EP2810077A2 - Polypeptidmarker zur diagnostik und beurteilung der herzinsuffizienz - Google Patents

Polypeptidmarker zur diagnostik und beurteilung der herzinsuffizienz

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EP2810077A2
EP2810077A2 EP13701490.8A EP13701490A EP2810077A2 EP 2810077 A2 EP2810077 A2 EP 2810077A2 EP 13701490 A EP13701490 A EP 13701490A EP 2810077 A2 EP2810077 A2 EP 2810077A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
markers
heart failure
polypeptide
sample
absence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP13701490.8A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Harald Mischak
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Original Assignee
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG filed Critical Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority to EP13701490.8A priority Critical patent/EP2810077A2/de
Publication of EP2810077A2 publication Critical patent/EP2810077A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/325—Heart failure or cardiac arrest, e.g. cardiomyopathy, congestive heart failure

Definitions

  • the present invention relates to the use of the presence or absence of one or more peptide markers in a sample of an individual for the diagnosis and evaluation of heart failure, and to a method for the diagnosis and evaluation of heart failure, wherein the presence or absence of the peptide marker (s) is indicative for heart failure.
  • Heart failure is a progressive disease that begins with risk factors for left ventricular dysfunction (eg, hypertension), progresses with asymptomatic changes in cardiac muscle structure (left ventricular hypertrophy) and cardiac function (eg, decreased relaxation), and then becomes clinically apparent heart failure leading to Disability and death.
  • risk factors for left ventricular dysfunction eg, hypertension
  • cardiac function eg, decreased relaxation
  • the five-year mortality rate for symptomatic heart failure is about 60%.
  • Heart failure can occur clinically with predominantly systolic (contraction) or diastolic (relaxation) dysfunction, but both can also occur together.
  • systolic contraction
  • diastolic diastolic
  • Heart failure can occur clinically with predominantly systolic (contraction) or diastolic (relaxation) dysfunction, but both can also occur together.
  • the incidence of asymptomatic but echocardiogram-diagnosed diastolic left ventricular dysfunction (early phase) is up to 27%. This is the proportion that is at risk of developing diastolic heart failure.
  • diagnosis of heart failure and, in particular, diastolic left ventricular heart failure remains difficult. Simple-to-use screening technologies are missing.
  • ACE inhibitors for example, angiotensin receptor
  • angiotensin receptor could already be carried out at this time.
  • zeptor blockers, or aldosterone antagonists are made to delay or prevent the progression to clinical symptoms.
  • the object is achieved by a method for the diagnosis of heart failure comprising the step of determining the presence or absence or amplitude of at least three polypeptide markers in a urine sample, wherein the polypeptide markers are selected from the markers given in Table 1 by values for the Molecular masses, the migration time and optionally their peptide sequence are characterized.
  • the evaluation of the measured polypeptides can be based on the presence or absence and / or amplitude of the markers taking into account the following limits:
  • AUC Area Under the Curve Specificity is defined as the number of actual negative samples divided by the sum of the number of actual negatives and the number of False positives. A specificity of 100% means that a test identifies all healthy persons as healthy, ie no healthy person is identified as ill. This does not say anything about how well the test detects sick patients.
  • Sensitivity is defined as the number of actual positive samples divided by the sum of the number of actual positives and the number of false negatives. A sensitivity of 100% means that the test detects all patients. He does not say how well the test detects healthy people.
  • markers of the invention it is possible to detect heart failure with a specificity of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%.
  • markers according to the invention it is possible to detect heart failure with a sensitivity of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%.
  • the migration time is determined by capillary electrophoresis (CE) - such. B. in point 2 - determined.
  • CE time capillary electrophoresis
  • the eluent used is, for example, 30% methanol, 0.5% formic acid in water.
  • the CE migration time can vary. However, the order in which the polypeptide labels elute is typically the same for any CE system used under the conditions indicated. To even out any differences in migration time, the system can be normalized using standards for which migration times are known. These standards may, for. These may be, for example, the polypeptides indicated in the examples (see Example 3), or certain, known peptides from urine, as described, for example, in Jantos-Siwy et al. (Quantitative Urinary Proteome Analysis for Biomarker Evaluation in Chronic Kidney Disease. J. Proteome. Res. 8, 268-281 (2009)).
  • the characterization of the polypeptides shown in Table 1 was determined by capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS), a method which was described e.g. B. in detail of z. Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry, 2004, Vol. 20, pages 149-156), Mischak, H. et al. (Cap- philary electrophoresis mass spectrometry as a powerful tool in biomarker dis- covery and clinical di- agnosis: An update of recent developments: Mass Spectrom Rev. 28, 703-724 (2009)), Mischak, H.
  • CE-MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • polypeptide markers according to the invention are proteins or peptides or degradation products of proteins or peptides. They can be chemically modified, for. By post-translational modifications such as glycolization, phosphorylation, alkylation or disulfide bridging, or by other reactions, e.g. B. in the context of degradation, be changed. Based on the parameters that determine the polypeptide markers (molecular mass and migration time), it is possible to identify the sequence of the corresponding polypeptides by methods known in the art.
  • the polypeptides of the invention are used to diagnose heart failure. Diagnosis is the process of gaining knowledge by assigning symptoms or phenomena to a disease or injury.
  • the presence or absence of a polypeptide marker can be measured by any method known in the art. Methods that can be used are exemplified below.
  • a polypeptide marker is present when its reading is at least as high as the threshold. If its reading is below that, the polypeptide marker is absent.
  • the threshold value can either be determined by the sensitivity of the measurement method (detection limit) or defined based on experience.
  • the threshold is preferably exceeded when the sample reading for a given molecular mass is at least twice that of a blank (e.g., only buffer or solvent).
  • the polypeptide marker (s) is / are used to measure its presence or absence, the presence or absence being indicative of heart failure.
  • polypeptide markers that are typically present in individuals with heart failure, but are less common or non-existent in individuals without heart failure.
  • polypeptide markers that are present in patients with heart failure but are not or only rarely present in patients without heart failure.
  • the frequency with which a marker occurs in the group with heart failure or in the control group is given in Table 2 as frequency.
  • the amplitudes can also be used for diagnosis.
  • the amplitudes are used in a way that does not determine the presence or absence, but decides the magnitude of the signal (amplitude) in the presence of the signal in both groups.
  • a nomination procedure makes sense in order to achieve comparability between differently concentrated samples or different measurement methods.
  • collagen fragments are preferably used, as in Jantos Siwy et al. (Quantitative Urinary Proteome Analysis for Biomarker Evaluation in Chronic Kidney Disease, J. Proteome Res., 8: 268-281 (2009)).
  • the linear correlation between the reference values for the amplitude of the given known peptides (so-called "housekeeping peptides”) and the experimentally determined values is determined.
  • the increase of the regression line corresponds exactly to the relative concentration and is used as a normalization factor for calibrating all peptide signals of this sample with a common normalization factor.
  • the decision to make a diagnosis depends on how high the amplitude of the respective polypeptide markers in the patient sample is compared to the mean amplitudes in the control group or the "sick" group. If the value is close to the mean amplitude of the "sick" group, it is to be assumed that the presence of a vascular disease, it corresponds more to the mean amplitudes of the control group, is not to be assumed by a vascular disease.
  • the distance to the mean amplitude can be interpreted as a probability of belonging to a group. Alternatively, the distance between the measured value and the mean amplitude may be considered as a probability of belonging to a group.
  • both the frequency and the amplitude are used for the evaluation.
  • the Wilcox p-value is a measure of the likelihood that the association of markers with the two groups (heart failure and control) is due to a random distribution not associated with heart failure. The smaller the Wilcox p-value, the more likely is the correlation with heart failure.
  • the AUC value is a measure of the expressiveness of the markers; at an AUC value of 0.5, the marker would have no significance; with an AUC of 1, the marker would be able to distinguish between the two groups with 100% certainty.
  • the individual from whom the sample is derived, in which the presence or absence or amplitude of one or more polypeptide markers is determined, may be any individual who may suffer from heart failure.
  • the subject is a mammal, most preferably a human.
  • the sample measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body.
  • the sample is a sample having a polypeptide composition suitable for making statements about the condition of the individual.
  • it may be blood, urine, synovial fluid, tissue fluid, body secretions, sweat, cerebrospinal fluid, lymph, intestinal, gastric, pancreatic, bile, tear fluid, tissue sample, sperm, vaginal fluid or stool sample.
  • it is a liquid sample.
  • the sample is a urine sample.
  • Urine samples may be known as known in the art.
  • a mid-jet urine sample is used.
  • the urine sample may e.g. by means of a catheter or also with the aid of a urination apparatus, as described in WO 01/74275.
  • the presence or absence or amplitude of a polypeptide marker in the sample can be determined by any method known in the art suitable for measuring polypeptide markers. Those skilled in such methods are known. In principle, the presence or absence of a polypeptide marker can be determined by direct methods such as e.g. Mass spectrometry, or indirect methods, such. B. by ligands or specific probes such as antibodies can be determined.
  • the sample of the subject eg, the urine sample
  • the sample of the subject may be pretreated by any suitable means prior to measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s), for example be cleaned or separated.
  • the treatment may, for.
  • a purification, separation, dilution or concentration include.
  • the methods may be, for example, centrifugation, filtration, ultrafiltration, dialysis, precipitation or chromatographic methods such as affinity separation or separation by means of ion exchange chromatography, or an electrophoretic separation.
  • a mass spectrometric method is used to determine the presence or absence or amplitude of a polypeptide marker, which method may precede purification or separation of the sample.
  • the mass spectrometric analysis has the advantage over current methods that the concentration of many (> 100) polypeptides of a sample can be determined by means of a single analysis. Any type of mass spectrometer can be used. With mass spectrometry it is possible to routinely measure 10 fmoles of a polypeptide marker, ie 0.1 ng of a 10 kDa protein with a measurement accuracy of approximately ⁇ 0.01% from a complex mixture. In mass spectrometers, an ion-forming unit is coupled to a suitable analyzer.
  • electrospray ionization (ESI) interfaces are mostly used to measure ions from liquid samples, whereas the matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from sample crystallized with a matrix. For analysis of the resulting ions z.
  • ESI electrospray ionization
  • the molecules present in solution are sprayed, inter alia, under the influence of high voltage (eg 1-8 kV), forming charged droplets, which become smaller as the solvent evaporates.
  • high voltage eg 1-8 kV
  • TOF analyzers have a very high scanning speed and achieve a very high resolution.
  • Preferred methods for determining the presence or absence of polypeptide markers include gas phase ion spectrometry, such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • gas phase ion spectrometry such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • CE-MS in which capillary electrophoresis is coupled with mass spectrometry. This method is in detail z.
  • German patent application DE 10021737 in Kaiser et al. (J. Chromatogr. A, 2003, Vol. 1013: 157-171, and Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055), in Wittke et al. (J. Chromatogr. A, 2003, 1013: 173-181) and Ref.
  • the CE-MS technique allows to determine the presence of several hundreds of polypeptide markers of a sample simultaneously in a short time, a small volume and high sensitivity. After a sample has been measured, a pattern of the measured polypeptide markers is prepared (see below).
  • CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
  • solvents include acetonitrile, methanol, and the like.
  • the solvents may be diluted with water and acid (e.g., 0.1% to 1% formic acid) added to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
  • Capillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow upon application of a current, cations are accelerated to the cathode and anions are retarded.
  • the advantage of capillaries in electrophoresis is the favorable ratio of surface area to volume, which enables a good removal of the Joule heat arising during the current flow. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.
  • fused silica capillaries with internal diameters of typically 50 to 75 ⁇ m are normally used. The used lengths are 30-100 cm.
  • the capillaries usually consist of plastic-coated quartz glass.
  • the capillaries may be both untreated, i. on the inside show their hydrophilic groups, as well as be coated on the inside. A hydrophobic coating can be used to improve the resolution.
  • a pressure which is typically in the range of 0-1 psi may also be applied. The pressure can also be created during the separation or changed during the process.
  • the markers of the sample are separated by capillary electrophoresis, then directly ionized and transferred online to a mass spectrometer coupled thereto for detection.
  • several polypeptide markers can advantageously be used for diagnostics. Preferred is the use of at least 5, 6, 8, or 10 markers. In one embodiment, 20 to 50 markers are used.
  • Urine was used to detect polypeptide markers for diagnosis. Urine was withdrawn from healthy donors (peer group) as well as patients suffering from vascular disease. For the subsequent CE-MS measurement, proteins such as albumin and immunoglobulins, which are also present in urine in higher concentrations, had to be separated by ultrafiltration. For this purpose, 700 ⁇ urine was taken and at 700 pm Filtrationspuffer (2M urea, lM ammonia, 0.02% SDS). These 1.4 ml sample volumes were ultrafiltered (20 kDa, Sartorius, Göttingen, DE). The UF was carried out at 3000 rpm in a centrifuge until 1.1 ml ultrafiltrate was obtained.
  • the CE-MS measurements were performed with a capillary electrophoresis system from Beckman Coulter (P / ACE MDQ System, Beckman Coulter Inc, Fullerton, USA) and a Bruker ESI-TOF mass spectrometer (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D).
  • the CE capillaries were purchased from New Objective, having an ID / OD of 50/360 pm and a length of 90 cm.
  • the mobile phase for the CE separation consisted of 20% acetonitrile and 0.25% formic acid in water. 30% isopropanol with 0.5% formic acid was used for the "sheath flow" at the MS, here with a flow rate of 20 ⁇ / h.
  • CE-ESI-MS sprayer kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE).
  • the duration of the injection was 99 seconds. With these parameters about 300 nl of the sample were injected into the capillary, this corresponds to about 10% of the capillary volume.
  • a "stacking" technique was used. An IM NH 3 solution is injected for 7 seconds (at 1 psi) prior to sample injection. After applying the separation voltage (25 kV), the analytes between these solutions are automatically concentrated.
  • the following CE separation was performed by a pressure method: 0 psi for 30 minutes, 0.1 psi for 1 min, 0.2 psi for 1 min, 0.3 psi for 1 min, 0.4 psi for 1 min, and 0.5 psi for 35 min.
  • the total duration of a separation run was thus 70 minutes.
  • REV REVQSKIGYGRQIIS 20.95 min 1732.96
  • ELM sequence: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.49 min 2333.19
  • GIVLY Sequence: GIVLYELMTGELPYSHIN 32.2 min 2048.03 The proteins / polypeptides are used in each case in a concentration of 10 pmol / ⁇ in water. "REV”, “ELM”, “KINCON” and “GIVLY” represent synthetic peptides.
  • peptide 2 is selected from the measurement and attempts to To identify a suitable polypeptide marker, again taking into account a corresponding time window. If, in turn, several markers can be found with a corresponding mass, the most probable assignment is that in which there is a substantially linear relationship between the shift for the peptide 1 and for the peptide 2.
  • further proteins from his sample for the assignment, for example ten proteins.
  • migration times are either lengthened or shortened by certain absolute values, or there are upsets or knocks throughout the course. Co-migrating peptides also co-migrate under such conditions.
  • the urine samples were analyzed according to Carty DM et al. (Urinary proteomics for predication of preeclampsia, Hypertension, 2011, 57: 561-9) with a Dionex Ultimate 3000 RSLS nanoflous system (Dionex, Camberley, UK) (LC / MS).
  • the samples (5 ⁇ ) were applied to a Dionex C18 nano-trap column (0.1 ⁇ 20 mm, 5 ⁇ m) at a flow rate of 5 ⁇ / min in 0.1% formic acid and 2% acetonitrile.
  • the sample was flown at a flow rate of 0.3 ⁇ / min onto an Acclaim-PepMap C18 nanocolumn (75pm x 15 cm, 2 ⁇ "100, 100 ⁇ )
  • the trap and the nanofluid column were maintained at 35 ° C.
  • the samples were treated for 100 minutes with a gradient of solvent A, 0.1% formic acid, against solvent B, acetonitrile, The column was washed with 90% B before being equilibrated prior to the next sample
  • the eluent from the column was eluted using a Proxeon nanospray ESI source (Thermo Fisher, Hemel Hempstead, UK) operating in positive-ion mode ionized into an Orbitrap-Velos FTMS
  • the ionization voltage was 2.5 kV and the capillary temperature was 200 ° C.
  • the mass spectrometer was measured in the MS / MS mode with a scan range of m / z 380 to 2000 amu
  • the 10 largest multiply charged ions were selected from each scan for MS / MS analysis, and the fragmentation method was HCD with 35% collision energy Ions were determined using a data-dependent method with a repetition number of 1 and exclusion time of 15 s for MS2 selected.
  • the ion dissolution was 60000 in MSI and 7500 for HCD-MS2.
  • the files were used for a search against the human non-redundant IPI database using the Open Mass Spectrometry Search Algorithm (OMSSA, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa) and SEQUEST (using the Thermo Proteome Discoverer) without any enzyme specificity. No fixed modification and oxidation of methionine and proline were chosen as variable modifications. The permissible mass error window for MS or MS / MS was 10 ppm or 0.05 Da. In the case of SEQUEST, the peptide data were extracted using high peptide-confidence and top-one peptide rank filters. 1% FDR was used as the threshold for identifying identified peptides.
  • FIG. 2 shows measured values of the biomarkers according to the invention for two unknown samples.
  • An amplitude of 0 means that the marker was not found.
  • a scoring was derived for belonging to the groups heart failure and healthy.
  • a reading from the frequency / amplitude to the heart failure group received a positive score; a reading that was from the frequency / amplitude to the healthy group got a negative score.
  • the individual scores were combined, whereby the Wilcox p-values and AUC values were also included in the assessment. There was a score for sample 1: 1,701, for sample 2 a score: score: -0,853.
  • subject 1 had clinical noncardiac cardiac insufficiency, while no evidence was found in subject 2.
  • Example 4
  • FIG. 3 shows measured values for the same subjects in which only three markers were evaluated.
  • Panel 1 Markers ID 5675 and 14906 were not found in the sample. Because these markers are less common in the heart failure group, absence is a positive score for heart failure. Marker 17968 occurs more frequently in the 'healthy'group; therefore, a negative score results from the presence of the marker. However, the amplitude is very close the mean amplitude of the heart failure group, this is a strong positive score; the result is a total score of 1,063.
  • the presence results in a negative score, moreover, the amplitude is close to the mean amplitude of the control group, so that overall there is a negative score.
  • marker 17968 results in a negative score due to the frequencies;
  • amplitude of 2.67 results in a further assignment to the control group and thus a further negative score.

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Abstract

Verfahren zur Diagnostik von Herzinsuffizienz umfassend den Schritt der Bestimmung einer An-oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.

Description

Polypeptid marker zur Diagnostik und
Beurteilung der Herzinsuffizienz
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Peptidmarker in einer Probe eines Individuums zur Diagnostik und Beurteilung von Herzinsuffizienz sowie ein Verfahren zur Diagnostik und Beurteilung der Herzinsuffizienz, wobei die An- oder Abwesenheit des oder der Peptidmarker(s) indikativ für die Herzinsuffizienz ist.
Herzinsuffizienz ist eine fortschreitende Erkrankung, die mit Risikofaktoren für linksventrikuläre Dysfunktion (z. B. Bluthochdruck) beginnt, mit asymptomatischen Veränderung der Herzmuskelstruktur (linksventrikuläre Hypertrophie) und der Herzfunktion (z.B. verminderter Relaxation) fortschreitet, und dann eine klinisch sichtbare Herzinsuffizienz wird, die zur Invalidität und zum Tod führen kann. Die Fünfjahres-Mortalitätsrate für die symptomatische Herzinsuffizienz ist etwa 60%.
Herzinsuffizienz kann klinisch mit vorwiegend systolischer (betreffend die Kontraktion) oder diastolischer (betreffend die Relaxation) Dysfunktion auftreten, aber beide können auch gemeinsam auftreten. In einer zufällig ausgewählten Personengruppe beträgt die Häufigkeit einer asymptomatischen, aber im Echokardiogram diagnostizierbaren, diastolischen linksventrikulären Dysfunktion (Frühphase) bis zu 27%. Dies ist der Anteil, der gefährdet ist, diastolische Herzinsuffizienz zu entwickeln. Trotz der damit verbundenen erheblichen Belastungen für die Gesellschaft ist die Diagnose der Herzinsuffizienz und insbesondere der diastolischen linksventrikulären Herzinsuffizienz weiterhin schwierig . Einfach anwendbare Screening-Technologien fehlen.
Bei einer Diagnose bereits im asymptomatischen Stadium könnte bereits zu diesem Zeitpunkt eine Behandlung mit z.B. ACE Inhibitoren, Angiotensin Re- zeptor Blockern, oder Aldosteron Antagonisten erfolgen, um das Fortschreiten zu klinischen Symptomen zu verzögern oder zu verhindern.
Damit wird deutlich, dass der Bedarf hinsichtlich einer nicht-invasiven Möglich- keit zur frühzeitigen und zuverlässigen Diagnose von Herzinsuffizienz besteht.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Mittel für die Diagnose von linksventrikulären Störungen und diastolischer Herzinsuffizienz bereit zu stellen.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Diagnostik von Herzinsuffizi- enz umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei die Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen, die Migrationszeit und gegebenenfalls ihre Peptidsequenz charakterisiert sind .
Tabelle 1. Polypeptidmarker
Die Auswertung der gemessenen Polypeptide kann anhand der An- oder Abwesenheit und/oder Amplitude der Marker unter Berücksichtigung der folgenden Grenzwerte erfolgen :
Tabelle 2 :
ID Masse ; CE-Zeit Frequenz log mean Frequenz log mean wilcox-p-value AUC : [Da] [min] Hl : Amp. (median) Hl Kontrolle Amp. (median)
Kontrolle
912 826,201 33.4119 0,16 169(153) 0,35 188(189) 0,0014626820 0.6017219
1495 838,401 ; 35,0611 0,16 105(0.92)! 0,36 2.37(2.43) 0,0000578108: 0,6294643
HI = Herzinsuffizienz
AUC=Area Under the Curve Spezifität ist definiert als die Nummer der tatsächlich negativen Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Negativen und der Anzahl der Falsch-Positiven. Eine Spezifität von 100% bedeutet, dass ein Test alle gesunden Personen als gesund erkennt, d.h. kein Gesunder wird als krank identifiziert. Dies trifft keine Aussage darüber, wie gut der Test kranke Patienten erkennt.
Sensitivität ist definiert als die Anzahl der tatsächlichen positiven Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Positiven und die Anzahl der Falsch-Negativen. Eine Sensitivität von 100% bedeutet, dass der Test alle Kranken erkennt. Er trifft keine Aussage, wie gut der Test gesunde Personen erkennt.
Durch die erfindungsgemäßen Markern ist es möglich, Herzinsuffizienz mit einer Spezifität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu detektieren.
Durch die erfindungsgemäßen Markern ist es möglich, Herzinsuffizienz mit einer Sensitivität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu detektieren.
Die Migrationszeit (CE-Zeit) wird mittels Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) - wie z. B. im Punkt 2 ausgeführt - bestimmt. In diesem Beispiel wird eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 pm und einem äußeren Durchmesser (OD) von 360 pm bei einer angelegten Spannung von 30 kV betrieben. Als Laufmittel wird zum Beispiel 30% Methanol, 0,5% Ameisensäure in Wasser verwendet.
Es ist bekannt, das die CE-Migrationszeit variieren kann. Dennoch ist die Rei- henfolge, mit der die Polypeptidmarker eluieren, für jedes verwendete CE System unter den angegebenen Bedingungen typischerweise gleich. Um dennoch auftretende Unterschiede in der Migrationszeit auszugleichen, kann das System unter Verwendung von Standards, für die die Migrationszeiten genau bekannt sind, normiert werden. Diese Standards können z. B. die in den Bei- spielen angegebenen Polypeptide sein (siehe Beispiel Punkt 3), oder bestimmte, bekannte Peptide aus Urin, wie z.B. bei Jantos-Siwy et al. (Quantitative Urinary Proteome Analysis for Biomarker Evaluation in Chronic Kidney Disease. J. Proteome. Res. 8, 268-281 (2009)) beschrieben.
Die Charakterisierung der Polypeptide, die in der Tabelle 1 gezeigt sind, wurde mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) bestimmt, einem Verfahren, das z. B. ausführlich von z. B. Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry , 2004, Bd . 20, Seite 149-156), Mischak, H. et al . (Capil- lary electrophoresis-mass spectrometry as a powerful tool in biomarker dis- covery and clinical diagnosis: An update of recent developments. Mass Spec- trom. Rev. 28, 703-724 (2009)), Mischak, H. et al. (Comprehensive human urine Standards for comparability and standardization in clinical proteome analysis. Proteomics Clin Appl. 4, 464-478 (2010)), Good,D.M . et al . (Natu- rally occurring human urinary peptides for use in diagnosis of chronic kidney disease. Mol. Cell Proteomics 9, 2424-2437 (2010)) beschrieben wurde. Die Variation der Molekülmassen zwischen einzelnen Messungen oder zwischen verschiedenen Massenspektrometern ist bei exakter Kalibrierung relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 0,05%, mehr bevorzugt ± 0,03%, noch mehr bevorzugt ± 0,01% oder 0,005%.
Die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker sind Proteine oder Peptide oder Abbauprodukte von Proteinen oder Peptiden. Sie können chemisch modifiziert sein, z. B. durch posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung, Phosphorylierung, Alkylierung oder Disulfidverbrückung, oder durch andere Reaktionen, z. B. im Rahmen des Abbaus, verändert sein. Ausgehend von den Parametern, die die Polypeptidmarker bestimmen (Molekularmasse und Migrationszeit), ist es möglich, durch im Stand der Technik bekannte Verfah- ren die Sequenz der entsprechenden Polypeptide zu identifizieren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden verwendet, um Herzinsuffizienz zu diagnostizieren. Unter Diagnose versteht man den Vorgang der Erkenntnisgewinnung durch die Zuordnung von Symptomen oder Phänomenen zu einer Krankheit oder Verletzung . Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Verfahren, die verwendet werden können, sind weiter unten beispielhaft aufgeführt. Ein Polypeptidmarker ist anwesend, wenn sein Messwert mindestens so hoch ist wie der Schwellenwert. Liegt sein Messwert darunter, ist der Polypeptidmarker abwesend . Der Schwellenwert kann entweder durch die Sensitivität des Messverfahrens (Nachweisgrenze) bestimmt werden oder anhand von Erfahrungen definiert werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Schwellenwert vorzugsweise überschritten, wenn der Messwert der Probe für eine bestimmte Molekularmasse mindestens doppelt so hoch ist, wie der einer Leerprobe (z.B. nur Puffer oder Lösungsmittel). Der oder die Polypeptidmarker wird/werden in der Weise verwendet, dass seine/ihre An- oder Abwesenheit gemessen wird, wobei die An- oder Abwesenheit indikativ für die Herzinsuffizienz ist. So gibt es Polypeptidmarker, die typischerweise bei Individuen mit Herzinsuffizienz vorhanden sind, jedoch bei Individuen ohne Herzinsuffizienz seltener oder gar nicht auftreten. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Patienten mit Herzinsuffizienz vorhanden sind, jedoch bei Patienten ohne Herzinsuffizienz nicht oder nur seltener vorhanden sind. Die Häufigkeit, mit der ein Marker in der Gruppe mit Herzinsuffizienz bzw. in der Kontrollgruppe auftritt, ist in Tabelle 2 als Frequenz angegeben.
Zusätzlich oder auch alternativ zu den Frequenz (Bestimmung der An- oder Abwesenheit) können auch die Amplituden zur Diagnose verwendet werden. Die Amplituden werden in der Weise verwendet, das nicht die An- oder Abwesenheit entscheidend ist, sondern die Höhe des Signals (die Amplitude) bei Anwesenheit des Signals in beiden Gruppen entscheidet. Dabei ist ein Nomi- nierungsverfahren sinnvoll, um eine Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlich konzentrierten Proben oder unterschiedlichen Messmethoden zu erreichen. Hierzu werden bevorzugt Kollagen Fragmente eingesetzt, wie bei Jantos Siwy et al. (Quantitative Urinary Proteome Analysis for Biomarker Evaluation in Chronic Kidney Disease. J. Proteome. Res. 8, 268-281 (2009)) detailliert beschrieben. Es wird die lineare Korrelation zwischen den Referenz werten für die Amplitude der vorgegebenen bekannten Peptide (sogenannte "housekeepng Peptides") und den experimentell ermittelten Werten bestimmt. Die Steigerung der Regressionsgeraden entspricht gerade der relativen Konzentration und wird als Normierungsfaktor zur Kalibration aller Peptidsignale dieser Probe mit einem gemeinsamen Normierungsfaktor eingesetzt.
Die Entscheidung zu einer Diagnose fällt dabei je nachdem, wie hoch die Amplitude der jeweiligen Polypeptidmarker in der Patientenprobe im Vergleich zu den mittleren Amplituden in der Kontrollgruppe bzw. der "Krank"-Gruppe ist. Liegt der Wert nahe an der mittleren Amplitude der "Krank"-Gruppe, ist von dem Vorliegen einer vaskulären Erkrankung auszugehen, entspricht sie eher den mittleren Amplituden der Kontroll-Gruppe, ist nicht von einer vaskulären Erkrankung auszugehen. Der Abstand zur mittleren Amplitude kann als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe interpretiert werden. Alternativ kann der Abstand zwischen dem Messwert und der mittleren Amplitude als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe betrachtet werden.
Bevorzugt wird zur Auswertung sowohl die Frequenz als auch die Amplitude herangezogen. Jeweils lassen sich aus Messdaten einer unbekannten Probe Wahrscheinlichkeiten für die Zuordnung zu den Gruppen "Herzinsuffizienz" oder 'Gesund' ableiten, aus den sich dann eine Gesamtwahrscheinlichkeit ergibt.
Der Wilcox-p-value ist ein Maß für die Wahrscheinlichkeit, dass die Zuordnung der Marker zu den beiden Gruppen (Herzinsuffizienz und Kontrolle) auf einer zufälligen Verteilung beruht, die nicht mit Herzinsuffizienz in Verbindung steht. Je kleiner der Wilcox-p-value, desto wahrscheinlicher ist die Korrelation mit Herzinsuffizienz.
Der AUC-Wert ist ein Maß für die Aussagekraft der Marker; bei einem AUC- Wert von 0,5 hätte der Marker keine Aussagekraft; bei einem AUC von 1 wäre der Marker in der Lage, zwischen den beiden Gruppen mit 100% Sicherheit zu unterscheiden.
Das Individuum, von dem die Probe stammt, in der die An- oder Abwesenheit oder Amplitude eines oder mehrerer Polypeptidmarker bestimmt wird, kann jedes Individuum sein, das an Herzinsuffizienz leiden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Individuum um ein Säugetier, am meisten bevorzugt handelt es sich um einen Menschen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nicht nur drei Polypeptidmarker, sondern eine größere Kombination von Markern verwendet. Durch Vergleich einer Mehrzahl von Polypeptidmarkern kann die Verfälschung des Gesamtergebnisses durch einzelne individuelle Abweichungen von der typischen Anwesenheitswahrscheinlichkeit im einzelnen Individuum reduziert oder vermieden werden.
Bei der Probe, in der die An- oder Abwesenheit des oder der erfindungsgemäßen Polypeptidmarker gemessen werden, kann es sich um jede Probe handeln, die aus dem Körper des Individuums gewonnen wird. Bei der Probe handelt es sich um eine Probe, die über eine Polypeptidzusammensetzung verfügt, die geeignet ist, Aussagen über den Zustand des Individuums zu treffen. Beispielsweise kann es sich um Blut, Urin, eine Gelenkflüssigkeit, eine Gewebeflüssigkeit, ein Körpersekret, Schweiß, Liquor, Lymphe, Darm-, Magen-, Pank- reassaft, Galle, Tränenflüssigkeit, eine Gewebeprobe, Sperma, Vaginalflüssigkeit oder eine Stuhlprobe handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine Flüssigprobe. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Urinprobe.
Urinproben können wie im Stand der Technik bekannt genommen werden. Vorzugsweise wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Mittelstrahlurinprobe verwendet. Die Urinprobe kann z.B. mittels eines Katheters oder auch mit Hilfe eines Urinierungsapparates, wie in WO 01/74275 beschrieben, entnommen werden.
Die An- oder Abwesenheit oder Amplitude eines Polypeptidmarkers in der Probe kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, das zur Messung von Polypeptidmarkern geeignet ist, bestimmt werden. Dem Fachmann sind solche Verfahren bekannt. Grundsätzlich kann die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers durch direkte Verfahren, wie z.B. Massenspektrometrie, oder indirekte Verfahren, wie z. B. mittels Liganden oder spezifischer Sonden wie Antikörper, bestimmt werden.
Falls erforderlich oder wünschenswert kann die Probe des Individuums, z.B. die Urinprobe, vor der Messung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker durch jedes geeignete Mittel vorbehandelt und z.B. aufgereinigt oder aufgetrennt werden. Die Behandlung kann z. B. eine Aufreinigung, Trennung, Verdünnung oder Konzentrierung umfassen. Die Verfahren können beispielsweise eine Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration, Dialyse, eine Fällung oder chromatographische Verfahren wie Affin itätstren- nung oder Trennung mittels Ionenaustauscherchromatographie, oder eine elektrophoretische Trennung sein. Besondere Beispiele hierfür sind Gelelektrophorese, zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE), Kapillarelektrophorese, Metallaffinitätschromatographie, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), Affinitätschromatographie auf der Basis von Lektinen, Flüssigchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Normal- und Umkehrphasen-HPLC, Kationenaustauscherchromatographie und selektive Bindung an Oberflächen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und der Fachmann wird das Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Probe und dem Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker auswählen können.
Vorzugsweise wird ein massenspektrometrisches Verfahren verwendet, um die An- oder Abwesenheit oder Amplitude eines Polypeptidmarkers zu bestimmen, wobei diesem Verfahren eine Aufreinigung oder Auftrennung der Probe vorgeschaltet werden kann. Die massenspektrometrische Analyse besitzt gegen- über den derzeit gängigen Verfahren den Vorteil, dass die Konzentration vieler (> 100) Polypeptide einer Probe mittels einer einzigen Analyse bestimmt werden kann. Jeder Typ eines Massenspektrometers kann verwendet werden. Mit der Massenspektrometrie ist es möglich, routinemäßig 10 fmol eines Polypeptidmarkers, also 0.1 ng eines 10 kDa Proteins mit einer Messgenauig- keit von ca. ±0.01% aus einem komplexen Gemisch zu vermessen. Bei Mas- senspektrometern ist eine Ionen-bildende Einheit mit einem geeigneten Analysegerät gekoppelt. Zum Beispiel werden meistens Elektrospray-Ionisations (ESI) Interfaces verwendet, um Ionen aus Flüssigproben zu vermessen, wohingegen die Matrix-assisted-laser-desorption/ionisation (MALDI) Technik verwendet wird, um Ionen aus mit einer Matrix kristallisierten Probe zu vermessen. Zur Analyse der entstandenen Ionen können z. B. Quadrupole, Ionenfallen oder Time-of-flight (TOF) Analysatoren verwendet werden. Bei der Elektrosprayionisation (ESI) werden die in Lösung vorliegenden Moleküle u.a. unter dem Einfluss von Hochspannung (z. B. 1-8 kV) versprüht, wobei sich geladene Tröpfchen bilden, die durch Verdampfen des Lösungsmittels kleiner werden. Schließlich kommt es durch sog. Coulomb-Explosionen zur Bildung freier Ionen, die dann analysiert und detektiert werden können.
Bei der Analyse der Ionen mittels TOF wird eine bestimmte Beschleunigungsspannung angelegt, die den Ionen eine gleich große kinetische Energie verleiht. Dann wird sehr genau die Zeit gemessen, die die jeweiligen Ionen benötigen, um eine Driftstrecke durch das Flugrohr zurückzulegen. Da bei gleicher kinetische Energie die Geschwindigkeit der Ionen von Ihrer Masse abhängt, kann diese somit bestimmt werden. TOF-Analysatoren haben eine sehr hohe Scan-Geschwindigkeit und erreichen eine sehr hohe Auflösung .
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Polypeptidmarkern schließen Gasphasenionenspektrometrie, wie Laserdesorp- tions/Ionisations-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhanced laser desorption ionisation), LC-MS (Liquid chromatography- mass spectrometry), 2D-PAGE-MS und Kapillarelektrophore- se-Massenspektrometrie (CE-MS) ein. Alle genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist CE-MS, in welchem die Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie gekoppelt wird. Dieses Verfahren ist ausführlich z. B. in der deutschen Patentanmeldung DE 10021737, bei Kaiser et al. (J. Chromatogr. A, 2003, Bd. 1013 : 157-171, sowie Electrophoresis, 2004, 25 : 2044-2055), bei Wittke et al . (J. Chromatogr. A, 2003, 1013 : 173-181) und in Ref. 2 beschrieben. Die CE-MS Technik erlaubt, das Vorhandensein einiger Hunderter Polypeptidmarker einer Probe gleichzeitig in kurzer Zeit, einem geringen Volumen und hoher Sensitivität zu bestimmen. Nachdem eine Probe vermessen wurde, wird ein Muster der gemessenen Polypeptidmarker hergestellt (siehe unten). Dieses kann mit Referenzmustern von kranken bzw. ge- sunden Individuen verglichen werden. In den meisten Fällen ist es ausreichend, eine begrenzte Anzahl von Polypeptidmarkern für die Diagnostik von Erkrankungen zu verwenden. Weiter bevorzugt ist ein CE-MS Verfahren, das CE online an ein ESI-TOF-MS gekoppelt, einschließt.
Für CE-MS ist die Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln bevorzugt, außerdem arbeitet man am besten unter im Wesentlichen salzfreien Bedingun- gen. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Acetonitril, Methanol und ähnliche. Die Lösungsmittel können mit Wasser verdünnt und mit einer Säure (z. B. 0,1% bis 1% Ameisensäure) versetzt sein, um den Analyten, vorzugsweise die Polypeptide, zu protonieren.
Mit der Kapillarelektrophorese ist es möglich, Moleküle nach ihrer Ladung und Größe zu trennen. Neutrale Teilchen wandern beim Anlegen eines Stromes mit der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses, Kationen werden zur Kathode beschleunigt und Anionen verzögert. Der Vorteil von Kapillaren in der Elektrophorese besteht im günstigen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was einen guten Abtransport der beim Stromfluss entstehenden Jouleschen Wärme ermöglicht. Dies wiederum erlaubt das Anlegen hoher Spannungen (üblicherweise bis 30 kV) und damit eine hohe Trennleistung und kurze Analysezeiten.
Bei der Kapillarelektrophorese werden normalerweise Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von typischerweise 50 bis 75 pm eingesetzt. Die verwen- deten Längen betragen 30-100 cm. Darüber hinaus bestehen die Kapillaren in der Regel aus kunststoffumhüllten Quarzglas. Die Kapillaren können sowohl unbehandelt sei, d.h. auf der Innenseite ihre hydrophilen Gruppen zeigen, als auch auf der Innenseite beschichtet sein. Eine hydrophobe Beschichtung kann verwendet werden, um die Auflösung zu verbessern. Zusätzlich zur Spannung kann auch ein Druck angelegt werden, der typischerweise im Bereich von 0-1 psi liegt. Der Druck kann dabei auch erst während der Trennung angelegt oder währenddessen verändert werden.
In einem bevorzugten Verfahren zur Messung von Polypeptidmarkern werden die Marker der Probe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, anschließend direkt ionisiert und online in ein daran gekoppeltes Massenspektrometer zur Detektion überführt. In dem erfindungsgemäßen Verfahren können in vorteilhafter Weise mehrere Polypeptidmarker zur Diagnostik verwendet werden. Bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 5, 6, 8, oder 10 Markern. In einer Ausführungsform werden 20 bis 50 Marker verwendet.
Um die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer Erkrankung bei Verwendung mehrerer Marker zu bestimmen, können dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden . Beispielsweise kann das von Weissinger et al . {Kidney Int., 2004, 65 : 2426-2434) beschriebene Random-Forests-Verfahren unter Verwendung eines Computerprogramms wie z. B. S-Plus oder die in der selben Veröffentlichung beschriebenen support-vector-machines verwendet werden. Weitere Informationen können beispielsweise Dakna et al . BMC Bioinformatics 11 (2010) 594 entnommen werden.
Diese Verfahren kombinieren mehrere Biomarker zu einer einzigen Variable, die sowohl mit der Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen der Erkrankung assoziiert ist, als auch mit dem Schweregrad der Erkrankung. Diese Variable kann somit auch eingesetzt werden um die Ausprägung bzw. den Schweregrad der Erkrankung zu bestimmen (z. B. gezeigt in Schiffer et al., Prediction of muscle- invasive bladder Cancer using urinary proteomics. Clin. Cancer Res. 15, 4935- 4943 (2009) für Blasenkarzinom), als auch um ein mögliches Ansprechen auf Therapie abzubilden (wie z. B. gezeigt in Haubitz et al ., Identification and Validation of urinary biomarkers for differential diagnosis and dvaluation of therapeutic Intervention in ANCA associated vasculitis. Mol. Cell. Proteomics 8, 2296-2307 (2009) für ANCA-assoziierte Vasculitius, oder in Andersen et al., Urinary proteome analysis enables assessment of renoprotective treatment in type 2 diabetic patients with microalbuminuria. BMC Nephrol. 11, 29 (2010) für diabetische Nephropathie).
Beispiel 1:
1. Probenvorbereitung :
Zur Detektion der Polypeptidmarker zur Diagnostik wurde Urin verwendet. Urin wurde von gesunden Spendern (Vergleichsgruppe) sowie Patienten, die an vaskulären Erkrankungen leiden, abgenommen. Für die nachfolgende CE- MS Messung mussten die auch in Urin von Patienten in höherer Konzentration vorkommenden Proteine wie Albumin und Immunoglobuline durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Dazu wurden 700 μΙ Urin entnommen und mit 700 pm Filtrationspuffer (2M Harnstoff, lOmM Ammoniak, 0.02% SDS) versetzt. Diese 1.4 ml Probenvolumen wurden ultrafiltriert (20 kDa, Sartorius, Göttingen, DE). Die UF wurde bei 3000 U/min in einer Zentrifuge durchgeführt bis 1.1 ml Ult- rafiltrat erhalten wurden.
Die erhaltenen 1.1 ml Filtrat wurden dann auf eine PD 10 Säule aufgetragen (Amersham Bioscience, Uppsala, Schweden) und mit 2.5 ml einer 0.01% NH4OH eluiert und lyophillisert. Zur CE-MS Messung wurden die Polypeptide dann mit 20 μΙ Wasser (HPLC-Reinheit, Merck) resuspendiert.
2. CE-MS Messung :
Die CE-MS Messungen wurden mit einem Kapillarelektrophoresesystem von Beckman Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Inc, Fullerton, USA) und einem ESI-TOF Massenspektrometer von Bruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D) durchgeführt. Die CE Kapillaren wurden von New Objective bezogen, sie hatten einen ID/OD von 50/360 pm und eine Länge von 90 cm. Die mobile Phase für die CE Trennung bestand aus 20% Acetonitril und 0.25% Ameisensäure in Wasser. Für den "Sheath-Flow" am MS wurde 30% Isopropanol mit 0.5% Ameisensäure verwendet, hier mit einer Flussrate von 20 μΙ/h. Die Kopplung von CE und MS wurde durch ein CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE) realisiert. Um die Probe zu injizie- ren, wurde 1 bis max. 6 psi Druck angelegt, die Dauer der Injektion betrug 99 Sekunden. Mit diesen Parametern wurden ca. 300 nl der Probe in die Kapillare injiziert, dieses entspricht ca. 10% des Kapillarvolumens. Um die Probe in der Kapillare aufzukonzentrieren wurde eine "Stacking"-Technik verwendet. Dabei wird vor der Probeninjektion für 7 Sek. (bei 1 psi) eine IM NH3 Lösung inji- ziert.. Nach Anlegen der Trennspannung (25 kV) werden die Analyten zwischen diesen Lösungen automatisch aufkonzentriert. Die folgende CE- Trennung wurde mit einer Druckmethode durchgeführt: 30 Minuten mit 0 psi, dann für 1 min 0.1 psi, für 1 min 0.2 psi, für 1 min 0.3 psi, für 1 min 0.4 psi, abschließend 35 min bei 0.5 psi. Die Gesamtdauer eines Trennlaufes betrug damit 70 Minuten.
Um auf der Seite des MS eine möglichst gute Signalintensität zu erhalten, wurde kein "Nebulizer Gas" eingesetzt. Die an der Spraynadel angelegte Spannung zur Erzeugung des Elektrosprays betrug 4000 - 4800 V. Die übrigen Einstellungen am Massenspektrometer wurden gemäß Anweisung des Herstellers für Peptiddetektion optimiert. Die Spektren wurden über einen Massenbereich von m/z 400 bis m/z 3000 aufgenommen und alle 3 Sek. akkumuliert. 3. Standards für die CE-Messung
Zur Kontrolle und Kalibrierung der CE-Messung wurden die folgenden Proteine bzw. Polypeptide eingesetzt, welche unter den gewählten Bedingungen durch die unten aufgeführten CE-Migrationszeiten charakterisiert sind :
Protein/Polypeptid Migrationszeit Masse (Da)
Aprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr. A1153) 19.3 min 6513,09
Ribonuclease, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr. ; R4875 19.55min 13681,32
Lysozym, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr. ; L7651 19.28 min 14303,88
"REV", Sequenz: REVQSKIGYGRQIIS 20.95 min 1732,96
"ELM", Sequenz: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.49 min 2333,19
"KINCON", Sequenz: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 22.62 min 2832,41
"GIVLY" Sequenz: GIVLYELMTGELPYSHIN 32.2 min 2048,03 Die Proteine/Polypeptide werden jeweils in einer Konzentration von 10 pmol/μΙ in Wasser eingesetzt. "REV", "ELM", "KINCON" und "GIVLY" stellen synthetische Peptide dar.
Es ist dem Fachmann prinzipiell bekannt, dass bei kapillarelektrophoretischen Trennungen geringe Schwankungen der Migrationszeiten auftreten können. Unter den beschriebenen Bedingungen ändert sich jedoch die Migrationsreihenfolge nicht. Es ist für den Fachmann in Kenntnis der angegebenen Massen und CE-Zeiten problemlos möglich, eigene Messungen den erfindungsgemäßen Polypeptidmarkern zuzuordnen. Hierzu kann er beispielsweise wie folgt vorgehen : zunächst wählt er eines der in seiner Messung gefundenen Polypeptide (Peptid 1) aus und versucht, innerhalb eines Zeitfensters der angegebenen CE-Zeit (beispielsweise ± 5 min) eine oder mehrere übereinstimmende Massen zu finden. Findet er innerhalb dieses Intervalls nur eine übereinstimmende Masse, ist die Zuordnung fertig gestellt. Findet er mehrere passende Massen, muss noch eine Entscheidung über die Zuordnung gefällt werden. Hierzu wird ein weiteres Peptid (Peptid 2) aus der Messung ausgewählt und versucht, hierfür einen passenden Polypeptidmarker zu identifizieren, wobei wieder ein entsprechendes Zeitfenster berücksichtigt wird. Lassen sich nun wiederum mit einer entsprechenden Masse mehrere Marker finden, ist die wahrscheinlichste Zuordnung die, bei der zwischen der Verschiebung für das Peptide 1 und für das Peptid 2 ein im Wesentlichen linearer Zusammenhang besteht. In Abhängigkeit von der Komplexität des Zuordnungsproblems bietet es sich für den Fachmann an, gegebenenfalls weitere Proteine aus seiner Probe für die Zuordnung zu verwenden, beispielsweise zehn Proteine. Typischerweise sind die Migrationszeiten entweder um gewisse absolute Werte verlängert oder ver- kürzt oder es treten Stauchungen oder Strickungen des gesamten Verlaufs auf. Co-migrierende Peptide co-migrieren aber auch unter solchen Bedingungen.
Zudem kann der Fachmann sich die von Zuerbig et al. in Electrophoresis 27 (2006), Seiten 2111 - 2125 beschriebenen Migrationsmuster zu nutze ma- chen. Wenn er mit Hilfe eines einfachen Diagramms seine Messung in Form von m/z versus Migrationszeit aufträgt, werden ebenfalls die beschriebenen Linienmuster sichtbar. Durch Abzählen der Linien ist nun eine einfache Zuordnung der einzelnen Polypeptide möglich. Auch andere Vorgehensweisen zur Zuordnung sind möglich. Grundsätzlich könnte der Fachmann auch die oben genannten Peptide als internen Standard verwenden, um seine CE-Messungen zuzuordnen.
4. Sequenzierung von Polypeptiden
Die Sequenzierung der durch dieses Verfahren ermittelten Polypeptide ist dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Es kann folgendes Verfahren verwendet werden.
Die Urinproben wurden gemäß Carty DM et al. (Urinary proteomics for predic- tion of preeclampsia. Hypertension. 2011; 57 : 561-9) mit einem Dionex- Ultimate-3000-RSLS-Nanoflusssystem (Dionex, Camberley, UK) (LC/MS) analysiert. Die Proben (5 μΙ) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 μΙ/min in 0,1% Ameisensäure und 2% Acetonitril auf eine Dionex-C18-Nano-Trap- Säule (0.1 x 20 mm, 5 pm) aufgegeben. Die Probe wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 μΙ/min auf eine Acclaim-PepMap-C18-Nanosäule (75pm x 15cm, 2μη"ΐ, 100 Ä) eluiert. Die Trap- und die Nanoflusssäule wurden auf 35 °C gehalten. Die Proben wurden über 100 min mit einem Gradienten von Lösungsmittel A, 0,1% Ameisensäure, gegen Lösungsmittel B, Acetonitril, beginnend mit 5% B und ansteigend auf 50% B, eluiert. Die Säule wurde mit 90% B gewaschen, bevor sie vor der nächsten Probe äquilibriert wurde. Der Eluent aus der Säule wurde unter Verwendung einer Proxeon-Nanospray-ESI- Quelle (Thermo Fisher, Hemel Hempstead, UK), die im positive-Ionen-Modus arbeitete, in ein Orbitrap-Velos-FTMS hinein ionisiert. Die Ionisierungsspannung betrug 2,5 kV, und die Kapillartemperatur betrug 200 °C. Das Massen- spektrometer wurde im MS/MS-Modus mit einem Scanbereich von m/z 380 bis 2000 amu betrieben. Die 10 größten mehrfach geladenen Ionen wurden aus jedem Scan für die MS/MS-Analyse ausgewählt; bei dem Fragmentierungsverfahren handelte es sich um HCD mit 35% Kollisionsenergie. Die Ionen wurden mit Hilfe eines datenabhängigen Verfahrens mit einer Wiederholungszahl von 1 und Ausschlusszeit von 15 s für MS2 ausgewählt. Die Ionenauflösung betrug 60000 in MSI und 7500 für HCD-MS2. Die Dateien wurden für eine Recherche gegen die humane nichtredundante Datenbank IPI unter Verwendung des Open Mass Spectrometry Search Algorithm (OMSSA, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa) und SEQUEST (unter Verwendung des Thermo Proteome Discoverer) verwendet, ohne jede Enzymspezifität. Es wurden keine festgelegte Modifikation und Oxidation von Methionin und Prolin als variable Modifikationen gewählt. Das zulässige Massenfehlerfenster für MS bzw. MS/MS betrug 10 ppm bzw. 0.05 Da. Im Falle von SEQUEST wurden die Peptiddaten unter Verwendung von hoher Peptidkonfidenz- und Top-One- Peptidrangfilter herausgezogen. 1% FDR wurde als Schwellenwert für die Angabe identifizierter Peptide verwendet. Die Korrelation zwischen Peptidladung beim Arbeits-pH von 2 und CE-Migrationszeit wurde ausgenutzt, um das Auftreten falsch positive Identifikationen zu minimieren (Zürbig,P. et al. Bio- marker discovery by CE-MS enables sequence analysis via MS/MS with plat- form-independent Separation. Electrophoresis 27, 2111-2125 (2006)). Die auf der Basis der Zahl der basischen Aminosäuren berechnete CE-Migrationszeit wurde mit der experimentellen Migrationszeit verglichen. Akzeptiert wurden nur diejenigen Peptide, die mit beiden Suchalgorithmen (OMSSA und SEQUEST) gefunden wurden und die eine Masseabweichung von unter ±10 ppm aufwiesen, Fragmentionen mit einer Masseabweichung von unter ±0.05 Da und einer Abweichung der CE-Migrationszeit von unter ±2 min.
Beispiel 2
Aus der FLEMENGHO Studie wurden 16 Patienten mit symptomatischem Herzversagen und 16 gesunde Kontrollen ausgewählt und Urinproben verbündet vermessen. Unter Zugrundelegung der Marker ergab sich eine Genauigkeit der Klassifikation von 0,84 (95% Intervall 0,70 bis 0,98, p = 0,001; siehe Figur 1).
Beispiel 3
Figur 2 zeigt Messwerte der erfindungsgemäßen Biomarker für zwei unbekannte Proben. Eine Amplitude von 0 bedeutet, dass der Marker nicht gefunden wurde. Aus den Frequenz und Amplitudendaten wurde ein Scoring für die Zugehörigkeit zu den Gruppen Herzinsuffizienz und Gesund abgeleitet. Ein Mess- wert, der von der Frequenz/Amplitude zur Gruppe Herzinsuffizienz gehörte, erhielt einen positiven Score; ein Messwert, der von der Frequenz/Amplitude zur Gruppe Gesund gehörte, bekam einen negativen Score. Je dichter der Wert an den Werten der Tabelle 2, desto (absolut) größer der Score. Anschließend wurden die einzelnen Scorewerte kombiniert, wobei auch die Wilcox-p- values und AUC Werte in die Beurteilung einflössen. Es ergab sich für Probe 1 ein Score-Wert: 1.701, für Probe 2 ein Score-Wert: Score : -0.853.
Anschließend wurden die Patienten untersucht: Proband 1 hatte eine klinische noch nicht sichtbare Herzinsuffizienz, während solche Anzeichen bei Proband 2 nicht gefunden wurden. Beispiel 4
Figur 3 zeigt Messwerte für die gleichen Probanden, bei denen nur drei Marker ausgewertet wurden.
Proband 1 : Die Marker mit der ID 5675 und 14906 wurden in der Probe nicht gefunden. Da diese Marker in der Herzinsuffizienzgruppe seltener auftreten,, ist die Abwesenheit ein positiver Score für Herzinsuffizienz. Marker 17968 tritt in der 'Gesunden'-Gruppe häufiger auf; daher ergibt sich ein negativer Score aus der Anwesenheit des Markers. Allerdings liegt die Amplitude sehr dicht an der mittleren Amplitude der Herzinsuffizienzgruppe, dies ist ein starker positiver Score; es ergibt sich ein Gesamtscore von 1.063.
Bei Proband 2 ergibt sich aus der Anwesenheit des Markers 5675 ein negativer Score. Die Amplitude von 2,34 liegt zwischen der Herzinsuffizienz- und der Kontrollgruppe, aber geringfügig dichter an der Herzinsuffizienzgruppe, daraus ergibt sich ein kleiner positiver Score.
Für den Marker 14906 ergibt sich aus der Anwesenheit ein negativer Score, darüber hinaus ist die Amplitude dicht an der mittleren Amplitude der Kontrollgruppe, so dass sich insgesamt ein negativer Score gibt.
Aus der Anwesenheit des Markers 17968 ergibt sich aufgrund der Frequenzen ein negativer Score; darüber hinaus ergibt sich aus der Amplitude von 2,67 eine weitere Zuordnung zu Kontrollgruppe und damit ein weiterer negativer Score.
Insgesamt ergibt sich aus den drei Messwerten für Proband 2 ein Score von -1,185.
Die Zuordnung der Probanden 1 und 2 konnte in einer klinischen Untersuchung bestätigt werden.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Diagnose von Herzinsuffizienz umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Marker anhand der in Tabelle 2 aufgeführten Referenzwerte erfolgt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens acht, mindestens zehn, mindestens 20 oder mindestens 50 Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 1 definiert sind .
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Probe eines Individuums eine Mittelstrahlurinprobe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Kapillarelektrophorese, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspektrometrie zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Polypeptidmarker verwendet wird .
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei vor einer Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durchgeführt wird .
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker verwendet wird.
Verwendung von mindestens drei Polypeptidmarker ausgewählt aus den Markern gemäß Tabelle 1, die durch die Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert ist, zur Diagnostik von Herzinsuffizienz.
Verfahren zur Diagnose von Herzinsuffizienz umfassend die Schritte a) der Auftrennung einer Probe in mindestens fünf, bevorzugt 10 Teilproben, b) Analyse von mindestens fünf Teilproben zur Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude mindestens eines Polypeptidmarkers in der Teilprobe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern der Tabelle 1, die durch die Mole- kularmassen und Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind .
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei mindestens 10 Teilproben gemessen werden .
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die CE-Zeit bezogen ist auf eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 pm bei einer angelegten Spannung von 25 kV, wobei als Laufmittel 20% Acetonitril, 0,25% Ameisensäure in Wasser verwendet wird.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 9 bis 11, wobei die Sensitivität mindestens 60% und der Spezifität mindestens 40% beträgt.
13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Herzinsuffizienz eine linksventrikuläre Störung ist.
14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Herzinsuffizienz eine linksventrikuläre, diastolische Herzinsuffizienz ist.
15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Herzinsuffizienz asymptomatisch ist.
16. Verfahren zur Beurteilung der Entwicklung einer Herzinsuffizienz umfassend die Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 zu zwei verschiedenen Zeitpunkten.
17. Verfahren nach Anspruch 16 zur Beurteilung einer therapeutischen Intervention.
18. Verfahren zur Prognose der Entwicklung einer Herzinsuffizienz umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in
Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind .
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Herzin¬ suffizienz bereits klinisch relevant ist.
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