TW202417831A - 用於微弱螢光光譜測量的方法和裝置 - Google Patents

Abstract

本發明公開了一種用於校準在光譜儀上獲得的螢光光譜測定值的方法。本發明的校準方法利用水的非螢光發射訊號，主要是利用水的拉曼散射訊號作為校準參考。對於含有微弱螢光待測物的水樣，經由光譜儀量測獲得的激發放射光譜，將同時帶有螢光訊號和水拉曼散射等非螢光發射訊號。故本發明提供了基於水拉曼光譜的校準因子，可以經由利用該校準因子校準光譜讀數，進而實現樣本能在不同批次或不同儀器量測間的相互比較。還公開了可用於執行校準方法的裝置，包括用於增強光譜測量效率和水拉曼校準方法的透鏡陣列、可執行校準方法的光譜儀，以及編碼了校準方法的電腦可讀取媒介。

Description

用於微弱螢光光譜測量的方法和裝置

本發明屬於分析化學領域。 更具體地，本發明涉及螢光訊號的光譜分析、用於測量校準的方法以及用於執行該分析的裝置。

生物樣本的螢光光譜可以揭露關於宿主中發生的生理或生化事件的重要信息，作為診斷工具具有很大的前景。當此類光譜數據庫與生物狀態關聯時，可做為代謝體學研究的基礎。例如，Liu 的美國專利公開號 US 2020/0093415A1 揭示了疾病狀況與血液自發光之間的相關性。 Lawaetz 等人。還公開了使用螢光光譜法早期檢測結直腸癌的方法（Lawaetz 等人，metabolomics (2012) 8:S111-S121，其全部內容通過引用併入本文）。然而，所有基於螢光技術產生的訊號，不僅包含與分析物相關的成分，還包含特定儀器或其他因環境造成的混雜因素，例如激發源的功率、樣本的光散射特性、光譜儀的收集效率和許多其他因素，這些因素通常被認為是背景干擾，且使所獲得螢光數據無法直接進行比較，特別是在螢光訊號非常弱的情況下（例如在同一台儀器上但在不同時間進行量測比較，或在不同儀器上進行測量）。如果沒有根據通用標準校準的測量方法，不同測量數據無法相互比較。因此，校準問題一直是光譜定量分析中的重要考慮因素。

Workman 等人討論了光譜分析中校準和轉換比較的整體問題（Spectroscopy, Spectroscopy-06-01-2020, Volume 35, Issue 6, p28-32 ，其全部內容通過引用併入本文。）利用序列稀釋標準樣本來建立標準曲線是一種訊號校準常用的方法， 然而，當分析物的訊號非常微弱時，這種校準方法可能因背景干擾而變得不可靠或很難達成。

此外，大數據的趨勢要求在不同儀器、甚至在同一儀器但在不同時間和不同測量條件下測量的數據組合可以直接進行比較。 儘管已經努力理解和考慮測量變異性，但傳統的校準方法在最好的情況下仍然是不可靠的。 實際上，建立個別分析物的先驗標準曲線也很繁瑣，尤其當樣本以不同的組合方式混合了多種未知分析物，並發出非常微弱的訊號時，基於樣本參考比對的校準方法可能非常具有挑戰性，甚至是不可能的。

Lawaetz 等人 (Applied Spectroscopy, Vol 63, No. 8, p936-940, 2009，其全部內容通過引用併入本文)提出了一種使用水拉曼峰的積分面積來校準螢光測量的方法。 該現有技術方法利用經驗定義的峰寬進行積分，以獲得拉曼校正因子作為用於調整訊號強度變化的標準校準參考。 Lawaetz 等人提出這種方法可以提供一個通用的拉曼尺度，將測量結果標準化為一個共同的拉曼單位，允許比較不同條件下和不同儀器的測量結果。 然而，Lawaetz 的方法僅限於可以產生良好訊噪比的樣本和儀器設置，並且仰賴於準確的峰寬量測，因此並無法廣泛且容易地校準這些儀器的個別儀器偏差。

Murphy公開了一種能自動確定螢光光譜中拉曼散射峰上下邊界的方法（Murphy, Applied Spectroscopy, vol. 65, no. 2, p.233-235, 2011，其全部內容併入本文 引用）。 這種方法據稱提高了拉曼單位方法的準確性，但仍然沒有解決未知混雜因素可能使光譜失真的局限性。在生物樣本的濃度非常低的情況下，導致相應螢光發射的光訊號強度非常低，樣本光譜可能會因各種背景訊號（包括拉曼訊號）而變得非常複雜。此外，如果量化涉及了在不同波長下激發的兩個不同螢光團之間的強度比，則該比值可能也需要進行儀器校準，而Murphy的方法並沒有考慮到這種情況。

因此，目前仍然需要一個更好的校準方法，可以廣泛統一校正光譜測量中的個別儀器偏差以及批次間的偏差。

首先，在第一方面，本發明提供了一種使用水的非螢光發射訊號作為校準參考，來校準自光譜儀上獲取之待測樣本螢光光譜測量值的方法。根據本發明，該方面的方法通常包括以下步驟：通過去除非螢光發射訊號來校正待測樣本螢光光譜測量值中的背景干擾； 利用一個或多個可將待測樣本中水的非螢光發射峰訊號與參考樣本中水的相應非螢光發射峰訊號相關聯的校準因子，來校準校正後的螢光光譜測量值。

為了獲得螢光光譜測量值，通常第一步是經由將激發光照射在待測樣本上，然後偵測從待測樣本發出的發射光。 在一些實施例中，螢光光譜測量值涵蓋了一系列波長的光譜讀數。在一些其他實施例中，螢光光譜測量值為一個或多個預定波長處的離散發射波長讀數。

理想的激發光源為具有預定波長的單色光。在一些實施例中僅使用單一波長。 在一些其他實施例中會使用數個波長。在一些優選實施例中，則使用一個波長範圍內彼此間距為固定預設值的離散波長。

光學領域中已存在許多類型的光源，在此不具體限制。舉例而言，包括發光二極管（LED）、激光二極管(laser diodes)、汞或氙弧燈和鹵素燈，或已知的任何其他光源。 本領域的專業人員理解，不同光源的特質亦所有差異，這可能會影響儀器設計、光學分析，讀數也必須針對背景干擾進行適當校正，並針對實驗上和儀器上的差異進行校準 。

可用於本發明方法的光譜儀沒有特別的限制，可以是使用濾光器隔離特定波長光的濾光片螢光計，也可以是使用衍射光柵單色器隔離入射光和螢光的光柵類型儀器。

水的非螢光發射訊號可以包括拉曼散射、瑞利散射，以及在被激發光激發後，來自水的任何其他非螢光發射訊號。 在一些優選實施例中，非螢光發射訊號僅包括拉曼散射。 在一些其他優選實施例中，非螢光發射訊號包括拉曼散射和瑞利散射。

適合使用本發明方法進行測量和校準的待測樣本通常為水樣。在一些實施例中，待測樣本含有微量的一種或多種螢光分析物，濃度優選地落在picomolar (pM)到micromolar (μM)的濃度範圍內；更優選地落在約10pM至約10μM之間。在一些優選實施例中，待測樣本可以是生物樣本。示例性的生物樣本可以包括全血樣本、血清樣本、含有類黃酮的水樣、唾液、尿液、痰或其組合。

校準前應對待測樣本的螢光光譜測量值進行背景干擾校正。需要校正的背景干擾包括拉曼散射、瑞利散射、環境光、裝置熱雜訊等。在一些實施例中，拉曼散射和瑞利散射都從螢光光譜測量值中去除。 在其他實施例中，僅拉曼散射訊號自螢光光譜測量值中移除。

本發明的校準因子主要將待測樣本的測量值縮放到與參考樣本的測量值相同。這些因子在數學上可將一組測量值轉換為另一組測量值，以便將因儀器、環境或其他因素引起的變化進行標準化。

任何數量的輸入參數和數學關係都可以有利地被採用來制定校準因子。在一些實施例中，校準因子是參考樣本和待測樣本的水拉曼峰高之間的比率。在一些其他實施例中，校準因子可以是參考樣本和待測樣本的水拉曼曲線下面積之間的比率。 在另外一些其他實施例中，也可以使用峰高和曲線下面積的組合。

可用於校準目的的參考樣本可以是純水對照(water blank)或含有一種或多種螢光分析物的水樣。

以純水對照做為參考樣本的實施例中，在具有相同儀器設置的相同裝置上測量的所有其他樣本可以針對純水對照進行校準，使得結果可以在相同校準尺度上進行比較。

在不使用純水對照的那些實施例中，待比較樣本的非螢光發射訊號可做為內建基準。 當欲比較一個樣本與另一個樣本的測量值時，其中一個樣本的非螢光發射訊號可以作為第二個樣本校準的參考基準。

螢光和非螢光發射訊號的激發光波長可能相同。水拉曼散射和瑞利散射的發射波長通常是廣被理解且可以預測的。含有生物分子的待測樣本如血液樣本等，可能具有與水拉曼和瑞利散射截然不同的光譜峰，因此，可以使用由相同激發光產生的非螢光發射訊號來執行校準。然而，在某些情況下，待測樣本的螢光訊號可能與其水溶劑的非螢光訊號重疊，在這種情況下，可能需要使用不同的激發波長來產生可以與該螢光訊號清楚區分的非螢光訊號。因此，在一些實施例中，可以包括實時“尋峰”(Real-time peak-seeking)的步驟。具體地說，在一些實施例中，根據本發明在這個方面的方法，可以進一步包括動態改變待測激發光波長，直到拉曼峰與其餘光譜能被清楚區分的步驟。

在第二方面，本發明提供了一種光譜儀，其被配置為執行如前述第一方面所描述的校準方法。

在一些實施例中，光譜儀為一微孔盤讀取儀。在一些其他實施例中，光譜儀可接收比色槽進行單一樣本分析。在另外一些進一步的實施例中，光譜儀還包括一個控制單元，用於控制裝置運作；一個存儲單元，用於記錄光譜測量值和編碼執行如前述第一方面所描述之校準方法指令的電腦可讀指令；以及一個計算單元，用於執行電腦可讀指令並處理光譜測量數據。

在第三方面，本發明提供了一種用於分析光譜測量數據的電腦實現方法。 本方法將廣泛地涵蓋可執行前述第一方面之方法的電腦可讀指令。

在第四方面，本發明提供一種編碼了前述第三方面所述方法的電腦可讀媒介。

在第五方面，本發明提供了一種與多孔容器一起使用的透鏡陣列蓋，該多孔容器可用於螢光光譜分析。且本方面所述之透鏡陣列蓋通常具有一透明基板，並有多個透鏡佈置在該透明基板上。

適用於本發明在本方面所述之多孔容器，通常是於一透明平板上形成複數個開孔，每個開孔皆具有一預定孔深且朝上的孔開口。該多孔容器的材料和尺寸沒有特別限制，只要該材料對激發光和發射光是透明的即可。

由於複數個透鏡形成陣列佈置在透明基板上，使得該基板搭配多孔容器進行應用時，透鏡陣列的每個透鏡皆會完全覆蓋到一個開孔。每個透鏡更配置成當激發光穿過透鏡時，光束將聚焦在孔的中心附近。

在一些實施例中，透鏡陣列蓋被配置為與其他多孔容器一起使用的獨立單元。 在一些其他實施例中，透鏡陣列和多孔容器可形成一個集成單元。在一個示例性實施例中，透鏡陣列可以被配置為一多孔容器的鉸蓋。

本領域技術人員將理解，雖然本發明的第五和第六方面是描述具有多個開孔的多孔容器，和具有多個可與孔匹配的透鏡陣列蓋，但是單孔容器也可以透過將透鏡蓋配置成可將激發光聚焦在該容器的大約中心處，以實現發射光產量最大化。因此，本發明的第五和第六方面進一步包括一單孔分析容器，例如，具有被可匹配之單透鏡蓋完全覆蓋朝上孔開口的試管。

在一些實施例中，上述之單孔分析容器可以為管狀主體，該主體具有可容納樣本的中空槽。在這樣的實施例中，透鏡蓋可以通過容器的橫截面幾何形狀來實現。示例性橫截面幾何形狀可以是具有一平面側邊的圓形橫截面，使得該平面側邊上的曲率形成能夠將入射光聚焦在單孔分析容器橫截面中心的凸透鏡。在一些優選實施例中，該橫截面具有一規則的幾何形狀。示例性的幾何形狀可以包括但不限於圓形、三角形、矩形、五邊形、六邊形和其他合適的幾何形狀。

在一些實施例中，上述之單孔分析容器可以是用於導引流體樣本流通的導管。 在這些實施例中，導管可以配置具有一光學增強側的橫截面，該光學增強側能夠將入射光聚焦在導管橫截面的中心。在一些進一步的實施例中，該導管可以是用於體外迴路的輸血管路。在其他進一步的實施例中，該導管可以選擇地包括一樣本儲槽，其中，該樣本儲槽還具有能夠將入射光聚焦在該樣本儲槽中心的光學增強窗口，使光譜儀可適用於該導管並進行原位測量，以對流過其中的樣本進行連續、半連續或臨時的測量。

本發明的其他方面和優點將從以下描述和發明申請權利範圍中顯而易見。

下面說明旨在詳細描述本發明技術的各種實施態樣，當不能以此內容限定本發明技術可實施的範圍。圖式將併入構成詳細描述的一部分，且為了讓本發明易於理解，詳細描述將包含具體細節。然而，本領域技術人員須清楚明白本發明範圍並不限於本文描述的具體細節，並且可以在沒有這些具體細節的情況下實施。在某些舉例中，眾所周知的結構和組件將以圖片形式顯示，以避免混淆本發明的概念。

基於本說明書的目的，術語“螢光光譜裝置”可與螢光光譜儀、螢光分光光度計、螢光計或螢光分光儀互換使用。此類設備執行將激發光導向待測樣本（通常在樣本盛放器皿或容器中）並檢測發射光的一般功能，發射光可以由該待測樣本中螢光團的螢光激發或非螢光散射光產生，例如拉曼散射發射。

本說明書中使用的術語“光”是指不可見光（例如，紫外光）和可見光，即肉眼可見的光。

拉曼和瑞利散射。當高強度單色光源，例如由激光提供的光源，被引導到分析物分子（或樣本）上時，大部分入射光子被分析物分子彈性散射，這意味著散射光子具有與入射光子具有相同的能量（因此具有相同的頻率），這種彈性散射稱為瑞利散射，彈性散射的光子和輻射分別稱為瑞利光子和瑞利輻射。然而，一小部分光子（例如，大約 10 ⁷個光子中有 1 個）被分析物分子非彈性散射，這些非彈性散射光子的頻率與入射光子不同， 此種光子的非彈性散射稱為拉曼效應。非彈性散射光子的頻率可能大於或更典型地小於入射光子的頻率。

當入射光子與分子碰撞時，能量可以從光子轉移到分子或從分子轉移到光子。 當能量從光子轉移到分子時，散射光子將從樣本中出現，並具有較低的能量和相應的較低頻率。這些較低能量的拉曼散射光子在拉曼光譜學中通常稱為斯托克斯輻射(Stokes radiation)。 而如果一小部分分析物分子已經處於高能激發狀態，當入射光子與激發分子碰撞時，能量由分子轉移到光子，光子將從樣本中出現，並具有更高的能量和相應的更高頻率。這些更高能量的拉曼散射光子在拉曼光譜學中通常稱為反斯托克斯輻射(anti-Stokes radiation)。

斯托克斯和反斯托克斯輻射可經由檢測器檢測，例如光電倍增管或波長色散光譜儀，能將入射光子的能量轉換成電訊號。該電訊號的特性至少部分取決於入射光子的能量（或波長、頻率、波數等）和每單位時間內入射光子的數量（強度）。檢測器生成的電訊號可用於生成一個強度與頻率之間關係的光譜圖，顯示所檢測到的拉曼訊號（即斯托克斯和反斯托克斯輻射）。通過將非彈性散射的拉曼光子的強度與其頻率、或以厘米倒數(cm ^-1)為單位的波數繪製成圖表，可以獲得對應於特定分析物的獨特拉曼光譜。。拉曼光譜讀數通常顯示為強度與拉曼位移的關係圖，拉曼位移被定義為源輻射（激發輻射）和拉曼散射輻射的波數之間的差異。對化學分析有意義的波峰和波谷通常是 500 cm ^{− 1}- 2000 cm ^{− 1}範圍內的拉曼位移，對於 1000 nm 的典型光源波長，其對應於波長在 1050 nm 至 1250 nm 之間的拉曼散射光子。

這種獨特的拉曼光譜已應用於許多目的，例如識別分析物、識別化學狀態或分析物中原子和分子的鍵結方式，以及確定分析物的物理和化學性質。拉曼光譜學也可用於分析單一分子種類或不同分子種類的混合物。此外，拉曼光譜學也可以應用於許多不同類型的分子構造，例如結晶態或非結晶態的有機和無機分子。

在本發明的背景下，值得關注的一種示例性訊號為生物樣本（例如受試者的血液或血漿）中化學物質的螢光發射訊號。螢光光譜是由入射光被分析物分子吸收後再發射的，與拉曼散射是兩種根本不同但相互競爭的現象，因此，當目的是獲取拉曼光譜訊號時，拉曼光譜儀器操作員通常會避免產生螢光訊號，反之亦然。

拉曼光譜可作為低螢光強度樣本的內建基準。在可以使用原始螢光光譜數據進行分析之前，應該進行幾種類型的數據校正，以最小化測量偏差，包括校正儀器偏差、樣本吸收偏差（通常稱為內部過濾效應）、批次偏差、背景去除和強度校準。儀器偏差校正解決了由於儀器變異性導致的峰位偏移問題。樣本吸收偏差的校正解決了由於光程長度和樣本中分析物濃度而導致的發射訊號衰減問題。這種現象通常被稱為內部過濾效應。在具有低吸光度的光學薄樣本中，這不是問題，因此可能不需要校正內部效應。另一方面，光譜位置、批次變化和發射強度讀數都高度依賴儀器。例如，不同的儀器可能使用不同的檢測器，這會轉化為不同的測量尺度。不同時間測量的批次，即使在同一儀器和相同設置上，由於功率波動等因素，可能會有不同的強度讀數。此外，強度讀數通常以任意單位顯示（光子計數系統除外），這使得跨儀器的數據直接定量與比較變得困難，甚至不可能實現。

為解決上述問題，現有技術方法通常依賴於使用序列稀釋的校準標準。當使用於特徵明確且已知的螢光團時，這種方法效果很好。 然而，當處理可能未知的螢光團之複雜混合物時，這種方法不起作用。迄今，大多數現有技術研究都試圖通過在同一台儀器上進行所有測量或使用具有穩定之外部表徵的標準品，例如硫酸奎寧或標準物質 2941（由 NIST 提供）來避免這個問題。

本文公開了一種校正螢光光譜數據的一般方法，該方法考慮了由於儀器變化、樣本間（批次）變化和強度尺度變化引起的偏差。本發明實施例之方法特別適用於微量螢光分析物的樣本，其產生之螢光訊號與水拉曼散射的動態範圍大致相同。 如圖 1 展示了在光譜分析中使用拉曼光譜執行校準的示例性工作流程。

如圖 1之步驟101，“準備校準溶液”，首先製備校準溶液。在一些實施例中，校準溶液僅使用純水對照(water blank)。在其他示例性實施例中，具有拉曼散射特性的待測樣本溶劑也可以作為校準溶液。而在其他示例性實施例中，溶劑的拉曼散射光譜可以進一步作為校準溶液和螢光光譜測量的內建基準。 在一些優選實施例中，待測樣本的主要溶劑是水。

與傳統基於螢光或吸收光譜的校準方法相比，本文所公開的校準方法將不存在光漂白或限制激發波長的問題。 此外，校準溶液的製備亦僅有較小的品質管控需求。

接下來，在步驟 102“加入校準溶液”中，將校準溶液裝入到合適的分析容器中。 本領域技術人員理解，本步驟對於不使用空白對照的實施例是選擇性的。 本領域技術人員也理解，適用於本發明方法的分析容器通常是為光譜分析而設計的。它們的配置使得激發光可以均勻地照射樣本，並且可以有效地收集發射的拉曼散射訊號。

在一些實施例中，為了避免發射訊號不必要的衰減，分析容器的透光壁應該是透明和平坦的。

在一些實施例中，為了避免背景干擾，分析容器可由在340-650nm的激發範圍內不發射自發螢光的材料構成。

本公開方法相關的校準溶液所適合使用之溶劑優選地具有穩定、獨特和穩健的拉曼散射特性。 校準溶液可以預先填充或手動填充到分析容器中。 在一些優選實施例中，校準標準溶液被填充於合適的容器中。

在步驟103，“生成校準訊號”中，具有預定波長的光源被引導到分析容器以激發容器內的校準溶液。 螢光測量中所使用的每個激發波長，均應用來激發和測量校準溶液在該特定激發波長下的拉曼散射訊號。 例如，如果使用 488 nm 的光激發血液中黃素的螢光，則還應測量校準溶液在 488 nm 光激發下的訊號。

與傳統的校準方法相比，本文公開的基於拉曼散射的校準方法在激發波長的選擇上具有更大的靈活性。當激發光源入射到校準溶液上時，會發出光。發射的光可以具有螢光和非螢光成分。

在步驟104，“收集校準訊號”中，收集來自校準溶液的非螢光訊號。當待測樣本的螢光訊號較弱時，其他訊號如溶劑的拉曼散射、瑞利散射、甚至米氏散射訊號，都可能干擾待測樣本的螢光光譜。而通過測量溶劑的拉曼散射、瑞利散射、甚至米氏散射訊號，不僅可以去除螢光光譜中的背景干擾，還可以找出測量系統中激發/收集效率的批次間變異比。因此，在該步驟中，通過光收集元件收集非螢光訊號用於進一步分析。示例性的光收集元件可以包括用於聚焦和折射訊號的透鏡、用於將訊號聚焦到光譜儀系統的入口狹縫中的透鏡、用於分離激發和訊號收集方向的二向色分束器(dichroic beam splitter)、用於阻擋雜散激發光的陷波濾波器(notch filter)、長通或帶通濾波器(long pass or band pass filters)以進一步阻擋環境背景，以及本領域已知的其他合適的光收集裝置。

在步驟105，“耦合校準訊號”中，將非螢光訊號耦合到光譜儀中。與螢光類似，自發拉曼散射訊號也可以全向發射，包括90度側向收集方向或後向收集方向。由於自發拉曼散射的激發和發射波長接近目標螢光，故可以在相同的系統設置下持續監測測量系統中激發/收集效率的批次間變化率。因此，收集到的非螢光訊號可有效地耦合到光譜儀中，以標準化批次間的訊號變化。示例性光譜儀可以包括光柵或棱鏡，用於將光的顏色分散到不同的傳播方向，透鏡或曲面鏡用於將每種顏色的光線聚焦到定義的檢測點上，以及具有一個像素或像素陣列的光電檢測系統，光電檢測系統可以是光電倍增管 (PMT)、電荷耦合器件 (CCD) 或雪崩光電二極管 (APD)。非螢光訊號的耦合可以通過透鏡將發散的訊號聚焦、二向色分束器分離激發和訊號收集的方向、陷波濾波器阻擋雜散激發光、長通或帶通濾波器來實現進一步阻擋環境背景，然後透鏡將訊號聚焦到光譜儀系統的入口狹縫中。

在步驟106，“檢測校準訊號”中，檢測並記錄非螢光訊號光子。 將非螢光訊號耦合到光譜儀後，便可通過光譜儀記錄和測量校準溶劑的拉曼散射光譜。應該注意的是，除了拉曼散射之外，由於雜散光或光譜儀分辨率低，激發源的瑞利散射也可能滲入螢光檢測範圍。這些光譜干擾可以通過標準溶劑的激發來測量。

在步驟107，“擷取校準光譜特徵”中，擷取拉曼和瑞利散射光譜的振幅和形狀。 擷取光譜特徵的方法在本領域中是已知的。 示例性的擷取方法可以包括光譜的主成分分析、改變激發波長以及通過拉曼峰波長的偏移來識別，但不限於此。 例如，考慮到拉曼散射光譜具有與激發源相似的形狀。 通過振幅擬合(amplitude fitting)，可以從雜散光或光譜儀分辨率差引起的瑞利背景中提取拉曼光譜及其振幅。

在一些實施例中，可以直接透過視覺檢視光譜圖以識別出拉曼峰；而在一些其他實施例中，拉曼峰需要透過電腦計算方式來識別。 在優選實施例中，通過計算光譜圖中發射波長的一階導數曲線，然後定位導數曲線穿過零點的發射波長來識別拉曼峰。導數曲線在拉曼峰預期存在的波長範圍內，在一些優選實施例中，該範圍為約400nm至約600nm。

在一些其他實施例中，拉曼峰的識別是實時進行的。 在這些實施例中，透過改變激發波長可觀察峰的位置變化，進而辨識出拉曼峰的本體。 本領域技術人員理解，於特定激發波長，分析物的螢光發射峰與水拉曼峰有重疊的情況下，可透過改變激發波長來產生不同的發射光譜，從而將水拉曼峰與分析物的螢光發射峰分離開來，提供更好的信噪比。

在步驟108，“確定校準參數”中，將提取的拉曼散射信號的振幅除以參考值，以獲得螢光劑量測定的校準比率。而來自校準標準的非螢光訊號的（波長、幅度）值和相應的光源（波長、平均功率）值便可以作為校準指標，評估批次間激發變化率/螢光光譜測量系統的收集效率。

螢光光譜系統設計。圖2為實施本文公開方法的螢光光譜系統之示意圖。 參考圖2，實現本文公開方法的系統通常將包括一個或多個激發光源201、一個或多個波長選擇模塊202、一個或多個照明組件203、用於容納液體分析物的分析容器204、樣本溶液205 、訊號收集組件206、訊號耦合組件207和光譜儀208。

圖3為針對反向收集方案的訊號採集組件設計示意圖，照明和訊號收集組件將是相同的，但是訊號將通過二向色分束器309 (參見圖3)而激發分離。

圖4顯示了適用於非螢光訊號的照明和收集之示例性設計。根據圖2在一些實施例中，光照射部件203和收集部件206可以被配置為與分析容器204一起形成集成的照明/收集部件(203/206)。在一些示例性實施例如圖4中，照明/收集組件是佈置成透鏡陣列403的微透鏡402，透鏡陣列403佈置在具有厚度d的基板404上。在基板的邊緣，可以預留寬度為B的邊界，具有長度D的分析容器204。在使用中，基板可以蓋在分析容器204上以充當容器的照明面。有利地，每個微透鏡402配置有曲率半徑R，使得與溶液分析物的有效焦距f將位於分析容器的分析物容納空間D內。這樣，透鏡將照明光403聚焦在分析物溶液上以有效地產生和收集微弱的拉曼訊號。在這樣的實施例中，照明和訊號收集組件與容器集成為一個組件。

圖5展示了傳統的樣本容器如所示的的血液樣本管和比色槽。 圖5的裝置可以配置有光學增強窗口501，用於引導光線聚焦在容器的中心以獲得有利的拉曼訊號。 儘管圖5顯示了與增強的光學窗口適配的示例性圓柱形採血管，但本領域技術人員將理解該管的形狀不必是圓柱形的，它可以具有矩形橫截面，如在比色槽或其他橫截面幾何形狀的情況下。

除了上述獨立的分析樣本容器之外，增強型光學窗口也可以有利地實施在體外管上，使得樣本可以由光譜儀進行連續測量。

圖 6 展示了人類對象 601 可有效地連接到一用於體外迴路的輸血管路602。在一些實施例中，該管可以選擇性地配置一樣本儲槽 603，其配置有一帶有光學透鏡的光學增強窗口，用於將激發光聚焦在該樣本儲槽的中心。在一些其他實施例中，該用於體外迴路的輸血管路為具有一光學增強側的橫截面604，該橫截面能夠發揮如光學透鏡的功能，將進入的激發光聚焦在該輸血管路的中心處。 在此類實施例中，光譜儀605可用於連續監測體外迴路中流體樣本的螢光。

為了進一步說明本發明，提供以下具體實施例。

以下示例概述了利用本發明公開之拉曼校準方法獲得一血液樣本之標準化螢光光譜的一般實驗流程：

1. 準備1毫升(mL)之去離子水，並利用200奈米(nm)孔徑之過濾器去除水中的雜質，以取得用於校準的標準溶液。

2.將該校準標準溶液填充到具有1cm×1cm橫截面積的比色槽中。

3.將裝有校準標準溶液的比色槽***光譜儀中。

4.啟動氙燈，通過單色儀選擇激發波長。 每個激發帶的中心波長可以是λ1=340nm，λ2=385nm，λ3=405nm，λ4=460nm，λ5=488nm，λ6=530nm，λ7=580nm。 每個波長都可以有效地激發一血液樣本中的特定螢光團。

5.調整單色儀的輸出狹縫尺寸，使得每個激發帶的激發帶寬為1奈米(nm)。 光譜的形狀可以通過高斯函數建模。

6.測量單色儀輸出後各激發帶的輸出功率。

7.將激發光聚焦到比色槽中，並在垂直於激發光軸的方向上收集產生的訊號。

8.將訊號耦合到具有200奈米(nm)之入口狹縫尺寸的光譜儀中。

9.將光譜儀中的偵測器冷卻至約攝氏-30度以抑制熱雜訊。

10.通過光柵的旋轉，可以以1奈米(nm)的光譜分辨率記錄拉曼光譜的強度，每個數據點都有 0.5 秒的積分時間。 該數據可呈現靈敏偵測器上轉阻放大器之輸出電壓。

11.測量該拉曼光譜中之拉曼峰在不同激發帶的振幅。

12.將這些不同波長下測得之拉曼峰振幅除以實驗基準日測得之基準值後，可得到一校準係數，該係數可做為螢光光譜的標準化比值。

13.接下來進行血液樣本之螢光光譜的測量。在激發和偵測條件皆與測量拉曼光譜時相同的前提下，將 1毫升( mL) 血液樣本裝入比色槽中，並掃描 λ1 至 λ7 的激發帶，測量相應的螢光光譜測量值。

14.螢光測量中的非螢光背景訊號（拉曼峰和瑞利尾）可以通過分數減法去除。

15. 為了公平比較當天測得之血液樣本螢光光譜測量值強度與實驗基準日所測得之峰值強度，必須將該螢光光譜測量值除以該標準化比值。

其中： 為樣本2在特定激發波長、激發帶寬、激發功率下的螢光光譜； 為樣本2的實測發射光譜； 為樣本2的水拉曼散射光譜； 為樣本2的瑞利尾光譜 為樣本間校準因子 是批次間校準因子 為機器對機器校準因子

儘管已經根據具體實施例和示例說明描述了本發明相關實施方式與細節，應當理解本說明書公開的實施例僅用於說明之目的，本領域技術人員可以在不脫離所請求發明申請專利範圍中闡述之本發明精神和範圍的情況下進行各種修改和變更。

圖1為根據本發明實施例所述之拉曼校準方法的示例性工作流程；圖2為根據本發明實施例所述之示例性光譜儀的示意圖；圖3為根據本發明實施例所述之另一個示例性光譜儀的示意圖；圖4為根據本發明實施例所述之透鏡陣列蓋的示例性實施方式；圖5為根據本發明實施例所述之光學增強的單孔分析容器的示例性實施方式；圖6為根據本發明實施例所述之具有用於螢光測量光學窗口的體外迴路之示例性實施方式。

1:

2:

3:

4:

Claims (14)

1. 一種用於校準自光譜儀上獲取一待測樣本之螢光光譜測量值的方法，包括： 從該螢光光譜測量值中去除非螢光發射訊號；以及 使用一個或複數個校準因子校準該螢光光譜測量值，該校準因子將待測樣品中的非螢光發射峰與參考樣品中對應的非螢光發射峰相關聯。
2. 如請求項1所述之方法，其特徵在於，該待測樣本包含濃度在約10pM至約10μM範圍內的一種或複數種螢光分析物。
3. 如請求項1所述之方法，其中該參考樣本為純水對照。
4. 如請求項1所述之方法，其中該校準因子為該參考樣本的水拉曼峰高與該待測樣本的水拉曼峰高的比值。
5. 如請求項2所述之方法，更進一步地包括利用改變激發波長並比較對應之水拉曼峰，來為該待測樣本選擇一合適的水拉曼峰。
6. 一種利用水拉曼峰進行自動校準螢光光譜測量值的光譜儀，包括： 一提供激發光的光源； 一用於偵測發射光和記錄光譜測量值的偵測器； 以及 一種數據處理單元，用以執行請求項1的方法。
7. 如請求項6所述之光譜儀，該光譜儀為一微孔盤讀取儀。
8. 一種可與一可被光譜儀讀取之微孔滴定盤一起使用的透鏡陣列，其中該微孔滴定盤具有複數個開孔，每個開孔皆具有預定孔深的一朝上開口，該透鏡陣列包括： 複數個透鏡元件佈置成陣列，以對應該微孔滴定盤的該複數個開孔，使該透鏡陣列放置於該微孔滴定盤的頂部時，每個透鏡元件可完全覆蓋對應之每個開孔的朝上開口； 並且，該複數個透鏡元件被配置為可將光聚焦在對應之開孔的中心。
9. 一種光譜樣本容器，包括： 一具有複數個開孔的基板，每個開孔被配置用於保留水樣；以及 根據請求項8所述之透鏡陣列。
10. 一種與請求項6所述之光譜儀一起使用的一光譜樣本容器，包括： 一細長管狀主體，該主體具有一光學增強截面，該光學增強截面具有聚光透鏡之功能，可將入射到該光學增強截面上的入射光聚焦在該主體的截面中心。
11. 如請求項10所述之光譜樣本容器，該細長管狀主體進一步具有一規則的幾何橫截面，且該幾何橫截面的其中一側具有聚光透鏡之功能。
12. 一種與請求項6所述之光譜儀一起使用的一光譜樣本容器，包括： 一用於導引流體樣本流過的導管，其中，該導管具有一橫截面，該橫截面具有能將入射光聚焦在該導管橫截面之中心的一光學增強側。
13. 如請求項12所述之光譜樣本容器，進一步包括： 一具有一光學增強窗口的樣本儲槽，該光學增強窗口可將入射光聚焦在該樣本儲槽的中心。
14. 一種用於分析光譜數據的電腦可讀媒介編碼方法，包括： 一種持續性的數位數據儲存媒介，且該數位數據儲存媒介可被編碼了請求項1所述方法之指令的一計算單元讀取。