WO2014073064A1 - フロー式単粒子分光器 - Google Patents

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fluorescence
condensing
wavelength
scattered light
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竹中　啓
富樫　盛典
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株式会社日立製作所
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Definitions

  • the present invention relates to a flow type single particle spectrometer that continuously acquires a fluorescence spectrum of particles such as individual microorganisms in a liquid and identifies the type of microorganisms.
  • a culture method has been generally used as a means for measuring specific microorganisms contained in liquids such as drinking water.
  • This culture method is a method of measuring the number of living microorganisms by applying a suspension of a liquid specimen onto a medium, culturing living microorganisms, and measuring the number of colonies formed by the grown microorganisms. .
  • this method it is possible to measure and identify a specific microorganism by using a medium that can grow only the specific microorganism.
  • the type of microorganism can be determined in more detail by acquiring a fluorescence spectrum using the wavelength of the excitation light as a parameter (hereinafter referred to as a two-dimensional fluorescence spectrum).
  • Fluorescence spectrometers are generally used as means for acquiring the fluorescence spectrum of microorganisms.
  • a fluorescence spectrometer is an apparatus that can irradiate a liquid placed in a dedicated measurement cell with excitation light having a specific wavelength and acquire a fluorescence spectrum emitted from the liquid.
  • measurement can be performed by suspending these particles in a liquid such as ultrapure water.
  • the excitation light of the fluorescence spectrometer is light extracted from the light of the white light source by a specific wavelength with a grating (diffraction grating) and a slit, and the wavelength of the excitation light can be changed by changing the position of the grating. Therefore, it is easy to obtain a two-dimensional fluorescence spectrum, which is a fluorescence spectrum with the wavelength of excitation light as a parameter.
  • the fluorescence spectrum that can be obtained with a fluorescence spectrometer is the average value of the fluorescence emitted by all particles in the liquid. Therefore, the fluorescence spectrum of each particle cannot be acquired.
  • a method for acquiring the spectrum of fluorescence or Raman scattered light emitted by a single particle has been reported.
  • a flow cytometer based on Raman detection described in Patent Document 1 below irradiates a measurement target particle flowing in a flow path with laser light and spectrally scatters Raman scattered light emitted from the particle with a spectroscopic element such as a grating. After that, the spectrum of Raman scattered light is acquired by detecting with a multi-channel detector.
  • Non-Patent Document 1 original name: High-ThroughputoughSingle-Cell Fluorescence Spectroscopy
  • the particles to be measured flowing through the flow path are irradiated with a 488 nm ion laser
  • the fluorescence emitted from the particles is dispersed by a grating and then detected by an ICCD (Intensified charge-coupling device) to obtain a fluorescence spectrum.
  • ICCD Intensified charge-coupling device
  • the obtained fluorescence spectrum is an average value of the fluorescence spectra of all the existing microorganisms, and therefore it is difficult to specify the type.
  • Patent Document 1 it is possible to acquire a fluorescence spectrum or Raman scattered light spectrum for one type of excitation light wavelength, but it is difficult to acquire a two-dimensional fluorescence spectrum. is there. For this reason, it is difficult to identify microorganisms having similar spectrum shapes.
  • the wavelength of the excitation light is determined by changing the position of the grating as described above, but it takes several seconds to change the position.
  • the time (measurement time) for the particles to be measured to pass through the detection region is generally several microseconds to milliseconds, It is difficult to change the wavelength of the excitation light during the measurement time.
  • the present invention is to provide a flow type single particle spectrometer capable of continuously acquiring the fluorescence spectrum of particles such as individual microorganisms in a liquid and identifying the type of microorganisms.
  • the present invention provides a sample container that holds a sample liquid containing particles to be examined, a detection flow channel that is a flow channel for optically detecting the particles to be examined, A waste liquid container for storing the sample liquid flowing in the detection flow path, a liquid feeding means for feeding the sample liquid in the order of the sample container, the detection flow path, and the waste liquid container; and an ultraviolet region
  • a white light source that emits white light having a wavelength range from 1 to the near-infrared region, an excitation light spectroscopic element that spatially disperses the white light for each wavelength, and light dispersed by the excitation light spectroscopic element
  • An excitation light condensing element for condensing on the detection flow path, a fluorescent condensing element for condensing fluorescence and side scattered light emitted from the particles to be inspected, and a fluorescent condensing element.
  • Fluorescent spectroscope that spatially disperses the emitted fluorescence for each wavelength And a spectral condensing element for condensing the fluorescence separated by the fluorescent spectroscopic element, and a multi-channel type light capable of detecting the intensity of the light collected by the spectroscopic condensing element for each wavelength. And a detector.
  • the present invention since it is possible to acquire a two-dimensional fluorescence spectrum of individual particles in a liquid, it is extremely excellent that it is possible to determine the type of particle using the difference in shape of the two-dimensional fluorescence spectrum. It is possible to provide a flow type single particle spectrometer capable of exhibiting the effect.
  • FIG. 1 is an overall schematic configuration diagram of a flow type single particle spectrometer according to Example 1 of the present invention.
  • 1 is a diagram illustrating a positional relationship of an optical system constituting a flow type single particle spectrometer according to Example 1.
  • FIG. FIG. 3 is a diagram showing particle positions and fluorescence spectra in a flow type single particle spectrometer according to Example 1.
  • 2 is a diagram showing a two-dimensional fluorescence spectrum acquired by a flow type single particle spectrometer according to Example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the identification method of the kind of particle
  • FIG. 1 is an overall schematic configuration diagram of a flow type single particle spectrometer according to Example 1.
  • FIG. It is a whole schematic block diagram of the flow type single particle spectrometer which concerns on Example 2 of this invention.
  • 6 is a configuration diagram of a cartridge constituting a flow type single particle spectrometer according to Embodiment 2.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view including a detection flow path in the cartridge according to Embodiment 2.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating an example of an exploded structure including a detection flow path in the cartridge according to the second embodiment.
  • microorganisms contained in the liquid to be detected are broader than the concept of ordinary microorganisms, and mean the inspection method and inspection device for viruses, bacteria, yeast, protozoa, fungi, spores, pollen. To do.
  • viruses, bacteria, yeast, protozoa, fungi, spores, pollen are simply indicated as “microorganisms”.
  • FIG. 1 is an overall schematic configuration diagram of a flow type single particle spectrometer according to Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a view showing the positional relationship of the optical system constituting the flow type single particle spectrometer according to the first embodiment.
  • a flow type single particle spectrometer 1 (also referred to as a single microorganism spectrometer) is roughly classified into a flow part for flowing a liquid to be examined (sample liquid) and a microorganism contained in the liquid.
  • an optical detection unit for detecting the target automatically includes a control system that controls the flow unit and handles signals from the optical detection unit.
  • the flow section is a detection container which is a flow path for optically detecting a sample container 110 for holding a sample liquid, a liquid feeding pump 111 for feeding the sample liquid, and a microorganism in the sample liquid flowing. It comprises a fine channel 112 and a waste liquid container 113 for storing the sample liquid that has passed through the detection fine channel 112.
  • the sample liquid in the sample container 110 flows from the sample container 110 to the waste liquid container 113 via the detection fine channel 112 by the liquid feed pump 111.
  • the optical detection unit includes a white light source 100 that emits white light, an excitation light spectroscopic element 101 that is a spectroscopic element for spectrally separating white light, and an optical that condenses the dispersed light 121 in the detection microchannel 112.
  • the excitation light condensing element 102 that is an element
  • the fluorescent condensing element 103 that is an optical element for condensing the fluorescence 122 emitted from the microorganisms 120 flowing through the detection microchannel 112, and the fluorescent condensing element 103.
  • Fluorescent spectroscopic element 104 which is a spectroscopic element for spectroscopically separating the emitted fluorescence
  • spectral condensing element 105 which is an optical element for condensing the spectroscopic fluorescent light on multichannel photodetector 106
  • a multi-channel photodetector 106 capable of acquiring a fluorescence spectrum by detecting the amount of fluorescence at regular wavelength intervals, and a microorganism 12 flowing in the detection microchannel 112
  • An optical element for condensing the forward scattered light to the forward scattered light detector 107 is emitted from a composed of the forward scattered light collection element 108.
  • the white light source 100 is a light source that emits white light in a wide wavelength range from the ultraviolet region to the near infrared region, and a white laser is preferable because it is easy to collect light and obtain a sufficient amount of light.
  • a light source such as a halogen lamp or a xenon lamp may be used.
  • the excitation light spectroscopic element 101 and the fluorescence spectroscopic element 104 are optical elements for spatially dispersing the white light source for each wavelength, and use a prism or a diffraction grating.
  • a prism is used in FIG. 1, a transmissive diffraction grating or a reflective diffraction grating may be used.
  • the excitation light condensing element 102, the fluorescence condensing element 103, the spectroscopic condensing element 105, and the forward scattered light condensing element 108 are optical elements for spatially condensing light incident on the element, and the lens. Or curved mirrors.
  • the multi-channel photodetector 106 is a photodetector that can detect the amount of light dispersed for each wavelength by the fluorescence spectroscopic element 104, and can acquire the spectrum of incident light.
  • Multiple light-receiving elements such as those composed of multiple photodiodes and photomultipliers, CCD (Charge-Coupled Device) image sensors, ICCD (Intensified charge-Coupling Device) image sensors, CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) image sensors
  • CCD Charge-Coupled Device
  • ICCD Intensified charge-Coupling Device
  • CMOS Complementary Metal Oxide Semiconductor
  • the forward scattered light detector 107 is a photodetector such as a photodiode or a photomultiplier, but generally the amount of forward scattered light is much larger than the amount of fluorescent light or side scattered light.
  • a photodetector having a lower sensitivity than the multi-channel photodetector 106 is used.
  • the detection fine channel 112 is a channel having a rectangular or circular cross section, and one side or diameter dimension of the cross section is preferably 1 ⁇ m to 1 mm, for example, and the length is preferably 0.01 mm to 10 mm, for example.
  • a light-transmitting substance is used as the material of the detection micro-channel 112, and preferably fluorescence is measured, so that autofluorescence is low and optical characteristics such as light transmittance, surface accuracy, and refractive index are excellent.
  • a material having excellent optical properties such as glass, quartz, polymethacrylic acid methyl ester, polydimethylsiloxane, cycloolefin polymer, polyethylene terephthalate, and polycarbonate is used.
  • the light 121 dispersed by the excitation light spectroscopic element 101 is irradiated to the detection microchannel 112 by the excitation light condensing element 102.
  • the wavelength of the spectrally divided light 121 (from the ultraviolet region to the near-infrared region) changes along the flow direction of the detection microchannel 102, and the microorganism 120 changes from the ultraviolet light to the near red when flowing through the detection microchannel 112.
  • the light having a wavelength up to the outer region is irradiated.
  • the liquid feeding pump 111 is a pump for feeding the specimen liquid in the order of the specimen container 110, the detection fine channel 112, and the waste liquid container 113, and it is preferable that the pulsating flow is small. Further, a sheath flow that flows so as to wrap the sample liquid with the sheath liquid may be used. In this case, a sheath liquid container for storing the sheath liquid is required, and the liquid feed pump 111 simultaneously flows the sample liquid and the sheath liquid. By utilizing the sheath flow, it becomes possible to flow the sample liquid through the center of the detection fine channel 112 and to align the direction of the microorganisms in the sample liquid. Since the intensity of scattered light does not change depending on the position and orientation of microorganisms, more accurate analysis is possible.
  • the direction of light emitted from the white light source 100 and passing through the excitation condensing element is perpendicular to the direction of the detection fine channel 112 (z direction in the figure). Further, in order to minimize the influence of light from the white light source, the fluorescence condensing element 103 is arranged in the y direction in the drawing from the detection fine channel 112.
  • Pretreatment of specimen liquid Perform appropriate pretreatment for the specimen liquid to be examined.
  • the pretreatment here refers to purification, which is an operation to remove unnecessary substances from the sample liquid, and to increase the purity of the microorganism to be inspected, and concentration, which is an operation to increase the concentration of the microorganism to be inspected. This is work such as staining to bind a specific fluorescent substance to a microorganism.
  • the specimen liquid that has undergone the pretreatment is placed in the specimen container 110, and the single microorganism spectrometer 1 is operated via the control system.
  • the single microorganism spectrometer 1 sends the sample liquid to the detection fine channel 112. Since the wavelength of the light radiated to the detection fine channel 112 changes from the near infrared region to the ultraviolet region along the channel direction, the microorganism 120 is in the vicinity when passing through the light 121 dispersed by the microorganism 120. Fluorescence is emitted using light having a wavelength in the infrared region to the ultraviolet region as excitation light.
  • FIG. 3 is a diagram showing a particle position and a fluorescence spectrum in the single particle spectrometer according to Example 1.
  • the microorganism 120 flows from the top to the bottom in the figure, and the wavelength of the dispersed light 121 becomes shorter as it goes from the top to the bottom, but the flow direction and the order of the wavelengths may be reversed.
  • the graph on the right side of the figure shows the spectrum of light emitted by the microorganism 120 at that position, and is obtained by the multichannel photodetector 106.
  • the light incident on the multichannel photodetector 106 is side scattered light from the microorganism 120 (of the excitation light scattered by the microorganism 120, lateral to the incident direction of light). Dispersed light).
  • the obtained spectrum is a superposition of the fluorescence spectrum and the spectrum of the side scattered light, but the wavelength of the fluorescence is longer than that of the excitation light, and the wavelength of the scattered light is the same as that of the excitation light. Therefore, of the two peaks of the spectrum, the peak 123 on the low wavelength side becomes the peak of the side scattered light spectrum, and the peak 124 on the long wavelength side becomes the peak of the fluorescence spectrum. Moreover, since the wavelength of the excitation light irradiated when the microorganisms 120 flow from the top to the bottom of the detection microchannel 112 also changes from the near infrared region to the ultraviolet region, the obtained spectrum also moves from the long wavelength side to the short wavelength side. .
  • FIG. 4 is a diagram showing a two-dimensional fluorescence spectrum acquired by the single particle spectrometer according to Example 1.
  • the obtained spectrum is converted into a two-dimensional spectrum having a fluorescence wavelength ⁇ f and an excitation wavelength ⁇ ex .
  • the value of the wavelength ⁇ ex of the excitation light is considered to be equal to the peak wavelength of the scattered light spectrum 123.
  • the single microorganism spectrometer 1 can acquire the intensity of forward scattered light of the microorganism 120, the intensity of side scattered light of the microorganism 120, and the two-dimensional fluorescence spectrum of the microorganism 120.
  • the intensity of the forward scattered light indicates the size of the microorganism 120
  • the intensity of the side scattered light indicates the complexity of the internal structure of the microorganism 120
  • the two-dimensional spectrum is an autofluorescent substance (NADH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) possessed by the microorganism) Etc.) and the ease of dyeing of fluorescent substances introduced by pretreatment. These properties vary depending on the type of microorganism.
  • FIG. 6 is an overall schematic configuration diagram of the single particle spectrometer according to the first embodiment.
  • FIG. 6 in the previous embodiment, light obtained by separating white light with the excitation light spectroscopic element 101 is used.
  • a monochromatic light source group 130 in which a plurality of light sources that emit light of different wavelengths are arranged. May be used.
  • the light emitted from the monochromatic light source group 130 is applied to the detection microchannel 112 so as not to overlap each other. Since the microorganism 120 emits fluorescence corresponding to each excitation wavelength when passing through the irradiation region of the light 125 of the monochromatic light source group, a two-dimensional spectrum can be acquired as in the previous embodiment.
  • FIG. 7 is an overall schematic configuration diagram of a single particle spectrometer according to Example 2 of the present invention.
  • the single microorganism spectroscopic system 2 includes a microbiological test cartridge 140 that has a mechanism for holding a sample liquid and a reagent therein and performing a process necessary for obtaining a fluorescence spectrum of each microbe,
  • a liquid supply control unit 142 for controlling the transport of the sample liquid and the reagent in the microbiological test cartridge 140 via the cartridge connection tubes 1421 to 1423 connected to the microbiological test cartridge 140;
  • the cartridge holding table 141 that holds the microorganism testing cartridge 140 and adjusts the position of the microorganism testing cartridge 140, and the light in the microorganisms in the microorganism testing cartridge 140 are irradiated with the dispersed light to detect fluorescence and scattered light emitted from the microorganisms. It consists of an optical detector.
  • the system device 148 connected to the single microorganism spectroscopic system 2 executes control signal output for the liquid feeding control unit 142 and signal processing for the electrical signal input from the optical detection unit.
  • the measurement result obtained by processing the electrical signal is displayed on the output device 149 connected to the system device 18.
  • the liquid feeding control unit 142 includes a pump 1424.
  • the vent holes 1451 to 1453 (FIG. 8) of the pump 1424 and the microorganism testing cartridge 140 are connected by cartridge connecting pipes 1421 to 1423.
  • Valves 1425 to 1427 are provided in the cartridge connection pipes 1421 to 1423, respectively. By opening and closing the valves 1425 to 1427, a gas having a predetermined pressure is supplied to the container of the microorganism testing cartridge 140 or the container of the microorganism testing cartridge 140 is opened to the atmosphere. By controlling the pressure, the sample liquid and the reagent in the microorganism testing cartridge 140 are transported.
  • the optical detection unit includes a white light source 100 that emits white light, an excitation light spectroscopic element 101 that is a spectroscopic element for splitting white light, and the spectrally separated light 121 into the detection microchannel 112.
  • An excitation light condensing element 102 which is an optical element for condensing
  • a fluorescent condensing element 103 which is an optical element for condensing fluorescence emitted from the microorganism 120 flowing through the detection microchannel 112, and a fluorescent light collecting element.
  • a fluorescence spectroscopic element 104 which is a spectroscopic element for spectroscopically collecting the fluorescence collected by the optical element 103, and a spectroscopic condensing element 105 which is an optical element for concentrating the spectroscopic fluorescence on the multi-channel photodetector 106.
  • the multi-channel photodetector 106 that can acquire the fluorescence spectrum by detecting the light quantity of the separated fluorescence at regular wavelength intervals, and the detection microchannel 112. It consists of the forward scattered light collection element 108 is an optical element for condensing the forward scattered light emitted from the microorganisms 120 forward scattered light detector 107.
  • the focal points of the excitation light condensing element 102, the fluorescence condensing element 103, and the scattered light condensing element 108 are arranged so that the respective focal points overlap with each other, and the detection fine channel 144 can be adjusted to the position of the focal point during measurement. It is configured as follows.
  • FIG. 8 is a configuration diagram of a cartridge constituting the single particle spectrometer according to the second embodiment.
  • the microbiological test cartridge 140 holds a sample container 1461 for holding the sample liquid and a staining liquid (reagent liquid) for staining the microorganism in the sample liquid, and mixes the sample liquid and the staining liquid.
  • a staining liquid container 1462 to be reacted, a detection fine channel 144 for irradiating excitation light and observing microorganisms, and a mixture of the sample liquid and the staining liquid that have passed through the detection fine channel 144 are discarded.
  • the waste liquid container 147, the sample container 1461, the staining liquid container 1462, and the detection fine channel 144 are connected to each other, the solution channels 1481 to 1482 for flowing the sample solution and the mixed solution, and the sample solution and the mixed solution are converted to the atmospheric pressure. In order to make it flow by this, it is comprised with the liquid feeding control part 142 and the flow paths 1491 to 1493 for connecting each container.
  • the sample container 1461 side is defined as the upstream side and the detection microchannel 144 side is defined as the downstream side along the flow of the sample liquid.
  • FIG. 9A is a cross-sectional view including a detection flow path in the cartridge according to the second embodiment.
  • FIG. 9B is a diagram illustrating an example of an exploded structure including a detection flow path in the cartridge according to the second embodiment.
  • FIG. 9A is a joint portion between the main body 151 of the microbe inspection cartridge 140 and the detection microchannel 144
  • FIG. 9B is an exploded perspective view of the detection microchannel 144.
  • main body 151 and the detection fine channel 144 are respectively produced in separate processes, and are joined together. A method for manufacturing the detection fine channel 144 will be described.
  • the microorganism detection unit 17 includes a cover member 171 and a flow path member 172, both of which are thin flat plates.
  • a groove 1731 is formed in the flow path member 172, and through holes 1741 and 1751 are formed at both ends of the groove 1731.
  • the cover member 171 and the flow path member 172 are bonded together so that the surface on which the groove 1731 is formed becomes the bonded surface. By this bonding, a detection fine channel 144 is formed.
  • the detection micro-channel inlet 174 and the detection micro-channel outlet 175 are constituted by the through holes 1741 and 1751 of the channel member 172.
  • the staining liquid container-detection fine flow path channel 1574 formed in the main body 151 changes the flow path direction at the lower end to form an opening on the surface of the main body 151.
  • the detection fine flow path-waste liquid container flow path 1576 changes the flow path direction at the upper end to form an opening on the surface of the main body 151.
  • the opening of the staining liquid container-detection microchannel channel 1574 is connected to the detection microchannel inlet 174, and the opening of the detection microchannel-waste liquid container channel 1576 is the detection microchannel outlet. 175.
  • the main body 15 is formed with a detection window frame 161.
  • the detection window frame portion 161 is a through hole or a through groove.
  • the detection window frame 161 is formed between the opening of the staining liquid container-detection microchannel flow path 1574 and the opening of the detection microchannel-waste liquid container flow path 1576.
  • the manufactured detection fine channel 144 is attached to the main body 151 as described above. As shown in FIG. 9A, the detection fine flow path 144 is arranged on the detection window frame portion 161 of the main body 151.
  • a detection window frame portion 161 that is a through hole or a through groove of the main body 151 is provided behind the detection fine channel 144. Therefore, the excitation light 180 irradiates only the detection fine channel 144 and does not irradiate the main body 151. For this reason, the reflected light from the main body 151 and autofluorescence that cause an increase in background light are not generated. In order not to irradiate the main body 151 with the excitation light 180 that has passed through the detection fine channel 144, the cross-section of the through-hole constituting the detection window frame portion 161 increases along the radiation direction of the excitation light 180. Is preferred.
  • the thickness of the cover member 171 is, for example, 0.01 ⁇ m to 1 mm.
  • the thickness of the flow path member 172 is, for example, 0.01 ⁇ m to 1 mm.
  • the cross-sectional shape of the detection fine channel 144 is, for example, a square, a rectangle, or a trapezoid. The larger the cross-sectional dimension of the fine flow path for fine detection 144 is, the smaller the pressure loss is, but a smaller one is better for flowing microorganisms one by one.
  • One side of the cross section of the detection fine channel 144 is preferably 1 ⁇ m to 1 mm, for example, and the length is preferably 0.01 mm to 10 mm, for example.
  • the optical axis of the excitation light 180 applied to the detection microchannel 144 is perpendicular to the direction vector of the detection microchannel 144.
  • Identification of individual bacterial species using the microorganism testing cartridge 140 is started in a state where the microorganism testing cartridge 140 is set in the single microorganism spectroscopy system 2 as shown in FIG.
  • This measurement process includes an alignment process for aligning the microorganism test cartridge 140, a pretreatment process for removing contaminants from the sample liquid to stain the microorganisms in the sample liquid, and actually measuring the two-dimensional spectrum of the microorganisms. It consists of a measurement process.
  • the specimen liquid is moved to the staining liquid container 1461.
  • the pressure of the liquid feeding control unit 142 shown in FIG. 7 is applied to the sample container 1461 through the vent 1451. Thereby, the atmospheric pressure in the sample container 1461 is increased.
  • the internal pressure of the staining liquid container 1462 is released to atmospheric pressure through the staining liquid container vent 1491. Due to the pressure difference, the sample liquid enters the staining liquid container 1462 and is mixed with the microorganism staining liquid. Bubbling is used for mixing. Bacteria in the sample liquid are stained with a staining liquid (here, a cyanine fluorescent dye is used).
  • the water level of the mixed liquid of the two liquids does not exceed the highest point of the staining liquid container-detecting fine flow path 1482 connecting the staining liquid container 1462 and the detection fine flow path 144, and further enters the staining liquid container 1462.
  • the air is discharged to the outside through the staining liquid container vent 1491. Since the atmospheric pressure of the staining liquid container 1462 is equal to the atmospheric pressure, the two-liquid mixed liquid is not pushed out to the detection microchannel 144, and the mixed liquid can be held in the staining liquid container 1462 for a time required for the reaction.
  • the contaminants in the sample liquid are removed from the sample solution by the contaminant removal unit 160.
  • the mixed liquid of the specimen liquid and the microorganism staining liquid is moved to the detection fine channel 144.
  • the detection microchannel 144 is irradiated with the dispersed light, so that when the microorganisms flowing through the detection microchannel 144 pass through the spectrally irradiated light area, respectively. Since the fluorescence corresponding to the excitation wavelength is emitted, a two-dimensional spectrum can be obtained as in the previous embodiment.
  • an apparatus that provides means for accurately identifying the type of individual particles in a liquid.
  • Two-dimensional fluorescence is obtained by sending a liquid containing the particles to be measured to the detection channel irradiated with light obtained by spectrally dividing white light, and obtaining a fluorescence spectrum by dispersing the fluorescence emitted from the particles to be measured.
  • the spectrum can be acquired, and the type of the particle can be specified from the acquired shape of the two-dimensional fluorescence spectrum.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.
  • SYMBOLS 1 Flow type single particle spectrometer, 2 ... Single microorganism spectroscopy system, 18 ... System apparatus, 10 ... Microorganism test chip, 100 ... White light source, 101 ... Excitation light spectroscopic element, 102 ... Excitation light condensing element, 103 ... Fluorescence condensing element, 104... Fluorescence spectroscopic element, 105... Spectral condensing element, 106... Multi-channel photodetector, 107.
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS ... Liquid feed pump, 112 ... Detection fine flow path, 113 ... Waste liquid container, 120 ... Microorganism, 121 ...
  • staining solution container 1481 to 1482 ... flow path for solution, 1491 to 1493 ... flow path for ventilation, 1731 ... groove, 1741 ... Ventilation hole, 1751... Ventilation hole, 1574... Stain solution container-flow path between detection fine flow paths, 1576... Detection fine flow path-waste liquid flow path tube flow path.

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Abstract

　液体中の個々の微生物等の粒子の蛍光スペクトルを連続的に取得し、微生物などの種類の特定を行うフロー式単粒子分光器を提供するもの。そこで本発明は、検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子を光学的に検出するための流路である検知用流路と、前記検出用流路を流動した前記検体液を保管するための廃液容器と、前記検体液を前記検体容器、前記検知用流路、前記廃液容器の順に送液するための送液手段と、紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器からなるフロー式単粒子分光器。

Description

フロー式単粒子分光器
　本発明は、液体中の個々の微生物等の粒子の蛍光スペクトルを連続的に取得し、微生物などの種類の特定を行うフロー式単粒子分光器に関する。
　従来、飲料水などの液体中に含まれる特定微生物の計測手段として、培養法が一般的に用いられていた。この培養法は、液体検体の懸濁液を培地上に塗布し生きている微生物を培養させ、増殖した微生物が形成するコロニー数を計測することで生きている微生物の数を計測する手法である。この手法は、特定微生物のみ増殖可能な培地を使用することで特定微生物の計測・特定も可能である。
　しかし、この培養法は、微生物がコロニーを形成するまでに１日から数日を必要とするため、計測結果を得るまでに長時間の検査時間を必要とする。また、懸濁、希釈、塗布、コロニー計測などの検査工程を手作業で行うため、検査者は専門的知識および技量が必要になる。
　そこで迅速に微生物の種類を特定する手段として、微生物の蛍光スペクトルの違いを利用する方法がある。この方法は、微生物の種類によって保持する物質の種類や量が異なり、また蛍光色素に対する染色度合いも異なるため、種類によって蛍光スペクトルは異なることを利用するものである。蛍光スペクトルは励起光の波長によっても異なるため、励起光の波長をパラメータとした蛍光スペクトル（以下、二次元蛍光スペクトルという）を取得することで、より詳細に微生物の種類の判別が可能になる。
　微生物の蛍光スペクトルを取得する手段としては、蛍光分光器が一般的に用いられている。蛍光分光器は、専用の測定セルに入れた液体に特定波長の励起光を照射し、液体が発する蛍光スペクトルを取得することができる装置である。微生物などの粒子の蛍光スペクトルを取得するには、これらの粒子を超純水などの液体に懸濁することで測定することができる。
　蛍光分光器の励起光は、白色光源の光からグレーティング（回折格子）とスリットで特定波長のみ取り出した光であり、グレーティングの位置を変えることで励起光の波長を変えることができる。そのため励起光の波長をパラメータとした蛍光スペクトルである二次元蛍光スペクトルを取得することも容易である
　しかし、蛍光分光器で取得可能な蛍光スペクトルは液体内の全て粒子が発する蛍光の平均値であるため、個々の粒子の蛍光スペクトルを取得することはできない。そこで近年単一の粒子の状態や種類を特定するために、単一の粒子の発する蛍光やラマン散乱光のスペクトルを取得する方法が報告されている。
　例えば、下記の特許文献１に記載されたラマン検出に基づくフローサイトメータは、流路を流れる測定対象の粒子にレーザー光を照射し、粒子から発せられるラマン散乱光をグレーティングなどの分光素子で分光したのち、マルチチャネル検出器により検出することでラマン散乱光のスペクトルを取得するものである。
　また、下記の非特許文献１に記載のハイスループット単一細胞蛍光分光器（原文名：High-Throughput Single-Cell Fluorescence Spectroscopy）では、流路を流れる測定対象の粒子に488 nm アルゴンイオンレーザーを照射し、粒子から発せられる蛍光をグレーティングによる分光したのちICCD（Intensified charge-coupling device）により検出することで蛍光スペクトルを取得するものである。
特表２００８－５２１００６号公報 Applied Spectroscopy、 Vol.59、 No.2、 pp221-226、 (2005)
　微生物の種類を迅速に特定するには、微生物の蛍光スペクトルの違いを利用することが有効である。しかし、上述した従来技術により知られるこれまでの方法及び装置では、液体中に含まれる微生物数、種類、液体の状態などの影響により、要求を十分に満たすことは難しかった。
　例えば蛍光分光器を使用する場合、液体検体中に十分な数の微生物（107個/ml～）が存在しないと蛍光スペクトルを取得することは難しい。例えば、水道水中に存在する微生物数は約1個/ml以下であるため、検体液の培養及び濃縮を繰り返さないと蛍光スペクトルを取得することは困難である。また、液体検体中に複数の微生物が含まれている場合は、得られた蛍光スペクトルは存在する微生物全ての蛍光スペクトルの平均値となるため、種類の特定は困難である。
　次に、上記特許文献１や非特許文献１の装置では、一種類の励起光の波長に対する蛍光スペクトルもしくはラマン散乱光スペクトルを取得することは可能だが、二次元蛍光スペクトルを取得することは困難である。そのため、スペクトルの形状が似ている微生物の特定は困難である。
　また、上記特許文献１や非特許文献１の装置の検出器に、蛍光分光器を使用したとしても個々の微生物の二次元蛍光スペクトルを取得することは以下の理由により困難である。蛍光分光器では先述のようにグレーティングの位置を変更することで励起光の波長を決めるが、位置変更には数秒の時間を必要とする。一方、上記特許文献１や非特許文献１の装置のようなフローサイトメータでは、測定対象の粒子が検出領域を通過する時間（測定時間）は一般的に数マイクロ秒～ミリ秒であるため、測定時間中に励起光の波長を変えることは困難である。
　そこで本発明は、液体中の個々の微生物等の粒子の蛍光スペクトルを連続的に取得し、微生物などの種類の特定を行うことができるフロー式単粒子分光器を提供することにある。
　上記課題を解決するために本発明は、検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子を光学的に検出するための流路である検知用流路と、前記検出用流路を流動した前記検体液を保管するための廃液容器と、前記検体液を前記検体容器、前記検知用流路、前記廃液容器の順に送液するための送液手段と、紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器とからなることを特徴とする。
　本発明によれば、液体中の個々の粒子の二次元蛍光スペクトルの取得が可能になることにより、二次元蛍光スペクトルの形状の差異を利用した粒子の種類の判別が可能になるという極めて優れた効果を発揮できるフロー式単粒子分光器を提供できる。
　上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
本発明の実施例１に係るフロー式単粒子分光器の全体概略構成図である。 実施例１に係るフロー式単粒子分光器を構成する光学系の位置関係を示す図である。 実施例１に係るフロー式単粒子分光器における粒子の位置と蛍光スペクトルを示す図である。 実施例１に係るフロー式単粒子分光器で取得した二次元蛍光スペクトルを示す図である。 実施例１に係るフロー式単粒子分光器で取得した二次元蛍光スペクトルを利用した粒子の種類の特定方法を示す図である。 実施例１に係るフロー式単粒子分光器の全体概略構成図である。 本発明の実施例２に係るフロー式単粒子分光器の全体概略構成図である。 実施例２に係るフロー式単粒子分光器を構成するカートリッジの構成図である。 実施例２に係るカートリッジにおける検知用流路を含む断面図である。 実施例２に係るカートリッジにおける検知用流路を含む分解構造例を示す図である。
　既述したように、従来は液体中に存在する菌を特定する場合は培養法で数日かけて検査する必要があった。しかし、万一の菌の発生・混入などを考慮に入れた場合には、安全・衛生を高める検知から、液体中の菌の種類を短時間に特定することが求められる。
　そこで、本願発明の発明者らは液体中の菌の種類を短時間に特定するための方法及び装置を種々検討した結果、本願発明に至った。以下その好ましい実施例について説明する。
　なお、本明細書において、検出対象となる液体中に含まれる微生物とは、通常の微生物の概念より広く、ウイルス、細菌、酵母、原生動物、菌類、胞子、花粉の検査方法及び検査装置を意味する。また、本明細書では、表記を簡単にするため、一般的に定義されている微生物（細菌、酵母、原生動物、菌類）の他、ウイルス、胞子、花粉を含め単に「微生物」と表記した。
　以下、図面を参照して、本発明の実施例を説明する。なお、後述する実施の形態は一例であって、各実施例同士の組み合わせ、公知又は周知の技術との組み合わせや置換による他の態様も可能であることは言うまでもない。
　図１は本発明の実施例１に係るフロー式単粒子分光器の全体概略構成図である。
　図２は実施例１に係るフロー式単粒子分光器を構成する光学系の位置関係を示す図である。
　図１において、フロー式単粒子分光器１（単微生物分光器ともいう）は、大別すると、検査対象（検体液）である液体を流動させるための流動部と液体中に含まれる微生物を光学的に検知するための光学検知部と図には記載がないが、流動部の制御と光学検知部からの信号を取り扱う制御システムからなる。
　流動部は、検体液を保持する検体容器１１０と、検体液を送液するための送液ポンプ１１１と、検体液中の微生物を流動させながら光学的に検知するための流路である検知用微細流路１１２と、検知用微細流路１１２を通過した検体液を保管するための廃液容器１１３からなる。検体容器１１０中の検体液は、送液ポンプ１１１により検体容器１１０から検知用微細流路１１２を経由し廃液容器１１３へと流動する。
　光学検知部は、白色光を発する白色光源１００と、白色光を分光するための分光素子である励起光分光素子１０１と、分光した光１２１を検知用微細流路１１２に集光するための光学素子である励起光集光素子１０２と、検知用微細流路１１２を流れる微生物１２０から発せられる蛍光１２２を集光するための光学素子である蛍光集光素子１０３と、蛍光集光素子１０３によって集光された蛍光を分光するための分光素子である蛍光分光素子１０４と、分光した蛍光をマルチチャネル型光検出器１０６に集光するための光学素子である分光集光素子１０５と、分光された蛍光の光量を一定の波長間隔毎に検出することで蛍光スペクトルを取得することができるマルチチャネル型光検出器１０６と、検知用微細流路１１２を流れる微生物１２０から発せられる前方散乱光を前方散乱光検出器１０７に集光するための光学素子である前方散乱光集光素子１０８で構成される。
　続いて、上述した各構成要素の詳細について説明する。
　まず、白色光源１００は紫外域から近赤外域までの広い波長域の白色光を放出する光源であり、集光や十分な光量を得ることが容易であることから白色レーザーが好ましいが、使用用途によってはハロゲンランプやキセノンランプのような光源でもよい。
　次に、励起光分光素子１０１や蛍光分光素子１０４は白色光源を波長毎に空間的に分散させるための光学素子であり、プリズムや回折格子を用いる。図１ではプリズムを使用しているが、透過型回折格子や反射型回折格子であってもよい。
　次に、励起光集光素子１０２、蛍光集光素子１０３、分光集光素子１０５、前方散乱光集光素子１０８は素子に入射する光を空間的に集光させるための光学素子であり、レンズや曲面鏡を用いる。
　次に、マルチチャネル型光検出器１０６は蛍光分光素子１０４によって波長毎に分散された光の光量を検出することが可能な光検出器であり、入射した光のスペクトルを取得することができる。複数のフォトダイオードやフォトマルチプライヤで構成されたものや、CCD（Charge Coupled Device）イメージセンサ、ICCD（Intensified charge Coupling Device）イメージセンサ、CMOS（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサのような複数の受光素子からなる光検出器を用いる。
　次に、前方散乱光検出器１０７は、フォトダイオードやフォトマルチプライヤのような光検出器であるが、一般的に前方散乱光の光量は蛍光や側方散乱光の光量よりもはるかに多いため、マルチチャネル型光検出器１０６よりは低感度の光検出器を用いる。
　次に、検知用微細流路１１２は、断面が矩形もしくは円形の流路であり、断面の一辺もしくは直径寸法は例えば１μｍ～１ｍｍが好ましく、長さは例えば０．０１ｍｍ～１０ｍｍが好ましい。検知用微細流路１１２の断面寸法は、大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには小さいほうが良い。また検知用微細流路１１２の材質には光透過性の物質を使用し、好ましくは蛍光計測を行うため自家蛍光が低く、光透過性、面精度、屈折率などの光学特性に優れている必要がある。ガラス、石英、ポリメタクリル酸メチルエステル、ポリジメチルシロキサン、シクロオレフィンポリマー、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイトなど光学特性に優れた材料を使用する。
　励起光分光素子１０１によって分光した光１２１は励起光集光素子１０２によって検知用微細流路１１２に照射される。このとき分光した光１２１の波長（紫外域から近赤外域）は検知用微細流路１０２の流れ方向にそって変化し、微生物１２０は検知用微細流路１１２を流れる際に紫外光から近赤外域までの波長の光を照射されることになる。
　次に送液ポンプ１１１は、検体液を検体容器１１０、検知用微細流路１１２、廃液容器１１３の順に送液するためのポンプであり、脈流が小さいほうが好ましい。また、検体液をシース液で包みこむように流すシースフローを利用してもよい。この場合はシース液を保管するためのシース液容器が必要になり、送液ポンプ１１１は検体液とシース液を同時に流動する。シースフローを利用することで、検体液を検知用微細流路１１２の中心を流すことが可能になり、また検体液中の微生物の向きを揃えることが可能になるため、微生物から発せられる蛍光や散乱光の強度が微生物の位置や向きによって変わらないため、より正確な解析が可能になる。
　図２において、白色光源１００から放出され励起用集光素子を通過した光の向き（図中ｘ方向）は、検知用微細流路１１２の向き（図中ｚ方向）と垂直の関係である。また、白色光源からの光の影響を最小にするため、蛍光集光素子１０３は検知用微細流路１１２から図中ｙ方向に配置する。
　次に、単微生物分光器１を利用した個々の微生物の二次元蛍光スペクトルを取得し、微生物の特定する手順について説明する。
（１）検体液の前処理
　検査する検体液について適切な前処理を実施する。ここでの前処理とは、検体液から余計な物質を取り除き検査対象である微生物の純度を高くする作業である精製、検査対象である微生物の濃度を高くする作業である濃縮、検査対象である微生物に特定の蛍光物質を結合させる染色などの作業である。
（２）検体液の測定
　前処理を終えた検体液を検体容器１１０に入れ、制御システムを介して単微生物分光器１を動作させる。単微生物分光器１は検体液を検知用微細流路１１２に送液する。検知用微細流路１１２に照射されている光は流路方向に沿って近赤外域から紫外域まで波長が変化するため、微生物１２０が分光した光１２１を通過する際には、微生物１２０は近赤外域から紫外域の波長の光を励起光とした蛍光を発する。
　図３は実施例１に係る単粒子分光器における粒子の位置と蛍光スペクトルを示す図である。本図では、検知用微細流路１１２を流れる微生物１２０が分光した光１２１を通過したときに取得することができる蛍光スペクトルを示す図である。
　図３において、図では微生物１２０は上から下方向に流れ、分光した光１２１の波長は上から下に向かうほど短波長になっているが、流れ方向や波長の順序は逆でも構わない。図中右側のグラフは、微生物１２０がその位置において発する光のスペクトルを示し、マルチチャネル型光検出器１０６で取得したものである。マルチチャネル型光検出器１０６に入射する光は微生物１２０から発せられる蛍光の他に微生物１２０からの側方散乱光（微生物１２０によって散乱された励起光のうち、光の入射方向に対し側方に分散した光）が含まれる。
　得られたスペクトルは蛍光スペクトルと側方散乱光のスペクトルを重ね合わせたものになるが、蛍光の波長は励起光よりも長波長であり、散乱光の波長は励起光と同じである。そのため、スペクトルの二つのピークのうち低波長側のピーク１２３が側方散乱光のスペクトルのピークとなり、長波長側のピーク１２４が蛍光のスペクトルのピークとなる。また微生物１２０が検知用微細流路１１２を上から下に流れると照射される励起光の波長も近赤外域から紫外域まで変化するため、得られるスペクトルも長波長側から短波長側に移動する。
　図４は実施例１に係る単粒子分光器で取得した二次元蛍光スペクトルを示す図である。本図は、得られたスペクトルを蛍光波長λfと励起波長λexの二次元スペクトルに変換したものである。
　図４において、励起光の波長λexの値は散乱光スペクトル１２３のピークの波長と等しいとして考える。
（３）微生物の特定
　単微生物分光器１は、微生物１２０の前方散乱光の強度、微生物１２０の側方散乱光の強度、微生物１２０の二次元蛍光スペクトルを取得することができる。前方散乱光の強度は微生物１２０の大きさを示し、側方散乱光の強度は微生物１２０の内部構造の複雑さを示し、二次元スペクトルは微生物が保有する自家蛍光物質（NADH（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）など）や前処理にて導入された蛍光物質に対する染まりやすさを示す。これらの性質は微生物の種類によって異なり、微生物毎にデータベース化することによって、取得した前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、二次元スペクトルの形状をデータベースと比較することにより微生物の種類の特定が可能になる（図５）。
　本装置で得ることのできるこれらのデータは、一個の微生物についてのデータであるため、蛍光を発する不純物やその他の微生物が混在したとしても、個々の微生物について特定が可能になる。
　図６は実施例１に係る単粒子分光器の全体概略構成図である。
　図６において、先の実施例では、白色光を励起光分光素子１０１で分光した光を利用したが、図６に示すように、異なる波長の光を放出する光源を複数並べた単色光源群１３０を利用してもよい。単色光源群１３０から放出された光を、互いに重ならないように検知用微細流路１１２に照射する。微生物１２０は単色光源群の光１２５の照射域を通過する際にそれぞれの励起波長に応じた蛍光を発するため、先の実施例と同様に二次元スペクトルを取得することができる。
　先の実施例では、検体液の前処理は検査者が手作業で行っていた。前処理は煩雑かつ専門的技量を必要とする作業であり、検査者の技量や作業時間の差異によって検査結果に違いが生じる。以下、前処理の工程も自動化することでこれらの課題を解決した実施例について説明する。
　図７は本発明の実施例２に係る単粒子分光器の全体概略構成図である。
　図７において、単微生物分光システム２は、検体液や試薬を内部に保持し、個々の微生物の蛍光スペクトルの取得に必要な工程を行うための機構を内部に備えた微生物検査カートリッジ１４０と、微生物計測に必要な工程を行うために、微生物検査カートリッジ１４０と連結したカートリッジ連結管１４２１～１４２３を介して、微生物検査カートリッジ１４０内の検体液や試薬の搬送を制御するための送液制御部１４２と、微生物検査カートリッジ１４０を保持し、微生物検査カートリッジ１４０の位置を調整するカートリッジ保持台１４１と、微生物検査カートリッジ１４０内の微生物に分光した光を照射し、微生物から発せられる蛍光及び散乱光を検出する光学検出部で構成されている。
　単微生物分光システム２に連結したシステム装置１４８は、送液制御部１４２に対する制御信号の出力と、光学検出部から入力される電気信号に対する信号処理を実行する。なお、電気信号の処理により得られた計測結果は、システム装置１８に接続された出力装置１４９に表示される。
　送液制御部１４２は、ポンプ１４２４を有する。ポンプ１４２４と微生物検査カートリッジ１４０の各通気口１４５１～１４５３（図８）は、カートリッジ連結管１４２１～１４２３によって接続されている。カートリッジ連結管１４２１～１４２３には、バルブ１４２５～１４２７がそれぞれ設けられている。バルブ１４２５～１４２７を開閉することにより、微生物検査カートリッジ１４０の容器に所定の圧力の気体を供給し、又は、微生物検査カートリッジ１４０の容器を大気開放する。この圧力の制御により、微生物検査カートリッジ１４０内における検体液や試薬の搬送を実現する。
　光学検出部は、先の実施例と同じく白色光を発する白色光源１００と、白色光を分光するための分光素子である励起光分光素子１０１と、分光した光１２１を検知用微細流路１１２に集光するための光学素子である励起光集光素子１０２と、検知用微細流路１１２を流れる微生物１２０から発せられる蛍光を集光するための光学素子である蛍光集光素子１０３と、蛍光集光素子１０３によって集光された蛍光を分光するための分光素子である蛍光分光素子１０４と、分光した蛍光をマルチチャネル型光検出器１０６に集光するための光学素子である分光集光素子１０５と、分光された蛍光の光量を一定の波長間隔毎に検出することで蛍光スペクトルを取得することができるマルチチャネル型光検出器１０６と、検知用微細流路１１２を流れる微生物１２０から発せられる前方散乱光を前方散乱光検出器１０７に集光するための光学素子である前方散乱光集光素子１０８で構成される。
　なお、励起光集光素子１０２、蛍光集光素子１０３及び散乱光集光素子１０８の焦点は、互いの焦点が重なるように配置され、測定時には検知用微細流路１４４を焦点の位置に調整できるように構成されている。
　図８は実施例２に係る単粒子分光器を構成するカートリッジの構成図である。
　図８において、微生物検査カートリッジ１４０は、検体液を保持するための検体容器１４６１と、検体液中の微生物の染色するための染色液（試薬液）を保持し、検体液と染色液を混合、反応させる染色液容器１４６２と、励起光を照射し、微生物を観測するための検知用微細流路１４４と、検知用微細流路１４４を通過した検体液と染色液の混合液を廃棄するための廃液容器１４７と、検体容器１４６１、染色液容器１４６２、検知用微細流路１４４を連結し、検体液や混合液が流動するための溶液用流路１４８１～１４８２と、検体液や混合液を気圧により流動させるため送液制御部１４２と各容器を接続する通気用流路１４９１～１４９３とで構成されている。本明細書においては、検体液の流れに沿って検体容器１４６１の側を上流側、検知用微細流路１４４の側を下流側と定義する。
　図９Ａ及び図９Ｂを用い、微生物検査カートリッジ１４０のうち検知用微細流路１４４の構造を説明する。
　図９Aは実施例２に係るカートリッジにおける検知用流路を含む断面図である。
　図９Bは実施例２に係るカートリッジにおける検知用流路を含む分解構造例を示す図である。
　図９Ａは、微生物検査カートリッジ１４０の本体１５１と検知用微細流路１４４の接合部であり、図９Ｂは、検知用微細流路１４４の分解斜視図を示す。
　なお、本体１５１と検知用微細流路１４４はそれぞれ別工程で作製され、それぞれを接合する。検知用微細流路１４４の製造方法を説明する。
　図９Ａ、図９Ｂにおいて、微生物検出部１７はカバー部材１７１と流路部材１７２からなり、両者は共に薄い平板からなる。流路部材１７２には溝１７３１が形成されており、この溝１７３１の両端には貫通孔１７４１、１７５１が形成されている。溝１７３１が形成された面が張り合わせ面となるように、カバー部材１７１と流路部材１７２を張り合わせる。この貼り合わせにより検知用微細流路１４４が形成される。流路部材１７２の貫通孔１７４１、１７５１によって、検知用微細流路入口１７４と検知用微細流路出口１７５が構成される。
　一方、本体１５１に形成された染色液容器－検知用微細流路間流路１５７４は、その下端にて流路方向を変更し、本体１５１の表面に開口を形成している。同様に、検知用微細流路－廃液容器間流路１５７６は、その上端にて流路方向を変更し、本体１５１の表面に開口を形成している。染色液容器－検知用微細流路間流路１５７４の開口は、検知用微細流路入口１７４に接続され、検知用微細流路－廃液容器間流路１５７６の開口は、検知用微細流路出口１７５に接続されている。
　本体１５には検知用窓枠部１６１が形成されている。検知用窓枠部１６１は、貫通孔、又は、貫通溝である。検知用窓枠部１６１は、染色液容器－検知用微細流路間流路１５７４の開口と検知用微細流路－廃液容器間流路１５７６の開口の間に形成されている。製造された検知用微細流路１４４は、前述したように、本体１５１に装着される。図９Ａに示すように、本体１５１の検知用窓枠部１６１の上に検知用微細流路１４４が配置されるようにする。
　形態例の場合、検知用微細流路１４４の背後に、本体１５１の貫通孔又は貫通溝である検知用窓枠部１６１が設けられる。従って、励起光１８０は、検知用微細流路１４４のみを照射し、本体１５１を照射しない。このため、背景光の増加の原因となる本体１５１からの反射光や自家蛍光は発生しない。検知用微細流路１４４を通過した励起光１８０が、本体１５１に照射されないためには、検知用窓枠部１６１を構成する貫通孔の断面は、励起光１８０の放射方向に沿って増加することが好ましい。
　カバー部材１７１の厚さは、例えば０．０１μm～１ｍｍとする。流路部材１７２の厚さは、例えば０．０１μm～１ｍｍとする。検知用微細流路１４４の断面形状は、例えば正方形、長方形、台形に形成する。微検知用微細流路１４４の断面寸法は、大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには小さいほうが良い。検知用微細流路１４４の断面の一辺は、例えば１μｍ～１ｍｍが好ましく、長さは例えば０．０１ｍｍ～１０ｍｍが好ましい。検知用微細流路１４４に照射する励起光１８０の光軸は、検知用微細流路１４４の方向ベクトルに対して垂直になる。
　微生物検査カートリッジ１４０を用いた個々の菌種の特定は、図７に示すように、微生物検査カートリッジ１４０を単微生物分光システム２にセットした状態で開始される。この測定工程は、微生物検査カートリッジ１４０の位置合わせを行う位置合わせ工程と、検体液から夾雑物を取り除いて検体液中の微生物を染色する前処理工程と、微生物の二次元スペクトルを実際に測定する計測工程とで構成される。
　位置合わせ工程と前処理工程は独立した工程であるため並列して行い、両工程が終了した段階で計測工程を行う。続いて、各工程における各液体の移動について説明する。
　図８において、前処理工程では、まず、検体液が染色液容器１４６１に移動される。次に、通気口１４５１を介して検体容器１４６１に対して図７に示す送液制御部１４２の圧力を加える。これにより、検体容器１４６１内の気圧を上げる。同時に、染色液容器通気口１４９１を介して染色液容器１４６２の内圧を大気圧に開放する。気圧差により、検体液は、染色液容器１４６２に入り、微生物染色液と混合される。混合には、バブリングを使用する。検体液中の菌は、染色液（ここではシアニン系蛍光色素を使用する。）により染色される。
　二液の混合液の水位は、染色液容器１４６２と検知用微細流路１４４を連結する染色液容器－検知用微細流路１４８２の最高点を越えず、さらに染色液容器１４６２中に入っている空気は、染色液容器通気口１４９１を介して外部に放出される。染色液容器１４６２の気圧は大気圧と等しいため、二液の混合液は検知用微細流路１４４に押し出されず、混合液を反応に必要な時間中、染色液容器１４６２に保持することができる。
　なお、染色中は、微生物検査チップ１０の温度を一定に保つことにより、温度変化による染色の影響を小さくすることが望ましい。
　また、検体液が夾雑物除去部１６０を経て、染色液容器１４６２へ流動する際に、検体液中の夾雑物は、夾雑物除去部１６０により検体液から取り除かれる。
　以上で、前処理工程が終了する。また、この前処理工程と並行して、微生物検査カートリッジ１４０の位置合わせが実行される。
　以上の動作が終了すると、検体液と微生物染色液の混合液が検知用微細流路１４４に移動される。先の実施例と同様に、検知用微細流路１４４には分光した光が照射されているため、検知用微細流路１４４を流れる微生物が分光された光の照射域を通過する際に、それぞれの励起波長に応じた蛍光を発するため、先の実施例と同様に二次元スペクトルを取得することができる。
　以上のごとく本発明によれば、液体中の個々の粒子の種類を正確に特定する手段を提供する装置。白色光を分光した光を照射した検知用流路に測定対象の粒子を含む液体を送液し、測定対象の粒子から発せられる蛍光を分光することで蛍光スペクトルを取得することにより、二次元蛍光スペクトルを取得することが可能になり、取得した二次元蛍光スペクトルの形状から粒子の種類の特定を行うことが可能になったものである。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されたものではない。またある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、またある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
１…フロー式単粒子分光器、２…単微生物分光システム、１８…システム装置、１０…微生物検査チップ、１００…白色光源、１０１…励起光分光素子、１０２…励起用光集光素子、１０３…蛍光集光素子、１０４…蛍光分光素子、１０５…分光集光素子、１０６…マルチチャネル型光検出器、１０７…前方散乱光検出器、１０８…前方散乱光集光素子、１１０…検体容器、１１１…送液ポンプ、１１２…検知用微細流路、１１３…廃液容器、１２０…微生物、１２１…光、１２３…散乱光スペクトル、１２５…光、１３０…単色光源群、１４０…微生物検査カートリッジ、１４１…カートリッジ保持台、１４２…送液制御部、１４８…システム装置、１４４…検知用微細流路、１４７…廃液容器、１４９…出力装置、１５１…本体、１６０…夾雑物除去部、１６１…検知用窓枠部、１７１…カバー部材、１７２…流路部材、１７４…検知用微細流路入口、１７５…検知用微細流路出口、１８０…励起光、１４２１～１４２３…カートリッジ連結管、１４２４…ポンプ、１４２５～１４２７…バルブ、１４６１…検体容器、１４６２…染色液容器、１４８１～１４８２…溶液用流路、１４９１～１４９３…通気用流路、１７３１…溝、１７４１…通気孔、１７５１…通気孔、１５７４…染色液容器－検知用微細流路間流路、１５７６…検知用微細流路－廃液流路管流路。

Claims (7)

  1. 　検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子を光学的に検出するための流路である検知用流路と、前記検出用流路を流動した前記検体液を保管するための廃液容器と、前記検体液を前記検体容器、前記検知用流路、前記廃液容器の順に送液するための送液手段と、
    　紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、
    　前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器からなるフロー式単粒子分光器。
  2. 　請求項１記載のフロー式単粒子分光器において、
    　前記マルチチャネル型光検出器は前記粒子から発せられる前方散乱光を集光するための散乱光用集光素子と、前記散乱光用集光素子によって集光された光の強度を検出するための散乱光用光検出器とを備えたフロー式単粒子分光器。
  3. 　検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子を光学的に検出するための流路である検知用流路と、前記検出用流路を流動した前記検体液を保管するための廃液容器と、前記検体液を前記検体容器、前記検知用流路、前記廃液容器の順に送液するための送液手段と、
    　紫外域から近赤外域までの一部波長域の光を発する複数の単色光源と、前記複数の単色光源から発せられた光を前記検知用流路に重複しないように集光するための励起光集光素子と、
    　前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器からなるフロー式単粒子分光器。
  4. 　請求項３記載のフロー式単粒子分光器において、
    　前記マルチチャネル型光検出器は前記粒子から発せられる前方散乱光を集光するための散乱光用集光素子と、前記散乱光用集光素子によって集光された光の強度を検出するための散乱光用光検出器とを備えたフロー式単粒子分光器。
  5. 　請求項１または３のいずれかに記載にフロー式単粒子分光器において、
    　前記マルチチャネル型光検出器で取得した光のスペクトルから、低波長側のピーク波長を励起光の波長と判断し、励起光の波長を変数とした二次元蛍光スペクトルを取得することができるフロー式単粒子分光器。
  6. 　請求項５記載のフロー式単粒子分光器において、
    　前記粒子の種類毎の前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、二次元蛍光スペクトルをデータベースとして備えて、前記単粒子分光器で測定した粒子の前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、二次元蛍光スペクトルとデータベースを比較することで粒子の種類を特定することができるフロー式単粒子分光器。
  7. 　検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子と反応する試薬を保持すると共に前記検体液と前記試薬とを反応させる反応容器と、前記検査対象の粒子を流動させ光学的に検出するための検知用流路とを有する検査カートリッジと、
    　前記検査カートリッジと連結され、前記検体液、前記試薬とを前記検査カートリッジ内に搬送する圧力供給装置と、
    　前記検査カートリッジを保持すると共に、前記検査カートリッジを移動させるステージとを有し、
    　紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、
    　前記粒子から発せられる前方散乱光を集光するための散乱光用集光素子と、前記散乱光用集光素子によって集光された光の強度を検出するための散乱光用光検出器と、
    前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器からなるフロー式単粒子分光器。
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