WO2011142543A2 - 아텔로콜라겐 분리방법 및 개질된 아텔로콜라겐 제조방법 그리고 이를 이용하여 제조된 아텔로콜라겐 및 콜라겐 기반 매트릭스 - Google Patents
아텔로콜라겐 분리방법 및 개질된 아텔로콜라겐 제조방법 그리고 이를 이용하여 제조된 아텔로콜라겐 및 콜라겐 기반 매트릭스 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a method for separating atelocollagen and high purity atelo collagen prepared by using the same. More specifically, atelocollagen is economically separating high purity atelocollagen from animal tissues by removing impurities efficiently and conveniently. It relates to a separation method and high purity atelo collagen prepared using the same.
- the present invention relates to a method for producing modified atelocollagen, which is dissolved in a neutral solution and has excellent biocompatibility, and thus can be applied to various formulations, and a modified atelocollagen prepared using the same.
- the present invention relates to a collagen-based matrix having a three-dimensional matrix structure and a method for producing the same by using the atelocollagen and the modified atelocollagen as described above to improve the mechanical strength by making a hard layer and a porous layer and crosslinking them. It is about.
- collagen or fibrinocytes contain a peptide (so-called "RGD peptide") sequence consisting of arginine-glycine-aspartic acid that induces cell adhesion.
- RGD peptide a peptide sequence consisting of arginine-glycine-aspartic acid that induces cell adhesion.
- Artificially arranging the RGD peptide on the surface of the biomaterial provides an environment that induces adhesion between the surface of the biomaterial and the cell, thereby mimicking the function of natural tissue by combining the surface of the biomaterial with the surrounding cells.
- collagen is one of the very important natural materials among the various natural polymers described above. This is because collagen, which is distributed in almost all tissues in vivo, is an essential protein for building a living body by forming and maintaining organs and tissues in combination with cells as a structure for supporting and proliferating cells.
- Collagen is a major protein component of the extra-cellular matrix, and it is contained in soft tissues such as bones and teeth as well as soft tissues including connective tissues such as skin, tendons, and blood vessels. It takes about one third of the protein, has a certain order, and the cells gather to form the basic structure of tissues or organs. Without collagen, multicellular animals cannot exist. Therefore, when trying to regenerate a damaged part of a living body to its original tissue, if the extracellular matrix of the tissue is supplied to the damaged part, the tissue cell will have regeneration ability, thus providing collagen as a basic matrix of the artificial tissue substitute. It is very advantageous.
- type 1 collagen is most widely used in tissue engineering because it is contained in almost all tissues such as skin, ligaments and bones.
- telopeptide that does not form a helix at both ends of the collagen type 1 molecule, which is the main cause of the immune response.
- Atelocollagen is used.
- the type 1 collagen separation method that is generally used up to now is treated with trypsin to separate animal cells from cells, remove minerals and various glycoproteins from the extracellular matrix, and utilize the intrinsic polarity or acid solubility of collagen.
- trypsin to separate animal cells from cells, remove minerals and various glycoproteins from the extracellular matrix, and utilize the intrinsic polarity or acid solubility of collagen.
- a precipitation method to separate type 1 collagen in this manner, a precipitation method, a chromatography method using a urea buffer solution, and a centrifugation method are conventionally used.
- pepsin is treated to remove telopeptides that cause an immune reaction. have.
- the conventional type 1 collagen separation method since the conventional type 1 collagen separation method has to go through a multi-step process, the separation process is inconvenient, time-consuming and expensive, as well as the urea used to separate type 1 collagen. In addition, there is a problem in that separation and inactivation of pepsin used for telopeptide removal are necessary. That is, the conventional type 1 collagen separation method makes the separation process more complicated and difficult, and makes it difficult to economically obtain high-purity type 1 collagen.
- biomaterials using collagen still have limitations for use in human tissues due to their low tensile strength and biodegradable properties.
- the Republic of Korea Patent No. 10-0465015 is a high purity type 1 collagen by removing the non-collagen substances through the enzyme treatment to reduce the immunity and extract and remove fatty impurities and insoluble collagen using an organic solvent The manufacturing method is described.
- the organic solvent is used as in the Republic of Korea Patent No. 10-0465015, there may be a degeneration of collagen and the use of an organic solvent that is harmful to the human body may cause side effects when the separated collagen is applied in vivo. .
- the Republic of Korea Patent No. 10-0676285 in the bone tissue, cartilage tissue, skin tissue, tendon / tendon tissue of the pig powdered or fragmented and acid treatment and then repeatedly treated pepsin to isolate the type 1 collagen primary
- a method of separating the precipitated collagen by centrifugation after neutralization at a low temperature of 30 to 37 ° C. after repeating the three steps of salt treatment and neutral titration is performed.
- the separation method of the Republic of Korea Patent No. 10-0676285 may be advantageous in terms of removing fat or insoluble substances while preventing the denaturation of collagen, but the salt treatment process and the titration process to neutral are complicated and multiply first. There was a problem that is inadequate to economically separate the type collagen yield.
- Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2002-0029859 discloses a method for producing atelocollagen, which is treated by enzymatic treatment and then purified by a conventional method immediately after pulverizing soft tissues or hard tissues of mammals in an acid solution.
- this technique also has the advantage of simplifying the process of the previous stage of the separation and purification process, but the method of increasing the purity by using dialysis and filtration in the subsequent separation and purification process.
- the extraction process of collagen has been performed using dialysis, multiple filtration, or various pore sizes in the process of increasing the purity by removing various impurities from the collagen separated from animal tissues.
- I was using a method of overlapping three or four filters.
- the dialysis method was limited in increasing purity due to the limited membrane pore size of 12,000 ⁇ 14,000 Daltons, and it was not possible to reuse multiple filters with different pore size.
- the use of expensive filters has the disadvantage of high cost.
- the present inventors provide a separation method in which an ultrafiltration and diafiltration method using a reusable filter is fused to provide high purity even through a single process line.
- a method of extracting collagen was developed.
- the present inventors have developed a method for producing modified atelocollagen, which is dissolved in a neutral solution and has excellent biocompatibility and can be applied to various formulations. Without collagen, it can be applied to various fields such as cosmetics, medicine, and food.
- the present inventors have introduced a porous matrix manufacturing technique in which a collagen is made of a two-layer structure (two collagen layers having different porosities) of a hard layer and a porous layer and crosslinked into the above-described technique to improve mechanical strength.
- the fabrication of the dimensional matrix structure solved the low tensile strength and biodegradation problem of collagen.
- An object of the present invention is to provide an atelocollagen separation method for efficiently and conveniently removing impurities and economically separating high-purity atelocollagen from animal tissues, and to provide high-purity atelocollagen prepared using the same.
- the present invention is a modified atel collagen production method and modified atel prepared using the improved ease of use that can be applied to a variety of formulations by modifying the water-soluble collagen dissolved in a neutral solution to improve biocompatibility Its purpose is to provide collagen.
- the present invention is a three-dimensional that improves the mechanical strength by making a hard layer and a porous layer (two collagen layers with different porosities) and crosslinking them using atelocollagen and modified atelocollagen as described above. It is an object of the present invention to provide a collagen-based matrix having a matrix structure and a method of preparing the matrix.
- ultrafiltration used in the specification of the present invention is a filtration method located in the middle of microfiltration and reverse osmosis, and removes low-molecular substances from the polymer solution, but not a difference in concentration across the filtration membrane. By means of separating and filtering the material using. Filtration membranes used for ultrafiltration have pores of various sizes depending on the material to be separated.
- diafiltration used in the specification of the present invention means that in the ultrafiltration, materials larger than the pores of the filtration membrane are concentrated in the relation of the feed, the residue, and the filtrate. Some of the desired substances to be filtered remain in the residue to be concentrated. The ratio of the desired substances to be gradually refined by returning them back to the feed side and adding purified water, etc., and concentrating them again through the filtration membrane. It means how to increase.
- the sample containing the atelo collagen is introduced into the filtration module having the filtration membrane from the container by the pumping action by the pump in the step (b).
- the filtration module is characterized in that to apply a pressure of about 10 ⁇ 30psi.
- the ultrafiltration process is stopped when the ultrafiltration rate is reduced to about 1 g / min or less in the step (e).
- the same amount of purified water as the solution filtered through the ultrafiltration process may be added to the residue returned to the vessel in the step (f).
- the diafiltration process may be performed at least five times.
- atelocollagen of an embodiment of the present invention is prepared according to the atelocollagen separation method as described above.
- step (c) maintaining the reaction solution of the atelo collagen and succinic anhydride stirred in step (b) at a pH of about 9 to 10 for a predetermined time;
- the step (b) and the step (c) may be repeated at least four times.
- the succinylation atelo collagen production method of an embodiment of the present invention may further comprise the step of washing the succinylation atelo collagen sedimentation with acidic distilled water.
- the method for preparing succinylation atelo collagen according to an embodiment of the present invention may further include lyophilizing the succinylation atelo collagen sedimentation.
- the succinylation atelo collagen of an embodiment of the present invention is prepared by the succinylation atelo collagen production method as described above.
- step (b) making the atelo collagen dispersion stirred in step (a) to approximately neutral state
- step (c) centrifuging the atelocollagen dispersion in a substantially neutral state in step (b) to obtain esterified atelocollagen sedimentation;
- step (d) putting the esterified atelo collagen sediment obtained in step (c) into a dialysis membrane to perform dialysis in purified water.
- the method for preparing esterified atelo collagen according to one embodiment of the present invention may further include lyophilizing the esterified atelo collagen sediment dialyzed in step (d).
- esterified atelo collagen of an embodiment of the present invention is prepared by the esterified atelo collagen production method as described above.
- step (d) secondly bonding the collagen hard layer and the collagen porous layer by crosslinking the collagen hard layer and the collagen porous layer primarily bonded through the step (c) using a crosslinking means. It includes.
- the method for producing a collagen-based matrix of an embodiment of the present invention further includes the step of (e) washing the crosslinking agent when the crosslinking means is a crosslinking agent.
- the bilayer of the collagen hard layer and the collagen porous layer may be further lyophilized.
- the pressure applied to the porous adsorption plate in the step (b) is preferably 1 ⁇ 20psi.
- the crosslinking means is characterized in that EDC [1-ethyl-3- (3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide] or glutaraldehyde.
- hyaluronic acid may be added to the atelo collagen dispersion used in step (a).
- the collagen-based matrix of an embodiment of the present invention is prepared by the method for producing a collagen-based matrix as described above.
- atelocollagen separation method of the present invention an efficient and simple removal of impurities through a single process line using a separation method that combines ultrafiltration and diafiltration using a reusable filter.
- High purity atelo collagen can be isolated and economically extracted from animal tissues.
- modified atelocollagen which is dissolved in a neutral solution and has excellent biocompatibility, and thus can be easily applied to various formulations.
- Atelocollagen has the advantage that it can be applied to various fields such as cosmetics, medicines, and foods in its natural state without hydrolysis by the peptideization and enzyme treatment of collagen.
- the method for preparing a collagen-based matrix of the present invention by making the collagen into a two-layer structure (two collagen layers having different porosities) of a hard layer and a porous layer, and then crosslinking them to improve the mechanical strength of the collagen-based matrix
- the 3D porous collagen-based matrix prepared by such a manufacturing method has an advantage in that the porous membrane is partially destroyed and lost in the aqueous solution, and does not cause a problem of being easily separated from the hard layer.
- FIG. 1 is a block schematically showing a separation and purification apparatus 100 used for atelocollagen separation and purification using a separation method in which the ultrafiltration and diafiltration methods are fused in an atelocollagen separation method according to an embodiment of the present invention. It is also.
- FIGS. 2 and 3 are graphs and charts showing the results of quantifying atelo collagen after water removal of purified atelocollagen (sample concentration 0.5 mg / mL) through the atelocollagen separation method according to one embodiment of the present invention. to be.
- Figure 4 is after performing SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) on the purified purified atelocollagen by the atelocollagen separation method of an embodiment of the present invention, Coomasie Brilliant Blue (Coomasie Brilliant Blue)
- SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
- Coomasie Brilliant Blue Coomasie Brilliant Blue
- Figure 5 is an electrophoresis picture that confirmed that the collagen type is type 1 collagen by performing a Western blotting after performing electrophoresis on the purified atelo collagen separated by the atelocollagen separation method of an embodiment of the present invention.
- FIG. 6 is a graph showing a result of circular dichroism spectrum analysis of atelocollagen separated and purified by atelocollagen separation method according to an embodiment of the present invention.
- FIG. 7 and 8 show the results of quantifying pepsin to confirm whether pepsin used for telopeptide remains in purified atelo collagen separated by the atelocollagen separation method of an embodiment of the present invention. Graphs and charts.
- Figure 9 shows the results of performing real-time PCR to determine whether the HEV (Hepatitis E virus), a pig-derived virus, is detected in purified atelocollagen by the atelocollagen separation method of an embodiment of the present invention Data plot.
- HEV Hepatitis E virus
- FIG. 10 is a reverse transcriptase PCR (RT-PCR) method for confirming whether JEV (Japanese encephalitis virus), a pig-derived virus, is detected in purified atelocollagen by atelocollagen separation method according to an embodiment of the present invention.
- RT-PCR reverse transcriptase PCR
- FIG. 11 is a photograph comparing solubility of succinylated atelo collagen (anionized atelo collagen) obtained using the modified atelocollagen production method of an embodiment of the present invention with conventional atelo collagen.
- pig skin was prepared from animal tissues and washed with tap water.
- animal tissue various animal tissues containing collagen, for example, oxtail, pig cartilage tissue, bone tissue, dry cloth, and the like can be used.
- the washed pig skin was cut into 2 cm x 10 cm in size, and the cut pork skin was immersed in 0.1-1 M acetic acid solution, and then swelled at 4 ° C. for 16 to 24 hours. Fat and epidermis of swollen porcine skin tissue were removed with a knife, and tissues from which fat and epidermis were removed were cut to a size of 1 cm ⁇ 1 cm.
- tissue cut to a size of 1cm ⁇ 1cm was washed 5-10 times with purified water and then placed in 90-99% ethanol solution and stirred at 4 ° C. for 16-24 hours. Then, the tissue cut to a size of 1cm ⁇ 1cm was sieved to remove the ethanol solution, and then put again in 90 ⁇ 99% ethanol solution and stirred at 4 °C or more for 5 hours.
- the stirred and treated tissues in ethanol solution were sieved, immersed in 0.1-1 M acetic acid solution, and swelled for 20-60 minutes.
- the swollen tissue was blended with 0.1-1 M acetic acid solution.
- the blended tissues were homogenized using a homogenizer.
- Pepsin was treated to the solution obtained by performing the pretreatment in Example 1-1 and stirred at 4 ° C. for 24 to 72 hours, and then the pH of the solution was adjusted to 8 to inactivate pepsin.
- step 2) After centrifuging the solution obtained in step 1) at 7,000-15,000 g at 4 ° C. for 10-30 minutes, the upper layer of fat and lower impurities were removed and the solution of the middle layer was taken.
- step 4) The solution passed through step 3) was centrifuged to obtain extracted atelo collagen acupuncture.
- step 5 Atelo collagen acupuncture extracted in step 4) was added to a 90 ⁇ 99% ethanol solution and stirred for 16-24 hours at 4 °C.
- step 6) further centrifuging the solution passed through step 5) to obtain atelo collagen acupuncture, and repeating step 5) once more.
- step 2) The solution obtained through step 1) (hereinafter, referred to as "refined collagen solution”) is separated and purified through a single process line using a separation method that combines ultrafiltration and diafiltration.
- a separation and purification apparatus 100 as shown in FIG. 1 was prepared.
- the device of FIG. 1 may be manufactured directly or may be configured using a device (model name: CENTRASETTE TM System) sold by Pall corporation.
- step 7 In the ultrafiltration process of step 7), if the rate of the filtrate solution is reduced to approximately 1 g / min or less, the filtration is stopped.
- the yield and yield of atelo collagen by a single process using the separation and purification apparatus 100 shown in FIG. Separation purification is performed to increase the purity. That is, in the separation and purification apparatus 100 of FIG. 1, the residue which is not filtered through the filtration membrane in the filtration module 30 is transferred to the feed tank 10 at a constant flow rate through the remaining portion 35 of the filtration module 30. If the ultrafiltration rate decreases below a predetermined speed in step 8), the ultrafiltration is stopped and the diafiltration process for the residue returned to the feed tank 10 is subsequently performed. At this time, the same amount of purified water as the ultrafiltered solution is added to the residue returned to the feed tank 10, and diafiltration is performed five times or more using the separation and purification apparatus 100 shown in FIG.
- the atelo collagen solution obtained by ultrafiltration through step 7 and the atelo collagen solution obtained by diafiltration through step 9) was adjusted to pH 7.0, and then lyophilized to form a sponge. Atelo collagen is finally obtained.
- the atelocollagen separation and purification method of this embodiment can solve the problem of expensive purification and inconvenient purification by consuming a large number of expensive filters when multiple filters are overlapped. That is, the ultrafiltration using the reusable filter first purified some of the atelo collagen and based on the filtration rate, the efficiency of the ultrafiltration is judged to be low, and the filtration module 30 remains immediately without replacement of the filter or the rearrangement of the device. It can be used as diafiltration device for.
- the atelocollagen separation and purification method of the present embodiment is efficient and simple to remove impurities and economically removes atelocollagen from animal tissues through a single cyclic process line using the separation and purification apparatus 100 as shown in FIG. 1. It can be separated and extracted with high purity with good yield.
- Example 2 Analytical tests such as purity and safety of atelo collagen extracted and separated in Example 1
- Atelo collagen was quantified after water removal of the extracted and purified atelocollagen (sample concentration 0.5 mg / mL) in Example 1. As a result, as shown in Figures 2 and 3, it was confirmed that the purity of the atelo collagen separated and purified using the atelocollagen separation method of one embodiment of the present invention.
- pepsin was quantified to confirm whether or not pepsin used for telopeptide remained in the extracted and purified atelocollagen in Example 1. As a result, as shown in Figures 7 and 8 it was confirmed that pepsin is not detected in the atelo collagen separated and purified through the atelocollagen separation method of an embodiment of the present invention.
- the atelocollagen separation method of the present invention is an effective method for separation and purification with high purity while maintaining the atelocollagen from the animal tissues in an undenatured state.
- HEV Hepatitis E virus
- a pig-derived virus was detected in atelocollagen extracted and purified in Example 1.
- HEV Hepatitis E virus
- a pig-derived virus was confirmed to be negative, and HEV was not detected in the atelocollagen isolated and purified using the atelocollagen separation method of the embodiment of the present invention. It was known to be harmless.
- RT-PCR Reverse Transcriptase PCR
- atelocollagen isolated and purified using the atelocollagen separation method according to an embodiment of the present invention is removed from the telopeptide as type 1 collagen. It is a high purity atelocollagen free from used pepsin and other impurities, and has been shown to be safe in terms of the risk of infection with animal viruses. Therefore, atelocollagen separated and purified using the atelocollagen separation method of one embodiment of the present invention can be applied to various fields such as cosmetics, medicines, and foods in their natural state.
- a method for preparing succinylated atelo collagen and esterified atelo collagen which is a modified atelocollagen, which is dissolved in a neutral solution and is easy to be applied to various formulations, has improved usability and biocompatibility.
- the method for producing modified atelo collagen of the present invention is improved in terms of improving yield and increasing purity than conventional methods.
- Example 3-1 Method for preparing succinylation atelo collagen
- Method for producing succinylation atelo collagen of an embodiment of the present invention is as follows.
- step 2) To the atelo collagen solution obtained in step 1), succinic anhydride is added at a rate of about 0.8 to 1.3 g per 1 g of atelo collagen added in step 1), and 0.05 to 10 minutes. The pH is maintained around 9-10 with 1M NaOH.
- step 2) The solution obtained in step 2) is stirred at 4 ° C. for 30 minutes.
- step 4) The solution stirred in step 3) is maintained at around 9-10 pH for 10 minutes using 0.05 ⁇ 1M NaOH.
- step 5 The solution obtained in step 4) is stirred at 4 ° C. for 30 minutes.
- step 6) The solution stirred in step 5) is maintained at around 9-10 pH for 10 minutes using 0.05 ⁇ 1M NaOH.
- step 7) The solution obtained in step 6) is stirred at 4 ° C. for 20 minutes.
- step 8) The solution stirred in step 7) is maintained at around 9-10 pH for 10 minutes using 0.05 ⁇ 1M NaOH.
- step 9) The solution obtained in step 8) is stirred at 4 ° C. for 10 minutes.
- step 10) The solution stirred in step 9) is adjusted to pH 9-10 using 0.05-1M NaOH.
- step 11 The solution obtained in step 10) was adjusted to pH 4.03 with 3-7M HCl to form succinylated atelo collagen precipitate and stirred at 4 ° C. for 15 minutes.
- step 12 The solution stirred in step 11) is centrifuged to obtain succinylated atelo collagen sedimentation.
- step 13 Add distilled water adjusted to pH 4.03 using 3-7M HCl at a rate of about 20 mL per 1 g of atelo collagen added in step 1) to the atelo collagen acupuncture obtained in step 12), Wash by stirring at 4 ° C. for 15 minutes.
- step 14) The solution obtained in step 13) is centrifuged to obtain washed succinylated atelo collagen precipitate.
- a reaction scheme showing a reaction in which the atelo collagen is succinylated through the manufacturing process as described above is as follows.
- the stirred solution is maintained at pH 9 to 10 for a predetermined time. This facilitates dissolution of the succinic anhydride to promote the succinylation reaction.
- the yield of succinylation atelo collagen can be improved.
- the preparation method of esterified atelo collagen of one embodiment of the present invention is as follows.
- step 2) Adjust the pH of the atelo collagen dispersion obtained in step 1) to 7.4 using 0.1-0.5M NaOH and then centrifuge to obtain only acupuncture.
- step 2) The acupuncture obtained in step 2) is stirred in purified water at a rate of about 10-100 mL per 1 g, and then put in a dialysis membrane to perform dialysis in purified water.
- a reaction scheme showing a reaction in which the atelo collagen is esterified through the manufacturing process as described above is as follows.
- the dialysis using only purified water is performed to improve the yield and purity
- the method for producing the esterified atelo collagen according to one embodiment of the present invention ethanol or methanol
- the atelo collagen dispersion containing the atelo collagen was neutralized, centrifuged to obtain only sedimentation, and then dialysis was performed using a dialysis membrane to improve purity and yield.
- Example 3 the solubility of succinylated atelo collagen (anionized atelo collagen) obtained using the modified atelocollagen preparation method of one embodiment of the present invention was compared with conventional atelo collagen. As can be seen in the photograph of Figure 11, it can be seen that the succinylation atelocollagen prepared using the modified atelocollagen production method of the present invention shows a high solubility at neutral pH (pH 6.0 ⁇ 7.0).
- succinylated atelocollagen obtained by combining succinic anhydride with atelo collagen obtained using the modified atelocollagen production method according to an embodiment of the present invention has anionic properties and is lysed at neutral pH. Can improve adhesion, proliferation, and migration.
- esterified atelocollagen obtained by combining ethanol (or methanol) with atelocollagen obtained using the modified atelocollagen production method of one embodiment of the present invention is also dissolved at neutral pH and has cationic properties. It has the advantage that it can be combined more quickly and easily with the cell.
- high purity atelo collagen obtained through ultrafiltration and diafiltration is modified to be dissolved in neutral pH solution by succinylation and esterification so that collagen is not hydrolyzed by peptide or enzymatic treatment of collagen.
- the present invention uses the atelocollagen and the modified atelocollagen as described above to create a hard layer and a porous layer (two collagen layers having different porosities) and crosslink them to improve a three-dimensional matrix.
- the method for preparing a collagen-based matrix of the structure will be described in detail step by step.
- the collagen-based matrix included in the present invention is composed of a porous membrane and a double layer of hard membrane, and basically the porous membrane and hard membrane are obtained from the atelo collagen dispersion.
- the atelo collagen dispersion for preparing a porous membrane was prepared by adding the atelocollagen obtained in Example 1 corresponding to 1 to 3% by weight in distilled water, stirring and dispersing at 4 ° C. for 1 to 2 days, and then using a pH of 0.05 to 1N NaOH. Prepare by adjusting to 7.4.
- the atherocollagen dispersion for hard film preparation was prepared by adding the atelocollagen obtained in Example 1 to 2 to 5% by weight in distilled water, stirring and dispersing for 1 to 2 days at 4 ° C., and then dispersing 0.05 to 1N NaOH. Prepare by adjusting the pH to 7.4 by addition.
- Example 5-1 1) First, the atelocollagen dispersion for preparing the porous membrane prepared in Example 5-1 was diffused on a Petri dish or a plate of releasable form to form a uniform membrane in the range of 0.05 to 1 mm, and then at -60 to -80 ° C. Lyophilized in a lyophilizer for 1-2 days to prepare a porous membrane.
- Example 5-1 the atherocollagen dispersion for hard film preparation prepared in Example 5-1 was diffused to the bottom of the releasable flat plate, and a pressure of 1-20 psi was applied to prepare a hard film of 0.05-1 mm.
- step 3 the hard membrane obtained in step 2) is dried at room temperature for about 10-20 minutes, and then the porous membrane obtained in step 1) is lightly laminated thereon and air-dried at room temperature for 1 to 2 days to harden and porous membrane. The membranes are combined to obtain a double layer.
- the double film prepared in step 5) is cut from 200 ⁇ m ⁇ 200 ⁇ m ⁇ 200 ⁇ m to a maximum of 10 mm ⁇ 15 mm ⁇ 15 mm to complete the collagen-based matrix with improved utilization as a tissue restorative material.
- Example 5-2 the collagen-based matrix manufacturing method shown in Example 5-2 will be described in more detail.
- Example 5-1 1) First, the atelo collagen prepared in Example 5-1 corresponding to 2% by weight in distilled water was added thereto, maintained at 4 ° C., and stirred for 40 hours to obtain a collagen dispersion, and 0.5N NaOH was added to the dispersion to give pH. An atelo collagen dispersion for preparing a porous membrane adjusted to 7.4 was obtained. Then, add the atelo collagen prepared in Example 5-1 corresponding to 4% by weight in distilled water, and maintained at 4 ° C and stirred for 30 hours to disperse to obtain a collagen dispersion, 0.5N NaOH was added to the dispersion to pH 7.4 An adjusted atelo collagen dispersion for hard film production was obtained.
- the atelocollagen dispersion for preparing the porous membrane was diffused on a plate of releasability to form a uniform membrane of 0.5 mm, and then lyophilized for 30 hours in a freeze dryer maintained at -70 ° C to prepare a porous membrane.
- the collagen dispersion was diffused to the bottom of the releasable flat plate, and a pressure of 10 psi was applied to the porous adsorptive plate to prepare a 0.5 mm hard membrane.
- step 3 After drying the hard membrane obtained in step 2) at room temperature for 15 minutes, the porous membrane obtained in step 2) was lightly laminated thereon and air-dried at room temperature for 30 hours to combine the hard membrane and the porous membrane to obtain a double layer.
- EDC was added to a 95 wt% ethanol solution at a concentration of 50 mM and stirred at 4 ° C. for 15 minutes to obtain a mixed solution.
- step 5 After immersing the mixed solution obtained in step 4) to the degree of immersion of the double membrane obtained in step 3), the porous membrane and the hard membrane were crosslinked at 4 ° C. for 40 hours.
- glutaraldehyde was added at a ratio of 0.625% to 95% by weight of ethanol solution and stirred at 4 ° C. for 15 minutes to obtain a mixed solution.
- step 7) After immersing the mixed solution obtained in step 6) to the degree of immersion of the double membrane obtained in step 3), the porous membrane and the hard membrane were crosslinked at 4 ° C. for 4 hours.
- a double layer obtained in step 9) was cut from 200 ⁇ m ⁇ 200 ⁇ m ⁇ 200 ⁇ m to a maximum of 10 mm ⁇ 15 mm ⁇ 15 mm to prepare a collagen-based matrix having high utility as a tissue restorative material.
- atelo collagen and hyaluronic acid is added to hyaluronic acid
- a mucopolysaccharide mucopolysaccharide
- antibiotics such as penicillin
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Abstract
본 발명은 재사용이 가능한 필터를 이용하는 한외여과 및 정용여과 방법을 융합시킨 분리방법을 이용하여 단일의 공정라인을 통해 효율적이면서 간편하게 불순물을 제거하고 동물 조직으로부터 고순도의 아텔로 콜라겐을 경제적으로 분리추출할 수 있는 아텔로콜라겐 분리방법을 제공한다.
Description
본 발명은 아텔로콜라겐 분리방법 및 이를 이용하여 제조된 고순도의 아텔로 콜라겐에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 효율적이면서 간편하게 불순물을 제거하여 동물 조직으로부터 고순도의 아텔로 콜라겐을 경제적으로 분리하는 아텔로콜라겐 분리방법 및 이를 이용하여 제조된 고순도의 아텔로 콜라겐에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 중성의 용액에도 용해되고 생체적합성이 우수하여 다양한 제형으로의 적용이 가능한 사용편의성이 개선된 개질된 아텔로콜라겐 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 개질된 아텔로 콜라겐에 관한 것이다.
그리고, 본 발명은 전술한 바와 같은 아텔로콜라겐 및 개질된 아텔로콜라겐을 이용하여 경질층 및 다공성층을 만들고 이들을 가교화시킴으로써 기계적 강도를 향상시킨 3차원 매트릭스 구조의 콜라겐 기반 매트릭스 및 그 제조방법에 관한 것이다.
조직 공학적으로 생체기능을 할 수 있는 조직을 재생하려면 다양한 세포가 충분히 분화되고 증식할 수 있는 환경을 제공해야 하는데, 조직의 형태를 유지하고 세포의 생장을 보장하는 결정적인 역할은 세포외기질(Extra-Cellular Matrix)이 담당하고 있다.
인공적으로 조직을 만들기 위해서는 기본적으로 세포가 생장하는 환경을 제공하고 세포를 증식시키는 기술이 필요하다. 일반적으로, 인공 조직 공학 분야에서는 콜라겐이나 프로테오글리칸 등의 세포외기질을 이용하여 세포의 생장환경을 제공하면서 세포증식을 위해 다양한 성장인자를 사용하고 있다.
인공조직을 만들기 위한 생체재료로서 이용되는 천연고분자의 대표적인 것은 세포외기질 중에서 콜라겐(collagen), 섬유결합소(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 라미닌(laminin) 등이 있다. 예를 들어, 콜라겐이나 섬유결합소에는 세포접착을 유도하는 아르기닌(arginine)-글리신(glycine)-아스파르트산(aspartic acid)으로 구성된 펩티드(소위, "RGD 펩티드"라고 함) 서열이 포함되어 있어, 생체재료의 표면에 RGD 펩티드를 인공적으로 배열하면 생체재료 표면과 세포의 접착을 유도하는 환경을 제공하므로 생체재료 표면과 주위 세포와의 결합으로 천연조직의 기능을 모방할 수 있다.
특히, 단백질을 생체재료로 응용하는 분야에 있어서는 전술한 다양한 천연고분자들 중에서 콜라겐이 매우 중요한 천연소재 중의 하나라고 볼 수 있다. 왜냐하면 생체내의 거의 모든 조직에 분포하는 콜라겐은 세포의 지지 및 증식을 위한 구조체로서 세포와 결합하여 장기와 조직의 형태를 형성 및 유지함으로써 생체를 구축하는데 필수 불가결한 단백질이기 때문이다.
콜라겐은 세포외기질(extra-cellular matrix)의 주 단백질 성분으로서 피부, 건(tendon), 혈관 등과 같은 결체조직을 포함한 연조직은 물론 뼈 및 치아 등과 같은 경조직에도 매우 많이 들어 있으며, 포유동물의 경우 전체 단백질의 약 1/3정도를 차지하면서 어느 일정한 질서를 갖추며 세포가 집합하여 조직이나 기관의 기본적인 구조를 형성시키는 역할을 한다. 만일 콜라겐이 없다면 다세포동물은 존재할 수가 없다. 따라서 생체의 손상부위를 그 본래의 조직으로 재생시키려고 할 때 손상부위에 조직의 세포외기질이 공급될 경우 그 조직세포가 재생력을 갖게 될 것이므로, 콜라겐을 인공 조직대체물의 기본적인 기질(matrix)로 제공한다는 것은 매우 유리하다.
한편, 생체에는 피부, 인대, 골, 혈관, 양막, 심막, 심장판막, 태반, 각막 등 콜라겐이 함유되어 있는 조직이 많지만 콜라겐의 종류는 각 조직마다 다르다. 특히 제1형 콜라겐은 피부, 인대, 골 등 거의 모든 조직에 다량 포함되어 있기 때문에 조직공학에서 가장 널리 이용되고 있다.
또한, 제1형 콜라겐 분자의 양쪽 말단에는 나선을 형성하지 않은 텔로펩타이드(telopeptide)라고 불리는 부분이 있는데, 이는 면역반응을 일으키는 주된 원인이므로, 의약품이나 화장품 등의 원료로 사용 시에는 이 부분을 제거한 아텔로콜라겐(atelocollagen)을 이용한다.
현재까지 일반적으로 사용되는 있는 제1형 콜라겐 분리방법은 동물 조직을 트립신(trypsin)으로 처리하여 세포와 분리시킨 후 세포외기질로부터 무기질과 각종 당단백을 제거하고, 콜라겐의 고유 극성이나 산 용해도를 이용하여 산 불용성 콜라겐 등을 제거하는 방식을 채택하고 있다. 이러한 방식의 제1형 콜라겐 분리를 위해 종래에는 침전법, 우레아 완충용액을 이용한 크로마토그래피 방법 및 원심분리법 등을 이용하고 있으며, 전술한 바와 같이 면역반응을 일으키는 텔로펩타이드를 제거하기 위해 펩신을 처리하고 있다.
그런데, 이러한 종래의 제1형 콜라겐 분리방법은 다단계 처리과정을 거쳐야 하므로 분리과정이 불편하고 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있을 뿐만아니라, 제1형 콜라겐을 분리하기 위해 필수적으로 사용되는 우레아를 추가적으로 분리해야 하는 불편과 텔로펩타이드 제거를 위해 사용된 펩신의 제거나 불활성화 과정이 반드시 필요한 문제가 있다. 즉, 종래의 제1형 콜라겐 분리방법은 분리과정을 더욱 복잡하고 어렵게 만들고 있으며 고순도의 제1형 콜라겐을 경제적으로 얻는 것을 어렵게 하고 있다.
또한, 콜라겐 사용에 의한 창상 치료 효과가 우수함에도 불구하고, 콜라겐을 이용한 생체재료 물질은 아직도 낮은 인장강도와 생분해적인 특성 때문에 사람 조직에서 바로 사용하기에 한계를 가지고 있다.
이와 같은 콜라겐의 특성으로 인해 콜라겐을 이용한 인공조직 등에 대한 연구는 지금까지도 활발하게 진행되고 있으며 이와 함께 동물조직에서 콜라겐을 추출하는 방법도 연구되고 있다.
이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0465015호에서는 효소처리를 통해 비콜라겐성 물질을 제거하고 면역성을 감소시킨 후 유기용매를 이용해 지방성 불순물 및 불용성 콜라겐을 추출하여 제거함으로써 높은 순도의 제1형 콜라겐을 제조하는 방법에 대해 기술하고 있다. 그러나, 상기 대한민국 등록특허 제10-0465015호와 같이 유기용매를 사용하는 경우에는 콜라겐의 변성이 있을 수 있고 인체에 유해한 유기용매의 사용은 분리된 콜라겐의 생체적용시 부작용을 낳을 수 있다는 문제점이 있었다.
또한, 대한민국 등록특허 제10-0676285호에서는 돼지의 골조직, 연골조직, 피부조직, 건/힘줄 조직을 분말화 또는 절편화하고 산처리한 후 펩신을 반복처리하여 제1형 콜라겐을 1차적으로 분리하고, 불순물 제거를 위해 3차에 걸친 염처리 및 중성으로의 적정과정을 반복한 다음, 30 내지 37℃ 저온에서 중성처리 후 원심분리하여 침전된 콜라겐을 분리하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 대한민국 등록특허 제10-0676285호의 분리방법은 콜라겐의 변성을 막으면서 지방이나 불용성 물질을 제거하는 관점에서 유리할 수 있으나 염처리 과정 및 중성으로의 적정과정이 다단계로 복잡하고 고순도의 제1형 콜라겐을 수율 좋게 경제적으로 분리하기에는 부적합한 문제점이 있었다.
이러한 문제들 때문에 지방, 불순물 단백질, 각종 불용성 불순물, 분리과정에 사용되는 우레아, 펩신 또는 기타 효소, 각종 염 등을 완전히 제거하면서 동물조직으로부터 고순도의 제1형 콜라겐을 분리하는 것은 매우 복잡하고 어려운 기술로 여겨지고 있다. 한편, 대한민국 공개특허공보 제10-2002-0029859호에서는 포유류의 연조직 또는 경조직을 산용액에 넣고 분쇄한 다음 바로 효소를 처리하고 통상의 방법으로 분리정제하는 아텔로콜라겐을 제조하는 방법을 개시하고 있으나, 이 기술 역시 분리정제 과정의 전(前) 단계의 공정을 일체화하여 단순화시켰다는 점에서 장점이 있을 뿐 추후 이루어지는 분리정제 과정에서는 투석과 여과를 이용하여 순도를 높이는 방식을 채택하고 있었다.
이와 관련하여 지금까지 콜라겐의 추출과정은 동물조직으로부터 1차적으로 분리된 콜라겐에서 각종 불순물 제거를 통한 순도를 높이는 과정에 있어서 투석(dialysis) 방법, 여러 회에 걸친 여과 방법 또는 다양한 공극의 크기를 가진 3~4개의 필터(filter)를 겹쳐서 사용하는 방법을 사용하고 있었다. 그러나, 투석 방법은 12,000~14,000 달톤(Dalton)의 제한된 막의 공극의 크기로 인해 순도를 높이는데 한계가 있었고, 다양한 공극의 크기를 가진 필터들을 여러 단계로 겹쳐서 사용하는 방법은 재사용이 불가능하여 여러 개의 고가의 필터들의 이용으로 인해 비용의 소모가 크다는 단점이 있다.
따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는 효율적이면서 간편하게 불순물을 제거하여 동물 조직으로부터 고순도의 아텔로 콜라겐을 경제적으로 분리하는 아텔로콜라겐 분리방법의 제공이 요구되고 있다고 할 수 있다.
이에 본 발명자들은 전술한 바와 같은 종래기술들의 문제점들을 해결하기 위해 재사용이 가능한 필터를 이용하는 한외여과(ultrafiltration) 및 정용여과(diafiltration) 방법을 융합시킨 분리방법을 제공하여 단일의 공정라인을 통해서도 고순도의 콜라겐을 추출하는 방법을 개발하였다.
또한, 본 발명자들은 중성의 용액에도 용해되고 생체적합성이 우수하여 다양한 제형으로의 적용이 가능한 사용편의성이 개선된 개질된 아텔로콜라겐을 제조방법을 개발하여 콜라겐의 펩타이드화 및 효소처리 등에 의한 가수분해 없이 콜라겐 본연의 상태로 화장품, 의약품, 식품 등의 다양한 분야에서도 적용할 수 있도록 하였다. 아울러, 본 발명자들은 콜라겐을 경질층 및 다공성층의 2층 구조(공극률이 서로 다른 2개의 콜라겐 층)로 만들고 가교화시킨 다공성 매트릭스 제조기법을 전술한 바와 같은 기술에 도입하여 기계적 강도를 향상시킨 3차원 매트릭스 구조를 제작함으로써 콜라겐의 낮은 인장강도와 생분해 문제를 해결하였다.
본 발명은 효율적이면서 간편하게 불순물을 제거하여 동물 조직으로부터 고순도의 아텔로 콜라겐을 경제적으로 분리하는 아텔로콜라겐 분리방법 및 이를 이용하여 제조된 고순도의 아텔로 콜라겐을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 중성의 용액에도 용해되는 수용성의 콜라겐으로 변형시켜 생체적합성을 향상시킴으로써 다양한 제형으로의 적용이 가능한 사용편의성이 개선된 개질된 아텔로콜라겐 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 개질된 아텔로 콜라겐을 제공하는데 그 목적이 있다.
추가로, 본 발명은 전술한 바와 같은 아텔로콜라겐 및 개질된 아텔로콜라겐을 이용하여 경질층 및 다공성층(공극률이 서로 다른 2개의 콜라겐 층)을 만들고 이들을 가교화시킴으로써 기계적 강도를 향상시킨 3차원 매트릭스 구조의 콜라겐 기반 매트릭스 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
우선, 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어를 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 한외여과(ultrafiltration)란 용어는 정밀여과와 역삼투압법의 중간에 위치하는 여과방법으로서, 고분자 용액으로부터 저분자물질을 제거하되 여과 멤브레인을 사이를 두고 농도차가 아닌 압력차를 이용하여 물질을 분리 여과하는 방법을 의미한다. 한외여과에 사용되는 여과 멤브레인은 분리대상이 되는 물질에 따라 다양한 크기의 세공(pore)을 갖고 있다.
또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 정용여과(diafiltration)란 용어는 한외여과에서 피드(공급물), 잔류물, 여과물의 관계에서 여과 멤브레인의 세공 보다 큰 물질들은 농축이 되고 작은 것은 여과되어 여과 멤브레인을 통과하게 되는데, 농축되는 잔류물 중에는 여과대상이 되는 원하는 물질이 일부 남아 있게 되므로 이를 다시 피드 쪽으로 복귀시킨 후 정제수 등을 첨가하여 재차 여과 멤브레인을 통해 농축을 수행하여 점진적으로 정제되는 원하는 물질의 비율을 높이는 방법을 의미한다.
이하에서는, 전술한 바와 같은 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어들을 사용하여 본 발명의 구성을 설명한다.
본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법은,
(a) 텔로펩타이드가 제거된 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 용기 내에 준비하는 단계와,
(b) 상기 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 상기 용기로부터 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시키고, 상기 여과모듈에 압력을 인가하여 상기 시료가 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되도록 하는 한외여과 과정을 수행하는 단계와,
(c) 상기 한외여과 과정을 통해 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되어 상기 여과모듈로부터 유출되는 아텔로 콜라겐 용액을 수집하는 단계와,
(d) 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되는 아텔로 콜라겐 용액의 유량을 측정하여 한외여과 속도를 결정하는 단계와,
(e) 상기 한외여과 속도가 일정한 속도 이하로 감소되면 상기 한외여과 과정을 중지하는 단계와,
(f) 상기 시료 중 상기 여과 멤브레인을 통과하지 못하고 상기 용기로 복귀되는 잔류물에 물을 첨가한 후 이를 상기 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시켜 정용여과 과정을 수행하는 단계와,
(g) 상기 정용여과 과정을 통해 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되어 상기 여과모듈로부터 유출되는 아텔로 콜라겐 용액을 수집하는 단계와,
(h) 상기 (f) 단계와 상기 (g) 단계를 반복하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 펌프에 의한 펌핑 작용에 의해 상기 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 상기 용기로부터 상기 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시키고, 상기 여과모듈에는 약 10~30psi의 압력을 인가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법에 있어서, 상기 (e) 단계에서 상기 한외여과 속도가 약 1g/분 이하로 감소되면 상기 한외여과 과정을 중지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법에 있어서, 상기 (f) 단계에서 상기 용기로 복귀되는 잔류물에는 한외여과 과정을 통해 여과된 용액과 동일한 양의 정제수를 첨가할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법에 있어서, 상기 정용여과 과정은 적어도 5회 수행할 수 있다.
한편, 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐은 전술한 바와 같은 아텔로콜라겐 분리방법에 따라 제조된 것이다.
또한, 본 발명의 일실시예의 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법은,
(a) 아텔로 콜라겐 용액에 숙신산 무수물을 넣어 반응시키고, 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응용액을 염기성 상태로 유지시키는 단계와,
(b) 상기 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응용액을 저온에서 일정 시간 동안 교반하는 단계와,
(c) 상기 (b) 단계에서 교반한 상기 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응용액을 일정 시간 동안 pH 9∼10 근처로 유지시키는 단계와,
(d) 상기 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응용액에 산을 첨가하여 상기 반응용액을 산성 상태로 전환시켜 석시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 형성하는 단계와,
(e) 상기 석시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 분리하여 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법에 있어서, 상기 (b) 단계와 상기 (c) 단계를 반복하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하기로는 상기 (b) 단계와 상기 (c) 단계는 적어도 4회 반복하는 것이 좋다.
본 발명의 일실시예의 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법은 상기 석시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 산성의 증류수로 세정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하기로는, 본 발명의 일실시예의 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법은 상기 석시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 일실시예의 석시닐화 아텔로 콜라겐은 전술한 바와 같은 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법으로 제조된 것이다.
또한, 본 발명의 일실시예의 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법은,
(a) 에탄올 또는 메탄올에 아텔로 콜라겐을 넣은 아텔로 콜라겐 분산액을 준비하고 산을 첨가하여 상기 아텔로 콜라겐 분산액을 산성 상태로 만든 후 교반하는 단계와,
(b) 상기 (a) 단계에서 교반된 상기 아텔로 콜라겐 분산액을 대략 중성 상태로 만드는 단계와,
(c) 상기 (b) 단계에서 대략 중성 상태로 된 상기 아텔로 콜라겐 분산액을 원심분리하여 에스테르화 아텔로 콜라겐 침사를 수득하는 단계와,
(d) 상기 (c) 단계에서 수득된 에스테르화 아텔로 콜라겐 침사를 투석 멤브레인에 넣어 정제수 내에서 투석을 실시하는 단계를 포함한다.
바람직하기로는 본 발명의 일실시예의 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법은 상기 (d) 단계에서 투석된 에스테르화 아텔로 콜라겐 침사를 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 일실시예의 에스테르화 아텔로 콜라겐은 전술한 바와 같은 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법으로 제조된 것이다.
추가로, 본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법은,
(a) 전술한 아텔로콜라겐 분리방법에 의해 수득한 아텔로 콜라겐 분산액을 일정한 두께로 확산시켜 일정 두께의 균일한 막을 형성한 후 이를 동결건조시켜 콜라겐 다공성층을 형성하는 단계와,
(b) 전술한 아텔로콜라겐 분리방법에 의해 수득한 아텔로 콜라겐 분산액을 일정한 두께로 확산시키고 다공성의 흡착판으로 압력을 가해서 수분은 침출시키고 콜라겐 입자들은 밀착시켜 조직이 치밀한 콜라겐 경질층을 형성하는 단계와,
(c) 상기 (b) 단계에서 형성된 콜라겐 경질층 상에 상기 (a) 단계에서 형성된 콜라겐 다공성층을 적층시키고 풍건하여 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 1차적으로 결합시키는 단계와,
(d) 상기 (c) 단계를 통해 1차적으로 결합된 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 가교화 수단을 이용하여 가교화시킴으로써 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 2차적으로 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법은, (e) 상기 가교화 수단이 가교화제인 경우 가교화제를 세정하는 단계를 더 포함한다.
또한, 더욱 바람직하기로는 상기 (e) 단계에서 가교화제를 세정한 후 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층의 이중층을 추가로 동결건조할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 다공성의 흡착판으로 가해지는 압력은 1~20psi인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 가교화 수단은 EDC[1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide] 또는 글루타르알데히드인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 사용되는 아텔로 콜라겐 분산액에는 히알루론산이 첨가될 수 있다.
한편, 본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스는 전술한 바와 같은 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법으로 제조된 것이다.
본 발명의 아텔로콜라겐 분리방법에 따르면, 재사용이 가능한 필터를 이용하는 한외여과(ultrafiltration) 및 정용여과(diafiltration) 방법을 융합시킨 분리방법을 이용하여 단일의 공정라인을 통해 효율적이면서 간편하게 불순물을 제거하고 동물 조직으로부터 고순도의 아텔로 콜라겐을 경제적으로 분리추출할 수 있다.
또한, 본 발명의 개질된 아텔로콜라겐 제조방법에 따르면 중성의 용액에도 용해되고 생체적합성이 우수하여 다양한 제형으로의 적용이 가능한 사용편의성이 개선된 개질된 아텔로콜라겐의 제조가 가능하고, 이러한 개질된 아텔로콜라겐은 콜라겐의 펩타이드화 및 효소처리 등에 의한 가수분해 없이 콜라겐 본연의 상태로 화장품, 의약품, 식품 등의 다양한 분야에서도 적용할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법에 따르면, 콜라겐을 경질층 및 다공성층의 2층 구조(공극률이 서로 다른 2개의 콜라겐 층)로 만든 후 이들을 가교화시킴으로써 콜라겐 기반 매트릭스의 기계적 강도를 향상시키고, 이러한 제조방법에 의해 제조된 3차원 다공성 콜라겐 기반 매트릭스는 수용액 중에서 다공성의 막이 부분적으로 파괴되어 손실되고 경질층과 쉽게 분리되는 문제점이 발생하지 않는 장점이 있다.
본 발명의 상기 및 다른 기술적 과제와 특징은 다음과 같은 도면을 참조하여 이루어지는 본 발명의 실시예에 대한 설명을 통하여 당업자에게 명확해 질 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법에 있어서 한외여과 및 정용여과 방법을 융합시킨 분리방법을 이용한 아텔로콜라겐 분리 및 정제에 사용되는 분리 정제 장치(100)를 개략적으로 도시하는 블럭도이다.
도 2 및 도 3은 각각 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐(시료 농도 0.5mg/mL)의 수분제거 후 아텔로 콜라겐을 정량한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다.
도 4는 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에 대해 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomasie Brilliant Blue)로 염색한 전기영동결과 사진 및 이에 대한 정량적인 분석 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에 대해 전기영동을 수행한 후 웨스턴 블롯팅을 시행하여 콜라겐 타입이 제1형 콜라겐임을 확인한 전기영동사진이다.
도 6은 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에 대해 원편광 이색성(圓偏光二色性) 스펙트럼(circular dichroism spectrum) 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 7 및 도 8은 각각 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에 텔로펩타이드 제거를 위해 사용된 펩신이 잔류하는지 여부를 확인하기 위해 펩신을 정량한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다.
도 9는 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에 돼지 유래 바이러스인 HEV(Hepatitis E virus)가 검출되는지 여부를 확인하기 위해 리얼타임 PCR을 수행한 결과를 나타내는 데이터 도표이다.
도 10은 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에 돼지 유래 바이러스인 JEV(Japanese encephalitis virus)가 검출되는지 여부를 확인하기 위해 RT-PCR(Reverse Transcriptase PCR)을 수행하고 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 본 발명의 일실시예의 개질된 아텔로콜라겐 제조방법을 이용하여 수득한 석시닐화 아텔로 콜라겐(음이온화된 아텔로 콜라겐)의 용해도를 통상의 아텔로 콜라겐과 비교한 사진이다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예 1: 아텔로 콜라겐 분리 방법
실시예 1-1: 동물조직의 전처리 과정
우선, 동물조직으로 돼지 피부를 준비하고, 수돗물을 이용하여 세척하였다. 본 실시예에서는 동물조직으로서 돼지 피부를 사용하였으나, 콜라겐을 함유하는 다양한 동물조직, 예를 들어, 소꼬리, 돼지의 연골 조직, 골조직, 건조직 등을 사용할 수 있음은 물론이다.
세척된 돼지 피부를 2cm×10cm 크기로 절단하고 절단된 돼지 피부를 0.1~1M 초산용액에 담군 후, 4℃에서 16~24시간 동안 팽윤(swelling)시켰다. 팽윤된 돼지 피부 조직의 지방 및 표피를 칼을 이용하여 제거하고, 지방 및 표피가 제거된 조직을 1cm×1cm의 크기로 절단하였다.
1cm×1cm의 크기로 절단된 조직을 정제수로 5~10회 세척한 후 90~99% 에탄올 용액에 넣어 4℃에서 16~24시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 1cm×1cm의 크기로 절단된 조직을 체에 걸러서 에탄올 용액을 제거한 후, 재차 90~99% 에탄올 용액에 넣어 4℃에서 5시간 이상 교반하였다.
그리고 나서, 에탄올 용액에서 교반되어 처리된 조직을 체에 거르고 0.1~1M 초산용액에 담군 후, 20~60분 동안 팽윤시켰다. 팽윤된 조직을 0.1~1M 초산용액으로 블렌딩(blending)하였다. 이렇게 블렌딩한 조직을 호모게나이저(homogenizer)를 이용하여 균질화하였다.
실시예 1-2: 텔로펩타이드 제거 및 아텔로 콜라겐의 추출 과정
1) 실시예 1-1에서 전처리 과정을 수행하여 수득한 용액에 펩신을 처리하고 4℃에서 24~72시간 동안 교반한 후, 상기 용액의 pH를 8로 조정하여 펩신을 불활성화시켰다.
2) 상기 1)번 과정을 통해 얻은 용액을 4℃에서 10~30분 동안 7,000~15,000g로 원심분리한 후, 상층의 지방 및 하층의 불순물을 제거하고 중간층의 용액을 취하였다.
3) 원심분리과정을 통해 분리한 상기 중간층 용액의 중량을 측정한 후, 1~10M NaCl 용액을 첨가하고 4℃에서 10~60분간 교반하여 아텔로 콜라겐을 추출하였다.
4) 상기 3)번 과정을 거친 용액을 원심분리하여, 추출된 아텔로 콜라겐 침사를 얻었다.
5) 상기 4)번 과정에서 추출한 아텔로 콜라겐 침사를 90~99% 에탄올 용액에 첨가하고 4℃에서 16~24시간 동안 교반하였다.
6) 상기 5)번 과정을 거친 용액을 추가로 원심분리하여 아텔로 콜라겐 침사를 얻고, 상기 5)번 과정을 한 번 더 반복하였다.
실시예 1-3: 아텔로 콜라겐의 분리 정제 과정
1) 실시예 1-2의 아텔로 콜라겐 추출 과정을 수행하여 수득한 용액을 원심분리하여 침사를 얻은 후, 0.01~0.1M 우레아 용액에 넣어 4℃에서 16~24 시간 동안 교반한다.
2) 상기 1)번 과정을 통해 얻은 용액(이하, "정제대상이 되는 콜라겐 용액"이라 함)을 한외여과 및 정용여과 방법을 융합시킨 분리방법을 이용하여 단일의 공정라인을 통해 분리정제한다. 이를 위해 도 1에 도시된 바와 같은 분리 정제 장치(100)를 준비하였다. 도 1의 장치는 직접 제작할 수도 있고, Pall corporation이 판매하는 장치(모델명: CENTRASETTETM System)를 이용하여 구성할 수도 있다.
3) 도 1의 분리 정제 장치(100)의 여과모듈 (30) 내에 여과 멤브레인(미도시)을 조립하고, 정제수를 이용하여 여과 멤브레인에 남아 있는 NaOH를 세척한다.
4) 도 1에 도시된 분리 정제 장치(100)의 여과모듈(30)에 제공된 피드 압력계(32)와 잔류물 압력계(34)를 확인하면서 "정제대상이 되는 콜라겐 용액"이 유입되는 피드 부분(33)과, 여과모듈(30)에 잔류하여 피드탱크(10)로 복귀되는 "잔류물(retentate)"이 유출되는 잔류 부분(35)의 압력을 모두 해제하고, 여과 멤브레인의 앞부분을 정제수를 이용하여 세척한다.
5) 도 1에 도시된 분리 정제 장치(100)의 압력조절밸브(40)를 조정하여 여과모듈(30)의 잔류 부분(35)에 10~30psi의 압력을 인가하여, 피드 부분(33)으로부터 자유롭게 유입된 정제수가 가압되도록 함으로써 정제수가 여과 멤브레인의 뒷부분도 세척하도록 한다. 세척완료 후에는 잔류 부분(35)의 압력을 해제한다.
6) "정제대상이 되는 콜라겐 용액"을 수용하기 위한 용기와 분리정제된 아텔로 콜라겐 용액을 수용하는 용기를 준비하고 이들 용기들을 도 1의 분리 정제 장치(100)에 호스를 통해 연결한다.
7) 도 1의 분리 정제 장치(100)의 압력조절밸브(40)를 조정하여 여과모듈(30)의 잔류 부분(35)에 10~30psi의 압력을 인가한다. 이렇게 하면, 피드 펌프(20)에 의한 펌핑 작용에 의해 피드 탱크(10)로부터 피드 부분(33)을 통해 여과모듈(30)에 유입되는 "정제대상이 되는 콜라겐 용액"이 가압되고 아텔로 콜라겐이 여과 멤브레인을 통과되어 여과된다. 이로써 1차적으로 "정제대상이 되는 콜라겐 용액"에 대한 한외여과가 이루어지게 되고, 정제된 일부 아텔로 콜라겐은 여과모듈(30)로부터 빠져 나와 미리 준비된 용기에 수용된다.
8) 그리고, 상기 7)번 과정의 한외여과 과정에서 여과 용액의 속도가 대략 1g/분 이하로 감소하면 여과를 멈춘다.
9) 그리고, 아텔로 콜라겐의 분리정제 과정의 간편성과 효율성을 위해 한외여과 과정과 정용여과 과정을 융합하여 도 1에 도시된 분리 정제 장치(100)를 이용한 단일공정에 의해 아텔로 콜라겐의 수율과 순도를 높이는 분리 정제를 수행한다. 즉, 도 1의 분리 정제 장치(100)에서 여과모듈(30)내의 여과 멤브레인을 통해 여과되지 않은 잔류물은 여과모듈(30)의 잔류 부분(35)을 통해 일정한 유량으로 피드탱크(10)로 복귀되는데, 상기 8)번 과정에서 한외여과 속도가 일정한 속도 이하로 감소하면 한외여과를 중단하고 피드탱크(10)로 복귀된 잔류물에 대한 정용여과 과정을 이어서 수행하게 되는 것이다. 이때, 한외여과된 용액과 동일한 양의 정제수를 피드 탱크(10)에 복귀된 잔류물에 추가하고 도 1에 도시된 분리 정제 장치(100)를 이용하여 5회 이상 정용여과를 수행한다.
10) 상기 7)번 과정을 통해 한외여과되어 수득된 아텔로 콜라겐 용액과 상기 9)번 과정을 통해 정용여과되어 수득된 아텔로 콜라겐 용액을 pH 7.0이 되도록 조정한 후, 동결건조하여 스펀지 형태의 아텔로 콜라겐을 최종적으로 얻는다.
본 실시예의 아텔로 콜라겐 분리정제 방법을 사용하면 여러 개의 필터를 겹쳐서 사용할 경우 고가의 필터를 다수 소모함으로써 정제비용이 많이 소요되고 정제가 불편한 문제를 해소할 수 있다. 즉, 재사용이 가능한 필터를 이용하는 한외여과로 우선 아텔로 콜라겐을 일부 정제하고 여과 속도를 기준으로 한외여과의 효율이 떨어지는 것으로 판단되면 필터의 교체나 장치의 재정비 없이 바로 여과모듈(30)을 잔류물에 대한 정용여과장치로 활용할 수 있다. 즉, 본 실시예의 아텔로 콜라겐 분리정제 방법은 도 1에 도시된 바와 같은 분리 정제 장치(100)를 이용한 순환식의 단일 공정라인을 통해 효율적이면서 간편하게 불순물을 제거하고 동물 조직으로부터 아텔로 콜라겐을 경제적으로 수율 좋게 고순도로 분리추출할 수 있다.
실시예 2: 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐의 순도 및 안전성 등의 분석시험
실시예 2-1: 분리정제된 아텔로 콜라겐의 순도, 변성 여부, 타입 등 분석
실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐(시료 농도 0.5mg/mL)의 수분제거 후 아텔로 콜라겐을 정량하였다. 그 결과, 도 2 및 도 3에 도시된 같이, 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리 정제된 아텔로 콜라겐의 순도가 98% 이상임을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐 아텔로 콜라겐에 대해 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomasie Brilliant Blue)로 염색하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리 정제된 아텔로 콜라겐의 펩타이드 α사슬의 존재를 확인할 수 있었고 그 순도가 98% 이상임을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐에 대해 원편광 이색성 스펙트럼(circular dichroism spectrum) 분석을 수행하였다. 도 6에 도시된 그래프에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리 정제된 아텔로 콜라겐은 변성되지 않고 펩타이드 나선쇄(α사슬) 3개가 수소결합을 한 구조를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
그리고, 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐에 텔로펩타이드 제거를 위해 사용된 펩신이 잔류하는지 여부를 확인하기 위해 펩신을 정량하였다. 그 결과, 도 7 및 도 8에 도시된 바와 같이 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 통해 분리 정제된 아텔로 콜라겐에는 펩신이 검출되지 않음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 아텔로콜라겐 분리방법은 동물조직으로부터 아텔로 콜라겐을 변성되지 않은 상태로 유지하면서 고순도로 분리정제하는데 효과적인 방법임을 알 수 있다.
한편, 도 5에 도시된 바와 같이, 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐에 대해 전기영동을 수행한 후 웨스턴 블롯팅을 시행하여 콜라겐 타입을 확인한 결과 분리정제된 아텔로 콜라겐은 제1형 콜라겐임을 확인할 수 있었다. 웨스턴 블롯팅 과정에서 1차 항체로는 마우스의 항-제1형 콜라겐 단일클론 항체를 사용하였고, 2차 항체로는 페록시다아제가 접합된 토끼의 항-마우스 IgG를 사용하였다.
실시예 2-2: 분리정제된 아텔로 콜라겐의 안전성 검사
실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐이 돼지 조직으로부터 유래한 것임을 감안하여 돼지 유래 바이러스의 존재를 검출하여 안전성 검사를 시행하였다.
우선, 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐에 돼지 유래 바이러스인 HEV(Hepatitis E virus)가 검출되는지 여부를 확인하기 위해 리얼타임 PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 9에서 확인되는 바와 같이, 돼지 유래 바이러스인 HEV가 음성인 것으로 확인되어 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리정제된 아텔로 콜라겐에서는 HEV가 검출되지 않아 인체에 무해함을 알 수 있었다.
다음으로, 실시예 1에서 추출되어 분리정제된 아텔로 콜라겐에 돼지 유래 바이러스인 JEV(Japanese encephalitis virus)가 검출되는지 여부를 확인하기 위해 RT-PCR(Reverse Transcriptase PCR)을 수행하고 전기영동하였다. 도 10의 전기영동결과 사진에서 확인되는 바와 같이, JEV에 해당하는 유전자 밴드가 나오지 않는 것으로 확인되어 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리정제된 아텔로 콜라겐에서는 JEV가 검출되지 않아 인체에 무해함을 알 수 있었다.
이상과 같은 분리정제된 아텔로 콜라겐의 순도 및 안전성 등의 분석시험에 따르면, 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리정제된 아텔로 콜라겐은 제1형 콜라겐으로서 텔로펩타이드 제거시 사용된 펩신과 기타 불순물이 제거된 고순도의 아텔로 콜라겐으로서 동물 바이러스의 감염 위험성 측면에서도 안전한 것으로 판명되었다. 따라서, 본 발명의 일실시예의 아텔로콜라겐 분리방법을 사용하여 분리정제된 아텔로 콜라겐은 본연의 상태로 화장품, 의약품, 식품 등 다양한 분야에 적용할 수 있다.
실시예 3: 개질된 아텔로 콜라겐 제조방법
이하에서는 중성의 용액에도 용해되어 다양한 제형으로의 적용이 용이하여 사용편의성 및 생체적합성이 향상된 개질된 아텔로콜라겐인 석시닐화 아텔로 콜라겐 및 에스테르화 아텔로 콜라겐의 제조방법을 설명한다. 본 발명의 개질된 아텔로 콜라겐의 제조방법은 종래의 방법 보다 수율을 향상시키고 순도를 높이는 면에서 개선된 것이다.
실시예 3-1: 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법
본 발명의 일실시예의 석시닐화 아텔로 콜라겐의 제조방법은 다음과 같다.
1) 0.1M 초산 용액에 0.002~0.01 중량%에 해당하는 아텔로 콜라겐(실시예 1에서 분리정제된 것 또는 상업적으로 구입가능한 것 모두 사용가능)을 넣고 4℃에서 1~2일간 교반시켜 아텔로 콜라겐을 용해시킨다.
2) 상기 1)번 과정에서 얻은 아텔로 콜라겐 용액에, 상기 1)번 과정에서 첨가한 아텔로 콜라겐 1g당 0.8~1.3g 정도의 비율로 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 넣고, 10분 동안 0.05~1M NaOH를 이용하여 pH를 9∼10근처로 유지시킨다.
3) 상기 2)번 과정에서 얻은 용액을 4℃에서 30분 동안 교반시킨다.
4) 상기 3)번 과정에서 교반한 용액을 0.05~1M NaOH를 이용하여 10분 동안 pH를 9∼10근처로 유지시킨다.
5) 상기 4)번 과정에서 얻은 용액을 4℃에서 30분 동안 교반시킨다.
6) 상기 5)번 과정에서 교반한 용액을 0.05~1M NaOH를 이용하여 10분 동안 pH를 9∼10근처로 유지시킨다.
7) 상기 6)번 과정에서 얻은 용액을 4℃에서 20분 동안 교반시킨다.
8) 상기 7)번 과정에서 교반한 용액을 0.05~1M NaOH를 이용하여 10분 동안 pH를 9∼10근처로 유지시킨다.
9) 상기 8)번 과정에서 얻은 용액을 4℃에서 10분 동안 교반시킨다.
10) 상기 9)번 과정에서 교반한 용액을 0.05~1M NaOH를 이용하여 pH 9∼10으로 조절한다.
11) 상기 10)번 과정에서 얻은 용액을 3~7M HCl을 이용하여 pH 4.03으로 조절하여 석시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 형성시키고, 4℃에서 15분 동안 교반한다.
12) 상기 11)번 과정에서 교반한 용액을 원심분리하여 석시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 얻는다.
13) 상기 12)번 과정에서 얻은 아텔로 콜라겐 침사에, 상기 1)번 과정에서 첨가한 아텔로 콜라겐 1g당 20mL 정도의 비율로 3~7M HCl을 이용하여 pH 4.03으로 조절된 증류수를 첨가하고, 4℃에서 15분 동안 교반하여 세정한다.
14) 상기 13)번 과정에서 얻은 용액을 원심분리하여 세정된 석시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 얻는다.
15) 상기 13)번 과정과 14)번 과정을 한번 더 반복하여 얻은 세정된 석시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 -70℃에서 30시간 동안 동결건조하여 최종적으로 석시닐화 아텔로 콜라겐을 얻는다.
전술한 바와 같은 제조공정을 통해 아텔로 콜라겐이 석시닐화되는 반응을 나타내는 반응식은 다음과 같다.
반응식 1
한편, 기존의 방법을 이용하여 석시닐화 콜라겐을 제조할 경우 숙신산 무수물의 pH가 너무 낮아도 또는 너무 높아도 용해되지 않는 문제가 있다. 숙신산 무수물은 pH가 9~10 정도일 때 용해가 가장 잘 되며 pH가 11이상이 될 경우에는 용해가 되지 않는다. 이러한 문제점에 착안하여 본 발명자들은 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응에 따라 pH가 변화되면 숙신산 무수물의 용해도가 떨어져 반응속도가 떨어지고 수율이 낮아지는 문제점을 확인하고, 이러한 문제점을 해결하기 위해 이들 반응용액의 pH를 반복하여 9~10으로 유지하는 공정(상기 3)번∼11)번 과정)을 새로이 도입하였다.
즉, 전술한 바와 같은 본 발명의 일실시예의 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법에서는 저온에서 일정 시간 동안 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응물을 교반한 후 교반한 용액을 일정 시간 동안 pH 9∼10으로 유지함으로써 숙신산 무수물의 용해가 잘 일어나도록 하여 석시닐화 반응을 촉진하였다. 이로써 본 발명의 일실시예의 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법에 따르면, 석시닐화 아텔로 콜라겐의 수율을 향상시킬 수 있다.
실시예 3-2: 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법
본 발명의 일실시예의 에스테르화 아텔로 콜라겐의 제조방법은 다음과 같다.
1) 70~90% 에탄올(또는 메탄올)에 1~5 중량%에 해당하는 아텔로 콜라겐(실시예 1에서 분리정제된 것 또는 상업적으로 구입가능한 것 모두 사용가능)을 넣은 분산액에 0.5~1M 초산(acetic acid) 또는 0.1~0.5M HCl을 넣어 pH 2~4로 조절한 후 4℃에서 4~10일 동안 교반한다.
2) 상기 1)번 과정에서 얻은 아텔로 콜라겐 분산액을 0.1~0.5M NaOH를 이용하여 pH를 7.4로 조정한 후 원심분리하여 침사만 얻는다.
3) 상기 2)번 과정에서 얻은 침사를 1g당 10~100mL 정도의 비율의 정제수에 교반한 후 투석 멤브레인(dialysis membrane)에 넣어 정제수(dialysis buffer) 내에서 투석(dialysis)을 실시한다.
4) 16~24시간 동안 교반한 후 정제수(dialysis buffer)를 교체하고, 그 후에는 3~5시간 마다 정제수(dialysis buffer)를 3~12번 교체한다.
5) 상기 3)번 과정 및 4)번 과정을 통해 투석된 에스테르화 아텔로 콜라겐 침사를 -70℃에서 30시간 이상 동결건조하고, 동결건조된 에스테르화 아텔로 콜라겐을 얻는다.
전술한 바와 같은 제조공정을 통해 아텔로 콜라겐이 에스테르화되는 반응을 나타내는 반응식은 다음과 같다.
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한편, 기존의 방법을 이용한 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법에서는 수율과 순도 향상을 위해 단순히 정제수를 이용한 투석만을 수행하는 반면에, 본 발명의 일실시예의 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법에서는 에탄올 또는 메탄올에 아텔로 콜라겐을 넣은 아텔로 콜라겐 분산액을 중성화시키고, 원심분리하여 침사만을 얻은 후 투석 멤브레인을 이용하여 투석을 수행하여 순도 및 수율을 향상시켰다.
실시예 4: 개질된 아텔로 콜라겐의 물성 평가
실시예 3에서 본 발명의 일실시예의 개질된 아텔로콜라겐 제조방법을 이용하여 수득한 석시닐화 아텔로 콜라겐(음이온화된 아텔로 콜라겐)의 용해도를 통상의 아텔로 콜라겐과 비교하였다. 도 11의 사진에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 개질된 아텔로콜라겐 제조방법을 이용하여 제조된 석시닐화 아텔로 콜라겐은 중성의 pH(pH 6.0∼7.0)에서 높은 용해도를 보이는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일실시예의 개질된 아텔로콜라겐 제조방법을 이용하여 수득한 "아텔로 콜라겐에 숙신산 무수물을 결합시킨 석시닐화 아텔로 콜라겐"은 음이온적인 성질을 띠고 있어 중성의 pH에서도 용해되며 세포의 부착, 증식, 이동을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 일실시예의 개질된 아텔로콜라겐 제조방법을 이용하여 수득한 "아텔로 콜라겐에 에탄올(또는 메탄올)을 결합시킨 에스테르화 아텔로 콜라겐 역시 중성의 pH에서도 용해되며, 양이온적인 성질을 띠고 있어 세포와 더욱 빠르고 쉽게 결합할 수 있는 장점이 있다.
따라서, 본 발명에서는 한외여과 및 정용여과 방법을 통해 얻어진 고순도의 아텔로 콜라겐을 석시닐화 및 에스테르화하여 중성의 pH 용액에서도 용해될 수 있도록 변형시켜 콜라겐의 펩타이드화 및 효소처리 등에 의한 가수분해 없이 콜라겐 본연의 상태로 화장품, 의약품, 식품 등의 다양한 분야에서도 적용할 수 있는 장점이 있는 것이다.
실시예 5: 3차원 매트릭스 구조의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법
이하에서는 본 발명은 전술한 바와 같은 아텔로콜라겐 및 개질된 아텔로콜라겐을 이용하여 경질층 및 다공성층(공극률이 서로 다른 2개의 콜라겐 층)을 만들고 이들을 가교화시킴으로써 기계적 강도를 향상시킨 3차원 매트릭스 구조의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법을 구체적으로 단계별로 설명하기로 한다.
본 발명에 포함되는 콜라겐 기반 매트릭스는 다공성막과 경질막의 2중막으로 구성되며 기본적으로 다공성막과 경질막은 아텔로 콜라겐 분산액으로부터 얻어진다.
실시예 5-1: 아텔로 콜라겐 분산액의 제조방법
우선, 다공성막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액은 증류수에 1~3 중량%에 해당하는 실시예 1에서 수득한 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃에서 1~2일간 교반 분산시킨 후 0.05~1N NaOH를 이용하여 pH를 7.4로 조절하여 준비한다.
그리고, 경질막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액은 증류수에 2~5 중량%의 실시예 1에서 수득한 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃를 유지한 상태에서 1~2일간 교반하여 분산시킨 후 0.05~1N NaOH를 첨가하여 pH를 7.4로 조절하여 준비한다.
실시예 5-2: 아텔로 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법
이하에서는 다공성막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액과, 경질막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액으로 콜라겐 기반 매트릭스를 제조하는 실시예를 설명한다.
1) 우선, 실시예 5-1에서 준비한 다공성막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액을 페트리디쉬(Petri dish) 또는 이형성의 평판 위에 확산시켜 0.05~1mm 범위의 균일한 막을 형성시킨 다음 -60~-80℃에서 1~2일간 동결건조기에서 동결건조시켜 다공성막을 제조한다.
2) 그리고, 실시예 5-1에서 준비한 경질막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액을 이형성의 평판바닥에 확산시켜 1~20psi의 압력을 가해 0.05~1mm의 경질막을 제조한다.
3) 그런 다음, 상기 2)번 과정에서 얻은 경질막을 10~20분정도 상온에서 건조시킨 후 그 위에 상기 1)번 과정에서 얻은 다공성막을 가볍게 적층시켜 상온에서 1~2일간 풍건하여 경질막과 다공성막을 결합시켜 2중막을 얻는다.
4) 90~99 중량%의 에탄올 용액에 EDC를 10~100mM농도로 첨가하여 4℃에서 10~15분간 교반하여 얻은 혼합용액에, 상기 3)번 과정에서 얻은 2중막이 잠길 정도로 침지한 후 4℃에서 1~2일간 다공성막과 경질막을 가교화시키거나, 90~99 중량%의 에탄올 용액에 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 0.5∼1% 비율로 첨가한 후 4℃에서 10∼15분 동안 교반하여 얻은 혼합용액에, 상기 3)번 과정에서 얻은 2중막이 잠길 정도로 침지한 후 4℃에서 4~8 시간 동안 다공성막과 경질막을 가교화시킨다.
5) 상기 4)번 과정에서 가교화된 2중막에서 EDC 또는 글루타르알데히드를 제거하기 위해 증류수로 4~6회 세정하고, 세정된 2중막을 다시 -60℃~-80℃에서 1~2일간 동결건조하여 정형의 2중막을 제조한다.
6) 상기 5)번 과정에서 제조된 2중막을 200㎛×200㎛×200㎛에서 최대 10mm×15mm×15mm크기로 재단하여 조직수복재로서의 활용도를 높인 콜라겐 기반 매트릭스를 완성한다.
실시예 5-3: 아텔로 콜라겐 기반 매트릭스의 구체적인 제조방법
이하에서는 상기 실시예 5-2로 제시된 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법을 좀더 구체적으로 설명한다.
1) 우선, 증류수에 2 중량%에 해당하는 실시예 5-1에서 준비한 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃를 유지하여 40시간 교반하여 분산시켜 콜라겐 분산액을 얻었고, 이 분산액에 0.5N NaOH를 넣어 pH를 7.4로 조절한 다공성막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액을 얻었다. 그리고, 증류수에 4 중량%에 해당하는 실시예 5-1에서 준비한 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃를 유지하여 30시간 교반하여 분산시켜 콜라겐 분산액을 얻고 이 분산액에 0.5N의 NaOH를 넣어 pH를 7.4로 조절한 경질막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액을 얻었다.
2) 상기 다공성막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액을 이형성의 평판 위에 확산시켜 0.5mm의 균일한 막을 형성시킨 다음 -70℃로 유지된 동결건조기에서 30시간 동결건조시켜 다공성막을 제조하였고, 경질막 제조용 아텔로 콜라겐 분산액을 이형성의 평판바닥에 확산시키고 다공성의 흡착판으로 10psi의 압력을 가해 0.5mm의 경질막을 제조하였다.
3) 상기 2)번 과정에서 얻은 경질막을 15분간 상온에서 건조시킨 후 그 위에 상기 2)번 과정에서 얻은 다공성막을 가볍게 적층시키고 상온에서 30시간 풍건하여 경질막과 다공성막을 결합시켜 2중막을 얻었다.
4) 95 중량%의 에탄올 용액에 EDC를 50mM농도로 첨가하여 4℃에서 15분간 교반하여 혼합용액을 얻었다.
5) 상기 4)번 과정에서 얻은 혼합용액에 상기 3)번 과정에서 얻은 2중막이 잠길 정도로 침지한 후 4℃에서 40시간 동안 다공성막과 경질막을 가교화시켰다.
6) 가교화시키는 또 다른 방법으로서, 95 중량%의 에탄올 용액에 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 0.625% 비율로 첨가하여 4℃에서 15분간 교반하여 혼합용액을 얻었다.
7) 상기 6)번 과정에서 얻은 혼합용액에 상기 3)번 과정에서 얻은 2중막이 잠길 정도로 침지한 후 4℃에서 4시간 동안 다공성막과 경질막을 가교화시켰다.
8) 상기 5)번 과정 및 7)번 과정에서 가교화된 2중막에서 EDC 또는 글루타르알데히드를 제거하기 위해 증류수로 15분간 5회 세정하였다.
9) 세정된 2중막을 다시 -70℃에서 30시간 동결건조하여 정형의 2중막을 얻었다.
10) 상기 9)번 과정에서 얻은 2중막을 200㎛×200㎛×200㎛에서 최대 10mm×15mm×15mm 크기로 재단하여 조직 수복재료로서의 활용도를 높인 콜라겐 기반 매트릭스를 제조하였다.
한편, 본 발명의 아텔로 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에서는 아텔로 콜라겐 분산액 대신에 콜라겐 섬유와 결합시 세포의 이동을 증가시킬 수 있는 무코다당(mucopolysaccharide)인 히알루론산을 첨가한 "아텔로 콜라겐 및 히알루론산 혼합분산액"을 사용할 수 있고, 또한 이들 분산액에 페니실린 등의 항생제를 첨가할 수도 있다(대한민국 등록특허 제10-0947765호 참조).
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
Claims (19)
- (a) 텔로펩타이드가 제거된 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 용기 내에 준비하는 단계와,(b) 상기 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 상기 용기로부터 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시키고, 상기 여과모듈에 압력을 인가하여 상기 시료가 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되도록 하는 한외여과 과정을 수행하는 단계와,(c) 상기 한외여과 과정을 통해 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되어 상기 여과모듈로부터 유출되는 아텔로 콜라겐 용액을 수집하는 단계와,(d) 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되는 아텔로 콜라겐 용액의 유량을 측정하여 한외여과 속도를 결정하는 단계와,(e) 상기 한외여과 속도가 일정한 속도 이하로 감소되면 상기 한외여과 과정을 중지하는 단계와,(f) 상기 시료 중 상기 여과 멤브레인을 통과하지 못하고 상기 용기로 복귀되는 잔류물에 물을 첨가한 후 이를 상기 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시켜 정용여과 과정을 수행하는 단계와,(g) 상기 정용여과 과정을 통해 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되어 상기 여과모듈로부터 유출되는 아텔로 콜라겐 용액을 수집하는 단계와,(h) 상기 (f) 단계와 상기 (g) 단계를 반복하는 단계를 포함하는 아텔로콜라겐 분리방법.
- 제1항에 있어서,상기 (b) 단계에서 펌프에 의한 펌핑 작용에 의해 상기 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 상기 용기로부터 상기 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시키고, 상기 여과모듈에는 10~30psi의 압력을 인가하는 것을 특징으로 하는 아텔로콜라겐 분리방법.
- 제1항에 있어서,상기 (e) 단계에서 상기 한외여과 속도가 1g/분 이하로 감소되면 상기 한외여과 과정을 중지하는 것을 특징으로 하는 아텔로콜라겐 분리방법.
- 제1항에 있어서,상기 (f) 단계에서 상기 용기로 복귀되는 잔류물에는 한외여과 과정을 통해 여과된 용액과 동일한 양의 정제수를 첨가하는 것을 특징으로 하는 아텔로콜라겐 분리방법.
- 제1항에 있어서,상기 정용여과 과정은 적어도 5회 수행하는 것을 특징으로 하는 아텔로콜라겐 분리방법.
- 청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 아텔로콜라겐 분리방법에 따라 제조된 아텔로콜라겐.
- (a) 아텔로 콜라겐 용액에 숙신산 무수물을 넣어 반응시키고, 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응용액을 염기성 상태로 유지시키는 단계와,(b) 상기 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응용액을 저온에서 일정 시간 동안 교반하는 단계와,(c) 상기 (b) 단계에서 교반한 상기 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응용액을 일정 시간 동안 pH 9∼10 근처로 유지시키는 단계와,(d) 상기 아텔로 콜라겐과 숙신산 무수물의 반응용액에 산을 첨가하여 상기 반응용액을 산성 상태로 전환시켜 석시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 형성하는 단계와,(e) 상기 석시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 분리하여 수득하는 단계를 포함하는 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법.
- 제7항에 있어서,상기 (b) 단계와 상기 (c) 단계는 적어도 4회 반복하는 것을 특징으로 하는 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법.
- 제7항에 있어서,상기 석시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 산성의 증류수로 세정하는 단계를 더 포함하는 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법.
- 제7항에 있어서,상기 석시닐화 아텔로 콜라겐 침사를 동결건조하는 단계를 더 포함하는 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법.
- 청구항 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 석시닐화 아텔로 콜라겐 제조방법에 따라 제조된 석시닐화 아텔로 콜라겐.
- (a) 에탄올 또는 메탄올에 아텔로 콜라겐을 넣은 아텔로 콜라겐 분산액을 준비하고 산을 첨가하여 상기 아텔로 콜라겐 분산액을 산성 상태로 만든 후 교반하는 단계와,(b) 상기 (a) 단계에서 교반된 상기 아텔로 콜라겐 분산액을 중성 상태로 만드는 단계와,(c) 상기 (b) 단계에서 중성 상태로 된 상기 아텔로 콜라겐 분산액을 원심분리하여 에스테르화 아텔로 콜라겐 침사를 수득하는 단계와,(d) 상기 (c) 단계에서 수득된 에스테르화 아텔로 콜라겐 침사를 투석 멤브레인에 넣어 정제수 내에서 투석을 실시하는 단계를 포함하는 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법.
- 제12항에 있어서,상기 (d) 단계에서 투석된 에스테르화 아텔로 콜라겐 침사를 동결건조하는 단계를 더 포함하는 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법.
- 청구항 제12항 또는 청구항 제13항에 정의된 에스테르화 아텔로 콜라겐 제조방법에 따라 제조된 에스테르화 아텔로 콜라겐.
- (a) 청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 아텔로콜라겐 분리방법에 의해 수득한 아텔로 콜라겐 분산액을 일정한 두께로 확산시켜 일정 두께의 균일한 막을 형성한 후 이를 동결건조시켜 콜라겐 다공성층을 형성하는 단계와,(b) 청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 아텔로콜라겐 분리방법에 의해 수득한 아텔로 콜라겐 분산액을 일정한 두께로 확산시키고 다공성의 흡착판으로 압력을 가해서 수분은 침출시키고 콜라겐 입자들은 밀착시켜 조직이 치밀한 콜라겐 경질층을 형성하는 단계와,(c) 상기 (b) 단계에서 형성된 콜라겐 경질층 상에 상기 (a) 단계에서 형성된 콜라겐 다공성층을 적층시키고 풍건하여 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 1차적으로 결합시키는 단계와,(d) 상기 (c) 단계를 통해 1차적으로 결합된 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 가교화 수단을 이용하여 가교화시킴으로써 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 2차적으로 결합시키는 단계를 포함하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
- 제15항에 있어서,상기 가교화 수단은 EDC[1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide] 또는 글루타르알데히드인 것을 특징으로 하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
- 제15항에 있어서,상기 가교화 수단이 가교화제인 경우 가교화제를 세정하는 단계를 더 포함하고, 가교화제를 세정한 후 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층의 이중층을 추가로 동결건조하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
- 제15항에 있어서,상기 (a) 단계에서 사용되는 아텔로 콜라겐 분산액에는 히알루론산이 첨가되는 것을 특징으로 하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
- 청구항 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 따라 제조된 콜라겐 기반 매트릭스.
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Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| GB201708853D0 (en) * | 2017-06-02 | 2017-07-19 | Jellagen Pty Ltd | Method |
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| GB201808106D0 (en) * | 2018-05-18 | 2018-07-04 | Cambridge Entpr Ltd | Collagen biomaterials and methods for manufacturing collagen biomaterials |
| WO2022055269A1 (ko) * | 2020-09-10 | 2022-03-17 | 주식회사 한국유니온 생명과학 | 고순도 및 고수율로 제조된 아텔로콜라겐 제조방법 및 이의 용도 |
| CN113201569B (zh) * | 2021-06-21 | 2022-08-30 | 江南大学 | 一种牛ⅰ型胶原蛋白的纯化方法 |
| CN114053166B (zh) * | 2021-11-08 | 2022-07-08 | 浙江崇山生物制品有限公司 | 一种酰化ⅰ型胶原蛋白水光针的制备方法 |
| CN116808279B (zh) * | 2023-08-25 | 2023-11-21 | 北京国械堂科技发展有限责任公司 | 一种亲水性复合胶原蛋白海绵及其制备方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4748152A (en) * | 1985-01-22 | 1988-05-31 | Opticol Corp. | Succinylated atelocollagen solution for use in viscosurgery and as a vitreous substitute |
| KR20020029859A (ko) * | 2000-10-14 | 2002-04-20 | 지귀환 | 제 1 형 아텔로교원질의 직접 분리추출 방법 |
| KR20030072512A (ko) * | 2002-03-04 | 2003-09-15 | 이재관 | 유기용매를 이용한 가용성 콜라겐의 제조방법 |
| KR100676285B1 (ko) * | 2005-03-11 | 2007-01-30 | 세원셀론텍(주) | 동물의 다양한 조직으로부터의 콜라겐 분리방법 및 콜라겐 용액의 제조방법 그리고 이를 이용하여 생산한 매트릭스 |
| KR100875136B1 (ko) * | 2008-04-16 | 2008-12-22 | 주식회사 다림바이오텍 | 돼지 유래 에스터화 아텔로콜라겐을 이용한 접착성 지혈제및 그 제조방법 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6028936A (ja) * | 1983-07-27 | 1985-02-14 | Koken:Kk | アテロコラ−ゲン水溶液およびその製造方法 |
| US5597486A (en) * | 1995-05-01 | 1997-01-28 | Millipore Investment Holdings Limited | Membrane filtration with optimized addition of second liquid to maximize flux |
| US6673370B2 (en) * | 2001-05-15 | 2004-01-06 | Biomedicines, Inc. | Oxidized collagen formulations for use with non-compatible pharmaceutical agents |
-
2010
- 2010-05-14 KR KR1020100045322A patent/KR101158338B1/ko active IP Right Grant
-
2011
- 2011-04-21 US US13/698,017 patent/US20130071645A1/en not_active Abandoned
- 2011-04-21 CN CN201180028248.3A patent/CN102933595B/zh active Active
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-
2013
- 2013-07-18 HK HK13108459.2A patent/HK1181056A1/xx unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4748152A (en) * | 1985-01-22 | 1988-05-31 | Opticol Corp. | Succinylated atelocollagen solution for use in viscosurgery and as a vitreous substitute |
| KR20020029859A (ko) * | 2000-10-14 | 2002-04-20 | 지귀환 | 제 1 형 아텔로교원질의 직접 분리추출 방법 |
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