25mmカタログ番号1825025
天秤:Mettler Toledo AG285
コニカルフラスコ。
架橋したプロテインA結晶:社内製
ヒトIgG:ICN Biomedical,Inc.カタログ番号64145
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠剤:Sigmaカタログ番号P−4417
グリシン:Fluka♯50046
0.1NのNaOH:Acrosカタログ番号12419−0010。
緩衝液の調製
リン酸緩衝生理食塩水(PBS):
錠剤を1つ蒸留水200mlに溶解させてリン酸緩衝生理食塩水を得た。
グリシン7.5gを水90mlに溶解させた。1NのHClを用いてpHを2.0に調整した。DI水を使用して容積を100mlにした。その後にpHを確認し、必要であれば再度2.0に調整した。
本実験で使用した架橋したプロテインA結晶(CLPC)は、10mMのトリス、pH7.0中にあった。50μlのCLPCを遠心分離して、上清を除去した。抗体を結合させるために、ペレットをPBSに再懸濁させ、PBSで3回洗浄して、PBS中でCLPCを平衡化した。
架橋したプロテインAの結晶の結合能を、CLPC1グラム当たりに結合し、溶出されたヒトIgGの量として算出した。実験の各工程におけるIgGの濃度が、以下の表3に示されている。
これらの実験から、平均結合能は、架橋したプロテインAの結晶1グラム当たり219.86mgのヒトIgGであると算出された。
目的
この実験の目的は、ヒトIgGを使用して、架橋したプロテインAの結晶の結合能を決定することであった。
機器:
卓上遠心分離機:Eppendorf遠心分離機5415D
Eppendorfチューブ、1ml
バキュームポンプ
Whatman濾紙ディスク:25mmカタログ番号1825025
天秤:Mettler Toledo AG285
コニカルフラスコ。
架橋したプロテインA結晶:社内製
ヒトIgG:ICN Biomedical,Inc.カタログ番号64145
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠剤:Sigmaカタログ番号P−4417
グリシン:Fluka♯50046
0.1NのNaOH:Acrosカタログ番号12419−0010。
緩衝液の調製
リン酸緩衝生理食塩水(PBS):
錠剤を1つ蒸留水200mlに溶解させてリン酸緩衝生理食塩水を得た。
グリシン7.5gを水90mlに溶解させた。1NのHClを用いてpHを2.0に調整した。DI水を使用して容積を100mlにした。その後にpHを確認し、必要であれば再度2.0に調整した。
本実験で使用した架橋したプロテインAの結晶(CLPC)は、10mMのトリス、pH7.0中にあった。50μlのCLPCを遠心分離して上清を除去した。抗体を結合させるために、ペレットをPBSに再懸濁させ、PBSで3回洗浄して、PBS中でCLPCを平衡化した。
架橋したプロテインAの結晶の結合能を、CLPC1グラム当たりに結合し、溶出されたヒトIgGの量として算出した。実験の各工程におけるIgGの濃度が、以下の表5に示されている。
これらの実験から、結合能は、架橋したプロテインAの結晶1グラム当たり1076.4mgのヒトIgGであると算出された。
この実施例では、バッチおよびカラムの両方におけるプロテインAのCLPCのヒト免疫グロブリンG(IgG)結合能の決定について記載されている。
5415C遠心分離機:Eppendorf International,Inc.
Ultrafree(登録商標)−MC遠心濾過ユニット:Durapore(登録商標)PVDF0.2μm、Millipore
ガラスマイクロファイバーフィルター:Whatman、Schleicher&Schuell、カタログ番号1825−025
空のSep−Pak(登録商標)Vacカラム:Waters Corporation
pH伝導率計:Denver Instrument、Model 220
8453紫外可視分光光度計:Agilent Technologies
プロテインAの架橋した結晶:Altusが所有者である技術を使用して作製した
DI(逆浸透&脱イオン)H2O
塩酸溶液、1N保証:Fisher Scientific、カタログ番号SA48−1
水酸化ナトリウム溶液N/2、0.5N:Fisher Scientific、カタログ番号SS270−1
水酸化ナトリウム溶液、1N保証:Fisher Scientifics、カタログ番号SS266−1
リン酸緩衝生理食塩水の錠剤:Sigma−Aldrich、カタログ番号P−4417
無水クエン酸:Fisher Scientific、カタログ番号A940−1
グリシン:Fisher Scientific、カタログ番号G48−500
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Trizma Base):Sigma−Aldrich、カタログ番号T−4661。
溶液の調製
リン酸緩衝生理食塩水溶液
Sigma−Aldrichからのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠剤1つを200mlのDI H2Oに溶解させて、以下のPBS溶液を調製した:0.01Mのリン酸緩衝液、2.7mMのKCl、137mMのNaCl、pH7.4。
12.11gのTrizma Baseを80mlのDI H2Oに溶解させた。1NのHCl溶液を用いてpHを8.5に調整し、DI H2Oを用いて溶液を100mlに調整した。
グリシン1.5gを80mlのDI H2Oに溶解させた。1NのHCl溶液を用いてpHを2に調整し、DI H2Oを用いて溶液を100mlに調整した。
無水クエン酸1.9gを80mlのDI H2Oに溶解させた。1NのNaOH溶液を用いてpHを3に調整し、DI H2Oを用いて溶液を100mlに調整した。
0.5NのNaOH溶液100mlを400mlのDI H2Oで希釈した。
カラムにおけるIgG結合能の決定
空のWaters Sep−Pak(登録商標)Vacカラムに、プロテインAのCLPCを充填した(ベッド容積はプロテインAのCLPCを伴っておよそ500μlであった)。
架橋したプロテインAの結晶の結合能を、CLPC1グラム当たりに結合し、溶出されたヒトIgGの量として算出した。実験の各工程におけるIgGの濃度が、以下の表7に示されている。
これらの実験から、結合能は、架橋したプロテインAの結晶1グラム当たり192.86mgのヒトIgG、または150.2mg/ml(プロテインAカラム)であると算出された。
本実験では、プロテインA−CLPCの結合能に対する処理後効果を評価する。プロテインA−CLPC含浸膜を、特定の種類の溶媒中のポリウレタンを用いて膜キャスティング溶液を形成する工程と、プロテインA−CLPCをキャスティング溶液に加える工程と、含浸膜複合材料を適切な媒質に沈殿させる工程と、場合によって、使用する前に乾燥させることによって複合材料を処理する工程とによって作出する。試験含浸膜のそれぞれについて、特定の処理条件、例えば、膜キャスティング溶媒の種類、例えばDMF、プロテインA−CLPCの量、沈殿槽の媒質(50/50のIPA/水)および処理後の状態(全く乾燥されず湿っている)などを同定し、試験する。プロテインA−CLPCの結合能を、試験含浸膜のそれぞれについて試験する。
本実験では、2つの群、すなわちA群およびB群の試験含浸膜を作出する。A群の膜(例えば、A1〜A2)はNMP溶媒中のポリウレタンから作出する。B群の膜(例えば、B1〜B2)はDMF溶媒中のポリウレタンから作出する。含浸膜は、直径が約1インチである。試験含浸膜のそれぞれについて、特定の処理条件、例えば、膜キャスティング溶媒の種類、例えばDMFまたはNMP、プロテインA−CLPCの量、沈殿槽の媒質(50/50のIPA/水、または水単独)および処理後の状態(全く乾燥されず湿っているか、または40%のグリセロールで乾燥された)、ガンマ線への曝露(15から40kGy)などを同定し、試験する。形成されたら、各群からの1つの膜をある特定の線量のガンマ線に曝露させる。各群の他の膜は、ガンマ線に曝露しない対照として使用する。次いで、それぞれの膜の抗体結合能を、抗体試験溶液を用いて試験する。その結果により、プロテインA−CLPCについて、有機溶媒およびガンマ線への曝露に対して結合能および安定性が保持されることがもたらされる。
Staphylococcus aureusからのプロテインAのcDNA配列が下に示されている(GenBankアクセッション番号:X61307)(配列番号1)。
Claims (42)
- 結晶形態のプロテインAを含む組成物。
- 架橋した結晶形態のプロテインAを含む組成物。
- 免疫グロブリンを精製する方法であって、該免疫グロブリンを、請求項1または請求項2に記載の組成物を用いて接触させる工程を含む、方法。
- 前記免疫グロブリンが抗体である、請求項3に記載の方法。
- 前記抗体が治療用抗体である、請求項4に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項4に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがFab断片である、請求項3に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがFc断片である、請求項3に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが単鎖抗体である、請求項3に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがキメラ抗体である、請求項3に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが完全ヒト抗体である、請求項3に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがヒト化抗体である、請求項3に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンがIgGクラスに属している、請求項3に記載の方法。
- グルタルアルデヒドによって架橋しているものである、請求項2に記載の組成物。
- 請求項1または2に記載の組成物を含むキット。
- 結晶形態および/または架橋した結晶形態のプロテインAの使用について記載されている使用説明書を含有するものである、請求項15に記載のキット。
- 請求項1または2に記載の組成物を含有するカラム。
- 前記結晶は、固定化された形態のプロテインAよりも活性(結合能)が高い、請求項2に記載の組成物。
- 前記結晶は、約pH2から約pH12において活性(結合能)があり、かつ安定である、請求項2に記載の組成物。
- 前記結晶は、固定化されたプロテインAと比較して0.0%のタンパク質浸出を有する、請求項2に記載の組成物。
- 予め充填されたカラムにおいてカラム材料として使用されるものである、請求項1または2に記載の組成物。
- 膜において使用される(含浸させられる)ものである、請求項1または2に記載の組成物。
- 体外デバイスにおいて使用されるものである、請求項1または2に記載の組成物。
- 免疫グロブリンを精製するためのプロセスであって、
(a)免疫グロブリンを含有する媒質を、約pH7.0からpH10の範囲のpHを有し、かつ陽イオンと陰イオンの組み合わせを含有する緩衝溶液と混合して、緩衝免疫グロブリン媒質をもたらす工程と、
(b)該緩衝免疫グロブリン媒質を固定化されたプロテインA(プロテインA−CLPC:プロテインA分子を結晶化して架橋することによってプロテインAが固定化されている)吸着剤と接触させて、該緩衝免疫グロブリン媒質中に存在する該免疫グロブリンを該固定化されたプロテインA吸着剤に吸着させる工程と、
(c)該免疫グロブリンが吸着したプロテインA−CLPC吸着剤を該緩衝溶液で洗浄する工程と、
(d)該免疫グロブリンが吸着したプロテインA−CLPC吸着剤を、約pH2からpH6の範囲のpHを有する緩衝溶液と接触させて、該吸着した免疫グロブリンを該プロテインA−CLPC吸着剤から取り出す工程と、
(e)該取り出された免疫グロブリンを実質的に純粋な形態で回収する工程と
を含む、プロセス。 - 前記緩衝免疫グロブリン媒質を前記プロテインA−CLPC吸着剤と接触させる工程が、該プロテインA−CLPC吸着剤のカラム中で実現される、請求項24に記載のプロセス。
- 前記免疫グロブリンを含有する媒質が、正常な哺乳動物の血清である、請求項24に記載のプロセス。
- 前記免疫グロブリンを含有する媒質が、免疫哺乳動物の血清である、請求項24に記載のプロセス。
- 前記媒質が哺乳動物の血漿である、請求項24に記載のプロセス。
- 前記媒質が哺乳動物の腹水である、請求項24に記載のプロセス。
- 前記媒質がハイブリドーマから得られる、請求項24に記載のプロセス。
- 前記媒質が組織培養液である、請求項24に記載のプロセス。
- 前記媒質が細胞培養液である、請求項24に記載のプロセス。
- 前記媒質が哺乳動物の細胞培養液である、請求項24に記載のプロセス。
- 前記媒質が細菌の細胞培養液である、請求項24に記載のプロセス。
- 前記媒質がトランスジェニック供給源の液体である、請求項24に記載のプロセス。
- 前記媒質が免疫グロブリンを含有する植物抽出物である、請求項24に記載のプロセス。
- 前記媒質が酵母培養液である、請求項13に記載のプロセス。
- 懸滴蒸気拡散結晶化法またはバッチ結晶化法を使用して結晶形態のプロテインAを作出する方法であって、
(a)脱イオン水中のプロテインAを、1:1のタンパク質対試薬比の状態にする工程であって、該試薬は、2Mの硫酸アンモニウム、0.1Mのカコジル酸緩衝液、pH6.5および0.2MのNaClを含有する組成物;クエン酸緩衝液中2Mの硫酸アンモニウム、pH5.5を含有する組成物;1Mのクエン酸ナトリウム、0.1Mのトリス−HCl緩衝液、pH7、および0.2MのNaClを含有する組成物;0.1Mの酢酸緩衝液中0.8MのNaH2PO4/1.2MのK2PC4、pH4.5を含有する組成物;ならびに2Mの硫酸アンモニウム、トリス−HCl緩衝液、pH7および0.2Mの硫酸リチウムを含有する組成物からなる群より選択される、工程と、
(b)結晶の形成が起こるまでインキュベートする工程と
を含む、方法。 - 工程(a)におけるプロテインAの濃度が、脱イオン水中約50.6mg/mlまたは約120mg/mlのプロテインAである、請求項38に記載の方法。
- 架橋した結晶形態のプロテインAを作出する方法であって、結晶形態のプロテインAをグルタルアルデヒドと混合する工程を含む、方法。
- 前記グルタルアルデヒドの最終濃度が約1%である、請求項40に記載の方法。
- 精製しようとする物質を請求項1または2に記載の組成物と接触させる工程を含む、精製の方法。
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