JP2006348006A - Ras信号伝達経路を標的にする血管新生、細胞増殖及び細胞転移抑制剤 - Google Patents
Ras信号伝達経路を標的にする血管新生、細胞増殖及び細胞転移抑制剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006348006A JP2006348006A JP2005193239A JP2005193239A JP2006348006A JP 2006348006 A JP2006348006 A JP 2006348006A JP 2005193239 A JP2005193239 A JP 2005193239A JP 2005193239 A JP2005193239 A JP 2005193239A JP 2006348006 A JP2006348006 A JP 2006348006A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ras
- gtp
- thymosin beta
- thymosin
- raf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57581—Thymosin; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
Abstract
【解決手段】チモシンβ10タンパク質は、Ras−GTPと結合してそれを隔離させたりRas−GTPのRafとの結合を妨害してRas−GTP/Raf複合体の量を減少させ血管内皮生成因子の発現を抑制することにより人体組織で起きる血管新生、細胞転移及び/または細胞増殖を抑制できる。したがって、本発明のチモシンβ10タンパク質は、Ras信号伝達経路の活性による血管新生、細胞増殖及び/または細胞転移と関連した疾病、例えば、卵巣癌、子宮頚部癌、胃癌及び肺癌等のような各種固形癌、リューマチ関節炎、乾癬及び糖尿病性網膜症等の治療に効果的に使用できる。
【選択図】図9
Description
本発明は、Ras信号伝達経路を標的にするチモシンβ10遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含む血管新生、細胞増殖または細胞転移抑制剤に関するものである。
本発明(2)は、チモシンβ10遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質が、哺乳類由来であることを特徴とする本発明(1)の抑制剤である。
本発明(3)は、チモシンβ10遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質が、ヒト由来であることを特徴とする本発明(2)の抑制剤である。
本発明(4)は、チモシンβ10遺伝子が、配列番号1、及びそれによりコードされるタンパク質が配列番号2で記載されることを特徴とする本発明(3)の抑制剤である。
本発明(5)は、血管新生、細胞増殖または細胞転移が、固形癌と関連した症状であることを特徴とする本発明(1)の抑制剤である。
本発明(6)は、固形癌が、胃癌、肺癌、子宮頚部癌または卵巣癌であることを特徴とする本発明(5)の抑制剤である。
本発明(7)は、血管新生が、リューマチ性関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症及び脂肪症等を含む疾患と関連した症状であることを特徴とする本発明(1)の抑制剤である。
本発明(8)は、Ras信号伝達経路を標的にすることが、チモシンβ10とRasとの直接的相互作用によるものであることを特徴とする本発明(1)乃至本発明(7)のいずれか一発明の抑制剤である。
本発明(9)は、チモシンβ10とRasとの直接的相互作用が、Ras−GTPの隔離及びRas−GTPのRafへの結合妨害、またはRas−GTPの隔離またはRas−GTPのRafへの結合妨害を招来することを特徴とする本発明(8)の抑制剤である。
本発明(10)は、Ras−GTPの隔離及びRas−GTPのRafへの結合妨害が、Ras−GTP/Raf複合体の量を減少させることを特徴とする本発明(9)の抑制剤である。
本発明(11)は、Ras−GTP/Raf複合体の量の減少が、血管内皮生成因子(VEGF)の発現を抑制することを特徴とする本発明(10)の抑制剤である。
本発明(12)は、チモシンβ10遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含むRas活性抑制剤である。
本発明(13)は、Ras活性の抑制が、チモシンβ10とRasとの直接的相互作用によるものであることを特徴とする本発明(12)のRas活性抑制剤である。
本発明(14)は、チモシンβ10とRasとの直接的相互作用が、Ras−GTPの隔離及びRas−GTPのRafへの結合妨害、またはRas−GTPの隔離またはRas−GTPのRafへの結合妨害を招来することを特徴とする本発明(13)のRas活性抑制剤である。
本発明(15)は、Ras−GTPの隔離及びRas−GTPのRafへの結合妨害が、Ras−GTP/Raf複合体の量を減少させることを特徴とする本発明(14)のRas活性抑制剤である。
本発明(16)は、RAS−GTP/Raf複合体の量の減少が、血管内皮生成因子(VEGF)の発現を抑制することを特徴とする本発明(15)のRas活性抑制剤である。
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例により限定されるものではない。
本発明のチモシンβ10の血管新生及び細胞増殖抑制効果の試験のための各種ベクターを下記のように製造した。
実施例1−1:チモシンβ10を発現するアデノウイルスベクター及びアデノウイルスの製造
アデノウイルスベクターへのクローニングのためのチモシンβ10及びβ4 cDNAは従来の文献(Lee等,Oncogene,2001年,第20巻,6700−6776頁;Lee等,Cancer Res,2005年,第65巻,137−147頁)に記載されているとおり製造した。続いて、前記各々のcDNAをアデノウイルスベクターに従来の記載どおり導入して、チモシンβ10を発現するGFP−AdTβ10及びAdTβ10アデノウイルスベクター及びそれら各々を含むアデノウイルスを収得した(Lee等,Oncogene,2001年,第20巻,6700−6776頁;Lee等,Cancer Res,2005年,第65巻,137−147頁;特許文献7)。
本発明のチモシンβ10及び陰性対照群としてβ4をGST(glutathione S transferase)との融合タンパク質で発現するためにGST(glutathione S transferase)融合タンパク質発現ベクターのpGEX4T−1(Pharmacia,米国)で実施例1−1のcDNAを各々従来記載の方法で導入した(Lee等,Oncogene,2001年,第20巻,6700−6776頁;Lee等,Cancer Res,2005年,第65巻,137−147頁)。ヒスチジン残基とRasの融合タンパク質発現のためにヒトK−Ras cDNAをヒスチジン(His)融合タンパク質発現ベクターのpcDNA4HisMaxベクター(Invitrogen,米国)に製造者のプロトコール及び従来文献(Lee等,Cancer Res,2005年,第65巻,137−147頁)に記載されたとおり導入した。Ras cDNA増幅に使用したプライマーは、次の通りである:正方形(5’−GAGAGAGGCCTGCTGAAAAT−3’);逆方向(5’−CCACTTGTACTAGTATGCCTTAAGAA−3’)。前記GSTまたは6個のヒスチジン残基と融合した融合タンパク質はタンパク質の分離、精製及びタンパク質間の相互作用分析に容易に使用できる。
チモシンβ10遺伝子の細胞内発現時に誘発される効果がチモシンβ10によるものかどうかを確認するために、その発現を遮断できるチモシンβ10配列を標的にするsiRNA(small interfering RNA)オリゴヌクレオチド配列(AAGCGGAGUGAAAUUUCCUAA)を使用してチモシンβ10遺伝子の発現を遮断した。 前記siRNAは、siRNA構築キット(Ambion,Austin,TX,米国)を製造者のプロトコールにしたがって合成した。RNAiシャトル(Orbigen,San Diego,CA,米国)を使用して製造者の勧告どおり細胞株でトランスフェクションされた(Lee等,Oncogene,2001年,第20巻,6700−6776頁;Lee等,Cancer Res,2005年,第65巻,137−147頁)。
本発明のチモシンβ10発現のために細胞培養に使用した各細胞株の培養培地及び条件を下記に示す:HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell,Clonetics,米国)は、EGM−2キット(Clonetics,米国)を使用して0.3%ゼラチンコーティングした皿で培養した。ヒト卵巣癌細胞株2774(Clonetics,米国)及びアデノウイルスの製造のための293 細胞株(Clonetics,米国)は各々10%FBS及び抗生剤(Life Technologies,米国)を添加したDMEM(Dulbecco’s Modification of Eagles Medium)とEMEM(Eagle’s Minimum Essential Medium)で培養し、前記細胞は37℃の5%の湿ったCO2大気で培養した。
チモシンβ10の発現が細胞増殖に及ぼす影響を分析するために下記の実験を行なった。実施例2に記載した方法によりHUVECを各々チモシンβ10を発現しないアデノウイルス(Ad)、チモシンβ10を発現するアデノウイルス(AdTβ10)またはチモシンβ10に特異的siRNAトランスフェクションと共にチモシンβ10を発現するアデノウイルス(AdTβ10+siRNA)で感染させた。前記siRNAは、実施例1−3に記載したとおり製造し、HUVEC細胞にトランスフェクションした後、その細胞をAdTβ10を含むアデノウイルスで感染させた。
チモシンβ10の発現が血管新生と関連した内皮細胞移動及び浸透に及ぼす影響を調査するために、従来に記載された方法によりトランスウェル(Transwell)(8−μm pore size,Costar,Cambridge,MA)を使用して移動及び浸透分析を行なった(Lee等,Biochem Biophys Res Commun,1999年,第264巻,743−750頁)。
チモシンβ10の直接的な抗血管新生効果を確認するためにチモシンβ10の過発現が内皮細胞のチューブ形成及び血管新生に及ぼす影響を下記のように調査した。
チモシンβ10のチューブ形成抑制効果は従来の記載どおりに行なった(Lee等,Cancer Res,2005年,第65巻,137−147頁)、要約すると、成長因子が減少したマトリゲル(Matrigel)を24−ウェル組織培養プレートに添加し、37℃で30分間重合した。続いて、実施例4に記載した方法で非感染HUVEC(Un)及びAd、GFP−AdTβ10及びGFP−AdTβ10+siRNA(トランスフェクション)アデノウイルスで感染したHUVEC細胞を準備して1×105細胞を前記準備したプレートのマトリゲルの表面に植えた後、10ng/mlのVEGFの存在及び不在下で1%FBSを含んだM199を入れて48時間培養した。その後、前記細胞の形態変化を光学顕微鏡(×400)下で観察した。HUVECチューブ長さはデジタルCCDカメラ(Zeiss)を装着した倒立顕微鏡及びイメージラボ(ImageLab)イメージソフトウェア(MCM Design)を使用して測定した。
チモシンβ10の生体外(ex vivo)血管新生抑制分析は、従来の記載どおりにマトリゲル上に骨格筋肉を体外培養する生体外移植法(ex vivo explant)で行なった(Jang等,Molecular Therapy,2004年,第9(3)巻,464〜474頁)。
実施例6−1:イーストツーハイブリッド分析法
前記のようにチモシンβ10による血管新生、細胞増殖及び/または細胞転移抑制効果に至る機序を糾明するためにチモシンβ10と相互作用するタンパク質をイーストツーハイブリッド分析法(Yeast two hybrid analysis)を使用して調査した。
実施例1−2により製造したGST−融合チモシンβ10(GST−Tβ10)及びHis−融合K−Ras(His−K−Ras)は、各々グルタチオンセパローズ4B(glutathione sepharose 4B,Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)及びNi−NTAアガロース(Qiagen,Chatsworth,CA)を使用して製造者の勧告どおり精製した。同量のグルタチオンセパローズビーズ(bead)に固定されたGSTまたはGST−Tβ10をHis−K−RasとインキュベーションしてRasを分離するプルダウン分析をした後、抗−His抗体を使用してウエスタンブロットでチモシンβ10と結合するRasを検出した(Lee等,Cancer Res,2005年,第65巻,137−147頁)。
前記のようにチモシンβ10のRasとの結合は、チモシンβ10がRas信号伝達経路に影響を及ぼす血管新生及び細胞増殖を抑制できることを示す。VEGFからはじまるRas信号伝達経路でRasの活性化及びその下流段階因子に続く活性化は血管新生及び細胞増殖等に非常に重要である。
実施例2に記載した方法でウイルスで感染しないHUVEC(Un)、チモシンβ10を発現しないアデノウイルス(Ad)またはチモシンβ10を発現するアデノウイルス(AdTβ10)で感染したHUVECを一晩の間、血清欠乏させた後、ホスファートフリー(phosphate−free)培地(Life Technologies,米国)で1%FBSを含むM199で5分間VEGF(50ng/ml)で刺激または刺激しなかった。
Rasに結合したGTP及びGDP分析は、従来の記載どおり行なった(Downward J.等,Nature,1990年,第346巻,719−723頁)。要約すると、ウイルスで感染しないHUVEC(Un)、チモシンβ10を発現しないアデノウイルス(Ad)またはチモシンβ10を発現するアデノウイルス(AdTβ10)で感染したHUVECを一晩の間、血清欠乏させた後、ホスファートフリー(phosphate−free)培地(Life Technologies)で3時間0.2mCi/ml[32P]オルソホスファート(orthophosphate)でラベリングした後、5分間VEGF(50ng/ml)で刺激または刺激しなかった(Un)。次に前記細胞を融解して融解物を獲得した。前記融解物で抗−Ras抗体及び陰性対照群としてIgG抗体でRasを沈澱させ分離した。次に前記抗−Ras及びIgG抗体で沈澱した沈澱物からそれに結合したヌクレオチドを抽出してポリエチレンイミンセルロースプレート(polyethyleneimine−cellulose plates,Sigma)を使用して薄膜クロマトグラフィー(TLC)で分離した。Rasに結合したGTP(Guanosine Triphosphate)及びGDP(Guanosine Diphosphate)の存在は放射線写真(図7B)で評価した。GTPとGTP+GDPの比率は、デンシトメトリー(densitometry)により測定(図7C)した。独立的に3回の反復実験を通じて類似な結果を得た。
実施例2によりウイルスで感染しないHUVEC(Un)、チモシンβ10を発現しないアデノウイルス(Ad)またはチモシンβ10を発現するアデノウイルス(GFP−AdTβ10)で感染したHUVECを5分間VEGF(50ng/ml)で刺激及び刺激しないで(Un)、前記細胞を細胞質、細胞膜及び核分画に分離して各分画から総タンパク質を分離して抗チュブリン抗体(Innogenex,San Ramon,CA)、抗GFP及び抗Ras(Santa Cruz Biotechnology,米国) (図6D)でウエスタンブロットを行なった(Lee等,Cancer Res,2005年,第65巻,137−147頁;Lee等,Oncogene,2001年,第20巻,6700−6776頁)。
下記に示す事項を除外して実施例7−3と同一な試験をした。HUVEC細胞を各分割別に分離しないで総細胞抽出物を分離して使用した。抗GFP、抗pMEK、抗pERK、抗ERK及び抗VEGF(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)、及び抗チュブリンに対する抗体を使用してウエスタンブロットを行なった。
チモシンβ10が直接的な抗腫瘍活性を有することを確認するために、マウスに腫瘍を誘導した後、チモシンβ10を処理してその効果を分析した。
本実験に使用したSPF(specific pathogen free)BALB/c及びnu/nuマウスは、各々バイオジェノミクス(Biogenomics,ソウル,韓国)及びカレスリバーラボ(Charles River Labs,Wilmington,MA)から得て従来公知の方法(Lee等,Cancer Res,2005年,第65巻,137−147頁)で製造した。
(1)腫瘍抑制活性
チモシンβ10の直接的な抗腫瘍活性を確認するために下記の実験を従来の記載どおりに行なった(Lee等,Cancer Res,2005年,第65巻,137−147頁)、要約すると、実施例9−1のマウスに実施例1により製造した1×109pfu/40μlのAdTβ10を含むアデノウイルスを3日に一回ずつ3回腫瘍内に注射した。腫瘍の大きさは3日毎にカリパー(caliper)測定法により評価した。マウスは、最終ウイルス注射後、27日目に犠牲にして免疫組織化学分析で血管数の変化を調べるために腫瘍を切開して血管内皮細胞に特異的な抗−マウスCD31(PECAM−1)抗体(PharMingen,San Diego,CA)で染色した。血管密度は、グループ当り3個の別個腫瘍横断面で血管数をカウントして計算した。
チモシンβ10が、生体内の実際の癌発生部位で発生した腫瘍の抑制に及ぼす影響を分析するために同所腫瘍マウスモデルを実施例9−1により製造し、同所腫瘍マウスでGFP−発現腫瘍をイルマツールツナブルライトシステム(Illumatool tunable lighting system:Lightools Research,Encinitas,CA)を使用して確認した。さらに前記腫瘍に1×109pfu/20μlのAdTβ10を注射して、10日目に犠牲にして腫瘍抑制の有無を確認した。卵巣腫瘍の大きさ及び血管数は実施例9−1と同様に分析した。
Claims (16)
- Ras信号伝達経路を標的にするチモシンβ10遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含む血管新生、細胞増殖または細胞転移抑制剤。
- チモシンβ10遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質が、哺乳類由来であることを特徴とする請求項1記載の抑制剤。
- チモシンβ10遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質が、ヒト由来であることを特徴とする請求項2記載の抑制剤。
- チモシンβ10遺伝子が、配列番号1、及びそれによりコードされるタンパク質が配列番号2で記載されることを特徴とする請求項3記載の抑制剤。
- 血管新生、細胞増殖または細胞転移が、固形癌と関連した症状であることを特徴とする請求項1記載の抑制剤。
- 固形癌が、胃癌、肺癌、子宮頚部癌または卵巣癌であることを特徴とする請求項5記載の抑制剤。
- 血管新生が、リューマチ性関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症及び脂肪症等を含む疾患と関連した症状であることを特徴とする請求項1記載の抑制剤。
- Ras信号伝達経路を標的にすることが、チモシンβ10とRasとの直接的相互作用によるものであることを特徴とする請求項1乃至請求項7のいずれか一項に記載の抑制剤。
- チモシンβ10とRasとの直接的相互作用が、Ras−GTPの隔離及びRas−GTPのRafへの結合妨害、またはRas−GTPの隔離またはRas−GTPのRafへの結合妨害を招来することを特徴とする請求項8記載の抑制剤。
- Ras−GTPの隔離及びRas−GTPのRafへの結合妨害が、Ras−GTP/Raf複合体の量を減少させることを特徴とする請求項9記載の抑制剤。
- Ras−GTP/Raf複合体の量の減少が、血管内皮生成因子(VEGF)の発現を抑制することを特徴とする請求項10記載の抑制剤。
- チモシンβ10遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含むRas活性抑制剤。
- Ras活性の抑制が、チモシンβ10とRasとの直接的相互作用によるものであることを特徴とする請求項12記載のRas活性抑制剤。
- チモシンβ10とRasとの直接的相互作用が、Ras−GTPの隔離及びRas−GTPのRafへの結合妨害、またはRas−GTPの隔離またはRas−GTPのRafへの結合妨害を招来することを特徴とする請求項13記載のRas活性抑制剤。
- Ras−GTPの隔離及びRas−GTPのRafへの結合妨害が、Ras−GTP/Raf複合体の量を減少させることを特徴とする請求項14記載のRas活性抑制剤。
- RAS−GTP/Raf複合体の量の減少が、血管内皮生成因子(VEGF)の発現を抑制することを特徴とする請求項15記載のRas活性抑制剤。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020050051068A KR20060130406A (ko) | 2005-06-14 | 2005-06-14 | Ras 신호전달경로를 표적으로 하는 혈관신생, 세포증식및 세포전이 억제제 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006348006A true JP2006348006A (ja) | 2006-12-28 |
Family
ID=37524814
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005193239A Pending JP2006348006A (ja) | 2005-06-14 | 2005-07-01 | Ras信号伝達経路を標的にする血管新生、細胞増殖及び細胞転移抑制剤 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20060281678A1 (ja) |
JP (1) | JP2006348006A (ja) |
KR (1) | KR20060130406A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015003914A (ja) * | 2007-04-13 | 2015-01-08 | サザン リサーチ インスティテュート | 血管新生阻害薬及び使用方法 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009033816A2 (en) * | 2007-09-11 | 2009-03-19 | Mondobiotech Laboratories Ag | Use of the combination of thymosin beta 10 and thymosin alpha 1 peptides as a therapeutic agent |
CN115814060A (zh) * | 2022-08-30 | 2023-03-21 | 长春科技学院 | 胸腺素β10在制备修复肝损伤药物中的用途 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100454871B1 (ko) * | 2001-10-10 | 2004-11-05 | 이제호 | 사이모신 β- 10을 고형악성종양의 유전자 치료에사용하는 용도 |
-
2005
- 2005-06-14 KR KR1020050051068A patent/KR20060130406A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-07-01 JP JP2005193239A patent/JP2006348006A/ja active Pending
- 2005-12-29 US US11/321,186 patent/US20060281678A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015003914A (ja) * | 2007-04-13 | 2015-01-08 | サザン リサーチ インスティテュート | 血管新生阻害薬及び使用方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20060130406A (ko) | 2006-12-19 |
US20060281678A1 (en) | 2006-12-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100681763B1 (ko) | 인간 리포칼린 2를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용약학적 조성물, 이를 이용한 암 전이 억제 방법 | |
Lee et al. | Thymosin β10 inhibits angiogenesis and tumor growth by interfering with Ras function | |
Miyake et al. | Monoclonal antibody against CXCL1 (HL2401) as a novel agent in suppressing IL6 expression and tumoral growth | |
PT1484338E (pt) | Métodos e composições para inibição do crescimento de células neoplásicas. | |
JP6309080B2 (ja) | がん治療のためのegfr−sglt1相互作用の標的化 | |
KR20100077160A (ko) | 근육 및 심장 강화제의 타겟으로서 trim72의 용도 | |
Zhang et al. | Runx2–smad signaling impacts the progression of tumor‐induced bone disease | |
EP1425399A2 (en) | Combinatorial methods for inducing cancer cell death | |
AU2016366515A1 (en) | Combined preparations of PKM2 modulators and HMGB1 | |
Cai et al. | Nogo‐B promotes tumor angiogenesis and provides a potential therapeutic target in hepatocellular carcinoma | |
WO2002030973A2 (en) | The caveolin-1 gene and polypeptide encoded thereby and methods of use thereof | |
Tada et al. | The novel IκB kinase β inhibitor IMD-0560 prevents bone invasion by oral squamous cell carcinoma | |
JP2006348006A (ja) | Ras信号伝達経路を標的にする血管新生、細胞増殖及び細胞転移抑制剤 | |
Zhang et al. | Retinoblastoma 94 enhances radiation treatment of esophageal squamous cell carcinoma in vitro and in vivo | |
US10973884B2 (en) | Pharmaceutical composition for preventing and treating cancer, containing CYB5R3 gene or protein as active ingredient | |
KR101123130B1 (ko) | Ptk7 단백질의 기능 저해를 통한 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제 | |
WO2000073445A2 (en) | Interleukin-1-receptor associated kinase-3 (irak3) | |
US7276490B1 (en) | Medicinal compositions containing prostacylin synthase gene | |
CN115381949A (zh) | 靶向抑制色素上皮衍生因子在促进肝脏再生及改善肝损伤中的应用 | |
WO2013047941A1 (ko) | 비소세포성 폐암에서 tm4sf4의 발현 또는 활성의 조절을 통한 방사선 저항성 및 암세포의 성장, 전이, 및 침윤능력을 저하시키는 방법 | |
US7297779B2 (en) | Colon cancer metastasis inhibitor | |
CN107529558B (zh) | 多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶的新应用 | |
JP2021520845A (ja) | マイクロペプチドとその使用 | |
WO2022237621A1 (zh) | 诊断和***的试剂及其用途 | |
US20040043004A1 (en) | Caveolin-1 gene and polypeptide encoded thereby and methods of use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080904 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20081202 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20081205 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20081225 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090106 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090402 |