WO2012037719A2 - 真菌（1-3）-β-D葡聚糖比色检测试剂盒的制备及其使用方法 - Google Patents

真菌（1-3）-β-D葡聚糖比色检测试剂盒的制备及其使用方法 Download PDF

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苑庆华
何永胜
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天津市一瑞生物工程有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen

Definitions

  • the invention is a synthetic chromogenic substrate Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN (N, N-diethylaminoaniline), Boc-leu-Gly-Arg-DIAN or Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N, N-diethylaminoaniline) specifically activates the G factor, coagulogen and coagulogen contained in the lysate of the oriental sputum blood cell using a trace amount of (1-3)- ⁇ -D-glucan Blood cell lysate coagulation reaction.
  • Activated coagulase hydrolyzed synthetic chromogenic substrate releases chromogenic group DIAN (N,N-diethylaminoaniline), DIM with 1-naphthol_4_sulfonate sodium, (1-naphthol-2_sulfonic acid) Sodium or sodium 1-naphthol-5-sulfonate) forms a blue condensate in the presence of sodium periodate.
  • DIAN N,N-diethylaminoaniline
  • DIM with 1-naphthol_4_sulfonate sodium, (1-naphthol-2_sulfonic acid) Sodium or sodium 1-naphthol-5-sulfonate) forms a blue condensate in the presence of sodium periodate.
  • the amount of zymogen activation and the absorbance of the formed condensate are within a certain range.
  • the linear relationship is used to quantitatively detect the concentration of (1-3)- ⁇ -D glucan in
  • the components in the lysate should contain metal ions such as Na + , Mg 2+ , Ca 2+ , etc. After adjusting the pH and sterilizing at 121 °C for 90 minutes, it can be used.
  • Blood cell lysis Aseptically, take about 20g of blood cells, add blood cell lysate according to 1-5 ratio, and use 200° rpm/min with high-speed homogenizer to break the cells, and destroy the damaged tissue cells. Store in a freezer at _30 °C for 10 hours, then remove the frozen cell fluid and slowly dissolve at room temperature. After all dissolved, use a high-speed tissue homogenizer for 200,000 rpm/min, 5-10 minutes of damage. The cells were then re-chilled and stored in the _30 °C refrigerator for 10 hours, and the last process was repeated 2 times.
  • the chromogenic synthetic substrate was dissolved in sterile water for injection to prepare a concentration of 6 mM, filtered through a 0.222 um filter, and stored at 4 ° C until use.
  • color solution B It is a 2% sodium periodate solution (formed with water for injection).
  • the above-mentioned color developing solution A and color developing liquid B were prepared, and then dispensed into a vial or an ampoule and then freeze-dried.
  • the chromogenic synthetic substrate solution is dispensed into vials or ampoules and lyophilized.
  • Sensitivity The (1-3)- ⁇ -D dextran standard was diluted with the lysate into 1000pg/ml, 500pg/ml, lOOpg/ml, 50pg/ml, lOpg/ml, 5pg/ml.
  • concentration of each standard solution is X-axis
  • absorbance value is plotted on the Y-axis.
  • the linear correlation coefficient r should be greater than 0.980.
  • Sample treatment solution Check whether the sample treatment solution is packaged for cracking or liquid overflow. Use a grinding wheel to scratch the neck of the ampoule, then use 75% alcohol cotton for disinfection. Leave it for 10 minutes and then open the ampoule.
  • the chromogenic agent B is mixed with 0. lml of chromogenic agent B, mixed with 0. lml of chromogenic medium, and then incubated at 37 ° C for 15 minutes; The mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and the absorbance was measured at a wavelength of 630-680 nm.
  • Cspl is the concentration of (1-3)- ⁇ -D-Glucan in the sample
  • Cstd is the concentration of (1-3) - ⁇ -D-Glucan in the standard solution
  • Reference Cut off value is 20 pg/ml. 8. Operational precautions
  • Plasma a sterile, pyrogen-free vacuum blood collection tube containing a heparin anticoagulant
  • Serum use a sterile, heat-free vacuum blood collection tube
  • Alveolar lavage fluid Use a sterile, heat-free vacuum blood collection tube.
  • Some drugs with (1-3) - ⁇ -D-Glucan as a component and hemodialysis with cellulose dialysis membranes have an effect on the measured values.
  • Protein preparations and some antibiotics also have an effect on the measured values.

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Description

真菌 （1-3 ) -β-D 葡聚糖比色检测试剂盒的制备及其使用方法 所属领域：
生物医药范畴， 更确切说是应用人工合成显色基质， 利用真菌细胞壁成分 （1-3 ) -β-D葡聚糖激活东方鲎 血细胞裂解物中 G 因子， 从而水解合成显色基质 Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN (N， N-二乙氨基苯胺）、 Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N，N-二乙氨基苯胺）进而发生缩合反应而定量检测（ 1-3 ) -β-D 葡聚糖方法及相关应用于临床诊断深部真菌感染的产品。
背景技术：
经初步检索， 未査到以人工合成显色基质 Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN (N， N_二乙氨基苯胺)制备成比色检 测真菌细胞壁成分 （1-3 ) -β-D 葡聚糖试剂专利。
发明内容：
本发明是以人工合成显色基质 Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN (N， N-二乙氨基苯胺）、 Boc-leu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N， N-二乙氨基苯胺）利用微量（1-3) - β -D葡聚糖特异性地激活东方鲎血细胞裂 解物中含有的 G因子、 凝固酶原及凝固蛋白原，从而诱发东方鲎血细胞裂解物凝固化反应。 被激活的凝固 酶水解合成显色基质释放出显色基团 DIAN (N，N-二乙氨基苯胺)， DIM与 1_萘酚 _4_磺酸钠、 （1-萘酚 _2_ 磺酸钠或 1-萘酚 -5-磺酸钠） 在高碘酸钠存在下生成蓝色缩合物，在 630-680nm波长处，酶原激活量与形成 的缩合物的吸收度在一定范围内呈线形关系，从而定量检测出样品中（1-3) - β -D葡聚糖浓度。 该试剂盒可 以用来早期诊断临床深部真菌感染。 参照说明书附图将本发明内叙述如下：
一、 合成显色基质
采用生物技术人工合成 Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN (N, N-二乙氨基苯胺）、 Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N，N-二乙氨基苯胺)类显色基质。 具体合成工艺 （见工艺路线图）。
二、 东方鲎血细胞裂解物提取、 分离
2. 1 血细胞裂解液配制：其中裂解液中成分应含有 Na+， Mg2+, Ca2+等金属离子，调节 pH后并进行 121 °C 90 分钟灭菌处理后方可使用。
2. 2 血细胞裂解： 无菌操作， 取约 20g血细胞， 按照 1-5比例加入血细胞裂解液， 并用高速均浆机进行 200000 rpm/min, 5-10分钟破损细胞， 将破损后的组织细胞液放入 _30 °C冰箱内快速冷冻保存 10 小时，之后将冷冻细胞液取出，在室温下缓慢溶解，待全部溶解后，再用高速组织均浆机进行 200000 rpm/min， 5-10 分钟破损细胞， 然后将破损后的组织细胞液再次放入 _30 °C冰箱内快速冷冻保存 10小时， 重复上次过程 2遍即可。
2. 3 血细胞分离、 提取： 将上述血细胞裂解液取出后进行 3000 rpm/min， 5-8分钟离心， 取上清液， 按照 1-2比例加入氯仿， 剧烈震荡 10分钟， 然后转移至无热原离心沉淀管中在 4 °C下进行 10000 rpm/min， 5_10分钟分离， 仔细取出上清液备用。
三、 显色合成基质及缩合溶液的配制及处理
1、 显色合成基质溶液配制
将显色合成基质用灭菌注射用水溶解， 配制成 6mM浓度， 使用 0. 22um滤膜过滤， 4°C保存备用。
2、 显色液 A
为 6mM的 1-萘酚 -4-磺酸钠溶液 （使用 pH 8. 5 浓度为 0. 05mol的硼酸缓冲液配制）。
3、 显色液 B 为 2%高碘酸钠溶液 （使用注射用水配制）。
4、 显色液 A及显色液 B处理
将上述显色液 A及显色液 B配制后， 分装至西林瓶或安瓿瓶中然后进行冷冻干燥。
5、 显色合成基质溶液处理
将显色合成基质溶液， 分装至西林瓶或安瓿瓶中然后进行冷冻干燥。
四、 反应主剂的制备与标定
1、 取提取、 分离好的东方鲎血细胞的上清液， 加到含有 1. 0M氯化镁 0. 5M氯化钙溶液中， 分装至西 林瓶或安瓿瓶中进行冷冻干燥即为反应主剂。
2、 取上述冷冻干燥好的反应主剂， 按照标示值加入溶解液使其完全溶解，然后用灭菌注射用水 1-10 倍稀释， 用紫外分光光度计检测， 应在 270 ± 3nm处有吸收峰。
3、 将 （1-3 ) -β-D 葡聚糖标准品用溶解液溶解并稀释成最终浓度为 100pg/ml溶液， 与反应主剂反 应， 应出现反 S型检测峰。
五、 （1-3 ) -β-D葡聚糖比色检测试剂盒的性能
1、 灵敏度 ：将 （1-3 ) -β-D 葡聚糖标准品用溶解液依次稀释成 1000pg/ml， 500pg/ml, lOOpg/ml, 50pg/ml, lOpg/ml, 5pg/ml的标准系列， 参照试剂盒使用说明书进行检测， 测定各自的吸光度值； 以各标准溶液浓度为 X轴， 以吸光度值为 Y轴作图分析， 其直线相关系数 r应大于 0. 980。
2、 特异性： 在已知 （1-3 ) -β-D 葡聚糖浓度的空白血浆中添加一定量的 （1-3 ) -β-D 葡聚糖标准溶 液， 其检测回收率应在 80-120%之间。
3、 重复性： 对同一样品进行 4回检测， 其吸光度值的 CV值应在 10%以内。
4、 测定范围： 5-500pg/ml之间。
六、 （1-3 ) -β-D葡聚糖比色检测试剂盒的组成
1、 组成如下表所示
Figure imgf000003_0001
2、 质控方法： 使用 （1-3 ) -β-Ρ 葡聚糖标准品， 其标准品试剂盒组成如下。
Figure imgf000004_0001
七、 检测试剂盒操作方法
( 1 ) 样品处理液 检测样品处理液包装有无破裂或液体溢出， 使用砂轮在安瓿颈部进行划痕， 然后使用 75%的酒精棉进行消毒处理， 放置 10分钟再将安瓿开启即可。
(2 ) 样品制备 无菌操作， 使用无菌、 无热原含有肝素类抗凝剂的真空采血管， 收集 2-4ml静脉血， 轻 轻混允， 然后进行 3000rpm/min lmin快速离心分离， 得含富血小板血浆样品， 直接取上清液即可。
( 3 ) 样品前处理 无菌操作， 取 0. 1ml上清液加入装有 0. 9ml样品处理液中， 轻轻混匀， 立刻放入 T01恒 温加热仪中 70° C保温 10分钟， 取出立刻防入冰水浴中冷却 10分钟， 即为待测样品。
( 4) 标准操作法
无菌操作， 将反应主剂安瓿掰开， 加入反应主剂用溶解液 0. 1ml， 轻轻混匀溶解， 然后分别加入标准品稀 释系列、 阴性对照及待测样品各 0. lml，37°C保温 60分钟； 之后分别加入 0. lml合成显色基质， 37°C保温 15 分钟； 取出振摇均匀， 然后加入显色剂 A 50ul，混匀， 再次加入 0. lml显色剂 B，混匀， 室温放置 5分钟， 在 波长 630-680nm检测吸光度。
结果计算方法
按照下列公式计算样品中的（1-3) - β -D-Glucan浓度：
Cspl = (As l - Abl) * Cstd * 10 / (Astd - Abl)
其中： Cspl为样品中的（1-3) - β -D-Glucan浓度；
Cstd 为标准液中的（1-3) - β -D-Glucan浓度；
Aspl样品的吸光度
Abl 空白对照的吸光度
Astd 为标准液的吸光度
测定结果的判断：
参考 Cut off 值为 20 pg/ml. 八、 操作上的注意事项
检测样本
血浆： 使用无菌、 无热源的含有肝素类抗凝剂的真空采血管；
血清： 使用无菌、 无热源的真空采血管；
肺泡灌洗液： 使用无菌、 无热源的真空采血管。
无菌操作， 无论在采血还是转移过程中， 一定要避免（l-3)- e -D-GluCan的污染。
干扰物质
测定过程中外环境的影响以及所使用器具中含有的（1_3) - β -D-Glucan的污染， 会对测定值产生影响； 尤 其是显色试剂添加前操作一定要避免微生物以及（l-3)- e -D-GluCan的污染。
以（1-3) - β -D-Glucan为成分的一些药品， 以及纤维素类透析膜进行血液透析时， 都会对测定值产生影响。 蛋白类制剂以及部分抗生素也会对测定值产生影响。

Claims

WO 2012/037719 权 利 要 求 书 PCT/CN2010/077158
1. 真菌 （ 1-3 ) - β -D 葡聚糖比色检测试剂盒的制备及其使用方法， 以人工合成显色基质 Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN (N， N- 二 乙 氨 基 苯 胺 ） 、 Boc- leu- Gly- Arg- DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N, N-二乙氨基苯胺）， 利用微量（1-3) -β-D葡聚糖特异性地激活东方鲎血细胞 裂解物中含有的 G因子、凝固酶原及凝固蛋白原，从而诱发东方鲎血细胞裂解物凝固化反应.被激活的 凝固酶水解合成显色基质释放出显色基团 DIAN (N， N-二乙氨基苯胺)， DIAN与显色剂 A ( 1_萘酚 _4_磺 酸钠、 1-萘酚 -2-磺酸钠或 1-萘酚 -5-磺酸钠） 在高碘酸钠显色剂 B 的存在下生成蓝色缩合物，在 630-680nm波长处，酶原激活量与形成的缩合物的吸收度在一定范围内呈线形关系，从而定量检测出样 品中（i-3) - e -D 葡聚糖浓度； 试验过程应严格按照使用说明书上具体操作方法进行操作， 同时要注 意一些操作过程中的注意事项； 该试剂盒可以用来早期诊断临床深部真菌感染， 作为临床诊断的参考 之一。
2. 如权利要求 1 所述的人工合成显色基质包括 Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN (N， N-二乙氨基苯胺）、 Boc- leu- Gly- Arg- DIAN及 Boc- Thr- Gly- Arg- DIAN (N， N-二乙氨基苯胺）三种。
3. 如权利要求 1所述的显色剂 A包括 1-萘酚 -4-磺酸钠、 1-萘酚 -2-磺酸钠及 1-萘酚 -5-磺酸钠以及显色 剂 B (高碘酸钠） 等。
4. 如权利要求 1所述的所生成的蓝色缩合物，在 630-680nm波长处，酶原激活量与形成的缩合物的吸收度 在一定范围内呈线形关系。
5. 如权利要求 2所述的人工合成显色基质的浓度为 2-6mMol之间， 配制后分装冷冻干燥或溶液在 2_8°C 避光保存， Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN (N， N_二乙氨基苯胺)核磁图见说明书附图 3。
6. 如权利要求 3所述的显色剂 1-萘酚 -4-磺酸钠、 1-萘酚 -2-磺酸钠及 1-萘酚 -5-磺酸钠的浓度为 0. 6-6 mMol之间， 并使用 0. 05Mol硼酸缓冲液配制 （pH 8. 5)， 其显色剂高碘酸钠的浓度为 0. 2_2%之间， 使 用灭菌注射用水配制， 分装在棕色瓶中冷冻干燥或溶液在 2-8°C避光保存。
7. 如权利要求 1所述的试剂盒具体操作方法为： 将反应主剂掰开， 加入反应主剂用溶解液 0. lml， 轻轻 混匀溶解， 分别加入标准品稀释系列、 阴性对照及待测样品各 0. lml, 37°C保温 60分钟； 之后分别加 入 0. lml合成显色基质， 37°C保温 15分钟； 取出振摇均匀， 然后加入显色剂 A 50ul混匀， 之后加入 0. 1ml显色剂 B混匀， 室温放置 5分钟， 最后在波长 630-680nm检测吸光度值， 计算含量。
8. 如权利要求 1 所述的试剂盒使用过程中注意外环境的影响以及所使用器具中含有的 (l-3) - 0 -D-Glucan的污染， 会对测定值产生影响； 尤其是显色试剂添加前操作一定要避免微生物以 及（l-3) - {3 -D-GlUcan 的污染， 另外以（l-3) - {3 -D-GlUcan为成分的一些药品、 纤维素类透析膜进行 血液透析时， 也都会对测定值产生影响。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102866255A (zh) * 2012-09-13 2013-01-09 莫水晶 一种人体液真菌（1,3）-β-D葡聚糖检测试剂盒及其应用方法
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CN109323996A (zh) * 2018-08-24 2019-02-12 宁波市奉化区人民医院 一种真菌检测试剂盒

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