WO2009116764A2 - Ptk7 단백질의 기능 저해를 통한 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제 - Google Patents

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WO2009116764A2
WO2009116764A2 PCT/KR2009/001298 KR2009001298W WO2009116764A2 WO 2009116764 A2 WO2009116764 A2 WO 2009116764A2 KR 2009001298 W KR2009001298 W KR 2009001298W WO 2009116764 A2 WO2009116764 A2 WO 2009116764A2
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sptk7
protein
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이승택
권영근
신원식
맹용선
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연세대학교 산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to inhibitors of cell migration, invasion or angiogenesis, and more particularly, cell migration and invasion, which can effectively inhibit angiogenesis, cell migration and cell invasion in vivo through the inhibition of function of PTK7 protein. Or providing angiogenesis inhibitors.
  • Human PTK7 (amino acid SEQ ID NO: GenBank AAN04862.1; mRNA SEQ ID NO: GenBank U40271) is an inactive type comprising an extracellular domain, a transmembrane domain, a tyrosine kinase domain, and the like.
  • Defective receptor protein tyrosine kinase (defective RPTK), a schematic of its polypeptide structure is shown at the top of FIG. 1.
  • the PTK7 polypeptide is an ER signal peptide, an extracellular domain having seven immunoglobulin (loop, Ig loops), a transmembrane domain, a juxtamembrane domain, and lack of enzyme activity. Tyrosine kinase domain and C-terminal tail region.
  • Drosophila Dtrk / OTK has been reported to be involved in neuronal cell adhesion, regulating neuronal recognition and axon guidance (Pulido, D. et al., EMBO J 11). 391-404), together with Plexin A, acts as a receptor for Sema1A, one of the cell surface ligands of the semaphorin family, repulsive axon guidance. (Winberg, ML et al., Neuron 32: 53-62).
  • Mouse PTK7 mRNA is highly expressed in the tail, ribs, segments, digestive tract, skull and facial areas early in development. Similarly, human PTK7 mRNA is elevated in the fetal colon (Mossie, K. et al., Oncogene 11: 2179-2184) and increased in metastatic colon carcinoma compared to normal colon (Saha, S. et al., Science 294: 1343-1346), reported to be reduced in metastatic melanoma (Easty, DJ et al., Int J Cancer 71: 1061-1065).
  • the first problem to be solved by the present invention is to inhibit angiogenesis, cell migration, cell invasion and cell adhesion by VEGF, inhibit the activation of PI3-kinase and Akt, and also FAK and Park By also inhibiting the activation of silin, to provide an inhibitor of cell migration, infiltration or angiogenesis that can effectively inhibit angiogenesis, cell migration and cell invasion in vivo.
  • the present invention to achieve the first object,
  • Inhibitors of cell migration, infiltration or angiogenesis through inhibition of function of PTK7 protein are inhibitors of cell migration, infiltration or angiogenesis through inhibition of function of PTK7 protein.
  • the inhibitor may comprise a soluble PTK7 protein fragment having an extracellular domain of PTK7 protein.
  • the soluble PTK7 protein fragment may include the remaining sequence except the 1 to 30th sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, more preferably Preferably, the least active fragment of the soluble PTK7 protein may be amino acid sequence 31 to 409, or amino acid sequence 327 to 409 of the human PTK7 protein of SEQ ID NO: 2.
  • the inhibitor may comprise a small RNA sequence that mediates specific RNA interference (RNAi) for messenger RNA (mRNA) encoding the PTK7 protein, more preferably the Small RNA sequences comprise small inhibitory RNA (siRNA), or small inhibitory RNA (siRNA) sequences, that form complementary bonds with messenger RNA (mRNA) sequences encoding PTK7 protein to inhibit expression of the mRNA sequence. Hairpin RNA (shRNA).
  • siRNA small inhibitory RNA
  • shRNA Hairpin RNA
  • the inhibitor may be a PTK7 protein neutralizing antibody that specifically inhibits the activity of PTK7 protein by specifically binding to PTK7 protein, and the neutralizing antibody may recognize the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the neutralizing antibody may recognize the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the cell may be a vascular endothelial cell.
  • nucleic acid' refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides in single- or double-helix form, and inherently nucleotides that bind to nucleic acids in a manner similar to naturally occurring nucleotides.
  • 'Operatively linked to' means a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, thereby The regulatory sequence will control the transcription and / or translation process of said other nucleic acid sequence.
  • a nucleic acid expression control sequence e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites
  • the term 'recombinant' as used in connection with a cell refers to the cell's replicating a heterologous nucleic acid or expressing a peptide or protein encoded by the heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can also express genes found in the cell's original form, but modified genes can be reintroduced into cells by artificial methods.
  • Promoter means a promoter capable of controlling the expression of a protein in plant cells when the gene of the desired protein is fused downstream of the promoter.
  • the promoter of the present invention can be further modified by binding to other transcription-translational active sequences.
  • Neutralizing antibodies are immune antibodies that are involved in neutralizing reactions. When an antigen, such as a virus, is toxic or infectious to an organism, it binds to the antigen and is active. It means an antibody that decays or disappears.
  • Soluble protein fragment' is a kind of simple protein that hydrolyzes to produce only amino acids, and means a protein that can be dissolved in water or salt solution.
  • Inhibitors by inhibiting angiogenesis, cell migration, cell infiltration and cell adhesion by VEGF, by inhibiting the activation of PI3-kinase and Akt, and also inhibit the activation of FAK and paxillin, Inhibitors can be provided that effectively inhibit angiogenesis, cell migration and cell infiltration in vivo.
  • Angiogenesis, cell migration and cell infiltration inhibitors according to the present invention can be carried out by a variety of means of inhibiting PTK7 function such as soluble PTK7 protein fragment treatment, PTK7 knockdown and PTK7 neutralizing antibody treatment.
  • 1 is a schematic diagram showing the structure of PTK7 polypeptide and all or part of the extracellular domain of PTK7 secreted from cells.
  • Figure 2 is a graph showing the results of analyzing the effect of sPTK7 on the angiogenesis of HUVEC induced by VEGF.
  • 3 is a graph showing the results of analyzing the effect of sPTK7 on the increase in the number of cells induced by VEGF in HUVEC.
  • 4 and 5 are graphs showing the results of analyzing the effect of sPTK7 on the cell migration and invasion of HUVEC induced by VEGF.
  • 6 and 7 are photographs and graphs showing the results of analyzing the effect of sPTK7 on in vivo angiogenesis induced by VEGF.
  • FIG. 8 is an electrophoresis result and a graph showing the results of analyzing the effect of sPTK7 on the activation of VEGF-induced signaling substances in HUVEC.
  • FIG. 9 is an electrophoresis and confocal fluorescence micrograph showing the results of analyzing the effect of sPTK7 on VEGF-induced FAK, paxillin activation, paxillin local attachment formation and actin filament formation in HUVEC.
  • FIG. 10 is a graphical representation of the results of analysis to determine the site of minimally active fragments of sPTK7 for cell migration of HUVECs induced by VEGF.
  • Figure 11 shows the sequence of siRNA (ON-TARGET plus from Dharmacon) used for PTK7 knockdown analysis.
  • Figure 12 is an electrophoresis picture showing the knockdown result of PTK7 by each siRNA and mixtures thereof.
  • Figure 13 is the information and target sequence (MISSION TRC shRNA from SIGMA-ALDRICH) of the shRNA vector used for PTK7 knockdown analysis.
  • 15 is a graph showing the results of analyzing the effect of knockdown of PTK7 on VEGF-induced angiogenesis in HUVEC.
  • 16 is an electrophoretic photograph showing the results of analyzing the effect of VEGF-induced phosphorylation of Akt by antiserum treatment of PTK7 in HUVEC.
  • the present inventors first confirmed that inhibiting the function of human PTK7 protein prevents cell migration, invasion and angiogenesis.
  • inhibiting the function of human PTK7 protein it is possible to prevent cell migration, invasion and angiogenesis and ultimately prevent and treat various diseases caused by cell migration, infiltration and angiogenesis including cancer metastasis.
  • the specific method for inhibiting function of PTK7 protein provided by the present invention can be implemented by various means, for example, by soluble PTK7 (sPTK7) protein fragment or part thereof that can compete with PTK7 protein and block its function.
  • soluble PTK7 sPTK7
  • the soluble PTK7 protein fragment was designed to have an extracellular domain or portion thereof of PTK7 as shown in FIG. 1, which inhibits angiogenesis, cell migration and invasion of vascular endothelial cells, while in vivo Inhibition of angiogenesis and inhibition of the activation of signaling proteins such as PI3-kinase and Akt was also confirmed.
  • PTK7-Ig14s fragments designed to have domains from the first Ig loop to the fourth Ig loop of the PTK7 extracellular domain were also identical to sPTK7. It inhibited the migration of vascular endothelial cells. Soluble PTK7 protein fragments according to the present invention are believed to inhibit PTK7 function by binding to ligands of PTK7 that have not yet been identified and acting as decoy receptors that compete with endogenous PTK7 proteins.
  • the soluble PTK7 (sPTK7) protein fragment that can be used in the present invention is not limited in kind as long as it can inhibit the activity of human PTK7 protein, preferably the protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the Minimal active fragments may be used.
  • the gene base sequence encoding the amino acid sequence is not limited, but preferably, the gene base sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be used.
  • the sPTK7 sequence indicated by SEQ ID NO: 2 includes a His tag, and may include an amino acid sequence except for the ER signal peptide corresponding to Nos. 1 to 30.
  • the sPTK7 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 includes 31 to 409, and more preferably, may include 327 to 409.
  • Preparation of soluble PTK7 protein fragments of the present invention comprises constructing a vector expressing a operably bound vector (pcDNA3-hPTK7-Ext-His) or a portion thereof to express human sPTK7 with His-tag, and then After transfection of the HEK293 cells to HEK293 cells, HEK293 cells expressing sPTK7 or a part thereof are isolated and cultured, and the soluble PTK7 proteins are purified in the cell culture using Ni 2+ -NTA column chromatography.
  • pcDNA3-hPTK7-Ext-His operably bound vector
  • Glutathione S-transferase at a contiguous position at the 5'- or 3'-end to facilitate purification of the recombinant peptide or protein expressed from the recombinant expression vector, which may be performed by a method, but is not limited thereto.
  • MBP maltose binding protein
  • FLAG FLAG
  • 5-7x His hexahistidine
  • NusA N utilization substance A
  • Trx Thioredoxin
  • the recombinant expression vector of the present invention is a strong promoter (e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp) when the prokaryotic cell is a host Promoters, recA promoters, SP6 promoters, trp promoters and T7 promoters, etc.), ribosomal binding sites for initiation of translation, and transcription / detox termination sequences, and genomes of mammalian cells when eukaryotic cells are a host.
  • a strong promoter e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp
  • Promoters derived from mammalian viruses e.g., metallothionine promoters
  • promoters derived from mammalian viruses e.g., adenovirus late promoters, vaccinia virus 7.5K promoters, SV40 promoters, cytomegalovirus promoters, CMV-IE promoters and HSVs Tk promoter
  • adenovirus late promoters e.g., vaccinia virus 7.5K promoters, SV40 promoters, cytomegalovirus promoters, CMV-IE promoters and HSVs Tk promoter
  • the recombinant expression vector of the present invention may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selectable label, for example, ampicillin, gentamycin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneeti Resistance genes for renal, neomycin, tetracycline and G418 resistance genes.
  • an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selectable label, for example, ampicillin, gentamycin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneeti Resistance genes for renal, neomycin, tetracycline and G418 resistance genes.
  • Preferred expression vectors of the present invention are plasmids (eg, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, etc.), phages (eg, ⁇ gt4? ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1 and M13 which are often used in the art). Etc.) or viruses (eg, SV40, etc.), but are not limited thereto.
  • Host cells capable of stable and continuous cloning and expression of vectors in the methods of the present invention may employ any host cell known in the art, for example E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3), E. Bacillus genus strains such as coli DH5 ⁇ , E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Enterobacteria and strains, such as Serratia marcesons and various Pseudomonas species.
  • E. coli JM109 E. coli BL21 (DE3)
  • E. Bacillus genus strains such as coli DH5 ⁇ , E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuring
  • yeast Sacharomyce cerevisiae
  • insect cells e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293) , HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines
  • CHO cell line Choinese hamster ovary
  • W138 BHK, COS-7, 293
  • HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293)
  • HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293) , HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines
  • the method of carrying the vector of the present invention into a host cell is performed by the CaCl2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)) when the host cell is a prokaryotic cell. , Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); 1983) and electroporation methods (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)) and the like.
  • the host cell is a eukaryotic cell
  • fine injection method Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)
  • calcium phosphate precipitation method Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973)
  • Electroporation Neuroporation
  • liposome-mediated transfection Wong, TK et al., Gene, 10:87 (1980)
  • DEAE- Dextran treatment Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)
  • gene balm Yamaang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)
  • vascular endothelial growth factor was used as an inducer of endothelial activity.
  • various concentrations of soluble PTK7 protein fragments were treated with HUVECs, followed by VEGF treatment after about 30 minutes, and the effects of soluble PTK7 protein fragments on angiogenesis of HUVECs induced by VEGF were analyzed.
  • HUVEC treated with VEGF alone in the absence of soluble PTK7 protein fragments formed reticulated vessels, but in the case of pretreatment with soluble PTK7 protein fragments, HUVEC induced concentration-dependently. Formation was inhibited (see FIG. 2).
  • mouse sPTK7 was prepared by the same method as human sPTK7, and Matrigel itself, Matrigel containing VEGF, and Matrigel containing mouse sPTK7 and VEGF were injected between the abdominal endothelial and the outer shell of the mouse to perform an in vivo Matrigel plug assay. It was. As a result, VEGF induced angiogenesis in the plug, whereas angiogenesis was significantly inhibited in the experimental group treated with VEPT with sPTK7 (see FIGS. 6 and 7).
  • PTK7-Ig14s-His contains the least active fragment of the human PTK7 extracellular domain portion, in particular the fourth intact Ig loop portion of the human PTK7 extracellular domain portion (amino acid sequence 327 to 409 of the human PTK7 protein). ) Is essential for the function of PTK7.
  • angiogenesis through the inhibition of function of PTK7 protein
  • a small inhibitory RNA is used to inhibit the expression of the mRNA sequence by forming a complementary bond with a messenger RNA (mRNA) sequence encoding the PTK7 protein to inhibit PTK7 protein function or to inhibit such small inhibitory RNA.
  • mRNA messenger RNA
  • PTK7 protein using PTK7 protein neutralizing antibody that inhibits PTK7 protein function using small hairpin RNA (shRNA) expression vectors comprising the (siRNA) sequence, or inhibits the activity of PTK7 protein by specifically binding to PTK7 protein. It may impair function.
  • shRNA small hairpin RNA
  • siRNA and shRNA vectors were used to knock down PTK7 expression, and the effects on vascular endothelial cell formation and Akt phosphorylation were analyzed.
  • the degree of knockdown of PTK7 was analyzed by Western blot using PTK7 anti-serum.
  • PTK7 was expressed after transfection of PTK7 siRNA to HUVEC or nucleic acid transfection of PTK7 shRNA vector to HEK293 cells. Since the expression was observed to be reduced by more than 70%, it was confirmed that PTK7 was knocked down effectively (see FIGS. 11 to 15).
  • PTK7 knockdown in vascular endothelial cells has the same effect as sPTK7 treatment, suggesting that sPTK7 blocks the function of endogenous PTK7 to inhibit vascular endothelial cell formation, migration, invasion and in vivo angiogenesis. I could confirm it.
  • the inhibitor can be used PTK7 protein neutralizing antibody that specifically inhibits the activity of PTK7 protein by specifically binding to PTK7 protein, in this case preferably the neutralizing antibody is represented by SEQ ID NO: 2 amino acid sequence Can be recognized (see Example 11).
  • Inhibitors of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • Compositions comprising the protein of the present invention or DNA encoding the same, oral formulations, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. Formulated in the form of can be used.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition comprising the extract of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate , Calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose in the extract. ) Or lactose, gelatin and the like are mixed.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • Vectors into which the DNA can be inserted to continuously supply the DNA encoding the protein of the present invention to the affected area include an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, and a retrovirus vector. And plasmids that can be expressed in lentivirus vectors, herpes simplex virus vectors, or animal cells.
  • Dosage forms of the composition containing the protein or DNA encoding the same can be any substrate commonly used in injections.
  • the substrate may be a mixture of distilled water, sodium chloride salt solution, a mixture of sodium chloride and mineral salts or the like, a solution of mannitol, lactose, dextran, glucose, and the like, glycine, arginine, and the like.
  • injectables may also be prepared as solutions, suspensions or colloidal solutions by adding osmotic pressure regulators, pH regulators, vegetable oils such as sesame oil or soybean oil, or surfactants such as lecithin, nonionic surfactants, etc., in the usual manner. Can be.
  • injectables may be prepared in powder form, lyophilized form and dissolved immediately before use.
  • composition containing the protein or DNA encoding the same according to the present invention as an active ingredient may be dissolved in a pre-sterilized substrate if necessary immediately before gene treatment in the solid phase, or may be used as it is without additional treatment in the liquid phase.
  • Preferred dosages of the protein of the present invention or DNA encoding the same may vary depending on the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the amount of 0.0001 to 1000 mg / kg may be administered once to several times per week, or once via a catheter after surgery, locally, at the site of disease caused by angiogenesis. It can be absorbed at the target point.
  • the dosage can be increased or decreased depending on the route of administration, degree of disease, sex, weight, age, and the like. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • the dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the protein of the present invention or DNA encoding the same can be administered to mammals such as mice, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • composition of the present invention does not necessarily mean to be approved as a medicine, it can be understood as a concept that includes a conventional functional food or even health supplements.
  • HUVECs Human umbilical vein endothelial cells
  • HUVEC contains 20% (w / v) fetal bovine serum (FBS), 100 units / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 3 ng / ml basic fibroblast growth factor (bFGF, Cultured from Upstate Biotechnology, USA) and M199 medium (purchased from Invitrogen, USA) containing 5 unit / ml heparin.
  • FBS fetal bovine serum
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • M199 medium purchasedd from Invitrogen, USA
  • HEK293 cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 10% FBS, 100 unit / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin. All cells were incubated at 37 ° C. with 5% CO 2 and 95% air.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Primer pairs used for PCR were 5'-AAAAGCTCAAGTTCACACCA-3 '(nucleotide sequences 1646-1665 of GenBank U40271) and 5'-GC.
  • TCTAGA TCA ATGATGATGATGATGATG CTGGATCATCTTGTAGGG-3 ' [His-tag coding sequence (underlined portion of the sequence), nucleotide codons 2239-2256 of GenBank U40271, termination codon and Xba I site (italic part of the sequence).
  • pcDNA3-hPTK7 Xho I nucleotide sequence 1829 of GenBank U40271
  • Xba I was cut into I (multi-cloning site of pcDNA3) to remove the 1.6 kb fragment, and then the PCR result was removed.
  • Xho I and Xba By cutting with I, a 0.45 kb fragment was isolated and conjugated to obtain a pcDNA3-hPTK7-Ext-His plasmid, which is a human sPTK7 expression vector. The prepared plasmid was confirmed that there is no PCR error through bidirectional sequencing.
  • amino acid sequences 1 to 30 of the PTK7 polypeptide are ER signal peptides, when the plasmid was introduced into eukaryotic cells, the entire PTK7 extracellular site and amino acid sequences of amino acid sequences 31 to 703 were expressed.
  • Human sPTK7 Expression Vector (pcDNA3-hPTK7-Ext-His) and Mouse sPTK7 Expression Vector (pcDNA3.1-mPtk7-Ext-His) Prepared in Example 2 (Jung, JW et al., Gene 328: 75-84)
  • HEK293 cells were transfected with calcium phosphate (calcium phosphate), respectively, and treated with 1.2 mg / ml of G418 to select G418-resistant cell clones. Selected cell clones were reselected to cell clones stably expressing human sPTK7 and mouse sPTK7 using anti-Penta-His single antibody (Qiagen, Hilden, Germany).
  • the serum-free medium in which the reselected clones were incubated for 7 days was saturated with ammonium sulfate to 70% to precipitate the proteins, and the precipitates were then diluted with 1 mM phenylmethanesulphonyl fluoride (PMSF) and 1 mM.
  • PMSF phenylmethanesulphonyl fluoride
  • PBS Phosphate buffered saline
  • EDTA ethylene diamine tetraacetic acid
  • samples were loaded on Ni 2+ -NTA agarose (purchased from Qiagen), eluted with imidazole, and repurified with PBS to obtain purified human sPTK7 and mouse sPTK7.
  • the cultured HUVECs were starvated for 6 hours in M199 medium containing 1% FBS, then separated with trypsin and dispersed in the same medium.
  • 2 x 10 5 HUVECs in 0.2 ml medium were pre-reacted with various concentrations of sPTK7 (0, 0.5, 1, 2, 4 ug / ml) for 30 minutes.
  • 0.2 mg of 10 mg / ml growth factor reduction Matrigel TM (purchased from BD Biosciences) was polymerized into each well of a 24-well plate, and then each well was treated with sPTK7-treated HUVEC and 20 ng / ml of vascular endothelium.
  • Vascular endothelial growth factor (VEGF) was added.
  • Figure 2 shows the results of analyzing the effect of sPTK7 in the vascularization process of HUVEC induced by VEGF.
  • Statistical analysis through Student's t-test showed ⁇ when the P value was less than 0.01 for the control without VEGF, and ** when the P value was less than 0.01 for the control with VEGF. *** when the value is less than 0.001.
  • the HUVEC treated with VEGF alone in the absence of sPTK7 increased the number of tubes formed by 45% compared to HUVEC treated with nothing.
  • pretreatment with sPTK7 inhibited angiogenesis of VEGF-induced HUVECs depending on sPTK7 concentration.
  • MTT assay was used to analyze whether the cytotoxicity of sPTK7 influenced the vascular endothelial cell formation.
  • 20 ⁇ l of 0.1% gelatin solution was added to each well of a 48-well plate and dried.
  • 2.0 x 10 4 HUVECs were added to each well, followed by incubation for 24 hours, followed by starvation for 6 hours in M199 culture medium containing 1% FBS.
  • the number of living cells was analyzed by MTT assay (Lee, SJ et al., Biochem Biophys Res Commun 312: 1196). -1201). As can be seen from the results of FIG.
  • the number of cells increased by 40.5% when only VEGF was treated, compared to the sample without VEGF, but in the sample treated with VEGF and the sample treated with sPTK7 together with VEGF, There was no difference. Therefore, it was found that sPTK7 did not affect the survival or reproduction of HUVEC, and it was confirmed that the vascularization inhibitory effect of vascular endothelial cells by sPTK7 was not caused by cytotoxicity.
  • cell migration was measured by a chemotactic motility assay in the Transwell system (see FIG. 4), and growth factor reduction Matrigel coated in the Transwell system.
  • Cell invasion was measured by an invasion assay (see FIG. 5). Quantitative analysis of cell migration and measurement of cell infiltration were performed as follows.
  • the bottom of the transwell was coated with 10 ⁇ l of 0.1% gelatin and dried.
  • HUVECs were starved for 6 hours in an M199 culture medium containing 1% FBS, then detached with trypsin and dispersed in the same medium.
  • Various concentrations of sPTK7 were added to make HUVEC 1 ⁇ 10 6 / ml and reacted for 30 minutes.
  • 0.1 mL of HUVEC reacted in the upper chamber of the transwell was added, and the M199 culture medium containing 10 ng / ml of VEGF and 1% FBS was added to the lower chamber and incubated at 37 ° C. for 4 hours. Cells migrated to the bottom of the filter were stained with hematoxylin and eosin.
  • the method of measuring cell invasion was the same as the method of measuring cell migration, but the difference between the dry and culture time was 24 hours by coating 80 ⁇ l of 10 mg / ml growth factor reduction Matrigel TM on the top of the transwell. After incubation, vascular endothelial cells infiltrated or infiltrated under the transwell were observed under an optical microscope (200 ⁇ ).
  • FIG. 4 and 5 are the results of analyzing the effect of sPTK7 on cell migration and infiltration of HUVEC induced by VEGF.
  • Cell migration (FIG. 4) and cell infiltration (FIG. 5) of HUVECs were determined using VEGF as a chemoattractant under and without growth factor reduction Matrigel, respectively, in the Transwell system.
  • Statistical analysis by Student's t test ⁇ when the P value is less than 0.001 for the control group not treated with VEGF, and *** when the P value is less than 0.001 for the control group treated with VEGF.
  • VEGF increased the migration of HUVEC 3.3 times, infiltration 5 times, but sPTK7 decreased the cell migration and infiltration according to the concentration. Therefore, it was confirmed that sPTK7 inhibits both migration and infiltration of HUVEC induced by VEGF in a concentration-dependent manner.
  • sPTK7 Since sPTK7 has no cytotoxicity against vascular endothelial cells and inhibits angiogenesis, cell migration and invasion, sPTK7 can be expected to inhibit angiogenesis in vivo.
  • a 7-week-old C57BL containing 20 units of heparin was added to 0.6 ml Matrigel TM containing nothing, 200 ng of mouse VEGF, or 200 ng of mouse VEGF and 20 ⁇ g of mouse sPTK7. / 6 female mice were injected between the ventral endothelial and the outer shell. After 7 days, the plugs were collected and photographed, and the hemoglobin level of each plug was measured with Drabkin's reagent kit 525 (purchased from Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) to quantify angiogenesis. .
  • FIG. 6 and 7 show the results of analyzing the effect of sPTK7 on in vivo angiogenesis induced by VEGF.
  • Five mice in each group were injected with Matrigel, Matrigel with mouse VEGF or Matrigel with mouse sPTK7 and VEGF, respectively.
  • FIG. 6 shows the results of angiogenesis in Matrigel plugs taken from each group of mice 7 days after Matrigel injection.
  • FIG. 4B shows the amount of hemoglobin in each Matrigel plug to quantify the degree of angiogenesis. It is measured.
  • Statistical analysis by Student's t test ⁇ when the P value is less than 0.001 for the control group not treated with VEGF, marked with ** when the P value is less than 0.01 for the control group treated with VEGF.
  • the plug containing only VEGF was reddish brown, whereas the plug containing Matrigel TM itself or the plug containing sPTK7 and VEGF was pale yellow (see FIG. 6), and the plug containing only VEGF contained almost 7 g / dl of hemoglobin.
  • the plug containing sPTK7 and VEGF the value was reduced to 1.5 g / dl (see FIG. 7). From the above results, it was confirmed that sPTK7 inhibits angiogenesis in vivo.
  • sPTK7 inhibits the signaling process in inhibiting HUVEC angiogenesis, cell migration and invasion.
  • Subconfluent culture HUVECs were starved for 6 hours in M199 medium containing 1% FBS. After 30 minutes of starvation, 4 ⁇ g / ml of sPTK7 was added and cultured. Then, 10 ng / ml of VEGF was added and incubated for 10 minutes (for 5 minutes in case of KDR phosphorylation assay).
  • radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer solution (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-) per 100 mm plate. 100, 0.1% SDS, 0.5% Sodium deoxycholate, 25 mM beta-glycerophosphate, 50 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4 , 1 mM PMSF) and dissolved for 20 minutes, centrifuged at 4 °C, 12,000g for 5 minutes. Isolate to obtain supernatant.
  • RIPA radioimmunoprecipitation assay
  • sPTK7 inhibited KDR (VEGFR2) phosphorylation induced by VEGF in HUVEC, and not only inhibited Akt phosphorylation but also inhibited the activity of PI3-kinase that activates Akt.
  • PI3-kinase is known to be deeply involved in angiogenesis, cell migration and cell infiltration by increasing the expression of angiogenetic cytokines (Brader, S. and Eccles, SA, Tumori 90: 2-8).
  • Akt is known to play an important role in angiogenesis by contributing to vascular maturation and permeability as well as survival, reproduction and migration of endothelial cells (Chen, J.
  • PI3-kinase and Akt activation inhibition plays an important role in the inhibition of endothelial cell migration, invasion and angiogenesis by sPTK7.
  • sPTK7 also inhibited the phosphorylation of Akt induced by bFGF in HUVEC. Therefore, sPTK7 was expected to inhibit angiogenesis, cell migration and invasion by blocking intracellular signaling processes such as PI3-kinase and Akt activated by various signaling inducers such as VEGF and bFGF.
  • VEGF focal adhesion kinase
  • paxillin focal adhesion kinase
  • FAK focal adhesion kinase
  • paxillin paxillin
  • PI3-kinase / Akt signaling mechanisms have been reported to be involved in actin reorganization and endothelial cell migration promoted by VEGF (Morales-Ruiz, M. et al., Circ Res 86: 892- 896; Radisavljevic, Z. et al., J Biol Chem 275: 20770-20774).
  • the cultured cells were treated with 3.7% paraformaldehyde for 10 minutes to fix the cells, treated with 0.5% Triton X-100 for 5 minutes, and blocked with 3% BSA for 1 hour. Subsequently, the reaction was performed with an antibody of paxillin for 2 hours, the reaction was carried out for 1 hour after the reaction with Rhodamine-conjugated secondary antibody and Phalloidin-FITC, followed by observation with a confocal microscope.
  • the effect of sPTK7 on the activation of FAK and paxillin observed sPTK7 in HUVEC was observed to inhibit tyrosine phosphorylation of FAK and paxillin induced by VEGF.
  • sPTK7 could be expected to inhibit the adhesion and migration of vascular endothelial cells by inhibiting local adhesion formation and actin reconstitution.
  • a deletion mutant of sPTK7 was constructed to determine the minimal activity of human PTK7 extracellular domain. Specifically, as shown in FIG. 1, pcDNA3.1-hPTK7-Ig13-His (the first Ig loop to the third Ig loop and the fourth Ig loop portion (amino acid sequences 31 to 344 of SEQ ID NO: 2) and His tag Expression], pcDNA3.1-hPTK7-Ig14-His [expression of the first Ig loop to the fourth Ig loop and part of the fifth Ig loop (amino acid sequence 31 to 436 of SEQ ID NO: 2) and His tag] and pcDNA3 .1-hPTK7-Ig15-His (expressing the first Ig loop to the fifth Ig loop and part of the sixth Ig loop (amino acid sequences 31 to 528 of SEQ ID NO: 2) and His tag) respectively after the last codon It was mutated by polymerase chain reaction (PCR) to have His tag codon and translation end codon.
  • PCR poly
  • pcDNA3.1-hPTK7-Ig14-His was prepared as follows.
  • the PCR was linked to the 436 amino acid of the 5th Ig loop entry of the extracellular domain of the human PTK7 protein to include His-tag coding sequence and translation end codon. Amplified through.
  • Primer pairs used for PCR were 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 '(T7 promoter sequences 863-882 of pcDNA3 vector) and 5'-GC TCTAGA TCA ATGATGATGATGATGATG CTGGGTCAGGCAATCCAA-3' for the fifth Ig loop entry (SEQ ID NO: 1). Nucleotide sequence of 1453-1470, His-tag coding sequence (underlined portion of the sequence), termination codon and XbaI site (italic portion of the sequence).
  • the PCR product and the pcDNA3.1 vector were cleaved with EcoRI and XbaI to conjugate fragments as in Example 2, so that a part of the first Ig loop to the fourth Ig loop and the fifth Ig loop of the human PTK7 extracellular domain (sequences)
  • a pcDNA3.1-hPTK7-Ig14-His plasmid expressing the amino acid sequence Nos. 1 to 436 of No. 2 and His tag was obtained.
  • the remaining plasmids were also obtained in this manner.
  • pcDNA3.1-hPTK7-Ig14s-His [expression of His tag and part from the first Ig loop to the fourth Ig loop (except amino acid sequence 31 of SEQ ID NO: 2) except for the fifth Ig loop entry part]
  • nucleotide sequences 1390 to 1470 of SEQ ID NO: 1 were deleted by PCR.
  • Primer pairs used for PCR were 5'-CATCACTGTGGCC CATCATCATCATCAT TGA TCTAGA GGGCC-3 '[SEQ ID NOS: 1377-1389, His-tag coding sequence (underlined portion of the sequence), termination codon and XbaI site (above) The italic part of the sequence) and the base sequence 997-1001 (the gothic part of the sequence) of the pcDNA3.1 vector] and 5'- GATGATGATGATG GGCCACAGTGATGTTGACATCCTGTCTC-3 '(part of the His-tag coding sequence (underlined) SEQ ID NOs: 1362-1389.
  • the PCR product was treated with DpnI, transformed into XL1-Blue Escherichia coli, and colonies were selected and cultured to obtain a deleted plasmid.
  • the prepared plasmids were confirmed to have no PCR error through bidirectional sequencing.
  • Expression plasmids of the human PTK7 extracellular domain portions prepared in this example (pcDNA3.1-hPTK7-Ig13-His, pcDNA3.1-hPTK7-Ig14s-His, pcDNA3.1-hPTK7-Ig14-His and pcDNA3.1 -hPTK7-Ig15-His) was expressed and purified as in Example 3, PTK7-Ig13-His (amino acid sequence Nos. 31 to 344 of human PTK7 protein), PTK7-Ig14s-His (human PTK7 protein) as shown in FIG.
  • PTK7-Ig13-His PTK7-Ig14s-His
  • PTK7-Ig14-His PTK7-Ig14-His
  • PTK7-Ig15-His influence the cell migration.
  • FIG. 10 the migration of HUVECs was increased 3.3-fold when only VEGF was treated, compared to when VEGF and sPTK7 or fragments thereof were not treated.
  • PTK7-Ig13-His did not reduce cell migration with concentration, but PTK7-Ig14s-His, PTK7-Ig14-His, PTK7-Ig15-His and sPTK7 reduced cell migration to a similar degree with concentration.
  • PTK7-Ig13-His was less than 0.01 for the VEGF-treated control group, but PTK7-Ig14s-His, PTK7- Ig14-His, PTK7-Ig15-His, sPTK7 had a P value of less than 0.001.
  • PTK7-Ig14s-His contains the least active fragment of the human PTK7 extracellular domain portion, and the fourth Ig loop portion (amino acid sequence 327-409 of the human PTK7 protein) in the human PTK7 extracellular domain portion is in complete form. It was confirmed that what is present is important for the function of PTK7.
  • RNA Interference (RNAi) Analysis of Angiogenesis and Akt Phosphorylation of Vascular Endothelial Cells During PTK7 Knockdown by RNA Interference (RNAi) Method
  • RNA interference was confirmed. Specifically, knocking down the expression of PTK7 by treating small interfering RNA (siRNA) of PTK7 or by inducing RNA interference by treating a small hairpin RNA (shRNA) vector of PTK7 expressing PTK7 siRNA The effects of vascular endothelial angiogenesis and Akt phosphorylation were analyzed. Knockdown of PTK7 using PTK7 siRNA in HUVEC was performed by the following method.
  • siRNA small interfering RNA
  • shRNA small hairpin RNA
  • HUVECs cultured in 6 cm petri dishes were replaced with serum-reduced medium (Opti-MEM I, purchased from Invitrogen), followed by 100 nM siRNA (Dharmacon's ON-TARGET plus family J- 003167-13, J-003167-14, J-003167-15 and J-003167-16), or mixtures thereof (see FIG. 11), using Lipofectamine (purchased from Invitrogen) for 4 hours. Incubated for transfection.
  • Opti-MEM I serum-reduced medium
  • siRNA Dharmacon's ON-TARGET plus family J- 003167-13, J-003167-14, J-003167-15 and J-003167-16
  • Lipofectamine purchased from Invitrogen
  • the nucleic acid transfer HUVECs were replaced with M199 medium (purchased from Invitrogen) containing 20% (w / v) FBS, 3 ng / ml of bFGF (Upstate Biotechnology) and 5 unit / ml of heparin and incubated for 48 hours. It was.
  • M199 medium purchased from Invitrogen
  • individual PTK7-siRNAs, J-003167-14, J-003167-15, J-003167-16, and PTK7 siRNA mixtures reduced PTK7 expression by more than 70% compared to negative control. It was shown that their knockdown efficacy is high (see FIG. 12).
  • knockdown of PTK7 using PTK7 shRNA vector in HEK293 was performed by the following method.
  • HEG293 cells cultured in 6 cm culture dishes were treated with 5 ug of Mission TRC shRNA vectors (calcium phosphate) (SIGMA-ALDRICH's Mission TRC shRNA family TRCN0000006431, TRCN0000006432, TRCN0000006433, TRCN0000006434 and TRCN0000006435, see FIG. 13).
  • Mission TRC shRNA vectors calcium phosphate
  • the nucleic acid transfected HEK293 cells were changed to DMEM medium containing 10% FBS, 100 unit / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin after 12 hours, and then cultured for 48 hours.
  • Analysis of PTK7 knockdown by each PTK7 shRNA vector in HEK293 revealed that TRCN0000006433 and TRCN0000006434 reduced the expression of PTK7 by more than 70% compared to the negative control, indicating that their PTK7 knockdown effect was high (FIG. 14).
  • PTK7 siRNA mixture was used to analyze the effect of PTK7 knockdown on cellular function.
  • 15 shows the results of analyzing the effect of knockdown of PTK7 on VEGF-induced angiogenesis in HUVEC.
  • PTK7 knockdown HUVECs were placed on growth factor-reducing Matrigel and incubated for 16 hours to determine the number of blood vessels produced, and statistically analyzed by Student's t test, with a P value of less than 0.01 for mock transfection without VEGF.
  • ⁇ P value is less than 0.001 ⁇
  • VEGF-treated control mock + VEGF
  • Akt phosphorylation was observed at levels similar to, but VEGF-induced Akt phosphorylation was inhibited in HUVEC knocked down PTK7. Since PTK7 knockdown has the same effect as sPTK7 treatment in vascular endothelial cells, it was confirmed that sPTK7 blocks endogenous PTK7 function and inhibits cell migration, invasion and angiogenesis.
  • sPTK7 In addition to sPTK7, as an alternative method of blocking PTK7 function, the antibody of PTK7 could be utilized. In previous examples, sPTK7 treatment has been shown to reduce cell migration, invasion, angiogenesis, and Akt phosphorylation when PTK7 function is inhibited. Therefore, after treatment with sPTK7 antibody, the effect on Akt phosphorylation in vascular endothelial cells was analyzed.
  • sPTK7 antiserum was prepared by injecting rabbits with purified sPTK7 as described in Example 10 and used after confirming specific recognition of PTK7. After culturing, the cells were wiped with PBS, and the supernatant was obtained in the same manner as in Example 8 with 120 ⁇ l of immunoprecipitation assay buffer per 60 mm plate. Western blots were then performed on the cell lysate supernatant.
  • PTK7 neutralizing monoclonal antibodies as well as PTK7 neutralizing polyclonal antibodies may be a method of inhibiting cell migration, invasion and angiogenesis by inhibiting the function of PTK7.
  • the sPTK7 expression and PTK7 neutralizing aptamer treatment may also inhibit cell migration and invasion. It can block angiogenesis by blocking the normal function of vascular endothelial cells.
  • Inhibitors of cell migration, cell infiltration and angiogenesis according to the present invention can be used for the treatment of various diseases including metastatic carcinoma associated with cell migration, infiltration and angiogenesis, subject cells also limited to vascular endothelial cells Rather, it can be applied to various kinds of cells expressing PTK7 and can be utilized to inhibit cell migration, invasion, and adhesion.

Abstract

본 발명은 PTK7 단백질의 기능 저해를 통한 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제에 관한 것으로서 PTK7 단백질의 기능을 저해하는 것을 특징으로 하며 이를 통해 본 발명에 따르면, VEGF에 의한 혈관 형성, 세포이동, 세포 침윤 및 세포 부착을 억제하며, PI3-키나아제(PI3-kinase) 및 Akt의 활성화를 억제한다. 또한 FAK 및 팍실린의 활성화도 저해함으로써, 생체 내에서의 혈관신생, 세포 이동 및 세포 침윤을 효과적으로 억제할 수 있다.

Description

PTK7 단백질의 기능 저해를 통한 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제
본 발명은 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 PTK7 단백질의 기능 저해를 통하여 생체 내에서의 혈관신생, 세포 이동 및 세포 침윤을 효과적으로 억제할 수 있는 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제를 제공하는 것이다.
인간 PTK7(아미노산 서열목록번호 GenBank AAN04862.1; mRNA 서열목록번호 GenBank U40271)은 세포외 도메인 (extracellular domain), 막통과 도메인 (transmembrane domain) 및 타이로신 키나아제 (tyrosine kinase domain) 도메인 등을 포함하는 비활성형 수용체 타입 단백질 인산화 효소 (defective receptor protein tyrosine kinase; defective RPTK)로서, 그 폴리펩타이드 구조에 대한 모식도가 도 1의 상단에 도시되어 있다. 구체적으로, PTK7 폴리펩타이드는 ER 신호 펩타이드, 7개의 면역글로불린 (immunoglobulin) 형태의 루프 (loop, 이하 Ig loop)를 갖는 세포외 도메인, 막통과 도메인, 막근접 도메인 (juxtamembrane domain), 효소 활성이 결여된 타이로신 키나아제 도메인 및 C-말단 꼬리 부위로 이루어져 있다.
본 발명자들은 인간 PTK7 (Park, S.K. et al., J Biochem (Tokyo) 119: 235-239)에 이어 생쥐의 PTK7 (Jung, J.W. et al., Gene 328: 75-84)을 규명한 바 있으며, 이외에도 닭의 KLG (Chou, Y.H. and Hayman, M.J., Proc Natl Acad Sci USA 88: 4897-4901), 초파리의 Dtrk/Off-track (OTK)(Pulido, D. et al., EMBO J 11: 391-404; Winberg, M.L. et al., Neuron 32: 53-62) 및 Hydra의 Lemon (Miller, M.A. and Steele, R.E., Dev Biol 224: 286-298)이 그 동위체로 간주될 수 있으므로 PTK7은 계통학상 보존되어 있다고 할 수 있다.
한편, Hydra Lemon mRNA는 정자 형성 (spermatogenesis), 난자 형성 (oogenesis) 및 수정란 발생 과정 (embryogenesis)에서 발현이 증가하는 것으로 보고되어 있고, 따라서 발생에 중요한 역할을 담당할 것으로 생각된다 (Miller, M.A. and Steele, R.E., Dev Biol 224: 286-298). 초파리 Dtrk/OTK는 신경 인지 (neuronal recognition)와 액손 유도 (axon guidance)를 조절하면서, 신경 세포 부착 (neuronal cell adhesion)에 관여할 것으로 보고된 바 있고 (Pulido, D. et al., EMBO J 11: 391-404), 플렉신 A (Plexin A)와 함께 세마포린 (Semaphorin) 계열의 세포 표면 리간드 (cell surface ligand) 중 하나인 Sema1A의 수용체 (receptor)로 작용하여 반발성 액손 유도 (repulsive axon guidance)에 관여한다는 보고가 있었다 (Winberg, M.L. et al., Neuron 32: 53-62). 또한, 닭 KLG는 플렉신 A1 (Plexin-A1)과 함께 Sema 6D와 결합하며, 플렉신 A1-KLG-Sema 6D 복합체는 닭의 심장 발생 과정에서 심실 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다 (Toyofuku, T. et al., Genes Dev 18: 435-447). 최근에는 N-말단 114개의 아미노산만으로 구성된 불완전한 PTK7을 발현하는 생쥐가 중뇌-후뇌 경계 부위에서 척수의 끝 부분까지 신경관 (neural tube)이 닫히지 않고, 입체섬모 다발 배향 (stereociliary bundle orientation)에 이상을 보여 출산 전후에 사망하며, 이러한 특징으로 인해 PTK7이 평면 세포 극성 (planar cell polarity; PCP)을 조절한다고 보고된 바 있다 (Lu, X. et al., Nature 430: 93-98).
생쥐 PTK7 mRNA는 발생 초기에 꼬리, 갈비뼈, 체절, 소화관, 두개골 및 안면 부분에서 높게 발현된다. 이와 유사하게 인간 PTK7 mRNA는 태아의 결장에서 높게 증가하며 (Mossie, K. et al., Oncogene 11: 2179-2184), 정상적인 결장에 비하여 전이성 결장암 (metastatic colon carcinoma)에서 증가되었으나 (Saha, S. et al., Science 294: 1343-1346), 전이성 흑색종 (metastatic melanoma)에서는 감소되는 것으로 보고되었다 (Easty, D.J. et al., Int J Cancer 71: 1061-1065). 따라서, 이상의 점을 종합하여 보면 종양과 같은 질병 상태에서 PTK7의 발현 정도가 높은 것이 이들 사이에 상관관계가 있다는 정도는 추정할 수 있으나, 구체적으로 PTK7이 종양의 발생 또는 세포의 이동, 침윤, 혈관 신생에 어떠한 영향을 미치는지 또는 양자간에 직접적인 인과관계가 성립하는지 여부는 확인하기 어려웠다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 VEGF에 의한 혈관 형성, 세포이동, 세포 침윤 및 세포 부착을 억제하며, PI3-키나아제(PI3-kinase) 및 Akt의 활성화를 억제하고, 또한 FAK 및 팍실린의 활성화도 저해함으로써, 생체 내에서의 혈관신생, 세포 이동 및 세포 침윤을 효과적으로 억제할 수 있는 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 첫 번째 과제를 달성하기 위하여,
PTK7 단백질의 기능 저해를 통한 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제를 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 억제제는 PTK7 단백질의 세포외 도메인을 갖는 가용성 PTK7 단백질 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 가용성 PTK7 단백질 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 1 ~ 30번째 서열을 제외한 나머지 서열을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 가용성 PTK7 단백질의 최소활성단편은 서열번호 2의 인간 PTK7 단백질의 31번 내지 409번 아미노산 서열, 또는 327번 내지 409번 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 상기 억제제는 상기 PTK7 단백질을 암호화하는 메신저 RNA (mRNA)에 대하여 특이적 RNA 간섭(RNAi)을 매개하는 소규모 RNA 서열을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 소규모 RNA 서열은 PTK7 단백질을 암호화하는 메신저 RNA (mRNA) 서열과 상보적 결합을 형성하여 상기 mRNA 서열의 발현을 억제하는 소규모 억제 RNA (siRNA), 또는 상기 소규모 억제 RNA (siRNA) 서열을 포함하는 소규모 헤어핀 RNA (shRNA)일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 억제제는 PTK7 단백질과 특이적으로 결합함으로써 PTK7 단백질의 활성을 억제하는 PTK7 단백질 중화항체일 수 있으며, 상기 중화항체는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 인식할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 세포는 혈관내피세포일 수 있다.
이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.
별도로 설명되어 있지 않다면, 용어 '핵산(nucleic acid)'은 단일- 또는 이중나선 형태에서 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 가리키고, 자연 발생하는 뉴클레오타이드와 비슷한 방식에서 핵산과 결합하는 본래 뉴클레오
타이드의 알려진 유사체들을 포함하며, 특별한 언급이 없는 한, 특정 핵산 서열은 그들의 상보적 서열을 포함한다.
'작동적으로 결합된(operatively linked to)'은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독 과정을 조절하게 된다.
세포와 관련하여 사용되는 용어 '재조합(recombinant)'은 세포가 이형의 핵산을 복제하거나 이형의 핵산에 의해 코드화되는 펩타이드 또는 단백질을 발현하는 것을 가리킨다. 또한 재조합 세포는 세포의 본래 형태에서 발견되는 유전자를 발현시킬 수 있으나, 변형된 유전자가 인공적인 방법에 의해 세포로 재도입 되어지기도 한다.
'프로모터'는 원하는 단백질의 유전자가 상기 프로모터의 다운스트림에 융합되었을 때 식물 세포에서 단백질의 발현을 조절할 수 있는 프로모터를 의미한다. 또한 본 발명의 프로모터는 다른 전사-번역 활성 서열에 결합하여 더욱 변형될 수 있다.
'중화항체(neutralizing antibody)'는 중화 반응에 관여하는 면역 항체로서 바이러스 따위의 항원(抗原)이 생체에 대하여 독성(毒性)이나 감염력 따위의 활성(活性)을 가졌을 때, 그 항원에 결합하여 활성을 감퇴시키거나 소실하는 항체를 의미한다.
'가용성 단백질 단편'은 가수 분해하여 아미노산만을 생성하는 단순 단백질의 일종으로 물 또는 염류 용액에 용해할 수 있는 단백질을 의미한다.
본 발명에 따르면, VEGF에 의한 혈관 형성, 세포이동, 세포 침윤 및 세포 부착을 억제하며, PI3-키나아제(PI3-kinase) 및 Akt의 활성화를 억제하고, 또한 FAK 및 팍실린의 활성화도 저해함으로써, 생체 내에서의 혈관신생, 세포 이동 및 세포 침윤을 효과적으로 억제하는 억제제를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 혈관신생, 세포이동 및 세포침윤 억제제는 가용성 PTK7 단백질 단편 처리, PTK7 녹다운 및 PTK7 중화 항체 처리 등과 같은 다양한 PTK7 기능 저해 수단들에 의해서 수행될 수 있다.
도 1은 PTK7 폴리펩타이드 구조와, 세포에서 분비시킨 PTK7의 세포외 도메인 전체 또는 일부를 나타낸 모식도이다.
도 2는 VEGF에 의하여 유도된 HUVEC의 혈관형성에 대한 sPTK7의 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 HUVEC에서 VEGF에 의하여 유도된 세포 수의 증가에서 sPTK7의 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4 및 도 5는 VEGF에 의하여 유도된 HUVEC의 세포 이동 및 침윤에 대한 sPTK7의 영향을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6 및 도 7은 VEGF에 의해 유도되는 생체 내 혈관신생에 대한 sPTK7의 영향을 분석한 결과를 사진 및 그래프로 도시한 도면이다.
도 8은 HUVEC에서 VEGF에 의하여 유도된 신호전달물질들의 활성화에서 sPTK7의 영향을 분석한 결과를 나타내는 전기영동 결과 및 그래프이다.
도 9는 HUVEC에서 VEGF에 의하여 유도된 FAK, 팍실린의 활성화, 팍실린의 국소 부착 형성 및 actin filament 형성에서 sPTK7의 영향을 분석한 결과를 나타내는 전기영동 결과 및 공초점 형광 현미경 사진이다.
도 10은 VEGF에 의하여 유도된 HUVEC의 세포 이동에 대한 sPTK7의 최소활동단편 부위를 결정하기 위해 분석한 결과를 그래프로 도시한 도면이다.
도 11은 PTK7 녹다운 분석에 사용된 siRNA의 서열(Dharmacon사의 ON-TARGET plus)이다.
도 12는 각 siRNA 및 이들의 혼합물에 의한 PTK7의 녹다운 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 13은 PTK7 녹다운 분석에 사용된 shRNA vector의 정보 및 표적 서열 (SIGMA-ALDRICH사의 MISSION TRC shRNA)이다.
도 14는 shRNA vector에 의한 PTK7의 녹다운 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 15는 HUVEC에서 PTK7의 녹다운이 VEGF에 의하여 유도된 혈관 형성에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 HUVEC에서 PTK7의 항혈청 처리에 의하여 VEGF에 의하여 유도된 Akt의 인산화에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
상술한 바와 같이, 종래에는 종양과 같은 질병 상태에서 PTK7 단백질이 과량 발현된다는 정도만 알려졌을 뿐, PTK7 단백질이 종양 발생이나 이와 관련한 과정과 직접적인 연관이 있는지 여부 및 있다면 어떠한 발생기작에 영향을 미쳤는지 여부는 알려지지 않았다.
이에, 본 발명자들은 인간 PTK7 단백질의 기능을 억제하였을 때 세포의 이동, 침윤 및 혈관신생을 막는다는 것을 최초로 확인하였다. 따라서, 인간 PTK7 단백질의 기능을 억제함으로써 세포의 이동, 침윤 및 혈관신생을 막아 궁극적으로 암 전이를 비롯한 세포의 이동, 침윤 및 혈관신생으로 인해 발생하는 각종 질병을 예방 및 치료할 수 있을 것이다.
이하에서는 인간 PTK7의 활성을 억제할 수 있는 여러가지 억제수단을 제공하고자 하나 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로 본 발명에서 제공되는 PTK7 단백질의 구체적인 기능 저해 방법은 다양한 수단에 의해서 구현될 수 있는데, 예를 들어 PTK7 단백질과 경쟁하여 그 기능을 차단할 수 있는 가용성 PTK7 (sPTK7) 단백질 단편 또는 그 일부에 의해서도 구현될 수 있다. 상기 가용성 PTK7 단백질 단편은 도 1에 도시된 바와 같은 PTK7의 세포외 도메인 (extracellular domain) 또는 그 일부를 갖도록 제작되었으며, 이는 혈관내피세포의 혈관 형성과, 세포 이동 및 침윤을 저해하는 동시에, 생체 내 혈관 신생을 저해하였으며, PI3-키나아제와 Akt 등의 신호전달 단백질의 활성화를 억제하는 기능도 수행하는 것으로 확인되었다. 또한 PTK7 세포외 도메인 중 첫번째 Ig loop부터 네번째 Ig loop까지의 도메인을 갖도록 제작된 PTK7-Ig14s 단편 역시 sPTK7과 동일하게 혈관내피세포의 이동을 저해하였다. 본 발명에 따른 가용성 PTK7 단백질 단편은 아직 규명되지 않은 PTK7의 리간드 (ligand)와 결합하여 내생적 PTK7 단백질과 경쟁하는 가짜 수용체 (decoy receptor)로 작용함으로써 PTK7의 기능을 저해하는 것으로 추정된다.
구체적으로 본 발명에 사용될 수 있는 가용성 PTK7 (sPTK7) 단백질 단편은 인간 PTK7 단백질의 활성을 저해할 수 있는 것이면 종류의 제한이 없으나, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질이나 상기 단백질의 최소활성단편을 사용할 수 있다. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 것이면 이를 코딩하는 유전자 염기서열은 제한이 없으나 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 유전자 염기서열을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 서열목록 2로 포시되는 sPTK7 서열은 His tag을 포함하고 있으며, 1번 ~ 30번에 해당하는 ER 신호 펩타이드이므로 이를 제외한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한편 최소활성단편은 실시예 9에서 알 수 있는 바와 같이 서열목록 2로 포시되는 sPTK7 아미노산 서열 중 31번 ~ 409번을 포함하며, 보다 바람직하게는 327번 ~ 409번을 포함할 수 있다.
본 발명의 가용성 PTK7 단백질 단편의 제조는, His-tag을 갖는 인간 sPTK7을 발현하도록 작동적으로 결합된 벡터(pcDNA3-hPTK7-Ext-His) 또는 그 일부를 발현하는 벡터를 제작한 다음, 이 벡터들을 HEK293 세포에 핵산전달감염 (transfection)시킨 후, sPTK7 또는 그 일부를 발현하는 HEK293 세포를 각각 분리하여 배양하고, 그 세포 배양액에서 Ni2+-NTA 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 가용성 PTK7 단백질들을 정제하는 방법에 의해서 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 재조합 발현벡터로부터 발현되는 재조합 펩타이드 또는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 5'- 또는 3'-말단의 인접한 위치에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), FLAG, 5 ~ 7x His (hexahistidine), NusA (N utilization substance A) 또는 Trx(Thioredoxin)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 포함될 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 발현벡터는 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함할 수 있으며, 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, CMV-IE 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 가질 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 발현벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린에 대한 내성 유전자 및 G418 저항성 유전자가 있다.
본 발명의 바람직한 발현벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322,pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4?λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예:SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법에서 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli DH5α, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 인간 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac.Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명에서는 sPTK7이 인간 혈관내피세포의 혈관 형성, 세포 이동 및 침윤을 억제하는지 여부를 분석하기 위해서, 혈관내피세포로는 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)을 사용하였고, 혈관내피세포의 활성 유도 물질로는 혈관내피 성장인자 (vascular endothelial growth factor; VEGF)를 사용하였다. 상기 분석방법에서는 여러 농도의 가용성 PTK7 단백질 단편을 HUVEC에 처리한 뒤, 약 30분 경과 후에 VEGF를 처리하고, VEGF에 의해 유도된 HUVEC의 혈관 형성에 대한 가용성 PTK7 단백질 단편의 영향을 분석하였다. 분석 결과, 가용성 PTK7 단백질 단편이 없는 상태에서 VEGF만을 처리한 HUVEC은 혈관과 유사한 형태로 그물 모양의 관들을 형성하였지만, 가용성 PTK7 단백질 단편을 전처리한 경우에는 농도 의존적으로 VEGF에 의하여 유도된 HUVEC의 관 형성을 억제하였다 (도 2 참조).
또한, 혈관내피세포의 혈관 형성에서 가용성 PTK7 단백질 단편의 세포 독성이 영향을 미쳤는지 여부를 분석해보기 위해서, 가용성 PTK7 단백질 단편을 처리한 후 HUVEC의 세포 수 변화를 MTT 분석법으로 조사하였으며, 그 결과 가용성 PTK7 단백질 단편이 HUVEC의 생존이나 번식에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(도 3 참조). 따라서, 가용성 PTK7 단백질 단편에 의한 혈관내피세포의 혈관 형성 억제 작용은 세포 독성에 의한 것이 아니라는 점을 확인할 수 있었다.
한편, 혈관내피세포의 혈관 형성에는 세포 이동과 침윤이 중요한 과정이므로, Transwell 시스템에서 화학주성 이동성 분석 방법 (chemotactic motility assay)으로 세포 이동을 측정하였고 (도 4 참조), Transwell 시스템에서 성장 인자 감소 Matrigel (growth factor-reduced Matrigel)을 코팅한 후 침윤 분석법 (invasion assay)으로 세포 침윤을 측정하였다 (도 5 참조). 각각에서 이동 및 침윤을 보인 세포 수를 정량 분석한 결과, 가용성 PTK7 단백질 단편은 농도 의존적으로 VEGF에 의하여 유도된 HUVEC의 이동 및 침윤을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 실험 결과들로부터 가용성 PTK7 단백질 단편이 생체 외 (in vitro)에서 세포 독성이 없고, 혈관내피세포의 혈관 형성, 세포 이동 및 침윤을 억제한다는 사실을 확인할 수 있었으므로, 생체 내 (in vivo)에서도 동일한 활성을 갖는지 확인하고자 하였다. 이를 위해서, 인간 sPTK7과 동일한 방법으로 생쥐 sPTK7을 제조하였으며, Matrigel 자체, VEGF를 포함하는 Matrigel, 생쥐 sPTK7과 VEGF를 포함하는 Matrigel을 생쥐의 복부 내피와 외피 사이에 주사하여 in vivo Matrigel 플러그 분석법을 수행하였다. 실험 결과, VEGF는 플러그 (plug)에 혈관신생을 유도한 반면, sPTK7를 VEGF와 같이 처리한 실험군에서는 혈관신생이 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다 (도 6 및 7 참조).
한편, sPTK7의 최소활성단편 부위를 결정하기 위하여 His-tag을 갖는 sPTK7의 각 Ig loop 도메인들을 발현, 정제하여 sPTK7과 같은 방법으로 세포 이동을 측정하였다. 실험 결과, PTK7-Ig14s-His, PTK7-Ig14-His 및 PTK7-Ig15-His는 농도 의존적으로 VEGF에 의한 HUVEC의 이동을 저해하는 것을 확인할 수 있었다 (도 1 및 도 10 참조). 그러나, PTK7-Ig13-His는 sPTK7에 비하여 매우 약한 세포 이동 억제능을 보였다. 이러한 결과로부터 PTK7-Ig14s-His가 인간 PTK7 세포외 도메인 부분의 최소활성 단편을 포함하며, 특히 인간 PTK7 세포외 도메인 부분에서 손상되지 않은 네번째 Ig loop 부분(인간 PTK7 단백질의 327번부터 409번 아미노산 서열)이 PTK7의 기능에 필수적이라는 것을 확인하였다.
본 발명에서는 PTK7 단백질의 기능 저해를 통해서 혈관신생, 세포 이동 및 세포 침윤을 억제할 수 있는 억제제를 제공하는 것에 기술적 특징이 있으며, 따라서 이러한 PTK7 단백질의 기능 저해는 가용성 PTK7 단백질 단편을 억제제로 사용하는 방법 이외에도 다양한 억제제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, PTK7 단백질을 암호화하는 메신저 RNA (mRNA) 서열과 상보적 결합을 형성함으로써 상기 mRNA 서열의 발현을 억제하는 소규모 억제 RNA (siRNA)를 사용하여 PTK7 단백질 기능을 저해하거나, 이러한 소규모 억제 RNA (siRNA) 서열을 포함하는 소규모 헤어핀 RNA (shRNA) 발현벡터를 사용하여 PTK7 단백질 기능을 저해하거나, 또는 PTK7 단백질과 특이적으로 결합함으로써 PTK7 단백질의 활성을 억제하는 PTK7 단백질 중화 항체를 사용하여 PTK7 단백질 기능을 저해할 수도 있다.
RNAi를 사용하는 PTK7 단백질 기능 저해 효과를 확인하기 위해서, siRNA 및 shRNA 벡터를 사용하여 PTK7의 발현을 녹다운한 뒤, 혈관내피세포의 혈관 형성과 Akt 인산화에 미치는 영향을 분석하였다. PTK7의 녹다운 정도는 PTK7 항-혈청 (anti-serum)을 사용하여 웨스턴 블랏으로 분석하였으며, 분석 결과, HUVEC에 PTK7 siRNA를 핵산전달감염시키거나 HEK293 세포에 PTK7 shRNA 벡터를 핵산전달감염시킨 후 PTK7의 발현이 70% 이상 감소한 것으로 관찰되었으므로, PTK7이 효과적으로 녹다운되었음을 확인하였다 (도 11 ~ 15 참조). 따라서, 혈관내피세포에서 PTK7 녹다운이 sPTK7 처리와 같은 효과를 보이므로, sPTK7이 내생적 (endogenous) PTK7의 기능을 차단하여 혈관내피세포의 혈관 형성, 이동, 침윤 및 생체 내 혈관신생을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 상기 억제제의 다른 실시예로서 PTK7 단백질과 특이적으로 결합함으로써 PTK7 단백질의 활성을 억제하는 PTK7 단백질 중화항체를 이용할 수 있으며, 이 경우 바람직하게는 상기 중화항체는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 인식할 수 있다(실시예 11 참조).
본 발명의 억제제는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 환부에 지속적으로 공급하기 위해 상기 DNA를 삽입할 수 있는 벡터로는 아데노바이러스 (adenovirus) 벡터, 아데노관련 바이러스(adeno-associated virus) 벡터, 레트로바이러스 (retrovirus) 벡터, 렌티바이러스 (lentivirus) 벡터, 단순포진 바이러스 (herpes simplex virus) 벡터 또는 동물 세포에서 발현될 수 있는 플라스미드에 포함됨을 특징으로 한다.
상기 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA를 함유하는 조성물의 투여 형태는 주사제에서 통상적으로 사용되는 어떠한 기재라도 사용 가능하다. 예를 들어, 기재는 증류수, 염화나트륨 염 용액, 염화나트륨 및 무기물염의 혼합물 또는 그와 유사한 혼합물, 만니톨, 락토스, 덱스트란, 글루코스 등의 용액, 글리신, 아르기닌 같은
아미노산 용액, 유기산 용액 또는 염 용액 및 글루코스 용액의 혼합 및 이와 유사한 용액 등을 포함한다. 또한, 주사제는 통상의 방법으로 삼투압 조절제, pH 조절제, 참기름이나 콩기름과 같은 식물성 기름, 또는 레시틴, 비이온성 표면활성제와 같은 표면활성제를 상기한 기재에 첨가하여 용액, 현탁액 또는 콜로이드 용액 등으로 제조할 수 있다. 이러한 주사제는 분말형, 동결건조형 등으로 제조하여 사용하기 바로 전에 용해하여 쓸 수도 있다.
본 발명에 따른 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA를 유효성분으로 함유하는 조성물은 고체상인 경우 유전자 치료 바로 전에 필요하면 미리 멸균한 기재에 용해하여 사용하거나, 액상인 경우 별도의 처리 없이 그대로 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 혈관신생에 의해 유발되는 질환 부위에 국부적으로 0.0001 내지 1000 mg/㎏의 양을 1주에 1회 내지 수회 투여하거나, 수술 이후에 카테터 (catherter)와 같은 것을 통해 일회 투여하여 목표 지점에서 흡수되도록 할 수 있다. 그 투여량은 투여경로, 질환의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물을 포함하는 것으로써 반드시 의약품으로 허가되는 것만을 의미하지는 않으며, 통상적인 기능성 식품 또는 건강 보조식품까지도 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니될 것이다.
< 실시예 1> 세포 배양
인간의 탯줄 정맥 (human umbilical vein)에 콜라겐 분해효소를 처리하여 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)를 분리하였다. HUVEC은 20% (w/v) 우태아혈청 (fetal bovine serum; FBS), 100 units/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 3 ng/ml 기초 섬유모세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor; bFGF, Upstate Biotechnology, U.S.A.로부터 구입) 및 5 unit/ml 헤파린을 함유한 M199 배지 (Invitrogen, U.S.A.로부터 구입)에서 배양하였다. 한편, HEK293 세포를 10% FBS, 100 unit/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)에서 배양하였다. 모든 세포들은 5% CO2 및 95% 공기가 존재하는 37℃에서 배양하였다.
<실시예 2> His-tag가 부착된 인간 sPTK7 발현 플라스미드의 제조
먼저, 인간 PTK7 전장 cDNA (Park, S.K. et al., J Biochem (Tokyo) 119: 235-239)에서 4.2-kb의 EcoRI 단편을 얻어, pcDNA3 벡터 (Invitrogen사로부터 구입)의 EcoRI 사이트에 서브클로닝함으로써 인간 PTK7 발현 벡터인 pcDNA3-hPTK7을 제작하였다. 인간 PTK7 단백질의 세포외 도메인 중 C-말단 부분을 암호화하고 있는 640-bp의 cDNA 단편에 His-tag 암호화 서열과 번역 종료 코돈을 포함하도록 중합 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; PCR)을 통하여 증폭시켰다. PCR에 사용된 프라이머 쌍은 5'-AAAAGCTCAAGTTCACACCA-3' (GenBank U40271의 염기서열 1646-1665)과 5'-GCTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGCTGGATCATCTTGTAGGG-3' [GenBank U40271의 염기서열 2239-2256인 His-tag 암호화 서열 (상기 서열 중 밑줄 그은 부분), 종료 코돈 및 XbaI 사이트 (상기 서열 중 이탤릭체 부분)]이었다. pcDNA3-hPTK7은 XhoI (GenBank U40271의 염기서열 1829)과 XbaI (pcDNA3의 다중 클로닝 부위 (multi-cloning site))으로 절단하여 1.6 kb의 단편을 제거한 후, 상기 PCR 결과물을 XhoI과 XbaI으로 절단하여 0.45 kb의 단편을 분리하고 접합시킴으로써, 인간 sPTK7 발현벡터인 pcDNA3-hPTK7-Ext-His 플라스미드를 얻었다. 제조된 플라스미드는 양방향 서열확인을 통하여 PCR 오차가 없음을 확인하였다. PTK7 폴리펩티드의 1번에서 30번까지의 아미노산 서열은 ER signal peptide이므로, 이 플라스미드를 진핵세포에 도입하면, 아미노산 서열 31번부터 703번까지의 PTK7 세포외 부위 전체와 His tag이 발현되었다.
<실시예 3> 인간 및 생쥐 sPTK7의 발현 및 정제
실시예 2에서 제작된 인간 sPTK7 발현 벡터 (pcDNA3-hPTK7-Ext-His)와 생쥐 sPTK7 발현 벡터 (pcDNA3.1-mPtk7-Ext-His) (Jung, J.W. et al., Gene 328: 75-84)를 HEK293 세포에 인산칼슘 (calcium phosphate) 방법으로 각각 핵산전달감염 (transfection)시킨 후 1.2 mg/ml의 G418을 처리하여 G418-저항성 세포 클론들을 선별하였다. 선별된 세포 클론들을 대상으로 항-펜타-His 단일 항체 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 인간 sPTK7 및 생쥐 sPTK7을 안정적으로 발현하는 세포 클론들을 재선별하였다. 재선별된 클론들을 7일간 배양한 무혈청 배양액을 황산암모늄 (ammonium sulfate)으로 70%까지 포화시켜 단백질들을 침전시킨 뒤, 침전물들을 1 mM 페닐메탄술포닐 플루오라이드 (phenylmethanesulphonyl fluoride; PMSF)와 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylene diamine tetraacetic acid; EDTA)이 포함된 인산 완충 식염수 (phosphate buffered saline; PBS) (137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 2 mM KH2PO4, pH 7.4)로 용해시켜 PBS로 투석하였다. 투석을 마친 시료들을 Ni2+-NTA 아가로오스 (Qiagen사로부터 구입)에 로딩하여 이미다졸로 용출한 후, PBS로 재투석하여 정제한 인간 sPTK7과 생쥐 sPTK7을 확보하였다.
<실시예 4> sPTK7에 의한 혈관내피세포의 혈관형성 억제 분석
배양된 HUVEC을 1% FBS가 포함된 M199 배지에서 6시간 동안 기아배양 (starvation)한 후, 트립신으로 떼어내서 같은 배지로 분산하였다. 0.2 ml 배지에 들어있는 2 × 105개의 HUVEC을 다양한 농도의 sPTK7 (0, 0.5, 1, 2, 4 ug/ml)과 30분간 미리 반응시켰다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 10 mg/ml 성장 인자 감소 MatrigelTM (BD Biosciences로부터 구입)을 0.2 ml씩 넣어 중합시킨 후, 각 웰에 sPTK7을 처리한 HUVEC을 넣고, 20 ng/ml의 혈관내피 성장인자 (vascular endothelial growth factor; VEGF)를 가하였다. 24-웰 플레이트를 16시간 동안 37℃에서 배양한 후, 형성된 혈관의 수를 광학현미경 (60배)으로 분석하였다. 본 분석 및 이하 분석에서 각 그룹의 비교는 Student's t-테스트를 이용하였으며, P 값이 0.05 미만일 경우 유의 수준이 없는 것으로 간주하였다. 모든 실험값들은 최소한 3회 이상의 독립 실험을 수행하여 얻었으며, "평균값 ± 표준편차값"으로 표시하였다.
도 2에서는 VEGF에 의하여 유도된 HUVEC의 혈관 형성 과정에서 sPTK7의 영향을 분석한 결과를 도시하였다. Student's t-테스트를 통한 통계 분석 결과에 있어서, VEGF를 처리하지 않은 대조군에 대해서는 P 값이 0.01 미만인 경우에 ††로, VEGF를 처리한 대조군에 대해서는 P 값이 0.01 미만인 경우에 **로, P 값이 0.001 미만인 경우에 ***로 표시하였다.
도 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, sPTK7이 없는 상태에서 VEGF만을 처리한 HUVEC은 아무 것도 처리하지 않은 HUVEC에 비하여 형성된 관의 수가 45% 정도 증가하였다. 그러나, sPTK7을 전처리한 경우에는 sPTK7 농도 의존적으로 VEGF에 의하여 유도된 HUVEC의 혈관 형성을 억제하였다.
<실시예 5> 혈관내피세포에서 sPTK7에 의한 독성 영향 분석
혈관내피세포의 혈관 형성에서 sPTK7의 세포 독성이 영향을 미쳤는지 여부를 분석해보기 위해서 MTT 실험법을 이용하였다. 48-웰 플레이트의 각 웰에 0.1% 젤라틴 용액 20 ㎕를 가한 후 건조시켰다. 각 웰에 2.0 x 104 개의 HUVEC을 넣고 24시간 동안 배양한 후, 1% FBS가 포함된 M199 배양액에서 6시간 동안 기아배양시켰다. 각 웰에 여러 농도의 인간 sPTK7과 10 ng/ml의 VEGF를 첨가하여 36시간 동안 배양한 후, 살아있는 세포의 수를 MTT 실험법으로 분석하였다 (Lee, S.J. et al., Biochem Biophys Res Commun 312: 1196-1201). 도 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, VEGF를 처리하지 않은 시료에 비하여 VEGF만 처리한 경우에는 세포수가 40.5% 증가하였으나, VEGF만 처리한 시료와 VEGF와 함께 sPTK7를 처리한 시료에서는 세포 수에 차이가 없었다. 따라서, sPTK7은 HUVEC의 생존이나 번식에 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있었고, sPTK7에 의한 혈관내피세포의 혈관 형성 억제 작용은 세포 독성에 의한 것이 아님을 확인할 수 있었다.
< 실시예 6> 혈관내피세포에서 sPTK7에 의한 세포 이동 및 침윤 억제 분석
혈관내피세포의 관 형성에는 세포 이동과 침윤이 중요한 과정이므로, Transwell 시스템에서 화학주성 운동 분석법 (chemotactic motility assay)으로 세포 이동을 측정하였고 (도 4 참조), Transwell 시스템에서 성장 인자 감소 Matrigel을 코팅한 후 침윤 분석법 (invasion assay)으로 세포 침윤을 측정하였다 (도 5 참조). 세포 이동의 정량적 분석과, 세포 침윤의 측정은 하기와 같이 수행하였다.
구체적으로 Transwell의 아랫면을 10㎕의 0.1% 젤라틴으로 코팅하여 건조하였다. HUVEC을 1% FBS가 포함된 M199 배양액에서 6시간 동안 기아배양한 후, 트립신으로 떼어내서 같은 배지로 분산하였다. 여러 농도의 sPTK7을 가하여 HUVEC이 1X 106개/ml이 되도록 한 후 30분간 반응시켰다. Transwell의 위 챔버에 반응시킨 HUVEC을 0.1ml씩 넣고, 아래 챔버에는 10 ng/ml의 VEGF와 1% FBS가 포함된 M199 배양액을 넣고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 필터의 아랫면으로 이동한 세포들은 헤마톡실린 (hematoxylin)과 에오신 (eosin)으로 염색하였다.
한편, 세포 침윤을 측정하는 방법은 세포 이동을 측정하는 방법과 동일하나, Transwell 윗면에도 10 mg/ml 성장 인자 감소 MatrigelTM 80㎕를 코팅하여 건조한 것과 배양 시간이 24시간인 점에서 차이가 있었다. 배양이 끝난 후 Transwell 아래 면으로 이동하거나 침윤한 혈관내피세포들을 광학현미경 (200배)으로 관찰하였다.
도 4 및 도 5는 VEGF에 의하여 유도된 HUVEC의 세포 이동 및 침윤에 대한 sPTK7의 영향을 분석한 결과이다. HUVEC의 세포 이동 (도 4)과 세포 침윤 (도 5)은 Transwell 시스템에서 각각 성장 인자 감소 Matrigel을 사용하지 않는 조건과 사용하는 조건에서 VEGF를 화학적 유인자 (chemoattractant)로 사용하여 결정하였다. Student's t test로 통계 분석하여, VEGF를 처리하지 않은 대조군에 대하여 P 값이 0.001 미만인 경우에 †††로, VEGF를 처리한 대조군에 대하여 P 값이 0.001 미만인 경우에 ***로 표시하였다.
도 4 및 도 5를 통해 알 수 있듯이, VEGF는 HUVEC의 이동을 3.3 배, 침윤을 5배 증가시켰으나, sPTK7은 농도에 따라 세포 이동과 침윤을 감소시켰다. 따라서, sPTK7은 농도 의존적으로 VEGF에 의하여 유도된 HUVEC의 이동과 침윤 모두를 저해하는 것을 확인하였다.
<실시예 7> sPTK7에 의한 생체 내 (in vivo) 혈관 신생 억제 분석
sPTK7은 혈관내피세포에 대한 세포 독성이 없으며, 혈관 형성, 세포 이동 및 침윤을 억제한다는 것을 확인하였으므로, sPTK7이 생체 내에서 혈관신생을 억제할 것을 예상할 수 있었다. 이를 증명하기 위하여, 아무 것도 포함하지 않거나, 200 ng의 생쥐 VEGF를 포함하거나, 또는 200ng의 생쥐 VEGF와 20 ㎍의 생쥐 sPTK7을 포함하는 0.6 ml MatrigelTM에 20 unit의 헤파린을 추가하여 7주령의 C57BL/6 암컷 생쥐에게 복부 내피와 외피 사이에 주사하였다. 7일 후 플러그 (plug)들을 회수하여 사진 촬영을 하고, 혈관신생 정도를 정량하기 위하여 Drabkin 시약 키트 525 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA로부터 구입)로 각 플러그의 헤모글로빈 수치를 측정하였다.
도 6 및 도 7에는 VEGF에 의해 유도되는 생체 내 혈관신생에 대한 sPTK7의 영향을 분석한 결과를 도시하였다. 각 그룹 당 5마리의 생쥐에 Matrigel, 생쥐 VEGF를 포함하는 Matrigel 또는 생쥐 sPTK7과 VEGF를 포함하는 Matrigel을 각각 주사하였다. 도 6은 Matrigel 주사 후, 7일이 지난 뒤에 각 그룹의 생쥐에서 꺼낸 Matrigel 플러그 (plug)에서 혈관 신생의 상태를 보여주는 결과이며, 도 4b는 혈관 신생 정도를 정량화하기 위하여 각 Matrigel 플러그의 헤모글로빈 양을 측정한 것이다. Student's t test로 통계 분석하여, VEGF를 처리하지 않은 대조군에 대하여 P 값이 0.001 미만인 경우에 †††, VEGF를 처리한 대조군에 대하여 P 값이 0.01 미만인 경우에 **로 표시하였다.
측정 결과, VEGF만 포함된 플러그는 적갈색인 반면, MatrigelTM 자체 혹은 sPTK7과 VEGF가 같이 함유된 플러그들은 엷은 노란색을 띄었으며 (도 6 참조), VEGF만 포함한 플러그에는 거의 7 g/dl의 헤모글로빈이 있었으나, sPTK7과 VEGF가 같이 포함된 플러그에서는 1.5 g/dl로 수치가 감소하였다 (도 7 참조). 상기 결과들로부터, sPTK7은 생체 내에서 혈관신생을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 8> 혈관내피세포에서 sPTK7에 의한 신호전달 단백질의 활성화 억제 분석
sPTK7이 HUVEC의 혈관 형성, 세포 이동과 침윤을 억제할 때 어떠한 신호전달 과정을 억제하는지 조사하였다. 미혼탁 배양된 (subconfluent culture) HUVEC을 1% FBS가 포함된 M199 배지에서 6시간 동안 기아배양시켰다. 기아배양 종료 30분 전에 4 ㎍/ml의 sPTK7을 넣어 배양한 후, 10 ng/ml의 VEGF를 넣고 10분 동안 (KDR 인산화 분석의 경우에는 5분 동안) 배양하였다. 배양이 종료된 세포들은 PBS로 닦아준 뒤, 100 mm 플레이트 당 350 ㎕의 방사면역침전 분석 (radioimmunoprecipitation assay; RIPA) 완충용액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% Sodium deoxycholate, 25 mM beta-glycerophosphate, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF)로 20분간 용해하고 (lysis), 4℃, 12,000g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 면역침전의 경우에는, 상층액 350 ㎕에 1 ㎍의 항체를 넣어 준 뒤, 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 각각의 반응물에 protein-A Sepharose (50% 슬러리) 20 ㎕를 넣어 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 원심분리를 하여 침전물을 얻었다. 웨스턴 블랏 (western blot)의 경우에는 면역 침천물 또는 세포 분해물 상층액에 SDS 겔 샘플 버퍼를 넣고 끊여서 시료를 준비한 후 SDS-PAG에 전기영동하여 니트로셀룰로오스 막에 블랏팅하고, 항체들을 반응시켰다. PI3-키나아제 활성은 면역침전물을 이용하여 경쟁 ELISA 키트 (Echelon Biosciences, Salt Lake City, UT, USA로부터 구입)로 측정하였다.
도 8에서 알 수 있듯이, sPTK7은 HUVEC에서 VEGF에 의해 유도된 KDR (VEGFR2) 인산화를 억제하였고, Akt 인산화도 억제하였을 뿐 아니라 Akt를 활성화하는 PI3-키나아제의 활성도 억제하였다. PI3-키나아제는 혈관형성 시토카인들 (angiogenetic cytokines)의 발현을 증가시키는 등의 역할로 혈관형성, 세포 이동 및 세포침윤과 깊은 연관이 있는 것으로 알려져 있다 (Brader, S. and Eccles, S.A., Tumori 90: 2-8). 또한, Akt는 내피세포의 생존, 번식 및 이동뿐만 아니라 혈관 성숙 및 투과성에도 기여하여 혈관형성에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Chen, J. et al., Nat Med, 11: 1188-1196; Manning, B.D. and Cantley, L.C., Cell 129: 1261-1274). 이러한 결과들을 종합하여 볼 때, sPTK7에 의한 내피세포의 이동, 침윤 및 혈관형성 저해에 PI3-키나아제 및 Akt 활성화 저해가 중요한 역할을 한다는 것을 예상할 수 있었다.
더욱이, sPTK7은 HUVEC에서 bFGF에 의하여 유도된 Akt의 인산화도 억제하였다. 따라서, sPTK7은 VEGF나 bFGF 등의 다양한 신호전달 유도자에 의하여 활성화된 PI3-키나아제 및 Akt 등의 세포 내 신호전달 과정을 차단함으로써 혈관신생, 세포 이동 및 침윤을 저해할 것으로 예상되었다.
내피 세포에 VEGF를 처리하면 국소 부착 키나아제 (focal adhesion kinase; FAK)와 팍실린 (paxillin)의 타이로신 인산화가 유발되는 것으로 알려져 있다 (Waltenberger, J. et al., J Biol Chem 269: 26988-26995; Abedi, H. and Zachary, I., J Biol Chem 272: 15442-15451). 또한, PI3-키나아제/Akt 신호 기작은 VEGF에 의해 촉진된 액틴 재구성 (actin reorganization)과 내피 세포의 이동에 관여한다고 보고된 바 있다 (Morales-Ruiz, M. et al., Circ Res 86: 892-896; Radisavljevic, Z. et al., J Biol Chem 275: 20770-20774).
FAK과 팍실린의 활성화에서 sPTK7의 영향을 확인하기 위하여, 상기의 실시예와 같은 방법으로 HUVEC에 sPTK7과 VEGF를 처리한 후, FAK과 팍실린을 각각의 항체로 면역 침전한 후 phosphotyrosine 항체로 웨스턴 블랏을 수행하여, FAK과 팍실린의 인산화를 분석하였다. 구체적으로 immuno-fluorescence microscopy를 위하여, 기아배양한 HUVEC에 sPTK7를 30분간 처리하고, VEGF를 가한 후 1시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 3.7% paraformaldehyde를 10분간 처리하여 세포를 고정하여, 0.5% Triton X-100으로 5분간 처리한 뒤, 3% BSA로 1시간동안 blocking을 하였다. 이어서 팍실린의 항체로 2시간동안 반응시키고, Rhodamine-conjugated 2차 항체와 Phalloidin-FITC를 넣고 1시간동안 반응시킨 뒤, confocal microscope로 관찰하였다. 그 결과 도9에서 알 수 있듯이, sPTK7이 FAK 및 팍실린의 활성화에서 미치는 영향을 관찰한 바, HUVEC에서 sPTK7은 VEGF에 의하여 유도된 FAK 및 팍실린의 타이로신 인산화를 억제하는 것으로 관찰되었다.
따라서, sPTK7은 국소 부착 형성과 액틴 재구성을 저해함으로써 혈관내피세포의 부착 및 이동을 억제하는 것으로 예상할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때, PTK7 기능 저해는 혈관내피세포뿐 아니라 PTK7을 발현하는 다른 유형의 세포에서도 세포 이동, 세포 침윤, 세포 부착 등을 억제할 것으로 예상할 수 있었다.
<실시예 9: 인간 PTK7의 세포외 도메인 부분의 최소활동단편의 결정>
인간 PTK7 세포외 도메인의 최소활성부위을 결정하기 위하여 sPTK7의 deletion mutant를 제작하였다. 구체적으로 도 1에 나타낸 바와 같이, pcDNA3.1-hPTK7-Ig13-His [첫 번째 Ig loop부터 세 번째 Ig loop 및 네 번째 Ig loop 일부(서열번호 2의 아미노산 서열 31번부터 344번) 및 His tag을 발현], pcDNA3.1-hPTK7-Ig14-His [첫 번째 Ig loop부터 네 번째 Ig loop 및 다섯 번째 Ig loop 일부(서열번호 2의 아미노산 서열 31번부터 436번) 및 His tag을 발현] 및 pcDNA3.1-hPTK7-Ig15-His [첫 번째 Ig loop부터 다섯 번째 Ig loop 및 여섯 번째 Ig loop 일부(서열번호 2의 아미노산 서열 31번부터 528번) 및 His tag을 발현]은 각각 마지막 코돈의 다음에 His tag 코돈과 번역 종료 코돈을 갖도록 중합 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; PCR) 방법으로 돌연변이 시켰다.
이 중 pcDNA3.1-hPTK7-Ig14-His의 제작은 하기와 같이 수행하였다. 앞서 제조된 인간 sPTK7 발현 벡터 (pcDNA3-hPTK7-Ext-His)에서 인간 PTK7 단백질의 세포외 도메인 중 다섯 번째 Ig loop 초입의 436번째 아미노산에 연결되어 His-tag 암호화 서열과 번역 종료 코돈을 포함하도록 PCR을 통하여 증폭시켰다. PCR에 사용된 프라이머 쌍은 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (pcDNA3 벡터의 T7 promoter 염기서열 863-882)과 다섯 번째 Ig loop 초입 부분에 대한 5'-GCTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGCTGGGTCAGGCAATCCAA-3' [서열번호 1의 염기서열 1453-1470, His-tag 암호화 서열 (상기 서열 중 밑줄 그은 부분), 종료 코돈 및 XbaI 사이트 (상기 서열 중 이탤릭체 부분)]이었다. 이후 실시예 2에서와 같이 상기 PCR 결과물과 pcDNA3.1 벡터를 EcoRI과 XbaI으로 절단하여 단편을 접합시킴으로써, 인간 PTK7 세포외 도메인의 첫 번째 Ig loop부터 네 번째 Ig loop 및 다섯 번째 Ig loop 일부(서열번호 2의 아미노산 서열 1번부터 436번) 및 His tag을 발현하는 pcDNA3.1-hPTK7-Ig14-His 플라스미드를 얻었다. 나머지 플라스미드들도 이와 같은 방법으로 각각 얻었다.
pcDNA3.1-hPTK7-Ig14s-His [다섯번째 Ig loop 초입 부분을 제외한, 첫 번째 Ig loop부터 네 번째 Ig loop까지의 부분 (서열번호 2의 아미노산 서열 31번부터 409번) 및 His tag을 발현]의 경우에는 pcDNA3.1-hPTK7-Ig14-His에서 서열번호 1의 염기서열 1390번부터 1470번을 PCR로 deletion하였다. PCR에 사용된 프라이머 쌍은 5'-CATCACTGTGGCCCATCATCATCATCATCATTGATCTAGAGGGCC-3' [서열번호 1의 염기서열 1377-1389, His-tag 암호화 서열 (상기 서열 중 밑줄 그은 부분), 종료 코돈 및 XbaI 사이트 (상기 서열 중 이탤릭체 부분)와 pcDNA3.1 벡터의 염기서열 997-1001 (상기 서열 중 고딕체 부분)]과 5'-GATGATGATGATGGGCCACAGTGATGTTGACATCCTGTCTC-3' (His-tag 암호화 서열 중 일부 (상기 서열 중 밑줄 그은 부분)와 서열번호 1의 염기서열 1362-1389)이었다. 상기 PCR 결과물을 DpnI을 처리한 후, XL1-Blue 대장균에 transformation시켜서 콜로니들을 선별, 배양하여 deletion된 플라스미드를 얻었다. 제조된 플라스미드들은 양방향 서열확인을 통하여 PCR 오차가 없음을 확인하였다.
이 실시예에서 제작한 인간 PTK7 세포외 도메인 부분들의 발현 플라스미드들 (pcDNA3.1-hPTK7-Ig13-His, pcDNA3.1-hPTK7-Ig14s-His, pcDNA3.1-hPTK7-Ig14-His 및 pcDNA3.1-hPTK7-Ig15-His)을 실시예 3과 같이 발현, 정제하여 도 1과 같이 PTK7-Ig13-His (인간 PTK7 단백질의 아미노산 서열 31번부터 344번), PTK7-Ig14s-His (인간 PTK7 단백질의 아미노산 서열 31번부터 409번), PTK7-Ig14-His (인간 PTK7 단백질의 아미노산 서열 31번부터 436번) 및 PTK7-Ig15-His (인간 PTK7 단백질의 아미노산 서열 31번부터 528번)을 확보하였다.
확보된 PTK7-Ig13-His, PTK7-Ig14s-His, PTK7-Ig14-His 및 PTK7-Ig15-His들이 세포 이동에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 실시예 6과 같이 세포 이동을 측정하였다. 도 10에서 알 수 있듯이, HUVEC의 이동은, VEGF와 sPTK7 또는 그 단편들을 처리하지 않았을 때에 비하여, VEGF만 처리하였을 때 3.3 배 증가시켰다. PTK7-Ig13-His는 농도에 따라 세포 이동을 감소시키지 못하였으나, PTK7-Ig14s-His, PTK7-Ig14-His, PTK7-Ig15-His 및 sPTK7은 농도에 따라 세포 이동을 유사한 정도로 감소시켰다. Student's t test로 통계 분석하여, VEGF를 처리하지 않은 대조군에 대하여 P 값은 0.001 미만이었으며, VEGF를 처리한 대조군에 대하여 PTK7-Ig13-His 은 P 값이 0.01 미만이었으나 PTK7-Ig14s-His, PTK7-Ig14-His, PTK7-Ig15-His, sPTK7은 P 값이 0.001 미만이었다. 따라서, PTK7-Ig14s-His이 인간 PTK7 세포외 도메인 부분의 최소활성단편을 포함하며, 인간 PTK7 세포외 도메인 부분에서 네번째 Ig loop 부분 (인간 PTK7 단백질의 327번부터 409번 아미노산 서열)이 완전한 형태로 존재하는 것이 PTK7의 기능에 중요하다는 것을 확인하였다.
<실시예 10> RNA 간섭 (RNA interference: RNAi) 방법에 의한 PTK7 녹다운 (knockdown)시 혈관내피세포의 혈관형성 및 Akt 인산화 저해 분석
sPTK7 외에 PTK7 기능을 차단할 수 있는 다른 방법으로서, RNA 간섭현상이 활용될 수 있는지 확인하였다. 구체적으로 PTK7의 소규모 억제 RNA (small interfering RNA: siRNA)를 처리하거나, PTK7 siRNA를 발현하는 PTK7의 shRNA(small hairpin RNA) 벡터를 처리하여 RNA 간섭(interference)를 유발시킴으로써 PTK7의 발현을 녹다운한 뒤, 혈관내피세포의 혈관형성과 Akt 인산화에 미치는 영향을 분석하였다. HUVEC에서 PTK7 siRNA를 사용한 PTK7의 녹다운은 하기와 방법으로 수행되었다. 6 cm의 배양 접시에서 배양된 HUVEC을 혈청감소 배지 (serum-reduced medium) (Opti-MEM I, Invitrogen사로부터 구입)로 교환한 뒤, 100 nM의 siRNA (Dharmacon사의 ON-TARGET plus 계열의 J-003167-13, J-003167-14, J-003167-15 및 J-003167-16), 또는 이들의 혼합물 (도 11 참조)을 리포펙타민(Lipofectamine) (Invitrogen사로부터 구입)을 이용하여 4시간 동안 배양하여 핵산전달감염 (transfection)시켰다. 핵산전달감염된 HUVEC을 20% (w/v) FBS, 3 ng/ml의 bFGF (Upstate Biotechnology) 및 5 unit/ml의 헤파린을 함유한 M199 배지 (Invitrogen사로부터 구입)로 바꾸어 준 후 48 시간 동안 배양하였다. HUVEC에서 PTK7의 녹다운 정도를 분석한 결과, 개별 PTK7-siRNA인 J-003167-14, J-003167-15, J-003167-16 및 PTK7 siRNA 혼합물이 negative control에 비해 PTK7의 발현을 70%이상 감소시켜, 이들의 녹다운 효능이 높다는 것을 보였다 (도 12 참조).
한편, HEK293에서 PTK7 shRNA 벡터를 사용한 PTK7의 녹다운은 아래의 방법으로 수행되었다. 6 cm의 배양 접시에서 배양된 HEK293 세포에 인산칼슘 (calcium phosphate) 방법으로 5 ug의 Mission TRC shRNA 벡터들(SIGMA-ALDRICH사의 Mission TRC shRNA 계열의 TRCN0000006431, TRCN0000006432, TRCN0000006433, TRCN0000006434 및 TRCN0000006435, 도 13 참조)을 각각 핵산전달감염 (transfection)시켰다. 핵산전달감염된 HEK293 세포를 12시간 뒤 10% FBS, 100 unit/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지로 바꾸어 준 후 48 시간 동안 배양하였다. HEK293에서 각각의 PTK7 shRNA 벡터들에 의한 PTK7의 녹다운 정도를 분석한 결과, 특히 TRCN0000006433과 TRCN0000006434가 negative control에 비해 PTK7의 발현을 70%이상 감소시켜, 이들의 PTK7 녹다운 효과가 높다는 것을 확인하였다(도 14 참조).
상기 결과에서와 같이 PTK7의 녹다운이 세포 기능에 미치는 영향을 분석하기 위하여 PTK7 siRNA 혼합물을 사용하였다. 도 15는 HUVEC에서 PTK7의 녹다운이 VEGF에 의하여 유도된 혈관 형성에 미치는 영향을 분석한 결과이다. PTK7 녹다운 HUVEC을 성장 인자 감소 Matrigel 위에 놓고 16시간 동안 배양한 후 생성된 혈관의 수를 측정하였으며, Student's t test로 통계 분석하여, VEGF를 처리하지 않은 대조군 (mock transfection)에 대하여 P 값이 0.01 미만인 경우에 ††, P 값이 0.001 미만인 경우에 †††, VEGF를 처리한 대조군 (mock + VEGF)에 대하여 P 값이 0.001 미만인 경우에 ***로 표시하였다. 도 15에서 알 수 있는 바와 같이, 허위 핵산전달감염 (mock transfection)시킨 HUVEC에 VEGF를 처리하였을 때 혈관 형성이 45% 정도 증가하였고, 대조군 siRNA를 핵산전달감염시킨 HUVEC에서도 허위 핵산전달감염시킨 HUVEC과 유사한 수준으로 VEGF에 의한 혈관형성이 관찰되었으나, PTK7을 녹다운한 HUVEC에서는 VEGF에 의하여 유도된 혈관형성이 억제되었다. 또한, 혈관형성과 유사하게 Akt 인산화 분석에서도, 허위 핵산전달감염 (mock transfection)시킨 HUVEC에 VEGF를 처리하였을 때 Akt의 인산화가 증가하였고, 대조군 siRNA를 핵산전달감염시킨 HUVEC에서도 허위 핵산전달감염시킨 HUVEC과 유사한 수준으로 Akt 인산화가 관찰되었으나, PTK7을 녹다운한 HUVEC에서는 VEGF에 의하여 유도된 Akt 인산화가 억제되었다. 혈관내피세포에서 PTK7 녹다운이 sPTK7 처리와 같은 효과를 보이므로, sPTK7이 내생적 (endogenous) PTK7의 기능을 차단하여 세포의 이동, 침윤 및 혈관신생을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 11> PTK7 항체에 의한 PTK7 기능 저해시 혈관내피세포의 Akt 인산화 저해 분석
sPTK7 외에 PTK7 기능을 차단할 수 있는 다른 방법으로서, PTK7의 항체가 활용될 수 있는지 분석하였다. 이전 실시예들에서 sPTK7 처리에 의하여 PTK7의 기능이 저해되었을 때 세포 이동, 침윤, 혈관신생이 감소하는 것과 Akt 인산화가 감소하는 것을 보인 바 있다. 따라서, sPTK7의 항체를 처리한 뒤, 혈관내피세포에서 Akt 인산화에 미치는 영향을 분석하였다.
sPTK7의 항체에 의하여 HUVEC에서 Akt 인산화에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, 기아배양 종료 30분 전에 2 ㎍/ml의 sPTK7 항혈청을 넣어 배양한 후, 10 ng/ml의 VEGF를 넣고 10분 동안 배양하였다. PTK7 항-혈청은 실시예 10에서 설명한 바와 같이 정제한 sPTK7을 토끼에 주사하여 제작하였으며, PTK7을 특이적으로 인식하는 것을 확인한 후 사용하였다. 배양이 종료된 세포들은 PBS로 닦아준 뒤, 60 mm 플레이트 당 120 ㎕의 면역침전 분석 완충용액으로 실시예 8과 같은 방법으로 상층액을 얻었다. 이어서 세포 분해물 상층액을 대상으로 웨스턴 블랏을 수행하였다. 도 16은 HUVEC에서 PTK7의 항혈청이 VEGF에 의하여 유도된 Akt의 인산화에 미치는 영향을 분석한 결과이다. sPTK7의 항혈청은 VEGF에 의하여 유도된 Akt의 인산화를 억제하는 것으로 관찰되었다. sPTK7의 항혈청이 sPTK7 처리와 유사한 효과를 보이므로, sPTK7의 항혈청에는 PTK7 중화 polyclonal 항체를 포함하고 있어 PTK7의 기능을 저해하는 것을 나타낸다. 따라서, PTK7 중화 polyclonal 항체 뿐 아니라 PTK7 중화 monoclonal 항체는 PTK7의 기능을 저해하여 세포 이동, 침윤, 혈관신생을 억제하는 방법이 될 수 있다.
결국, 본 발명의 실시예들을 통해 sPTK7 처리, PTK7 녹다운, PTK7 중화 항체 (PTK7 neutralizing antibody) 처리 외에도 PTK7의 기능을 저해하는 sPTK7 발현, PTK7 중화 aptamer 처리 등의 방법도 세포의 이동, 침윤을 저해하고, 혈관내피세포의 정상적인 기능을 차단하여 혈관신생을 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 세포 이동, 세포 침윤 및 혈관신생의 억제제는, 세포 이동, 침윤 및 혈관신생과 연관된 전이 암종 (metastatic carcinoma)를 비롯한 다양한 질병의 치료에 사용될 수 있으며, 대상 세포 역시 혈관내피세포에만 국한되는 것이 아니라, PTK7을 발현하는 다양한 종류의 세포에 적용되어 세포의 이동, 침윤, 부착을 억제하는데 활용될 수 있다.

Claims (9)

  1. PTK7 단백질의 기능을 저해하는 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 억제제는 PTK7 단백질의 세포외 도메인을 갖는 가용성 PTK7 단백질 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 가용성 PTK7 단백질 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 1 ~ 30번째 서열을 제외한 나머지 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 가용성 PTK7 단백질의 최소활성단편은 서열번호 2의 인간 PTK7 단백질의 31번 내지 409번 아미노산 서열 또는 327번 내지 409번 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 억제제는 상기 PTK7 단백질을 암호화하는 메신저 RNA (mRNA)에 대하여 특이적 RNA 간섭(RNAi)을 매개하는 소규모 RNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 소규모 RNA 서열은 PTK7 단백질을 암호화하는 메신저 RNA (mRNA) 서열과 상보적 결합을 형성하여 상기 mRNA 서열의 발현을 억제하는 소규모 억제 RNA (siRNA), 또는 상기 소규모 억제 RNA (siRNA) 서열을 포함하는 소규모 헤어핀 RNA (shRNA)인 것을 특징으로 하는 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제.
  7. 제1항에 있어서, 상기 억제제는 PTK7 단백질과 특이적으로 결합함으로써 PTK7 단백질의 활성을 억제하는 PTK7 단백질 중화항체인 것을 특징으로 하는 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 중화항체는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 인식하는 것을 특징으로 하는 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 혈관내피세포인 것을 특징으로 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제.
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