WO2014065375A1 - 酸化ストレスによる細胞増殖抑制方法 - Google Patents

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WO2014065375A1
WO2014065375A1 PCT/JP2013/078850 JP2013078850W WO2014065375A1 WO 2014065375 A1 WO2014065375 A1 WO 2014065375A1 JP 2013078850 W JP2013078850 W JP 2013078850W WO 2014065375 A1 WO2014065375 A1 WO 2014065375A1
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antibody
amino acid
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PCT/JP2013/078850
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綾 笹川
嘉樹 住友
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協和発酵キリン株式会社
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to an intracellular oxidative stress promoter comprising, as an active ingredient, a monoclonal antibody having an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids into cells or an antibody fragment thereof.
  • the present invention also relates to a cell growth inhibitor comprising a monoclonal antibody or antibody fragment thereof having an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids into cells as an active ingredient, and promoting intracellular oxidative stress.
  • the present invention relates to a method for promoting intracellular oxidative stress, which comprises administering a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof having an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids into cells.
  • the present invention also relates to a method for inhibiting cell growth, which comprises administering a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof having an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids into cells and promoting intracellular oxidative stress.
  • ASCT2 polypeptide is a 10-transmembrane protein consisting of a total length of 541 amino acids and functions as a transporter that transports neutral amino acids through cell membranes in a sodium ion-dependent manner.
  • Solitary family family 1 neutral amino acid transport
  • member 5 Solitary family family 1, member 5, or SLC1A5 and S1 are used.
  • SLC1A5, SLC7A5 and SLC38A5 is markedly enhanced in cancer tissues by examination using an EST (expressed sequence tag) database (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 it has been clarified that the expression of SLC1A5 is observed in clinical tissues of hepatocellular carcinoma and hepatoblastoma, whereas no expression of SLC1A5 is observed in normal liver. Furthermore, it has been clarified that the expression of SLC1A5 is increased in clinical tissues of poorly differentiated astrocytoma and glioblastoma multiforme as compared with normal tissues (Non-patent Document 3).
  • Non-patent Document 4 In addition, in clinical tissues of colorectal cancer and prostate cancer, it is known that the expression of ASCT2 is detected by immunohistochemical staining or Western blotting, and the prognosis is poor in patients with high expression of ASCT2 (Non-patent Document 4).
  • Non-patent Documents 5, 6, 7, and 8 glutamine uptake is carried by ASCT2 (Non-patent Documents 5, 6, 7, and 8). It has been reported that cell growth is suppressed by competitively inhibiting intracellular incorporation of glutamine using a mixture of alanine, serine and threonine, which is a substrate of (Non-patent Document 9).
  • An object of the present invention is to provide an intracellular oxidative stress promoter comprising, as an active ingredient, a monoclonal antibody having an activity of inhibiting neutral amino acid intracellular uptake or an antibody fragment thereof.
  • the present invention also provides a cell growth inhibitor characterized by comprising a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof having an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids into cells as an active ingredient, and promoting intracellular oxidative stress. For the purpose.
  • an object of the present invention is to provide a method for promoting intracellular oxidative stress, which comprises administering a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof having an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids into cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting cell growth, which comprises administering a monoclonal antibody or antibody fragment thereof that has an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids into cells, and promoting intracellular oxidative stress.
  • the present application relates to the inventions (1) to (12).
  • An intracellular oxidative stress promoter comprising, as an active ingredient, a monoclonal antibody having an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids into cells or an antibody fragment thereof.
  • ASCT2 ASC amino acid transporter 2
  • CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VH comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 32, 33 and 34, respectively, and CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VL contain SEQ ID NOs: 35, 36 and A monoclonal antibody comprising the amino acid sequence represented by 37.
  • C CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VH comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 49, 50 and 51, respectively, and CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VL contain SEQ ID NOs: 52, 53 and A monoclonal antibody comprising the amino acid sequence represented by 54.
  • the intracellular oxidative stress promoter according to any one of (1) to (5), wherein the cell is a cancer cell.
  • a cell growth inhibitor comprising a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof having an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids in cells as an active ingredient, and promoting intracellular oxidative stress.
  • the cell growth inhibitor according to (7), wherein the neutral amino acid is glutamine.
  • the cell growth inhibitor according to (7) or (8), wherein the monoclonal antibody is an antibody that binds to an extracellular region of a neutral amino acid transporter.
  • the cell growth inhibitor according to (7) or (8), wherein the monoclonal antibody is an antibody that binds to an extracellular region of ASCT2.
  • the monoclonal antibody is one antibody selected from (A) to (C).
  • CDR1, CDR2 and CDR3 of antibody VH comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 26, 27 and 28, respectively, and CDR1, CDR2 and CDR3 of antibody VL contain SEQ ID NOs: 29, 30 and A monoclonal antibody comprising the amino acid sequence represented by 31.
  • CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VH comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 32, 33 and 34, respectively, and CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VL contain SEQ ID NOs: 35, 36 and A monoclonal antibody comprising the amino acid sequence represented by 37.
  • C CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VH comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 49, 50 and 51, respectively, and CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VL contain SEQ ID NOs: 52, 53 and A monoclonal antibody comprising the amino acid sequence represented by 54.
  • a method for promoting intracellular oxidative stress comprising administering a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof having an activity of inhibiting neutral amino acid intracellular uptake.
  • the neutral amino acid is glutamine.
  • the monoclonal antibody is an antibody that binds to an extracellular region of a neutral amino acid transporter.
  • the monoclonal antibody is an antibody that binds to an extracellular region of the system ASC amino acid transporter 2 (ASCT2).
  • CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VH comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 49, 50 and 51, respectively, and CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VL contain SEQ ID NOs: 52, 53 and A monoclonal antibody comprising the amino acid sequence represented by 54.
  • the method according to (13), wherein the cell is a cancer cell.
  • a method for inhibiting cell growth comprising administering a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that has an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids into cells, and promoting intracellular oxidative stress.
  • the neutral amino acid is glutamine.
  • CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VH comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 32, 33 and 34, respectively, and CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VL contain SEQ ID NOs: 35, 36 and A monoclonal antibody comprising the amino acid sequence represented by 37.
  • C CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VH comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 49, 50 and 51, respectively, and CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VL contain SEQ ID NOs: 52, 53 and A monoclonal antibody comprising the amino acid sequence represented by 54.
  • the intracellular oxidative stress promoter and cell growth inhibitor of the present invention contain a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof having an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids into the cell as an active ingredient, thereby promoting oxidative stress in the cell. Suppression of ATP production by inhibiting the uptake of sex amino acids, double-strand damage in DNA, or cell cycle stagnation in G1 phase can be suppressed to suppress cell proliferation or cause cell death.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in intracellular metabolic response of SNU-16 cancer cell line to KM4008HV2LV3.
  • metabolome analysis results using CE-TOFMS in KM4008HV2LV3 or solvent-treated cells the relative area values of the intermediate metabolites of the glutathione synthesis system and the TCA circuit system 2 hours or 8 hours after the addition of the antibody are shown.
  • the horizontal axis indicates the time after KM4008HV2LV3 or solvent treatment, and the vertical axis indicates the relative area value.
  • the graph shows the solvent treatment group in black and the KM4008HV2LV3 treatment group in white.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of an antibody array involved in oxidative stress.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of an antibody array involved in the double chain damage response.
  • FIG. 4 is a diagram showing cell cycle fluctuations by KM4008HV2LV3.
  • FIG. 5 is a diagram showing analysis of cell death by KM4008HV2LV3.
  • stained with annexinV-FITC 72 hours afterward, and measured the fluorescence intensity using the flow cytometer is shown.
  • the horizontal axis shows the fluorescence intensity of FL1 representing the fluorescence intensity of annexin V-FITC, and the vertical axis shows the relative cell number with the peak cell number in each treatment group as 100% as the relative cell number (%).
  • NT indicates solvent treatment
  • FIG. 6 is a diagram showing the recovery of cell growth inhibition by KM4008HV2LV3 using an antioxidant.
  • the results of adding antibodies and N-acetylcysteine (NAC) to SNU-16 cells, performing PI staining 48 or 72 hours later, and measuring the number of viable cells using a flow cytometer are shown.
  • the horizontal axis shows the culture period (hours) after addition of the antibody, and the vertical axis shows the number of living cells (cells / mL).
  • n 3 and error bars indicate standard deviation.
  • NT represents solvent treatment
  • Ab represents KM4008HV2LV3 treatment
  • NAC NAC treatment.
  • the present invention relates to an intracellular oxidative stress promoter comprising, as an active ingredient, a monoclonal antibody having an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids into cells or an antibody fragment thereof.
  • the present invention also relates to a cell growth inhibitor characterized by comprising a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof having an activity of inhibiting intracellular uptake of neutral amino acids as an active ingredient, and promoting intracellular oxidative stress.
  • the present invention includes a tricarboxylic acid (TCA) cycle (also referred to as citric acid cycle) inhibitor containing a monoclonal antibody having an activity of inhibiting the uptake of neutral amino acids into cells or an antibody fragment thereof as an active ingredient.
  • TCA tricarboxylic acid
  • the present invention also includes a cell growth inhibitor characterized by containing a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof having an activity of inhibiting intracellular uptake of neutral amino acids as an active ingredient and suppressing the TCA cycle.
  • examples of the neutral amino acid include glutamine, alanine, serine and threonine, and preferably glutamine.
  • a pathway that is taken into cells via a neutral amino acid transporter is preferred, and a pathway that is taken into cells via a system ASC amino acid transporter (ASCT2) is more preferred.
  • Species are not particularly limited as ASCT2 in the present invention, but preferably include mammal-derived ASCT2, specifically human-derived ASCT2.
  • the amino acid sequence information of ASCT2 can be obtained from a known database such as NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
  • human ASCT2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence (NCBI accession number: NP_005619), or the amino acid sequence of mouse ASCT2 represented by SEQ ID NO: 86 (NCBI accession number: NP_033227).
  • ASCT2 in the present invention includes, for example, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, And a polypeptide having the function of ASCT2.
  • a polypeptide having the function of ASCT2 is also included in the ASCT2 of the present invention.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is obtained by site-directed mutagenesis [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring. Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example 1 to 20, more preferably 1 to several, for example 1 to 5 amino acids. It is.
  • Examples of the gene encoding ASCT2 include a gene containing DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 was used as a probe, a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or It means a hybridizable DNA obtained by a DNA microarray method or the like.
  • 0.7 to 1.0 mol / L of chloride is used.
  • Hybridization in the presence of sodium at 65 ° C. [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in MolecularJoL A Practical pproach, Second Edition, Oxford University, (1995)]
  • 0.1-2 fold concentration of SSC solution composition of 1 fold concentration of SSC solution is 150 mmol / L sodium chloride, 15 mmol / L sodium citrate
  • the DNA capable of hybridizing is DNA having at least 60% homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, preferably DNA having 80% homology or more, more preferably 95% homology or more.
  • the gene used in the present invention includes a gene in which a small-scale mutation has occurred in the nucleotide sequence due to such a polymorphism, and is included in the gene encoding ASCT2 of the present invention.
  • the numerical value of homology in the present invention may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art unless otherwise specified, but the base sequence may be BLAST [J. Mol. Biol. , 215, 403 (1990)], for amino acid sequences such as numerical values calculated using default parameters, BLAST2 [Nucleic Acids Res. , 25, 3389 (1997), Genome Res. , 7, 649 (1997), http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / Education / BLASTinfo / information3. numerical values calculated using default parameters in [html].
  • the default parameters are 5 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if it is an amino acid sequence, 2 if -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and 1 if it is an amino acid sequence.
  • -Q (Penalty for nucleotide mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotide match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • 11 residues when -W (wordsize) is a base sequence
  • -y [Dropoff (X) for blast extensions in bits] is 20 when blastn, 7 for programs other than blastn
  • -X X dropoff value for If the gap alignment in bits) is 15 and -Z (final X dropoff value for gapd alignment in bits) is blastn, it is 25 for programs other than blastn (http://www.cn.cn. /Blast/html/blastcgihelp.html).
  • a polypeptide comprising a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be prepared by a method known to those skilled in the art, for example, a part of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is deleted. And a transformant introduced with an expression vector containing the same can be cultured. In addition, an amino acid in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 by the same method as described above based on the polypeptide or DNA prepared by the above method A polypeptide having the sequence can be obtained.
  • a polypeptide comprising a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • Fmoc fluorenylmethyloxycarbonyl
  • tBoc t-butyloxycarbonyl
  • the monoclonal antibody in the present invention includes an antibody that binds to the extracellular region of the neutral amino acid transporter, and preferably includes an antibody that binds to the extracellular region of ASCT2.
  • the amino acid sequence of the transporter is converted into a known transmembrane region prediction program SOSUI (http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html). ), TMHMM ver. 2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) or ExPASy Proteomics Server (http://Ca.expasy.org/) It is done.
  • SOSUI http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html.
  • TMHMM ver. 2 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
  • ExPASy Proteomics Server http://Ca.expasy.org/
  • the extracellular region of ASCT2 for example, the amino acid sequence of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 is converted into a known transmembrane region prediction program SOSUI (http://sosui.proteome.bio.tuat.ac. jp / sosuiframe0.html), TMHMM ver. 2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) or ExPASy Proteomics Server (http://Ca.expasy.org/) It is done.
  • SOSUI http://sosui.proteome.bio.tuat.ac. jp / sosuiframe0.html
  • TMHMM ver. 2 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
  • ExPASy Proteomics Server http://Ca.expasy.org/
  • the five domains 74 to 98, 154 to 224, 287 to 305, 357 to 376, and 420 to 425 are the extracellular domains predicted in ExPASy Proteomics Server. Can be mentioned.
  • the five extracellular regions are expressed in order from the N-terminal side as EL1 region, EL2 region, EL3 region, EL4 region and EL5 region.
  • the EL2 region in the amino acid sequence of the ASCT2 polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 is positions 154 to 224 or 152 to 224.
  • the monoclonal antibody that binds to the extracellular region of the neutral amino acid transporter may bind to any region of the extracellular region.
  • the monoclonal antibody that binds to the extracellular region of ASCT2 may bind to any region of the extracellular region of ASCT2, but is preferably selected from the EL1 to EL5 regions of the extracellular region of ASCT2.
  • the method of evaluating the activity of inhibiting the uptake of amino acids into cells is a device such as a scintillation counter that inhibits the uptake of amino acids such as alanine labeled with a radioactive substance by reacting an antibody or the antibody fragment with cells.
  • a scintillation counter that inhibits the uptake of amino acids such as alanine labeled with a radioactive substance by reacting an antibody or the antibody fragment with cells.
  • the method for evaluating the cell growth inhibitory activity by inhibiting the uptake of amino acids into cells is to react the antibody with the antibody or the antibody fragment to inhibit the proliferation of cells dependent on neutral amino acids. Evaluation method using measurement reagent etc. [J. Surgical Research, 90, 149 (2000)].
  • the cell in the present invention may be any cell as long as a neutral amino acid or a neutral amino acid transporter is involved in the survival or proliferation of the cell, for example, a cell that exists naturally in the human body, or a natural amino acid in the human body.
  • the cell in the present invention preferably expresses a neutral amino acid transporter, and more preferably expresses ASCT2.
  • cancer cells that naturally exist in the human body include cancer cells.
  • cancer include blood cancer, breast cancer, uterine cancer, colon cancer, esophageal cancer, stomach cancer, ovarian cancer, lung cancer, kidney cancer, rectal cancer, thyroid cancer, cervical cancer, small intestine cancer, prostate cancer and pancreatic cancer.
  • hematological cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer or prostate cancer can be mentioned.
  • hematological cancers include myeloid leukemia, lymphoid leukemia, multiple myeloma, Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma.
  • the antibody used in the present invention may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, preferably a monoclonal antibody that binds to a single epitope.
  • the monoclonal antibody may be a monoclonal antibody produced from a hybridoma, or may be a recombinant antibody produced by a gene recombination technique or any monoclonal antibody, but it reduces immunogenicity in humans. Therefore, it is preferable to use a human chimeric antibody (hereinafter also simply referred to as a chimeric antibody), a humanized antibody [also referred to as a human complementary determining region (CDR) transplanted antibody] and a human antibody.
  • a human chimeric antibody hereinafter also simply referred to as a chimeric antibody
  • CDR human complementary determining region
  • the monoclonal antibody of the present invention include antibodies selected from (A) to (C).
  • (A) CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region (designated as VH) of the antibody comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 26, 27 and 28, respectively, and the light chain variable region of the antibody (VL and CDR1, CDR2, and CDR3 of (denoted) include the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 29, 30, and 31, respectively.
  • CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VH comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 32, 33 and 34, respectively, and CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VL contain SEQ ID NOs: 35, 36 and A monoclonal antibody comprising the amino acid sequence represented by 37.
  • C CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VH comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 49, 50 and 51, respectively, and CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VL contain SEQ ID NOs: 52, 53 and A monoclonal antibody comprising the amino acid sequence represented by 54.
  • the VH CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VH in the present invention comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 26, 27 and 28, respectively, and the CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VL contain SEQ ID NOs: 29, 30 and
  • the monoclonal antibody comprising the amino acid sequence represented by 31, anti-ASCT2 mouse monoclonal antibody KM4008, anti-ASCT2 human chimeric antibody cKM4008, anti-ASCT2 humanized antibodies KM4008HV2LV3 and KM4008HV10LV3 (International Publication No. 2010/008075, International Publication) No. 2011/087091).
  • the VH CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VH in the present invention comprise the amino acid sequences shown by SEQ ID NOs: 32, 33 and 34, respectively, and the CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VL contain SEQ ID NOs: 35, 36 and Examples of the monoclonal antibody including the amino acid sequence represented by 37 include anti-ASCT2 mouse monoclonal antibody KM4012, anti-ASCT2 human chimeric antibody cKM4012 (International Publication No. 2010/008075, International Publication No. 2011/087091), and the like. It is done.
  • the VH CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VH in the present invention comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 49, 50 and 51, respectively, and the CDR1, CDR2 and CDR3 of the antibody VL contain SEQ ID NOs: 52, 53 and Examples of the monoclonal antibody having the amino acid sequence represented by 54 include anti-ASCT2 rat monoclonal antibody KM4018, anti-ASCT2 human chimeric antibody cKM4018 (International Publication No. 2010/008075, International Publication No. 2011/087091) and the like. It is done.
  • a monoclonal antibody is an antibody that is secreted by a single clone of an antibody-producing cell, recognizes only one epitope (also called an antigenic determinant), and has an amino acid sequence (primary structure) constituting the monoclonal antibody.
  • An epitope is a single amino acid sequence that is recognized and bound by a monoclonal antibody, a three-dimensional structure consisting of amino acid sequences, and a modified residue such as a sugar chain, glycolipid, polysaccharide lipid, amino group, carboxyl group, phosphate, or sulfuric acid. And a three-dimensional structure comprising an amino acid sequence to which the modified residue is bonded.
  • the three-dimensional structure is a three-dimensional structure of a naturally occurring protein, and refers to a three-dimensional structure formed by a protein expressed in a cell or on a cell membrane.
  • an antibody molecule is also referred to as an immunoglobulin (hereinafter referred to as Ig), and human antibodies are divided into IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 and IgM depending on the molecular structure. Classified as isotype. IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 having relatively high amino acid sequence homology are collectively referred to as IgG.
  • an antibody molecule is composed of polypeptides called heavy chains (hereinafter referred to as H chains) and light chains (hereinafter referred to as L chains).
  • the H chain is composed of VH and H chain constant regions (also referred to as CH) from the N-terminal side
  • the L chain is composed of VL and L chain constant regions (also referred to as CL) from the N-terminal side. Is done.
  • CH is further composed of each domain of CH1 domain, hinge domain, CH2 domain, and CH3 domain from the N-terminal side.
  • the CH2 and CH3 domains are collectively referred to as the Fc region or simply Fc.
  • the CH1 domain, hinge domain, CH2 domain, CH3 domain, and Fc region are EU indexes [Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] can be specified by the number of amino acid residues from the N-terminus.
  • CH1 is an amino acid sequence of EU indexes 118 to 215
  • hinge is an amino acid sequence of EU indexes 216 to 230
  • CH2 is an amino acid sequence of EU indexes 231 to 340
  • CH3 is an EU index 341 to 447. Each amino acid sequence is identified.
  • Chimeric antibodies are antibodies composed of VH and VL of antibodies derived from animals other than humans and CH and CL of human antibodies.
  • the kind of animal derived from the variable region is not particularly limited as long as it is an animal capable of producing a hybridoma such as a mouse, rat, hamster, or rabbit.
  • cDNAs encoding VH and VL of antibodies derived from animals other than humans are obtained and inserted into expression vectors having genes encoding CH and CL of human antibodies, respectively. It can be constructed by constructing, introducing it into animal cells and expressing it.
  • the CH of the human chimeric antibody is not particularly limited as long as it is human immunoglobulin (hereinafter abbreviated as hIg), but is preferably of the hIgG class.
  • the CL of the human chimeric antibody may be either ⁇ chain or ⁇ chain.
  • a humanized antibody is an antibody (human CDR-grafted antibody) obtained by grafting CDRs of VH and VL of antibodies derived from animals other than humans at appropriate positions of VH and VL of human antibodies.
  • the human CDR-grafted antibody is a neutral amino acid transporter, specifically, the VH and VL CDRs of a non-human animal antibody that specifically binds to ASCT2, and the VH and VL frameworks of any human antibody (hereinafter referred to as the framework).
  • the framework Abbreviated as FR
  • the cDNA encoding the V region transplanted is constructed and inserted into an expression vector having DNA encoding the CH and CL of the human antibody to construct a humanized antibody expression vector. It can be prepared by introducing and expressing.
  • the amino acid sequences of human antibody VH and VL FRs are not particularly limited as long as they are amino acid sequences derived from human antibodies.
  • the CH of the humanized antibody is not particularly limited as long as it is hIg, but is preferably of the hIgG class.
  • the CL of the humanized antibody may be either ⁇ chain or ⁇ chain.
  • the kind of the antibody fragment of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, diabody, dsFv, and a peptide containing CDR.
  • Fab is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen binding activity among fragments obtained by treating IgG with papain (proteolytic enzyme).
  • the Fab can be prepared by treating an antibody with papain or inserting a DNA encoding the Fab into an expression vector and introducing the vector into a prokaryotic organism or a eukaryotic organism for expression.
  • F (ab ′) 2 is an antibody fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 100,000 among fragments obtained by treating IgG with pepsin (proteolytic enzyme).
  • F (ab ′) 2 can be produced by treating an antibody with pepsin or binding Fab ′ (described later) with a thioether bond or a disulfide bond.
  • F (ab ′) is an antibody fragment having an antigen binding activity of about 50,000 molecular weight obtained by cleaving a disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 .
  • Fab ′ is prepared by treating antibody F (ab ′) 2 with dithiothreitol or inserting DNA encoding the antibody Fab ′ into an expression vector and introducing the vector into prokaryotic or eukaryotic organisms. It can be produced by expressing.
  • ScFv is an antibody fragment having an antigen binding activity in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker. scFv obtains cDNA encoding antibody VH and VL, constructs DNA encoding scFv, inserts this DNA into an expression vector, and introduces this expression vector into prokaryotic or eukaryotic cells for expression Thus, it can be produced.
  • Diabody is an antibody fragment in which scFv is dimerized.
  • Diabody which is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity, obtains cDNA encoding the antibody VH and VL, and constructs a DNA encoding diabody.
  • the DNA can be prepared by inserting the DNA into an expression vector, introducing the expression vector into a prokaryotic organism or a eukaryotic organism, and expressing it.
  • DsFv is an antibody fragment in which a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue is bound via a disulfide bond between cysteine residues.
  • dsFv obtains cDNA encoding antibody VH and VL, constructs DNA encoding dsFv, inserts this DNA into an expression vector, and introduces this expression vector into prokaryotic or eukaryotic cells for expression Thus, it can be produced.
  • the peptide containing CDR is a peptide containing at least one region of CDR of VH or VL.
  • the peptide containing the CDR of the antibody is constructed by constructing a DNA encoding the CDR of the antibody VH or VL, inserting this DNA into an expression vector, and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism for expression. Can be made.
  • a peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • oxidative stress means that the active oxygen production system and the active oxygen scavenging system, which are normally kept almost constant in cells due to various factors such as drugs, radiation, and ischemia, are lost, and the active oxygen production system is Refers to the state of superiority.
  • oxidative stress is promoted in the cell, cell damage, mutation by modification of DNA base, DNA damage, induction of apoptosis, and the like occur.
  • the promotion of oxidative stress may be due to the enhancement of the active oxygen production system in the cell or the suppression of the active oxygen scavenging system.
  • that the intracellular active oxygen production system is enhanced means that the abundance of amino acids or amino acid metabolites involved in the intracellular active oxygen production system is reduced compared to the negative control
  • the expression that the intracellular active oxygen scavenging system is suppressed means that the abundance of amino acids or amino acid metabolites involved in the intracellular active oxygen scavenging system is lower than that of the negative control.
  • the abundance of amino acids or amino acid metabolites involved in the intracellular active oxygen production system is lower than the negative control, or the abundance of amino acids or amino acid metabolites involved in the intracellular active oxygen elimination system is negative.
  • the amino acid or amino acid metabolite involved in the active oxygen production system or the amino acid or amino acid metabolite involved in the active oxygen elimination system is reduced in comparison with the control. This can be confirmed by the fact that the relative area value in the test cells is lower than the relative area value in the negative control.
  • the TCA cycle is one of the mechanisms for extracting cellular energy from food.
  • ATP adenosine triphosphate
  • Example 1 Cell acquisition and culture conditions The gastric cancer cell line SNU-16 was obtained from American Type Culture Collection (ATCC). Using RPMI1640 (catalog No. 11875-119, manufactured by Invitrogen) to which 10% Fetal Bovine Serum (catalog No. A15-501, manufactured by PAA) was added, twice a week to 1 ⁇ 10 5 cells / mL After thinning and subculture, the cells were cultured in an incubator (Catalog No. 3110 manufactured by Forma) at 37 ° C. under 5% CO 2 condition, and used for the subsequent experiments.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Sigma Catalog No. D5030) and Sodium bicarbonate solution (Sigma Catalog No. S8761) 3.7 g / L, D-(+) -Glucose solution 45% in H 2 O (Sigma catalog No. G8769) 1.0 g / L, sodium pyruvate solution (Sigma catalog No. S8636) 1 mM, L-glutamine (Nacalai Tesque catalog No. 1694804) ) Medium supplemented with 0.2 mM and dialyzed FBS (Invitrogen Catalog No. 26400044) 10% (hereinafter assay) Used as medium).
  • Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Sigma Catalog No. D5030) and Sodium bicarbonate solution (Sigma Catalog No. S8761) 3.7 g / L, D-(+) -Glucose solution 45% in H 2 O (Sigma catalog No. G8769) 1.0 g /
  • Example 2 Action of KM4008HV2LV3 on the intracellular metabolic system of cultured cancer cell lines
  • Anti-ASCT2 humanized antibody KM4008HV2LV3 binds to the extracellular region of ASCT2 and exhibits glutamine uptake inhibition activity and cell growth inhibition activity (International publication) 2010/008075, International Publication No. 2011/087091).
  • a capillary electrophoresis-time-of-flight mass spectrometer CE-TOFMS
  • Metabolomic analysis was performed.
  • 600 ⁇ L of a medium containing 500 ⁇ g / mL of KM4008HV2LV3 (a solvent solution containing 300 ⁇ g of KM4008HV2LV3 [10 mM sodium citrate, 262 mM D-sorbitol, 0.05 mg / mL Polysorbate 80 (pH 5.7) )] Diluted to 600 ⁇ L with assay medium) was added and cultured at 37 ° C.
  • solvent-treated cells were prepared by adding 600 ⁇ L of a medium obtained by diluting an antibody solvent solution with an equal amount of assay medium to a flask and culturing at 37 ° C. Cells were detached 2 and 8 hours after the addition of the antibody and the antibody solvent solution, centrifuged at 1300 rpm for 3 minutes, the supernatant was removed, and the precipitate fraction was treated with 10 mL of mannitol aqueous solution [final concentration is Suspended in ultrapure water to which mannitol was added to 5%.
  • the obtained relative area value reflects the intracellular concentration of each amino acid or amino acid metabolite. Therefore, by comparing the relative area values of the antibody treatment and the solvent treatment at the reaction time of 2 hours or 8 hours from the antibody or solvent treatment, the intracellular treatment of the amino acid or amino acid metabolite by the antibody treatment at each reaction time is performed. Changes in concentration can be evaluated.
  • the relative area values of glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), reduced glutathione (GSH), and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) were determined from the relative area values of antibody and NPPH. All decreased after the time to less than half the relative area value of the solvent-treated group. In addition, even after 8 hours from antibody treatment, the relative area value of the amino acid or amino acid metabolite was reduced to 2/3 or less of the relative area value of the solvent-treated group (FIG. 1, Table 1).
  • the relative area value of each amino acid or amino acid metabolite reflects the concentration of the amino acid or amino acid metabolite in the cell. Therefore, this result shows that the concentration of glutamine, glutamic acid, reduced glutathione, and NADPH in the cells is decreased as compared with the solvent-treated group at any reaction time of 2 hours or 8 hours by treatment with KM4008HV2LV3. In other words, the biosynthesis of the amino acid or amino acid metabolite is suppressed by the antibody treatment.
  • glutamine is converted to glutamic acid by glutaminase, and glutamic acid is synthesized by glutathione synthetase through 5-L-glutamylcysteine to synthesize reduced glutathione.
  • NADPH is a hydrogen donor for reducing oxidized glutathione.
  • the metabolites described above constitute a TCA circuit that is part of the pathway responsible for the production of ATP, the energy of the cell, and glutamate is oxidatively deaminated into 2-oxoglutarate by glutamate dehydrogenase in the cell.
  • 2-oxoglutaric acid is used in the reaction of the TCA cycle.
  • Example 3 Antibody array analysis when KM4008HV2LV3 is added In order to clarify the molecular mechanism of cell growth inhibitory activity by KM4008HV2LV3 in more detail, an antibody array in which many antibodies against phosphorylated proteins related to various signal transduction pathways in vivo are spotted is used. In vivo, signal changes in cancer cells when KM4008HV2LV3 was added were measured.
  • SNU-16 was seeded in 20 mL assay medium at a density of 1 ⁇ 10 5 cells / mL, cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 condition for 24 hours, and then medium containing KM4008HV2LV3 (solvent solution containing KM4008HV2LV3 [10 mM (Sodium L-glutamate, 262 mM D-Sorbitol, 0.05 mg / mL PS80 (pH 5.7)] diluted in assay medium) to a final concentration of 10 ⁇ g / mL, or the same amount of the solvent solution of the antibody is added. And allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours or 24 hours under 5% CO 2 condition.
  • solvent solution containing KM4008HV2LV3 [10 mM (Sodium L-glutamate, 262 mM D-Sorbitol, 0.05 mg / mL PS80 (pH 5.7)] diluted in assay medium
  • Biotinylation was performed using the Antibody Array Assay Kit (Full Moon Biosystems catalog No. KAS02) according to the manufacturer's protocol.
  • a cell extract containing 70 ⁇ g of biotin-labeled protein was hybridized to Phosphor Explorer Antibody Array (Catalog No. PEX100 manufactured by Full Moon Biosystems) according to the manufacturer's protocol.
  • the biotinylated protein bound on the array is reacted with Cy3 Streptavidin (GE Healthcare, Catalog No. PA43001), scanned using a microarray scanner (Agilent, Catalog No. G2565CA), and the resulting signal is digitized. Went.
  • the antibody in which the change in the signal intensity more than doubled was detected in both of the two spots compared with the cell added with the solvent and the cell added with KM4008HV2LV3 was 4 antibodies after 2 hours and 37 antibodies after 24 hours. there were. 24 hours after treatment with KM4008HV2LV3, among the 37 antibodies in which a change in signal intensity more than doubled was detected in both of the two spots compared with cells with KM4008HV2LV3, catalase Phospho-Tyr385, Casitas related to oxidative stress FIG. 2 shows changes in the signals of B-lineage Lymphoma (CBL) Phospho-Tyr700 and murine double minute 2 (MDM2) Phospho-Ser166.
  • CBL B-lineage Lymphoma
  • MDM2 murine double minute 2
  • FKHR rhabdomyosarcoma
  • Abl1 V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1
  • checkpoint Kinase 2 (chk2) Phospho-Thr383, p53, H2A.
  • X Phospho-Ser139, caspase9 Phospho-Tyr153 signal also increased more than 2-fold in KM4008HV2LV3-treated cells compared to solvent-treated cells (FIG. 3). These are known to increase in response to DNA double strand damage (DNA repair 8: 1047-1054, 2009, Leukemia 24: 679-686, 2010, J. Biol. Chem. 280). : 11147-111151, 2005), KM4008HV2LV3-added cells were shown to have DNA double strand damage.
  • Example 4 DNA damage analysis by Western blot when KM4008HV2LV3 was added H2A. In KM4008HV2LV3-treated cells suggesting DNA double strand damage seen in Example 3. An increase in X Phospho-Ser139 signal was detected by Western blot. Anti-phospho-Histone H2A. X Ser139, clone JBW301 (Millipore catalog No. 05-636) and Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (CST catalog No. 7076) were used as secondary antibodies.
  • SNU-16 was seeded in 10 mL assay medium at a density of 2 ⁇ 10 4 cells / mL, cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions for 24 hours, KM4008HV2LV3 (final concentration 10 ⁇ g / mL), antibody solvent The solution or hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) (final concentration 50 ⁇ M) was added. The cells were allowed to stand at 37 ° C. under 5% CO 2 for 8 hours, and then the floating cells were collected together with the culture supernatant.
  • the collected cells were washed with D-PBS and centrifuged, and then the protease inhibitor kittail (Merck catalog No. 535142) and phosphatase inhibitor kittail (Nacalai Tesque) were added to RIPA buffer (catalog No. P7562 manufactured by Takara Bio Inc.). Catalog No. 07574-61) was suspended and dissolved in a solution to which 1/100 volume was added.
  • the obtained cell lysate was allowed to stand on ice for 15 minutes, then centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, and the protein concentration in the supernatant obtained using BCA protein assay kit (Catalog No. 23225 manufactured by Pierce). Was measured.
  • the cell lysate was prepared to 1.2 ⁇ g / ⁇ L with RIPA buffer, and then 1/5 volume of sample buffer (for SDS-PAGE, 6-fold concentration, containing reducing agent) (catalog No. 09499 made by Nacalai Tesque) 14) was added and boiled at 100 ° C. for 5 minutes to obtain a cell extract.
  • Proteins were separated by electrophoresis of cell extract containing 10 ⁇ g of protein using 5-20% gradient gel (ePAGE EL catalog No. 2331730 manufactured by ATTO), and EzBlot (catalog No. AE-1460 manufactured by ATTO). ) was transferred to a PVDF membrane (Catalog No. IPVH304F0 manufactured by Millipore), and then blocked with Block Ace (Catalog No. UK-B40 manufactured by DS Pharma Biomedical).
  • the primary antibody prepared with Can Get Signal (catalog No. NKB-101 manufactured by TOYOBO) was reacted and washed with Tris Buffered Serine (TBS-T) supplemented with 0.05% Tween-20.
  • TBS-T Tris Buffered Serine
  • a secondary antibody prepared with Can Get Signal was reacted. After washing with TBS-T, it was immersed in Supersignal West Dura (Thermo Fisher catalog No. 34075), and chemiluminescence was detected using a lumino image analyzer (Fuji Film LAS-3000).
  • Example 5 Cell cycle fluctuation by KM4008HV2LV3 As a cause of cell growth suppression by KM4008HV2LV3, there was a possibility that cell cycle stagnation or cell death occurred in G1 phase. Therefore, the cell cycle was evaluated by KM4008HV2LV3 treatment by staining the cells with iodide iodide (PI) and measuring the fluorescence intensity using a flow cytometer.
  • PI iodide iodide
  • SNU-16 was seeded in 10 mL of assay medium at a density of 2 ⁇ 10 4 cells / mL and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions. After culturing for 24 hours, a medium containing KM4008HV2LV3 (a solvent solution containing KM4008HV2LV3 (10 mM Sodium L-glutamate, 262 mM D-Sorbitol, 0.05 mg / mL PS80 pH 5.7) diluted with assay medium) (final concentration 10 ⁇ g / mL) ), The same amount of the solvent solution of the antibody, or hydrogen peroxide (catalog No. 081-04215 manufactured by WAKO) (final concentration 50 ⁇ M) was added.
  • a medium containing KM4008HV2LV3 a solvent solution containing KM4008HV2LV3 (10 mM Sodium L-glutamate, 262 mM D-Sorbitol, 0.05 mg / mL PS
  • the cells are centrifuged and washed with D-PBS ( ⁇ ).
  • the pellet is suspended in 5% D-(+)-glucose, and then 100% ethanol (catalog No. manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) to a final concentration of 70%. 14713-95) was added and fixed at -30 ° C.
  • the fixed cells were washed twice with D-PBS ( ⁇ ), the pellet was suspended in PI / RNase staining buffer (BD Bioscience, Catalog No. 550825), allowed to stand in the dark for 30 minutes, and then flow site. The fluorescence intensity was measured with a meter (BD bioscience, FACS Calibur).
  • FIG. 4 shows the result of analyzing the obtained data with FlowJo (manufactured by Tree Star Inc.).
  • the fluorescence intensity on the horizontal axis reflects the amount of DNA contained in the cells.
  • the peak observed near the fluorescence intensity 600 is the peak observed in the G2 / M phase cell population near the fluorescence intensity 300. , G1 phase cell population.
  • the cell population having a lower fluorescence intensity than the G1 phase is a cell population causing cell death, and the cell population existing between the peaks indicating the G1 phase and G2 / M phase cell populations is the S phase cell population. It is.
  • the ratio of peak heights reflecting the number of cells in the cell population was taken.
  • a Western blot was performed in the same manner as in Example 4 to analyze the protein amount of p21.
  • p21 is expressed and induced by p53, etc., and inhibits its function by binding to a complex of cyclinE and cyclin dependent kinase 2 (CDK2) or a complex of cyclin D and cyclin dependent kinase 4/6 (CDK4 / 6).
  • CDK2 cyclinE and cyclin dependent kinase 2
  • CDK4 / 6 complex of cyclin D and cyclin dependent kinase 4/6
  • P21 (C19) antibody (Santa Cruz catalog No. sc-397) was used as the primary antibody, and Anti-rabbit IgG and HRP-linked Antibody (CST catalog No. 7074) were used as the secondary antibody.
  • KM4008HV2LV3-treated cells showed an increase in p21 signal compared to solvent-treated cells, indicating that the cell cycle was stagnant in the G1 phase, similar to the cell cycle analysis results. .
  • Example 6 Analysis of cell death caused by KM4008HV2LV3 In Example 5, it was shown that cell death occurred in KM4008HV2LV3-treated cells. By staining cells with Annexin V and measuring the fluorescence intensity using a flow cytometer, Analysis of cell death in KM4008HV2LV3-treated cells was performed.
  • SNU-16 cancer cells were seeded in 10 mL assay medium at a density of 2 ⁇ 10 4 cells / mL and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions. After culturing for 24 hours, a medium containing KM4008HV2LV3 (a solvent solution containing KM4008HV2LV3 (10 mM Sodium L-glutamate, 262 mM D-Sorbitol, 0.05 mg / mL PS80 pH 5.7) diluted with assay medium) (final concentration 10 ⁇ g / mL), solvent solution of antibody, or hydrogen peroxide (catalog No. 081-04215, manufactured by WAKO) (final concentration 50 mM) was added.
  • KM4008HV2LV3 a solvent solution containing KM4008HV2LV3 (10 mM Sodium L-glutamate, 262 mM D-Sorbitol, 0.05 mg / mL PS80 pH 5.7
  • the collected cells are washed with D-PBS ( ⁇ ), centrifuged, and the precipitate is suspended in 100 ⁇ L Annexin V Binding Buffer (BD catalog No. 556454), and 5 ⁇ L annexin V-FITC (catalog No. BD manufactured by BD) is suspended. 556420) and 0.5 ⁇ L of iodide iodide (Catalog No. P3566 manufactured by Invitrogen) were added and allowed to stand in the dark for 15 minutes.
  • Example 7 Recovery of cell growth inhibition by KM4008HV2LV3 with antioxidants From Examples 2 and 3, it was shown that oxidative stress occurred in KM4008HV2LV3-treated cells. Therefore, in order to verify the causal relationship with cell growth inhibition, Using a cytometer, changes in proliferation of KM4008HV2LV3-treated cells with and without the addition of the antioxidant N-acetylcysteine (NAC) were measured.
  • N-acetylcysteine N-acetylcysteine
  • SNU-16 was seeded in 1 mL of assay medium at a density of 2 ⁇ 10 4 cells / mL, cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions for 24 hours, then KM4008HV2LV3 (final concentration 10 ⁇ g / mL), antibody solvent The solution, hydrogen peroxide (final concentration 50 ⁇ M) or NAC (Sigma catalog No. A9165) (final concentration 5 mM) was added. After culturing for 48 or 72 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions, the floating cells were collected together with the culture supernatant.
  • the collected cells were washed with D-PBS (Nacalai Tesque Catalog No. 14249-95), suspended in 1 mL of 3% fetal bovine serum in D-PBS, Flow-Count (Catalog No. 7547053 manufactured by Beckman Coulter) and Propidium iodide (Catalog No. P3566 manufactured by Invitrogen) was added, and the number of viable cells was measured using a flow cytometer (BD bioscience manufactured, FACS calibration).
  • D-PBS Nacalai Tesque Catalog No. 14249-95
  • Flow-Count Catalog No. 7547053 manufactured by Beckman Coulter
  • Propidium iodide Catalog No. P3566 manufactured by Invitrogen
  • FlowJo (manufactured by Tree Star Inc.) was used for analysis of the obtained data.
  • the cells were developed using a front scatter (FSC) and a side scatter (SSC), and the number of cells was calculated from the ratio of the number of living cells to the number of beads with a known concentration.
  • FSC front scatter
  • SSC side scatter
  • SEQ ID NO: 5-description of artificial sequence ASCT2-myc / His base sequence
  • SEQ ID NO: 6-description of artificial sequence ASCT2-myc / His amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 7-description of artificial sequence: N-ASCT2 primer catalog No. 1) base sequence sequence number 8-Description of Artificial Sequence: N-ASCT2 Primer (Catalog No. 2) Base Sequence
  • SEQ ID NO: 14-Description of artificial sequence Amino acid sequence of ASCT2 peptide (2-16, Cys) SEQ ID NO: 15-Description of artificial sequence: Primer (mG3a2) base sequence SEQ ID NO: 16-description of artificial sequence: primer (mG2ba1) base sequence SEQ ID NO: 17-description of artificial sequence: primer (mKa1) base sequence SEQ ID NO: 38-description of artificial sequence: cKM4008VH / cKW4012VH primer (Fw) nucleotide sequence SEQ ID NO: 39-artificial sequence Akira: base sequence number 40 of cKM4008VH primer (Rv)-description of artificial sequence: base sequence number 41 of cKM4008VL / cKM4012VL primer (Fw)-description of artificial sequence: base sequence sequence number of cKM4008VL / cKM4012VL primer (Rv) 42-Description of artificial sequence: base sequence number 43 of cKM40

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Abstract

　本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、細胞内酸化ストレス促進剤に関する。また、本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含み、かつ細胞内の酸化ストレスを促進させることを特徴とする細胞増殖抑制剤に関する。

Description

酸化ストレスによる細胞増殖抑制方法
　本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、細胞内酸化ストレス促進剤に関する。また、本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含み、かつ細胞内の酸化ストレスを促進させることを特徴とする細胞増殖抑制剤に関する。
　さらに本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を投与することを含む、細胞内酸化ストレス促進方法に関する。また、本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を投与し、かつ細胞内の酸化ストレスを促進させることを含む、細胞増殖抑制方法に関する。
　ＡＳＣＴ２ポリペプチドは全長５４１アミノ酸からなる１０回膜貫通蛋白質であり、ナトリウムイオン依存的に細胞膜を介して中性アミノ酸を輸送するトランスポーターとして機能する。ＡＳＣＴ２の別の名称としては、Ｓｏｌｕｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　１（ｎｅｕｔｒａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ），ｍｅｍｂｅｒ　５、Ｓｏｌｕｔｅ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　１　ｍｅｍｂｅｒ　５、またはＳＬＣ１Ａ５が用いられており、癌とＡＳＣＴ２またはＳＬＣ１Ａ５の発現との関係に関しては、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ）データベースを用いた検討でＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５およびＳＬＣ３８Ａ５の３つが癌組織で顕著に発現亢進していることが知られている（非特許文献１）。
　また、正常の肝臓においてＳＬＣ１Ａ５の発現は全く認められないのに対して、肝細胞癌や肝芽腫の臨床組織においてＳＬＣ１Ａ５の発現が認められることが明らかにされている（非特許文献２）。さらに、低分化星状細胞腫や多形性膠芽腫の臨床組織においても正常組織と比べてＳＬＣ１Ａ５の発現が亢進していることが明らかにされている（非特許文献３）。
　また、大腸癌と前立腺癌の臨床組織において、ＡＳＣＴ２の発現が免疫組織染色やウェスタンブロッティングによって検出され、ＡＳＣＴ２の発現が高い患者では予後が悪いことが知られている（非特許文献４）。
　さらに、大腸癌、肝癌、乳癌、星状細胞腫および神経芽細胞腫の幾つかの細胞株において、グルタミンの取り込みがＡＳＣＴ２により担われており（非特許文献５、６、７、８）、ＡＳＣＴ２の基質であるアラニン－セリン－スレオニン混合物を用いてグルタミンの細胞内取り込みを競合阻害させることにより、細胞の増殖が抑制されることが報告されている（非特許文献９）。
　また、抗ＡＳＣＴ２抗体により細胞内へのアミノ酸取り込みが阻害されること、および細胞増殖が抑制されることは報告されているが（特許文献１、２）、そのメカニズムについては明らかになっていない。
国際公開第２０１０／００８０７５号 国際公開第２０１１／０８７０９１号
Ｓｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５，２５４（２００５） Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８３，Ｇ１０６２（２００２） ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，１５，５７５（２００４） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，２５５５（２００２）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，３４１３（２００３） Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９０，１４９（２０００） Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１７６，１６６（１９９８） Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６６，９５９（２００１） Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８２，Ｃ１２４６（２００２） Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９０，１４９（２０００）
　本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、細胞内酸化ストレス促進剤の提供を目的とする。また、本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含み、かつ細胞内の酸化ストレスを促進させることを特徴とする細胞増殖抑制剤を提供することを目的とする。
　さらに本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を投与することを含む、細胞内酸化ストレス促進方法の提供を目的とする。また、本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を投与し、かつ細胞内の酸化ストレスを促進させることを含む、細胞増殖抑制方法の提供を目的とする。
　本願は（１）～（１２）の発明に関する。
（１）中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、細胞内酸化ストレス促進剤。
（２）前記中性アミノ酸がグルタミンである（１）に記載の細胞内酸化ストレス促進剤。
（３）前記モノクローナル抗体が中性アミノ酸トランスポーターの細胞外領域に結合する抗体である、（１）または（２）に記載の細胞内酸化ストレス促進剤。
（４）前記モノクローナル抗体がシステムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２（ＡＳＣＴ２）の細胞外領域に結合する抗体である、（１）または（２）に記載の細胞内酸化ストレス促進剤。
（５）前記モノクローナル抗体が（Ａ）～（Ｃ）から選ばれる１の抗体である、（１）～（４）のいずれか１に記載の細胞内酸化ストレス促進剤。
（Ａ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０および３１で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（Ｂ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３５、３６および３７で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（Ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４９、５０および５１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５２、５３および５４で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（６）前記細胞が癌細胞である、（１）～（５）のいずれか１に記載の細胞内酸化ストレス促進剤。
（７）中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含み、かつ細胞内の酸化ストレスを促進させることを特徴とする細胞増殖抑制剤。
（８）前記中性アミノ酸がグルタミンである（７）に記載の細胞増殖抑制剤。
（９）前記モノクローナル抗体が中性アミノ酸トランスポーターの細胞外領域に結合する抗体である、（７）または（８）に記載の細胞増殖抑制剤。
（１０）前記モノクローナル抗体がＡＳＣＴ２の細胞外領域に結合する抗体である、（７）または（８）に記載の細胞増殖抑制剤。
（１１）前記モノクローナル抗体が（Ａ）～（Ｃ）から選ばれる１の抗体である、（７）～（１０）のいずれか１に記載の細胞増殖抑制剤。
（Ａ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０および３１で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（Ｂ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３５、３６および３７で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（Ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４９、５０および５１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５２、５３および５４で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（１２）前記細胞が癌細胞である、（７）～（１１）のいずれか１に記載の細胞増殖抑制剤。
（１３）中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を投与することを含む、細胞内酸化ストレス促進方法。
（１４）前記中性アミノ酸がグルタミンである（１３）に記載の方法。
（１５）前記モノクローナル抗体が中性アミノ酸トランスポーターの細胞外領域に結合する抗体である、（１３）に記載の方法。
（１６）前記モノクローナル抗体がシステムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２（ＡＳＣＴ２）の細胞外領域に結合する抗体である、（１３）に記載の方法。
（１７）前記モノクローナル抗体が（Ａ）～（Ｃ）から選ばれる１の抗体である、（１３）に記載の方法。
（Ａ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０および３１で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（Ｂ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３５、３６および３７で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（Ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４９、５０および５１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５２、５３および５４で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（１８）前記細胞が癌細胞である、（１３）に記載の方法。
（１９）中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を投与し、かつ細胞内の酸化ストレスを促進させることを含む、細胞増殖抑制方法。
（２０）前記中性アミノ酸がグルタミンである（１９）に記載の方法。
（２１）前記モノクローナル抗体が中性アミノ酸トランスポーターの細胞外領域に結合する抗体である、（１９）に記載の方法。
（２２）前記モノクローナル抗体がＡＳＣＴ２の細胞外領域に結合する抗体である、（１９）に記載の方法。
（２３）前記モノクローナル抗体が（Ａ）～（Ｃ）から選ばれる１の抗体である、（１９）に記載の方法。
（Ａ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０および３１で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（Ｂ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３５、３６および３７で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（Ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４９、５０および５１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５２、５３および５４で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（２４）前記細胞が癌細胞である、（１９）に記載の方法。
　本発明の細胞内酸化ストレス促進剤および細胞増殖抑制剤は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含むことにより、細胞内における酸化ストレスの促進、中性アミノ酸の取り込みを阻害することによるＡＴＰ産生の抑制、ＤＮＡにおける二重鎖の損傷、またはＧ１期における細胞周期の停滞を生じさせ、細胞の増殖を抑制または細胞死を引き起こすことができる。
図１は、ＳＮＵ－１６癌細胞株のＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３に対する細胞内代謝応答の変化を示す図である。ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３もしくは溶媒処理細胞におけるＣＥ－ＴＯＦＭＳを用いたメタボローム解析結果のうち、抗体添加から２時間または８時間後のグルタチオン合成系およびＴＣＡ回路系の中間代謝物質の相対面積値を示す。横軸は、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３または溶媒処理後の時間を示し、縦軸は相対面積値を示す。グラフは、溶媒処理群を黒色で、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理群を白色で示す。 図２は、酸化ストレスに関与する抗体アレイ結果を示す図である。ＳＮＵ－１６細胞に薬剤を添加後、２４時間で細胞を破砕、Ｆｕｌｌ　Ｍｏｏｎ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の抗体アレイにハイブリダイズし、シグナルの変動を検出した。溶媒または抗体添加から２４時間後に、溶媒処理細胞に対するＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞のシグナル強度が２以上であった抗体のうち、酸化ストレスに関与する抗体の結果を示す。横軸に抗体添加後の培養期間（時間）、縦軸にＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞のシグナル値を溶媒処理細胞のシグナル値で割った値を示す。 図３は、二重鎖損傷応答に関与する抗体アレイ結果を示す図である。ＳＮＵ－１６細胞に薬剤を添加後、２４時間で細胞を破砕、Ｆｕｌｌ　Ｍｏｏｎ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の抗体アレイにハイブリダイズし、シグナルの変動を検出した。溶媒または抗体添加から２４時間後に、溶媒処理細胞に対するＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞でのシグナル強度が２以上であった変化のあった抗体のうち、二重鎖損傷応答に関与する抗体の結果を示す。横軸に抗体添加後の培養期間（時間）、縦軸にＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞のシグナル値を溶媒処理細胞のシグナル値で割った値を示す。 図４は、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３による細胞周期変動を示す図である。ＳＮＵ－１６細胞に薬剤を添加し、２４時間後に細胞を固定してｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅで染色後、フローサイトメーターにより蛍光強度を測定したヒストグラムを示す。横軸にＤＮＡ含量を表すＦＬ２の蛍光強度を、縦軸に各処理群におけるピーク細胞数を１００％とした相対的な細胞数を相対細胞数（％）として示す。ＮＴは溶媒処理を、ＡｂはＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３（１０μｇ／ｍＬ）処理を、Ｈ２Ｏ２はｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ（５０μＭ）処理を示す。 図５は、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３による細胞死の解析を示す図である。ＳＮＵ－１６細胞に薬剤を添加し、７２時間後にａｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣで染色し、フローサイトメーターを用いて蛍光強度を測定したヒストグラムを示す。横軸にａｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣの蛍光強度を表すＦＬ１の蛍光強度を、縦軸に各処理群におけるピーク細胞数を１００％とした相対的な細胞数を相対細胞数（％）として示す。ＮＴは溶媒処理を、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３はＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３（１０μｇ／ｍＬ）処理を、Ｈ２Ｏ２はｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ（５０μＭ）処理を示す。 図６は、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３による細胞増殖抑制の抗酸化物質による回復を示す図である。ＳＮＵ－１６細胞に抗体およびＮ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＮＡＣ）を添加し、４８あるいは７２時間後にＰＩ染色を行い、フローサイトメーターを用いて生細胞数を測定した結果を示す。横軸に抗体添加後の培養期間（時間）、縦軸に生細胞数（個／ｍＬ）を示す。ｎ＝３でエラーバーは標準偏差を示す。ＮＴは溶媒処理を、ＡｂはＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理を、ＮＡＣはＮＡＣ処理を示す。
　本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、細胞内酸化ストレス促進剤に関する。
　また、本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含み、かつ細胞内の酸化ストレスを促進させることを特徴とする細胞増殖抑制剤に関する。
　本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＴＣＡ）サイクル（クエン酸回路とも表記する）抑制剤を含む。
　また、本発明は、中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含み、かつＴＣＡサイクルを抑制することを特徴とする細胞増殖抑制剤を含む。
　本発明において、中性アミノ酸としては、例えば、グルタミン、アラニン、セリンおよびスレオニンが挙げられ、好ましくはグルタミンが挙げられる。
　本発明において、中性アミノ酸の細胞内への取り込みの経路は特に限定されない。好ましくは中性アミノ酸トランスポーターを介して細胞内に取り込まれる経路であり、より好ましくはシステムＡＳＣアミノ酸トランスポーター（ＡＳＣＴ２）を介して細胞内に取り込まれる経路が挙げられる。
　本発明におけるＡＳＣＴ２としては、特に種を限定するものではないが、好ましくは哺乳動物由来のＡＳＣＴ２が挙げられ、具体的にはヒト由来のＡＳＣＴ２が挙げられる。
　ＡＳＣＴ２のアミノ酸配列情報は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）などの公知のデータベースから取得することができ、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するヒトＡＳＣＴ２のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセション番号：ＮＰ＿００５６１９）、または配列番号８６で示されるマウスＡＳＣＴ２のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセション番号：ＮＰ＿０３３２２７）などが挙げられる。
　本発明におけるＡＳＣＴ２としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＳＣＴ２の機能を有するポリペプチドが挙げられる。配列番号２で示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡＳＣＴ２の機能を有するポリペプチドも本発明のＡＳＣＴ２に包含される。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）］などを用いて、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
　ＡＳＣＴ２をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつＡＳＣＴ２の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＡＳＣＴ２の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、ならびに配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつＡＳＣＴ２の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども本発明のＡＳＣＴ２をコードする遺伝子に包含される。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
　具体的には、例えば、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，（１９９５）］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
　ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＡＳＣＴ２をコードする遺伝子に包含される。
　本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，７，６４９（１９９７）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
　デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５および－Ｚ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎ　の場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、上記の方法で作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
　さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、または配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明におけるモノクローナル抗体としては、中性アミノ酸トランスポーターの細胞外領域に結合する抗体が挙げられ、好ましくはＡＳＣＴ２の細胞外領域に結合する抗体が挙げられる。
　本発明における中性アミノ酸トランスポーターの細胞外領域としては、該トランスポーターのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｆｒａｍｅ０．ｈｔｍｌ）、ＴＭＨＭＭ　ｖｅｒ．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０／）またはＥｘＰＡＳｙ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／Ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）などを用いて予測された領域などが挙げられる。
　具体的には、ＡＳＣＴ２の細胞外領域として、例えば、配列番号２で示される該ポリペプチドのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｆｒａｍｅ０．ｈｔｍｌ）、ＴＭＨＭＭ　ｖｅｒ．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０／）またはＥｘＰＡＳｙ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／Ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）などを用いて予測された領域などが挙げられる。
　より具体的には、例えば、ＥｘＰＡＳｙ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　Ｓｅｒｖｅｒにおいて予測される細胞外ドメインである７４～９８番目、１５４～２２４番目、２８７～３０５番目、３５７～３７６番目、および４２０～４２５番目の５つの領域が挙げられる。
　または、例えば、文献［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１，１８６５７（１９９６）］もしくは［Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３，４４７０（１９９９）］で予測されている細胞外ドメインである６５～８８番目、１５２～２２４番目、２８８～３０６番目、３６１～３８０番目、および４４７～４５１番目の５つの領域が挙げられる。
　本発明において、５つの細胞外領域をＮ末側から順にＥＬ１領域、ＥＬ２領域、ＥＬ３領域、ＥＬ４領域およびＥＬ５領域と表す。例えば、配列番号２で示されるＡＳＣＴ２ポリペプチドのアミノ酸配列におけるＥＬ２領域は、１５４～２２４番目または１５２～２２４番目である。
　本発明における、中性アミノ酸トランスポーターの細胞外領域に結合するモノクローナル抗体としては、該細胞外領域のいずれの領域に結合してもよい。具体的にはＡＳＣＴ２の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体は、ＡＳＣＴ２の細胞外領域のいずれの領域に結合してもよいが、好ましくはＡＳＣＴ２の細胞外領域のうち、ＥＬ１～ＥＬ５領域から選ばれる少なくとも１つの領域に結合し、より好ましくはＡＳＣＴ２の細胞外領域のうち、少なくともＥＬ２領域に結合する抗体が挙げられる。
　本発明においてアミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を評価する方法としては、細胞に抗体または該抗体断片を反応させ、放射性物質で標識したアラニンなどのアミノ酸の取り込みが阻害されることをシンチレーションカウンターなどの機器を用いて評価する方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１４８８３（１９９６）］などが挙げられる。
　本発明においてアミノ酸の細胞内取り込み阻害による細胞増殖抑制活性を評価する方法としては、細胞に抗体または該抗体断片を反応させ、中性アミノ酸依存的な細胞の増殖が阻害されることを生細胞数測定試薬などを用いて評価する方法［Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９０，１４９（２０００）］などが挙げられる。
　本発明における細胞は、該細胞の生存や増殖などに中性アミノ酸もしくは中性アミノ酸トランスポーターが関与していればいずれの細胞でもよく、例えば、ヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株、または遺伝子組換え技術により得られた細胞などが挙げられる。本発明における細胞は、中性アミノ酸トランスポーターを発現していることが好ましく、ＡＳＣＴ２を発現していることがより好ましい。
　ヒト体内に天然に存在する細胞としては、具体的には、例えば、癌細胞が挙げられる。癌としては、例えば、血液癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌および膵臓癌などが挙げられ、好ましくは血液癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌または前立腺癌が挙げられる。血液癌としては、例えば、骨髄性白血病、リンパ性白血病、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫などが挙げられる。
　本発明に用いられる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくは単一のエピトープに結合するモノクローナル抗体が挙げられる。
　モノクローナル抗体は、ハイブリドーマから生産されるモノクローナル抗体であってもよいし、遺伝子組換え技術によって作製された遺伝子組換え抗体であってもいずれのモノクローナル抗体でもよいが、ヒトにおいて免疫原性を低下させるために、ヒト型キメラ抗体（以下、単にキメラ抗体ともいう）、ヒト化抗体［ヒト型ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；（ＣＤＲ）移植抗体ともいう］およびヒト抗体を用いることが好ましい。
　本発明のモノクローナル抗体としては、具体的には、（Ａ）～（Ｃ）から選ばれる抗体が挙げられる。
（Ａ）抗体の重鎖可変領域（ＶＨと表記する）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬと表記する）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０および３１で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（Ｂ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３５、３６および３７で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
（Ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４９、５０および５１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５２、５３および５４で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
　本発明における抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０および３１で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体の一態様としては、抗ＡＳＣＴ２マウスモノクローナル抗体ＫＭ４００８、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３およびＫＭ４００８ＨＶ１０ＬＶ３（国際公開第２０１０／００８０７５号、国際公開第２０１１／０８７０９１号）などが挙げられる。
　本発明における抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３５、３６および３７で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体の一態様としては、抗ＡＳＣＴ２マウスモノクローナル抗体ＫＭ４０１２、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４０１２（国際公開第２０１０／００８０７５号、国際公開第２０１１／０８７０９１号）などが挙げられる。
　本発明における抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４９、５０および５１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５２、５３および５４で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体の一態様としては、抗ＡＳＣＴ２ラットモノクローナル抗体ＫＭ４０１８、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４０１８（国際公開第２０１０／００８０７５号、国際公開第２０１１／０８７０９１号）などが挙げられる。
　本発明においてモノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ１つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一である抗体をいう。
　エピトープとは、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖、糖脂質、多糖脂質、アミノ基、カルボキシル基、リン酸、硫酸など修飾残基が結合したアミノ酸配列および該修飾残基が結合したアミノ酸配列からなる立体構造をいう。立体構造とは、天然に存在するタンパク質が有する３次元立体構造であり、細胞内または細胞膜上に発現しているタンパク質が構成する立体構造をいう。
　本発明において抗体分子はイムノグロブリン（以下、Ｉｇと表記する）とも称され、ヒト抗体は、分子構造の違いに応じて、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭのアイソタイプに分類される。アミノ酸配列の相同性が比較的高いＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を総称してＩｇＧとも称する。
　本発明において抗体分子は重鎖（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ、以下Ｈ鎖と記す）および軽鎖（ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ、以下Ｌ鎖と記す）と呼ばれるポリペプチドより構成される。
　また、Ｈ鎖はＮ末端側よりＶＨおよびＨ鎖定常領域（ＣＨとも表記される）、Ｌ鎖はＮ末端側よりＶＬおよびＬ鎖定常領域（ＣＬとも表記される）の各領域により、それぞれ構成される。
　ＣＨはさらに、Ｎ末端側よりＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの各ドメインにより構成される。ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを合わせてＦｃ領域又は単にＦｃと呼ばれる。
　本発明におけるＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＦｃ領域は、ＥＵインデックス［Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］により、Ｎ末端からのアミノ酸残基の番号で特定することができる。
　具体的には、ＣＨ１はＥＵインデックス１１８～２１５番のアミノ酸配列、ヒンジはＥＵインデックス２１６～２３０番のアミノ酸配列、ＣＨ２はＥＵインデックス２３１～３４０番のアミノ酸配列、ＣＨ３はＥＵインデックス３４１～４４７番のアミノ酸配列とそれぞれ特定される。
　キメラ抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体のＶＨおよびＶＬと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬとからなる抗体である。可変領域について由来となる動物の種類は、マウスやラット、ハムスター、ウサギなどのハイブリドーマを作製しうる動物であれば特に限定されない。
　ヒト型キメラ抗体はヒト以外の動物由来の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることで作製できる。ヒト型キメラ抗体のＣＨは、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと略記する）のものであれば特に限定されないが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。ヒト型キメラ抗体のＣＬは、κ鎖およびλ鎖のいずれでもよい。
　ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体（ヒト型ＣＤＲ移植抗体）である。ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、中性アミノ酸トランスポーター、具体的にはＡＳＣＴ２に特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと略記する）に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることで、作製されうる。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のアミノ酸配列であれば特に限定されない。
　ヒト化抗体のＣＨは、ｈＩｇであれば特に限定されないが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。ヒト化抗体のＣＬは、κ鎖およびλ鎖のいずれでもよい。
　本発明の抗体断片の種類は特に限定されず、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
　Ｆａｂは、ＩｇＧをパパイン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂは、抗体をパパインで処理するか、ＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。
　Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをペプシン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、抗体をペプシンで処理するか、Ｆａｂ’（後述）をチオエーテル結合またはジスルフィド結合で結合させることで、作製されうる。
　Ｆ（ａｂ’）は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’は、抗体のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールで処理するか、前記抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。
　ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカーを用いて連結した抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。
　ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片であるｄｉａｂｏｄｙは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｉａｂｏｄｙをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。
　ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体断片である。ｄｓＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含むペプチドである。抗体のＣＤＲを含むペプチドは、抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によっても作製することができる。
　本発明において酸化ストレスとは、薬物、放射線、虚血など様々な要因により、細胞において通常はほぼ一定に保たれている活性酸素産生系および活性酸素消去系のバランスが崩れ、活性酸素産生系が優位になった状態を指す。細胞内で酸化ストレスが促進されると、細胞傷害、ＤＮＡ塩基の修飾による突然変異、ＤＮＡの損傷、アポトーシスの誘導などが起こる。
　本発明において酸化ストレスの促進とは、細胞内の活性酸素産生系が亢進したことによるものであっても、活性酸素消去系が抑制されたことによるものであってもよい。
　本発明において細胞内の活性酸素産生系が亢進しているとは、細胞内の活性酸素産生系に関わるアミノ酸もしくはアミノ酸代謝物の存在量が陰性対照と比較して低下していることをいい、細胞内の活性酸素消去系が抑制されているとは、細胞内の活性酸素消去系に関わるアミノ酸もしくはアミノ酸代謝物の存在量が陰性対照と比較して低下していることをいう。
　細胞内の活性酸素産生系に関わるアミノ酸もしくはアミノ酸代謝物の存在量が陰性対照と比較して低下していること、または細胞内の活性酸素消去系に関わるアミノ酸もしくはアミノ酸代謝物の存在量が陰性対照と比較して低下していることは、例えば、ＣＥ－ＴＯＦＭＳを用いたメタボローム解析で、活性酸素産生系に関わるアミノ酸もしくはアミノ酸代謝物または活性酸素消去系に関わるアミノ酸もしくはアミノ酸代謝物について、被検細胞における相対面積値が陰性対照における相対面積値と比較して低下していることによって確認することができる。
　本発明においてＴＣＡサイクルとは、食物から細胞のエネルギーを取り出すしくみの一つである。糖、脂質、タンパク質の分解により生じたアセチルＣｏＡのアセチル基を酸化し、ミトコンドリア内膜の電子伝達系と共役することで、最終的に水と二酸化炭素、アデノシン三リン酸（ＡＴＰと表記する）を生成する。
　以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されない。
［実施例１］
細胞の入手と培養条件
　胃がん細胞株ＳＮＵ－１６はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手した。ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製　カタログＮｏ．１１８７５－１１９）に１０％　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＰＡＡ社製　カタログＮｏ．Ａ１５－５０１）を添加した培地を用いて、週に２回、１×１０５個／ｍＬに薄めて継代し、インキュベータ（Ｆｏｒｍａ社製　カタログＮｏ．３１１０）内で３７℃にて５％　ＣＯ２条件下で培養し、以降の実験に使用した。
　アッセイ時は特に記載がない限り、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ社製　カタログＮｏ．Ｄ５０３０）にＳｏｄｉｕｍ　ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社製　カタログＮｏ．Ｓ８７６１）３．７ｇ／Ｌ，Ｄ－（＋）－ｇｌｕｃｏｓｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　４５％　ｉｎ　Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ社製　カタログＮｏ．Ｇ８７６９）１．０ｇ／Ｌ，ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社製　カタログＮｏ．Ｓ８６３６）１ｍＭ，Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ナカライテスク社製　カタログＮｏ．１６９４８０４）０．２ｍＭ，およびｄｉａｌｙｚｅｄ　ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製　カタログＮｏ．２６４０００４４）１０％を添加した培地（以下アッセイ培地と表記する）を使用した。
［実施例２］
ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３の培養がん細胞株の細胞内代謝系に対する作用
　抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３は、ＡＳＣＴ２の細胞外領域に結合し、グルタミンの細胞内への取り込み阻害活性および細胞増殖抑制活性を示す（国際公開第２０１０／００８０７５号、国際公開第２０１１／０８７０９１号）。上述した活性の分子メカニズムを明らかにするために、キャピラリー電気泳動―飛行時間型質量分析計（ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＣＥ－ＴＯＦＭＳ）を用いて、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理および溶媒処理細胞でのメタボローム解析を実施した。
２－１）培養細胞試料の調製
　ＳＮＵ－１６がん細胞株をアッセイ培地で２×１０４個／ｍＬになるように懸濁し、Ｔ１７５フラスコ（ファルコン社製　３５３０２８）に３０ｍＬずつ播種した。該細胞を２４時間培養後、フラスコ内に５００μｇ／ｍＬのＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３を含む６００μＬの培地（ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３を３００μｇ含む溶媒液［１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２６２ｍＭ　Ｄ－ソルビトール、０．０５ｍｇ／ｍＬ　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０（ｐＨ５．７）］をアッセイ培地で６００μＬに希釈したもの）を添加して３７℃にて培養した。
　また陰性対照として、フラスコに抗体の溶媒液を等量のアッセイ培地で希釈した培地を６００μＬ添加して３７℃にて培養した溶媒処理細胞を調製した。抗体および抗体の溶媒液を添加してから２時間、８時間後に細胞を剥離し、１３００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を除去して、沈殿画分を１０ｍＬのマンニトール水溶液［終濃度が５％になるようにマンニトールを添加した超純水］にて懸濁した。
　細胞懸濁液の一部を取り出し、細胞数をカウントした後、細胞懸濁液を遠心分離した。上清を除去した後、１ｍＬのメタボライト抽出用メタノール溶液［Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１（１０ｍＭ，ヒューマンメタボロームテクノロジーズ社製）をメタノール（和光純薬社製ＬＣ／ＭＳ用　１３４－１４５２３）にて１０００倍希釈した溶液］を添加し、ＣＥ－ＴＯＦＭＳによるメタボローム解析に供した。
２－２）ＣＥ－ＴＯＦＭＳによるメタボローム解析
　ＣＥ－ＴＯＦＭＳによるメタボローム解析は、データ解析も含めてヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社（以下ＨＭＴ社とも表記する）に委託した。データ解析の方法について以下に示す。ＣＥ－ＴＯＦＭＳにより検出された各ピークについて、自動積分ソフトウェアのＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ　ｖｅｒ．２．９．０．９（慶應義塾大学開発）を用いて、ピーク情報（質量電荷比（ｍ／ｚ）、泳動時間（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ：ＭＴ）およびピーク面積値）を得た。得られたｍ／ｚとＭＴをもとにして、ＨＭＴ社が保有する代謝物質データベースから、ＣＥ－ＴＯＦＭＳで検出された各ピークに相当するアミノ酸またはアミノ酸代謝物質を同定した。
　同定された各アミノ酸またはアミノ酸代謝物質について、（ピーク面積値）／（内部標準物質の面積値×測定に使用した細胞数）で表わされる相対面積値を算出した。ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３または溶媒添加から、２時間後、８時間後の該アミノ酸またはアミノ酸代謝物質の相対面積値を表１に、表１をグラフ化したものを図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られた相対面積値は、各アミノ酸またはアミノ酸代謝物質の細胞内での濃度を反映している。そのため、抗体または溶媒処理から２時間または８時間それぞれの反応時間における、抗体処理と溶媒処理の相対面積値を比較することで、各反応時間における、抗体処理による該アミノ酸またはアミノ酸代謝物質の細胞内濃度の変化を評価することができる。
　ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３で処理した細胞では、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＮＡＤＰＨ）の相対面積値が、抗体処理から２時間後にいずれも溶媒処理群の相対面積値の２分の１以下に減少した。また、抗体処理から８時間後でも、上記アミノ酸またはアミノ酸代謝物の相対面積値はいずれも溶媒処理群の相対面積値の３分の２以下に減少していた（図１、表１）。
　上述したように、各アミノ酸またはアミノ酸代謝物質の相対面積値は、該アミノ酸またはアミノ酸代謝物質の細胞内での濃度を反映している。そのため本結果は、細胞へのＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理により、２時間または８時間のいずれの反応時間においても、細胞内でのグルタミン、グルタミン酸、還元型グルタチオン、およびＮＡＤＰＨの濃度が溶媒処理群と比較して低下していること、つまり抗体処理によって、該アミノ酸またはアミノ酸代謝物質の生合成が抑制されていることを示す。
　細胞内において、グルタミンはグルタミナーゼによりグルタミン酸に変換され、グルタミン酸は５－Ｌ－グルタミルシステインを経てグルタチオンシンテターゼによって還元型グルタチオンが合成される。ＮＡＤＰＨは、酸化型グルタチオンを還元するための水素供与体である。
　以上より、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３で処理したがん細胞では、細胞内へのグルタミン取り込みが阻害されることで細胞内のグルタミン酸が減少した結果、グルタチオンの合成が抑制されることが示された。さらに、グルタチオンは抗酸化物質であることから、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３は、がん細胞のレドックスホメオスタシス（活性酸素消去系）を抑制する、つまり酸化ストレスを促進させることが示された。
　また、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３で処理した細胞では、２－オキソグルタル酸（２－Ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ　ａｃｉｄ）、コハク酸（Ｓｕｃｃｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、フマル酸（Ｆｕｍａｒｉｃ　ａｃｉｄ）、マレイン酸（Ｍａｌｉｃ　ａｃｉｄ）、およびアデノシン三リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＴＰ）の相対面積値が、溶媒処理群と比べていずれも抗体処理から２時間後で２分の１以下に、８時間後では５分の４以下に減少した（図１、表１）。
　上述した代謝物質は、細胞のエネルギーであるＡＴＰの産生を担う経路の一部であるＴＣＡ回路を構成しており、細胞内においてグルタミン酸はグルタミン酸デヒドロゲナーゼにより２－オキソグルタル酸に酸化的に脱アミノ化されて、２－オキソグルタル酸は、ＴＣＡ回路の反応に用いられる。
　以上より、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３で処理したがん細胞では、細胞内へのグルタミン取り込みが阻害されることで、グルタミン酸減少によるＴＣＡ回路の低下が起こり、その結果、細胞のエネルギーであるＡＴＰの産生が抑制されることが示された。
［実施例３］
ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３添加時の抗体アレイ解析
　ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３による細胞増殖抑制活性の分子メカニズムをより詳細に明らかにするため、生体内での様々なシグナル伝達経路に関するリン酸化タンパク質に対する抗体が多数スポットされた抗体アレイを用いて、癌細胞におけるＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３添加時の生体内でのシグナル変化を測定した。
　ＳＮＵ－１６を１×１０５個／ｍＬの密度で２０ｍＬのアッセイ培地に播種し、３７℃にて５％ＣＯ２条件下で２４時間培養後、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３を含む培地（ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３を含む溶媒液［１０ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ，２６２ｍＭ　Ｄ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌ，０．０５ｍｇ／ｍＬ　ＰＳ８０（ｐＨ５．７）］をアッセイ培地に希釈したもの）を終濃度　１０μｇ／ｍＬとなるように、あるいは抗体の溶媒液を同量添加し、２時間または２４時間、３７℃にて５％　ＣＯ２条件下で静置した。
　細胞の剥離、溶解、タンパク質の抽出、ビオチン化はＡｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｒｒａｙ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｆｕｌｌ　Ｍｏｏｎ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製　カタログＮｏ．ＫＡＳ０２）を用い、メーカーのプロトコールに従って実施した。ビオチンラベルした７０μｇのタンパク質を含む細胞抽出液を、メーカーのプロトコールに従ってＰｈｏｓｐｈｏ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｒｒａｙ（Ｆｕｌｌ　Ｍｏｏｎ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製　カタログＮｏ．ＰＥＸ１００）にハイブリダイズした。アレイ上に結合したビオチン化タンパク質をＣｙ３　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＧＥヘルスケア社製　カタログＮｏ．ＰＡ４３００１）と反応させ、マイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製　カタログＮｏ．Ｇ２５６５ＣＡ）を用いてスキャンし、得られたシグナルの数値化を行った。
　アレイ上には１３１８種類の抗体が２スポットずつ塗布されており、検出限界を超えるシグナルが２つのスポットの両方で検出できたものを数えると、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３を添加して２時間後の細胞では３９０抗体、２４時間後の細胞では４１９抗体であった。
　その中で、溶媒添加細胞とＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３添加細胞を比較して２倍以上のシグナル強度の変化が２つのスポットの両方で検出できた抗体は、２時間後で４抗体、２４時間後で３７抗体であった。ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理から２４時間後に溶媒添加細胞とＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３添加細胞を比較して２倍以上のシグナル強度の変化が２つのスポットの両方で検出できた３７抗体のうち、酸化ストレスに関わるｃａｔａｌａｓｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔｙｒ３８５，Ｃａｓｉｔａｓ　Ｂ－ｌｉｎｅａｇｅ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＣＢＬ）Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔｙｒ７００，ｍｕｒｉｎｅ　ｄｏｕｂｌｅ　ｍｉｎｕｔｅ　２（ＭＤＭ２）Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｅｒ１６６のシグナルの変化を図２に示す。
　上記のシグナルは酸化ストレス時に増加することが報告されており［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２９６６７－２９６７５，２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２２８８－２２９６，２００７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７　Ｍｏｕｓｅ　ａｎｔｉ－ｃ－Ｃｂｌ（ｐＹ７００）テクニカルデータシート］、図２の結果より、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３添加細胞で酸化ストレスが起きていることが示された。
　また、ｆｏｒｋｈｅａｄ　ｉｎ　ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ（ＦＫＨＲ）およびＶ－ａｂｌ　Ａｂｅｌｓｏｎ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒａｌ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ　１（Ａｂｌ１）の発現量の増加もみられており（図２）、これらは酸化ストレスに応答して増加するという報告はないものの、ＦＫＨＲはｃａｔａｌａｓｅなどの活性酸素を除去する酵素群の転写誘導を、Ａｂｌ１はＴｙｒ３８５のリン酸化によるｃａｔａｌａｓｅの活性化をそれぞれ担っているタンパク質であり（Ａｎｔｉｏｘｉｄ　Ｒｅｄｏｘ　Ｓｉｇｎａｌ．１４（４）：５９３－６０５，２０１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２９６６７－２９６７５，２００３）、これらの増加はＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３による酸化ストレスの促進とその応答経路の活性化を示すものである。
　加えて、ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　２（ｃｈｋ２）Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔｈｒ３８３，ｐ５３，Ｈ２Ａ．Ｘ　Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｅｒ１３９，ｃａｓｐａｓｅ９　Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔｙｒ１５３のシグナルも、溶媒処理細胞と比較してＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞で２倍以上の上昇がみられた（図３）。これらはＤＮＡの二重鎖損傷に応答して増加するシグナルであることが知られており（ＤＮＡ　ｒｅｐａｉｒ　８：１０４７－１０５４，２００９，Ｌｅｕｋｅｍｉａ　２４：６７９－６８６，２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１１１４７－１１１５１，２００５）、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３添加細胞でＤＮＡの二重鎖損傷が起きていることが示された。
［実施例４］
ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３添加時のｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔによるＤＮＡ損傷解析
　実施例３で見られた、ＤＮＡ二重鎖損傷を示唆するＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞でのＨ２Ａ．Ｘ　Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｅｒ１３９のシグナル上昇を、ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにより検出した。一次抗体としてａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ２Ａ．Ｘ　Ｓｅｒ１３９、ｃｌｏｎｅ　ＪＢＷ３０１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　カタログＮｏ．０５－６３６）を、二次抗体としてＡｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ，ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＳＴ　カタログＮｏ．７０７６）を使用した。
　ＳＮＵ－１６を２×１０４個／ｍＬの密度で１０ｍＬのアッセイ培地に播種し、３７℃にて５％　ＣＯ２条件下で２４時間培養後、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３（終濃度１０μｇ／ｍＬ）、抗体の溶媒液、あるいはｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ（Ｈ２Ｏ２）（終濃度　５０μＭ）を添加した。細胞を３７℃にて５％　ＣＯ２条件下で８時間静置した後、浮遊している細胞を培養上清とともに回収した。
　接着している細胞に関してはＤ－ＰＢＳ（－）（ナカライテスク社製　カタログＮｏ．１４２４９－９５）で洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製　カタログＮｏ．１２５６３－０１１）を１．５ｍＬ添加し３７℃にて５％　ＣＯ２条件下で５分間静置することで剥離させ、最初に回収した浮遊細胞と混合して後の操作に用いた。
　回収した細胞をＤ－ＰＢＳで洗浄して遠心分離した後、ＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製　カタログＮｏ．Ｐ７５６８２）にｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（メルク社製　カタログＮｏ．５３５１４２）およびｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（ナカライテスク社製　カタログＮｏ．０７５７４－６１）を１／１００量添加した溶液に懸濁して溶解させた。
　得られた細胞溶解液を１５分間氷上に静置した後１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製　カタログＮｏ．２３２２５）を用いて得られた上清中のタンパク質濃度を測定した。該細胞溶解液をＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒで１．２μｇ／μＬに調製した後、１／５量の試料緩衝液（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用，６倍濃縮，還元剤含有）（ナカライテスク社製　カタログＮｏ．０９４９９－１４）を添加し１００℃で５分間煮沸し、細胞抽出液とした。１０μｇのタンパク質を含む細胞抽出液を５－２０％のｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ（ＡＴＴＯ社製　ｅＰＡＧＥＬ　カタログＮｏ．２３３１７３０）を用いて電気泳動することでタンパク質を分離し、ＥｚＢｌｏｔ（ＡＴＴＯ社製　カタログＮｏ．ＡＥ－１４６０）を用いてＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製　カタログＮｏ．ＩＰＶＨ３０４Ｆ０）に転写した後、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル社製　カタログＮｏ．ＵＫ－Ｂ４０）によりブロッキングを行った。
　ブロッキング終了後、Ｃａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製　カタログＮｏ．ＮＫＢ－１０１）にて調製した一次抗体を反応させ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０を添加したＴｒｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓｅｒｉｎｅ（ＴＢＳ－Ｔ）で洗浄後、Ｃａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌで調製した二次抗体を反応させた。ＴＢＳ－Ｔで洗浄後、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ　Ｗｅｓｔ　Ｄｕｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製　カタログＮｏ．３４０７５）に浸し、化学発光をルミノイメージアナライザー（Ｆｕｊｉ　Ｆｉｌｍ社製ＬＡＳ－３０００）を用いて検出した。
　その結果、溶媒処理細胞と比較して、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞およびＨ２Ｏ２処理細胞においてＨ２Ａ．Ｘ　Ｓｅｒ１３９のリン酸化シグナルが増加しており、実施例３と同様、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞ではＤＮＡの二重鎖損傷が生じていることが示された。
［実施例５］
ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３による細胞周期変動
　ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３による細胞増殖抑制の原因としては、Ｇ１期での細胞周期の停滞や、細胞死が生じている可能性が考えられた。そのため、細胞をｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）染色し、フローサイトメーターを用いて蛍光強度を測定することで、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理による細胞周期の変動を評価した。
　ＳＮＵ－１６を２×１０４個／ｍＬの密度で１０ｍＬのアッセイ培地に播種し３７℃にて５％　ＣＯ２条件下で培養した。２４時間培養後にＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３を含む培地（ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３を含む溶媒液（１０ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ，２６２ｍＭ　Ｄ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌ，０．０５ｍｇ／ｍＬ　ＰＳ８０　ｐＨ５．７）をアッセイ培地で希釈したもの）（終濃度１０μｇ／ｍＬ）、同量の抗体の溶媒液、あるいはｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ（ＷＡＫＯ社製　カタログＮｏ．０８１－０４２１５）（終濃度５０μＭ）を添加した。
　２４時間培養した後に浮遊している細胞を培養上清とともに回収した。接着している細胞に関してはＤ－ＰＢＳ（－）（ナカライテスク社製　カタログＮｏ．１４２４９－９５）で洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製　カタログＮｏ．１２５６３－０１１）を１．５ｍＬ添加し３７℃にて５％　ＣＯ２条件下で５分間静置することで回収し、最初に回収した浮遊細胞と混合して後の操作に用いた。
　細胞を遠心した後Ｄ－ＰＢＳ（－）で洗浄し、ペレットを５％　Ｄ－（＋）－ｇｌｕｃｏｓｅに懸濁後、終濃度が７０％となるように１００％エタノール（ナカライテスク社製　カタログＮｏ．１４７１３－９５）を添加し、－３０℃で固定した。
　固定後の細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で２度洗浄し、ペレットをＰＩ／ＲＮａｓｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製　カタログＮｏ．５５０８２５）で懸濁し、３０分間暗所に静置した後、フローサイトメーター（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ）で蛍光強度を測定した。
　得られたデータをＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ　Ｓｔａｒ　Ｉｎｃ．社製）で解析した結果を図４に示す。図４は、横軸の蛍光強度が細胞に含まれるＤＮＡ量を反映しており、蛍光強度６００付近に見られるピークが、Ｇ２／Ｍ期の細胞集団を、蛍光強度３００付近に見られるピークが、Ｇ１期の細胞集団を示す。また、Ｇ１期より蛍光強度の低い細胞集団は細胞死を起こしている細胞集団であり、Ｇ１期とＧ２／Ｍ期の細胞集団を示すピークの間に存在する細胞集団は、Ｓ期の細胞集団である。抗体、溶媒またはｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ添加時それぞれのヒストグラムについて、上記細胞集団の細胞数を反映しているピークの高さの比をとった。
　その結果、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞は溶媒処理細胞と比較してＧ１期の細胞が多く、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期の細胞が少ないことが判明し、Ｇ１期で細胞周期が停滞していることが明らかとなった（図４）。また、Ｇ１期よりもＤＮＡ量が少ない細胞がＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞で増加しており、細胞死が起きていることが示された（図４）。
　加えて、Ｇ１期での細胞周期の停滞をタンパクレベルで確認するため、実施例４と同様の方法でｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを行い、ｐ２１のタンパク量を解析した。ｐ２１は、ｐ５３などにより発現誘導されｃｙｃｌｉｎＥとｃｙｃｌｉｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　２（ＣＤＫ２）との複合体あるいはｃｙｃｌｉｎＤとｃｙｃｌｉｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　４／６（ＣＤＫ４／６）との複合体と結合してその機能を阻害することにより、Ｓ期への進行を妨げる働きを持つことが知られている（Ｐｒｏｃ　Ｓｏｃ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ．２１３：１３８－１４９，１９９６）。
　一次抗体にはｐ２１（Ｃ１９）ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　カタログＮｏ．ｓｃ－３９７）、二次抗体にはＡｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ，ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＳＴ　カタログＮｏ．７０７４）を用いた。ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを行った結果、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞では溶媒処理細胞と比較してｐ２１のシグナルが増加しており、細胞周期の解析結果と同じく、Ｇ１期で細胞周期が停滞していることが示された。
［実施例６］
ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３によって起こる細胞死の解析
　実施例５においてＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞では細胞死が生じていることが示されたことから、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖで細胞を染色し、フローサイトメーターを用いて蛍光強度を測定することで、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞における細胞死の解析を実施した。
　ＳＮＵ－１６がん細胞を２×１０４個／ｍＬの密度で１０ｍＬのアッセイ培地に播種し、３７℃にて５％　ＣＯ２条件下で培養した。２４時間培養後に、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３を含む培地（ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３を含む溶媒液（１０ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ，２６２ｍＭ　Ｄ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌ，０．０５ｍｇ／ｍＬ　ＰＳ８０　ｐＨ５．７）をアッセイ培地で希釈したもの）（終濃度１０μｇ／ｍＬ）、抗体の溶媒液、またはｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ（ＷＡＫＯ社製　カタログＮｏ．０８１－０４２１５）（終濃度５０ｍＭ）を添加した。
　７２時間培養した後に浮遊している細胞を培養上清とともに回収した。接着している細胞に関してはＤ－ＰＢＳ（－）（ナカライテスク社製　カタログＮｏ．１４２４９－９５）で洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製　カタログＮｏ．１２５６３－０１１）を１．５ｍＬ添加し３７℃にて５％　ＣＯ２条件下で５分間静置することで回収し、最初に回収した浮遊細胞と混合して後の操作に用いた。
　回収した細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で洗浄後、遠心分離し、沈殿を１００μＬのＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ　カタログＮｏ．５５６４５４）に懸濁し、５μＬのａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＦＩＴＣ（ＢＤ社製　カタログＮｏ．５５６４２０）および０．５μＬのｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製　カタログＮｏ．Ｐ３５６６）を添加して暗所に１５分間静置した。
　４００μＬのａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ　Ｂｉｎｄｉｇ　Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、フローサイトメーター（ＢＤ社製　ＦＡＣＳ　ｃａｌｉｂｕｒ）を用いて蛍光強度を測定した。データの解析にはＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ　Ｓｔａｒ　Ｉｎｃ．社製）を用いた。
　その結果、０．２ｍＭのＬ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含む培地で７２時間培養すると、半数程度のＳＮＵ－１６細胞はａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ陽性になることが判明した。加えて、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３で処理した細胞は溶媒処理した細胞と比較してａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ陽性細胞の割合が高いことが明らかとなった（図５）。この結果より、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理によりＳＮＵ－１６が細胞死を起こしたことが示された。
［実施例７］
ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３による細胞増殖の抑制の抗酸化物質による回復
　実施例２および３より、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞では酸化ストレスが生じていることが示されたことから、細胞増殖抑制との因果関係を検証するため、フローサイトメーターを用いて、抗酸化物質Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＮＡＣ）の添加の有無によるＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理細胞の増殖の変化を測定した。
　ＳＮＵ－１６を２×１０４個／ｍＬの密度で１ｍＬのアッセイ培地に播種し、３７℃にて５％　ＣＯ２条件下で２４時間培養後、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３（終濃度　１０μｇ／ｍＬ）、抗体の溶媒液、ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ（終濃度　５０μＭ）あるいはＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ社製　カタログＮｏ．Ａ９１６５）（終濃度　５ｍＭ）を添加した。４８あるいは７２時間、３７℃にて５％　ＣＯ２条件下で培養した後、浮遊している細胞を培養上清とともに回収した。
　接着している細胞に関してはＤ－ＰＢＳ（－）（ナカライテスク社製　カタログＮｏ．１４２４９－９５）で洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製　カタログＮｏ．１２５６３－０１１）を１．５ｍＬ添加し３７℃にて５％　ＣＯ２条件下で５分間静置することで回収し、最初に回収した浮遊細胞と混合して後の操作に用いた。
　回収した細胞はＤ－ＰＢＳ（ナカライテスク　カタログＮｏ．１４２４９－９５）による洗浄後、１ｍＬ　の３％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ｉｎ　Ｄ－ＰＢＳに懸濁し、Ｆｌｏｗ－Ｃｏｕｎｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製　カタログＮｏ．７５４７０５３）およびｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製　カタログＮｏ．Ｐ３５６６）を添加し、フローサイトメーター（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＦＡＣＳ　ｃａｌｉｂｕｒ）を用いて生細胞数の測定を行った。
　得られたデータの解析にはＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ　Ｓｔａｒ　Ｉｎｃ．社製）を用いた。細胞をｆｒｏｎｔ　ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳＣ）とｓｉｄｅ　ｓｃａｔｔｅｒ（ＳＳＣ）で展開し、濃度既知のｂｅａｄｓの数に対する生細胞数の比から、細胞数を計算した。
　その結果、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理した細胞は溶媒処理した細胞と比較して細胞増殖が抑制されることを確認した。さらに、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理による細胞増殖の抑制は、ＮＡＣの添加により回復することが判明した（図６）。この結果より、ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３処理による増殖抑制は、酸化ストレスによって誘導されていることが示された。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１２年１０月２４日付けで出願された米国仮出願（６１／７１７，７０３号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
配列番号３－人工配列の説明：ＡＳＣＴ２プライマー（ＦｗカタログＮｏ．１）の塩基配列
配列番号４－人工配列の説明：ＡＳＣＴ２プライマー（ＲｖカタログＮｏ．１）の塩基配列
配列番号５－人工配列の説明：ＡＳＣＴ２－ｍｙｃ／Ｈｉｓの塩基配列
配列番号６－人工配列の説明：ＡＳＣＴ２－ｍｙｃ／Ｈｉｓのアミノ酸配列
配列番号７－人工配列の説明：Ｎ－ＡＳＣＴ２プライマー（カタログＮｏ．１）の塩基配列
配列番号８－人工配列の説明：Ｎ－ＡＳＣＴ２プライマー（カタログＮｏ．２）の塩基配列
配列番号９－人工配列の説明：Ｎ－ＡＳＣＴ２プライマー（カタログＮｏ．３）の塩基配列
配列番号１０－人工配列の説明：Ｎ－ＡＳＣＴ２プライマー（カタログＮｏ．４）の塩基配列
配列番号１１－人工配列の説明：Ｃ－ＡＳＣＴ２－ｍｙｃ／Ｈｉｓプライマー（ＦｗカタログＮｏ．２）の塩基配列
配列番号１２－人工配列の説明：Ｃ－ＡＳＣＴ２－ｍｙｃ／Ｈｉｓプライマー（ＲｖカタログＮｏ．２）の塩基配列
配列番号１３－人工配列の説明：Ｃ－ＡＳＣＴ２－ｍｙｃ／Ｈｉｓプライマー（ＲｖカタログＮｏ．３）の塩基配列
配列番号１４－人工配列の説明：ＡＳＣＴ２ペプチド（２－１６，Ｃｙｓ）のアミノ酸配列
配列番号１５－人工配列の説明：プライマー（ｍＧ３ａ２）の塩基配列
配列番号１６－人工配列の説明：プライマー（ｍＧ２ｂａ１）の塩基配列
配列番号１７－人工配列の説明：プライマー（ｍＫａ１）の塩基配列
配列番号３８－人工配列の説明：ｃＫＭ４００８ＶＨ／ｃＫＷ４０１２ＶＨプライマー（Ｆｗ）の塩基配列
配列番号３９－人工配列の説明：ｃＫＭ４００８ＶＨプライマー（Ｒｖ）の塩基配列
配列番号４０－人工配列の説明：ｃＫＭ４００８ＶＬ／ｃＫＭ４０１２ＶＬプライマー（Ｆｗ）の塩基配列
配列番号４１－人工配列の説明：ｃＫＭ４００８ＶＬ／ｃＫＭ４０１２ＶＬプライマー（Ｒｖ）の塩基配列
配列番号４２－人工配列の説明：ｃＫＭ４０１２ＶＨプライマー（Ｒｖ）の塩基配列
配列番号４３－人工配列の説明：プライマー（ｒＧ２ａ）の塩基配列
配列番号４４－人工配列の説明：プライマー（ｒＫａ２）の塩基配列
配列番号５５－人工配列の説明：ｃＫＭ４０１８ＶＨプライマー（Ｆｗ）の塩基配列
配列番号５６－人工配列の説明：ｃＫＭ４０１８ＶＨプライマー（Ｒｖ）の塩基配列
配列番号５７－人工配列の説明：ｃＫＭ４０１８ＶＬプライマー（Ｆｗ）の塩基配列
配列番号５８－人工配列の説明：ｃＫＭ４０１８ＶＬプライマー（Ｒｖ）の塩基配列
配列番号５９－人工配列の説明：マウスＡＳＣＴ２－ｍｙｃ／Ｈｉｓの塩基配列
配列番号６０－人工配列の説明：マウスＡＳＣＴ２－ｍｙｃ／Ｈｉｓのアミノ酸配列
配列番号６１－人工配列の説明：マウスＡＳＣＴ２－ｍｙｃ／Ｈｉｓプライマー（Ｆｗ）の塩基配列
配列番号６２－人工配列の説明：マウスＡＳＣＴ２－ｍｙｃ／Ｈｉｓプライマー（Ｒｖ）の塩基配列
配列番号６３－人工配列の説明：ヒトＡＳＣＴ２　ＮｃｏＩサイト変異導入用プライマー（Ｆｗ）の塩基配列
配列番号６４－人工配列の説明：ヒトＡＳＣＴ２　ＮｃｏＩサイト変異導入用プライマー（Ｒｖ）の塩基配列
配列番号６５－人工配列の説明：ヒトＡＳＣＴ２　ＢａｍＩＩＩサイト導入用プライマー（Ｆｗ）の塩基配列
配列番号６６－人工配列の説明：ヒトＡＳＣＴ２　ＢａｍＩＩＩサイト導入用プライマー（Ｒｖ）の塩基配列
配列番号６７－人工配列の説明：マウスＡＳＣＴ２　ＮｃｏＩサイト変異導入用プライマー（Ｆｗ）の塩基配列
配列番号６８－人工配列の説明：マウスＡＳＣＴ２　ＮｃｏＩサイト変異導入用プライマー（Ｒｖ）の塩基配列
配列番号６９－人工配列の説明：ヒトＡＳＣＴ２　ＥＬ４マウス型置換用プライマー（Ｆｗ）の塩基配列
配列番号７０－人工配列の説明：ヒトＡＳＣＴ２　ＥＬ４マウス型置換用プライマー（Ｒｖ）の塩基配列
配列番号７１－人工配列の説明：ＫＭ４００８　ＨＶ０のアミノ酸配列
配列番号７２－人工配列の説明：ＫＭ４００８　ＬＶ０のアミノ酸配列
配列番号７３－人工配列の説明：ＫＭ４００８　ＨＶ０の塩基配列
配列番号７４－人工配列の説明：ＫＭ４００８　ＬＶ０の塩基配列
配列番号７５－人工配列の説明：ＨＶ２の塩基配列
配列番号７６－人工配列の説明：ＨＶ２のアミノ酸配列
配列番号７７－人工配列の説明：ＨＶ４の塩基配列
配列番号７８－人工配列の説明：ＨＶ４のアミノ酸配列
配列番号７９－人工配列の説明：ＨＶ７の塩基配列
配列番号８０－人工配列の説明：ＨＶ７のアミノ酸配列
配列番号８１－人工配列の説明：ＨＶ１０の塩基配列
配列番号８２－人工配列の説明：ＨＶ１０のアミノ酸配列
配列番号８３－人工配列の説明：ＬＶ３の塩基配列
配列番号８４－人工配列の説明：ＬＶ３のアミノ酸配列
配列番号８７－人工配列の説明：ＨＶ２合成遺伝子の塩基配列
配列番号８８－人工配列の説明：ＬＶ３合成遺伝子の塩基配列
配列番号８９－人工配列の説明：ＨＶ１０合成遺伝子の塩基配列

Claims (24)

  1. 　中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含む、細胞内酸化ストレス促進剤。
  2. 　前記中性アミノ酸がグルタミンである請求項１記載の細胞内酸化ストレス促進剤。
  3. 　前記モノクローナル抗体が中性アミノ酸トランスポーターの細胞外領域に結合する抗体である、請求項１または２記載の細胞内酸化ストレス促進剤。
  4. 　前記モノクローナル抗体がシステムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２（ＡＳＣＴ２）の細胞外領域に結合する抗体である、請求項１または２記載の細胞内酸化ストレス促進剤。
  5. 　前記モノクローナル抗体が（Ａ）～（Ｃ）から選ばれる１の抗体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞内酸化ストレス促進剤。
    （Ａ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０および３１で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
    （Ｂ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３５、３６および３７で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
    （Ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４９、５０および５１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５２、５３および５４で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
  6. 　前記細胞が癌細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞内酸化ストレス促進剤。
  7. 　中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含み、かつ細胞内の酸化ストレスを促進させることを特徴とする細胞増殖抑制剤。
  8. 　前記中性アミノ酸がグルタミンである請求項７記載の細胞増殖抑制剤。
  9. 　前記モノクローナル抗体が中性アミノ酸トランスポーターの細胞外領域に結合する抗体である、請求項７または８記載の細胞増殖抑制剤。
  10. 　前記モノクローナル抗体がＡＳＣＴ２の細胞外領域に結合する抗体である、請求項７または８記載の細胞増殖抑制剤。
  11. 　前記モノクローナル抗体が（Ａ）～（Ｃ）から選ばれる１の抗体である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制剤。
    （Ａ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０および３１で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
    （Ｂ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３５、３６および３７で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
    （Ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４９、５０および５１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５２、５３および５４で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
  12. 　前記細胞が癌細胞である、請求項７～１１のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制剤。
  13. 　中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を投与することを含む、細胞内酸化ストレス促進方法。
  14. 　前記中性アミノ酸がグルタミンである請求項１３記載の方法。
  15. 　前記モノクローナル抗体が中性アミノ酸トランスポーターの細胞外領域に結合する抗体である、請求項１３記載の方法。
  16. 　前記モノクローナル抗体がシステムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２（ＡＳＣＴ２）の細胞外領域に結合する抗体である、請求項１３記載の方法。
  17. 　前記モノクローナル抗体が（Ａ）～（Ｃ）から選ばれる１の抗体である、請求項１３記載の方法。
    （Ａ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０および３１で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
    （Ｂ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３５、３６および３７で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
    （Ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４９、５０および５１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５２、５３および５４で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
  18. 　前記細胞が癌細胞である、請求項１３記載の方法。
  19. 　中性アミノ酸の細胞内取り込み阻害活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片を投与し、かつ細胞内の酸化ストレスを促進させることを含む、細胞増殖抑制方法。
  20. 　前記中性アミノ酸がグルタミンである請求項１９記載の方法。
  21. 　前記モノクローナル抗体が中性アミノ酸トランスポーターの細胞外領域に結合する抗体である、請求項１９記載の方法。
  22. 　前記モノクローナル抗体がＡＳＣＴ２の細胞外領域に結合する抗体である、請求項１９記載の方法。
  23. 　前記モノクローナル抗体が（Ａ）～（Ｃ）から選ばれる１の抗体である、請求項１９記載の方法。
    （Ａ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７および２８で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０および３１で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
    （Ｂ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３５、３６および３７で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
    （Ｃ）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４９、５０および５１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５２、５３および５４で示されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
  24. 　前記細胞が癌細胞である、請求項１９記載の方法。
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