WO2013113702A1 - Forensisches verfahren - Google Patents

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WO2013113702A1
WO2013113702A1 PCT/EP2013/051694 EP2013051694W WO2013113702A1 WO 2013113702 A1 WO2013113702 A1 WO 2013113702A1 EP 2013051694 W EP2013051694 W EP 2013051694W WO 2013113702 A1 WO2013113702 A1 WO 2013113702A1
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protein
organ
skeletal muscle
myosin
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PCT/EP2013/051694
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Sascha Dammeier
Heinz-Dieter Wehner
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Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum
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    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue

Definitions

  • the present invention relates to a forensic method for identifying an penetrated by a corpus delicti organ.
  • the object of the invention is to provide a forensic method for identifying a body penetrated by a corpus delicti, with which the disadvantages of the prior art are at least partially avoided.
  • a forensic method should be provided, which is characterized by high specificity and analytical safety.
  • a corpus delicti is understood to mean an object or object of the crime. Examples include slash, stab or firearms and firearms projectiles etc.
  • total protein profile is understood to mean a pattern representing all proteins of the biological material.
  • organ-specific protein signature is understood as meaning a pattern which represents at least one or more proteins which can be assigned to a specific organ. Such proteins are referred to as “organ-specific proteins” according to the invention.
  • Organ-specific proteins are known to the person skilled in the art and are described, for example, in WO 2008/021290. This document further describes methods for detecting such organ-specific proteins. The content of this publication is incorporated herein by reference.
  • the inventive method has the advantage that can be searched with high accuracy for a variety of different organ-specific protein signatures, without the availability of antibodies is required.
  • the investigation is based on a total protein profile of the biological material.
  • This can be systematically analyzed on a variety of different organs without the need for recourse to the biological material.
  • the method according to the invention starts with relatively small amounts of biological material.
  • the identification of an organ-specific protein signature leads to a higher specificity and greater analytical safety than when using immunocytochemical methods.
  • the organ-specific protein signature is a brain-specific, heart-specific, liver-specific, lung-specific, kidney-specific and / or skeletal muscle-specific protein signature. This measure has the advantage that by means of said protein signatures an assignment of the biological material to the most important organs from a forensic point of view is made possible.
  • the organ-specific protein signature at least 2, preferably 3, more preferably 4, more preferably 5, more preferably 6, further preferably 7, further preferably 8, more preferably 9, further preferably 10, or includes more organ-specific proteins.
  • This measure has the advantage that with increasing number of organ-specific proteins of the protein signature an increasing specificity is achieved.
  • the process according to the invention thus leads to even greater analytical safety.
  • the a. brain-specific protein signature comprises brain-specific proteins selected from the group consisting of: myelin basic protein (MBP), myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), myelin-associated oligodendrocyte basic glycoprotein (MOBP) and the AT1A3 Na / K ATPase Alpha-3 subunit, and / or the b.
  • MBP myelin basic protein
  • MOG myelin oligodendrocyte glycoprotein
  • MOBP myelin-associated oligodendrocyte basic glycoprotein
  • AT1A3 Na / K ATPase Alpha-3 subunit and / or the b.
  • cardiac-specific protein signature includes cardiac-specific proteins selected from the group consisting of myosin-binding protein C (MYBPC3), troponin C (TNNC1), myosin-regulatory light chain 2 (MYL2) ventricular / myocardial isoform, troponin I (TNNI3), AT1A1 Na / K ATPase alpha 1 subunit (AT1A1), creatine kinase S- Type (KCRS), citrate synthase (CISY) and isocitrate dehydrogenase (IDHP), and / or the c.
  • MYBPC3 myosin-binding protein C
  • TNNC1 troponin C
  • MYL2 myosin-regulatory light chain 2
  • TNNI3 troponin I
  • AT1A1 Na / K ATPase alpha 1 subunit AT1A1
  • KCRS creatine kinase S- Type
  • CISY citrate synthase
  • liver-specific protein signature comprises liver-specific proteins selected from the group consisting of: aspartate aminotransferase (AATM), 4-aminobutyrate aminotransferase (GABT), serine pyruvate aminotransferase (SPYA), alcohol dehydrogenase (ADH), carbamoyl phosphate synthase (CPSM), glycogen phosphorylase ( PYGL), copper transport protein (ATOX1), phospholysine phosphohistidine, inorganic pyrophosphate phosphatase (LHPP), proteasome subunit alpha type 2 (PSMA2), proteasome subunit alpha type 6 (PSMA6), glycine N-acyltransferase (GLYAT), glycinamidinotransferase ( GATM), arginase 1 (ARGI 1), prostaglandin F-synthase (PGFS), prostaglandin reductase (PTGR1) and argininosuccinate lya
  • lung-specific protein signature comprises lung-specific proteins selected from the group consisting of: lung surfactant-associated protein A1 (SFPA1), lung surfactant associated with protein A2 (SFPA2), lung surfactant associated with protein B (PSPB), cathelicin antimicrobial peptide (CAMP ), Annexin A1 / A3 / A2 (ANXA), transgelin-2 (TAGLN), histones H1, H2b, H4 (H2, H4), 14-3-3beta / alpha / delta (1433B), and / or the e.
  • SFPA1 lung surfactant-associated protein A1
  • SFPA2 lung surfactant associated with protein A2
  • PSPB lung surfactant associated with protein B
  • CAMP cathelicin antimicrobial peptide
  • ANXA Annexin A1 / A3 / A2
  • TAGLN transgelin-2
  • skeletal muscle specific protein signature includes skeletal muscle specific proteins selected from the group consisting of: actin / alpha skeletal muscle (ACTA), troponin C / skeletal muscle (TNNC), troponin T / fast skeletal muscle (TNNT), myosin light chain 1/3 Skeletal muscle isoform (MLC), myosin-regulatory-light-chain-2-skeletal muscle isoform (MLRS), myosin-1 (MYH1), myosin-2 (MYH2), fructose-biphosphate aldolase C (ALDOC), fructose-biphosphate aldolase A (ALDO), myoglobin (MYG), and / or the f.
  • actin / alpha skeletal muscle ACTA
  • TNNC troponin C / skeletal muscle
  • TNNT troponin T / fast skeletal muscle
  • MLC myosin light chain 1/3 Skeletal muscle isoform
  • MLC myosin-regulatory-light-chain-2-
  • kidney-specific protein signature comprises kidney-specific proteins selected from the group consisting of: acidceramidase (ASAH1), glycinamidinotransferase (GATM), chloride intracellular channel protein (CLIC4), transketolase (TKT), voltage-dependent anion-selective channel (VDAC), aquaporin 1 (AQP1).
  • ASAH1 acidceramidase
  • GTM glycinamidinotransferase
  • CLIC4 chloride intracellular channel protein
  • TKT transketolase
  • VDAC voltage-dependent anion-selective channel
  • AQP1 aquaporin 1
  • This measure has the advantage that, depending on the organ, those proteins are analyzed which enable a highly specific assignment of the biological material.
  • steps 2 and 3 are carried out by means of mass spectrometric analysis.
  • This measure has the advantage that an established method in protein analysis is used with which can be determined with high specificity and largely automated a variety of organ-specific protein signatures.
  • the total protein profile of the biological material in step 2 is established as follows:
  • the extensive database of established bioinformatics databases is used to determine the proteins contained in the biological material based on the generated mass spectra.
  • the creation of a single protein identifying pattern is automated using suitable software such as Mascot (Matrix Sciences). By obtaining a single protein-identifying pattern, the initial situation is created for the subsequent determination of the organ-specific protein signature.
  • suitable protein databases are UniProt, Swiss-Prot, TrEMBL and Protein Information Resource (PIR).
  • the individual proteins identifying pattern is analyzed for the presence of organ-specific protein signature.
  • the determination of the organ-specific protein signature is realized in an advantageous manner.
  • the identification is again automated, for example. Using the Mascot software.
  • the present invention also relates to the use of an organ-specific protein signature of a biological material in contact with a corpus delicti to identify an organ penetrated by the corpus delicti.
  • Fig. 1 shows the organ and tissue specific mRNA expression profiles of
  • Fig. 2 shows the result of a preliminary experiment in which a projectile sample, which has previously penetrated human heart tissue, was analyzed by means of the method according to the invention.
  • FIG. 3 shows the result of an experiment in which allied projectile samples, which had previously penetrated different tissues, were analyzed by means of the method according to the invention.
  • organ-specific proteins with specificities or primary specificities for the organs heart, liver, lung, skeletal muscle and kidney. References are also given in which the respective organ specificity is described. Furthermore, the short name (“accession number”) used in the databases and a secondary specificity described in the literature are given for the particular organ-specific protein.
  • a firearm projectile was mechanically pushed through a human heart as part of an autopsy.
  • the projectile was stored in a sample bag and stored at -20 ° C until further processing.
  • the metal ball was removed and subjected to proteolytic cleavage using the protease trypsin in a suitable plastic tube.
  • proteolytic cleavage using the protease trypsin in a suitable plastic tube.
  • first a reduction with dithiothreitol and then an alkylation with iodoacetamide were carried out in solution before the protease was added and incubated at 37 ° C. overnight. Due to adhering tissue residues, the inside of the sample bag became also added with the reagents for tryptic cleavage and treated as the metal ball.
  • the reaction was stopped by acidification with trifluoroacetic acid (final concentration: 5%) and the resulting peptide solutions were centrifuged off. A portion of the supernatants was after enrichment via Stage Tips (Proxeon) on an Acclaim PepMap RSLC 75 ⁇ x 25 cm C18 2 ⁇ 100 A chromatographically separated on an UltiMate 3000 nano-HPLC system (Dionex).
  • the enriched and chromatographically separated supernatants of the peptide solutions were measured online in an LTQ Orbitrap mass spectrometer (Thermo Fischer Scientific). In each case, the 10 most intense masses of a filling cycle were automatically selected for fragmentation. The fragmentation was carried out by means of the collision induced decay (CI) method. The masses which appeared in the fragment spectra were compared in combination with the corresponding parent masses by applying the Mascot search algorithm (Matrix Science) with the theoretical protein and peptide mass parameters from the SwissProt database and the results were analyzed using the Scaffold Software (Proteome Software Inc .) visualized. The result is a total protein profile in the form of so-called hit lists or hit lists, in which the protein identifications are weighted according to their reliability or non-random occurrence
  • the protein identifications obtained were screened for cardiac-specific proteins. These are either known from physiological textbook literature, for example by taking into account the particular muscle function of the heart, or were filtered out by comparison with expression databases, eg the Gene Expression Atlas, maintained by the European Institute of Bioinformatics and accessible via UniProt.
  • Fig. 1 the mRNA expression patterns of the four proteins that are mainly for the heart-specific signature responsible.
  • TNNI3, Fig. 1 D the specific signature of proteins which occur almost exclusively in heart tissues such as myosin-binding protein C (MYPC3, Fig. 1A) and troponin I (TNNI3, Fig. 1 D), and of those proteins which may have Sekundarspezifitaten how troponin C (TNNC1, Figure 1B) and myosin regulatory light chain 2 (MLRV, Figure 1C) is formed.
  • FIG. 2 Shown is the analyzed cardiac-specific protein signature, consisting of the four proteins myosin-binding protein C (MYPC3), troponin C (TNNC1), myosin-regulatory light chain 2 (MLRV) and troponin I (TNNI3).
  • MYPC3 myosin-binding protein C
  • TNNC1 troponin C
  • MLRV myosin-regulatory light chain 2
  • TNNI3 troponin I
  • the enriched and chromatographically separated supernatants of the peptide solutions were measured online in an LTQ Orbitrap mass spectrometer (Thermo Fischer Scientific). In each case, the 10 most intense masses of a filling cycle were automatically selected for fragmentation. The fragmentation was carried out by means of the collision induced decay (CI) method. The masses which appeared in the fragment spectra were compared in combination with the corresponding parent masses by applying the Mascot search algorithm (Matrix Science) with the theoretical protein and peptide mass parameters from the SwissProt database and the results were analyzed using the Scaffold Software (Proteome Software Inc .) visualized. The result is a total protein profile in the form of so-called hit lists or hit lists, in which the protein identifications are weighted according to their reliability or non-random occurrence.
  • CI collision induced decay
  • the inventors have succeeded in providing a forensic method for identifying a penetrated by a Corpus Delicti organ, which is characterized by high specificity, ease of use and a very high hit rate.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein forensisches Verfahren zur Identifizierung eines durch einen Corpus Delicti penetrierten Organs.

Description

Forensisches Verfahren
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein forensisches Verfahren zur Identifizierung eines durch einen Corpus Delicti penetrierten Organs.
[0002] In der forensischen Untersuchung von Verbrechensopfern ist es von zentraler Wichtigkeit, mit hoher Sicherheit nachweisen zu können, welche Verletzungen durch ein Objekt, wie bspw. Hieb-, Stich- oder Schusswaffen, verursacht wurden, insbesondere wenn diese Verletzung zum Tode des Opfers führte. Dies gilt insbesondere für die Rekonstruktion des Tatherganges in dem Fall, in dem das Verbrechensopfer durch mehrere Objekte verletzt und ggf. getötet wurde. Hier gilt es nachzuweisen, durch welches Objekt die tödliche Verletzung verursacht wurde.
[0003] Durch moderne molekularbiologische Methoden ist es möglich, genetisches Material, das auf einem Objekt verblieben sind, der verletzten oder getöteten Person zuzuordnen. Es ist jedoch nicht oder nur schwerlich möglich, dieses Material akkurat einem bestimmten Organ zuzuordnen.
[0004] Bei den im Stand der Technik beschriebenen forensischen Verfahren handelt es sich in der Regel um immuncytochemische Untersuchungen. So beschreiben Wehner et al. (2008), Immunocytochemical examinations of biological traces on expan- ding bullets (QD-PEP), Forensic Science International 182, Seiten 66-70, dass auf einem Projektil anhaftendes Gewebes aus einem Schwein, erfolgreich dem Herzen und der Leber zugeordnet werden konnte. Der Nachweis erfolgte durch die Verwendung eines für Hepatocytenmitochondrien spezifischen Antikörpers mit der Bezeichnung HepPar 1 und eines für Herztroponin 1 spezifischen Antikörpers mit der Bezeichnung DAKO. Dieses Verfahren hat jedoch den grundsätzlichen Nachteil, dass es von der Verfügbarkeit von hochselektiven Antikörpern abhängt. Außerdem muss für jede organspezifische Analyse auf das biologische Material zurückgegriffen werden. Dies erfordert größeren experimen- teilen Aufwand und bereitet dann Schwierigkeiten, wenn nur geringe Mengen des biologischen Materials zur Verfügung stehen. Ferner hat sich herausgestellt, dass das bekannte Verfahren fehleranfällig ist und eine sichere Zuordnung des auf dem Projektil anhaftenden Gewebes zu einem penetrierten Organ häufig nicht mit ausreichender Sicherheit möglich ist. Dadurch wird die kriminalistische Aufklärungsarbeit erschwert und kann letztlich dazu führen, dass eine Täteridentifizierung nicht möglich ist.
[0005] Vor diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein forensisches Verfahren zur Identifizierung eines durch einen Corpus Delicti penetrierten Organs bereitzustellen, mit dem die Nachteile aus dem Stand der Technik zumindest teilweise vermieden werden. Insbesondere soll ein solches forensisches Verfahren bereitgestellt werden, das sich durch hohe Spezifität und analytische Sicherheit auszeichnet.
[0006] Diese Aufgabe wird durch ein forensisches Verfahren gelöst, das folgende Schritte aufweist:
1 ) Bereitstellung von sich mit dem Corpus Delicti in Kontakt befundenem biologischem Material,
2) Erstellung eines Gesamtproteinprofils des biologischen Materials,
3) Analyse des Gesamtproteinprofils auf eine organspezifische Proteinsignatur,
4) Identifizierung des durch den Corpus Delicti penetrierten Organs bei
Vorhandensein eines organspezifischen Proteinprofils.
[0007] Erfindungsgemäß wird unter einem Corpus Delicti ein Gegenstand bzw. Objekt des Verbrechens verstanden. Beispiele hierfür sind Hieb-, Stich- oder Schusswaffen bzw. Schusswaffenprojektile etc. [0008] Unter "Gesamtproteinprofil" wird erfindungsgemäß ein sämtliche Proteine des biologischen Materials repräsentierendes Muster verstanden.
[0009] Erfindungsgemäß wird unter "organspezifischer Proteinsignatur" ein solches Muster verstanden, das zumindest ein oder mehrere Proteine repräsentiert, die einem bestimmten Organ zugewiesen werden können. Derartige Proteine werden erfindungsgemäß als "organspezifische Proteine" bezeichnet.
[0010] Organspezifische Proteine sind dem Fachmann bekannt und werden bspw. in der WO 2008/021290 beschrieben. Dieses Dokument beschreibt ferner Verfahren zur Ermittlung derartiger organspezifischer Proteine. Der Inhalt dieser Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Offenbarung.
[0011] Es versteht sich, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht nur ein Organ sondern mehrere durch einen Corpus Delicti penetrierte Organe identifiziert werden können. Die singuläre Form wird lediglich aus Gründen der besseren Lesbarkeit gewählt.
[0012] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
[0013] Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass mit hoher Genauigkeit nach einer Vielzahl von verschiedenen organspezifischen Proteinsignaturen gesucht werden kann, ohne dass die Verfügbarkeit von Antikörpern erforderlich ist. Die Untersuchung geht dabei von einem Gesamtproteinprofil des biologischen Materials aus. Dieses kann systematisch auf eine Vielzahl von verschiedenen Organen analysiert werden, ohne dass ein Rückgriff auf das biologische Material erforderlich ist. Dadurch kommt das erfindungsgemäße Verfahren mit relativ geringen Mengen von biologischem Material aus. Die Ermittlung einer organspezifischen Proteinsignatur führt zu einer höheren Spezifität und größeren analytischen Sicherheit als bei der Verwendung immuncyto- chemischer Verfahren. [0014] Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn es sich bei der organspezifischen Proteinsignatur um eine gehirnspezifische, herzspezifische, leberspezifische, lungenspezifische, nierenspezifische und/oder skelettmuskelspezifische Proteinsignatur handelt. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass mittels der genannten Proteinsignaturen eine Zuordnung des biologischen Materials zu den aus forensischer Sicht wichtigsten Organen ermöglicht wird.
[0015] Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn die organspezifische Proteinsignatur zumindest 2, vorzugsweise 3, weiter bevorzugt 4, weiter bevorzugt 5, weiter bevorzugt 6, weiter bevorzugt 7, weiter bevorzugt 8, weiter bevorzugt 9, weiter bevorzugt 10, oder mehr organspezifische Proteine umfasst.
[0016] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass mit zunehmender Anzahl von organspezifischen Proteinen der Proteinsignatur eine zunehmende Spezifität erreicht wird. Das erfindungsgemäße Verfahren führt damit zu noch größerer analytischer Sicherheit.
[0017] Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es weiter bevorzugt, wenn die a. gehirnspezifische Proteinsignatur gehirnspezifische Proteine umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Myelin-Basisches Protein (MBP), Myelin-Oligodendrocyt-Glycoprotein (MOG), Myelinassoziiertes Oligodendrocyt-Basisches Glycoprotein (MOBP) und der AT1A3-Na/K-ATPase-Alpha-3-Untereinheit, und/oder die b. herzspezifische Proteinsignatur herzspezifische Proteine umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Myosin-Bindeprotein C (MYBPC3), Troponin C (TNNC1 ), Ventrikuläre/Herzmuskelisoform der Myosin-Regulatorischen Leichten Kette 2 (MYL2), Troponin I (TNNI3), AT1A1 -Na/K-ATPase-Alpha-1 -Untereinheit (AT1A1 ), Kreatinkinase S- Typ (KCRS), Citratsynthase (CISY) und Isocitratdehydrogenase (IDHP), und/oder die c. leberspezifische Proteinsignatur leberspezifische Proteine umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Aspartataminotrans- ferase (AATM), 4-Aminobutyrataminotransferase (GABT), Serinpyruvat- aminotransferase (SPYA), Alkoholdehydrogenase (ADH), Carbamoylp- hosphatsynthase (CPSM), Glycogenphosphorylase (PYGL), Kupfertransportprotein (ATOX1 ), Phospholysin-Phosphohistidine anorganische Pyrophosphatphosphatase (LHPP), Proteasom-Untereinheit-Alpha Typ 2 (PSMA2), Proteasom-Untereinheit-Alpha Typ 6 (PSMA6), Glycin-N- Acyltransferase (GLYAT), Glycinamidinotransferase (GATM), Arginase 1 (ARGI 1 ), Prostaglandin-F-synthase (PGFS), Prostaglandinreduktase (PTGR1 ) und Argininosuccinatlyase (ARLY), und/oder die d. lungenspezifische Proteinsignatur lungenspezifische Proteine umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Lungensurfactan- tassoziiertes Protein A1 (SFPA1 ), Lungensurfactantassoziiert.es Protein A2 (SFPA2), Lungensurfactantassoziiert.es Protein B (PSPB), Cathelici- din-antimikrobielles Peptid (CAMP), Annexin A1/A3/A2 (ANXA), Trans- gelin-2 (TAGLN), Histone H1 , H2b, H4 (H2, H4), 14-3-3 beta/alpha/delta (1433B), und/oder die e. skelettmuskelspezifische Proteinsignatur skelettmuskelspezifische Proteine umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Actin/alpha Skelettmuskel (ACTA), Troponin C/Skelettmuskel (TNNC), Troponin T/schneller Skelettmuskel (TNNT), Myosin-leichte-Kette-1/3- Skelettmuskelisoform (MLC), Myosin-regulatorische-leichte-Kette-2- Skelettmuskelisoform (MLRS), Myosin-1 (MYH1 ), Myosin-2 (MYH2), Fructose-Biphosphat-Aldolase C (ALDOC), Fructose-Biphosphat- Aldolase A (ALDO), Myoglobin (MYG) , und/oder die f. nierenspezifische Proteinsignatur nierenspezifische Proteine umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Acidceramidase (ASAH1 ), Glycinamidinotransferase (GATM), Chlorid-intrazelluläres Kanalprotein (CLIC4), Transketolase (TKT), Spannungsabhängiger anio- nenselektiver Kanal (VDAC), Aquaporin 1 (AQP1 ).
[0018] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass je nach Organ solche Proteine analysiert werden, die eine hochspezifische Zuordnung des biologischen Material ermöglichen.
[0019] Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn die Schritte 2 und 3 mittels massenspektrometrischer Analyse durchgeführt werden.
[0020] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein in der Proteinanalytik etabliertes Verfahren zum Einsatz kommt, mit dem sich mit hoher Spezifität und weitgehend automatisiert eine Vielzahl von organspezifischen Proteinsignaturen ermitteln lässt.
[0021] Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Gesamtproteinprofil des biologischen Materials in Schritt 2 wie folgt erstellt:
- Massenspektrometrische Analyse des Gesamtproteins des biologischen Materials zum Erhalt von Massenspektren, und
- Abgleich der erhaltenen Massenspektren mit einer Proteindatenbank zum Erhalt des Gesamtproteinprofils in Form eines einzelne Proteine identifizierenden Musters.
[0022] Mit dieser Maßnahme wird der umfangreiche Datenbestand etablierter bioinformatischer Datenbanken genutzt, um anhand der generierten Massenspektren die in dem biologischen Material enthaltenen Proteine zu bestimmen. Die Erstellung eines einzelne Proteine identifizierenden Musters erfolgt automatisiert unter Verwendung geeigneter Software wie z.B. Mascot (Matrix Sciences). Durch den Erhalt eines einzelne Proteine identifizierenden Musters wird die Ausgangssituation für die anschließende Bestimmung der organspezifischen Proteinsignatur geschaffen. Beispiele für geeignete Proteindatenbanken sind UniProt, Swiss-Prot, TrEMBL und Protein Information Resource (PIR).
[0023] Dabei ist es ferner bevorzugt, wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das einzelne Proteine identifizierende Muster auf das Vorhandensein der organspezifischen Proteinsignatur analysiert wird.
[0024] Mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise die Ermittlung der organspezifischen Proteinsignatur realisiert. Die Identifizierung erfolgt erneut automatisiert, bspw. unter Verwendung der Mascot-Software.
[0025] Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer organspezifischen Proteinsignatur eines sich mit einem Corpus Delicti in Kontakt befundenem biologischem Materials zur Identifizierung eines durch den Corpus Delicti penetrierten Organs.
[0026] Die Merkmale, Vorteile und bevorzugten Weiterentwicklungen des erfindungsgemäßen Verfahrens gelten für die erfindungsgemäße Verwendung entsprechend.
[0027] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
[0028] Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele dienen der Illustrierung der Erfindung und schränken den Schutzbereich nicht ein. [0029] In den Ausführungsbeispielen wird Bezug auf die beigefügten Figuren genommen, in denen Folgendes dargestellt ist:
Fig. 1 zeigt die organ- und gewebsspezifischen mRNA-Expressionsprofile der
Marker aus Affymetrix-Experimenten;
Fig. 2 zeigt das Ergebnis eines Vorversuches, in dem eine Projektilprobe, die zuvor menschliches Herzgewebe durchdrungen hat, mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens analysiert wurde.
Fig. 3 zeigt das Ergebnis eines Versuches, in dem verbündete Projektilproben, die zuvor verschiedene Gewebe durchdrungen hatten, mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens analysiert wurden.
Beispiel 1 : Organspezifische Proteine
[0030] In den nachfolgenden Tabellen sind die wichtigsten organspezifischen Proteine mit Spezifitäten bzw. Primärspezifitäten für die Organe Herz, Leber, Lunge, Skelettmuskel und Niere aufgelistet. Angegeben werden auch Referenzen, in denen die jeweilige Organspezifität beschrieben ist. Ferner wird zu dem jeweiligen organspezifischen Protein die in den Datenbanken verwendete Kurzbezeichnung ("accession num- ber") sowie eine ggf. in der Literatur beschriebene Sekundärspezifität angegeben.
Tabelle 1 : Proteine mit Organspezifität "Gehirn"
Figure imgf000010_0001
"laut Literatur
Tabelle 2: Proteine mit Organspezifität "Herz"
Figure imgf000010_0002
"laut Literatur Tabelle 3: Proteine mit Organspezifität "Leber"
Figure imgf000011_0001
"laut Literatur Tabelle 4: Proteine mit Organspezifität "Lunge"
Figure imgf000012_0001
"laut Literatur
Tabelle 5: Proteine mit Organspezifität "(Skelett-)Muskel"
Protein Name Accession No. Sekundär- Referenz
spezifität*
Actin/alpha
ACTA ACTSJHUMAN
Skelettmuskel
Troponin http://www.uniprot.orq/uni
TNNC TNNC2_HUMAN
C/Skelettmuskel prot/P02585
Troponin T,
http://www.uniprot.orq/uni
TNNT schneller TNNT3_HUMAN
prot/P45378
Skelettmuskel
Myosin-Ieichte
Kette- 1/3, http://www.uniprot.orq/uni
MLC MYL1_HUMAN
Skelettmuskel prot/P05976 Isoform
Myosin- regulatorische
http://www.uniprot.orq/uni
MLRS leichtet Kette 2, MLRS_HUMAN
prot/Q96A32
Skelettmuskel
Isoform
http://www.uniprot.orq/uni
MYH1 Myosin-1 MYH1_HUMAN
prot/P12882
MYH2 Myosin-2
Fructose-
ALDOC Bisphosphate- ALDOC_HUMAN Hirn
Aldolase C
Fructose- http://www.ncbi.nlm.nih.qo
ALDO ALDOA_HUMAN
Bisphosphate- v/qene/226 Aldolase A
MYG Myoglobin MYGJHUMAN Herz, Lunge
"laut Literatur
Tabelle 6: Proteine mit Organspezifität "Niere"
Figure imgf000013_0001
"laut Literatur
Beispiel 2: Vorversuch
[0031] In einem Vorversuch sollte geklärt werden, ob sich organspezifische Proteine des Herzens auf einem Projektil, das zuvor ein menschliches Herz durchdrungen hatte, nachweisen lassen.
ProbenisolierungZ-aufbereitung
[0032] Ein Projektil einer Schusswaffe wurde im Rahmen einer Autopsie mechanisch durch ein menschliches Herz hindurchgedrückt. Das Projektil wurde in einem Probenbeutel asserviert und bis zur Weiterbearbeitung bei -20°C gelagert. Zur Analyse wurde die Metallkugel entnommen und in einem passenden Plastikrohrchen einer proteolytischen Spaltung mit Hilfe der Protease Trypsin unterzogen. Dazu wurden zunächst in Lösung eine Reduktion mit Dithiothreitol und anschließend eine Alkylierung mit Jodace- tamid durchgeführt, bevor die Protease hinzugegeben und bei 37°C über Nacht inkubiert wurde. Aufgrund von anhaftenden Geweberesten wurde das Innere des Probenbeutels ebenfalls mit den Reagenzien zur tryptischen Spaltung versetzt und wie die Metallkugel behandelt. Die Reaktion wurde durch Ansäuern mit Trifluoressigsäure (Endkonzentration: 5%) abgestoppt und die resultierenden Peptidlösungen abzentrifugiert. Ein Teil der Überstände wurde nach Anreicherung über Stage Tips (Proxeon) über eine Acclaim PepMap RSLC 75 μηη x 25 cm C18 2μηι 100 A chromatographisch auf einer UltiMate 3000 Nano-HPLC-Anlage (Dionex) getrennt.
Erstellung eines Gesamtproteinprofils mittels Massenspektrometrie
[0033] Die angereicherten und chromatographisch getrennten Überstände der Peptidlösungen wurden online in einem LTQ Orbitrap Massenspektrometer (Thermo Fischer Scientific) vermessen. Dabei wurden jeweils die 10 intensivsten Massen eines Füllzyklus automatisch zur Fragmentierung ausgewählt. Die Fragmentierung wurde mittels Cl D-Verfahren (collision induced decay) durchgeführt. Die in den Fragmentspektren aufgetretenen Massen wurden in Kombination mit den jeweils dazugehörenden Muttermassen durch die Anwendung des Mascot-Suchalgorithmus (Matrix Science) mit den theoretischen Protein- und Peptidmassenparametern aus der SwissProt-Datenbank abgeglichen und die Ergebnisse mit Hilfe der Scaffold Software (Proteome Software Inc.) visualisiert. Das Ergebnis ist ein Gesamtproteinprofil in Form von sogenannten Hit- oder Trefferlisten, in denen die Proteinidentifizierungen gemäß Ihrer Zuverlässigkeit, bzw. ihres nicht zufälligen Auftretens gewichtet werden
Analyse des Gesamtproteinprofils auf eine herzspezifische Proteinsignatur
[0034] Die erhaltenen Proteinidentifizierungen wurden nach herzspezifischen Proteinen durchsucht. Diese sind entweder aus physiologischer Lehrbuchliteratur bekannt, z.B. durch Berücksichtigung der besonderen Muskelfunktionalität des Herzens, oder wurden durch Abgleich mit Expressionsdatenbanken, z.B. dem Gene Expression Atlas, unterhalten vom Europäischen Institut für Bioinformatik und zugänglich via UniProt, herausgefiltert. In den in Fig. 1 dargestellten Diagrammen werden die mRNA- Expressionsmuster der vier Proteine, die hauptsächlich für die herzspezifische Signatur verantwortlich sind, gezeigt. Dabei ist festzustellen, dass die spezifische Signatur aus Proteinen, die nahezu ausschließlich in Herzgeweben vorkommen wie Myosin- Bindeprotein C (MYPC3, Fig. 1A) und Troponin I (TNNI3, Fig. 1 D), und aus solchen Proteinen, die Sekundarspezifitaten aufweisen können wie Troponin C (TNNC1 , Fig. 1 B) und Myosin-regulatorische leichte Kette 2 (MLRV, Fig. 1 C), gebildet wird.
[0035] Das Ergebnis des Vorversuches ist in Fig. 2 gezeigt. Dargestellt ist die analysierte herzspezifische Proteinsignatur, bestehend aus den vier Proteinen Myosin- Bindeprotein C (MYPC3), Troponin C (TNNC1 ), Myosin-regulatorische leichte Kette 2 (MLRV) und Troponin I (TNNI3). Der Nachweis dieser 4 herzspezifischen Proteine in der biologischen Probe lässt eine sehr spezifische Zuordnung des Projektils zu dem Organ Herz zu.
[0036] Im Rahmen dieses Vorversuches konnte nachgewiesen werden, dass anhand der Bestimmung einer herzspezifischen Proteinsignatur des biologischen Materials auf der Oberfläche eines Projektils, die organspezifische Penetration, im Speziellen des Herzens, zugeordnet werden kann.
Beispiel 3: Hauptversuch
[0037] In einem verbündeten Versuchsansatz wurden verschiedene Projektile untersucht, die zuvor verschiedene menschliche Organe durchdrungen hatten.
ProbenisolierungZ-aufbereitung
[0038] Acht verschiedene Projektile, die zuvor acht verschiedene menschliche Organe durchdrungen hatten, wurden jeweils in Reagenzgläsern asserviert und bis zur weiteren Bearbeitung bei -20°C gelagert. Zur Analyse wurden die Metallkugeln entnommen und in passenden Plastikröhrchen einer Proteolyse mit Hilfe der Protease Trypsin unterzogen. Dazu wurde zunächst in Lösung mit Dithiothreitol reduziert und mit Jodace- tamid alkyliert, bevor jeweils die Protease hinzugegeben und bei 37°C über Nacht inkubiert wurde. Die Reaktionen wurden durch Ansäuern mit Trifluoressigsäure (Endkonzent- ration: 5%) abgestoppt und die resultierenden Peptidlösungen abzentrifugiert. Ein kleiner Teil vom Überstand wurde nach Anreicherung über Stage Tips (Proxeon) über eine Acclaim PepMap RSLC 75 μηη x 25 cm C18 2μηι 100 A chromatographisch auf einer UltiMate 3000 Nano HPLC-Anlage (Dionex) getrennt.
Erstellung eines Gesamtproteinprofils mittels Massenspektrometrie
[0039] Die angereicherten und chromatographisch getrennten Überstände der Peptidlösungen wurden online in einem LTQ Orbitrap Massenspektrometer (Thermo Fischer Scientific) vermessen. Dabei wurden jeweils die 10 intensivsten Massen eines Füllzyklus automatisch zur Fragmentierung ausgewählt. Die Fragmentierung wurde mittels Cl D-Verfahren (collision induced decay) durchgeführt. Die in den Fragmentspektren aufgetretenen Massen wurden in Kombination mit den jeweils dazugehörenden Muttermassen durch die Anwendung des Mascot-Suchalgorithmus (Matrix Science) mit den theoretischen Protein- und Peptidmassenparametern aus der SwissProt-Datenbank abgeglichen und die Ergebnisse mit Hilfe der Scaffold Software (Proteome Software Inc.) visualisiert. Das Ergebnis ist ein Gesamtproteinprofil in Form von sogenannten Hit- oder Trefferlisten, in denen die Proteinidentifizierungen gemäß Ihrer Zuverlässigkeit, bzw. ihres nicht zufälligen Auftretens gewichtet werden.
Analyse des Gesamtproteinprofils auf organspezifische Proteinsignaturen
[0040] Das Ergebnis des Hauptversuches ist in der Fig. 3 dargestellt. Fettgedruckt sind diejenigen Identifizierungen, die richtig zugeordnet wurden (wahre Identitäten in der rechten Spalte). Die mit einem * (Stern) markierten Proben wurden nicht einwandfrei asserviert, hier gab es in erster Linie starke Kontaminationen mit Blut.
[0041] Hieraus ergibt sich, dass sechs von acht Projektilen korrekt den Organen zugeordnet werden konnten, die diese wirklich durchdrungen hatten. Konkret gelangen die Zuordnungen zu den Organen Gehirn (Projektil Nr. 1 ), Herz (Nr. 2), Leber (Nr. 3), Lunge (Nr. 4), Skelettmuskel (Nr. 7) und Niere (Nr. 8). Projektil Nr. 5 war stark durch Blut verunreinigt und konnte nicht korrekt zugeordnet werden. Projektil Nr. 6 konnte ebenfalls nicht korrekt zugeordnet werden. Dies bedeutet unter Einschluss der stark kontaminierten Projektile eine Trefferquote von 75%, bei Berücksichtigung von ausschließlich einwandfrei asservierten Projektilen von über 83%.
Fazit
[0042] Den Erfindern ist es gelungen, ein forensisches Verfahren zur Identifizierung eines durch einen Corpus Delicti penetrierten Organs bereitzustellen, das sich durch hohe Spezifität, einfache Handhabung und eine sehr hohe Trefferquote auszeichnet.

Claims

Patentansprüche
Forensisches Verfahren zur Identifizierung eines durch einen Corpus Delicti penetrierten Organs, das folgende Schritte aufweist:
1 ) Bereitstellung von sich mit dem Corpus Delicti in Kontakt befundenem biologischem Material,
2) Erstellung eines Gesamtproteinprofils des biologischen Materials,
3) Analyse des Gesamtproteinprofils auf eine organspezifische Proteinsignatur,
4) Identifizierung des durch den Corpus Delicti penetrierten Organs bei Vorhandensein eines organspezifischen Proteinprofils.
Forensisches Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die organspezifische Proteinsignatur ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: gehirnspezifischer, herzspezifischer, leberspezifischer, lungenspezifischer, nierenspezifischer und skelettmuskelspezifischer Proteinsignatur.
Forensisches Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die organspezifische Proteinsignatur zumindest 2, vorzugsweise 3, weiter bevorzugt 4, weiter bevorzugt 5, weiter bevorzugt 6, weiter bevorzugt 7, weiter bevorzugt 8, weiter bevorzugt 9, weiter bevorzugt 10, oder mehr organspezifische Proteine umfasst.
Forensisches Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die
- gehirnspezifische Proteinsignatur gehirnspezifische Proteine umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Myelin-Basisches Protein (MBP), Myelin-Oligodendrocyt-Glycoprotein (MOG), Myelin-assoziiertes Oli- godendrocyt-Basisches Glycoprotein (MOBP) und der AT1A3-Na/K-ATPase- Alpha-3-Untereinheit, und/oder die
- herzspezifische Proteinsignatur herzspezifische Proteine umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Myosin-Bindeprotein C (MYBPC3), Troponin C (TNNC1 ), Ventrikuläre/Herzmuskelisoform der Myosin- Regulatorischen Leichten Kette 2 (MYL2), Troponin I (TNNI3), AT1A1 -Na/K- ATPase-Alpha-1 -Untereinheit (AT1A1 ), Kreatinkinase S-Typ (KCRS), Citrat- synthase (CISY) und Isocitratdehydrogenase (IDHP), und/oder die
- leberspezifische Proteinsignatur leberspezifische Proteine umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Aspartataminotransferase (AATM), 4-Aminobutyrataminotransferase (GABT), Serinpyruvataminotransferase (SPYA), Alkoholdehydrogenase (ADH), Carbamoylphosphatsynthase (CPSM), Glycogenphosphorylase (PYGL), Kupfertransportprotein (ATOX1 ), Phospholy- sin-Phosphohistidine anorganische Pyrophosphatphosphatase (LHPP), Proteasom-Untereinheit-Alpha Typ 2 (PSMA2), Proteasom-Untereinheit-Alpha Typ 6 (PSMA6), Glycin-N-Acyltransferase (GLYAT), Glycinamidinotransferase (GATM), Arginase 1 (ARGI 1 ), Prostaglandin-F-synthase (PGFS), Prostaglandinreduktase (PTGR1 ) und Argininosuccinatlyase (ARLY), und/oder die
- lungenspezifische Proteinsignatur lungenspezifische Proteine umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Lungensurfactantassoziiertes Protein A1 (SFPA1 ), Lungensurfactantassoziiertes Protein A2 (SFPA2), Lungensurfactantassoziiertes Protein B (PSPB), Cathelicidin-antimikrobielles Peptid (CAMP), Annexin A1/A3/A2 (ANXA), Transgelin-2 (TAGLN), Histone H1 , H2b, H4 (H2, H4), 14-3-3 beta/alpha/delta (1433B), und/oder die
- skelettmuskelspezifische Proteinsignatur skelettmuskelspezifische Proteine umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Actin/alpha Skelettmuskel (ACTA), Troponin C/Skelettmuskel (TNNC), Troponin T/schneller Skelettmuskel (TNNT), Myosin-leichte-Kette-1/3-Skelettmuskelisoform (MLC), Myosin-regulatorische-leichte-Kette-2-Skelettmuskelisoform (MLRS), Myosin-1 (MYH1 ), Myosin-2 (MYH2), Fructose-Biphosphat-Aldolase C (ALDOC), Fructo- se-Biphosphat-Aldolase A (ALDO), Myoglobin (MYG) , und/oder die
- nierenspezifische Proteinsignatur nierenspezifische Proteine umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Acidceramidase (ASAH1 ), Gly- cinamidinotransferase (GATM), Chlorid-intrazelluläres Kanalprotein (CLIC4), Transketolase (TKT), Spannungsabhängiger anionenselektiver Kanal (VDAC), Aquaporin 1 (AQP1 ).
Forensisches Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte 2 und 3 mittels massenspektrometrischer Analyse durchgeführt werden.
Forensisches Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gesamtproteinprofil des biologischen Materials in Schritt 2 wie folgt erstellt wird:
- massenspektrometrische Analyse des Gesamtproteins des biologischen Materials zum Erhalt von Massenspektren, und
- Abgleich der erhaltenen Massenspektren mit einer Proteindatenbank zum Erhalt des Gesamtproteinprofils in Form eines einzelne Proteine identifizierenden Musters.
Forensisches Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das einzelne Proteine identifizierende Muster auf das Vorhandensein der organspezifischen Proteinsignatur analysiert wird.
8. Verwendung einer organspezifischen Proteinsignatur eines sich mit einem Corpus Delicti in Kontakt befundenem biologischem Materials zur Identifizierung eines durch den Corpus Delicti penetrierten Organs.
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