JP5895064B2 - フロー式単粒子分光器 - Google Patents
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Description
本発明は、液体中の個々の微生物等の粒子の蛍光スペクトルを連続的に取得し、微生物などの種類の特定を行うフロー式単粒子分光器に関する。
従来、飲料水などの液体中に含まれる特定微生物の計測手段として、培養法が一般的に用いられていた。この培養法は、液体検体の懸濁液を培地上に塗布し生きている微生物を培養させ、増殖した微生物が形成するコロニー数を計測することで生きている微生物の数を計測する手法である。この手法は、特定微生物のみ増殖可能な培地を使用することで特定微生物の計測・特定も可能である。
しかし、この培養法は、微生物がコロニーを形成するまでに1日から数日を必要とするため、計測結果を得るまでに長時間の検査時間を必要とする。また、懸濁、希釈、塗布、コロニー計測などの検査工程を手作業で行うため、検査者は専門的知識および技量が必要になる。
そこで迅速に微生物の種類を特定する手段として、微生物の蛍光スペクトルの違いを利用する方法がある。この方法は、微生物の種類によって保持する物質の種類や量が異なり、また蛍光色素に対する染色度合いも異なるため、種類によって蛍光スペクトルは異なることを利用するものである。蛍光スペクトルは励起光の波長によっても異なるため、励起光の波長をパラメータとした蛍光スペクトル(以下、二次元蛍光スペクトルという)を取得することで、より詳細に微生物の種類の判別が可能になる。
微生物の蛍光スペクトルを取得する手段としては、蛍光分光器が一般的に用いられている。蛍光分光器は、専用の測定セルに入れた液体に特定波長の励起光を照射し、液体が発する蛍光スペクトルを取得することができる装置である。微生物などの粒子の蛍光スペクトルを取得するには、これらの粒子を超純水などの液体に懸濁することで測定することができる。
蛍光分光器の励起光は、白色光源の光からグレーティング(回折格子)とスリットで特定波長のみ取り出した光であり、グレーティングの位置を変えることで励起光の波長を変えることができる。そのため励起光の波長をパラメータとした蛍光スペクトルである二次元蛍光スペクトルを取得することも容易である
しかし、蛍光分光器で取得可能な蛍光スペクトルは液体内の全て粒子が発する蛍光の平均値であるため、個々の粒子の蛍光スペクトルを取得することはできない。そこで近年単一の粒子の状態や種類を特定するために、単一の粒子の発する蛍光やラマン散乱光のスペクトルを取得する方法が報告されている。
しかし、蛍光分光器で取得可能な蛍光スペクトルは液体内の全て粒子が発する蛍光の平均値であるため、個々の粒子の蛍光スペクトルを取得することはできない。そこで近年単一の粒子の状態や種類を特定するために、単一の粒子の発する蛍光やラマン散乱光のスペクトルを取得する方法が報告されている。
例えば、下記の特許文献1に記載されたラマン検出に基づくフローサイトメータは、流路を流れる測定対象の粒子にレーザー光を照射し、粒子から発せられるラマン散乱光をグレーティングなどの分光素子で分光したのち、マルチチャネル検出器により検出することでラマン散乱光のスペクトルを取得するものである。
また、下記の非特許文献1に記載のハイスループット単一細胞蛍光分光器(原文名:High-Throughput Single-Cell Fluorescence Spectroscopy)では、流路を流れる測定対象の粒子に488 nm アルゴンイオンレーザーを照射し、粒子から発せられる蛍光をグレーティングによる分光したのちICCD(Intensified charge-coupling device)により検出することで蛍光スペクトルを取得するものである。
微生物の種類を迅速に特定するには、微生物の蛍光スペクトルの違いを利用することが有効である。しかし、上述した従来技術により知られるこれまでの方法及び装置では、液体中に含まれる微生物数、種類、液体の状態などの影響により、要求を十分に満たすことは難しかった。
例えば蛍光分光器を使用する場合、液体検体中に十分な数の微生物(107個/ml〜)が存在しないと蛍光スペクトルを取得することは難しい。例えば、水道水中に存在する微生物数は約1個/ml以下であるため、検体液の培養及び濃縮を繰り返さないと蛍光スペクトルを取得することは困難である。また、液体検体中に複数の微生物が含まれている場合は、得られた蛍光スペクトルは存在する微生物全ての蛍光スペクトルの平均値となるため、種類の特定は困難である。
次に、上記特許文献1や非特許文献1の装置では、一種類の励起光の波長に対する蛍光スペクトルもしくはラマン散乱光スペクトルを取得することは可能だが、二次元蛍光スペクトルを取得することは困難である。そのため、スペクトルの形状が似ている微生物の特定は困難である。
また、上記特許文献1や非特許文献1の装置の検出器に、蛍光分光器を使用したとしても個々の微生物の二次元蛍光スペクトルを取得することは以下の理由により困難である。蛍光分光器では先述のようにグレーティングの位置を変更することで励起光の波長を決めるが、位置変更には数秒の時間を必要とする。一方、上記特許文献1や非特許文献1の装置のようなフローサイトメータでは、測定対象の粒子が検出領域を通過する時間(測定時間)は一般的に数マイクロ秒〜ミリ秒であるため、測定時間中に励起光の波長を変えることは困難である。
そこで本発明は、液体中の個々の微生物等の粒子の蛍光スペクトルを連続的に取得し、微生物などの種類の特定を行うことができるフロー式単粒子分光器を提供することにある。
上記課題を解決するために本発明は、検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子を光学的に検出するための流路である検知用流路と、前記検出用流路を流動した前記検体液を保管するための廃液容器と、前記検体液を前記検体容器、前記検知用流路、前記廃液容器の順に送液するための送液手段と、紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器とからなることを特徴とする。
本発明によれば、液体中の個々の粒子の二次元蛍光スペクトルの取得が可能になることにより、二次元蛍光スペクトルの形状の差異を利用した粒子の種類の判別が可能になるという極めて優れた効果を発揮できるフロー式単粒子分光器を提供できる。
上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
既述したように、従来は液体中に存在する菌を特定する場合は培養法で数日かけて検査する必要があった。しかし、万一の菌の発生・混入などを考慮に入れた場合には、安全・衛生を高める検知から、液体中の菌の種類を短時間に特定することが求められる。
そこで、本願発明の発明者らは液体中の菌の種類を短時間に特定するための方法及び装置を種々検討した結果、本願発明に至った。以下その好ましい実施例について説明する。
なお、本明細書において、検出対象となる液体中に含まれる微生物とは、通常の微生物の概念より広く、ウイルス、細菌、酵母、原生動物、菌類、胞子、花粉の検査方法及び検査装置を意味する。また、本明細書では、表記を簡単にするため、一般的に定義されている微生物(細菌、酵母、原生動物、菌類)の他、ウイルス、胞子、花粉を含め単に「微生物」と表記した。
以下、図面を参照して、本発明の実施例を説明する。なお、後述する実施の形態は一例であって、各実施例同士の組み合わせ、公知又は周知の技術との組み合わせや置換による他の態様も可能であることは言うまでもない。
図1は本発明の実施例1に係るフロー式単粒子分光器の全体概略構成図である。
図2は実施例1に係るフロー式単粒子分光器を構成する光学系の位置関係を示す図である。
図1において、フロー式単粒子分光器1(単微生物分光器ともいう)は、大別すると、検査対象(検体液)である液体を流動させるための流動部と液体中に含まれる微生物を光学的に検知するための光学検知部と図には記載がないが、流動部の制御と光学検知部からの信号を取り扱う制御システムからなる。
流動部は、検体液を保持する検体容器110と、検体液を送液するための送液ポンプ111と、検体液中の微生物を流動させながら光学的に検知するための流路である検知用微細流路112と、検知用微細流路112を通過した検体液を保管するための廃液容器113からなる。検体容器110中の検体液は、送液ポンプ111により検体容器110から検知用微細流路112を経由し廃液容器113へと流動する。
光学検知部は、白色光を発する白色光源100と、白色光を分光するための分光素子である励起光分光素子101と、分光した光121を検知用微細流路112に集光するための光学素子である励起光集光素子102と、検知用微細流路112を流れる微生物120から発せられる蛍光122を集光するための光学素子である蛍光集光素子103と、蛍光集光素子103によって集光された蛍光を分光するための分光素子である蛍光分光素子104と、分光した蛍光をマルチチャネル型光検出器106に集光するための光学素子である分光集光素子105と、分光された蛍光の光量を一定の波長間隔毎に検出することで蛍光スペクトルを取得することができるマルチチャネル型光検出器106と、検知用微細流路112を流れる微生物120から発せられる前方散乱光を前方散乱光検出器107に集光するための光学素子である前方散乱光集光素子108で構成される。
続いて、上述した各構成要素の詳細について説明する。
まず、白色光源100は紫外域から近赤外域までの広い波長域の白色光を放出する光源であり、集光や十分な光量を得ることが容易であることから白色レーザーが好ましいが、使用用途によってはハロゲンランプやキセノンランプのような光源でもよい。
次に、励起光分光素子101や蛍光分光素子104は白色光源を波長毎に空間的に分散させるための光学素子であり、プリズムや回折格子を用いる。図1ではプリズムを使用しているが、透過型回折格子や反射型回折格子であってもよい。
次に、励起光集光素子102、蛍光集光素子103、分光集光素子105、前方散乱光集光素子108は素子に入射する光を空間的に集光させるための光学素子であり、レンズや曲面鏡を用いる。
次に、マルチチャネル型光検出器106は蛍光分光素子104によって波長毎に分散された光の光量を検出することが可能な光検出器であり、入射した光のスペクトルを取得することができる。複数のフォトダイオードやフォトマルチプライヤで構成されたものや、CCD(Charge Coupled Device)イメージセンサ、ICCD(Intensified charge Coupling Device)イメージセンサ、CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)イメージセンサのような複数の受光素子からなる光検出器を用いる。
次に、前方散乱光検出器107は、フォトダイオードやフォトマルチプライヤのような光検出器であるが、一般的に前方散乱光の光量は蛍光や側方散乱光の光量よりもはるかに多いため、マルチチャネル型光検出器106よりは低感度の光検出器を用いる。
次に、検知用微細流路112は、断面が矩形もしくは円形の流路であり、断面の一辺もしくは直径寸法は例えば1μm〜1mmが好ましく、長さは例えば0.01mm〜10mmが好ましい。検知用微細流路112の断面寸法は、大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには小さいほうが良い。また検知用微細流路112の材質には光透過性の物質を使用し、好ましくは蛍光計測を行うため自家蛍光が低く、光透過性、面精度、屈折率などの光学特性に優れている必要がある。ガラス、石英、ポリメタクリル酸メチルエステル、ポリジメチルシロキサン、シクロオレフィンポリマー、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイトなど光学特性に優れた材料を使用する。
励起光分光素子101によって分光した光121は励起光集光素子102によって検知用微細流路112に照射される。このとき分光した光121の波長(紫外域から近赤外域)は検知用微細流路102の流れ方向にそって変化し、微生物120は検知用微細流路112を流れる際に紫外光から近赤外域までの波長の光を照射されることになる。
次に送液ポンプ111は、検体液を検体容器110、検知用微細流路112、廃液容器113の順に送液するためのポンプであり、脈流が小さいほうが好ましい。また、検体液をシース液で包みこむように流すシースフローを利用してもよい。この場合はシース液を保管するためのシース液容器が必要になり、送液ポンプ111は検体液とシース液を同時に流動する。シースフローを利用することで、検体液を検知用微細流路112の中心を流すことが可能になり、また検体液中の微生物の向きを揃えることが可能になるため、微生物から発せられる蛍光や散乱光の強度が微生物の位置や向きによって変わらないため、より正確な解析が可能になる。
図2において、白色光源100から放出され励起用集光素子を通過した光の向き(図中x方向)は、検知用微細流路112の向き(図中z方向)と垂直の関係である。また、白色光源からの光の影響を最小にするため、蛍光集光素子103は検知用微細流路112から図中y方向に配置する。
次に、単微生物分光器1を利用した個々の微生物の二次元蛍光スペクトルを取得し、微生物の特定する手順について説明する。
(1)検体液の前処理
検査する検体液について適切な前処理を実施する。ここでの前処理とは、検体液から余計な物質を取り除き検査対象である微生物の純度を高くする作業である精製、検査対象である微生物の濃度を高くする作業である濃縮、検査対象である微生物に特定の蛍光物質を結合させる染色などの作業である。
(2)検体液の測定
前処理を終えた検体液を検体容器110に入れ、制御システムを介して単微生物分光器1を動作させる。単微生物分光器1は検体液を検知用微細流路112に送液する。検知用微細流路112に照射されている光は流路方向に沿って近赤外域から紫外域まで波長が変化するため、微生物120が分光した光121を通過する際には、微生物120は近赤外域から紫外域の波長の光を励起光とした蛍光を発する。
(1)検体液の前処理
検査する検体液について適切な前処理を実施する。ここでの前処理とは、検体液から余計な物質を取り除き検査対象である微生物の純度を高くする作業である精製、検査対象である微生物の濃度を高くする作業である濃縮、検査対象である微生物に特定の蛍光物質を結合させる染色などの作業である。
(2)検体液の測定
前処理を終えた検体液を検体容器110に入れ、制御システムを介して単微生物分光器1を動作させる。単微生物分光器1は検体液を検知用微細流路112に送液する。検知用微細流路112に照射されている光は流路方向に沿って近赤外域から紫外域まで波長が変化するため、微生物120が分光した光121を通過する際には、微生物120は近赤外域から紫外域の波長の光を励起光とした蛍光を発する。
図3は実施例1に係る単粒子分光器における粒子の位置と蛍光スペクトルを示す図である。本図では、検知用微細流路112を流れる微生物120が分光した光121を通過したときに取得することができる蛍光スペクトルを示す図である。
図3において、図では微生物120は上から下方向に流れ、分光した光121の波長は上から下に向かうほど短波長になっているが、流れ方向や波長の順序は逆でも構わない。図中右側のグラフは、微生物120がその位置において発する光のスペクトルを示し、マルチチャネル型光検出器106で取得したものである。マルチチャネル型光検出器106に入射する光は微生物120から発せられる蛍光の他に微生物120からの側方散乱光(微生物120によって散乱された励起光のうち、光の入射方向に対し側方に分散した光)が含まれる。
得られたスペクトルは蛍光スペクトルと側方散乱光のスペクトルを重ね合わせたものになるが、蛍光の波長は励起光よりも長波長であり、散乱光の波長は励起光と同じである。そのため、スペクトルの二つのピークのうち低波長側のピーク123が側方散乱光のスペクトルのピークとなり、長波長側のピーク124が蛍光のスペクトルのピークとなる。また微生物120が検知用微細流路112を上から下に流れると照射される励起光の波長も近赤外域から紫外域まで変化するため、得られるスペクトルも長波長側から短波長側に移動する。
図4は実施例1に係る単粒子分光器で取得した二次元蛍光スペクトルを示す図である。本図は、得られたスペクトルを蛍光波長λfと励起波長λexの二次元スペクトルに変換したものである。
図4において、励起光の波長λexの値は散乱光スペクトル123のピークの波長と等しいとして考える。
(3)微生物の特定
単微生物分光器1は、微生物120の前方散乱光の強度、微生物120の側方散乱光の強度、微生物120の二次元蛍光スペクトルを取得することができる。前方散乱光の強度は微生物120の大きさを示し、側方散乱光の強度は微生物120の内部構造の複雑さを示し、二次元スペクトルは微生物が保有する自家蛍光物質(NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)など)や前処理にて導入された蛍光物質に対する染まりやすさを示す。これらの性質は微生物の種類によって異なり、微生物毎にデータベース化することによって、取得した前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、二次元スペクトルの形状をデータベースと比較することにより微生物の種類の特定が可能になる(図5)。
(3)微生物の特定
単微生物分光器1は、微生物120の前方散乱光の強度、微生物120の側方散乱光の強度、微生物120の二次元蛍光スペクトルを取得することができる。前方散乱光の強度は微生物120の大きさを示し、側方散乱光の強度は微生物120の内部構造の複雑さを示し、二次元スペクトルは微生物が保有する自家蛍光物質(NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)など)や前処理にて導入された蛍光物質に対する染まりやすさを示す。これらの性質は微生物の種類によって異なり、微生物毎にデータベース化することによって、取得した前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、二次元スペクトルの形状をデータベースと比較することにより微生物の種類の特定が可能になる(図5)。
本装置で得ることのできるこれらのデータは、一個の微生物についてのデータであるため、蛍光を発する不純物やその他の微生物が混在したとしても、個々の微生物について特定が可能になる。
図6は実施例1に係る単粒子分光器の全体概略構成図である。
図6において、先の実施例では、白色光を励起光分光素子101で分光した光を利用したが、図6に示すように、異なる波長の光を放出する光源を複数並べた単色光源群130を利用してもよい。単色光源群130から放出された光を、互いに重ならないように検知用微細流路112に照射する。微生物120は単色光源群の光125の照射域を通過する際にそれぞれの励起波長に応じた蛍光を発するため、先の実施例と同様に二次元スペクトルを取得することができる。
先の実施例では、検体液の前処理は検査者が手作業で行っていた。前処理は煩雑かつ専門的技量を必要とする作業であり、検査者の技量や作業時間の差異によって検査結果に違いが生じる。以下、前処理の工程も自動化することでこれらの課題を解決した実施例について説明する。
図7は本発明の実施例2に係る単粒子分光器の全体概略構成図である。
図7において、単微生物分光システム2は、検体液や試薬を内部に保持し、個々の微生物の蛍光スペクトルの取得に必要な工程を行うための機構を内部に備えた微生物検査カートリッジ140と、微生物計測に必要な工程を行うために、微生物検査カートリッジ140と連結したカートリッジ連結管1421〜1423を介して、微生物検査カートリッジ140内の検体液や試薬の搬送を制御するための送液制御部142と、微生物検査カートリッジ140を保持し、微生物検査カートリッジ140の位置を調整するカートリッジ保持台141と、微生物検査カートリッジ140内の微生物に分光した光を照射し、微生物から発せられる蛍光及び散乱光を検出する光学検出部で構成されている。
単微生物分光システム2に連結したシステム装置148は、送液制御部142に対する制御信号の出力と、光学検出部から入力される電気信号に対する信号処理を実行する。なお、電気信号の処理により得られた計測結果は、システム装置18に接続された出力装置149に表示される。
送液制御部142は、ポンプ1424を有する。ポンプ1424と微生物検査カートリッジ140の各通気口1451〜1453(図8)は、カートリッジ連結管1421〜1423によって接続されている。カートリッジ連結管1421〜1423には、バルブ1425〜1427がそれぞれ設けられている。バルブ1425〜1427を開閉することにより、微生物検査カートリッジ140の容器に所定の圧力の気体を供給し、又は、微生物検査カートリッジ140の容器を大気開放する。この圧力の制御により、微生物検査カートリッジ140内における検体液や試薬の搬送を実現する。
光学検出部は、先の実施例と同じく白色光を発する白色光源100と、白色光を分光するための分光素子である励起光分光素子101と、分光した光121を検知用微細流路112に集光するための光学素子である励起光集光素子102と、検知用微細流路112を流れる微生物120から発せられる蛍光を集光するための光学素子である蛍光集光素子103と、蛍光集光素子103によって集光された蛍光を分光するための分光素子である蛍光分光素子104と、分光した蛍光をマルチチャネル型光検出器106に集光するための光学素子である分光集光素子105と、分光された蛍光の光量を一定の波長間隔毎に検出することで蛍光スペクトルを取得することができるマルチチャネル型光検出器106と、検知用微細流路112を流れる微生物120から発せられる前方散乱光を前方散乱光検出器107に集光するための光学素子である前方散乱光集光素子108で構成される。
なお、励起光集光素子102、蛍光集光素子103及び散乱光集光素子108の焦点は、互いの焦点が重なるように配置され、測定時には検知用微細流路144を焦点の位置に調整できるように構成されている。
図8は実施例2に係る単粒子分光器を構成するカートリッジの構成図である。
図8において、微生物検査カートリッジ140は、検体液を保持するための検体容器1461と、検体液中の微生物の染色するための染色液(試薬液)を保持し、検体液と染色液を混合、反応させる染色液容器1462と、励起光を照射し、微生物を観測するための検知用微細流路144と、検知用微細流路144を通過した検体液と染色液の混合液を廃棄するための廃液容器147と、検体容器1461、染色液容器1462、検知用微細流路144を連結し、検体液や混合液が流動するための溶液用流路1481〜1482と、検体液や混合液を気圧により流動させるため送液制御部142と各容器を接続する通気用流路1491〜1493とで構成されている。本明細書においては、検体液の流れに沿って検体容器1461の側を上流側、検知用微細流路144の側を下流側と定義する。
図9A及び図9Bを用い、微生物検査カートリッジ140のうち検知用微細流路144の構造を説明する。
図9Aは実施例2に係るカートリッジにおける検知用流路を含む断面図である。
図9Bは実施例2に係るカートリッジにおける検知用流路を含む分解構造例を示す図である。
図9Aは、微生物検査カートリッジ140の本体151と検知用微細流路144の接合部であり、図9Bは、検知用微細流路144の分解斜視図を示す。
なお、本体151と検知用微細流路144はそれぞれ別工程で作製され、それぞれを接合する。検知用微細流路144の製造方法を説明する。
図9A、図9Bにおいて、微生物検出部17はカバー部材171と流路部材172からなり、両者は共に薄い平板からなる。流路部材172には溝1731が形成されており、この溝1731の両端には貫通孔1741、1751が形成されている。溝1731が形成された面が張り合わせ面となるように、カバー部材171と流路部材172を張り合わせる。この貼り合わせにより検知用微細流路144が形成される。流路部材172の貫通孔1741、1751によって、検知用微細流路入口174と検知用微細流路出口175が構成される。
一方、本体151に形成された染色液容器−検知用微細流路間流路1574は、その下端にて流路方向を変更し、本体151の表面に開口を形成している。同様に、検知用微細流路−廃液容器間流路1576は、その上端にて流路方向を変更し、本体151の表面に開口を形成している。染色液容器−検知用微細流路間流路1574の開口は、検知用微細流路入口174に接続され、検知用微細流路−廃液容器間流路1576の開口は、検知用微細流路出口175に接続されている。
本体15には検知用窓枠部161が形成されている。検知用窓枠部161は、貫通孔、又は、貫通溝である。検知用窓枠部161は、染色液容器−検知用微細流路間流路1574の開口と検知用微細流路−廃液容器間流路1576の開口の間に形成されている。製造された検知用微細流路144は、前述したように、本体151に装着される。図9Aに示すように、本体151の検知用窓枠部161の上に検知用微細流路144が配置されるようにする。
形態例の場合、検知用微細流路144の背後に、本体151の貫通孔又は貫通溝である検知用窓枠部161が設けられる。従って、励起光180は、検知用微細流路144のみを照射し、本体151を照射しない。このため、背景光の増加の原因となる本体151からの反射光や自家蛍光は発生しない。検知用微細流路144を通過した励起光180が、本体151に照射されないためには、検知用窓枠部161を構成する貫通孔の断面は、励起光180の放射方向に沿って増加することが好ましい。
カバー部材171の厚さは、例えば0.01μm〜1mmとする。流路部材172の厚さは、例えば0.01μm〜1mmとする。検知用微細流路144の断面形状は、例えば正方形、長方形、台形に形成する。微検知用微細流路144の断面寸法は、大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには小さいほうが良い。検知用微細流路144の断面の一辺は、例えば1μm〜1mmが好ましく、長さは例えば0.01mm〜10mmが好ましい。検知用微細流路144に照射する励起光180の光軸は、検知用微細流路144の方向ベクトルに対して垂直になる。
微生物検査カートリッジ140を用いた個々の菌種の特定は、図7に示すように、微生物検査カートリッジ140を単微生物分光システム2にセットした状態で開始される。この測定工程は、微生物検査カートリッジ140の位置合わせを行う位置合わせ工程と、検体液から夾雑物を取り除いて検体液中の微生物を染色する前処理工程と、微生物の二次元スペクトルを実際に測定する計測工程とで構成される。
位置合わせ工程と前処理工程は独立した工程であるため並列して行い、両工程が終了した段階で計測工程を行う。続いて、各工程における各液体の移動について説明する。
図8において、前処理工程では、まず、検体液が染色液容器1461に移動される。次に、通気口1451を介して検体容器1461に対して図7に示す送液制御部142の圧力を加える。これにより、検体容器1461内の気圧を上げる。同時に、染色液容器通気口1491を介して染色液容器1462の内圧を大気圧に開放する。気圧差により、検体液は、染色液容器1462に入り、微生物染色液と混合される。混合には、バブリングを使用する。検体液中の菌は、染色液(ここではシアニン系蛍光色素を使用する。)により染色される。
二液の混合液の水位は、染色液容器1462と検知用微細流路144を連結する染色液容器−検知用微細流路1482の最高点を越えず、さらに染色液容器1462中に入っている空気は、染色液容器通気口1491を介して外部に放出される。染色液容器1462の気圧は大気圧と等しいため、二液の混合液は検知用微細流路144に押し出されず、混合液を反応に必要な時間中、染色液容器1462に保持することができる。
なお、染色中は、微生物検査チップ10の温度を一定に保つことにより、温度変化による染色の影響を小さくすることが望ましい。
また、検体液が夾雑物除去部160を経て、染色液容器1462へ流動する際に、検体液中の夾雑物は、夾雑物除去部160により検体液から取り除かれる。
以上で、前処理工程が終了する。また、この前処理工程と並行して、微生物検査カートリッジ140の位置合わせが実行される。
以上の動作が終了すると、検体液と微生物染色液の混合液が検知用微細流路144に移動される。先の実施例と同様に、検知用微細流路144には分光した光が照射されているため、検知用微細流路144を流れる微生物が分光された光の照射域を通過する際に、それぞれの励起波長に応じた蛍光を発するため、先の実施例と同様に二次元スペクトルを取得することができる。
以上のごとく本発明によれば、液体中の個々の粒子の種類を正確に特定する手段を提供する装置。白色光を分光した光を照射した検知用流路に測定対象の粒子を含む液体を送液し、測定対象の粒子から発せられる蛍光を分光することで蛍光スペクトルを取得することにより、二次元蛍光スペクトルを取得することが可能になり、取得した二次元蛍光スペクトルの形状から粒子の種類の特定を行うことが可能になったものである。
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されたものではない。またある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、またある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
1…フロー式単粒子分光器、2…単微生物分光システム、18…システム装置、10…微生物検査チップ、100…白色光源、101…励起光分光素子、102…励起用光集光素子、103…蛍光集光素子、104…蛍光分光素子、105…分光集光素子、106…マルチチャネル型光検出器、107…前方散乱光検出器、108…前方散乱光集光素子、110…検体容器、111…送液ポンプ、112…検知用微細流路、113…廃液容器、120…微生物、121…光、123…散乱光スペクトル、125…光、130…単色光源群、140…微生物検査カートリッジ、141…カートリッジ保持台、142…送液制御部、148…システム装置、144…検知用微細流路、147…廃液容器、149…出力装置、151…本体、160…夾雑物除去部、161…検知用窓枠部、171…カバー部材、172…流路部材、174…検知用微細流路入口、175…検知用微細流路出口、180…励起光、1421〜1423…カートリッジ連結管、1424…ポンプ、1425〜1427…バルブ、1461…検体容器、1462…染色液容器、1481〜1482…溶液用流路、1491〜1493…通気用流路、1731…溝、1741…通気孔、1751…通気孔、1574…染色液容器−検知用微細流路間流路、1576…検知用微細流路−廃液流路管流路。
Claims (5)
- 検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子を光学的に検出するための流路である検知用流路と、前記検出用流路を流動した前記検体液を保管するための廃液容器と、前記検体液を前記検体容器、前記検知用流路、前記廃液容器の順に送液するための送液手段と、
紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、
前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器からなるフロー式単粒子分光器。 - 請求項1記載のフロー式単粒子分光器において、
前記マルチチャネル型光検出器は前記粒子から発せられる前方散乱光を集光するための散乱光用集光素子と、前記散乱光用集光素子によって集光された光の強度を検出するための散乱光用光検出器とを備えたフロー式単粒子分光器。 - 請求項1記載のフロー式単粒子分光器において、
前記マルチチャネル型光検出器で取得した光のスペクトルから、低波長側のピーク波長を励起光の波長と判断し、励起光の波長を変数とした二次元蛍光スペクトルを取得することができるフロー式単粒子分光器。 - 請求項3記載のフロー式単粒子分光器において、
前記粒子の種類毎の前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、二次元蛍光スペクトルをデータベースとして備えて、前記単粒子分光器で測定した粒子の前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、二次元蛍光スペクトルとデータベースを比較することで粒子の種類を特定することができるフロー式単粒子分光器。 - 検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子と反応する試薬を保持すると共に前記検体液と前記試薬とを反応させる反応容器と、前記検査対象の粒子を流動させ光学的に検出するための検知用流路とを有する検査カートリッジと、
前記検査カートリッジと連結され、前記検体液、前記試薬とを前記検査カートリッジ内に搬送する圧力供給装置と、
前記検査カートリッジを保持すると共に、前記検査カートリッジを移動させるステージとを有し、
紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、
前記粒子から発せられる前方散乱光を集光するための散乱光用集光素子と、前記散乱光用集光素子によって集光された光の強度を検出するための散乱光用光検出器と、
前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器からなるフロー式単粒子分光器。
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