JPWO2018181656A1 - 抗gpr20抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)配列番号1においてアミノ酸番号1乃至48に示されるアミノ酸配列を含むことからなるペプチドに特異的に結合する抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(2)GPR20への結合に対して、配列番号3のアミノ酸番号20乃至466に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号11のアミノ酸番号20乃至232に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体と競合阻害活性を有する抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(3)LEVPLFHLFARLD(配列番号31)に示されるアミノ酸配列からなるエピトープに結合することを特徴とする(1)又は(2)に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、
(4)重鎖配列が、配列番号5または8に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号6または9に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、並びに、配列番号7に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を有する可変領域を含み;
軽鎖配列が配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を有する可変領域を含む、(1)乃至(3)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(5)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び、配列番号12に示される軽鎖可変領域を含むことからなる、(1)乃至(4)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(6)配列番号3のアミノ酸番号20乃至466に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖、及び、配列番号11のアミノ酸番号20乃至232に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる(1)乃至(5)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(7)キメラ抗体であることを特徴とする(1)乃至(5)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(8)定常領域がウサギ抗体由来であることを特徴とする、(7)に記載のキメラ抗体、
(9)配列番号19のアミノ酸番号20乃至456に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号21のアミノ酸番号21乃至232に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む(1)乃至(5)、(7)及び(8)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(10)ウサギ化されていることを特徴とする、(1)乃至(5)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の機能性断片、
(12)以下の(a)または(b)に記載の重鎖、及び(c)に記載の軽鎖を含む、(1)乃至(5)及び(10)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片:
(a)配列番号23においてアミノ酸番号20乃至456に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、
(b)配列番号25においてアミノ酸番号20乃至456に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、
(c)配列番号27においてアミノ酸番号21乃至230に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、
(13)配列番号23においてアミノ酸番号20乃至456に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号27においてアミノ酸番号21乃至230に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、(1)乃至(5)及び(10)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(14)配列番号25においてアミノ酸番号20乃至456に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号27においてアミノ酸番号21乃至230に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、(1)乃至(5)及び(10)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(15)Fab、F(ab’)2、Fab’およびFvからなる群から選択される、(1)乃至(14)のいずれか1項に記載の抗体の抗原結合性断片、
(16)scFvであることを特徴とする、(1)乃至(14)のいずれか1項に記載の抗体、
(17)(1)乃至(16)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含む組成物、
(18)(1)乃至(16)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本(以下、単に「標本」という。)中のGPR20の検出または測定方法に使用される、(17)に記載の組成物、
(19)(1)乃至(16)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のGPR20の検出または測定方法に使用される、(17)または(18)に記載の組成物、
(20)GPR20の検出または測定方法が、被検標本においてGPR20が検出もしくは測定されたか、または被検標本におけるGPR20の発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてGPR20が検出もしくは測定されなかったか、または被検標本におけるGPR20の発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、(18)または(19)に記載の組成物、
(22)GPR20陽性疾患の検査または診断方法が、GPR20の検出または測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、GPR20に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むGPR20陽性疾患の治療または予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、GPR20に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むGPR20陽性疾患の治療または予防方法には適していないと判定することを含む、(17)乃至(21)のいずれか1項に記載の組成物、
(23)GPR20陽性疾患がGPR20陽性癌である、(21)または(22)に記載の組成物、
(24)GPR20陽性疾患が消化管間質腫瘍(GIST)である、(21)乃至(23)のいずれか1項に記載の組成物、
(25)下記(a)乃至(c)のいずれか一つに記載の被験者に投与される、GPR20に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を含む医薬組成物:
(a)(17)乃至(19)及び(21)のいずれか1項に記載の組成物を用いてGPR20が検出または測定された被検標本の由来する被験者;
(b)(20)記載の組成物を用いたGPR20の検出または測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者;
(c)(22)または(24)記載の組成物を用いて、GPR20に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むGPR20陽性疾患の治療または予防に適していると判定された被験者、
(26)以下の工程(a)及び(b)を含むGPR20陽性疾患の治療方法:
(a)(1)乃至(16)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片、(17)乃至(19)、(21)に記載の組成物を用いて検体のGPR20を検出または測定する工程;
(b)(a)においてGPR20の発現が検出または測定された検体に由来する被験者に抗GPR20抗体又は該抗体の抗原結合性断片を投与する工程、
(27)(1)乃至(16)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド、
(28)(27)記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
(29)(27)記載のポリヌクレオチドまたは(28)記載のベクターを含む細胞、
(30)下記の工程(a)および(b)を含む、(1)乃至(16)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片の製造方法:
(a)(29)記載の細胞を培養する工程;
(b)工程(a)の培養物からモノクローナル抗体または該抗体の抗原結合性断片を回収する工程。
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖または三本鎖以上のヌクレオチドであり、DNA鎖とRNA鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド(RNA)とデオキシリボヌクレオチド(DNA)が混在するものおよびそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖または三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。本発明の「GPR20遺伝子」としては、例えば、GPR20蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれるDNA、mRNA、cDNA、cRNA等を挙げることができる。
本発明で用いるGPR20は、ヒト、ヒト以外の哺乳動物(例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど)あるいはニワトリのT細胞あるいは肥満細胞から直接精製して使用するか、あるいは上記の細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、GPR20をin vitroにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、GPR20 cDNAを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってGPR20を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
本発明のGPR20に対する抗体は、常法を用いて、GPR20またはGPR20のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原となるGPR20の生物種はヒトに限定されず、サル、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するGPR20を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種GPR20に結合する抗体とヒトGPR20との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。なお、抗原となるGPR20はGPR20遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、GPR20遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したGPR20を精製すればよい。
ある態様において、好適な抗体は、非変性型のヒトGPR20、及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型ヒトGPR20の両方に特異的に結合する。また、より好適な抗体は、非変性型のヒトGPR20、及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型ヒトGPR20の両方に特異的に結合し、かつ他のGPRファミリーに特異的に結合しない抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
本発明は抗GPR20抗体もしくはその機能断片またはその修飾体を含む医薬組成物を提供する。
本発明は抗GPR20抗体もしくはその機能断片またはその修飾体を含む検査用または診断用組成物(以下、まとめて「診断用組成物」という)をも提供する。
組織切片は、好適にはホルマリン固定後にパラフィン包埋処理する。パラフィン包埋後、薄切した組織切片を脱パラフィン処理した後、抗原賦活処理および非特異的反応抑制処理を行う。抗原賦活処理の方法としては、加熱処理、プロテアーゼ等による酵素処理を例示することができ、好適には加熱処理である。加熱処理の条件としては、通常、温度90乃至110℃、pH8乃至10、処理時間20乃至60分の範囲が好適である。pHの調整にはTris−EDTA緩衝液(例えば、1mMのEDTAを含有する10mMトリス緩衝液)等を使用することができる。非特異的反応抑制処理としては、発色に使用する酵素と同様または類似の触媒活性を有する内因性の酵素を不活性化する方法が通常用いられる。ペルオキシダーゼ反応により発色させる場合、予め組織中に存在する内因性のペルオキシダーゼをH2O2等で阻害することが好ましい。H2O2の溶媒は水、メタノール等を使用することができ、H2O2の濃度は0.1乃至3%、好適には0.3乃至3%である。H2O2溶液にはアジ化ナトリウムを添加することができる。また、血清やカゼインによりブロッキングする方法も非特異的反応抑制処理として使用することができる。血清やカゼインは、一次抗体反応の前に組織を処理することができるが、1次抗体を希釈する溶媒に含有せしめることもできる。
本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片またはその修飾体は、試薬としても有用である。かかる試薬は、上述の検査または診断用、研究用およびその他の用途で使用される。
1)−1 ヒトGPR20発現ベクターの構築
ヒトGPR20タンパク質(NP_005284)をコードするcDNAは、当業者に公知な方法に従いヒト脳由来cDNAを鋳型としたPCR法により増幅され、哺乳動物発現用ベクターに組み込むことによってヒトGPR20発現ベクターpcDNA3.1−hGPR20が作製された。ヒトGPR20のアミノ酸配列を配列表の配列番号1に示す。pcDNA3.1−hGPR20プラスミドDNAの大量調製は、EndoFree Plasmid Giga Kit(QIAGEN社)を用いて行った。
免疫には6週齢のWKY/Izmラットの雌(日本エスエルシー社)が使用された。まずラット両足下腿部をHyaluronidase(SIGMA−ALDRICH社)にて前処理後、同部位にヒトGPR20発現ベクターpcDNA3.1−hGPR20が筋肉内注射された。続けて、ECM830(BTX社)を使用し、2ニードル電極を用いて、同部位にインビボ エレクトロポレーションを実施した。二週間に一度、同様のインビボ エレクトロポレーションを繰り返した後、79日目にラットのリンパ節を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
リンパ節細胞とマウスミエローマSP2/0−ag14細胞とをHybrimune Hybridoma Production System(Cyto Pulse Sciences社)を用いて電気細胞融合した後、ClonaCell−HY Selection Medium D(StemCell Technologies社)に懸濁し、希釈して37℃、5% CO2の条件下で培養した。出現した各々のハイブリドーマコロニーは、モノクローンとして回収され、ClonaCell−HY Selection Medium E(StemCell Technologies社)に懸濁して37℃、5% CO2の条件下で培養した。適度に細胞が増殖した後、各々のハイブリドーマ細胞の凍結ストックを作製すると共に、培養上清が回収され、抗GPR20抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングに用いられた。
1)−4−1 Cell−ELISA用抗原遺伝子発現細胞の調製
293α細胞(インテグリンαv及びインテグリンβ3を発現するHEK293由来の安定発現細胞株)を10% FBS含有DMEM培地中5x106細胞/10mLになるよう調製した。Lipofectamine 2000(インビトロジェン社)を用いた形質移入手順に従って、この293α細胞に対して、pcDNA3.1−hGPR20もしくは陰性コントロールとしてpcDNA3.1のDNAを導入し、96−well plate(Corning社)に100μLずつ分注後、10% FBS含有DMEM培地中で37℃、5% CO2の条件下で24から27時間培養した。得られた形質移入細胞を接着状態のまま、Cell−ELISAに使用した。
実施例1)−4−1で調製した発現ベクター導入293α細胞の培養上清を除去後、pcDNA3.1−hGPR20またはpcDNA3.1導入293α細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、4℃で1時間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBS(+)で1回洗浄後、5% FBS含有PBS(+)で500倍に希釈したAnti−Rat IgG−Peroxidase antibody produced in rabbit(SIGMA社)を加えて、4℃で1時間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBS(+)で3回洗浄した後、OPD発色液(OPD溶解液(0.05 M クエン酸3ナトリウム、0.1M リン酸水素2ナトリウム・12水 pH4.5)にo−フェニレンジアミン二塩酸塩(和光純薬社)、H2O2をそれぞれ0.4mg/mL、0.6%(v/v)になるように溶解)を100μL/wellで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、1M HClを100μL/wellで添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー(ENVISION:PerkinElmer社)で490nmの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するヒトGPR20に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールのpcDNA3.1導入293α細胞と比較し、pcDNA3.1−hGPR20発現ベクター導入293α細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ヒトGPR20抗体産生陽性として選択した。
1)−5−1 フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
293T細胞を5×104細胞/cm2になるよう225cm2フラスコ(住友ベークライト社製)に播種し、10% FBS含有DMEM培地中で37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。翌日、pcDNA3.1−hGPR20および陰性コントロールとしてpcDNA3.1をそれぞれ293T細胞にLipofectamine 2000を用いて導入し、37℃、5% CO2の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入293T細胞をTrypLE Express(Life Technologies社製)で処理し、10% FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
実施例1)−4−2のCell−ELISAで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のヒトGPR20に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例1)−5−1で調製した一過性発現293T細胞の懸濁液を遠心し、上清を除去した後、各々に対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG FITC conjugate(SIGMA社製)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、2μg/ml 7−aminoactinomycin D(Molecular Probes社製)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500:BeckmanCoulter社製)で検出を行った。データ解析はFlowjo(TreeStar社製)で行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるpcDNA3.1導入293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しpcDNA3.1−hGPR20導入293T細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしている抗体を産生するハイブリドーマをヒトGPR20に結合する抗体産生ハイブリドーマとして178クローン選択した。図9にヒトGPR20に特異的に結合した抗体の例としてクローン番号04−093、13−001、13−006、13−010、13−040及び13−046、並びに1次抗体を添加していない陰性コントロール(w/o 1stAb)の結果を示す。図9の横軸はクローン番号、縦軸はMFI(mean fluorescence intensity)による抗体結合量を示す。
ヒトGPR20のN末端側48アミノ酸に対する結合性をペプチド−ELISA法により評価した。96−well Maxisorp plate(Nunc社)にPBSで1μg/mLに希釈したNeutrAvidin(Pierce社)を100μL/wellで添加し、4℃で1晩静置した。溶液を除去し、300μL/wellの0.05%Tween20含有PBS(以下PBST)で3回洗浄した後、C末端がビオチン化されたヒトGPR20のN末端側1−48アミノ酸(配列番号29)からなる合成ペプチド1をPBSで10 nMに溶解した溶液を100μL/wellで添加し、室温で1時間静置した。同様にC末端がビオチン化された、GPR20のアミノ酸配列とは異なる配列を有する合成ペプチドを添加したプレートを陰性コントロールとして用意し、以下同様に処理した。プレートから溶液を除去し、PBSTで3回洗浄した後、1%BSA含有PBSを100μL/wellで添加し、室温で1晩静置した。溶液を除去し、PBSTで3回洗浄した後、1%BSA含有PBSで2倍希釈した抗ヒトGPR20抗体産生ハイブリドーマの培養上清を100μL/wellで添加し、室温で1時間静置した。溶液を除去し、PBSTで3回洗浄した後、PBSで500倍希釈したAnti−Rat IgG−Peroxidase antibody produced in rabbit(SIGMA社)を100μL/wellで添加し、室温で1時間静置した。溶液を除去し、PBSTで3回洗浄した後、SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrateを100μl/wellで添加し、室温で10分間静置した後、プレートリーダー(ARVO,PerkinElmer社)で化学発光を測定した。図10にヒトGPR20のN末端側1−48アミノ酸に特異的な結合を示した6種の抗体の典型的な反応例を示す。図10の横軸はクローン番号、縦軸は化学発光量(CPS)による抗体結合量を示す。
ラット抗ヒトGPR20モノクローナル抗体の重鎖のサブクラス、軽鎖のタイプは、RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT(DSファーマバイオメディカル社)により決定された。その結果、04−093、13−001、13−006、13−010、13−040及び13−046は、いずれもIgG2b、κ鎖であることが確認された。また、実施例4に記載の方法と同様の方法により塩基配列を解析した結果、13−001、13−006、13−010、13−040の各抗体のアミノ酸配列は高い相同性を示す配列を有しており、同一のエピトープを認識することが推定された。
ラット抗ヒトGPR20モノクローナル抗体04−093、13−001及び13−046は、ハイブリドーマ培養上清から精製された。
2)−1 GPR20一過性発現293T細胞を用いたGPR20染色性評価
2)−1−1 セルブロックの作製
293T細胞は、Lipofectamine 2000(Life Technologies社)を用いて、pcDNA3.1−hGPR20またはpcDNA3.1(空ベクター)でトランスフェクションされた(GPR20発現293T細胞)。このGPR20発現293T細胞のペレットをホルマリン固定後にパラフィン包埋ブロックとした。同様にpcDNA3.1(空ベクター)をトランスフェクションした293T細胞(コントロール293T細胞)についてもホルマリン固定後にパラフィン包埋ブロックとした。
1)−8で調製したラットモノクローナル抗ヒトGPR20抗体04−093、13−001及び13−046と市販のウサギポリクローナル抗ヒトGPR20抗体のGPR20染色性を比較した。市販の抗体は、いずれもヒトGPR20に由来する合成ペプチドを抗原として作製されており、LS Bio社製のLS−A101(C末端)、LS−A102(N末端)、LS−A103(細胞質ドメイン)、LS−A104(C末端)、LS−B7724(291〜340アミノ酸)、abcam社製のab75559、Novus Biologicals社製のNLS101(C末端)、Santa Cruz Biotechnology社製のsc−87141(N末端)が用いられた。なお、括弧内は各ウサギポリクローナル抗体作製時の免疫に使用された合成ペプチドのGPR20内の部位を示している。
2)−2−1 GIST組織アレイの染色
臨床検体における抗GPR20抗体の染色性をGIST481, Gastrointestinal stromal tumor tissue array, 24 cases/48 cores(US Biomax社製)を用いて検討した。
3)−1 04−093産生ハイブリドーマからのtotal RNAの調製
04−093の重鎖及び軽鎖のシグナル配列と可変領域をコードするcDNAを増幅するため、04−093産生ハイブリドーマよりTRIzol Reagent(Ambion社)を用いてtotal RNAを調製した。
04−093の重鎖のシグナル配列と可変領域をコードするcDNAの増幅は、実施例3)−1で調製したtotal RNAの約1μgとSMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech社)を用いて実施した。04−093の重鎖のシグナル配列と可変領域をコードするcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、UPM (Universal Primer A Mix:SMARTer RACE cDNA Amplification Kitに付属)、及び公知のラット重鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
実施例3)−2と同様の方法で実施した。ただし、04−093の軽鎖のシグナル配列と可変領域をコードするcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、UPM (Universal Primer A Mix:SMARTer RACE cDNA Amplification Kitに付属)、及び公知のラット軽鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
4)−1 抗GPR20抗体04−093のウサギキメラ化体のデザイン
ウサギキメラ化配列は、ウサギの重鎖定常領域IGHG*02とウサギの軽鎖定常領域IGKC2*01をIMGT(登録商標), the international ImMunoGeneTics information system(登録商標)から参照して、クローン04−093のそれぞれの可変領域につなげることで設計した。
ウサギ化抗体の可変領域のアミノ酸配列は、CDRグラフティング(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))によって設計した。可変領域のアミノ酸配列の同一性とウサギgermline配列における中庸さに基づき、重鎖アクセプター配列はIGHV1S7*01とIGHJ3*01を、軽鎖アクセプター配列はIGKV1S39*01とIGKJ1−2*01を選択した。タンパク質立体構造解析プログラムBioLuminate(Schrodinger社製)で構築されたクローン04−093のホモロジーモデルを分析し、アクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基をQueen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))によって与えられる基準などを参考に選択した。重鎖定常領域はウサギのIGHG*02を、軽鎖定常領域はウサギのIGKC1*01を選択した。
4)−2−1 ウサギキメラ化抗GPR20抗体の重鎖発現ベクターの構築
4)−2−1−1 抗体発現ベクターpCMA−LKの構築
プラスミドpcDNA3.3−TOPO/LacZ(Invitrogen社)を制限酵素XbaI及びPmeIで消化して得られる約5.4kbのフラグメントと、配列番号28に示すヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて結合して、pcDNA3.3/LKを作製した。
配列番号18に示すウサギキメラ化抗体重鎖OcHchのアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。配列表の配列番号18に示されるヌクレオチド配列の26乃至82番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、83乃至424番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、425乃至1393番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。
4)−2−2−1 ウサギキメラ化抗体軽鎖OcLch発現ベクターの構築
配列番号20に示すウサギキメラ化抗体軽鎖OcLchのアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。配列表の配列番号20に示されるヌクレオチド配列の26乃至85番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、86乃至406番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は軽鎖可変領域をコードし、407乃至721番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例4)−2−1−2と同様の方法でウサギキメラ化抗体軽鎖OcLchの発現ベクターを構築した。
4)−2−3−1 ウサギ化抗体重鎖OcH01の発現ベクターの構築
配列番号22に示すウサギ化抗体重鎖OcH01のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。配列表の配列番号22に示されるヌクレオチド配列の26乃至82番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、83乃至424番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、425乃至1393番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例4)−2−1−2と同様の方法でウサギ化抗体重鎖OcH01発現ベクターを構築した。
配列番号24に示すウサギ化抗体重鎖OcH02のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。配列表の配列番号24に示されるヌクレオチド配列の26乃至82番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、83乃至424番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、425乃至1393番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例4)−2−1−2と同様の方法でウサギ化抗体重鎖OcH02発現ベクターを構築した。
4)−2−4−1 ウサギ化抗体軽鎖OcL01の発現ベクターの構築
配列番号26に示すウサギ化抗体軽鎖OcL01のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。配列表の配列番号26に示されるヌクレオチド配列の26乃至85番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、86乃至406番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、407乃至721番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例5)−2−1−2と同様の方法でウサギ化抗体軽鎖OcL01発現ベクターを構築した。
4)−2−5−1 リコンビナント抗体の生産
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen社)はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の1.2×109個のFreeStyle 293F細胞(Invitrogen社)を3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING社)に播種し、FreeStyle293 expression medium (Invitrogen社)で希釈して2.0×106細胞/mLに調製した。40mLのOpti−Pro SFM培地(Invitrogen社)に0.24mgの重鎖発現ベクターと0.36mgの軽鎖発現ベクターと1.8mgのPolyethyleneimine(Polyscience #24765)を加えて穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle 293F細胞に添加した。37℃、8%CO2インキュベーターで4時間、90rpmで振とう培養後に600mLのEX−CELL VPRO培地(SAFC Biosciences社)、18mLのGlutaMAX I(GIBCO社)、及び30mLのYeastolate Ultrafiltrate(GIBCO社)を添加し、37℃、8%CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposable Capsule Filter (Advantec #CCS−045−E1H)でろ過した。
実施例4)−2−5−1で得られた培養上清をrProtein Aアフィニティークロマトグラフィーの1段階工程で精製した。培養上清をPBSで平衡化したMabSelectSuReが充填されたカラム(GE Healthcare Bioscience社製)にアプライしたのちに、カラム容量の2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液(pH4.0)で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社、Slide−A−Lyzer Dialysis Cassette)によりPBSへのバッファー置換を行った。Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF10K,Sartorius社)で抗体を濃縮し、IgG濃度を2mg/mLに調製した。最後にMinisart−Plus filter(Sartorius社)でろ過し、精製サンプルとした。
5)−1 GIST細胞株の免疫染色
実施例4)−2−5で作製したウサギキメラ化抗GPR20抗体及びウサギ化抗GPR20抗体の染色性を、GIST細胞株(GIST430、GIST430/654)および陰性対照として前立腺癌細胞株(PC−3)のパラフィン包埋標本を用いて検討した。脱パラフィンおよび抗原賦活はAutostainer Link用前処理システム(PT Link:DAKO社製)を用いて、抗原賦活液(Target Retrieval Solution High pH:DAKO社製)、97℃で40分間実施した。その後の染色作業は自動染色装置(ダコ Autostainer Link48:DAKO社製)を用いて室温で実施した。EnVision FLEX WASH BUFFER(DAKO社製)で1回洗浄した後、Peroxidase Block 3% H2O2(DAKO社製)を加え5分間インキュベートし、EnVision FLEX WASH BUFFERで1回洗浄した。Protein Block serum free(DAKO社製)を加え、30分間インキュベートし、Air blowで液を除去した。ラットモノクローナル抗GPR20抗体あるいはウサギキメラ化抗GPR20抗体及びウサギ化抗GPR20抗体をREAL Antibody Diluent(DAKO社製)で1.0μg/mL〜10μg/mLに希釈し、30分間反応させた。EnVision FLEX WASH BUFFERで3回洗浄後、ラット抗体に対してはHistofine simplestain mouse MAX PO(Rat)#414311(ニチレイバイオサイエンス社製)を、ウサギ抗体に対してはEnVision+ System−HRP Labelled Polymer Anti−Rabbit #K4003(DAKO社製)を加え、いずれも30分インキュベートした後、EnVision FLEX WASH BUFFERで2回洗浄した。
臨床検体におけるウサギキメラ化抗GPR20抗体及びウサギ化抗GPR20抗体の染色性をGIST801, Gastrointestinal stromal tumor tissue array, 80 cases/80 cores(US Biomax社製)を用いて検討した。染色は実施例5)−1と同様の方法で実施した。
6)−1 ペプチドELISAによる結合能評価
以下の合成ペプチドに対するラット抗ヒトGPR20抗体04−093の結合をペプチド−ELISA法により評価した。96−well Maxisorp plate(Nunc社)にPBSで1μg/mLに希釈したNeutrAvidin(Pierce社)を100μL/wellで添加し、4℃で1晩静置した。溶液を除去し、300μL/wellの0.05%Tween20含有PBS(以下PBST)で3回洗浄した後、C末端がビオチン化された、ヒトGPR20のアミノ酸番号1から48番目(配列番号29)からなる合成ペプチド1、ヒトGPR20のアミノ酸番号30から48番目(配列番号30)からなる合成ペプチド2、GPR20のアミノ酸配列とは異なる配列を有する陰性コントロールの合成ペプチドを各々PBSで10 nMに溶解した溶液を100μL/wellで添加し、室温で1時間静置した。プレートから溶液を除去し、PBSTで3回洗浄した後、Blocker Casein in PBS(Thermo Fisher Scientific社)を100μL/wellで添加し、室温で1晩静置した。溶液を除去し、PBSTで3回洗浄した後、Blocker Casein in PBSで1μg/mLに希釈した04−093抗体を100μL/wellで添加し、室温で1時間静置した。溶液を除去し、PBSTで3回洗浄した後、PBSで500倍希釈したAnti−Rat IgG−Peroxidase antibody produced in rabbit(Jackson ImmunoResearch Laboratories社)を100μL/wellで添加し、室温で1時間静置した。溶液を除去し、PBSTで3回洗浄した後、SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrateを100μl/wellで添加し、室温で10分間静置した後、プレートリーダー(SpectraMax M3,Molecular Devices社)で化学発光を測定した。図15に各種抗体の反応例を示す。図15の横軸はクローン番号、縦軸は化学発光量(CPS)による抗体結合量を示す。04−093抗体は、合成ペプチド1及び合成ペプチド2に対して同等の結合活性を示した。一方、他の抗GPR20抗体は、合成ペプチド2に対して結合性を示さなかった。本結果から、04−093抗体はGPR20のアミノ酸番号30から48番目からなるアミノ酸配列(配列番号30:LEVPLFHLFARLDEELHGT)に結合することが示された。
6)−2 GPR20断片ペプチドを用いた結合能評価
エピトープを詳細に解析するため、GPR20のアミノ酸番号29から48番目からなるペプチド、並びに本ペプチドの末端のアミノ酸を一残基ずつ連続的に短縮したペプチドを合成し、N−末端をビオチン化、C−末端をアミド化したものをGPR20断片ペプチドライブラリーとして作製した(シグマ アルドリッチ ジャパン社)。作製したGPR20断片ペプチドと04−093抗体の解離定数は、Octet RED384システム(Pall ForteBio社製)を使用し、GPR20断片ペプチドをリガンドとしてセンサーチップに捕捉、04−093抗体をアナライトとすることで測定した。緩衝液としてPBS−T、センサーチップとしてストレプトアビジンセンサーチップ(Pall ForteBio社製)を用いた。各GPR20断片ペプチドについて、センサーチップを1μg/mLのペプチド溶液に300秒間浸した後、04−093抗体の希釈系列溶液(0.247〜20nMの3倍希釈系列、5濃度)に90秒間浸して結合相をモニターし、引き続き緩衝液に浸して270秒間の解離相をモニターした。各濃度の04−093抗体を測定後は、センサーチップを再生するためにクエン酸緩衝液pH 2.2に20秒間浸し、さらに平衡化のため緩衝液に20秒間浸した。データの解析には1:1結合モデルを用いて、結合速度定数ka、解離速度定数kd及び解離定数(KD;KD=kd/ka)を算出した。
結果を表3に示す。
293T細胞に一過性に発現させたGPR20タンパク質をウエスタンブロッティング法により検出した。293T細胞にLipofectamine 2000(Life Technologies社)を用いて、ヒトGPR20発現ベクターpcDNA3.1−hGPR20、N末端にFLAGタグを付加したヒトGPR20の発現ベクターpFLAG−GPR20並びにpcDNA3.1(空ベクター)を各々導入した。各細胞よりMem−PER Plus Membrane Protein Extraction Kit(ThermoFisher Scientific社)を用いて膜画分のタンパク質溶解液を調製し、BCA protein assay(ThermoFisher Scientific社)を用いてタンパク質濃度を測定した。濃度調整したタンパク質溶液にNuPAGETM LDS Sample Buffer (4X)、NuPAGETM Sample Reducing Agent (10X) (Thermo Fisher Scientific社)を1X濃度となるように添加し、70℃で10分間加熱した後、定法に従いTris /Glysin/SDS bufferを用いたSDS−PAGEで20μg/laneのタンパク質を電気泳動した。泳動後のゲルからImmobilon−FL膜(Millipore社)にタンパク質を転写した。このImmobilon−FL膜をOdyssey Blocking Buffer(LI−COR社)で1時間ブロッキングした後、0.1% Tween20/ Odyssey Blocking Bufferで希釈したウサギキメラ化抗GPR20抗体またはウサギ化抗GPR20抗体の1次抗体反応液中で4℃、一晩振盪した。また、対照としてウサギIgG及びマウス抗FLAG抗体、マウス抗β actin抗体を同様に一次抗体反応液として用いた。SNAP i.d. システム(Millipore社)を用いてTBS−0.1%Tween20バッファーで3回洗浄した後、0.1% Tween20/ Odyssey Blocking Bufferで希釈した2次抗体液(1次抗体がウサギ抗体の場合はIRDye 680CW Goat anti−rabbit IgG、1次抗体がマウス抗体の場合はIRDye 800CW Goat anti−mouse IgGを使用した)で反応させた後、TBS−0.1%Tween20バッファーで2回、TBSで1回洗浄した。蛍光の検出にはOdyssey Infrared Imaging System(LI−COR社)を用いた。図17において、ウサギ化抗GPR20抗体OcH1L1、OcH2L1、ウサギキメラ化抗GPR20抗体OcChimeraは、ヒトGPR20を発現する293T−pcDNA3.1−GPR20細胞またはN末端にFLAGタグを付加したヒトGPR20を発現する293T−pFLAG−GPR20細胞に対して反応性を示し、複数のバンドが検出された。一方、陰性コントロールである293T−pcDNA3.1細胞ではバンドが検出されなかった。また、マウス抗FLAG抗体は293T−pFLAG−GPR20に対してのみ反応性を示し、複数のバンドが検出された。以上の結果より、ウサギキメラ化抗GPR20抗体及びウサギ化抗GPR20抗体はウエスタンブロッティング法によるGPR20の検出に有用であることが示された。
配列番号19: ウサギキメラ化抗体重鎖OcHchのアミノ酸配列
配列番号20:ウサギキメラ化抗体軽鎖OcLchのアミノ酸配列をコードする配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号21: ウサギキメラ化抗体軽鎖OcLchのアミノ酸配列
配列番号22:ウサギ化抗体重鎖OcH01のアミノ酸配列をコードする配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号23: ウサギ化抗体重鎖OcH01のアミノ酸配列
配列番号24:ウサギ化抗体重鎖OcH02のアミノ酸配列をコードする配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号25: ウサギ化抗体重鎖H02のアミノ酸配列
配列番号26:ウサギ化抗体軽鎖OcL01のアミノ酸配列をコードする配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号27:ウサギ化抗体軽鎖OcL01のアミノ酸配列
配列番号28:ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片
配列番号29:合成ペプチド1 ヒトGPR20の1から48番目のアミノ酸配列
(1)配列番号1においてアミノ酸番号1乃至48に示されるアミノ酸配列を含むことからなるペプチドに特異的に結合する抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(2)GPR20への結合に対して、配列番号3のアミノ酸番号20乃至466に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号11のアミノ酸番号20乃至232に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体と競合阻害活性を有する抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(3)LEVPLFHLFARLD(配列番号31)に示されるアミノ酸配列からなるエピトープに結合することを特徴とする(1)又は(2)に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片、
(4)重鎖配列が、配列番号5または8に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号6または9に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、並びに、配列番号7に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を有する可変領域を含み;
軽鎖配列が配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を有する可変領域を含む、(1)乃至(3)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(5)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び、配列番号12に示される軽鎖可変領域を含むことからなる、(1)乃至(4)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(6)配列番号3のアミノ酸番号20乃至466に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖、及び、配列番号11のアミノ酸番号20乃至232に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる(1)乃至(5)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(7)キメラ抗体であることを特徴とする(1)乃至(5)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(8)定常領域がウサギ抗体由来であることを特徴とする、(7)に記載のキメラ抗体、
(9)配列番号19のアミノ酸番号20乃至456に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号21のアミノ酸番号21乃至232に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む(1)乃至(5)、(7)及び(8)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(10)ウサギ化されていることを特徴とする、(1)乃至(5)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(12)以下の(a)または(b)に記載の重鎖、及び(c)に記載の軽鎖を含む、(1)乃至(5)及び(10)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片:
(a)配列番号23においてアミノ酸番号20乃至456に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、
(b)配列番号25においてアミノ酸番号20乃至456に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、
(c)配列番号27においてアミノ酸番号21乃至230に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、
(13)配列番号23においてアミノ酸番号20乃至456に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号27においてアミノ酸番号21乃至230に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、(1)乃至(5)及び(10)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(14)配列番号25においてアミノ酸番号20乃至456に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号27においてアミノ酸番号21乃至230に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、(1)乃至(5)及び(10)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
(15)Fab、F(ab’)2、Fab’およびFvからなる群から選択される、(1)乃至(14)のいずれか1項に記載の抗体の抗原結合性断片、
(16)scFvであることを特徴とする、(1)乃至(14)のいずれか1項に記載の抗体、
(17)(1)乃至(16)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含む組成物、
(18)(1)乃至(16)のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本(以下、単に「標本」という。)中のGPR20の検出または測定方法に使用される、(17)に記載の組成物、
(19)(1)乃至(16)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のGPR20の検出または測定方法に使用される、(17)または(18)に記載の組成物、
(20)GPR20の検出または測定方法が、被検標本においてGPR20が検出もしくは測定されたか、または被検標本におけるGPR20の発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてGPR20が検出もしくは測定されなかったか、または被検標本におけるGPR20の発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、(18)または(19)に記載の組成物、
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖または三本鎖以上のヌクレオチドであり、DNA鎖とRNA鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド(RNA)とデオキシリボヌクレオチド(DNA)が混在するものおよびそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖または三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。本発明の「GPR20遺伝子」としては、例えば、GPR20蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれるDNA、mRNA、cDNA、cRNA等を挙げることができる。
2)−1 GPR20一過性発現293T細胞を用いたGPR20染色性評価
2)−1−1 セルブロックの作製
293T細胞は、Lipofectamine 2000(Life Technologies社)を用いて、pcDNA3.1−hGPR20またはpcDNA3.1(空ベクター)でトランスフェクションされた。このGPR20発現293T細胞のペレットをホルマリン固定後にパラフィン包埋ブロックとした。同様にpcDNA3.1(空ベクター)をトランスフェクションした293T細胞(コントロール293T細胞)についてもホルマリン固定後にパラフィン包埋ブロックとした。
配列番号18に示すウサギキメラ化抗体重鎖OcHchのアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。配列表の配列番号18に示されるヌクレオチド配列の26乃至82番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、83乃至424番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、425乃至1393番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。
4)−2−2−1 ウサギキメラ化抗体軽鎖OcLch発現ベクターの構築
配列番号20に示すウサギキメラ化抗体軽鎖OcLchのアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。配列表の配列番号20に示されるヌクレオチド配列の26乃至85番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、86乃至406番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は軽鎖可変領域をコードし、407乃至721番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例4)−2−1−2と同様の方法でウサギキメラ化抗体軽鎖OcLchの発現ベクターを構築した。
4)−2−3−1 ウサギ化抗体重鎖OcH01の発現ベクターの構築
配列番号22に示すウサギ化抗体重鎖OcH01のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。配列表の配列番号22に示されるヌクレオチド配列の26乃至82番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、83乃至424番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、425乃至1393番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例4)−2−1−2と同様の方法でウサギ化抗体重鎖OcH01発現ベクターを構築した。
配列番号24に示すウサギ化抗体重鎖OcH02のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。配列表の配列番号24に示されるヌクレオチド配列の26乃至82番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、83乃至424番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、425乃至1393番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例4)−2−1−2と同様の方法でウサギ化抗体重鎖OcH02発現ベクターを構築した。
4)−2−4−1 ウサギ化抗体軽鎖OcL01の発現ベクターの構築
配列番号26に示すウサギ化抗体軽鎖OcL01のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。配列表の配列番号26に示されるヌクレオチド配列の26乃至85番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、86乃至406番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は軽鎖可変領域をコードし、407乃至721番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例5)−2−1−2と同様の方法でウサギ化抗体軽鎖OcL01発現ベクターを構築した。
293T細胞に一過性に発現させたGPR20タンパク質をウエスタンブロッティング法により検出した。293T細胞にLipofectamine 2000(Life Technologies社)を用いて、ヒトGPR20発現ベクターpcDNA3.1−hGPR20、N末端にFLAGタグを付加したヒトGPR20の発現ベクターpFLAG−GPR20並びにpcDNA3.1(空ベクター)を各々導入した。各細胞よりMem−PER Plus Membrane Protein Extraction Kit(ThermoFisher Scientific社)を用いて膜画分のタンパク質溶解液を調製し、BCA protein assay(ThermoFisher Scientific社)を用いてタンパク質濃度を測定した。濃度調整したタンパク質溶液にNuPAGETM LDS Sample Buffer (4X)、NuPAGETM Sample Reducing Agent (10X) (Thermo Fisher Scientific社)を1X濃度となるように添加し、70℃で10分間加熱した後、定法に従いTris /Glycine/SDS bufferを用いたSDS−PAGEで20μg/laneのタンパク質を電気泳動した。泳動後のゲルからImmobilon−FL膜(Millipore社)にタンパク質を転写した。このImmobilon−FL膜をOdyssey Blocking Buffer(LI−COR社)で1時間ブロッキングした後、0.1% Tween20/ Odyssey Blocking Bufferで希釈したウサギキメラ化抗GPR20抗体またはウサギ化抗GPR20抗体の1次抗体反応液中で4℃、一晩振盪した。また、対照としてウサギIgG及びマウス抗FLAG抗体、マウス抗β actin抗体を同様に一次抗体反応液として用いた。SNAP i.d. システム(Millipore社)を用いてTBS−0.1%Tween20バッファーで3回洗浄した後、0.1% Tween20/ Odyssey Blocking Bufferで希釈した2次抗体液(1次抗体がウサギ抗体の場合はIRDye 680CW Goat anti−rabbit IgG、1次抗体がマウス抗体の場合はIRDye 800CW Goat anti−mouse IgGを使用した)で反応させた後、TBS−0.1%Tween20バッファーで2回、TBSで1回洗浄した。蛍光の検出にはOdyssey Infrared Imaging System(LI−COR社)を用いた。図17において、ウサギ化抗GPR20抗体OcH1L1、OcH2L1、ウサギキメラ化抗GPR20抗体OcChimeraは、ヒトGPR20を発現する293T−pcDNA3.1−GPR20細胞またはN末端にFLAGタグを付加したヒトGPR20を発現する293T−pFLAG−GPR20細胞に対して反応性を示し、複数のバンドが検出された。一方、陰性コントロールである293T−pcDNA3.1細胞ではバンドが検出されなかった。また、マウス抗FLAG抗体は293T−pFLAG−GPR20に対してのみ反応性を示し、複数のバンドが検出された。以上の結果より、ウサギキメラ化抗GPR20抗体及びウサギ化抗GPR20抗体はウエスタンブロッティング法によるGPR20の検出に有用であることが示された。
配列番号19: ウサギキメラ化抗体重鎖OcHchのアミノ酸配列
配列番号20:ウサギキメラ化抗体軽鎖OcLchのアミノ酸配列をコードする配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号21: ウサギキメラ化抗体軽鎖OcLchのアミノ酸配列
配列番号22:ウサギ化抗体重鎖OcH01のアミノ酸配列をコードする配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号23: ウサギ化抗体重鎖OcH01のアミノ酸配列
配列番号24:ウサギ化抗体重鎖OcH02のアミノ酸配列をコードする配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号25: ウサギ化抗体重鎖OcH02のアミノ酸配列
配列番号26:ウサギ化抗体軽鎖OcL01のアミノ酸配列をコードする配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号27:ウサギ化抗体軽鎖OcL01のアミノ酸配列
配列番号28:ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片
配列番号29:合成ペプチド1 ヒトGPR20の1から48番目のアミノ酸配列
Claims (30)
- 配列番号1においてアミノ酸番号1乃至48に示されるアミノ酸配列を含むことからなるペプチドに特異的に結合する抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
- GPR20への結合に対して、配列番号3のアミノ酸番号20乃至466に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号11のアミノ酸番号20乃至232に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体と競合阻害活性を有する抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
- LEVPLFHLFARLD(配列番号31)に示されるアミノ酸配列からなるエピトープに結合することを特徴とする請求項1又は2に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
- 重鎖配列が、配列番号5または8に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号6または9に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2、並びに、配列番号7に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3を有する可変領域を含み;
軽鎖配列が配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2、及び配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3を有する可変領域を含む、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。 - 配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び、配列番号12に示される軽鎖可変領域を含むことからなる、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
- 配列番号3のアミノ酸番号20乃至466に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖、及び、配列番号11のアミノ酸番号20乃至232に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる請求項1乃至5のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
- キメラ抗体であることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
- 定常領域がウサギ抗体由来であることを特徴とする、請求項7に記載のキメラ抗体。
- 配列番号19のアミノ酸番号20乃至456に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号21のアミノ酸番号21乃至232に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む請求項1乃至5、7及び8のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
- ウサギ化されていることを特徴とする、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の機能性断片。
- ヒト化されていることを特徴とする、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の機能性断片。
- 以下の(a)または(b)に記載の重鎖、及び(c)に記載の軽鎖を含む、請求項1乃至5及び10のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片:
(a)配列番号23においてアミノ酸番号20乃至456に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、
(b)配列番号25においてアミノ酸番号20乃至456に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、
(c)配列番号27においてアミノ酸番号21乃至230に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖。 - 配列番号23においてアミノ酸番号20乃至456に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号27においてアミノ酸番号21乃至230に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、請求項1乃至5及び10のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
- 配列番号25においてアミノ酸番号20乃至456に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号27においてアミノ酸番号21乃至230に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、請求項1乃至5及び10のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
- Fab、F(ab’)2、Fab’およびFvからなる群から選択される、請求項1乃至14のいずれか1項に記載の抗体の抗原結合性断片。
- scFvであることを特徴とする、請求項1乃至14のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求項1乃至16のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含む組成物。
- 請求項1乃至16のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本(以下、単に「標本」という。)中のGPR20の検出または測定方法に使用される、請求項17に記載の組成物。
- 請求項1乃至16のいずれか1項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のGPR20の検出または測定方法に使用される、請求項17または18に記載の組成物。
- GPR20の検出または測定方法が、被検標本においてGPR20が検出もしくは測定されたか、または被検標本におけるGPR20の発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてGPR20が検出もしくは測定されなかったか、または被検標本におけるGPR20の発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、請求項18または19に記載の組成物。
- GPR20陽性疾患の検査または診断方法に使用される、請求項17乃至20のいずれか1項に記載の組成物。
- GPR20陽性疾患の検査または診断方法が、GPR20の検出または測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、GPR20に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むGPR20陽性疾患の治療または予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、GPR20に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むGPR20陽性疾患の治療または予防方法には適していないと判定することを含む、請求項17乃至21のいずれか1項に記載の組成物。
- GPR20陽性疾患がGPR20陽性癌である、請求項21または22に記載の組成物。
- GPR20陽性疾患が消化管間質腫瘍(GIST)である、請求項21乃至23のいずれか1項に記載の組成物。
- 下記(a)乃至(c)のいずれか一つに記載の被験者に投与される、GPR20に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を含む医薬組成物:
(a)請求項17乃至19及び21のいずれか1項に記載の組成物を用いてGPR20が検出または測定された被検標本の由来する被験者;
(b)請求項20記載の組成物を用いたGPR20の検出または測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者;
(c)請求項22または24記載の組成物を用いて、GPR20に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むGPR20陽性疾患の治療または予防に適していると判定された被験者。 - 以下の工程(a)及び(b)を含むGPR20陽性疾患の治療方法:
(a)請求項1乃至16のいずれか1項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片、請求項17乃至19、21に記載の組成物を用いて検体のGPR20を検出または測定する工程;
(b)(a)においてGPR20の発現が検出または測定された検体に由来する被験者に抗GPR20抗体又は該抗体の抗原結合性断片を投与する工程。 - 請求項1乃至16のいずれか1項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項27記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項27記載のポリヌクレオチドまたは請求項28記載のベクターを含む細胞、
- 下記の工程(a)および(b)を含む、請求項1乃至16のいずれか1項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片の製造方法:
(a)請求項29記載の細胞を培養する工程;
(b)工程(a)の培養物からモノクローナル抗体または該抗体の抗原結合性断片を回収する工程。
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