WO2019054744A1 - 종양 억제 유전자 ｐｉｐ４ｋ２ａ 및 그의 용도 - Google Patents

종양 억제 유전자 ｐｉｐ４ｋ２ａ 및 그의 용도 Download PDF

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pip4k2a
protein
expression
gene
cancer
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PCT/KR2018/010679
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남도현
신용재
사제이슨경하
김미숙
이예리
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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Definitions

  • Tumor suppressor gene PIP4K2A uses thereof.
  • Glioma is a malignant tumor that accounts for 60% of primary brain tumors and has a high incidence and is difficult to treat. Glioblastoma is the most common single tumor occurring in the brain, which accounts for 12 to 15% of all brain tumors and accounts for 50 to 60% of brain gliomas. In addition, there is a rapid increase in the intracranial pressure, which may cause headache (severe in the morning), nausea (vomiting), vomiting, convulsions, deterioration of nerve function due to brain edema, limb movement or sensory depression, facial paralysis, - It shows various symptoms such as right-sided disorder.
  • Glioblastoma is highly resistant to radiation and chemotherapy when compared to other cancers, and once diagnosed, life expectancy is only one year.
  • the delivery of the drug for treatment is not easy due to the presence of a cerebrovascular barrier.
  • glioblastomas present an aggressive variant when compared to other brain tumors, which can result in catastrophic results within weeks if not treated quickly.
  • the genetic, physiological and environmental characteristics of the patient must be taken into account, as well as chemotherapy, radiotherapy, surgical therapy, immune cell therapy And the like.
  • these treatments are in a different state due to the causes such as the occurrence of resistant mutant strains and the recurrence by tumor stem cells. Therefore, there is a need to develop a new therapeutic method.
  • One aspect is to provide the tumor suppressor gene PIP4K2A.
  • Another aspect is to provide a composition for preventing, ameliorating or treating cancer comprising the PIP4K2A gene or protein or an active fragment thereof.
  • Yet another aspect is to provide a method of diagnosing cancer using the PIP4K2A.
  • Another aspect is to provide a method for screening candidate substances for cancer treatment using PIP4K2A.
  • PIP4K2A Phosphatidylinositol-5-Phosphate 4-Kinase Type 2 Alpha
  • active fragment thereof PIP4K2A (Phosphatidylinositol-5-Phosphate 4-Kinase Type 2 Alpha), or an active fragment thereof.
  • One aspect provides a vector comprising or comprising a polynucleotide encoding a PIP4K2A protein or an active fragment thereof.
  • the PIP4K2A protein or active fragment thereof may be a cell-penetrating peptide linked.
  • the active fragments and the cell permeable peptides will be described later.
  • One aspect provides a composition for preventing, ameliorating or treating cancer comprising an expression or activity-increasing agent of PIP4K2A gene or protein as an active ingredient.
  • Another aspect provides a method of preventing, ameliorating, or treating cancer comprising administering to a subject an expression or activity enhancer of a PIP4K2A gene or protein.
  • Yet another aspect provides the use of a PIP4K2A gene or protein expression or activity enhancer for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing, ameliorating or treating cancer.
  • the expression or activity enhancer of the PIP4K2A protein may comprise a PIP4K2A protein or an active fragment thereof.
  • Treat " as used herein refers to the treatment of a disease or condition at an individual who is at risk of developing the disease, an improvement in the condition of the individual (e.g., one or more symptoms) Slowing the onset of symptoms or slowing the progression of symptoms, and the like.
  • treatment also includes prophylactic treatment of the individual to prevent the occurrence of symptoms.
  • treatment and “ prevention” are not intended to mean healing or complete removal of symptoms. These include any form of treatment that provides an effect to a patient suffering from a disease, including an improvement in the condition of the patient (e. G., One or more symptoms), a delay in the progression of the disease,
  • a “treatment-effective amount” refers to an amount of a compound that, in a patient afflicted with cancer, such as a glioblastoma, includes an improvement in the condition of the patient (e.g., one or more symptoms) Quot; means an amount sufficient to produce the desired effect.
  • the cancer of the present specification includes cancer of the brain, glioblastoma, cerebrospinal tumor, head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, thymoma, esophageal cancer, cervical cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, biliary cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, Cancer, cervical cancer, endometrial cancer, lymphoma, acute leukemia, chronic leukemia, multiple myeloma, sarcoma, malignant melanoma or skin cancer.
  • the PIP4K2 may specifically play a role in cancer cells in which PTEN is deleted or PTEN expression is reduced.
  • the cancer may be a cancer in which the PTEN is deleted or the expression of PTEN is reduced.
  • the glioblastoma may be any subtype selected from the group consisting of classical glioblastoma, proneural glioblastoma, neural glioblastoma, mesenchymal glioblastoma, .
  • the PIP4K2A (Phosphatidylinositol-5-phosphate 4-kinase type-2 alpha) protein or fragment thereof refers to a native or recombinant PIP4K2A protein or a protein having physiological activity substantially equivalent thereto. Protein having substantially equivalent physiological activity includes a native / recombinant PIP4K2A protein or fragment thereof and functional equivalents and functional derivatives thereof.
  • the above-mentioned " functional equivalent” means a modified amino acid sequence in which some or all of the native protein amino acid is substituted, or a part of the amino acid is deleted or added, and has substantially the same physiological activity as the native PIP4K2A protein or a fragment thereof.
  • functional derivative means a protein or fragment thereof that has been modified to increase or decrease the physicochemical properties of the PIP4K2A protein or fragment thereof, and has substantially equivalent physiological activity to the native PIP4K2A protein.
  • the PIP4K2A protein or fragment thereof of the present invention may be derived from a mammal, and the mammal includes a human.
  • the PIP4K2A protein may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the active fragment of PIP4K2A may contain any one of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2 to 5.
  • the expression enhancer of the PIP4K2A gene may be a vector comprising a polynucleotide encoding the PIP4K2A protein or an active fragment thereof, or a cell containing the vector.
  • polynucleotide is a polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides present in single-stranded or double-stranded form.
  • the polynucleotide includes a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the PIP4K2A protein, as well as a complementary sequence to the sequence.
  • the complementary sequence includes not only perfectly complementary sequences but also substantially complementary sequences, which can be obtained under stringent conditions known in the art, for example, using nucleotides encoding the amino acid sequence of the fusion protein Quot; means a sequence that can hybridize with a nucleotide sequence of a nucleotide sequence.
  • vector means means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, adenovirus vectors, lentivirus vectors, retroviral vectors, and adeno-associated viral vectors.
  • the vector that can be used as the recombinant vector includes, for example, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX series, Plasmids such as? Gt4? B,? -Charon,? Z1, and M13, which are frequently used in the art, such as viruses, or SV40.
  • the polynucleotide sequence encoding the fusion protein in the recombinant vector is operatively linked to a promoter.
  • operatively linked means a functional linkage between a nucleotide expression control sequence, such as a promoter sequence, and another nucleotide sequence, whereby the regulatory sequence is capable of transcription and / or translation of the other nucleotide sequence .
  • the recombinant vector may be an expression vector capable of stably expressing the PIP4K2A protein in a host cell.
  • the expression vector may be any conventional vector used in the art to express an exogenous protein in plants, animals or microorganisms.
  • the recombinant vector may be constructed by a variety of methods known in the art.
  • the recombinant vector may be constructed with prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (for example, pL? Promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc. ), A ribosome binding site for initiation of translation, and a transcription / translation termination sequence.
  • the origin of replication that functions in eukaryotic cells contained in the vector includes f1 replication origin, SV40 replication origin, pMB1 replication origin, adeno replication origin, AAV replication origin, and BBV replication origin But is not limited thereto.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells e.g., metallothionein promoter
  • mammalian viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, The cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV
  • adenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • a cell penetrating peptide may be linked to the PIP4K2A protein or an active fragment thereof.
  • the cell permeable peptide may be a cationic cell permeable peptide.
  • the cationic cell penetrating peptide may comprise at least 70%, at least 80%, such as 70-90%, or 80-90% of the entire amino acid sequence of any one or more amino acid residues selected from the group consisting of arginine, lysine and histidine, . ≪ / RTI >
  • the amino acid of the above-mentioned cell permeable peptide can be made into an L-type or D-type in consideration of stability in the body.
  • the cell penetrating peptide may be composed of a length of 10 to 40 amino acid residues including any one or more amino acid residues selected from the group consisting of arginine, lysine, and histidine.
  • the cell permeable peptide may be selected from the group consisting of TAT (SEQ ID No. 6: YGRKKRRQRRR), Penetratin (SEQ ID No. 7: RQIKIWFQNRRMKWKK), polyarginine (SEQ ID No. 8: RRRRRRR), polylysine No.
  • KKKKKKKKKK low molecular weight protamine
  • LMWP low molecular weight protamine
  • ANTP Antennapedia
  • Other peptides or peptide analogs other than the above-mentioned peptides can be used as long as they are capable of permeating the cell membrane.
  • the composition may be administered in combination with an additional anti-cancer agent.
  • the anticancer agent may be, for example, a target anticancer agent.
  • Targeted anti-cancer drugs can be anti-cancer agents that selectively kill cancer cells by blocking specific signals that are specific to specific cancer cells or signals that are involved in the growth and development of cancer by targeting specific gene changes.
  • the PIP4K2A protein or active fragment thereof may bind p85 of PI3K. Whereby the PIP4K2A protein or active fragment thereof may promote degradation of p85 and p110.
  • composition of the present invention may be prepared by incorporating at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above-described effective ingredients for administration.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a mixture of saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome and one or more of these components.
  • a buffer solution, a bacteriostatic agent, and the like may be added.
  • injection formulations pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like by additionally adding diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants, Specific antibody or other ligand can be used in combination with the carrier.
  • the composition of the present invention may be manufactured for oral, topical, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, and the like administration.
  • it can be used in an injectable form.
  • any pharmaceutically acceptable vehicle for the injectable composition for direct injection into the area to be treated accordingly.
  • the composition of the present invention may comprise a freeze-dried composition which allows for the composition of an injectable solution, in particular by addition of isotonic sterile or sterile water or suitable physiological saline. Direct injection of the patient into the tumor is advantageous because it allows the treatment efficiency to be concentrated in the infected tissue.
  • the dosage used can be controlled by various parameters, in particular by the protein, the gene, the vector, the mode of administration employed, the disease in question, or alternatively the desired duration of treatment. Also, the range varies depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of disease.
  • the daily dose is about 0.0001 to 10 mg / kg, preferably 0.001 to 1 mg / kg, and can be administered once or several times a day.
  • Another aspect provides a method of diagnosing cancer using PIP4K2A.
  • the present invention provides a composition for cancer diagnosis comprising an agent for measuring the activity or expression of PIP4K2A protein or gene. Also provided is a method for diagnosing cancer comprising the step of measuring the activity or expression of a PIP4K2A protein or gene in a subject-derived sample of an individual.
  • diagnosis refers to the presence or absence of a disease associated with the expression or activity of said gene or protein by measuring the presence or absence of a PIP4K2A protein of the invention and a polynucleotide encoding the same, in a biological sample or tissue sample It means to confirm.
  • the activity of the PIP4K2A protein may be measured through an antibody.
  • the expression of the PIP4K2A gene may include an agent for measuring mRNA expression level of the gene.
  • the agent for measuring the mRNA expression level may include a primer pair, a probe, or an antisense nucleotide that specifically binds to the gene.
  • measurement of mRNA expression level is a process of confirming the presence and expression level of a mRNA marker of a cancer marker gene in a biological sample in order to diagnose cancer, and can be determined by measuring the amount of mRNA.
  • RT-PCR Competitive RT-PCR
  • Real-time RT-PCR RNase protection assay (RPA)
  • Northern blotting Northern blotting
  • measurement of protein expression or activity level refers to a process of confirming the presence and expression level of a protein expressed in a cancer marker gene in a biological sample in order to diagnose cancer.
  • the amount of protein is determined using an antibody.
  • the assay method include Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis , Immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chip, and the like, but are not limited thereto.
  • Yet another aspect is a method of treating a candidate substance, comprising: treating a candidate substance to a PIP4K2A protein or gene; Measuring the activity or expression of the PIP4K2A protein or gene; And selecting a candidate substance that increases the activity or expression of the PIP4K2A protein or gene compared to a control group in which the candidate substance is not treated.
  • the measurement of the activity or expression level of the protein or gene is as described above.
  • the candidate material may be, but is not limited to, a peptide, a protein, a nonpeptide compound, a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, a plant extract, or an animal tissue extract.
  • the treatment of the candidate substance may be a treatment of a PIP4K2A protein or a cell expressing the gene.
  • the cell may be a cell transformed with a recombinant expression vector containing the gene, and such a transformation method is well known in the art.
  • the degree of expression of the gene is not limited thereto.
  • a second antibody linked to a specific and detectable label on the target protein may be added.
  • Detection may also involve addition of a second antibody followed by the addition of a third antibody having a binding affinity for the second antibody and linked to the detectable label.
  • an enzyme capable of exhibiting color development upon culturing with a suitable chromogenic substrate may be used.
  • Detectable moieties can include compositions detectable by spectroscopic, enzymatic, photochemical, biochemical, biotechnological, immunochemical, electrical, optical or chemical means, including, for example, fluorescent markers and dyes, magnetic labels , Linked enzymes, mass spectroscopic tags, spin markers, electron transfer donors, and recipients.
  • the candidate substance can be selected as a cancer treatment agent.
  • a therapeutic agent participating in the mechanism is selected at a short period of time, and an experiment for proving the therapeutic agent is conducted to provide a prophylactic and / or therapeutic agent useful for a patient in need of prevention and / .
  • the tumor suppressor gene PIP4K2A is derived through an in vivo RNAi screening technique and can be a new target useful for cancer treatment, so that it can be effectively used for cancer diagnosis, treatment, and therapeutic screening method.
  • Figure 1 is an illustration of an in vivo RNAi screening technique using glioblastoma spoloids to screen tumor suppressor genes;
  • A screening for the most highly amplified candidate gene among cancer suppressor candidates;
  • B shows that the PIP4K2A gene is among the shRNA candidates injected into GBM1 tumors and amplified;
  • C Gene amplification of PIP4K2A shRNA in three brain tumor spleoids and LN428 cells;
  • D ShRNAs of PIP4K2A gene among the shRNA candidates amplified in three brain tumor spoloids were commonly amplified in all cells.
  • Figure 2 shows (A) PIP4K2A expression in glioblastoma patients and normal brain tissue using Oncomine dataset; (B) and (C) Phillips data set (mRNA) and TCGA dataset CNA, respectively, in patients with low PIP4K2A expression or copy number; (D) RNAseq data showing the expression of PIP4K2A in glioblastoma spoloid and neural progenitor cells (NPC).
  • FIG. 3A is a diagram showing the expression of PIP4K2A using Immunohistochemistry (IHC) in glioblastoma tissue tissues (Tissue microarrays);
  • TissueFAX shows the amount of protein expression of PIP4K2A in the tumor portion and the non-tumor portion of each patient tissue.
  • FIG. 3B is a diagram showing the expression of PIP4K2A using immunohistochemistry (IHC) in glioblastoma tissue tissues (Tissue microarrays);
  • IHC immunohistochemistry
  • FIG. 3B Quantification of expression amount of PIP4K2A protein measured in (A) above;
  • C Representative expression of PIP4K2A protein expression in tumor and non-tumor parts in tissues of 202 patients;
  • D the amount of PIP4K2A protein expressed in the tumor and non-tumor areas in 68 patient tissues.
  • FIG. 4 is a graph showing that PIP4K2A overexpression in glioblastoma spolide significantly reduced cell growth and stemness;
  • A A comparison of cell growth after overexpression of PIP4K2A in glioblastoma spoloids shows that cell growth is inhibited in cells overexpressing PIP4K2A;
  • B A comparison of stem cell viability after PIP4K2A overexpression in glioblastoma spoloids shows that stem cell characteristics are suppressed in cells overexpressing PIP4K2A gene;
  • C a result of quantifying and comparing the cell viability measured in (B) above;
  • D a graphical representation of the cell viability measured in (C) above.
  • Figure 5 is a graph showing that cancer growth is significantly reduced upon overexpression of PIP4K2A using an in vivo competition assay;
  • A A diagram showing the process of injecting PIP4K2A overexpressing cells into a glioblastoma spolide with red (RFP) and the other cells with green (GFP) injection into an animal model 1: 1;
  • B Western blot analysis of PIP4K2A protein overexpression;
  • C Animal model The comparison of the color of tumor cells obtained after the experiment shows that the distribution of the cells (45.93%) in which the PIP4K2A gene is not overexpressed is more than that of the cells.
  • (D) a figure obtained by quantifying the result from (C) above;
  • (E) A comparison of the color of tissues from animal models shows a higher distribution of cells (hatched) that did not overexpress PIP4K2A;
  • (F) A diagram showing the distribution of cells in the animal model tissue with respect to the result shown in (E) above.
  • 6A shows the results of confirming that phosphorylation of AKT and S6K is reduced when PIP4K2A is overexpressed in a glioblastoma spoloid;
  • A Immunofluorescence assay results;
  • B Western blotting results.
  • FIG. 6B shows the results of confirming that phosphorylation of AKT and S6K is reduced when PIP4K2A is overexpressed in a glioblastoma spoloid;
  • C Western blotting results.
  • FIG. 7 is a graph showing that the expression of regulatory (p85) and catalytic (p110) subunits of PI3K is reduced when PIP4K2A is overexpressed in a glioblastoma spoloid;
  • A Western blotting results;
  • B a graph showing quantitatively the result of Western blotting;
  • C immunofluorescence assay results.
  • FIG. 8 shows that (a) the reduction of p85 expression in glioblastoma spolod using MG-132, which is a proteasome inhibitor, is accomplished by proteolysis rather than merely expression reduction; (B) and Western blotting (C to E) show that p85 degradation by PIP4K2A overexpression using p85 shRNA, Cbl shRNA, or MG-132 is cbl-dependent, .
  • FIG. 9 shows that PIP4K2A inhibits cancer growth in animal models using a glioblastoma animal model and PIK3CA activating mutations (E545K).
  • the number of relative cells (A), the number of survival days (B) As shown in Fig.
  • FIG. 10A shows the expression of regulatory (p85) and catalytic (p110) subunits of PI3K according to expression of PIP4K2A using immunohistochemistry (IHC) in (A) Tissue microarrays of glioblastoma patient tissues.
  • FIG. 10B is a graph showing the expression of regulatory (p85) and catalytic (p110) subunits of PI3K according to expression of PIP4K2A in (B) 68 glioblastoma patient tissues.
  • FIG. 11A is a graph showing the expression levels of (A) PIP4K2A, pAKT, AKT, pS6K, S6K and PTEN in glioblastoma spoloids overexpressing PIP4K2A by immunoblotting; (B) and (C) the relative expression level of the results of (A) above.
  • FIG. 11B is a graph showing (D) cell proliferation in a glioblastoma tumor spoloid overexpressing PIP4K2A; (E) a graph showing the results of a limiting dilution assay (LDA) analysis for tumor spheroid formation; (F) The expression amounts of PI3K complexes (p85, p110? And p110?) Were confirmed by immunoblotting.
  • D cell proliferation in a glioblastoma tumor spoloid overexpressing PIP4K2A
  • E a graph showing the results of a limiting dilution assay (LDA) analysis for tumor spheroid formation
  • LDA limiting dilution assay
  • Figure 12 shows that PIP4K2A binds to p85 and PTEN interferes with this binding using co-immunoprecipitation.
  • Patients with high PIP4K2A expression without PTEN in the TCGA dataset (copy number) Lt; RTI ID 0.0 > survival < / RTI >
  • A The expression of p85, PIP4K2A and PTEN in a control or PTEN-transformed glioblastoma spoloid using co-immunoprecipitation;
  • B Expression of p85, PTEN, and PIP4K2A in the glioblastoma sp., Transformed with PTEN, PIP4K2A, or PTEN / PIP4K2A;
  • C Expression of PIP4K2A and p85 in PTEN-defective glioblastoma spoloid using co-immunoprecipitation;
  • D a graph showing the relative expression level
  • Figure 13 is a diagrammatic representation of (A) a simulated TAT-peptide of PIP4K2A; (B) Western blotting showing that the peptide of (A) binds to the regulatory (p85) subunit of PI3K to promote degradation.
  • FIG. 14 is a graph showing the inhibition of cell growth and phosphorylation of AKT using PIP4K2A simulated TAT-peptide of FIG. 13:
  • A PIP4K2A simulated TAT-peptide was injected into glioblastoma spoloids and p85, pAKT , demonstrating the decrease in the expression level of pS6K through immunofluorescence;
  • B the analysis of the reduction of pAKT protein by Western blotting;
  • C peptides inhibit cell growth and stem cell characteristics;
  • D peptides inhibit cell growth.
  • FIG. 15A shows that genes associated with EGFR are higher in patients with low expression of PIP4K2A than those in patients with (A) glioblastoma by analysis of Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) of patients with low expression of PIP4K2A gene and those with high expression ; (B) The result of correlation analysis of PIP4K2A gene and EGFR gene in glioblastoma patients.
  • GSEA Gene Set Enrichment Analysis
  • 15B is a graph showing the results of correlation analysis of PIP4K2A gene and EGFR gene in (C) glioblastoma patients.
  • FIG. 16A is a graph showing the expression of the PIP4K2A gene in the four subtypes of (A) glioblastoma patients as the lowest expression level of the PIP4K2A gene in the classical patient group;
  • FIG. 16B is a graph showing the results of correlation analysis between scores of PIP4K2A expression and classical subtypes in (B) glioblastoma patients; (C) The analysis of total gene expression of patients with high PIP4K2A gene expression and those with low PIP4K2A gene expression level showed that the classical subtype score was higher in patients with less PIP4K2A expression;
  • FIG. 16C is a graph showing the results of correlation analysis in which (D) PIP4K2A and expression in the glioblastoma patients are inversely related to the classical score.
  • FIG. 17 is a view showing that the expression of PIP4K2B gene in four subtypes of a glioblastoma patient is not related to Subtype; (A) RIP expression of the gene of PIP4K2B in four subtypes of glioblastoma patient; (B) DNA expression of PIP4K2B gene in 4 subtypes of glioblastoma patient.
  • Example 1 Screening of new tumor suppressor genes by in vivo RNAi screening technique
  • RNAi screening techniques were performed. Specifically, 23 RNAi-suppressing gene candidates were selected through a genome analysis of glioblastoma patients in a public database, and RNAi pools were prepared for them. The prepared pool was injected into various kinds of brain tumor speeloids, and injected cells were injected in an in vivo mouse model to compare shRNA amplification in tumor model. Thereafter, the novel tumor suppressor gene PIP4K2A was selected through the shRNA with the highest amplification, and the results are shown in FIG.
  • PIP4K2A and MXI1 were selected as novel tumor suppressor candidates and experiments on PIP4K2A were performed in subsequent experiments.
  • glioblastoma spoloids and normal neural progenitor cells were cultured as previously described (Kim et al., 2013; Lee et al., 2006; Son et al., 2009).
  • GSCs Glioma Stem Cells
  • NPCs normal neural progenitor cells
  • PIP4K2A was further measured by the IHC method. Specifically, expression of PIP4K2A was measured by measuring the expression level of the antibody through PIP4K2A-targeting antibodies (PIP4K2A 1: 1000, # AP8041b, Abgent) in patient tissues, and the results are shown in FIG.
  • a vector (Lentivirus, Invitrogen) containing a PIP4K2A gene sequence was prepared, and then directly transformed into cells to compare the amount of PIP4K2A gene expression in each cell.
  • the cells were cultured in a 96-well plate at 10 3 / well for 5-7 days, and the growth of the cells was confirmed by the manufacturer's instructions using an EX-cytox kit (Daeil Lab).
  • EX-cytox kit Daeil Lab
  • LDA limiting dilution assays
  • the frequency of stem cells was calculated using extreme limiting dilution analysis (ELDA). The results are shown in FIG.
  • the survival rate of PIP4K2A expression or replication was low in the patient group, and the expression of PIP4K2A was expressed in glioblastoma spp and neural progenitor cells (NPC) .
  • NPC neural progenitor cells
  • PIP4K2A plays a role as a tumor suppressor gene.
  • PIP4K2A was overexpressed in glioblastoma spproid in the same manner as in Example 2 above.
  • PIP4K2A (# 1, TRCN0000356569; # 2, TRCN0000356567; # 3 TRCN0000356495; # 4 TRCN0000356493; # 5, TRCN0000006009)
  • p85 (# 1, TRCN0000039904; # 2, TRCN0000039906; # 3, TRCN0000039906; Of PIP4K2A in glioblastoma spoloids was determined using Cbl (# 1, TRCN0000039723; # 2, TRCN0000039724; # 3, TRCN0000039726; # 4, TRCN0000039727; # 5, TRCN0000039725) (Sigma-Aldrich) Lt; / RTI > Cell Signaling), p110b 1: 1000 (3011, Cell Signaling), pAKT 1: 1000 (4257, Cell Signaling) 1000 (4060, Cell Signaling),
  • IHC was also detected using PIP4K2A 1:50 (# AP8041b, Abgent), pAKT 1: 200 (4060, Cell Signaling), p85 1: 100 (ab86714, abcam), and p110 1: 100 (ab1678, abcam) Respectively.
  • Fig. 6 it was confirmed that phosphorylation of AKT and S6K was reduced when PIP4K2A was overexpressed.
  • Fig. 7 it was confirmed that the expression of regulatory (p85) and catalytic (p110) subunits of PI3K decreased upon overexpression of PIP4K2A.
  • Fig. 8 it was confirmed that the decrease in expression of p85 was not caused by a decrease in simple expression but by protein degradation.
  • the degradation of p85 due to overexpression of PIP4K2A was found to be cbl dependent.
  • PIP4K2A promotes the degradation of PI3K regulatory (p85) and catalytic (p110) subunits.
  • expression of PIP4K2A also results in phosphorylation of AKT and S6K, No change was observed.
  • FIG. 12 in patients in which PIP4K2A and p85 bind, PTEN inhibits the binding of PIP4K2A and p85, and PTEN is absent and PIP4K2A expression is high, the survival rate of PTEN- High.
  • the animal model was prepared by injecting glioma glioma cells (2 x 10 5 cells per mouse) into the brain of a mouse (BALB / c nude mouse, Orient Bio) directly by intracranial injection .
  • a vector containing PIP4K2A was added to the cells as described above, and the cells were directly injected into the mouse brain. Thereafter, the cancer cell growth inhibitory ability was confirmed by measuring the survival period of the mouse, and the results are shown in FIG. 5 and FIG.
  • SEQ ID NOS: 2 to 5 were used as the active fragments of PIP4K2A, and TAT was used as the cell penetrating peptide.
  • the mimetic TAT-peptide of PIP4K2A binds to the regulatory (p85) subunit of PI3K to promote degradation and inhibits cell growth and phosphorylation of AKT.
  • GSEA Gene Set Enrichment Analysis

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Abstract

종양 억제 유전자 PIP4K2A 및 그의 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 종양 억제 유전자 PIP4K2A는 in vivo RNAi 스크리닝 기법을 통해 도출되어, 암 치료에 유용한 새로운 타겟이 될 수 있어 암 진단, 치료 및 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

종양 억제 유전자 ＰＩＰ４Ｋ２Ａ 및 그의 용도
종양 억제 유전자 PIP4K2A 및 그의 용도에 관한 것이다.
신경교종(glioma)은 원발성 뇌종양(primary brain tumor)의 60%를 차지하는 종양으로서, 발생빈도가 높고 치료가 어려워서, 현재까지도 방사선 치료 외엔 특별한 치료법이 없는 악성 종양이다. 교모세포종은 전체 뇌종양의 12~15%를 차지하고, 뇌 교종의 50~60%를 차지하는 뇌에 발생하는 단일 종양 중 가장 많이 발생하는 종양이다. 또한, 뇌압이 급속히 상승하여 두통(아침에 심함), 메슥거림(오심), 구토, 경련, 뇌 부종으로 인한 신경기능의 저하, 사지 운동 또는 감각 저하, 얼굴마비, 언어장애, 인지기능 저하, 좌-우 구분장애 등의 다양한 증상을 나타낸다. 교모세포종(glioblastoma, GBM)의 경우, 다른 암과 비교하였을 때 방사선 및 항암제 치료에 대한 저항성이 매우 높아 일단 진단되면 기대 생존기간이 단 1년에 불과하다. 또한 이와 같은 뇌종양의 경우, 뇌혈관 장벽이 있어 치료를 위한 약물의 전달이 쉽지 않다. 특히 상대적으로 뇌신경 생물학에 대한 이해가 부족하여 그에 대한 치료제 개발이 더디게 진행되고 있다. 더욱이, 교모세포종은 다른 뇌종양과 비교해볼 때 공격적 변이(aggressive variant)를 나타내어, 이를 빠른 시일 내에 치료하지 않으면 몇 주 이내에 치명적인 결과를 초래할 수 있다. 교모세포종이 발병된 환자를 치료하기 위하여는, 환자의 유전적, 생리적 및 환경적 특성을 고려하여야 할 뿐만 아니라, 교모세포종의 진행수준에 맞추어, 화학적 요법, 방사선 요법, 외과적 요법, 면역세포치료법 등의 다양한 치료방법을 적용하여야 한다. 그러나, 이러한 치료는 내성 변이주의 발생, 종양줄기세포에 의한 재발 등의 원인으로 인하여 한계에 다다른 상황이므로, 새로운 치료법을 개발하여야 할 필요성이 요구되고 있는 실정이다.
일 양상은 종양 억제 유전자 PIP4K2A 를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 PIP4K2A 유전자 또는 단백질 또는 그의 활성 단편을 포함하는 암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 PIP4K2A를 이용한 암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 PIP4K2A를 이용한 암 치료제 후보물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 종양 억제 유전자 또는 단백질 PIP4K2A(Phosphatidylinositol-5-Phosphate 4-Kinase Type 2 Alpha), 또는 그의 활성 단편을 제공한다.
일 양상은 PIP4K2A 단백질 또는 그의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
상기 PIP4K2A 단백질 또는 그의 활성 단편은 세포 투과 펩티드가 연결된 것일 수 있다. 상기 활성 단편 및 세포 투과 펩티드에 대해서는 후술한다.
일 양상은 PIP4K2A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 증가제를 유효성분으로 포함하는 암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 PIP4K2A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 증가제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 암 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 PIP4K2A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 증가제의 용도를 제공한다.
상기 PIP4K2A 단백질의 발현 또는 활성 증가제는 PIP4K2A 단백질 또는 그의 활성 단편을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "치료하다(treat)"는 질병을 앓거나 또는 질병을 발병할 위험이 있는 개체에게, 상기 개체의 상태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 질병 진행의 지연, 증상 발생의 지연 또는 증상 진행의 둔화 등을 포함한 효과를 제공하는 임의의 형태의 치료 또는 예방을 의미한다. 따라서, 용어 "치료(treatment)"는 또한 증상의 발생을 예방하는 개체의 예방적 치료를 포함한다.
본 명세서에서 사용된, "치료(treatment)" 및 "예방(prevention)"은 증상의 치유 또는 완전한 제거를 의미하도록 의도되지 않는다. 이들은 환자의 상태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 질병의 진행의 지연 등을 포함한, 질병을 앓고 있는 환자에게 효과를 제공하는 임의의 형태의 치료를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "치료적 유효량(treatment-effective amount)"은 교모세포종과 같은 암에 걸린 환자에서, 환자의 상태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 질병의 진행의 지연 등을 포함한 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양을 의미한다.
본 명세서의 암은 뇌종양, 교모세포종, 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 또는 피부암 등을 포함할 수 있다. 또한, 일 구체예에 있어서, 상기 PIP4K2는 PTEN이 결실된 또는 PTEN의 발현이 감소된 암세포에서 특이적으로 역할을 수행할 수 있다. 따라서, 상기 암은 PTEN이 결실된 또는 PTEN의 발현이 감소된 암일 수 있다.
또한, 상기 교모세포종은 전통적(classical) 교모세포종, 전신경(proneural) 교모세포종, 신경(neural) 교모세포종, 간엽(mesenchymal) 교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아형(subtype)인 것일 수 있다.
상기 PIP4K2A((Phosphatidylinositol-5-phosphate 4-kinase type-2 alpha) 단백질 또는 그의 단편은 천연형 또는 재조합 PIP4K2A 단백질 또는 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 말한다. 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 PIP4K2A 단백질 또는 이의 단편과 그 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다.
상기 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 PIP4K2A 단백질 또는 이의 단편과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다. 상기 "기능적 유도체"는 상기 PIP4K2A 단백질 또는 이의 단편의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질 또는 이의 단편으로서 천연형 PIP4K2A 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 PIP4K2A 단백질 또는 이의 단편은 포유동물로부터 유래된 것일수 있으며, 상기 포유동물은 인간을 포함한다. 예를 들면, 상기 PIP4K2A 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 PIP4K2A의 활성 단편은 서열번호 2 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 PIP4K2A 유전자의 발현 증가제는 PIP4K2A 단백질 또는 그의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포일 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 PIP4K2A 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등과 같은 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드, λgt4λB, λ-Charon, λ△z1 및 M13 등과 같은 파지 또는 SV40 등과 같은 바이러스를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 프로모터 서열과 같은 뉴클레오티드 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
상기 재조합 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 PIP4K2A 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
다른 구체예에 있어서, 세포 투과 펩티드가 상기 PIP4K2A 단백질 또는 그의 활성 단편에 연결된 것일 수 있다. 상기 세포 투과 펩티드는 양이온성 세포 투과 펩티드일 수 있다. 상기 양이온성 세포 투과 펩티드는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 잔기를 전체 아미노산 서열의 적어도 70% 이상, 80% 이상, 예를 들면, 70 내지 90%, 또는 80 내지 90%로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 세포 투과 펩티드는 아미노산은 체내에서의 안정성을 고려하여 L-형 또는 D-형으로 할 수 있다. 상세하게는 상기 세포 투과펩티드는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 10 내지 40 아미노산 잔기의 길이로 구성된 것일 수 있다. 상세하게는 상기 세포 투과 펩티드는 TAT(서열번호 6: YGRKKRRQRRR), 페너트라틴(Penetratin; 서열번호 7:RQIKIWFQNRRMKWKK), 폴리아르기닌(polyarginine)(서열번호 8:RRRRRRR), 폴리라이신(polylysine)(서열번호 9:KKKKKKKKKK), LMWP(low molecular weight protamine; 서열번호 10: VSRRRRRRGGRRRR), 프로타민(protamine) 절편 및 안테나페디아(Antennapedia, ANTP)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 세포막을 투과할 수 있다면 전술한 펩티드 이외의 다른 펩티드 또는 펩티드 유사체도 사용할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 추가적인 항암제와 병용 투여 될 수 있다. 상기 항암제는 예를 들면, 표적항암제 일 수 있다. 표적항암제는 특정 암세포에만 많이 나타나는 특정 단백질이나 특정 유전자 변화를 표적으로 암의 성장과 발생에 관여하는 신호를 차단함으로써 암세포만 선택적으로 사멸시키는 항암제를 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 PIP4K2A 단백질 또는 그의 활성 단편은 PI3K의 p85와 결합하는 것일 수 있다. 이를 통해 상기 PIP4K2A 단백질 또는 그의 활성 단편은 p85와 p110의 분해를 촉진하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 경구, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 주사 가능한 형태로 사용될 수 있다. 이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도록 하므로 유리하다. 사용되는 투여량은 다양한 파라미터, 특히 단백질, 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 10 mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 1 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있다.
또 다른 양상은 PIP4K2A를 이용한 암 진단 방법을 제공한다.
상세하게는 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다. 또한, 개체의 피검체 유래 시료에서 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현을 측정하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "진단"이란 생물학적 시료 또는 조직 샘플에서 본 발명의 PIP4K2A 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 측정함으로써 상기 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성과 관련된 질환의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.
또한, 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현을 측정하는 단계; 상기 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현을 정상 대조군의 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현과 비교하는 단계; 및 상기 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현이 대조군에 비해 감소하는 경우, 암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 또는 유전자 검출 방법을 제공한다.
상기 PIP4K2A 단백질의 활성은 항체를 통해 측정하는 것일 수 있다.
상기 PIP4K2A 유전자의 발현은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다. 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA 의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "단백질 발현 또는 활성 수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양상은 후보물질을 PIP4K2A 단백질 또는 유전자에 처리하는 단계; 상기 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현을 측정하는 단계; 및 상기 후보물질을 무처리한 대조군과 비교하여 상기 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현을 증가시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현 수준의 측정에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 후보물질은 이에 한정되지 않지만 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출물, 식물 추출물, 또는 동물 조직 추출물 일 수 있으며, 신규한 물질뿐 아니라 널리 알려진 것일 수도 있다. 상기 후보물질의 처리는 PIP4K2A 단백질 또는 유전자가 발현된 세포에 처리하는 것일 수 있다. 상기 세포는 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 세포일 수 있으며, 이러한 형질 전환 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
상기 유전자의 발현 정도는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 발현에 따른 단백질의 양을 확인하는 방법으로서 항체를 이용하는 경우에는, 표적 단백질에 특이적이고 검출 가능한 표지에 연결된 제2항체를 첨가할 수 있으며, 검출은 또한 제2항체를 첨가한 후, 제2항체에 대한 결합 친화도를 가지며, 검출 가능한 표지에 연결된 제3항체를 첨가할 수도 있다. 제 2항체 또는 제3항체에 검출될 수 있는 표지는 적절한 발색성 기질과 배양시 발색을 나타내는 효소가 사용될 수 있다. 검출 가능한 부분은 분광학적, 효소적, 광화학적, 생화학적, 생체전자공학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단으로 검출가능한 조성물을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 형광 마커 및 염료, 자성 표지, 연결된 효소, 질량 분광 태그, 스핀 표지, 전자 전달 공여자 및 수용자 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 후보물질을 처리한 세포에서의 상기 단백질 또는 유전자의 발현 정도가 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 경우, 상기 후보물질은 암 치료제로서 선별될 수 있다.
상기 본 발명의 스크리닝 방법을 이용하는 경우, 빠른 시간에 상기 메카니즘에 관여하는 치료제를 선별하고, 이를 입증하는 실험을 통하여 암 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 유용한 예방제 및/또는 치료제를 제공할 수 있다.
일 양상에 따른 종양 억제 유전자 PIP4K2A는 in vivo RNAi 스크리닝 기법을 통해 도출되어, 암 치료에 유용한 새로운 타겟이 될 수 있어 암 진단, 치료 및 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 종양 억제 유전자를 스크리닝 하기 위해 교모세포종 스페로이드를 이용한 in vivo RNAi 스크리닝 기법을 나타낸 도면이다; (A) 암 억제유전자 후보자중 가장 높게 증폭된 유전자 후보를 선별하는 도면이다; (B) GBM1 종양에 투입되어 증폭된 shRNA 후보 중 PIP4K2A 유전자가 있음을 나타내는 도면이다; (C) 3개의 뇌종양 스페로이드와 LN428 세포 중 PIP4K2A shRNA의 유전자 증폭을 보여주는 도면이다; (D) 3개의 뇌종양 스페로이드에서 증폭된 shRNA 후보 중 PIP4K2A 유전자 shRNA가 공통적으로 모든 세포에서 증폭된 것을 나타낸 도면이다.
도 2는, (A) Oncomine dataset을 이용하여 교모세포종 환자와 정상 뇌조직에서 PIP4K2A 발현을 나타낸 도면이다; (B) 및 (C) Phillips data set (mRNA)과 TCGA dataset CNA에서 PIP4K2A 발현 또는 복제수(copy number)가 낮은 환자군에서 생존율을 나타낸 도면이다; (D) RNAseq 데이터를 이용하여 교모세포종 스페로이드와 정상 신경전구세포 (neural progenitor cell: NPC)에서 PIP4K2A의 발현을 나타낸 도면이다.
도 3a는, 교모세포종 환자조직(Tissue microarrays)에서 Immunohistochemistry(IHC)를 이용한 PIP4K2A의 발현을 확인한 도면이다; (A) TissueFAX를 통해 각 환자 조직의 종양 부분과 종양이 아닌 부분에서 PIP4K2A의 단백질 발현량을 측정한 도면이다.
도 3b는, 교모세포종 환자조직(Tissue microarrays)에서 Immunohistochemistry(IHC)를 이용한 PIP4K2A의 발현을 확인한 도면이다; (B) 상기 (A)에서 측정한 PIP4K2A 단백질의 발현량을 정량화 한 도면이다; (C) 대표적으로 202 환자의 조직에서 종양부분과 종양이 아닌 부분에서 PIP4K2A 단백질 발현량을 측정한 도면이다; (D) 68개의 환자 조직에서 종양과 종양이 아닌 부분의 PIP4K2A 단백질 발현량을 측정한 도면이다.
도 4는, 교모세포종 스페로이드에서 PIP4K2A를 과발현 시켜 세포성장과 줄기세포성(stemness)이 유의성 있게 감소하는것을 확인한 도면이다; (A) 교모세포종 스페로이드에서 PIP4K2A를 과발현 시킨 후 세포성장을 비교한 결과 PIP4K2A가 과발현된 세포에서 세포성장이 억제되는 것을 나타낸 도면이다; (B) 교모세포종 스페로이드에서 PIP4K2A를 과발현 시킨 후 줄기세포성을 비교한 결과 PIP4K2A 유전자가 과발현 된 세포에서는 줄기세포성 특징이 억제 되는 것을 나타낸 도면이다; (C) 상기 (B)에서 측정된 줄기세포성을 수치화해 비교한 결과이다; (D) 상기 (C)에서 측정된 줄기세포성을 수치화해 그래프로 나타낸 도면이다.
도 5는, 교모세포종 동물모델(in vivo competition assay)을 이용하여 PIP4K2A를 과발현시 암 성장이 유의성 있게 감소하는 것을 확인한 도면이다; (A) 교모세포종 스페로이드에 PIP4K2A를 과발현 시킨 세포는 빨간색(RFP)으로, 그렇지 아니한 세포는 초록색(GFP)으로 만들어서 동물모델에 1:1로 injection한 과정을 나타낸 도면이다; (B) 웨스턴 블랏을 이용해 PIP4K2A 단백질 과발현 실험을 한 결과를 기재한 도면이다; (C) 동물모델 실험 후 얻은 종양세포 색깔을 비교한 결과 PIP4K2A 유전자가 과발현되지 않은 세포 (45.93%)의 분포가 더 많은 것을 확인한 도면이다; (D) 상기 (C)에서 나온 결과를 정량하여 측정한 도면이다; (E) 동물모델에서 나온 조직의 색깔을 비교한 결과 PIP4K2A를 과발현 시키지 않은 세포 (빗금)의 분포가 더 높은 것을 나타낸 도면이다; (F) 상기 (E)에서 나온 결과에 대한 동물모델 조직에서 세포의 분포를 확인한 도면이다.
도 6a는, 교모세포종 스페로이드에 PIP4K2A를 과발현시켰을 때, AKT, S6K의 인산화가 줄어드는 것을 확인한 결과이다; (A) 면역 형광 어세이 결과를 나타낸 도면이다; (B) 웨스턴 블랏팅 결과를 나타낸 도면이다.
도 6b는, 교모세포종 스페로이드에 PIP4K2A를 과발현시켰을 때, AKT, S6K의 인산화가 줄어드는 것을 확인한 결과이다; (C) 웨스턴 블랏팅 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 7은, 교모세포종 스페로이드에 PIP4K2A를 과발현시켰을 때, PI3K의 regulatory (p85)와 catalytic (p110) subunit의 발현이 줄어드는 것을 확인한 도면이다; (A) 웨스턴 블랏팅 결과를 나타낸 도면이다; (B) 웨스턴 블랏팅 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다; (C) 면역형광 어세이 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은, (A) 프로테아좀 억제제인 MG-132를 이용하여 교모세포종 스페로이드에서 p85 발현감소는 단순히 발현 감소가 아니라 단백질 분해에 의하여 이루어지는 것을 확인한 결과이다; (B) 내지 (E)는 p85의 shRNA, Cbl의 shRNA, 또는 MG-132를 이용하여 PIP4K2A 과발현으로 인한 p85 분해는 cbl 의존적임을 상대적 세포의 수(B)와 웨스턴 블랏팅(C 내지 E)을 통해 확인한 결과이다.
도 9는, 교모세포종 동물모델과 PIK3CA activating mutations (E545K) 를 이용하여 PIP4K2A가 동물모델에서 암 성장을 저해 하는 것을 상대적 세포의 수(A)와 생존일 수(B), 및 조직 검사(C)로 확인한 도면이다.
도 10a는, (A) 교모세포종 환자조직(Tissue microarrays)에서 Immunohistochemistry(IHC)를 이용하여 PIP4K2A의 발현에 따른 PI3K의 regulatory (p85)와 catalytic (p110) subunit의 발현을 확인한 도면이다.
도 10b는, (B) 68명의 교모세포종 환자 조직에서 PIP4K2A의 발현에 따른 PI3K의 regulatory (p85)와 catalytic (p110) subunit의 발현을 수치화한 도면이다.
도 11a는, PIP4K2A를 과발현시킨 교모세포종 스페로이드에서 (A) PIP4K2A, pAKT, AKT, pS6K, S6K, 및 PTEN의 발현량을 면역 블랏팅으로 확인한 도면이다; (B) 및 (C) 상기 (A)의 결과를 상대적 발현량으로 나타낸 그래프이다.
도 11b는, PIP4K2A를 과발현시킨 교모세포종 종양스페로이드에서 (D) 세포의 증식을 확인한 그래프이다; (E) 종양 구형 형성에 대한 LDA(limiting dilution assay) 분석 결과를 나타낸 그래프이다; (F) PI3K 복합체 (p85, p110α 및 p110β)의 발현량을 면역 블랏팅으로 확인한 도면이다.
도 12는, 공동 면역침강법(co-Immunoprecipitation)을 사용하여 PIP4K2A가 p85에 결합하고 PTEN이 이러한 결합을 방해하며, TCGA dataset (copy number)에서 PTEN이 없으면서 PIP4K2A 발현이 높은 환자는 PTEN이 없으면서 PIP4K2A 발현이 적은 환자군보다 생존율이 높음을 보임을 나타낸 도면이다; (A) 공동 면역침강법(co-Immunoprecipitation)을 사용하여 대조군 또는 PTEN이 형질전환된 교모세포종 스페로이드에서 p85, PIP4K2A 및 PTEN의 발현을 나타낸 도면이다; (B) 대조군, PTEN, PIP4K2A, 또는 PTEN/PIP4K2A이 형질전환된 교모세포종 스페로이드에서 p85, PTEN, 및 PIP4K2A의 발현을 나타낸 도면이다; (C) 공동 면역침강법(co-Immunoprecipitation)을 사용하여 PTEN-결실 교모세포종 스페로이드에서 PIP4K2A 및 p85의 발현을 나타낸 도면이다; (D) 상기(B)에서 p85의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다; (F) PIP4K2A 카피 수에 기반하여 PTEN 결실 교모세포종 환자에서 카플란-마이어 생존 분석(Kaplan-Meier survival analysis) 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은, (A) PIP4K2A의 모사 TAT-펩티드를 도식화하여 나타낸 도면이다; (B) 상기 (A)의 펩티드가 PI3K의 regulatory (p85) subunit에 결합하여 분해를 촉진함을 웨스턴 블랏팅을 통해 나타낸 도면이다.
도 14는, 도 13의 PIP4K2A 모사 TAT-펩티드를 이용하여 세포성장과 AKT의 인산화를 저해하는 것을 규명한 도면이다: (A) PIP4K2A 모사 TAT-펩티드를 교모세포종 스페로이드에 투입한 결과 p85, pAKT, pS6K의 발현량이 감소하는 것을 면역형광을 통해 검증한 도면이다; (B) pAKT 단백질의 감소를 웨스턴 블랏팅으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다; (C) 펩티드가 세포성장 및 줄기세포성 특징을 억제하는 것을 나타낸 도면이다; (D) 펩티드가 세포성장을 억제하는 것을 수치화한 도면이다.
도 15a는, (A) 교모세포종 환자 중 PIP4K2A 유전자의 발현이 낮은 환자군과 높은 환자군의 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) 분석을 통하여 EGFR과 관련된 유전자들이 PIP4K2A 발현이 낮은 환자군에서 더 높게 나오는 것을 확인한 결과이다; (B) 교모세포종 환자에서 PIP4K2A 유전자와 EGFR 유전자의 상관분석 결과를 확인한 도면이다.
도 15b는 (C) 교모세포종 환자에서 PIP4K2A 유전자와 EGFR 유전자의 상관분석 결과를 확인한 도면이다.
도 16a는, (A) 교모세포종 환자의 4가지 Subtype에서의 PIP4K2A 유전자의 발현을 비교한 결과 PIP4K2A 유전자가 Classical 환자 그룹에서 가장 낮게 발현되는 것을 나타낸 도면이다;
도 16b는 (B) 교모세포종 환자에서 PIP4K2A 발현과 Classical subtype의 점수의 상관분석결과를 나타낸 도면이다; (C) 교모세포종 환자에서 PIP4K2A유전자 발현량이 높은 환자군과 낮은 환자군의 전제 유전자 발현량을 분석하였을 경우, Classical subtype 점수가 PIP4K2A 발현이 적은 환자군에서 높게 나온 것을 확인한 도면이다;
도 16c는 (D) 교모세포종 환자에서 PIP4K2A와 발현이 Classical 점수와 반대로 나오는 상관분석을 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은, 교모세포종 환자의 4가지 Subtype에서의 PIP4K2B 유전자의 발현이 Subtype과 상관이 없다는 것 나타낸 도면이다; (A) 교모세포종 환자의 4가지 Subtype에서 PIP4K2B의 유전자의 RNA 발현을 나타낸 도면이다; (B) 교모세포종 환자의 4가지 Subtype에서 PIP4K2B의 유전자의 DNA 발현을 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. in vivo RNAi 스크리닝 기법을 통한 신규 종양 억제 유전자 선별
신규 종양 억제 유전자를 선별하기 위해, in vivo RNAi 스크리닝 기법을 수행하였다. 구체적으로, Public database에서 교모세포종 환자의 유전체 분석을 통해 23개의 암 억제 유전자 후보를 선택을 하여 이에 대한 RNAi pool을 제작 하였다. 제작된 pool을 다종류의 뇌종양 스페로이드에 투입을 하였고, 투입된 세포를 in vivo 마우스 모델에서 주사하여 종양모델에서의 shRNA 증폭성을 비교하였다. 이후에, 가장 증폭이 높은 shRNA을 통해 신규 종양 억제 유전자 PIP4K2A를 선별하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 신규 종양 억제 후보자로서, PIP4K2A 및 MXI1을 선별하였고, 이후의 실험에서 PIP4K2A에 대한 실험을 수행하였다.
실시예 2. 교모세포종 스페로이드에서의 PIP4K2A의 발현 분석
교모세포종 스페로이드에서 PIP4K2A의 발현을 분석하기 위해, Oncomine dataset, Philips data set, TCGA dataset CNA, 및 RNA seq data를 사용하였다.
구체적으로, 교모세포종 스페로이드와 정상 신경 전구 세포 (NPCs)는 이전에 기술된 바와 같이 배양하였다(Kim et al., 2013; Lee et al., 2006; Son et al., 2009). 구형 배양(Sphere culture)을 위해 GSCs(Glioma Stem Cells)와 NPCs는 "NBE"신경 배양 조건(neurosphere culture condition)에서 배양하였다(Kim et al., 2013; Lee et al., 2006; Son et al., 2009). 정상 NPC (Lonza, Cat #, PT-2599)는 제공사의 지시에 따라 배양하였다.
이후에, Public database에서 나온 수치화된 PIP4K2A의 유전자의 발현량을 비교하는 방법으로 PIP4K2A의 발현을 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
또한, 추가적으로, IHC 방법을 통해 PIP4K2A의 발현을 측정하였다. 구체적으로, 환자 조직에서 PIP4K2A 타겟 하는 항체(PIP4K2A 1:1000, #AP8041b, Abgent)를 통해 그 항체의 발현량을 측정하여 PIP4K2A의 발현을 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
또한, PIP4K2A의 과발현과 세포 성장의 관계를 확인하기 위해 PIP4K2A 유전자 서열이 들어간 벡터(렌티바이러스, Invitrogen)를 제작한 후, 이를 직접 세포에 형질전환하여 각 세포에서의 PIP4K2A유전자 발현량을 비교하였다. 세포 성장은 96 웰 플레이트에서 웰당 103로 5~7일 동안 세포를 배양한 후 EX-cytox 키트(Daeil Lab)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 세포의 성장을 확인하였다. 또한, LDA(limiting dilution assays)를 위해, 상기와 동일한 방법으로, 96 웰 플레이트에서 웰당 103로 1-2주동안 배양하였고, 구형(Shpere)이 없는 웰의 수를 카운트하여 분석하였다. 줄기세포 빈도는 ELDA(extreme limiting dilution analysis)를 사용하여 계산하였다. 상기 결과는 도 4에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, PIP4K2A 발현 또는 복제수가 낮은 환자군에서 생존율이 매우 낮게 나타났으며, 교모세포종 스페로이드와 정상 신경전구세포 (neural progenitor cell: NPC)에서 PIP4K2A 발현을 나타내며 교모세포종 스페로이드에서 PIP4K2A의 발현이 낮게 나타났다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, PIP4K2A의 발현이 암조직에서 정상 조직보다 유의성 있게 적게 나타났으며, 도 4에 나타낸 바와 같이 PIP4K2A를 과발현 시킨 결과, 세포성장과 줄기세포성(stemness)가 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다.
이상의 결과로, PIP4K2A는 종양 억제 유전자로서 역할을 함을 알 수 있다.
실시예 3. 교모세포종 스페로이드에서의 PIP4K2A의 과발현을 통한 작용 메카니즘 분석
교모세포종 스페로이드에서의 PIP4K2A의 과발현 또는 발현 감소시 나타나는 현상을 웨스턴 블랏팅과 IHC 방법을 통해 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 교모세포종 스페로이드에서 PIP4K2A를 과발현시켰다. 또한, PIP4K2A 발현 감소를 위해, PIP4K2A (#1, TRCN0000356569; #2, TRCN0000356567; #3 TRCN0000356495; #4 TRCN0000356493; #5, TRCN0000006009), p85 (#1, TRCN0000039904; #2, TRCN0000039906; #3, TRCN0000039907; #4, TRCN0000039563), Cbl (#1, TRCN0000039723; #2, TRCN0000039724; #3, TRCN0000039726; #4, TRCN0000039727; #5, TRCN0000039725)(Sigma-Aldrich)를 사용하여 교모세포종 스페로이드에서의 PIP4K2A의 발현을 감소시켰다. 이후에, PIP4K2A 1:1000 (#AP8041b, Abgent), p85 1:1000 (4257, Cell Signaling), p110a 1:1000 (4249, Cell Signaling), p110b 1:1000 (3011, Cell Signaling), pAKT 1:1000 (4060, Cell Signaling), AKT 1:1000 (4691, Cell Signaling), pS6K 1:1000 (9234, Cell Signaling), S6K 1:1000 (2708, Cell Signaling), Cbl 1:1000, (2747, Cell Signaling), PTEN 1:1000 (9188, Cell Signaling) 및 b-actin 1:5000 (A5316, Sigma-Aldrich) 항체를 사용하여 면역 블랏팅을 수행하였다. 또한, PIP4K2A 1:50 (#AP8041b, Abgent), pAKT 1:200 (4060, Cell Signaling), p85 1:100 (ab86714, abcam), 및 p110 1:100 (ab1678, abcam) 항체를 사용하여 IHC를 수행하였다.
이를 통해 PIP4K2A 및 관련 타겟 유전자의 발현량을 측정하였고, 그 결과를 도 6 내지 8, 도 10, 및 도 11 및 12에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, PIP4K2A를 과발현 시에, AKT, 및 S6K의 인산화가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, PIP4K2A를 과발현 시에, PI3K의 regulatory (p85)와 catalytic (p110) subunit의 발현이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, p85의 발현 감소가 단순 발현 감소가 아니라, 단백질 분해에 의하여 이루어지는 것임을 확인하였다. 또한, PIP4K2A 과발현으로 인한 p85의 분해는 cbl의존적임을 알 수 있었다.
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, PIP4K2A의 발현이 높은 환자 조직에서는 p85와 p110 단백질 발현이 낮음을 알 수 있었다.
또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, PIP4K2A가 PI3K의 regulatory (p85)와 catalytic (p110) subunit의 분해를 촉진하지만 일부 교모세포종 스페로이드에서는 PIP4K2A를 발현하여도 AKT, S6K의 인산화와 p85, p110의 단백질 변화가 없음을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 하여, 도 12에 나타낸 바와 같이, PIP4K2A와 p85가 결합하고 PTEN이 PIP4K2A와 p85의 결합을 방해하고, PTEN이 없으면서 PIP4K2A 발현이 높은 환자는 PTEN이 없으면서 PIP4K2A 발현이 적은 환자군 보다 생존율이 높음을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 동물모델에서의 PIP4K2A의 과발현을 통한 암성장 저해능 확인
동물모델에서의 PIP4K2A의 과발현을 통한 암 성장 저해능은 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 동물 실험은 삼성서울병원 동물실험윤리위원회(IACUC)의 지침에 따라 수행하였다.
먼저 동물 모델은 뇌내 주입(intracranial injection)으로 직접 마우스(BALB/c 누드 마우스, Orient Bio)의 뇌에 신경교종 스페로이드(glioma cells)(마우스 당 2 x 105 cells)를 투입하는 방법으로 제작하였다. PIP4K2A를 과발현 시키기 위해 앞에서와 같이 PIP4K2A 포함하는 벡터를 세포에 투입한 후에 세포를 직접 마우스 뇌에 투입하는 방법을 수행하였다. 이후에 마우스의 생존율 기간을 측정하는 방법으로 암 세포 성장 저해능을 확인하였고, 그 결과를 도 5 및 도 9에 나타내었다.
도 5 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 교모세포종 동물모델(in vivo competition assay)을 이용하여 PIP4K2A를 과발현 시 암 성장이 유의성 있게 감소하고, 마우스의 생존율 기간이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 5. 활성 단편과 세포 투과 펩티드를 이용한 암 성장 저해능 확인
PIP4K2A의 활성 단편으로서 서열번호 2 내지 5를 이용하였고, 세포 투과 펩티드로서, TAT를 사용하였다.
이들을 상기 실시예 2및 3과 동일한 방법으로 교모세포종 스페로이드에 처리하여, 이들이 p85 subunit과 결합하는 여부와 세포 성장을 억제하는지 여부를 PIP4K2A나 p85 subunit을 타겟 하는 항체를 사용하여 발현량을 측정하였고, 그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.
도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, PIP4K2A의 모사 TAT-펩티드가 PI3K의 regulatory (p85) subunit에 결합하여 분해를 촉진하며, 세포성장과 AKT의 인산화를 저해하는 것을 확인하였다.
실시예 6. 교모세포종 환자에서의 PIP4K2A 유전자 발현 분석
교모세포종 환자에서 실제적으로 PIP4K2A의 유전자 발현이 어떻게 나타나는지 확인하였다.
구체적으로, GSEA(Gene Set Enrichment Analysis) 분석을 PIP4K2A RNA 발현량을 측정하여 GSEA에서 사용되는 algorithm을 통해 수행하였고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
또한, 교모세포종 환자의 4가지 서브타입에서 PIP4K2A의 발현 분석은 기존에 TCGA에서 기재된 교모세포종 환자의 서브타입을 정하여 각 그룹의 환자에서 발현되는 PIP4K2A 발현량을 이미 TCGA에서 기재된 유전자의 수치화된 발현량과 비교하여 수행하였고, 그 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, EGFR과 관련된 유전자들이 PIP4K2A 발현이 낮은 환자군에서 더 높게 나오는 것을 확인하였다.
또한, 도 16 및 17에 나타낸 바와 같이, 교모세포종 환자에서 PIP4K2A유전자 발현량이 높은 환자군과 낮은 환자군의 전제 유전자 발현량을 분석하였을 경우, Classical 아형 점수가 PIP4K2A 발현이 적은 환자군에서 높게 나온 것을 확인하였고, 교모세포종 환자의 4가지 아형에서의 PIP4K2B 유전자의 발현이 아형과 상관이 없다는 것을 확인하였다.

Claims (17)

  1. PIP4K2A(Phosphatidylinositol-5-phosphate 4-kinase type-2 alpha) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 증가제를 유효성분으로 포함하는 암 예방, 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 PIP4K2A 유전자의 발현 또는 활성 증가제는 PIP4K2A 단백질 또는 그의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포인 것인 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 PIP4K2A 단백질의 발현 또는 활성 증가제는 PIP4K2A 단백질 또는 그의 활성 단편인 것인 약학적 조성물.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 PIP4K2A 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  5. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 활성 단편은 서열번호 2 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  6. 청구항 2에 있어서, 세포 투과 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 PIP4K2A 단백질 또는 그의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 것인 약학적 조성물.
  7. 청구항 3에 있어서, 세포 투과 펩티드가 상기 PIP4K2A 단백질 또는 그의 활성 단편에 연결된 것인 약학적 조성물.
  8. 청구항 6 또는 7에 있어서, 상기 세포 투과 펩티드는 TAT(서열번호 6: YGRKKRRQRRR), 페너트라틴(Penetratin; 서열번호 7:RQIKIWFQNRRMKWKK), 폴리아르기닌(polyarginine)(서열번호 8:RRRRRRR), 폴리라이신(polylysine)(서열번호 9:KKKKKKKKKK), LMWP(low molecular weight protamine; 서열번호 10: VSRRRRRRGGRRRR), 프로타민(protamine) 절편 및 안테나페디아(Antennapedia, ANTP)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 교모세포종 또는 PTEN(Phosphatase and tensin homolog)이 결실된 암인 것인 약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 교모세포종은 전통적(classical) 교모세포종, 전신경(proneural) 교모세포종, 신경(neural) 교모세포종, 중간엽(mesenchymal) 교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아형(subtype)인 것인 약학적 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 추가적인 항암제와 병용 투여 되는 것인 약학적 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 PIP4K2A 단백질 또는 그의 활성 단편은 PI3K의 p85와 결합하여 p85와 p110의 분해를 촉진하는 것인 약학적 조성물.
  13. 청구항 2에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터인 것인 약학적 조성물.
  14. 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 PIP4K2A(Phosphatidylinositol-5-phosphate 4-kinase type-2 alpha) 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현을 측정하는 단계;
    상기 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현을 정상 대조군의 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현과 비교하는 단계; 및
    상기 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현이 대조군에 비해 감소하는 경우, 암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 또는 유전자 검출 방법.
  15. 후보물질을 PIP4K2A(Phosphatidylinositol-5-phosphate 4-kinase type-2 alpha) 단백질 또는 유전자에 처리하는 단계;
    상기 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현을 측정하는 단계; 및
    상기 후보물질을 무처리한 대조군과 비교하여 상기 PIP4K2A 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현을 증가시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  16. PIP4K2A(Phosphatidylinositol-5-phosphate 4-kinase type-2 alpha) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 증가제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법.
  17. 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 PIP4K2A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 증가제의 용도.
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